CN115925972A - 在植物细胞或整株植物中产生结合物-毒素融合蛋白的方法 - Google Patents
在植物细胞或整株植物中产生结合物-毒素融合蛋白的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115925972A CN115925972A CN202210858173.1A CN202210858173A CN115925972A CN 115925972 A CN115925972 A CN 115925972A CN 202210858173 A CN202210858173 A CN 202210858173A CN 115925972 A CN115925972 A CN 115925972A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- toxin
- conjugate
- plant
- fusion protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/11—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production isolated from eggs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/13—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production isolated from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
- C12N15/8258—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon for the production of oral vaccines (antigens) or immunoglobulins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种产生结合物‑毒素融合蛋白的方法,所述融合蛋白包含至少选自抗体、保留靶结合能力的抗体片段或衍生物或抗体模拟物的一种蛋白质结合物,任选存在的肽接头,和至少一种蛋白质毒素或蛋白质原毒素。所述方法包括以下步骤:将植物细胞或整株植物与包含可操作连接的至少以下的核酸构建体接触:(A)编码蛋白质结合物或其靶结合链或结构域的至少一种多核苷酸,及或者B1)编码可切割肽接头的多核苷酸和编码蛋白质毒素的多核苷酸或者B2)编码蛋白质原毒素的多核苷酸,该原毒素包含用于激活的其可切割结构域,使所述构建体整合到所述植物细胞或所述整株植物的一或多个细胞的核中,并表达由所述核酸构建体编码的融合蛋白(图7)。
Description
本申请是2020年2月18日提交的题为“在植物细胞或整株植物中产生结合物-毒素融合蛋白的方法”的中国专利申请202080029119.5的分案申请。
发明领域
本发明申请涉及结合物-毒素融合蛋白的领域。
背景技术
在四十年前已经开发了组合靶结合物和毒素的缀合物,现在代表着对抗癌症的主要希望。这些缀合物主要由抗体-药物-缀合物(ADC)类别代表,由通过接头与化学细胞毒性剂化学缀合的单克隆抗体组成。这些药物结合了单克隆抗体靶向癌细胞的特异性和有效载荷的高毒性效能,以杀死被靶向的细胞,同时使健康组织不受伤害。
然而,事实证明,这一观念难以转化为临床成功。尽管其对肿瘤细胞具有特异性,但在产品未达到其有效治疗剂量的情况下,经常会发生不良反应,导致相对狭窄的治疗窗口,这可能会限制其临床反应。通常在非靶向表达的组织中观察到剂量限制性毒性(脱靶效应),主要是由于所用接头的相对不稳定性导致不需要的毒素释放,而不是由于抗体的特异性问题(Drake and Rabuka(2015))。
除了脱靶毒性之外,已经表明只有极少数(1-2%)的完整缀合物到达被靶向肿瘤(Peters and Brown(2015))。由于这种不佳的靶向效率,细胞毒性有效载荷必须具有高效力,以在低剂量下仍能引起被靶向细胞死亡。
然而,由于上述的接头的相对不稳定性,使用高效力毒素要求接头在血流内必须是稳定的,以避免过早释放毒素,从而扩大治疗窗口(Parslow et al.(2016))。
化学缀合的毒性有效载荷具有与化学接头意外分离的风险,导致脱靶毒性(Alewine et al.(2014))。这种不稳定性限制了以这种方式生产的免疫缀合物的功效。
扩大抗体药物缀合物的治疗窗口的一种方法是开发与主要来自植物和细菌的高细胞毒性蛋白质或肽融合的抗体。这种方法最初是在二十世纪八十年代初期开发的。第一代这种缀合物由化学偶联于抗体的细胞毒性肽组成。
然而,已经讨论过的化学缀合的相对不稳定性,加上天然细胞毒性蛋白的高免疫原性,这些被认为是阻碍这些缀合物的治疗可用性的主要障碍。
然而,理论上,这些缀合物在治疗中具有巨大的潜力。大多数蛋白质毒素的作用机制是基于蛋白质合成抑制,这与常用的有机细胞毒素(主要是微管蛋白抑制剂或RNA聚合酶抑制剂)不同,这意味着非重叠的毒性特征,并促进与标准疗法的组合。
此外,细胞毒性蛋白似乎对化疗难治性患者中也有效,表明其不受针对有机细胞毒素观察到的肿瘤耐药机制的影响。
再者,与大多数有机细胞毒素不同,细胞毒性蛋白对于静止细胞(即不分裂的细胞)也有效。
此外,细胞毒性蛋白可以与抗体共表达,即以融合蛋白的形式。融合蛋白的这种重组生产减少了对于化学接头技术观察到的不期望的有效载荷解离。
通过肽接头将蛋白质结合物例如抗体与细胞毒性蛋白质的遗传融合提供了一些优点。除了单纯的连接作用外,接头还可以影响融合蛋白的折叠、稳定性、药代动力学特征和生物活性,以及其在宿主细胞中的生产产量。
存在两类接头,即稳定接头和可切割接头。稳定接头由稳定的肽序列组成,其可具有延长的血浆半衰期并避免细胞毒性蛋白的意外释放。整个缀合物被内在化到细胞中,然后通过蛋白质结合物的细胞内降解而释放毒素。
许多哺乳动物蛋白酶敏感序列可用作设计可切割生物缀合物的接头。特别地,对癌细胞过表达的酶敏感的序列可用于将细胞毒性融合蛋白激活于靶细胞或肿瘤环境中。然而,这些使用哺乳动物酶敏感序列的复杂融合蛋白难以产生为标准系统(哺乳动物细胞(例如CHO或HEK)、昆虫细胞和酵母),主要是因为即使在低背景表达的情况下也存在特定酶。在这种情况下,前肽通过其活性结构域的释放而被激活,诱导宿主细胞增殖的抑制。因此,必须在细菌表达系统中产生具有哺乳动物蛋白水解可切割接头的结合物-毒素融合蛋白。然而,细菌无法正确折叠具有多个结构域的复杂蛋白质,并且缺乏形成二硫键的能力(Yin etal.(2007))。这些限制阻止了细菌系统产生单链抗体片段(scFv)和基于无糖基化细胞毒性蛋白的结合物-毒素融合蛋白。然而,基于细菌scFv的小尺寸生物缀合物诱导快速肾脏清除,限制了这些分子的治疗窗口(Guo et al.(2016)。
WO2009064815公开了藻类叶绿体含有必要的机制以折叠复杂的结合物-毒素融合蛋白,避免在标准系统中观察到的宿主细胞杀伤。事实上,莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)与原核生物中发现的叶绿体一样,只有一个叶绿体,但含有允许复杂蛋白质折叠的蛋白质(蛋白质二硫化物异构酶、分子伴侣)。WO2009064815证明了绿藻叶绿体适合产生可溶的功能性单链抗体(CD22),其具有通过由两个重复G4S序列(四个甘氨酸,后接丝氨酸)组成的不可切割接头与蛋白质毒素融合的人IgG1的铰链、CH2、CH3结构域。然而,一个主要问题是微藻叶绿体的翻译后修饰,特别是缺乏用于N-糖基化的酶机制,这是生物制药的一个关键特质(Mathieu-Rivet et al.(2014))。
另一种基于人胚胎肾细胞(HEK-293T)的方法使用不可切割的结合物-毒素融合蛋白开发,所述融合蛋白由血管内皮生长因子121(VEG121)通过G4S稳定接头连接于受保护的颗粒酶B组成(Mohamedali et al.(2013))。蛋白酶颗粒酶B的功能结构域由一个额外的组氨酸标签保护,所述标签由肠激酶敏感位点连接,最大可能地避免宿主细胞杀伤。在产生后,必须通过额外的肠激酶处理步骤去除受保护的位点。尽管观察到了抗肿瘤功效,但这种结合物-毒素融合蛋白的产生是复杂的。
所述限制可以通过使用经由肽接头与肽有效载荷连接的靶向部分的完全重组生物缀合来克服。例如,这种重组免疫缀合物例如使用与修饰的志贺样毒素缀合的CD20特异性单链可变片段(scFv)设计,并在原核表达系统中表达(WO2014164680A1)。由此产生的化合物在NHL的I/Ib期显示出有希望的结果,表明完整重组免疫缀合物可以减少化学缀合于肽毒素的抗体所观察到的脱靶毒性。
然而,基于scFv抗体的免疫缀合物已经示出具有非常有限的血液半衰期,这是由于肾脏清除限制了其功效所致,而通常用于产生基于scFv的免疫毒素的细菌模型不适合产生全长抗体或scFv-Fc结构,因为其不能形成二硫键。此外,这种细菌系统不会使抗体或由此产生的抗体片段糖基化,这同样可能导致所产生抗体的半衰期缩短或效应子功能降低。由于这些原因,通常使用哺乳动物表达系统如CHO(中国仓鼠卵巢细胞)产生这种复杂的抗体或抗体片段或衍生物。
然而,由于毒性原因,在哺乳动物细胞中很难实现活性蛋白毒素有效载荷或包含后者的缀合物的产生,特别是如果使用由哺乳动物蛋白酶识别的切割位点。然而,特别感兴趣的是在免疫缀合物中具有由哺乳动物蛋白酶识别的这种切割位点。
这将允许在结合物-毒素融合蛋白与其靶结合后激活所述毒素,例如在特征在于所述靶的疾病部位。由于其对哺乳动物蛋白酶的敏感性,切割位点将被切割,从而释放出激活的毒素。
因此,本发明的一个目的是提供一种有效的生产系统以利用新的结合物-毒素融合蛋白的治疗潜力。
本发明的另一个目的是提供一种生产结合物-毒素融合蛋白的方法,所述方法
a)允许形成结合蛋白中的二硫键和/或结合蛋白的糖基化,
b)允许使用对哺乳动物细胞具有毒性的蛋白质毒素,和/或
c)允许掺入由哺乳动物蛋白酶识别的切割位点。
本发明的再一个目的是能产生糖基化的结合物-毒素融合蛋白,其组合了重组融合于细胞毒性蛋白的靶向部分,其在接头切割后被激活,具有延长的血清半衰期。
即使实际的结合蛋白(a)未糖基化、(b)使用对于哺乳动物细胞无毒性的毒素或(c)不具有这种切割位点,也希望解决任何这些目标,因为事实上这种方法使上述任三项均可提供高度灵活性,并使得可以产生大量的结合物-毒素融合蛋白。
根据本发明的独立权利要求的方法和手段可以满足这些和进一步的目的。从属权利要求与特定实施方案相关。
发明概述
本发明提供了一种产生结合物-毒素融合蛋白的方法。在下文将详细讨论本发明及其特征的一般优点。
附图简述
图1:通过western印迹法,使用抗人IgG Fc部分抗体分析经农杆菌渗入4天和6天后(4或6dpa)的30μg本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶提取物。使用含有p19沉默抑制基因(+)或不含有p19沉默抑制基因(-)的二元转化载体。使用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)(A.t.)LBA4404(1-4泳道)或GV3101(5-8泳道)表达融合蛋白,菌株在图上方标明。阴性对照使用在A.t.LBA4404中的空白pPZP-ATB二元质粒(C-)。200ng人血清IgG(Sigma,I5154)用作阳性对照(C+)。在非还原条件下进行4-20%丙烯酰胺SDS-PAGE。整合蛋白大小用星号表示。
图2:通过western印迹使用抗人IgG Fc部分和抗人(左图)颗粒酶B(右图)抗体分析经农杆菌渗入4天后的25μg本氏烟草叶提取物。使用不含p19沉默抑制基因的根癌农杆菌(A.t.)LBA4404表达融合蛋白。50ng人血清IgG(Sigma,I5154)用作阳性对照(C+)。在还原(+DTT)或非还原条件(-DTT)下进行4-20%丙烯酰胺SDS-PAGE。L表示蛋白质阶梯(分子量大小标记)。整合蛋白大小用星号表示。单体整合大小用Δ表示。
图3:通过western印迹使用抗人IgG Fc部分抗体分析经农杆菌渗入4天后的40μg本氏烟草叶提取物。50ng人血清IgG(Sigma,I5154)用作阳性对照(人血清IgG)。在非还原条件下进行4-20%丙烯酰胺SDS-PAGE。表达的构建体在相应泳道顶部示出。L表示蛋白质梯(分子量大小标记)。整合蛋白大小用星号表示。
图4:体外细胞毒性和结合
A:通过WST-1测定的体外细胞毒性。将10μl纯化的scFv-Fc-LINK1-TOX2在40μl生长培养基中稀释,之后加入Raji细胞上,所述scFv-Fc-LINK1-TOX2其中LINK1可被枯草杆菌蛋白酶样前蛋白转化酶家族切割,TOX2抑制蛋白质合成,scFv-Fc结合在B细胞上表达的细胞表面蛋白质。温育72小时后,通过光密度读数观察到存活率。DMSO(5%)或triton(2%)作为阳性对照。使用仅缓冲液对照(10μl于40μl生长培养基中)标准化scFv-Fc-LINK1-TOX2和阳性对照的效果。
B:通过ELISA的结合能力分析。抗原已包被在96孔微孔板上。将50μl纯化的构建体温育1小时。加入山羊抗人Fc抗体HRPO用于检测。50μl特异性裸mAb用作阳性对照(线性红色曲线)。50μl非特异性裸mAb用作阴性对照(线性灰色曲线)。FCS=弗林蛋白酶切割位点,GB=颗粒酶B。
图5:通过western印迹使用抗人IgG Fc部分和抗人(左图)颗粒酶B(右图)抗体分析共培养3天后的25μg烟草(Nicotiana tabacum)植物细胞提取物。根癌农杆菌(A.t.)LBA4404携带具有p19沉默抑制基因的二元质粒,用于表达融合蛋白。在非还原条件下进行4-20%丙烯酰胺SDS-PAGE。L表示蛋白质梯(分子量大小标记)。整合蛋白大小用星号表示。
图6:通过western印迹使用抗人IgG Fc部分抗体分析33μL烟草5天龄的稳定植物细胞提取物。选择的稳定表达scFv-Fc-FCS-颗粒酶B的植物细胞系已用于细胞提取物分析。在非还原条件下进行4-20%丙烯酰胺SDS-PAGE。L表示蛋白质梯(分子量大小标记)。整合蛋白大小用星号表示。
图7:由人细胞(左图)和烟草植物或细胞(右图)产生的N-糖基化模式。
图8:(左图)通过western印迹使用抗人IgG Fc抗体分析共培养3天后的33μL烟草植物细胞提取物。根癌农杆菌(A.t.)LBA4404携带具有p19沉默抑制基因的二元质粒,用于表达融合蛋白。(右图)通过western印迹使用抗人IgG Fc部分抗体分析经农杆菌渗入4天后的40μg本氏烟草叶提取物。在非还原条件下进行4-20%丙烯酰胺SDS-PAGE。表达的构建体在相应泳道的顶部示出。TOX2表示来自本文公开的毒素类别2的毒素(蛋白质合成抑制剂)。L表示蛋白质梯(分子量大小标记)。整合蛋白大小用星号表示。
图9:根据本发明的结合物-毒素形式的结构。
9A-C:毒素融合于抗体链的C末端。A:(scFv-FC)-(切割位点)-毒素/原毒素;B:HC加LC-(切割位点)-毒素/原毒素,和C:LC加HC-(切割位点)-毒素/原毒素。
9D-G:毒素融合于抗体链的N末端。
scFv-FC是如本文所讨论的特定抗体形式。LC是IgG抗体的轻链。HC是IgG抗体的重链。CS表示切割位点,Tox表示毒素/原毒素。不同链之间的横条代表二硫键。
图10:肽糖型分析结果。为了证实取自本文公开的抗体并包含N-糖基化位点的肽具有将其与哺乳动物产生的蛋白质分开的特征性糖型,使用了本氏烟草的不同株,其中一些通过RNA干扰(RNAi)技术进行了糖工程化(Material provided by NOMAD BioscienceGmbH,Munich),以获得内源性β-1,2-木糖基转移酶(XylT)和α1,3-岩藻糖基转移酶(FucT)的靶向下调,图10示出在不同株中产生的这两种肽的MS谱。
图11:切割测定的结果。scFv-Fc-FCS-GB(FCS=弗林蛋白酶切割位点,GB=颗粒酶B)已从本氏烟草表达。农杆菌渗入4天后,通过蛋白质A色谱法从叶提取物中纯化蛋白质。纯化的材料已暴露于重组弗林蛋白酶。在还原条件下进行4-20%丙烯酰胺SDS-PAGE。L表示蛋白质梯(分子量大小标记)。切割后产生的游离GB蛋白用星号表示。重组蛋白April用作切割对照。April的切割相关条带由Δ表示。
图12:通过SDS PAGE考马斯蓝的纯化蛋白分析。从本氏烟草表达一些构建体。在农杆菌渗入4天后,通过蛋白质A色谱法从叶提取物中纯化蛋白质。将7μl纯化的蛋白质加入7μl加样缓冲液(2×)中。然后将12μl加样于相应的孔中。在非还原条件下进行4-20%丙烯酰胺SDS-PAGE。L表示蛋白质梯(分子量大小标记)。整合蛋白大小用星号表示。
图13:通过SDS PAGE考马斯蓝的纯化蛋白分析。从本氏烟草表达一些构建体。农杆菌渗入4天后,通过蛋白质A色谱法从叶提取物中纯化蛋白质。将7μl纯化的蛋白质加入7μl加样缓冲液(2×)中。然后将12μl加样于相应的孔中。在还原条件下进行4-20%丙烯酰胺SDS-PAGE。L表示蛋白质梯(分子量大小标记)。整合蛋白大小用星号表示。
发明详述
在详细描述本发明之前,应理解本发明不限于所描述装置的特定组成部分或所描述方法的过程步骤,因为这种装置和方法可以变化。还应理解,本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的,并不旨在进行限制。必须注意的是,如在说明书和所附权利要求中使用的,单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括单数和/或复数所指对象,除非上下文另外明确指示。此外应当理解,在给出由数值界定的参数范围的情况下,该范围被认为包括这些限定值。
还应理解的是,本文公开的实施方案并不意味着被理解为彼此不相关的单独实施方案。一个实施方案讨论的特征也在本文所示的其它实施方案相关地公开。在一种情况下,如果某特定特征在一个实施方案中未公开,但是在另一个实施方案中公开,本领域技术人员将理解这并不一定意味着所述特征在所述其他实施方案中公开。本领域技术人员将理解,本申请的主旨是所述特征也为其它实施方案公开,但是仅仅为了清楚的目的以及将说明书保持在易控制的篇幅而未公开。
此外,在此引用的现有技术文献的内容并入本文作参考。这尤其是指公开的标准或常规方法的现有技术文件。在这种情况下,通过并入作参考的主要目的是提供充分的可实现公开,及避免冗长重复。
根据本发明的第一方面,提供了一种产生结合物-毒素融合蛋白的方法,
a)一种选自下组的蛋白质结合物:
·抗体
·保留靶结合能力的抗体片段或衍生物,或
·抗体模拟物,
b)任选地,肽接头,和
c)至少一种蛋白质毒素或蛋白质原毒素
所述方法包括以下步骤:
(i)将植物细胞或整株植物与核酸构建体接触,所述核酸构建体至少包含可操作连接的以下:
A)至少一种编码所述蛋白质结合物或其靶结合链或结构域的多核苷酸,以及
B1)编码可切割肽接头的多核苷酸和编码蛋白质毒素的多核苷酸,或
B2)编码蛋白质原毒素的多核苷酸,所述原毒素包含用于其激活的可切割结构域,
(ii)使所述构建体整合到所述植物细胞或所述整株植物的一或多个细胞的核中,和
(iii)表达由所述核酸构建体编码的融合蛋白。
发明人惊奇地发现,通过这种方法,可以大规模和高生产率地生产重组结合物-毒素融合蛋白。
如本文所用,术语“植物”(包括由其衍生的细胞)涉及藻类(包括绿藻门和轮藻门/链藻门(Streptophyta),以及中斑藻纲(Mesostigmatophyceae)、绿方藻纲(Chlorokybophyceae)和螺带鼓藻属(Spirotaenia)),还涉及陆生植物(有胚植物),包括裸子植物(Gymnospertms)和被子植物,包括单子叶植物和双子叶植物。
在一个实施方案中,与所述核酸构建体接触的植物或植物细胞不是叶绿体,或不是藻类的叶绿体,特别是不是莱茵衣藻的叶绿体。在另一个实施方案中,与所述核酸构建体接触的植物或植物细胞中的结构不是叶绿体,或不是藻类的叶绿体,特别是不是莱茵衣藻的叶绿体。
如本文所用,术语“蛋白质毒素”或“蛋白质原毒素”是指涵盖细胞毒性和/或细胞生长抑制蛋白质,或其前变体。
如本文所用,术语“细胞生长抑制蛋白”是指可以抑制细胞增殖或细胞分裂而不必须杀死细胞的蛋白质。适当地,所述细胞生长抑制剂抑制肿瘤细胞的增殖。
如本文所用,术语“细胞毒性蛋白质”是指对细胞有害并最终导致细胞死亡的蛋白质。在一些实施方案中,所述细胞毒性蛋白质快速伤害分裂的细胞例如肿瘤细胞并导致肿瘤细胞死亡,尤其是肿瘤细胞死亡的同时对非肿瘤细胞不造成损害或造成较少损害。
术语“蛋白质毒素”或“蛋白质原毒素”是指但不限于根据其化学性质是蛋白质(即长度≥50个氨基酸残基的肽)或多肽(即长度为≥10至≤50个氨基酸残基的肽)。在本发明的含义中,原毒素是毒素的前体,也称为潜伏毒素,其需要被激活,例如通过切除抑制性氨基酸序列、或通过经历构象变化而被激活。术语“原毒素”和“蛋白质原毒素”在此可互换使用并表示相同的主题。
基于植物的重组蛋白表达已经发展了三十多年。目前,在植物或植物细胞(如烟草或烟草细胞)中产生的一些治疗性蛋白质如单克隆抗体(mAb)已在临床试验中进行了测试并已商业化或即将商业化(Yao et al.(2015))。基于植物的重组蛋白包括抗体的表达也可以在藻类中进行(Hempel et al.,2011)。
与原核和真核细胞系统相比,植物在生产成本低、产品固有安全性、易于升级、折叠和组装复杂蛋白质的能力以及进行复杂的翻译后修饰方面具有一些优势。
此外,植物悬浮细胞培养在生产过程中提供了更高的再现性和安全性(没有已知的微生物、昆虫或哺乳动物病原体),满足当前的良好生产规范生产要求。植物悬浮细胞培养只需要简单定义的营养素用于生长,与哺乳动物或微生物系统相比,其运行成本要低得多。
如本文所用,术语“融合蛋白”是指具有与至少一种其它组分可操作地连接的肽组分并且在其结构域的组成和/或组构方面不同于天然蛋白质的蛋白质。
如本文所用,术语“可操作地连接”,当指两个或更多个多核苷酸时,是指不同的多核苷酸彼此处于功能关系中的情况。例如,如果启动子影响编码序列的转录,则所述启动子与所述编码序列可操作地连接。同样,如果信号肽影响多肽的细胞外分泌,则所述信号肽的编码序列与所述多肽的编码序列可操作地连接。根据本发明的一个实施方案,当各个多核苷酸编码不同的肽时,“可操作地连接”是指各个多核苷酸是连续的,并且在需要连接两个蛋白质编码区时,开放读框是对齐的。
如本文所用,术语“可切割肽接头”是指融合蛋白内的内部氨基酸序列,其包含连接结合物部分和毒素蛋白的残基,从而使毒素蛋白不能在靶细胞外发挥其毒性作用或限制毒素蛋白抑制细胞生长(细胞生长停滞)或导致细胞死亡(细胞毒性)的能力。以这种方式,蛋白质毒素只要在血浆中就保持无活性,直到其到达靶细胞,在此细胞毒性有效载荷将被选择性释放和/或激活(Grawunder&Stein,2017)。在靶细胞内,可切割接头序列被切割,毒素蛋白变得有活性或有毒性。本发明的融合蛋白由细胞特异性结合物部分和蛋白质毒素部分组成,这些部分通过具有特异性蛋白酶、特别是但不限于癌症特异性蛋白酶的切割识别位点的特定氨基酸残基或氨基酸序列连接,和/或在特定条件下例如但不限于酸和/或还原条件下可切割。编码特定蛋白酶的切割识别位点的序列可以在已知遍在的人蛋白酶中和/或通过检测癌症相关蛋白酶的表达来鉴定。此外,接头序列不应干扰结合物部分在细胞结合和内化到溶酶体中的作用。
术语原毒素的“可切割结构域”涉及这样的序列,其一旦通过水解或酶促切割而被切割,则激活原毒素的毒素部分。许多原毒素具有被酶或通过pH依赖性水解(例如在核内体中的内吞作用之后)特异性切割的氨基酸结构域,以便将活性毒素部分释放到细胞溶质中。这种可切割结构域双重充当“天然存在的”可切割肽接头(或“内在切割位点”),这与在毒素不包含用于激活的可切割结构域的情况下必须使用的可切割肽接头相反,例如因为其最初不作为原毒素产生。
术语“选择性激活/释放”是指在特定条件下原毒素或蛋白质毒素抑制细胞生长(细胞停滞)或导致细胞死亡(细胞毒性)的能力的激活。这种选择性激活是指蛋白质毒素的非天然或非天然发现的可修饰激活部分,其在修饰后,将无活性毒素(蛋白质原毒素)转化为活性毒素或原毒素的天然可切割接头。当可选择性修饰的激活部分是毒素融合蛋白的成分时,可修饰的激活部分的修饰可直接导致原毒素对靶细胞变得具有毒性,或可导致原毒素呈现可天然激活以变得对靶细胞具有毒性的形式。天然可激活的原毒素包括例如可修饰的激活部分的修饰,从而其对靶细胞的内源成分或靶细胞周围的环境(例如靶细胞特异性蛋白酶或遍在蛋白酶)和/或特定条件例如但不限于酸和/或还原条件是敏感的。可以使用天然或非天然和非天然发现的可修饰的激活部分将天然活性毒素修饰为在毒素融合物中是无活性的(原毒素),从而其对靶细胞的内源性成分或靶细胞周围的环境和/或特定条件例如但不限于酸和/或还原条件是敏感的。可修饰的激活部分在本发明中被定义为可切割的接头。
因此,虽然可切割的接头在活性谱方面提供优于稳定接头的明显优势,但其使用在哺乳动物、昆虫和酵母细胞中使相应结合蛋白-毒素缀合物的产生复杂化,因为接头的切割导致生产系统的自我中毒。然而,这不适用于基于植物的生产系统,因为
(i)其不切割所述接头(由于缺乏相应的蛋白酶或还原/水解条件所致),和/或
(ii)对哺乳动物或哺乳动物细胞有毒性的相应蛋白质毒素对植物或植物细胞是无毒性的。
如本文所用,术语“单克隆抗体”应指具有同质抗体群的抗体组合物,即由完整免疫球蛋白或其抗原结合片段或衍生物组成的同质群。特别优选地,这种抗体选自IgG、IgD、IgE、IgA和/或IgM,或其片段或衍生物。
如本文所用,术语“片段”应指保留靶结合能力的这种抗体的片段,例如:
·CDR(互补决定区),
·高变区,
·可变域(Fv),
·IgG重链(由VH、CH1、铰链、CH2和CH3区组成),
·IgG轻链(由VL和CL区组成),和/或
·Fab和/或F(ab)2。
如本文所用,术语“衍生物”应指在结构上不同于但仍与通常抗体概念具有某些结构关系的蛋白质构建体,例如scFv、scFv-FC、Fab和/或F(ab)2,以及双、三或更高特异性抗体构建体或单价抗体,并进一步保留靶结合能力。所有这些项目均在下文解释。
本领域技术人员已知的其它抗体衍生物是双抗体、骆驼抗体、纳米抗体、结构域抗体、具有由scFv、IgAs(由J链和分泌组分连接的两个IgG结构)组成的两条链的二价同源二聚体、鲨鱼抗体、由新世界灵长类框架加上非新世界灵长类CDR组成的抗体、包含CH3+VL+VH的二聚化构建体以及抗体缀合物(例如与毒素、细胞因子、放射性同位素或标记连接的抗体或片段或衍生物)。这些类型在文献中充分描述,本领域技术人员可以在本公开的基础上使用,增加进一步的创造性活性。
先前已经描述了产生杂交瘤细胞的方法(参见和Milstein 1975,并入本文作参考)。基本上,例如将小鼠用人可溶的鸟苷酰环化酶(sGC)蛋白免疫,然后从所述小鼠中分离B细胞并将分离的B细胞与骨髓瘤细胞融合。
产生和/或选择嵌合或人源化mAb的方法是本领域已知的。基本上,例如将来自不参与靶结合的鼠抗sGC抗体的蛋白质序列用相应的人序列置换。例如,Genentech的US6331415描述了嵌合抗体的产生,而Medical Research Council的US6548640描述了CDR移植技术,Celltech的US5859205描述了人源化抗体的产生。所有这些公开内容均并入本文作参考。
产生和/或选择完全人mAb的方法是本领域已知的。这些方法可涉及使用用人sGC免疫的转基因动物,或使用合适的展示技术,如酵母展示、噬菌体展示、B细胞展示或核糖体展示,其中在静止期针对人sGC筛选来自文库的抗体。
MorphoSys的US6300064和MRC/Scripps/Stratagene的US6248516中公开了体外抗体文库等。例如,在Dyax的US5223409中公开了噬菌体展示技术。例如,在TaconicArtemis的EP1480515A2中描述了转基因哺乳动物平台。所有这些公开内容均并入本文作参考。
IgG、scFv、scFv-FC、Fab和/或F(ab)2是技术人员熟知的抗体形式。相关的可实现技术可从相应教科书中获得。
如本文所用,术语“Fab”涉及包含抗原结合区的IgG片段,所述片段由来自抗体的每个重链和轻链的一个恒定域和一个可变域组成。
如本文所用,术语“F(ab)2”涉及由通过一或多个二硫键彼此连接的两个Fab片段组成的IgG片段。
如本文所用,术语“scFv”涉及作为免疫球蛋白重链和轻链可变区的融合物的单链可变片段,用短接头通常是丝氨酸(S)或甘氨酸(G)连接在一起。尽管去除了恒定区并导入了接头肽,但这个嵌合分子保留了原始免疫球蛋白的特异性。
如本文所用,术语“scFv-FC”涉及特定抗体形式。这种形式特别稳定,可以在植物细胞和植物中高产表达。scFv-FC构建体例如在Bujak et al(2014)中公开,其内容并入本文作参考。scFv-Fc构建体是包含例如通过一或多个二硫键彼此相连的两条链的二聚体构建体,其中每个链由如下结构组成(N至C方向):
VL-接头-VH-接头-FC,或
VH-接头-VL-接头-FC
其中VL是抗体轻链的可变区,VH是抗体重链的可变区,FC是抗体的恒定区。
使用全长IgG形抗体或scFv-Fc结合域赋予缀合物更长的半衰期。此外,当需要CDC(补体依赖性细胞毒性)或ADCC(抗体依赖性细胞毒性)激活时,抗体的Fc部分可能是最重要的。
修饰的抗体形式是例如双特异性或三特异性抗体构建体、基于抗体的融合蛋白、免疫缀合物等。这些类型在文献中均有充分描述,本领域技术人员可以在本公开的基础上使用,增加进一步的创造性活性。此外,单价抗体先前已在US 2004/0033561 A1(在其中称为monobodies)或WO2007048037中描述;这两个专利均并入本文作参考。
抗体模拟物是有机化合物,在大多数情况下是重组蛋白或肽,其与抗体一样,可以特异性结合抗原,但在结构上与抗体不相关。相对于抗体的共同优势是更好的溶解性、组织渗透性、对热和酶的稳定性以及相对低生产成本。抗体模拟物正在开发作为治疗剂和诊断剂,尤其包括Affibody分子、Affilins、泛素、Affimers、Affitins、Alphabodies、Anticalins、Avimers、DARPins、Fynomers、Kunitz结构域肽、单体和nanoCLAMPs。抗体模拟物在Gebauer and Skerra(2009)中有详细讨论,所述文献并入本文作参考。
通常,蛋白质结合物可由单链组成。例如,当蛋白质结合物是scFv抗体或scFv-FC时就是这种情况。在这种情况下,可以在单个多核苷酸上编码整个蛋白质结合物。
在另一个实施方案中,所述蛋白质结合物例如在全长IgG或F(ab)2片段中可以包含两个或更多个链。在这种情况下,条件是所述核酸构建体可以包含两个或更多个编码蛋白质结合物的不同链或结构域的多核苷酸。
在蛋白质结合物包含两个或更多个链的另一个实施方案中,条件是提供两个核酸构建体,第一个核酸构建体包含编码蛋白质结合物的第一个链、接头和毒素的三个多核苷酸,而第二个核酸构建体包含编码蛋白质结合物的第二个链的多核苷酸。
根据本发明的一个实施方案,所述方法进一步包括步骤(iv)回收和/或纯化在步骤(iii)中表达的融合蛋白。
根据本发明的另一个实施方案,所述植物或植物细胞来自烟草属(Nicotiana)。
在一个实施方案中,当使用植物时,融合蛋白的表达是瞬时表达。在另一个实施方案中,当使用植物细胞时,融合蛋白的表达是瞬时或稳定表达。
如本文所用,术语“瞬时表达”涉及在核酸(最常见的是编码表达盒的质粒DNA)被导入宿主细胞或植物后短时间表达的基因的暂时表达。
如本文所用,术语“稳定表达”涉及在核酸(最常见的是编码表达盒的质粒DNA)被导入宿主细胞的基因组(核或质体整合)后适时连续表达的基因的表达。在稳定转染的细胞中,外源基因成为基因组的一部分并因此被复制。
“诱导型启动子”可以诱导瞬时和稳定表达二者。这些启动子在存在内源或外源刺激或响应化学、环境、激素和/或发育信号而选择性表达可操作连接的DNA序列。这些调节元件是但不限于对乙醇、热、光、应激、茉莉酮、水杨酸、植物激素、盐、水灾或干旱敏感,如Abdel-Ghany et al(2015)的综述以及在US 10344290 B2中的讨论,其均并入本文作参考。诱导型启动子包括但不限于Ali et al(2019)中讨论的合成组分,所述文献的内容并入本文作参考。
烟草属包括烟草植物。已经对烟草植物或植物细胞进行测试以产生重组免疫治疗结合物-毒素融合蛋白,其由稳定接头连接至蛋白质毒素的小sFv片段组成(Francisco etal.(1997)和US6140075A)。
蛋白质融合的另一个实例是在本氏烟草中瞬时产生通过不可切割接头重组融合于scFv-Fc的人免疫细胞因子IL2(Marusic et al.(2016)。然而,通过可切割接头与强效蛋白质毒素连接的抗体的产生从未在植物系统中公开。
根据本发明进一步的实施方案,所述植物细胞是选自如下的至少一种:
·烟草cv.BY2,
·烟草NT-1,
·拟南芥(Arabidopsis thaliana),
·胡萝卜(Daucus carota),和/或
·水稻(Oyrza sativa)。
烟草cv.BY2又名烟草BY-2细胞和cv.烟草1(NT-1,BY-2的姊妹株)是非绿色快速生长植物细胞,在充足培养基和良好培养条件下,其数量可以在一周内增加高达100倍。这种烟草栽培品种作为细胞培养物保存,更特别地作为细胞悬浮培养物(一种在液体培养基中生长的特化细胞群,由科学家们培育以研究植物细胞的特定生物学性质)保存。在细胞悬浮培养中,每个细胞在培养基中独立漂浮或至多仅以短链漂浮。每个细胞均具有与其它细胞相似的性质。
所述模型植物系统可与用于人体研究的HeLa细胞相当。由于生物体相对简单且可预测,因此可以更轻松地研究生物学过程,并且可以成为了解更复杂生物体的中间步骤。它们被植物生理学家和分子生物学家用作模型生物体,也被用作高等植物的模型系统,因为其具有相对高的同质性和高生长速度,特色是仍然具有植物细胞的一般行为。自然生长的植物(体内)的任何部分中细胞类型的多样性使得非常难以研究和理解活植物细胞的一些一般的生化现象。例如,难以研究溶质转运入或转运出细胞,因为多细胞生物体中特化细胞表现不同。细胞悬浮培养物如烟草BY-2在单个细胞及其区室水平上为这些研究提供了良好的模型系统,因为烟草BY-2细胞行为彼此非常相似。相邻细胞行为的影响在悬浮液中并不像在完整植物中那样重要。因此,在施加刺激后观察到的任何变化均可以在统计上相关,并且可以确定这些变化是对刺激的反应还是仅仅是巧合。BY-2和NT-1细胞相对充分了解并经常用于研究,包括异源蛋白特别是抗体的表达(Hellwig et al(2004)。这种方法在et al.(2018)揭示,其内容并入本文作参考。
Torres(1989)讨论了建立胡萝卜细胞悬浮培养物的方法。Shaaltiel et al(2007)讨论了使用基于胡萝卜细胞的表达系统产生酶。这些文章的内容并入本文作参考。胡萝卜和水稻在Santos et al(2016)中也被讨论作为合适的基于植物细胞的表达系统,其内容并入本文作参考。Plasson et al(2009)公开了在烟草、拟南芥、水稻中产生重组蛋白,其内容并入本文作参考。
通常,本发明可以用任何植物品种实施,其中植物细胞可以用适于表达外源多肽的DNA构建体转化及在标准植物细胞培养条件下培养。尽管可以使用愈伤组织培养或其它常规植物细胞培养方法,但优选植物细胞悬浮培养或植物组织培养。
根据本发明的另一个实施方案,所述植物是本氏烟草。例如,在Daniell et al.(2001)中公开了在烟草植物中生产抗体,其内容并入本文作参考。
可用于本发明的其它植物或植物细胞包括但不限于生菜(Lactuca spp.)、菠菜(Spinacia oleracea)和拟南芥属(Arabidopsis spp.)。
根据本发明的一个进一步的实施方案,将植物细胞或整株植物与核酸构建体接触的步骤(i)包括单独使用“表达载体”或由根癌农杆菌介导的从其衍生的载体,或粒子轰击/基因枪法。
如本文所用,术语“表达载体”涉及能将核酸构建体导入植物或植物细胞中的载体,例如质粒、病毒、噬菌体、可整合DNA片段和其它运载体。可用于本方法中的表达载体为本领域熟知。术语“载体”是指包含调节元件和用于导入核酸构建体的位点的核酸分子,例如质粒。
在一些实施方案中,载体可以基于但不限于全病毒系统、解构病毒或非病毒元件。Geneware(美国专利号7,939,318中描述的平台)和MagnIcon分别是最知名的全病毒系统和解构病毒系统,在Altman et al(2011)中描述,其内容并入本文作参考。
通常使用的病毒载体可以分为基于RNA或DNA的载体。例如,RNA载体可以包括但不限于烟草花叶病毒属(例如烟草花叶病毒(TMV))、豇豆花叶病毒(CMV)、马铃薯X病毒属(例如马铃薯病毒X(PVX))或烟草脆裂病毒属(Tobravirus)(例如烟草脆裂病毒(TRV))。DNA载体通常与花椰菜花叶病毒属和双粒病毒属(Gemini-virus)相关联,包括玉米线条病毒属、曲顶病毒属(curtovirus)、番茄伪曲顶病毒属(topocuvirus)和菜豆金色黄花叶病毒属(begomovirus)。例如来自玉米线条病毒属的豆黄矮病毒(Bean Yellow dwarf)(BeYDV)和烟草黄矮病毒已被广泛使用。
或者,载体可以基于非病毒元件并包括例如合成的(Peyret et al.,2019)或来自其它蛋白质(Diamos,et al.,2016)的5’和3’非翻译区。这两篇文件的内容并入本文作参考。
重要的是要注意,载体可以是复制型的,也可以是非复制型的。此外,一旦激活调节元件,如Dugdale et al.(2013)描述的植物内激活(影响)系统,也可以诱导载体的可复制性,所述文章内容并入本文作参考。
农杆菌转染例如在Mayo et al(2006)中描述,其内容并入本文作参考。TMV转染例如在Hussain Shah et al(2013)中描述,其内容并入本文作参考。粒子轰击/基因枪法例如在Kikkert et al(2005)中公开,其内容并入本文作参考。
重要的是强调根据本发明的方法的优点不限于其中使用烟草植物或细胞系的实施方案。例如,由于可切割接头或可切割结构域被植物或植物细胞保持完整,因此缀合物可以在植物中表达的事实对于植物而言是允许缀合物表达而不伤害植物或植物细胞的普遍原则。因此,本发明的观念是适用的,可在所有可用于重组表达的植物或植物细胞中实现。
核酸可以在能在给定植物或植物细胞中表达的合适的可操作连接的启动子控制下在植物或植物细胞中表达。任何常规方法均可用于植物细胞转化、培养和再生,包括但不限于以下实施例中描述的那些。
对于核基因组的转化,可以使用常规技术。可以使用所有已知的将外源DNA瞬时或稳定导入植物细胞的方法,例如Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、电穿孔、原生质体融合、粒子枪轰击或DNA渗入细胞例如花粉、小孢子、种子和未成熟的胚中。病毒载体如双粒病毒或卫星病毒等也可用作导入手段。根癌农杆菌和发根农杆菌(rhizogenes)是导入表达载体的优选手段。在这种情况下,将本发明的序列与所有必需的调节序列例如启动子、终止子等以及在稳定植物产生的情况下选择已经整合了异源序列的转化体所需的任何序列一起导入合适的载体中。在诱导表达的特定情况下,将本发明的序列导入含有可诱导的启动子和所有必需调节序列的载体中。
可以通过核基因组的转化、或通过植物细胞的叶绿体基因组的转化或通过线粒体基因组的转化,以瞬时或稳定的方式将核酸分子导入植物细胞中。
植物细胞核基因组的转化通常使用上述靶向信号进行,其确定了其中发生蛋白质表达和/或积累的细胞区室。
除了肽之外,靶向序列还可以包含由KDEL、SEKDEL或HEKDEL肽组成的内质网驻留信号。这些信号通常存在于蛋白质的C末端并保留在成熟蛋白质上。
根据本发明的一个实施方案,肽接头或原毒素中的可切割结构域由哺乳动物细胞表达的酶或哺乳动物宿主产生的酶特异性或非特异性切割。
这种酶及其切割位点的实例在下表中示出(也见Choi et al(2012),其内容并入本文作参考)。在这个表中,参考“Merops”数据库以获取关于各个酶的更多可用信息。https://www.ebi.ac.uk/merops/index.shtml。
切割位点是由切割位点处(用↓表示)来描述的。字母x指的是所有氨基酸。当有几个优选氨基酸时,用斜线(/)隔开。
这种酶优选是蛋白酶。在一个实施方案中,所述肽接头不能被植物酶切割。
弗林蛋白酶(Furin)是属于枯草杆菌蛋白酶样前蛋白转化酶家族的一种酶,在典型碱性氨基酸序列基序Arg-X-Arg/Lys-Arg(RX(R/K)R)的C末端切割蛋白质,其中X可以是任何天然蛋白质原氨基酸。所述基序在本文中称为弗林蛋白酶切割位点。优选地,其序列为HRRRKRSLDTS。
组织蛋白酶是在所有动物以及其它生物体中发现的蛋白酶。大多数成员在溶酶体中的低pH下被激活。组织蛋白酶B能切割包含二肽基序Val-Ala(VA)的肽序列。所述基序在本文中称为组织蛋白酶B切割位点。技术人员在Turk el al(2012)中发现关于组织蛋白酶及其切割位点的足够可用信息,其内容并入本文作参考。
颗粒酶B是一种丝氨酸蛋白酶,可在独特的四肽序列切割。存在超过580个这种四肽切割位点(Wee et al.(2011))。四肽Ile-Glu-Pro-Asp(IEPD)被鉴定为体外最佳四肽切割序列。然而,关于颗粒酶B底物的新数据表明,体内切割特异性更多样化,许多底物具有超出所述四肽序列的切割特异性(VanDamme et al.(2009))。
天然颗粒酶B酶原通过用组织蛋白酶C(二肽基肽酶I)在具有以下序列的切割位点切割而被激活:DAGE’IIGG。以这种方式,激活的颗粒酶B酶具有以IIGGHE开始的N-末端,在本文中以SEQ ID NO:1示出。因此,这是根据本发明的一个实施方案使用的激活的酶的N-截短序列。
半胱天冬酶(半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸天冬氨酸酶或半胱氨酸依赖性天冬氨酸定向蛋白酶)是在程序性细胞死亡中起重要作用的蛋白酶家族。在人蛋白质组中已发现超过1500种半胱天冬酶底物。一般的切割基序是DXXD-A/G/S/T,其中X可以是任何天然的蛋白质原氨基酸。技术人员在Kumar el al(2014)中发现关于半胱天冬酶及其切割位点的足够可用信息,其内容并入本文作参考。
基质金属蛋白酶(MMP),也称为matrixins,是钙依赖性含锌内肽酶;其它家族成员是蛇毒蛋白酶、沙雷氏菌溶素(serralysins)和虾红素。总的来说,这些酶能降解所有种类的细胞外基质蛋白,但也可以处理许多生物活性分子。技术人员在Eckard el al(2016)中发现关于基质金属蛋白酶及其切割位点的足够可用信息,其内容并入本文作参考。
通常,技术人员能够通过常规考虑和参考文献选择与相应哺乳动物酶匹配的特定切割位点,以控制蛋白质毒素或原毒素的靶特异性释放。发现这些切割位点的一般指南例如在Rawlings(2016)中揭示。
根据本发明的一个实施方案,肽接头或原毒素中的可切割结构域不能被植物细胞表达的酶或植物宿主产生的酶切割。技术人员现有一些常规方法来检查是否满足该条件。见例如Wilbers et al(2016)。
根据本发明的一个实施方案,至少一种蛋白质毒素或原毒素是酶。由于蛋白质毒素通常充当酶,因此一个毒素分子可以作用于许多底物分子,从而对细胞产生多重毒性作用,这与非酶毒素相反,其通常仅对靶结构以化学计量方式起作用。
根据本发明的一个实施方案,所述蛋白质毒素是选自如下的至少一种:
(1)细胞死亡诱导蛋白(“1类毒素”)
(2)蛋白质合成抑制剂(“2类毒素”)
(3)膜扰动蛋白(“3类毒素”)
(4)细胞分裂抑制蛋白(“4类毒素”)
细胞死亡诱导蛋白包括但不限于直接或间接作用于细胞凋亡途径和/或影响核酸成分的蛋白质。根据蛋白水解和/或核分解活性,细胞死亡诱导蛋白以所有形式靶向凋亡介导的蛋白质、RNA和DNA。
蛋白质合成抑制剂类别包括阻止核糖体正常运行的蛋白质。这个类别主要但不限于由ADP-核糖基化蛋白质代表。这些蛋白质催化哺乳动物延伸因子2的ADP-核糖基化,导致其失活和阻断核糖体。
膜扰动蛋白包括但不限于成孔蛋白质。这组蛋白质插入质膜孔,使电解质和其它小分子可自由通过,以破坏膜完整性,导致细胞裂解。
细胞分裂抑制蛋白是一组通过作用于细胞骨架的元件(微管、微管蛋白、肌动蛋白)和/或作用于调节细胞周期进程的蛋白质来中断细胞周期的蛋白质。微管动态的抑制和细胞周期蛋白依赖性蛋白的改变诱导有丝分裂停滞及导致细胞去除。
根据本发明的一个实施方案,所述蛋白质毒素或原毒素是天然蛋白质毒素的去免疫化变体。例如Schmohl et al.(2015)或Grinberg and Benhar(2017)公开了通过序列修饰使蛋白质毒素去免疫的重组方法,其内容并入本文作参考。
根据一个实施方案,至少一种蛋白质毒素是哺乳动物毒素,优选选自颗粒酶,更优选颗粒酶B,或其保留所述蛋白质毒素毒性活性的片段。
颗粒酶是由细胞毒性T细胞和自然杀伤(NK)细胞内的细胞质颗粒释放的丝氨酸蛋白酶。其在靶细胞中诱导程序性细胞死亡(凋亡),从而消除已经癌变或被病毒或细菌感染的细胞。颗粒酶还可以杀死细菌并抑制病毒复制。在NK细胞和T细胞中,颗粒酶与穿孔素(perforin)一起包装在细胞毒性颗粒中。在粗内质网、高尔基复合体和反式高尔基网状结构中也可以检测到颗粒酶。细胞毒性颗粒的内容物起到允许颗粒酶进入靶细胞细胞溶质中的作用。颗粒被释放到与靶细胞形成的免疫突触中,其中穿孔素介导颗粒酶进入靶细胞的内体,最后进入靶细胞的细胞溶质中。颗粒酶是丝氨酸酯酶家族的一部分。
颗粒酶B既具有细胞死亡诱导作用,也抑制细胞分裂(Weidle et al(2014)。颗粒酶B溶细胞蛋白从内体释放后诱导凋亡。此外,颗粒酶B可以进一步切割死亡底物,如聚(ADP核糖)聚合酶、DNA依赖性蛋白激酶、细胞骨架和核有丝分裂体的成分以及参与应激反应和细胞稳态的蛋白质。
颗粒酶B通过激活半胱天冬酶(尤其是半胱天冬酶-3)来激活凋亡,半胱天冬酶切割许多底物,包括半胱天冬酶激活的DNase,以执行细胞死亡。颗粒酶B还切割蛋白Bid,后者募集蛋白Bax和Bak以改变线粒体的膜通透性,导致释放细胞色素c(其是通过凋亡体激活半胱天冬酶-9所需部分之一)、Smac/Diablo和Omi/HtrA2(其抑制凋亡蛋白(IAP)的抑制剂),以及其它蛋白质。颗粒酶B还切割在没有半胱天冬酶活性的情况下造成凋亡的许多蛋白质。其它颗粒酶通过半胱天冬酶依赖性和半胱天冬酶非依赖性机制激活细胞死亡。
除了杀死其靶细胞外,颗粒酶还可以靶向并杀死细胞内病原体。颗粒酶B切割病毒蛋白以抑制病毒激活和复制。颗粒酶直接与核酸DNA和RNA结合;这增强了其对核酸结合蛋白的切割。
在一个实施方案中,所述蛋白质毒素或原毒素对植物或植物细胞无毒性。技术人员现有一些常规方法来检查是否满足这个条件。见例如Klaine and Lewis(1995)的综述,其内容并入本文作参考。
根据本发明的另一方面,提供了用根据以上描述的方法产生的结合物-毒素融合蛋白。在进一步的实施方案中,这种结合物-毒素融合蛋白可具有如以上描述中所述的所有结构或功能限制。这尤其包括所述蛋白质结合物、接头或切割位点以及特定毒素的形式。
根据本发明的另一方面,提供了结合物-毒素融合蛋白,其至少包含:
a)选择的一种蛋白质结合物
b)任选地,肽接头,和
c)至少一种蛋白质毒素或蛋白质原毒素
其中所述结合物-毒素融合蛋白由核酸构建体编码,所述核酸构建体至少包含可操作连接的以下:
A)至少一种编码蛋白质结合物或其靶结合链或结构域的多核苷酸,以及
B1)编码可切割肽接头的多核苷酸和编码蛋白质毒素的多核苷酸,或
B2)编码蛋白质原毒素的多核苷酸,所述原毒素包含用于其激活的可切割结构域。
同样,在进一步的实施方案中,这种结合物-毒素融合蛋白可具有如以上描述中所述的所有结构或功能限制。这尤其包括所述蛋白质结合物、接头或切割位点以及特定毒素的形式。
根据本发明的一个实施方案,所述蛋白质包含至少一种植物特异性N-聚糖。N-聚糖是与蛋白质、主要是Asn-X-Thr或Asn-X-Ser(NXT或NXS)基序中的天冬酰胺(Asn)残基的酰胺基连接的聚糖,其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。Gomord et al.(2010)公开了典型的植物特异性N-聚糖,与哺乳动物N-聚糖模式明显不同。见图7。
根据本发明的一个实施方案,所述蛋白质结合物与人CD20结合。在一个实施方案中,所述蛋白质结合物是抗体、保留靶结合能力的抗体片段或衍生物、或抗体模拟物。
在一个实施方案中,所述结合物包括以下至少一种:
a)包含如利妥昔单抗(C2B8)中所包含的3个重链CDR和3个轻链CDR的集合,
b)上述a)的重链CDR/轻链CDR集合,条件是至少一个CDR相对于a)中指定的相应CDR具有最多3个氨基酸取代,同时保持其结合人CD20的能力,
c)上述a)的重链CDR/轻链CDR组合,条件是至少一个CDR相对于a)中指定的相应CDR具有≥66%的序列相同性,同时保持其结合人CD20的能力。
其中CDR嵌入合适的蛋白质框架中以能结合人CD20。
利妥昔单抗(也称为C2B8)和公开其序列的不同专利包含在Storz U(2014),其内容并入本文作参考。
利妥昔单抗的全长序列在本文中示为SEQ ID NO:4(重链)和SEQ ID NO:5(轻链)。利妥昔单抗的可变结构域在例如EP2000149B1的权利要求1和图4和5中公开,其内容并入本文作参考。
对应于利妥昔单抗的CDR的序列例如在下文示出的SEQ ID NO:9-14中公开。
在一些实施方案中,至少一个CDR相对于相应CDR具有≥67%、优选≥68%、更优选≥69%、≥70%、≥71%、≥72%、≥73%、≥74%、≥75%、≥76%、≥77%、≥78%、≥79%、≥80%、≥81%、≥82%、≥83%、≥84%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98任一或最优选≥99%的序列相同性。
在另一个实施方案中,至少一个CDR已经通过亲和力成熟或其它修饰被修饰,与上文公开的序列相比产生序列修饰。
在一些实施方案中,至少一个CDR相对于a)或b)中指定的相应CDR具有最多2个、优选1个氨基酸取代。
在一个实施方案中,所述结合物包括以下至少一种:
a)如在利妥昔单抗(C2B8)中包含的重链/轻链可变域对,
b)上述a)的重链/轻链可变结构域对,条件是至少一个结构域相对于a)具有≥80%的序列相同性
c)上述a)的重链/轻链可变结构域序列对,条件是至少一个结构域相对于a)分别具有最多10个氨基酸取代,
同时保持其与人CD20结合的能力。
在一些实施方案中,至少一个结构域相对于利妥昔单抗(C2B8)的重链/轻链可变结构域对具有≥81%、优选≥82%、更优选≥83%、≥84%、≥85%、≥86%、≥87%、≥88%、≥89%、≥90%、≥91%、≥92%、≥93%、≥94%、≥95%、≥96%、≥97%、≥98或最优选≥99%的序列相同性。
在一些实施方案中,至少一个结构域相对于利妥昔单抗(C2B8)的重链/轻链可变结构域对具有最多9个、优选最多8个、更优选最多7、6、5、4、3或2个、最优选最多1个氨基酸取代。
根据本发明的一些实施方案,单链双抗体中的至少一个氨基酸取代是保守氨基酸取代。
在一个实施方案中,所述蛋白质结合物
·与上述定义的蛋白质结合物之一相比,与人CD20的靶结合亲和性≥50%,和/或
·与上述定义的蛋白质结合物之一竞争结合人CD20。
如本文所用,术语“靶结合亲和性”是指根据本发明的结合分子对其靶的亲和性,使用“KD”值以数字方式表示。通常,较高的KD值对应较弱的结合。在一些实施方案中,“KD”通过放射性标记抗原结合测定(MA)或表面等离子共振(SPR)测定使用例如BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000进行测量。在某些实施方案中,还用表面等离子共振(SPR)技术确定了“结合速率(on-rate)”或“结合的速率”或“结合速率(association rate)”或“kon”以及“解离速率”或“解离的速率”或“解离速率(dissociation rate)”或“koff”。在另外的实施方案中,“KD”、“kon”和“koff”使用系统测量。
如本文所用,在提及由如上序列定义的抗体之一中使用术语“竞争结合”,是指当前抗体结合相同靶、或靶表位或结构域或亚结构域的活性与所述序列定义的抗体一样,并且是后者的变体。所述结合效率(例如动力学或热力学)可以等于或大于或小于后者的效率。例如,两种抗体结合底物的平衡结合常数可能不同。
如本文所用,术语“保持与给定靶结合的能力”是指例如与未修饰肽的靶结合亲和性相比,相应变体具有≥50%的靶结合亲和性。
在此上下文中,如本文所用,“保守氨基酸取代”对抗体功能的影响小于非保守取代。尽管有多种方法分类氨基酸,但通常根据其结构和R基团的一般化学特征将其分为六大类。
在一些实施方案中,“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换。例如,本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有如下侧链的氨基酸:
·碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸),
·酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸),
·不荷电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸),
·非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸),
·β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和
·芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
其它保守的氨基酸取代也可以发生在氨基酸侧链家族中,例如当用天冬酰胺取代天冬氨酸以修饰肽的电荷时。保守改变还可包括化学同源的非天然氨基酸的取代(即合成的非天然疏水性氨基酸代替亮氨酸,合成的非天然芳香族氨基酸代替色氨酸)。
“序列相同性百分比”通过在比较窗口内比较两个最佳比对的序列而确定,其中与不包含添加或缺失的参考序列(例如多肽)相比,所述比较窗口中所述多核苷酸序列的部分可包含添加或缺失(即缺口),以用于两个序列的最佳比对。通过确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数量,得出匹配位置的数量,将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数,并将结果乘以100以得出序列相同性百分比。
在进一步的实施方案中,所述结合物-毒素融合蛋白具有以下结构之一:
·(scFv-FC)-(切割位点)-毒素/原毒素(二聚体)
·两个HC和两个LC-(切割位点)-毒素/原毒素的四聚体
·两个LC和两个HC-(切割位点)-毒素/原毒素的四聚体
这种结构例如在图9中示出,其中CS是指切割位点,而Tox是指毒素/原毒素。HC代表IgG抗体的重链,LC代表IgG抗体的轻链。scFv-FC代表scFv-FC构建体。
在进一步的实施方案中,所述结合物-毒素融合蛋白具有以下结构之一(N->C方向):
·(scFv-FC)-CS-毒素(二聚体)(->与FC区域C末端连接的毒素)(见图9A)
·两个HC和两个LC-CS-毒素的四聚体(->与LC的C末端连接的毒素)(见图9B)
·两个LC和两个HC-CS-毒素的四聚体(->与HC的C末端连接的毒素)(见图9C)
·毒素-CS-(scFv-FC)(二聚体)(->与scFv的N末端连接的毒素)(见图9D)
·两个HC和两个毒素-CS-LC的四聚体(->与LC的N末端连接的毒素)(见图9E)
·两个LC和两个毒素-CS-HC的四聚体(->与HC的N末端连接的毒素)(见图9F)
·毒素-CS-(-FC-scFv)(二聚体)(->与FC的N末端连接的毒素)(见图9G)
其中,CS代表“切割位点”,在一个实施方案中是弗林蛋白酶切割位点。
在一个实施方案中,毒素是颗粒酶B。
在进一步的实施方案中,所述结合物-毒素融合蛋白包含如下至少之一:
根据另一个实施方案,所述结合物-毒素融合蛋白包含如下至少之一:
·SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:17所示氨基酸序列
·两个SEQ ID NO:4所示氨基酸序列(C2B8的HC)和两个SEQ ID NO:6所示氨基酸序列(C2B8的LC-FCS-颗粒酶B)
·两个SEQ ID NO:7所示氨基酸序列(C2B8的HC-FCS-颗粒酶B)和两个SEQ ID NO:5所示氨基酸序列(C2B8的LC)。
关于第一个选项,所述结合物-毒素融合蛋白可以包含两个所述序列,通过至少一个二硫键相互关联。
关于第二个和第三个选项,所述结合物-毒素融合蛋白可以包含两个这种序列对,通过一组二硫键相互缀合。
根据本发明的另一方面,提供了一种药物组合物,其至少包含任何上述的融合蛋白,以及任选存在的一或多种药学上可接受的赋形剂。
根据本发明的另一方面,提供了一种组合,其包含(i)根据上述的融合蛋白或根据上述的药物组合物和(ii)一或多种治疗活性化合物。
根据本发明的进一步实施方案,提供了根据上述的结合物-毒素融合蛋白、或根据上述的组合物、或根据上述的组合,用于治疗如下的人或动物对象(的药物的制备):
·患有
·有发生风险,和/或
·经诊断为
发生肿瘤性疾病,或用于预防这种病症。
根据本发明的另一方面,提供了治疗如下的人或动物对象的方法:
·患有
·有发生风险,和/或
·经诊断为
发生肿瘤性疾病,或用于预防这种病症,所述方法包括施用治疗有效量的根据上述的结合物-毒素融合蛋白,或根据上述的组合物,或根据上述的组合。
在这方面,重要的是要强调植物产生的N-聚糖与例如哺乳动物产生的那些N-聚糖明显不同。特别地,烟草植物产生的N-聚糖具有:
·通过α3糖苷键(而不是哺乳动物中的α6)与近端N-乙酰基-葡糖胺残基缀合的岩藻糖残基,
·通过β2糖苷键与近端甘露糖残基缀合的木糖残基,
·两个远端N-乙酰基-葡萄糖胺残基,每个残基通过α3糖苷键携带岩藻糖残基,通过β3糖苷键携带半乳糖残基(而不是哺乳动物中的神经氨酸)。
另一方面,在例如藻类中重组表达的蛋白质通常缺乏任何类型的糖基化。然而,藻类能表达IgG形抗体或具有一个或多个二硫键的抗体片段。
因此,通过上述新方法产生的结合物-毒素结合物还具有与在不同表达系统中产生的结合物-毒素结合物相比新的结构特征。见例如图7中关于烟草植物产生的N-聚糖的图示。
实施例
虽然已经在附图和前文描述中详细示例和描述了本发明,但是这种示例和描述被认为是说明性的或示例性的而不是限制性的;本发明不限于所公开的实施方案。通过研究附图、公开内容和所附权利要求,本领域技术人员在实践权利要求保护的发明时可以理解和实现公开的实施方案的其它变化。在权利要求中,“包括”一词不排除其它要素或步骤,不定冠词“一个”或“一种”不排除复数。在相互不同的从属权利要求中叙述某些措施的事实并不表示这些措施的组合不能有利地使用。权利要求中的任何参考标记不应被解释为限制范围。
本文公开的所有氨基酸序列均从N-末端至C-末端示出;本文公开的所有核酸序列均以从5’至3’末端示出。
材料和方法
遗传构建体
全长利妥昔单抗HC和LC序列已用于开发基于mAb的结合物-毒素融合蛋白。利妥昔单抗序列的重链和轻链的可变部分序列已组装在单链scFv中并与人IgG1 Fc部分序列融合。然后使用人弗林蛋白酶切割序列将人颗粒酶B序列融合在全长利妥昔单抗的LC或HC的C末端部分或scFv-Fc的C末端部分,以获得HC+LC-FCS-颗粒酶B、HC-FCS-颗粒酶B+LC和scFv-c-FCS-颗粒酶B融合蛋白序列。另一种结合物-毒素融合蛋白用连接于颗粒酶B的scFv-Fc部分而没有切割位点实现以获得scFv-Fc-颗粒酶B。这些序列通过基因合成产生,侧翼是XbaI和IsceI。
pPZP200二元质粒的骨架用于构建新的二元质粒pPZP-ATB,其连续包含一个nptII卡那霉素抗性盒、一个(scFv-Fc形式)或两个(mAb形式)感兴趣基因表达盒和一个GFP表达盒。使用XbaI和IsceI将编码利妥昔单抗HC和LC、LC-FCS-GB、HC-FCS-GB、scFv-Fc-FCS-GB、scFv-Fc-GB的ORF导入合适的二元质粒中的花椰菜花叶病毒p35S启动子(p35S)和土壤杆菌胭脂碱合酶终止子(tNOS)之间。还产生了pPZP-ATB二元质粒的一个版本,其包括在感兴趣的基因和GFP盒之间的番茄丛矮病毒p19基因表达盒。
在本氏烟草植物叶中瞬时表达
将本氏烟草在16小时光照/8小时黑暗光周期、22℃+/-3℃下生长。将7-8周龄植物叶通过注射器侵润瞬时转化。通过以3500g离心10分钟收集携带pPZP-ATB-scFv-Fc-F-GB或pPZP-ATB-scFv-Fc-F-GB-p19二元质粒的达到在600nm光密度(OD600)为大约0.8-1.0的根癌农杆菌LBA4404(pBBR1MCS-5.virGN54D)或GV3101(pMP90RK)。最后,将细菌在浸润缓冲液(10mM MgCl2、10mM MES、100μM乙酰丁香酮,pH 5.6)中调整至OD600为0.5,使用无针注射器浸润混合物。在农杆菌渗入后4天和6天收获浸润区域。农杆菌渗入后4天收获全部叶子用于蛋白A纯化。
在烟草(N.tabacum)细胞中表达
如其内容并入本文作参考的Nagata et al.(1992)所述,将烟草植物悬浮细胞在130rpm、25℃在植物培养基中生长5天。通过以2000g离心5分钟收集携带pPZP-ATB二元质粒的达到600nm光密度(OD600)约为0.8-1.0的根癌农杆菌LBA4404(pBBR1MCS-5.virGN54D)。然后将植物细胞和细菌细胞在共培养培养基中共培养30分钟,然后以2000g离心5分钟。去除上清液后,将细胞铺在固体共培养培养基上两天。在瞬时转化的情况下,然后收集细胞并洗涤3次,在收获用以进一步分析之前,在含有头孢噻肟和羧苄青霉素(Carbeniclin)的植物培养基中培养。在稳定转化的情况下,在固体共培养2天后,洗涤细胞并铺板在含有选择性卡那霉素和头孢噻肟和羧苄青霉素抗生素的植物培养基上。4周后选择愈伤组织并在固体培养基或液体悬浮培养物中传代培养用于后续分析。
蛋白质分析:ELISA、SDS-PAGE和Western印迹
将收集的叶片组织(120mg)在400μL提取缓冲液(250mM山梨糖醇、60mM Tris、Na2EDTA、0.6%Polyclar AT、1mM PMSF、pH8.0,补加2μg/mL的每种蛋白酶抑制剂:亮抑酶肽、抑肽酶、抗蛋白酶素(antipain)、胃酶抑素A、胰凝乳蛋白酶抑制剂)中研磨。将匀浆后的组织在4℃以18200g离心40分钟。然后回收上清液,在液氮中冷冻并储存在-20℃。
通过Western印迹分析提取的组织。将蛋白质在还原性或非还原性SDS加样缓冲液(80mM Tris-HCl,pH 6.8,2%SDS,10%甘油,0.005%溴酚蓝,补加1mM PMSF和蛋白酶抑制剂混合物:各2μg/mL的亮抑酶肽、抑肽酶、抗蛋白酶素、胰凝乳蛋白酶抑制剂和胃酶抑素)中煮沸5分钟,以13000rpm离心5分钟,并通过SDS-PAGE(4-20%聚丙烯酰胺)分离。对于Western印迹,使用半干电泳装置(Biorad Trans-Blot Turbo)将蛋白质电转移到PVDF膜(Biorad)上;然后,将膜在室温用在TBST缓冲液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.5%Tween20,pH 7.5)中的3%(w/v)脱脂奶粉封闭1小时,然后在室温与1:10.000稀释的针对抗人IgGFc特异性区域的HRP缀合的抗体(A0170;Sigma-Aldrich)或与1:10.000稀释的针对抗人颗粒酶B一抗(EPR20129-217;Abcam)的HRP缀合的抗体温育(TBS-Tween 0.1%+0.5%脱脂奶粉)1小时。抗颗粒酶B抗体之后是HRP缀合的抗兔抗体(0545;Sigma),稀释度为1:10000。通过增强化学发光(Amersham Imager 600/GE;GE Healthcare)检测蛋白质。
抗CD20 ELISA
对于抗CD20缀合物特异性分析,通过96孔微孔板(Greiner)分析植物提取物,将所述微孔板在37℃用100μL的5μg/mL CD20(AcroBiosystems)包被2小时,然后在洗涤缓冲液(TBS Tween 0,1%)洗涤5次。然后在室温用在TBS pH8.0中200μL 1%BSA封闭30分钟,然后洗涤5次。加样100μL抗CD20对照抗体以实现在5至0μg/mL之间的校准曲线,将100μL样品在室温加样于相同的96孔平板上2小时,以用于比较,然后洗涤5次。加样100μL的1/150,000稀释的检测抗体(山羊抗人HRPO,Bethyl),在室温温育1小时。然后用100μL的TMB反应缓冲液(Zentech)进行30分钟显色,最后用1M H3PO4终止。然后通过光谱法在450nm分析酶活性。
进一步的ELISA
为了对特异于未公开的抗原(在人细胞表面表达的结构,在某些癌症中过表达,本文称为抗原X)的缀合物进行特异性分析,将包含针对X的结合物的纯化的结合物-毒素融合蛋白通过96孔微孔板(Greiner)进行分析。将所述孔用50μl抗原X(2.5μg/mL)在37℃包被1小时,然后用250μL洗涤缓冲液(PBS Tween 0.1%)洗涤5次。然后在室温用在PBST中的150μL水解酪蛋白(hydrocasein)(3.6%)封闭30分钟,然后洗涤5次。加样50μL抗抗原对照抗体以实现5至0μg/mL之间的校准曲线,将50μL样品加样于相同的96孔板上,在室温下进行1小时的比较,然后洗涤5次。加样50μL的1/200,000稀释的检测抗体(山羊抗人HRPO,Bethyl),在室温温育1小时。然后用50μL TMB反应缓冲液(Zentech)显色15分钟,最后用1M H3PO4终止。然后通过光谱法在450nm分析酶活性。结果如图4B所示。
蛋白质A纯化
农杆菌渗入4天后,收集叶片、称重并在搅拌机中研磨,每克新鲜的农杆菌渗入的叶子使用2mL提取缓冲液(250mM山梨糖醇、60mM Tris、Na2EDTA、0.6%Polyclar AT、1mMPMSF,pH8.0,补加2μg/mL每种蛋白酶抑制剂:亮抑酶肽、抑肽酶、抗蛋白酶素、胃酶抑素A、胰凝乳蛋白酶抑制剂)。然后将混合物通过双层Miracoth(Millipore)层过滤。然后将滤液在4℃以20.000g离心30分钟。将上清液加样于用提取缓冲液预平衡的蛋白A树脂上。然后用10倍柱体积的60mM Tris pH8.0洗涤树脂,并使用直接用10%Tris 1M pH8.0缓冲的100mM甘氨酸pH3.0进行洗脱。收集富集的蛋白质级分并在液氮中冷冻。
体外细胞毒性测定
通过体外细胞毒性测定(MTT)评估抗CD20抗体利妥昔单抗和基于利妥昔单抗的缀合物对靶细胞Raji(CD20+)和非靶细胞Loucy(CD20)的影响。简言之,培养Raji和Loucy细胞系,以1.105个细胞/50μL的密度重悬于无FBS培养基中,将50μl细胞悬液分装到96孔平底板中。然后,将利妥昔单抗和包含利妥昔单抗的缀合物与不同浓度的细胞在37℃、5%CO2温育6、24和48小时。对于每个时间点,使用MTT试剂盒测定法(Roche)评估细胞毒性。通过测量550nm吸光度计算细胞存活。计算一式三份测定的存活平均值。
进一步的体外细胞毒性测定
使用细胞增殖试剂WST-1(Merck,5015944001)评估包含针对未公开的抗原X的结合物的纯化的结合物-毒素融合蛋白对细胞系存活的影响。WST-1(4-[3-(4-碘苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-5-四唑]-1,3-苯二磺酸盐)是线粒体脱氢酶的底物,被裂解为甲臜(formazan)。形成的甲臜染料的量与培养物中代谢活性细胞的数量直接相关。
将细胞以30,000个细胞/孔的密度接种在96孔微滴定板中50ml生长培养基中。通过将10ml结合物-毒素融合蛋白或缓冲液加入40ml生长培养基中制备结合物-毒素融合蛋白或缓冲液的稀释液,将混合物与细胞温育。一式两份测试结合物-毒素融合蛋白。缓冲液和阳性对照(2%Triton和5%DMSO)一式三份进行测试。
在37℃和5%CO2条件下温育72小时后,将10ml细胞增殖试剂WST-1(Merck,5015944001)加入每个孔中,并将平板在37℃和5%CO2条件下再温育4小时。通过读取平板在450nm和690nm的OD来量化甲臜染料以进行背景扣除。
为确定未处理的细胞和用结合物-毒素融合蛋白处理的细胞和阳性对照的存活百分比,计算用缓冲液处理的孔的平均OD值(OD450nm-OD690nm),设置为100%存活。结果如图4A所示。
肽糖形分析
为证实用根据本发明的方法制备的结合物-毒素融合蛋白在结构上不同于在其它表达系统例如哺乳动物中制备的结合物-毒素融合蛋白,分析了使用不同本氏烟草株制成的肽和(的糖形,两者均包含粗体标示的N-糖基化位点,在本文中以SEQ ID NO:15和16示出,包含于本文公开的一些结合物-毒素融合蛋白中。ATB_3和ATB_4是野生型,ATB_22和ATB_24被内源性β1,2-木糖基转移酶(XylT或XT)和α1,3-岩藻糖基转移酶(FucT或FT)基因的RNAi敲低(方法参见Strasser et al(2008),其内容并入本文作参考)。
植株名称 | ATB_3 | ATB_4 | ATB_22 | ATB_24 |
注解 | 野生型 | 野生型 | ΔXT/FT | ΔXT/FT |
简言之,将样品在溶液中消化。蛋白质用碘乙酰胺S-烷基化并用胰蛋白酶(Promega)消化。
将消化后的样品加样于BioBasic C18柱(BioBasic-18,150x 0.32mm,5μm,ThermoScientific)上,使用80mM甲酸铵缓冲液作为水相溶剂。在45分钟内应用从5%B(B:80%ACCN)至40%B的梯度,然后以6μL/分钟的流速从40%B至90%B的15分钟梯度以促进大肽洗脱。使用配备标准ESI正离子源的QTOF MS(Bruker maXis 4G)进行检测,DDA模式(=切换到MSMS模式以洗脱峰)。记录MS扫描(范围:150-2200Da)并选择3个最高峰进行片段化。使用ESI校准混合物(Agilent)进行仪器校准。三种可能的糖肽被鉴定为由肽部分和附着的N-聚糖组成的一组峰,在HexNAc单元、己糖、脱氧己糖和戊糖残基的数量上有所不同。这些糖肽的理论质量是通过使用氨基酸和单糖的单同位素质量的电子数据表确定的。
使用DataAnalysis 4.0(Bruker)进行人工糖肽搜索。为量化不同糖形,使用前四个同位素峰的EIC(提取的离子色谱图)的峰面积。
切割测定
在纯化的scFv-Fc-FCS-GB(结合物-毒素融合蛋白)上加入重组弗林蛋白酶后,已在体外证明了使毒素释放的可切割性。在35μl切割缓冲液(20mM Hepes、Triton X-1000.1%、1mM CaCl2,pH7.5)中将25单位/ml弗林蛋白酶(NEB P8077S)加入6微克结合物-毒素融合蛋白,在25℃反应过夜。切割已通过SDS Page考马斯蓝凝胶(4-20%聚丙烯酰胺)可视化。来自小鼠的增殖诱导配体(APRIL)用作弗林蛋白酶切割的对照。将APRIL(SRP3189-Sigma-Aldrich,20μg冻干蛋白)重悬于20μL含有0.1%BSA的水中。
结果
在这项研究中,我们设计了几种重组结合物-毒素融合蛋白,其由通过可切割接头与毒素融合的结合部分组成,并成功地在植物细胞或整株植物中表达。基于利妥昔单抗(C2B8)的全长mAb、scFv-Fc形式和scFv形式用作结合部分。Storz(2014)中描述了利妥昔单抗及其序列。具有氨基酸序列HRRRKRSLDTS的弗林蛋白酶切割序列(FCS)用作可切割接头。用与天然颗粒酶B重组连接的scFv-Fc而没有切割序列构建的另一种结合物-毒素融合蛋白也用作重组非可切割接头的实例。人颗粒酶B用作有效载荷示例。有效载荷位置可因结合部分而异,在本研究中,我们举例说明了颗粒酶B在全长mAb重链或轻链的C末端的融合。
已经构建了几种基于scFv-Fc形式的重组结合物-毒素融合蛋白:scFv-Fc-FCS-颗粒酶B、scFv-Fc-颗粒酶B,也构建了单独的scFv-Fc作为对照。已经构建了两种基于全长mAb的结合物-毒素融合蛋白:HC+LC-FCS-颗粒酶B、HC-FCS-颗粒酶B+LC。未缀合的mAb也单独构建为对照。
下表概括了本文产生的缀合物:
每个DNA构建体的DNA序列均经过植物密码子优化,并导入pPZP-ATB农杆菌二元转化载体中的花椰菜花叶病毒p35S启动子(p35S)和农杆菌胭脂碱合酶终止子(tNOS)之间。Rouwendal et al.(1997)公开了烟草植物中密码子优化的方法,其内容并入本文作参考。
将相同构建体也导入带有一个用于沉默抑制基因p19的补充表达盒的pPZP-ATB-p19中。在这个实施例中,插入了一个额外的新霉素磷酸转移酶II(nptII)卡那霉素抗性盒以用于稳定克隆选择。所有构建体均被电穿孔到根癌农杆菌LBA4404或GV3101中。
整株植物表达系统
农杆菌菌株首先用于通过用编码scFv-Fc-F-颗粒酶B缀合物的构建体的注射器农杆菌渗入法瞬时转化本氏烟草。然后在农杆菌渗入后(dpa)4天和6天,使用抗人IgG Fc部分抗体(图1)通过western印迹分析农杆菌渗入的植物组织提取物。评估使用根癌农杆菌LBA4404或农杆菌GV3101菌株以及收获日和p19共表达对融合蛋白表达的影响。当使用根癌农杆菌LBA4404菌株表达时(图1,泳道1和2),所述融合蛋白在农杆菌渗入4天后表达并且似乎基本完整。在农杆菌渗入或使用GV3101菌株6天后似乎出现更多降解产物。与仅在p19存在下示出表达的GV3101菌株(图1,泳道6和8)相比,当使用LBA4404进行时,加入p19基因沉默阻抑物对于表达似乎无影响(图1,泳道2和4)。关于收获时间,农杆菌渗入6天后出现更多降解片段(图1,泳道3、4和8)。
scFv-Fc-FCS-颗粒酶B融合蛋白由两个80kDa单体形式组成,产生大约160kDa的完整二聚体形式。如图1(左图)所用,在根癌农杆菌LBA4404感染后,在还原(+DTT)和非还原(-DTT)条件下使用针对人IgG Fc部分(图2,左)或人颗粒酶B(图2,右)的特异性检测mAb通过对蛋白质提取物的western印迹鉴定了每种单体成分。全尺寸scFv-Fc-FCS-颗粒酶B的检测(图2)通过使用抗IgG Fc部分(左图,-DTT)检测到约250kDa的信号以及通过使用抗颗粒酶B抗体检测到相同大小的信号(右图,-DTT)而证实。请注意,大约150kDa的人血清IgG也会产生大约250kDa的信号。在还原条件下,单体形式也被抗IgG Fc抗体和抗颗粒酶B抗体二者检测到,信号在70至100kDa之间(左右图上以Δ标示),接近80kDa的单体预期大小。
其它形式的结合物-毒素融合蛋白已使用根癌农杆菌LBA4404在本氏烟草中瞬时表达,植物叶提取物如图3所示。检测到预期大小的scFv-Fc-FCS-颗粒酶B、scFv-Fc-颗粒酶B。此外,还检测到预期大小的基于完整mAb的结合物-毒素融合蛋白HC-FCS-颗粒酶B+LC。
植物细胞表达系统
农杆菌菌株也用于瞬时转化烟草(Nicotiana tabacum)cv.Bright Yellow 2细胞(BY-2细胞)。不同结合物-毒素融合蛋白已在烟草cv.BY-2中瞬时表达。然后使用抗Fc-人IgG通过western印迹分析细胞内提取物。
scFv-Fc-FCS-颗粒酶B的表达鉴别已在图5中得到证实,通过抗人IgG Fc部分和抗颗粒酶B抗体检测到大小约为250kDa的二聚体全尺寸融合蛋白。
这些结合物-毒素融合蛋白也可以在植物悬浮细胞中稳定表达。例如,我们通过与农杆菌菌株共培养进行了烟草cv.BY-2植物细胞稳定转化。在这种情况下,使用卡那霉素抗性盒选择稳定的植物细胞克隆。图6示出稳定的植物悬浮细胞中scFv-FCS-颗粒酶B结合物-毒素融合蛋白以整合预期大小存在,表明这种分子可以在植物细胞系统中稳定表达。
一种由scFv-Fc、弗林蛋白酶切割位点和毒素家族2中的毒素组成的新的结合物-毒素融合蛋白(scFv-Fc-FCS-TOX2)也在植物细胞(图8,左图)和在整株植物中(图8,右图)中成功表达。TOX2是来自本文公开的2类毒素(蛋白质合成抑制)。全尺寸结合物-毒素融合蛋白以其预期大小检测到,类似于上文已经提出的scFv-Fc-FCS-颗粒酶B。
总之,这些数据证实了由通过人可切割序列连接于细胞毒性蛋白质有效载荷的蛋白质结合物组成的结合物-毒素融合蛋白可在整株植物或植物细胞系统中产生。
植物细胞中产生的scFv-Fc-GB缀合物的结合功能已通过抗CD20 Elisa评估,其亲和性与利妥昔单抗的亲和性相当(数据未示出)。还对CD20+细胞(Raji细胞)进行了体外细胞毒性测定。期待与利妥昔单抗相比具有相似或改善的细胞毒性。这些结果表明scFv-Fc-GB的Fc部分是功能性的并且对被靶向的细胞表现出生物学细胞毒性。
肽糖形分析
鉴定的主要糖形是复合型聚糖(GnGn/GnGnXF)。还检测到其它糖形(Man5-Man9、GnGnF、GnGnX、MMXF、Man5Gn和GnM(X)(F))。表1列出了结构及其相对比例。所有样品均包含非糖基化肽。
MS谱中的峰高大致反映了糖形的摩尔比(请注意,每个糖形存在一种以上的电荷态)。表1和表2示出不同糖形的定量(通过前4个同位素峰的EIC积分定量)。对于不同糖形缩写的解释,见Strasser et al(2008),其内容并入本文作参考。
请注意,给出了一种可能的异构体,所使用的方法仅给出了聚糖的组成。对于聚糖名称,使用了原聚糖(proglycan)命名法(http://www.proglycan.com/protein-glycosylation-analysis/nomenclature)。另见参考文件“What′s your name,sugar?-Asimple abbreviation system for complex N-glycan structures”。
根据这个命名法,MGnX是指例如:
参考文献
·Daniell H et al.,Trends Plant Sci.2001 May;6(5):219–226.
·Gomord V et al.,(2010),.Plant Biotechnology Journal,8:564-587
·Storz U,MAbs.2014 Jul-Aug;6(4):820-37
·Nagata,T et al.,(1992).International Review of Cytology(Vol.132,pp.1-30).
·Schmohl J et al,Toxins(Basel).2015 Oct;7(10):4067–4082.
·Yehudit Grinberg Y and Benhar I,Biomedicines.2017 Jun;5(2):28.
·Grawunder,Ulf,and Stefan Barth,eds.Next Generation Antibody DrugConjugates(ADCs)and Immunotoxins.Springer,2017
·Yao,Jian,et al.,International journal of molecular sciences 16.12(2015):28549-28565
·Yin,Jiechao,et al.Journal of biotechnology 127.3(2007):335-347.
·Alewine,Christine,Raffit Hassan,and Ira Pastan.The oncologist(2015):theoncologist-2014.
·Guo,Rui,et al.International journal of pharmaceutics 511.1(2016):538-549.
·Mathieu-Rivet,Elodie,et al.Frontiers in plant science 5(2014):359.
·Mohamedali,Khalid A.,et al.Molecular cancer therapeutics(2013).
·Drake,Penelope M.,and David Rabuka.Current opinion in chemicalbiology 28(2015):174-180.
·Peyret,H.,Brown,J.K.,&Lomonossoff,G.P.(2019).Plant methods,15(1),108.
·Diamos,A.G.,Rosenthal,S.H.,&Mason,H.S.(2016).Frontiers in plantscience,7,200.
·Peters,Christina,and Stuart Brown.Bioscience reports(2015):BSR20150089.
·Parslow,Adam C.,et al.Biomedicines 4.3(2016):14.
·Rouwendal,G.J.,Mendes,O.,Wolbert,E.J.et al.Plant Mol Biol(1997)33:989.
·Kikkert JR et al.(2005),Methods in Molecular Biology 286:61-78
·Mayo KJ et al.Nat Protoc.2006;1(3):1105-11.
·Hussain Shah K et al,Plant Mol Biol Report.2013;31(6):1529–1538.
·Gebauer and Skerra,Curr Opin Chem Biol.2009 Jun;13(3):245-55.
·Francisco JA.,et al.,Binder-toxin fusion protein chemistry 8.5(1997):708-713.
·Marusic C et al.,Plant biotechnology journal 14.1(2016):240-251.
·Wee LJKet al,BMC Genomics.2011;12(Suppl 3):S11.
·Van Damme P et al,Mol Cell Proteomics.2009 Feb;8(2):258-72.
·Santos R et al.,Front.Plant Sci.,Front.Plant Sci.,11 March 2016
·Klaine,S.J.and M A.Lewis.Algal And Plant Toxicity Testing.1995Chapter 8,in Hoffman et al(eds),Handbook of Ecotoxicology.Lewis Publishers,Boca Raton,FL,163-184,(1995).
·Turk V et al,Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Proteins andProteomics,Volume 1824,Issue 1,January 2012,Pages 68-88
·Kumar S et al,PLoS One.2014;9(10):e110539
·Eckard U et al,Matrix Biology,Volume 49,January 2016,Pages 37-60
·Rawlings ND,Biochimie,Volume 122,March 2016,Pages 5-30
·Torres,K.C.(1989).In Tissue Culture Techniques for HorticulturalCrops(pp.161-163).Springer,Boston,MA.)
·Shaaltiel,Y et al.,(2007)Plant biotechnology journal,5(5),579-590
·Plasson,C et al.,(2009),Recombinant Proteins From Plants(pp.145-161).Humana Press.
·Bujak E et al.,Methods Mol Biol.2014;1131:315-34
·Choi,KY,et al.,Theranostics 2.2(2012):156.
·Wilbers,RH et al,Plant biotechnology journal,14(8),1695-1704
·Weidle,UH et al,Cancer Genomics-Proteomics,11(2),67-79
·Hellwig,S et al.,Nature biotechnology,22(11),1415
·Strasser R et al.,Plant Biotechnology Journal(2008)6,pp.392–402
·What′s your name,sugar?-A simple abbreviation system for complex N-glycan structures–Anon,2007Hussain Shah et al(2013)
·Dugdale,Benjamin,et al.,The Plant Cell 25.7(2013):2429-2443
·Hempel F et al.,PLoS One.2011;6(12)
·Abdel-Ghany S.E.(2015).Engineering of plants for the production ofcommercially important products:approaches and accomplishments.In Plantbiology and biotechnology(pp.551-577).Springer.
·Ali,S.,&Kim,W.C.(2019).A fruitful decade using synthetic promotersin the improvement of transgenic plants.Frontiers in plant science,10.
·Altman,A.,&Hasegawa,P.M.(Eds.).(2011).Plant biotechnology andagriculture:prospects for the 21st century.Academic press.
本文所用缩写词
HC=抗体重链
LC=抗体轻链
TOX=毒素
CS=切割位点
FCS=弗林蛋白酶切割位点
LINK=接头/切割位点
LINK2:2类接头(=细胞溶质切割位点)
LINK3:3类接头(=细胞表面切割位点)
GB=颗粒酶B
TOX2:2类毒素(=蛋白质合成抑制)
TOX3:3类毒素(=膜扰动蛋白)
scFv:单链形式
scFv-FC:scFv-FC-形式
序列
以下序列构成本申请公开内容的一部分。本申请还提供了与WIPO ST 25兼容的电子序列表。为免生疑问,如果下表中的序列与电子序列表中的序列存在差异,则应认为这个表中的序列是正确的序列。
Claims (19)
1.一种产生结合物-毒素融合蛋白的方法,所述融合蛋白至少包含:
a)选自以下的一种蛋白质结合物
·抗体
·保留靶结合能力的抗体片段或衍生物,或
·抗体模拟物,
b)任选地,肽接头,和
c)至少一种蛋白质毒素或蛋白质原毒素
所述方法包括以下步骤:
(i)将植物细胞或整株植物与核酸构建体接触,所述核酸构建体至少包含可操作连接的以下:
A)至少一种编码所述蛋白质结合物或其靶结合链或结构域的多核苷酸,以及
B1)编码可切割肽接头的多核苷酸和编码蛋白质毒素的多核苷酸,或
B2)编码蛋白质原毒素的多核苷酸,所述原毒素包含用于其激活的可切割结构域,
(ii)使所述构建体整合到所述植物细胞或所述整株植物的一或多个细胞的核中,和
(iii)表达由所述核酸构建体编码的所述融合蛋白。
2.权利要求1的方法,其还包括以下步骤:
(iv)回收和/或纯化步骤(iii)中表达的所述融合蛋白。
3.前述权利要求任一项的方法,其中所述植物或植物细胞来自烟草属(Nicotiana)。
4.前述权利要求任一项的方法,其中所述肽接头或原毒素中的可切割结构域可由哺乳动物细胞表达的酶或哺乳动物宿主产生的酶特异性或非特异性切割。
5.前述权利要求任一项的方法,其中所述可切割接头或原毒素中的可切割结构域包含选自以下的至少一个切割位点:
a)内体和/或溶酶体蛋白酶切割位点,
b)胞质蛋白酶切割位点,和/或
c)细胞表面蛋白酶切割位点。
6.前述权利要求任一项的方法,其中所述肽接头或原毒素中的可切割结构域不能被植物细胞表达的酶或植物宿主产生的酶切割。
7.前述权利要求任一项的方法,其中至少一种蛋白质毒素或原毒素是酶。
8.前述权利要求任一项的方法,其中所述蛋白质毒素是选自以下的至少一种:
(1)细胞死亡诱导蛋白,
(2)蛋白质合成抑制剂,
(3)膜扰动蛋白,
(4)细胞分裂抑制蛋白。
9.前述权利要求任一项的方法,其中至少一种蛋白质毒素是哺乳动物毒素或其保留所述蛋白质毒素毒性活性的片段,所述毒素优选选自颗粒酶类,更优选是颗粒酶B。
10.用权利要求1至9任一项的方法产生的结合物-毒素融合蛋白。
11.结合物-毒素融合蛋白,其至少包含:
a)选择的一种蛋白质结合物,
b)任选地,肽接头,和
c)至少一种蛋白质毒素或蛋白质原毒素,
其中所述结合物-毒素融合蛋白由核酸构建体编码,所述核酸构建体至少包含可操作连接的以下:
A)至少一种编码所述蛋白质结合物或其靶结合链或结构域的多核苷酸,以及
B1)编码可切割肽接头的多核苷酸和编码蛋白质毒素的多核苷酸,或
B2)编码蛋白质原毒素的多核苷酸,所述原毒素包含用于其激活的可切割结构域。
12.权利要求11的结合物-毒素融合蛋白,所述蛋白包含至少一种植物特异性N-聚糖。
13.权利要求11至12任一项的结合物-毒素融合蛋白,其中所述蛋白质结合物结合人CD20。
14.权利要求11至13任一项的结合物-毒素融合蛋白,其具有以下结构之一:
·(scFv-FC)-CS-毒素(二聚体),
·两个HC和两个LC-CS-毒素的四聚体,
·两个LC和两个HC-CS-毒素的四聚体,
·毒素-CS-(scFv-FC)(二聚体),
·两个HC和两个毒素-CS-LC的四聚体,
·两个LC和两个毒素-CS-HC的四聚体,
·毒素-CS-(-FC-scFv)(二聚体)。
15.权利要求11至14任一项的结合物-毒素融合蛋白,其包含以下之一的至少一个:
·SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列,
·两个SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列(C2B8的HC)和两个SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列(C2B8的LC-FCS-颗粒酶B),
·两个SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列(C2B8的HC-FCS-颗粒酶B)和两个SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列(C2B8的LC)。
16.一种药物组合物,其至少包含权利要求11至15任一项的融合蛋白和任选存在的一或多种药学上可接受的赋形剂。
17.一种组合,其包含(i)权利要求11至15任一项的融合蛋白或权利要求16的药物组合物,和(ii)一或多种进一步的治疗活性化合物。
18.权利要求11至15任一项的结合物-毒素融合蛋白,或权利要求16的组合物,或权利要求17的组合,用于治疗人或动物对象(的药物的制备),所述人或动物对象:
·患有
·处于发生如下的危险中,和/或
·经诊断为
发生肿瘤性疾病,或者用于预防这种病症。
19.一种治疗人或动物对象的方法,所述对象:
·患有
·处于发生如下的危险中,和/或
·经诊断为
发生肿瘤性疾病,或用于预防这种病症,所述方法包括施用治疗有效量的权利要求11至15任一项的结合物-毒素融合蛋白,或权利要求16的组合物,或权利要求17的组合。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP19157839 | 2019-02-18 | ||
EP19157839.2 | 2019-02-18 | ||
CN202080029119.5A CN113728107B (zh) | 2019-02-18 | 2020-02-18 | 在植物细胞或整株植物中产生结合物-毒素融合蛋白的方法 |
PCT/EP2020/054263 WO2020169620A1 (en) | 2019-02-18 | 2020-02-18 | Method of producing a binder-toxin fusion protein in a plant cell or a whole plant |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202080029119.5A Division CN113728107B (zh) | 2019-02-18 | 2020-02-18 | 在植物细胞或整株植物中产生结合物-毒素融合蛋白的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115925972A true CN115925972A (zh) | 2023-04-07 |
Family
ID=65717705
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202080029119.5A Active CN113728107B (zh) | 2019-02-18 | 2020-02-18 | 在植物细胞或整株植物中产生结合物-毒素融合蛋白的方法 |
CN202210858173.1A Pending CN115925972A (zh) | 2019-02-18 | 2020-02-18 | 在植物细胞或整株植物中产生结合物-毒素融合蛋白的方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202080029119.5A Active CN113728107B (zh) | 2019-02-18 | 2020-02-18 | 在植物细胞或整株植物中产生结合物-毒素融合蛋白的方法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220090113A1 (zh) |
EP (1) | EP3927831A1 (zh) |
JP (2) | JP7150999B2 (zh) |
KR (1) | KR102398485B1 (zh) |
CN (2) | CN113728107B (zh) |
BR (1) | BR112021016348A2 (zh) |
CA (1) | CA3128793C (zh) |
IL (1) | IL285719B (zh) |
WO (1) | WO2020169620A1 (zh) |
ZA (1) | ZA202105654B (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TW202210632A (zh) * | 2020-05-28 | 2022-03-16 | 日商中外製藥股份有限公司 | 經改良之顆粒酶b變體 |
IL300701A (en) | 2020-08-17 | 2023-04-01 | Atb Therapeutics | Immunotoxin-containing immunotoxin-containing or renase |
WO2023156634A1 (en) | 2022-02-17 | 2023-08-24 | Atb Therapeutics | Recombinant immunotoxin comprising a ribosome inactivating protein |
CN114605556B (zh) * | 2022-03-10 | 2023-04-14 | 南开大学 | 一种增强植物根系募集功能细菌的融合蛋白及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US6548640B1 (en) | 1986-03-27 | 2003-04-15 | Btg International Limited | Altered antibodies |
US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
AU634186B2 (en) | 1988-11-11 | 1993-02-18 | Medical Research Council | Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors |
US5859205A (en) | 1989-12-21 | 1999-01-12 | Celltech Limited | Humanised antibodies |
US5736137A (en) | 1992-11-13 | 1998-04-07 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma |
US6140075A (en) | 1994-07-25 | 2000-10-31 | Monsanto Company | Method for producing antibodies and protein toxins in plant cells |
ES2176484T3 (es) | 1995-08-18 | 2002-12-01 | Morphosys Ag | Bancos de proteinas/(poli)peptidos. |
US7053202B2 (en) | 2001-10-19 | 2006-05-30 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Immunoglobulin DNA cassette molecules, monobody constructs, methods of production, and methods of use therefor |
US20030204862A1 (en) | 2002-03-05 | 2003-10-30 | Ralf Kuehn | Inbred embryonic stem-cell derived mice |
AU2003237528A1 (en) | 2002-06-07 | 2003-12-22 | Kentucky Bioprocessing, Llc | Flexible vaccine assembly and vaccine delivery platform |
TW200732350A (en) | 2005-10-21 | 2007-09-01 | Amgen Inc | Methods for generating monovalent IgG |
EP2215247B1 (en) * | 2007-11-13 | 2014-09-24 | The Scripps Research Institute | Production of cytotoxic antibody-toxin fusion in eukaryotic algae |
WO2011137245A2 (en) * | 2010-04-30 | 2011-11-03 | Esperance Pharmaceuticals, Inc. | Lytic-peptide-her2/neu (human epidermal growth factor receptor 2) ligand conjugates and methods of use |
WO2011156535A1 (en) | 2010-06-09 | 2011-12-15 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Regulatory sequences for modulating transgene expression in plants |
JP6548630B2 (ja) | 2013-03-12 | 2019-07-24 | モレキュラー テンプレーツ, インク.Molecular Templates, Inc. | 特定の細胞型の選択的死滅のための細胞標的化結合領域と志賀毒素aサブユニット領域とを含む細胞毒性タンパク質 |
WO2016187585A1 (en) * | 2015-05-20 | 2016-11-24 | Viventia Bio Inc. | Deimmunized linker and methods of use |
-
2020
- 2020-02-18 JP JP2021548219A patent/JP7150999B2/ja active Active
- 2020-02-18 IL IL285719A patent/IL285719B/en unknown
- 2020-02-18 BR BR112021016348A patent/BR112021016348A2/pt unknown
- 2020-02-18 EP EP20704343.1A patent/EP3927831A1/en active Pending
- 2020-02-18 CN CN202080029119.5A patent/CN113728107B/zh active Active
- 2020-02-18 WO PCT/EP2020/054263 patent/WO2020169620A1/en active Search and Examination
- 2020-02-18 CN CN202210858173.1A patent/CN115925972A/zh active Pending
- 2020-02-18 US US17/431,374 patent/US20220090113A1/en active Pending
- 2020-02-18 KR KR1020217027132A patent/KR102398485B1/ko active IP Right Grant
- 2020-02-18 CA CA3128793A patent/CA3128793C/en active Active
-
2021
- 2021-08-05 ZA ZA2021/05654A patent/ZA202105654B/en unknown
-
2022
- 2022-07-27 JP JP2022119504A patent/JP2022176933A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113728107B (zh) | 2022-06-24 |
CN113728107A (zh) | 2021-11-30 |
KR20210120051A (ko) | 2021-10-06 |
CA3128793C (en) | 2023-02-28 |
JP2022518614A (ja) | 2022-03-15 |
JP7150999B2 (ja) | 2022-10-11 |
EP3927831A1 (en) | 2021-12-29 |
BR112021016348A2 (pt) | 2021-11-23 |
CA3128793A1 (en) | 2020-08-27 |
ZA202105654B (en) | 2023-04-26 |
IL285719A (en) | 2021-10-31 |
KR102398485B1 (ko) | 2022-05-16 |
WO2020169620A1 (en) | 2020-08-27 |
US20220090113A1 (en) | 2022-03-24 |
JP2022176933A (ja) | 2022-11-30 |
IL285719B (en) | 2022-07-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN113728107B (zh) | 在植物细胞或整株植物中产生结合物-毒素融合蛋白的方法 | |
ES2395842T3 (es) | Composiciones y métodos para la humanización y optimización de N-glicanos en plantas | |
Satheeshkumar | Expression of single chain variable fragment (scFv) molecules in plants: a comprehensive update | |
Loos et al. | Expression of antibody fragments with a controlled N-glycosylation pattern and induction of endoplasmic reticulum-derived vesicles in seeds of Arabidopsis | |
Loos et al. | Production of monoclonal antibodies with a controlled N‐glycosylation pattern in seeds of Arabidopsis thaliana | |
Villani et al. | Plant pharming of a full‐sized, tumour‐targeting antibody using different expression strategies | |
Rodríguez et al. | Transient expression in tobacco leaves of an aglycosylated recombinant antibody against the epidermal growth factor receptor | |
Yang et al. | Toward stable genetic engineering of human O-glycosylation in plants | |
Ko et al. | Production of antibodies in plants: approaches and perspectives | |
Marusic et al. | Expression, intracellular targeting and purification of HIV Nef variants in tobacco cells | |
Phakham et al. | Functional characterization of pembrolizumab produced in Nicotiana benthamiana using a rapid transient expression system | |
US20090041776A1 (en) | Production of cancer-specific antibodies in plants | |
US20230310557A1 (en) | Recombinant immunotoxin comprising a ribotoxin or rnase | |
Wang et al. | Expression of bioactive anti-CD20 antibody fragments and induction of ER stress response in Arabidopsis seeds | |
Jin et al. | Low binding affinity and reduced complement-dependent cell death efficacy of ofatumumab produced using a plant system (Nicotiana benthamiana L.) | |
US9024110B2 (en) | Methods for glyco-engineering plant cells for controlled human O-glycosylation | |
Bouaziz et al. | A stable cytosolic expression of VH antibody fragment directed against PVY NIa protein in transgenic potato plant confers partial protection against the virus | |
WO2023156634A1 (en) | Recombinant immunotoxin comprising a ribosome inactivating protein | |
Lonoce | Production of tumour-targeting antibodies in hairy root cultures | |
Heidari et al. | Improvement in the stability and functionality of Nicotiana tabacum produced recombinant TRAIL through employment of endoplasmic reticulum expression and ascorbate buffer mediated extraction strategies | |
Dorokhov et al. | Plant platform for therapeutic monoclonal antibody production | |
Westerhof | Plants as a production platform for high-value proteins | |
Boonyayothin | Production and characterization of anti-receptor activator of nuclear factor kappa-b ligand monoclonal antibody from nicotiana benthamiana | |
Lombardi | Plant production of a tumour-targeting human IgG. Considerations on expression strategies, glycosylation profile and in planta proteolysis | |
Nworji | Characterisation of Transgenic Tobacco Plants Expressing Synthetic Mouse Prion Protein |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |