KR100830703B1

KR100830703B1 - 메틸로박테리움 속 미생물, 이를 이용한 유기산 생산방법,중금속 오염 토양 정화 방법 및 식물 생장 촉진방법

Info

Publication number: KR100830703B1
Application number: KR1020070011974A
Authority: KR
Inventors: 조경숙; 구소연
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2007-02-06
Filing date: 2007-02-06
Publication date: 2008-05-20

Abstract

본 발명은 메틸로박테리움 속 (Methylobacterium sp.) 미생물, 이를 이용한 유기산 생산 방법, 중금속으로 오염된 토양의 정화 방법 및 식물 생장 촉진방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 중금속에 대하여 내성을 갖고 인돌아세트산의 생산 능력이 우수하며 다양한 종류의 유기산을 생산할 수 있는 신규 미생물 Methylobacterium sp. SY-NiR1을 돌피, 산괭이사초, 닭의장풀 또는 흰여뀌의 근권 토양으로부터 분리함으로써 이 미생물을 이용하여 유기산을 생산하는 방법, 식물의 중금속 제거 효율을 향상시켜 중금속으로 오염된 토양을 정화하는 방법 및 식물의 생장을 촉진하는 방법을 제공할 수 있는, 메틸로박테리움 속 미생물, 이를 이용한 유기산 생산 방법, 중금속으로 오염된 토양의 정화 방법 및 식물 생장 촉진방법에 관한 것이다.

메틸로박테리움 속 미생물, 중금속, 오염, 토양 정화, 식물 생장

Description

메틸로박테리움 속 미생물, 이를 이용한 유기산 생산방법, 중금속 오염 토양 정화 방법 및 식물 생장 촉진방법{Methylobacterium sp. SY-NiR1 and method for organic acid production, heavy metal contaminated-soil purification and plant growth promotion using the same}

도 1은 중금속 내성을 가진 분리균의 상대적 IAA 생산능을 측정한 결과를 나타낸 도이다(*는 대조군과 비교하여 IAA 생산능에 차이를 나타내는 샘플을 의미한다. p<0.005).

도 2는 시간경과에 따른 Methylobacterium sp. SY-NiR1 세균 성장 및 IAA의 생산능을 측정한 결과를 나타낸 도이다.

도 3은 16S rDNA 분석 방법에 의한 Methylobacterium sp. SY-NiR1의 염기서열을 나타낸다.

도 4는 Methylobacterium sp. SY-NiR1 배양시 시간 경과에 따른 세균 성장 및 pH 변화를 측정한 결과를 나타낸 도이다.

도 5는 Methylobacterium sp. SY-NiR1 배양 배지에서의 시간 경과에 따른 각종 유기산 농도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.

도 6a 내지 도 6f는 각각의 중금속((a): Cd, (b): Cr, (c): Cu, (d): Ni, (e): Pb, (f): Zn)을 함유한 배양액에서 Methylobacterium sp. SY-NiR1의 평균성장속도 및 비성장속도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 메틸로박테리움 속 (Methylobacterium sp.) 미생물, 이를 이용한 유기산 생산 방법, 중금속으로 오염된 토양의 정화 방법 및 식물 생장 촉진방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 다양한 중금속에 대하여 내성을 갖고 인돌아세트산의 생산 능력이 우수하며 다양한 종류의 유기산을 생산할 수 있는 신규 미생물 Methylobacterium sp. SY-NiR1을 돌피, 산괭이사초, 닭의장풀 또는 흰여뀌의 근권 토양으로부터 분리함으로써 이 미생물을 이용하여 유기산을 생산하는 방법, 식물의 중금속 제거 효율을 향상시켜 중금속으로 오염된 토양을 정화하는 방법 및 식물의 생장을 촉진하는 방법을 제공할 수 있는, 메틸로박테리움 속 미생물, 이를 이용한 유기산 생산 방법, 중금속으로 오염된 토양의 정화 방법 및 식물 생장 촉진방법에 관한 것이다.

산업현장 곳곳에서 다량으로 배출되어 환경으로의 유입이 가속화되고 있는 중금속은 토양 입자 등에 강력하게 흡착하여 독성이 적은 물질로 분해되거나 안정화되지 않고 장기간 체류하여 생태계 내에 고농도로 축적된다 (Rajkumar et al., 2005 Chemosphere 62, 741-748). 이러한 환경 내 중금속은 먹이사슬을 통해 생 물체 내 고농도로 축적되어 DNA 손상이나 암 등의 문제를 일으키며, 토양 미생물의 여러 가지 효소 활성, 세포막의 기능 장애 그리고 핵산의 손상을 야기하는 등의 독성을 가지고 있다 (Beveridge and Doyle, 1989 Metal ions and bacteria. John Wiley and Sons, Inc, New York.; Foster, 1983 Microbiol. Rev. 47, 361-409.; Freedman, 1995 Environmental Ecology: the ecological effects of pollution, disturbance, and other stresses. Acadeimc Press, San Diego, CA.; Gadd, 1986 Fungal reponses towards heavy metals. In: Herbert, R.A., Codd, G.A. (eds), Microbes in extreme environments. Academic Press, New York, pp. 83-110; Gadd, 1992 Microbial control of pollution. Cambridge Press, Cambridge, pp. 59-88). 또한, 토양 미생물의 군집 수준에서 보았을 때, 중금속은 전반적인 대사 활성을 떨어뜨리고, 군집의 다양성 및 군집 내 개체수를 감소시킨다 (Heggo and Angle, 1990 Soil Biol. Biochem. 22, 865-869.; Ietswaart et al., 1992 Appl. Envion. Microbiol. 33, 1225-1228; Reber, 1992 Biol. Fertil. Soils 13, 181-186; Roane and Kellogg, 1996 Can. J. Microbiol. 42, 593-603).

이러한 유해한 중금속으로 오염된 토양을 정화하기 위한 방법으로 토양 속에 축적되어 있는 중금속이 식물의 뿌리에 의하여 흡수 및 축적되거나 흡착되는 기작을 이용하여 토양으로부터 중금속 제거 및 토양 내 중금속 이동의 최소화할 수 있는 식물상 복원법(phytoremediation)이 많이 이용되고 있는데(Kumino et al., 2001 J. Soil Biol. 37, 95-102), 이 복원법은 기존의 물리적, 화학적 처리 방법과 비교하여 친환경적이고 처리비용이 저렴한 장점이 있다.

최근 들어, 이러한 식물체의 중금속 흡수율을 향상시키기 위하여 식물의 뿌리와 근권세균과의 상리공생적인 상호관계를 이용한 리조리메디에이션 (rhizoremediation)에 대한 관심이 증가하고 있다.

리조리메디에이션을 이용한 중금속 오염 토양 정화방법에 있어, 식물 성장 촉진 능력을 지닌 근권세균을 이용하면 식물 성장을 향상시켜 중금속 제거 효율을 증진시킬 수 있다. 또한, 아세트산, 옥살산, 말레산 등과 같은 유기산을 분비할 수 있는 근권세균을 이용하는 경우, 근권세균에 의해 분비된 유기산에 의해 토양 입자에 흡착된 중금속이 가용화 상태로 전환되어 식물 뿌리로 흡수되어 제거될 수 있으므로 중금속 제거 효율 향상 효과를 가져올 수 있다. 그런데 이 경우 근권세균이 자신이 분비한 유기산에 의해 가용화된 중금속 독성에 의해 근권세균의 활성이 저하될 수 있으므로 중금속에 어느 정도 내성을 지닌 근권세균을 활용하는 것이 필요하다.

따라서 보다 효율적으로 중금속으로 오염된 토양 복원을 촉진시키기 위해서는, 중금속에 내성이 있고, 유기산 생산 능력을 가진 새로운 근권세균을 발굴하고 식물과 이의 근권세균을 적극 활용한 중금속 오염 토양의 복원 기법의 개발이 시급한 현실이다.

이에 본 발명자는 이러한 종래의 문제점을 해결하기 위하여 연구, 노력한 결과, 장기간 중금속으로 오염된 유류저장 탱크 주변에 서식하고 있던 돌피, 산괭이 사초, 닭의장풀 또는 흰여뀌의 근권 토양을 접종원으로 하고, 중금속이 포함된 배지를 이용하여 농화배양을 수행하여 중금속에 내성을 가지면서 인돌아세트산의 생산 능력이 우수하고 다양한 종류의 유기산을 생산할 수 있는 신규 미생물 Methylobacterium sp. SY-NiR1을 순수 분리하고, 이 미생물을 식물과 함께 중금속으로 오염된 토양에 접종했을 때 중금속 제거 효율을 향상시키면서 식물의 생장을 촉진시킨다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 돌피, 산괭이사초, 닭의장풀 또는 흰여뀌의 근권 토양으로부터 유래된 메틸로박테리움 속 미생물을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기 미생물을 이용하여 유기산을 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 미생물을 이용하여 중금속으로 오염된 토양을 정화시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 미생물을 이용하여 식물의 생장을 촉진시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 돌피, 산괭이 사초, 닭의장풀 또는 흰여뀌의 근권 토양에서 유래된 미생물 메틸로박테리움 속 (Methylobacterium sp.) SY-NiR1 균주 (KCCM10837P)를 제공한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 다양한 중금속에 내성을 나타내고, 인돌아세트산(IAA)의 생산 능 력이 우수하고 다양한 종류의 유기산을 생산할 수 있는 신규 미생물 Methylobacterium sp. SY-NiR1을 돌피 (Echinochloa crus-galli), 산괭이사초 (Carex leiorhyncha), 닭의장풀 (Commelina communis) 또는 흰여뀌 (Persicaria lapathifolia), 특히 장기간 중금속으로 오염된 유류저장 탱크 주변부에 서식하고 있던 돌피, 산괭이사초, 닭의장풀 또는 흰여뀌의 근권 토양으로부터 분리함으로써 이 미생물을 이용하여 식물의 중금속 제거 효율을 향상시키면서 식물의 생장을 촉진시킬 수 있는 Methylobacterium sp. SY-NiR1 (KCCM10837P), 이를 이용하여 유기산을 생산하는 방법, 중금속으로 오염된 토양을 정화시키는 방법 및 식물의 생장을 촉진시키는 방법에 관한 것이다.

본원의 Methylobacterium sp. SY-NiR1의 분리, 동정 방법을 설명하면, 먼저 장기간 중금속으로 오염된 유류저장 탱크 주변부에 서식하고 있던 돌피, 산괭이사초, 닭의장풀 또는 흰여뀌와 함께 채취된 근권 토양으로부터 중금속에 대한 농화배양 방법을 이용하여 중금속에 대한 내성을 가진 근권세균을 분리한다. 분리된 근권세균들을 대상으로 식물성 호르몬인 인돌아세트산 (IAA)의 생산 능력, 유기산 생산 능력 등을 측정한다. 분리 균주의 동정을 위하여 각 균주의 16S rDNA를 PCR로 증폭하고 서열을 분석하여 유전자은행 데이터베이스와 비교하여 동정한다.

이렇게 분리 동정된 본원의 메틸로박테리움 속 미생물 Methylobacterium sp. SY-NiR1은 다양한 중금속에 내성을 나타내고, IAA의 생산 능력이 우수하며 다양한 종류의 유기산을 생산할 수 있어 중금속으로 오염된 토양의 정화제, 식물 생장 촉진제 등의 유효 성분으로 활용될 수 있다.

또한, 본 발명의 Methylobacterium sp. SY-NiR1 균주는 식물의 생장을 촉진시키므로, 닭의장풀, 소리쟁이, 옥수수 등의 중금속 흡착 식물과 함께 이용하여 중금속으로 오염된 토양의 정화 효율을 향상시키는 방법도 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하겠는바, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 : Methylobacterium sp . SY - NiR1 의 분리, 동정 및 특성 확인

(1) 중금속 내성 근권세균 분리

장기간 중금속으로 오염된 유류 저장 탱크 주변에 서식하고 있던 식물체, 즉 돌피 (Echinochloa crus - galli), 산괭이사초 (Carex leiorhyncha), 닭의장풀 (Commelina communis) 그리고 흰여뀌 (Persicaria lapathifolia)의 근권 토양을 식물체와 함께 채취한 후, 근권 미생물의 활성을 위해 20℃에서 보관하였다.

상기 4 종류 식물의 근권토양으로부터 토착의 중금속 내성균주를 분리하기 위해 다음과 같은 농화배양 방법을 이용하였다.

근권토양 2 g을 18 ml의 멸균수에 넣고 혼탁 시켰다. 30분간 정치시킨 후, 상등액을 각각 같은 양으로 취하여 멸균한 삼각 플라스크에 넣고 잘 섞었다. 이를 각각의 중금속이 포함된 LB 배지에 10% (v/v) 접종하였고, 30℃에서 180 rpm으로 배양하였으며, 배양이 확인되면 중금속의 농도를 높인 배지로 옮겨 배양하 는 방법을 이용하여 점차적으로 중금속 농도를 높였다. 상기 LB (Difco, USA) 배지는 1/10 희석한 배지 (10% LB 배지)를 사용하였고, 중금속은 Cr (as K₂Cr₂O₇), Cd (as CdCl₂·2H₂O), Ni (as NiCl₂·6H₂O)로 Cd와 Cr은 1.0 mM, Ni는 0.8 mM를 초기농도로 하였다. 중금속의 농도를 높인 배지에서 더 이상 배양이 관찰되지 않을 경우에는 직전 농도의 배양액을 같은 농도의 중금속이 포함된 10% LB-agar 배지에 100 ㎕씩 접종하여 30℃에서 배양하고, 여기서 배양된 균주를 해당 중금속에 내성을 가진 균주로 분리하였다.

그 결과, Cd, Cr, Ni 이 포함된 배양액으로부터 해당 중금속에 내성을 가지는 균주를 각각 분리하였는데, Cd에 내성을 가지는 분홍색과 흰색의 콜로니를 형성하는 2 균주 (SY-CdR1, SY-CdR2), Cr에 내성을 가지는 흰색의 콜로니를 형성하는 균주 (SY-CrR1) 그리고 Ni에 내성을 가지는 분홍색의 콜로니를 형성하는 균주 (SY-NiR1)로 총 4 가지의 중금속 내성 균주를 분리하였다.

(2) 중금속 내성 근권세균의 인돌아세트산(IAA) 생산 능력 확인

상기에서 중금속 내성 균주로서 분리된 4개 균주, SY-CdR1, SY-CdR2, SY-CrR1 및 SY-NiR1을 대상으로 식물성장 촉진 활성을 나타내는 식물성 호르몬인 IAA의 생산 능력을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.

4 균주를 각각 0.5 mg/mL의 트립토판이 함유된, 조성을 약간 변형한 DF 배지 (Dworkin and Foster, 1958 J. Bacteriol. 75, 592-603) 5 mL에 접종하여 30 ℃에 서 180 rpm으로 5 일간 배양하였다. 상기 DF 배양액의 조성은 다음과 같다: (NH₄)₂SO₄ 2 g; KH₂PO₄ 4 g; Na₂HPO₄·12H₂0 15 g; MgSO₄·7H₂O 0.2 g; FeSO₄·7H₂O 1.0 mg; B(as H₃BO₃) 10 ㎍; Mn(as MnSO₄·H₂O) 11 ㎍; Zn(as ZnSO₄·7H₂O) 125 ㎍; Cu(as CuSO₄·5H₂O) 78 ㎍; Mo(as Na₂MoO₄·2H₂O) 17 ㎍; 증류수 1 L. 배양 후, 배양액과 살코우스키 시약 (Salkowski's reagent) (진한 H₂SO₄ 150 mL; 증류수 250mL; 0.5 M FeCl₃·6H₂O 7.5 mL)를 1 : 2 의 비율로 섞은 후 분홍색으로 발색되는 동안 상온에서 20 분간 정치하였다. 발색 정도는 흡광광도계를 이용하여 530 nm에서 흡광도로 측정하였다. SPSS (12.0K)를 이용하여 균주를 접종하지 않은 대조군과 이원배치 분산분석 (two sample t-test)을 수행하였고, 3-인돌아세트산 (C₈H₆N-CH₂COOH, SHOWA chemical co., Japan) 시약을 이용한 검량선식을 이용하여 농도로 환산하였다.

그 결과, 평가된 균주 모두 IAA를 생산하는 능력을 가지고 있었으며, 특히 Ni에 내성을 가진 균주인 SY-NiR1이 5일의 배양기간 동안 가장 많은 IAA를 생산하는 것으로 나타났다 (도 1). 그 다음으로는 SY-NiR1 균주와 같은 분홍색의 콜로니를 형성하는 SY-CdR1로, SY-NiR1 균주가 생산한 IAA의 약 1/4 수준의 IAA를 생산하였으며, SY-CdR1과 SY-CrR1균주는 상대적으로 매우 낮은 IAA 생산능을 보였다.

도 1의 결과에 따라 IAA 생산력이 가장 우수한 SY-NiR1을 대상으로 하여 배지 내 IAA의 농도를 배양시간에 따라 평가하였다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, SY-NiR1 균주에 의하여 5일 배양기간 동안 최종적으로 생산된 IAA의 농도는 약 2.3 mg/L이었으며, 균주의 성장에 비례하여 배지 내 IAA 농도도 증가하였으며, 균주의 성장이 정체기에 들어서면서 IAA 농도 또한 더 이상 증가하지 않았다.

근권세균들은 식물이 체외 대사산물로 배출하는 L-트립토판을 생장에 필요한 영양물질로 이용하며, 그 대사산물로 IAA를 합성한다. 이렇게 생성된 IAA는 다시 식물에 흡수되면서 식물의 성장을 촉진하고 조절함으로써 식물과 근권세균 사이에 긴밀한 상호관계가 형성된다.

본원의 SY-NiR1는 5일 동안 약 2.3 mg/L 농도의 IAA를 생산하였는데, Doronina et al.의 연구에서 IAA를 생산하는 능력을 가지는 메탄올 자화균 (methylotrophic bacteria)들은 적게는 1.4 ㎍ m/L에서 많게는 95.7 ㎍ m/L의 IAA를 생산하였다고 보고하고 있고 (Doronina et al., 2002 Microbiology 71, 116-118), Ryu et al.의 연구에서는 2 종류의 Methylobacterium spp.가 7일 동안 각각 2.33 ㎍ m/L, 4.03 ㎍ m/L의 IAA를 생산하였다고 보고(Ryu et al., 2006 Plant growth substances produced by Methylobacterium spp. And their effect on tomato (Lycopersicon esculentum L.) and red pepper (Capsicum annum L.) growth. J. Microbiol. Biotechnol. 16, In Press.)되어 있는 것에 비해 매우 우수한 IAA 생산능을 나타낸다고 할 수 있다.

따라서 본원의 중금속 내성 근권세균 SY-NiR1을 접종원으로 사용하였을 때, 이 균주에 의한 IAA 생합성 및 분비로 인하여 식물 성장이 촉진될 수 있다.

(3) 근권세균 SY-NiR1의 동정

상기와 같이 선별된 근권세균 SY-NiR1을 동정하기 위하여 16S rDNA 서열분석 방법을 이용하였다.

SY-NiR1 콜로니를 0.5N NaOH 30 μL에 현탁시킨 후 95 ℃에서 30 분간 가열하여 균체를 라이시스시켰고, 이에 따라 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR (polymerase chain reaction)을 수행하였다. DNA 주형 1 μL, 프라이머 27f 및 1492r 각각 20 pmol, BSA 0.5 mg/mL, dNTP 0.2 mM 및 10x 버퍼 2.5 μL를 넣고 dH₂O로 총 부피를 25 μL로 맞추었다. 이때 사용한 프라이머는 유니버셜 프라이머 (universal primer)로 27f (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AC-3') 및 1492r (5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT-3')이었다. PCR은 93 ℃에서 2 분 동안 프레-디네이쳐레이션 (pre-denaturation), 92 ℃에서 1 분 동안 디네이쳐레이션, 55 ℃에서 1 분 동안 어닐링 (annealing), 및 68 ℃에서 45 초 동안 익스텐션 (extension)을 35 사이클 반복하였고, 72 ℃에서 2 분 동안 최종 익스텐션한 후 4 ℃로 유지되었다.

그 다음, 상기 16S rDNA PCR 산물의 서열을 분석(도 3, 서열번호 1)하여 BLAST 서치한 결과, 본원의 미생물은 알파-프로테오박테리아 (α-Proteobacteria)의 메틸로박테리움 후지사와엔스 (Methylobacterium fujisawaense, NCBI Accession no. AB175634)와 유사도가 100% (754/754)인 것으로 나타났다.

따라서 본원의 근권세균 SY-NiR1은 메틸로박테리움 속의 미생물이며, 또한 그람음성의 분홍색 색소를 내는 조건적 메틸 영양체(pink-pigmented facultative methylotrophs, PPFMs)임을 확인할 수 있었다.

위와 같이 전체 16S rDNA 중 본원에서 분석한 염기서열 부분에 있어서는 SY-NiR1와 Methylobacterium fujisawaense (Accession no. AB175634)의 서열이 일치하였으나, 본원의 SY-NiR1 균주는 식물의 근권토양에서 분리되었고, M. fujisawaense 균주는 식물의 잎 표면에서 분리된 것으로서, 본원의 SY-NiR1은 옥살산, 말산, 숙신산 등의 유기산을 생산하는 능력을 보이나 M. fujisawaense 균주는 유기산의 이용과 생산에 관한 능력을 가지고 있지 않으므로, 본 발명에서 분리한 균주와 전체 염기서열에서는 차이가 있을 수 있다. 본원의 SY-NiR1 균주는 식물의 잎에서 배출되는 메탄올 양에 비하여 토양 내에서는 이용할 수 있는 메탄올의 양이 상대적으로 적은 환경에 적응하여 식물의 뿌리로부터 배출되는 탄수화물, 유기산 성분을 대안적 탄소원으로 이용할 수 있다는 차이점을 가지고 있다.

본 발명자들은 위와 같은 방법으로 얻어진 메틸로박테리움 속 미생물을 Methylobacterium sp. SY-NiR1라고 명명하고 이를 2007년 1월 15일자로 한국미생물보존센터에 기탁하였다 (수탁번호: KCCM10837P).

(4) 근권세균 Methylobacterium sp. SY-NiR1의 유기산 생산 능력 확인

본원발명의 Methylobacterium sp. SY-NiR1의 유기산 생산능을 확인하기 위하여, 30 g/L의 글루코스를 넣은 최소 염 배지 (minimal salts medium) (KH₂PO₄ 1.5 g/L, Na₂HPO₄·12H₂O 9.0 g/L, (NH₄)₂SO₄ 3.0 g/L, FeSO₄·7H₂O 0.01 g/L, MgSO₄·7H₂O 0.15 g/L, CaCl₂·2H₂O 0.01 g/L)에 접종하여 30 ℃에서 160 rpm으로 교반 배양하였다. 배양하는 동안, 배양액의 흡광도 (600nm)와 pH를 측정하였고, 이온-크로마토그래피 (Dionex, DX-500 with ED40 Electro-chemical Detector, IonPac AS11 (4x250mm) column, ASRS-Ultra II Anion self regenerating suppressor)를 이용하여 최종 배양액 내 생산된 유기산의 농도를 분석하였다. 측정된 유기산은 아세트산, 시트르산, 말레산, 말산, 옥살산 및 숙신산이었다.

그 결과, 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 배양 기간 동안 균주의 성장에 따라 배양액의 pH는 약 7.0 에서 6.0 수준으로 감소하였다.

또한, 시간별 유기산의 농도를 측정한 결과는 다음과 같다.

도 5를 보면, 배양 초기, 글루코오스가 가수분해되어 생성된 옥살산 및 말산의 초기 농도가 각각 2112.6 mg/L, 1253.2 mg/L 이었으나, 분리 균주가 성장함에 따라 이들 유기산을 탄소원으로 사용하여 그 농도가 감소됨을 알 수 있다. 그러나 SY-NiR1의 성장이 진행되면서 옥살산 및 말산 농도의 감소와 증가가 반복되어, 유기산의 생성과 소모가 반복되는 것으로 나타났다. 전체적으로 보았을 때에는 이들 유기산 성분의 농도가 시간이 경과할수록 점차적으로 증가하는 양상을 나타내었다. 이는 사용되는 유기산에 비하여 생산되는 유기산의 농도가 더 높다는 것을 의미하며, 이로 인하여 배양액의 pH가 감소된 것으로 보인다.

그 외 나머지 유기산 중에서는 숙신산이 생산되었는데, 배양 13일 째 농도가 118.8 mg/L 이었다.

상기와 같이, 식물의 뿌리 혹은 많은 토양 미생물이 배출해내는 아세트산, 옥살산, 푸말산, 시트르산, 타르타르산과 같은 저분자의 유기산 성분들은 토양 입자나 유기물질 등에 강력하게 흡착되어 있는 중금속이나 인과 같은 생물학적 이용도가 낮은 물질들을 가용화시키고 (Mench and Martin, 1991 Plant Soil 137, 187-196; Robert and Berthelin, 1994 Role of biological and biochemical factor in soil mineral weathering. In: Huang, P.M., Schnitzer, M. (eds), Interaction of soil minerals with natural organic and microbes. Soil Sci. Soc. Amer, Madison, WI.; Stevenson and Fitch, 1994 Chemistry of complexation of metal ions with soil solution organics. In: Huang, P.M., Schnitzer, M. (eds), Interaction of soil minerals with natural organic and microbes. Soil Sci. Soc. Amer, Madison, WI.), 가용화된 중금속은 식물체 내부로 축적되게 된다.

따라서 본원의 Methylobacterium sp. SY-NiR1이 생산하는 유기산에 의하여 토양의 pH가 감소되고 토양 입자 등에 흡착되어 있던 중금속이 가용화 상태로 용출되어, 중금속의 식물체 내부로의 축적을 향상시킬 수 있을 것이다. 또한 식물 성장의 제한요소인 인 또한 가용화되어 생물학적 이용도가 높아짐으로써 식물의 영양학적 관점에서 보았을 때에도 유리한 효과를 줄 것이라 사료된다.

(5) 근권세균 Methylobacterium sp. SY-NiR1의 다양한 중금속에 대한 내성 확인

상기에서 분리한 Ni에 내성을 가지는 Methylobacterium sp. SY-NiR1 균주를 대상으로 6 종류의 중금속 (Cd, Cr, Cu, Ni, Pb, Zn)에 대한 내성능을 각각의 중금속 농도 변화에 따라 조사하였다.

실험에 사용된 배지는 10% LB 배지로 이에 함유된 각 중금속의 농도는 다음과 같다: Cd 0.2~1.8 mM, Cr 0.01~0.2 mM, Cu 0.2~1.0 mM, Ni 1~9 mM, Pb 0.5~3.5 mM, or Zn 1~5 mM. SY-NiR1을 각각의 배지에 접종하여, 30℃에서 3일 동안 배양하였다. 흡광광도계를 이용하여 시간별 흡광도 (600 nm)를 측정하여 비성장속도 (specific growth rate, 지연기를 제외한 지수성장기에서 배양시간에 따른 균주 성장속도)와 평균성장속도 (average growth rate, 지연기를 포함한 총 배양시간을 기준으로 한 균주 성장속도)를 구하였다.

그 결과, SY-NiR1 균주는 다양한 중금속 (Cd, Cr, Cu, Ni, Pb, Zn)에 대하여 내성을 가지고 있으며, 특히 Cd 0.6 mM, Cr 0.15 mM, Cu 1.0 mM, Ni 4 mM, Pb 1.0 mM, Zn 5 mM의 조건에서도 성장이 가능한 중금속 내성 근권세균임을 확인할 수 있었다(도 6a 내지 6f).

실시예 2 : 본 발명의 Methylobacterium sp. SY-NiR1와 식물을 이용한 중금속 오염 토양의 정화 효과 및 식물 생장 효과 확인

본 발명의 Methylobacterium sp. SY-NiR1의 배양액을 원심분리 후 최소 염 배지(MSM)로 재현탁시켜 제조한 액상 미생물제제와 중금속 흡착 식물인 닭의장풀, 소리쟁이 및 옥수수를 이용하여 중금속으로 오염된 토양 정화 처리를 하였다.

토양에 Pb, Cu 및 Cd 중금속 용액을 인위적으로 첨가하여 잘 혼합한 후 각 중금속의 농도가 Pb 100 mg/kg, Cu 50 mg/kg, Cd 50 mg/kg이 되도록 오염을 시켰다. 이렇게 중금속으로 오염 시킨 토양 l0 kg을 화분에 넣고 닭의장풀, 소리쟁이 및 옥수수 씨를 파종하여 30일 동안 재배하였다. 30일 동안 재배 후, Methylobacterium sp. SY-NiR1 균주를 이용하여 제조한 액상의 미생물 제제(10⁹ - 10¹⁰ CFU/mL)를 1kg의 오염토양 당 10⁹ CFU가 되도록 골고루 살포한 후, 60일 동안 식물을 재배하였다. 식물을 재배하는 동안 1-2일에 한번씩 물을 주어 토양이 건조하지 않도록 하였으며, 10일마다 한번씩 최소 염 배지를 주입하였다.

실험 종료 후, 식물체를 수거하여 뿌리에 있는 토양을 물로 세척하여 완전히 제거한 후, 건조시켜 식물체의 건조중량을 측정하였다.

또한, 토양시료는 채취하여 토양 중의 중금속 농도를 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 토양 1.0 g에 HNO₃ 1.2 mL, HCl 3.6 mL을 첨가한 후 가열하여 수분을 제거한 다음, 10 mL의 증류수를 첨가하였다. 이 용액을 여과지로 거른 후, 원자흡광광도계 (AAS vario 6, analyticjenaAG, Germany)를 이용하여 중금속 농도를 분석하였다.

또한, Methylobacterium sp. SY-NiR1 균주 접종 효과를 비교 분석하기 위해, SY-NiR1 균주를 접종하지 않고 식물만을 동일한 방법으로 재배하는 실험을 동시에 수행하였다.

표 1에 나타난 바와 같이, 닭의장풀, 소리쟁이 및 옥수수 등과 같은 식물만을 이용한 경우에는 Pb, Cu 및 Cd의 제거효율은 각각 71-85%, 85-88% 및 83-89%이 었다. 그런데, 이러한 식물과 함께 Methylobacterium sp. SY-NiR1 균주를 동시에 접종한 경우에는 Pb, Cu 및 Cd의 제거효율은 각각 82-93%, 94-95% 및 91-95%로 중금속 제거 효율이 향상됨을 확인 할 수 있었다.

조건	중금속 제거 효율 (%)
조건	Pb	Cu	Cd
닭의장풀	71	85	83
닭의장풀 + Methylobacterium sp. SY-NiR1	82	94	91
소리쟁이	85	88	89
소리쟁이 + Methylobacterium sp. SY-NiR1	93	95	94
옥수수	79	87	86
옥수수 + Methylobacterium sp. SY-NiR1	87	95	95

또한, 식물성 호르몬인 IAA 생산 활성을 나타내는 Methylobacterium sp. SY-NiR1 균주를 접종함으로써 닭의장풀, 소리쟁이 및 옥수수의 생장이 각각 1.4배, 1.3배 및 1.7배 향상됨으로써, 본원 Methylobacterium sp. SY-NiR1 균주가 중금속으로 오염된 토양에서 식물의 생장을 촉진시킴을 확인할 수 있었다.

따라서 본 발명의 Methylobacterium sp. SY-NiR1 균주는 중금속으로 오염된 토양에서 식물의 생장을 촉진시키고, 유기산 분비하여 토양에서의 중금속의 이동성을 용이하게 하여 식물로 잘 흡수될 수 있게 하여 식물을 이용한 중금속 오염 토양의 정화 효율을 더욱 향상시키는 효과를 나타낼 수 있다.

상술한 바와 같이, 장기간 중금속으로 오염된 지역의 돌피, 산괭이사초, 닭의장풀 또는 흰여뀌의 근권 토양으로부터 분리된 본 발명의 Methylobacterium sp. SY-NiR1 균주는 인돌아세트산의 생산 능력이 우수하고 다양한 종류의 유기산을 생산할 수 있는 신규한 미생물로서, 이는 식물의 생장을 촉진시킬 수 있을 뿐만 아니라 토양 내 중금속을 가용화시켜 생물학적 이용도를 증진시키는 효과가 있다.

따라서 본 발명에서 분리한 Methylobacterium sp. SY-NiR1을 닭의장풀, 소리쟁이 및 옥수수와 같은 중금속 흡착 식물과 함께 중금속으로 오염된 토양 정화에 적용한다면, 식물이 중금속 독성에 의한 스트레스에 대항하는데 도움을 주고 이에 식물이 보다 많은 중금속을 흡수, 축적하게 함으로써 식물을 이용한 중금속 오염 토양의 정화 효율을 향상시키는 효과를 나타낼 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

돌피, 산괭이사초, 닭의장풀 또는 흰여뀌의 근권 토양으로부터 분리된 미생물 Methylobacterium sp. SY-NiR1 (KCCM10837P).
제 1 항의 미생물 Methylobacterium sp. SY-NiR1을 이용하여 유기산을 생산하는 방법.
제 1 항의 미생물 Methylobacterium sp. SY-NiR1을 이용하여, Cu, Cd, Cr, Pb, Zn 및 Ni 를 포함하는 중금속으로 오염된 토양을 정화시키는 방법.
제 1 항의 미생물 Methylobacterium sp. SY-NiR1을 이용하여 식물의 생장을 촉진시키는 방법.