JP2022554304A

JP2022554304A - 二重特異性結合剤を用いる表面タンパク質の分解

Info

Publication number: JP2022554304A
Application number: JP2022525466A
Authority: JP
Inventors: エー．ウェルズジェイムズ; ディー．コットンアダム; グエンデュイ; パンスカタリナ
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2019-11-01
Filing date: 2020-10-30
Publication date: 2022-12-28
Also published as: CA3159745A1; KR20220091559A; AU2020376928A1; BR112022008201A2; MX2022005241A; WO2021087338A1; EP4051715A4; EP4051715A1; CN114867752A; US20240026031A1

Abstract

本開示は、とりわけ、標的の表面タンパク質および膜結合性ユビキチンＥ３リガーゼに結合する二重特異性結合剤または免疫複合体を用いてユビキチン経路で標的の表面タンパク質を分解する方法に関する。本開示はまた、標的の表面タンパク質に結合して、ユビキチンＥ３リガーゼ活性を示す操作された膜貫通タンパク質を用いてユビキチン経路で標的の表面タンパク質を分解する方法に関する。本開示はまた、二重特異性結合剤および操作された膜貫通タンパク質、免疫複合体、それらをコードする核酸、前記核酸で遺伝的に修飾された宿主細胞を作製するのに有用な組成物および方法、ならびに細胞の活性を調節する方法および／または癌などの様々な病気を治療する方法を提供する。【選択図】図１

Description

関連する出願の参照
本願は、２０１９年１１月１日に提出された米国特許仮出願第62/929,674号の恩恵を主張するものであり、その全内容を参照により本明細書に組み込む。

表または付録のASCIIファイルとして提出されたコンピュータープログラム一覧である「配列一覧」の参照
２０２０年１０月３０日に048536-670001WO_SequenceListing_ST25に記載された２１３，４５５バイトの配列リスト（マシン形式：IBM-PC, MS Windowsオペレーティングシステム）を参照により本明細書に組み込む。

連邦政府支援による研究開発に関する陳述
本発明は、政府の支援を受け、国立衛生研究所から供与された助成金P41 CA196276およびR35 GM122451により行われた。政府は本発明に特定の権利を有する。

本開示は、一般に、ユビキチン経路を用いて細胞表面の表面タンパク質を分解する新規な方法および薬剤に関する。本開示はまた、前記薬剤、前記薬剤をコードする核酸、前記核酸で遺伝的に修飾された宿主細胞を作製する方法、細胞の活性を調節する方法、および／または癌などの様々な病気を治療する方法を提供する。

悪性腫瘍細胞は、増殖効果または免疫抑制効果を有する表面タンパク質を発現することが多い。例えば、腫瘍によっては増殖を刺激する成長因子受容体（HER2またはHER3）を過剰発現する。免疫チェックポイントタンパク質（例えば、PD-L1およびCTLA-4)が過剰発現すると、自然免疫応答が抑制される。これにより、悪性細胞が増殖し、宿主の免疫系をかいくぐって腫瘍が形成される。

現在の治療法は、これら表面タンパク質に特異的に結合して、結合中は表面タンパク質の活性を阻害する抗体および抗体誘導体を用いて、この問題に対処している。しかしながら、よりよい効果（例えば、より持続する効果）のある治療および／または癌と戦う応答効果を高め、かつ／あるいは増殖効果または免疫抑制効果を有する表面タンパク質に対抗することにより癌細胞または腫瘍細胞を標的する治療が必要とされている。本明細書で提供される本開示は、これらの問題に対処し、またさらなる解決策を提供する。

本明細書で引用されるすべての参考文献および特許は、本明細書ですべて記載されたものとして参照によりその全内容が組み込まれる。

本開示では、ユビキチン経路を用いて標的表面タンパク質の除去および分解を促進する新規な治療方法および薬剤が記載される。本明細書で記載されるのは、標的表面タンパク質と膜結合性ユビキチンＥ３リガーゼの両方に結合する二重特異性結合剤で、前記二重特異性結合剤の結合により前記標的表面タンパク質はユビキチン化された後、分解される。また、本明細書で記載されるのは、標的表面タンパク質結合ドメインを有するＥ３リガーゼ誘導体で、このＥ３リガーゼ誘導体が標的細胞の細胞膜に存在すると標的表面タンパク質はユビキチン化される。

本開示の一態様は、Ｅ３リガーゼに特異的に結合する第一の結合ドメイン、および標的細胞の標的タンパク質上の細胞外エピトープに特異的に結合する第二の結合ドメインを含む二重特異性結合剤で、前記Ｅ３リガーゼおよび前記標的タンパク質の両方は膜結合性である。一実施形態は、前記二重特異性結合剤が前記Ｅ３リガーゼと前記標的タンパク質の両方に結合すると、前記標的タンパク質をユビキチン化する二重特異性結合剤である。一実施形態は、前記標的細胞が腫瘍細胞である二重特異性結合剤である。一実施形態は、前記細胞が乳癌、B細胞リンパ腫、膵臓癌、ホジキンリンパ腫、卵巣癌、前立腺癌、中皮腫、肺癌、非ホジキンB細胞(B-NHL)、メラノーマ、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、神経芽細胞腫、神経膠腫、膠芽細胞腫、膀胱癌、および結腸直腸癌からなる群より選択される癌細胞である、二重特異性結合剤である。一実施形態は、前記標的タンパク質が免疫チェックポイントタンパク質である、二重特異性結合剤である。一実施形態は、前記標的タンパク質がPD-L1、PD-1、CTLA-4、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、KIR、LAG3、NKG2D、TIM-3、VISTA、およびSIGLEC7からなる群より選択される、二重特異性結合剤である。いくつかの実施形態では、前記二重特異性結合剤の第一の結合ドメインは、Ｅ３リガーゼに結合させた細胞外タンパク質に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、前記二重特異性結合剤の第一の結合ドメインは、Ｅ３リガーゼと相互作用する膜貫通タンパク質に特異的に結合する。前記二重特異性結合剤の特定の実施形態において、前記標的タンパク質の分解は、標的細胞の増殖能力を低減する。タンパク質によっては、例えば、A2aRは免疫系を調節する、すなわち、CD8免疫応答および増殖を促進することがある。前記二重特異性結合剤の特定の実施形態において、前記標的タンパク質は、HER2、CD19、CD20、PD-L1、EGFR、CTLA-4、MMP14、およびCDCP1からなる群より選択される。

他の実施形態では、前記二重特異性結合剤のＥ３リガーゼは膜貫通タンパク質を含む。例えば、いくつかの実施形態では、前記Ｅ３リガーゼは貫通膜Ｅ３リガーゼを含む。例示的ないくつかの実施形態では、前記Ｅ３リガーゼは、RNF43、RNF128(GRAIL)、ZNRF3。およびMARCH11からなる群より選択される。一実施形態は、前記第一の結合ドメインと前記第二の結合ドメインがそれぞれ独立して、半抗体（half antibodies）、単一ドメイン抗体、ナノボディ、単一特異的Fab₂、scFv、scFv－Fc、ミニボディ、IgNAR、V-NAR、hcIgG、VhH、ラクダ抗体、およびペプチボディからなる群より選択されるか、前記第一の結合ドメインと前記第二の結合ドメインは共に二重特異性抗体、二重特異性ダイアボディ、二重特異性Fab₂、二重特異性ラクダ抗体、または二重特異性ペプチボディを形成する、二重特異性結合剤である。一実施形態は、二重特異性抗体を含む二重特異性結合剤である。一実施形態は、二重特異性IgGを含む二重特異性結合剤である。一実施形態は、ノブ・アンド・ホール(knob and hole)二重特異性IgGを含む二重特異性結合剤である。一実施形態は、前記第一の結合ドメインはFabを含み、前記第二の結合ドメインは単鎖Fabを含む、二重特異性結合剤である。一実施形態は、前記第一の結合ドメインはFabを含み、前記第二の結合ドメインはscFvを含む、二重特異性結合剤である。いくつかの実施形態では、前記第一の結合ドメインは、配列番号１２または３２０で示される重鎖フレームワーク領域（FR）配列および配列番号１１または３１９によって示される軽鎖FR配列を含む。いくつかの実施形態では、前記第二の結合ドメインは配列番号１２または３２０で示される重鎖FR配列および配列番号１１または３１９によって示される軽鎖FR配列を含む。

いくつかの実施形態では、前記第一の結合ドメインは、それぞれ表２に示される配列を含む軽鎖可変領域CDR3(LC-CDR3)配列、重鎖可変領域CDR1(HC-CDR1)配列、HC-CDR2配列、およびHC-CDR3配列を含む。いくつかの実施形態では、前記第二の結合ドメインは、それぞれ表3に示されるLC-CDR3配列、HC-CDR1配列、HC-CDR2配列、HC-CDR3配列を含む。

いくつかの実施形態では、前記二重特異性結合剤の第一の結合ドメインは重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、前記VHは配列番号３２１で示されるFR配列を含み、前記二重特異性結合剤の第二の結合ドメインは配列番号１２または３２０で示される重鎖FR配列と配列番号１１または３１９で示される軽鎖FR配列を含む。

いくつかの実施形態では、前記第一の結合ドメインは、それぞれ表４に示されるVH-CDR1、VH-CDR2、およびVH-CDR3配列を含み、前記第二の結合ドメインは、それぞれ表３に示される配列を含むLC-CDR3配列、HC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3配列を含む。

本開示の一態様は、Ｅ３リガーゼに特異的に結合する第一の結合ドメイン、および標的細胞の標的タンパク質上の細胞外エピトープに特異的に結合する第二の結合ドメインを含み、前記Ｅ３リガーゼおよび前記標的タンパク質の両方が膜結合性である前記二重特異性結合剤の何れか１つをコードする核酸である。一実施形態は、さらにベクターを含む核酸である。一実施形態は、前記二重特異性結合剤をコードする配列に操作可能に（operably）結合されたプロモーターをさらに含む核酸である。

本開示の一態様は、上述した、あるいは本明細書で記載される二重特異性結合剤の何れか１つをコードする核酸を含むベクターである。一実施形態は、前記二重特異性結合剤をコードする配列に操作可能に結合されたプロモーターをさらに含むベクターである。

本開示の一態様は免疫複合体である。いくつかの実施形態では、前記免疫複合体は、本明細書で開示される二重特異性結合剤および小分子を含む。他の実施形態では、前記免疫複合体は、さらにリンカーを含む。特定の実施形態では、前記リンカーは切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、親水性リンカー、およびジカルボン酸系リンカーからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、前記免疫複合体はDBCO-PEG4-CGS21680を含み、DBCOは連結に用いられ、PEG4はリンカーであり、CGS21680は小分子である。いくつかの実施形態では、前記免疫複合体はDBCO-PEG4-アミンを含む。いくつかの実施形態では、前記小分子はアミン、CGS21680、オキサジリジン－アジド、ZM241385、プレリキサフォル、マラビロク、およびアプラビロクを含む。しかしながら、自明であるが、前記小分子は、当業者が好適でと考えるいずれの小分子であってもよい。

本開示の一態様は薬学的に許容される担体、および本明細書に記載の二重特異性結合剤、本開示の免疫複合体、または本明細書に記載の核酸を含む医薬組成物である。一実施形態は、前記二重特異性結合剤が前記Ｅ３リガーゼと前記標的タンパク質の両方に結合すると前記標的タンパク質はユビキチン化される、医薬組成物である。一実施形態は、前記標的細胞が腫瘍細胞である医薬組成物である。一実施形態は、前記細胞が乳癌、B細胞リンパ腫、膵臓癌、ホジキンリンパ腫、卵巣癌、前立腺癌、中皮腫、肺癌、非ホジキンB細胞(B-NHL)、メラノーマ、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、神経芽細胞腫、神経膠腫、膠芽細胞腫、膀胱癌、および結腸直腸癌からなる群より選択される癌細胞である医薬組成物である。一実施形態は、前記標的タンパク質が免疫チェックポイントタンパク質である、医薬組成物である。一実施形態は、前記標的タンパク質がPD-L1、PD-1、CTLA-4、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、KIR、LAG3、NKG2D、TIM-3、VISTA、およびSIGLEC7からなる群より選択される医薬組成物である。一実施形態は、前記標的タンパク質の分解により標的細胞の増殖能力が低減される医薬組成物である。一実施形態は、前記標的タンパク質はHER2、CD19、CD20、PD-L1、EGFR、CTLA-4、MMP14、およびCDCP1からなる群より選択される医薬組成物である。

本開示の一態様は、タンパク質を発現することができる細胞、および二重特異性結合剤をコードする核酸を含む操作された細胞である。一実施形態は、前記細胞はB細胞、Ｂメモリ細胞、または形質細胞である操作された細胞である。

本開示の一態様は、対象者の腫瘍性疾患または障害を治療する方法であって、治療有効量の本開示の二重特異性結合剤、本開示の核酸、本開示の医薬組成物、または本開示の操作された細胞を、それを必要とする対象に投与する方法である。

本開示の一態様は、本開示の二重特異性結合剤をコードする核酸を含むタンパク質を合成することができる細胞を提供して、前記二重特異性結合剤の発現を誘発することにより、本開示の二重特異性結合剤を作製する方法である。

本開示の一態様は、標的タンパク質が腫瘍細胞または免疫細胞の表面に存在する腫瘍性疾患を治療するための操作された膜貫通タンパク質であって、前記標的タンパク質に特異的な標的タンパク質結合ドメインに結合した膜結合性Ｅ３リガーゼを含む。一実施形態は、前記Ｅ３リガーゼと前記標的タンパク質結合ドメインが共有結合している操作された膜貫通タンパク質である。一実施形態は、前記Ｅ３リガーゼと前記標的タンパク質結合ドメインが融合タンパク質として発現している操作された膜貫通タンパク質である。一実施形態は、前記Ｅ３リガーゼと前記標的タンパク質結合ドメインがジスルフィド結合によって共有結合している操作された膜貫通タンパク質である。一実施形態は、標的タンパク質結合ドメインがHER2、EGFR、MMP14、CDCP1、PD-L1、PD-1、CTLA-4、CD19、CD20、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、KIR、LAG3、NKG2D、TIM-3、VISTA、およびSIGLEC7からなる群より選択される標的タンパク質に特異的である、操作された膜貫通タンパク質である。

本開示の一態様は、本開示の操作された膜貫通タンパク質をコードする核酸である。一実施形態は、さらにベクターを含む核酸である。一実施形態は、前記操作された膜貫通タンパク質をコードする配列に操作可能に結合されたプロモーターをさらに含む核酸である。

本開示の一態様は、標的タンパク質が腫瘍細胞の表面に存在する腫瘍性疾患を治療するための組成物であって、治療量の本開示の操作された膜貫通タンパク質と融合性担体とを含み、前記担体は前記腫瘍細胞の細胞膜と融合することができる組成物である。一実施形態は、前記担体は融合性リポソームである組成物である。

本開示の一態様は、標的タンパク質が腫瘍細胞の表面に存在する腫瘍性疾患を治療するための組成物であって、治療量の本開示の操作された膜貫通タンパク質をコードする核酸と薬学的に許容される担体とを含み、前記担体は前記核酸を前記腫瘍細胞の細胞質ゾルに送達することができる組成物である。一実施形態は、前記担体がウイルス粒子、リポソーム、またはエキソソームを含む組成物である。一実施形態は、前記担体がウイルス粒子を含む組成物である。一実施形態は、前記担体がリポソームを含む組成物である。一実施形態は、前記担体がエキソソームを含む組成物である。

本開示の一態様は、本開示の二重特異性結合剤；本開示の二重特異性結合剤をコードする核酸；本開示の操作された膜貫通タンパク質；本開示の操作された膜貫通タンパク質をコードする核酸；本開示の二重特異性結合剤、本開示の二重特異性結合剤をコードする核酸、本開示の免疫複合体、本開示の操作された膜貫通タンパク質、または本開示の操作された膜貫通タンパク質をコードする核酸を含む医薬組成物；本開示の二重特異性結合剤または本開示の操作された膜貫通タンパク質をコードするベクター；もしくは本開示の二重特異性結合剤をコードする核酸を含む操作された細胞の腫瘍性疾患治療のための使用である。

本開示の一態様は、本開示の二重特異性結合剤；本開示の二重特異性結合剤をコードする核酸；本開示の免疫複合体；本開示の操作された膜貫通タンパク質；本開示の操作された膜貫通タンパク質をコードする核酸；本開示の二重特異性結合剤、本開示の二重特異性結合剤をコードする核酸、本開示の操作された膜貫通タンパク質、または本開示の操作された膜貫通タンパク質をコードする核酸を含む医薬組成物；本開示の二重特異性結合剤または本開示の操作された膜貫通タンパク質をコードするベクター；もしくは本開示の二重特異性結合剤をコードする核酸を含む操作された細胞の、腫瘍性疾患治療用の薬剤を製造するための使用である。

以上、発明の概要は例示に過ぎず、如何なる限定をも意図するものではない。例示的な実施形態と本明細書で記載する構成に加えて、本開示のさらなる態様、実施形態、目的、および構成は、図面、詳細な説明、および請求項から十分に明らかにされる。

膜結合性Ｅ３リガーゼRNF43および対象の標的表面タンパク質（「ＰＯＩ」）に結合した本開示の二重特異性結合剤（ここでは、例示的な二重特異性抗体）と、ＰＯＩの細胞内ユビキチン化を示す模式図である。

緑色蛍光タンパク質(GFP)結合ドメインと膜結合性Ｅ３リガーゼドメインと有する操作された膜貫通タンパク質、および細胞内NanoLucドメインと細胞外GFPドメインを有する膜結合レポーターコンストラクトを示す模式図である。操作された膜貫通タンパク質がGFPドメインに結合すると、NanoLucドメインの細胞内ユビキチン化が促進され、NanoLucドメインが分解され、信号が消える。

「ノブ・イントゥ・ホール（knob-into-hole）」構成を有する本開示の二重特異性IgG抗体の模式図である。

図４Ａは、本開示の二重特異性IgGを用いて三種陰性乳癌細胞株(MDA-MB-231)からPD-L1を除去・分解する実験の結果を示す。図４Ａは、PD-L1量は抗RNF43抗体(R3 IgG)または抗PD-L1抗体（Tecentriq（登録商標））によって影響されないが、１０ｎＭの本開示の二重特異性抗RNF43/PD-L1 IgGを２４時間用いることで実質的に低減または除去される。図４Ｂは、同じ細胞と二重特異性IgGを用いた用量反応を示す図であり、１０ｎＭの二重特異性IgGによりPD-L1が最も多く分解されることが示されている。

図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃは、３つの異なる癌細胞株について本開示の二重特異性IgGとTecentriq（登録商標）（アテゾリズマブ）のPD-L1分解活性を比較した図である。これらの薬剤を１０ｎＭ、２４時間投与した。図５Ａは、二重特異性IgGはMDA-MB-231細胞(三種陰性乳癌モデル)で実質的にPD-L1を分解したが、アテゾリズマブは分解またはPD-L1発現の下方調節を促進しなかったことを示す。図５Ｂは、二重特異性IgGはHCC827細胞(非小細胞肺癌モデル)で実質的にPD-L1を分解したが、アテゾリズマブは分解もPD-L1発現の下方調節もしなかったことを示す。図５Ｃは、二重特異性IgGはT24細胞（進行した膀胱癌のモデル）で実質的にPD-L1を分解したが。アテゾリズマブは実質的に分解もPD-L1発現の下方調節もしなかったことを示す。

図６は、本開示の二重特異性IgGの、トリプルネガティブ乳癌細胞株（MDA-MB-231）からPD-L1を分解する効果を示す棒グラフである。

図７は、各Ala変異体のバイオレイヤー干渉法（BLI）によるグラフをまとめて示す。

図８は、分解率（パーセント）とKoffの相関関係を示す。

図９は、分解率（パーセント）とKdの相関関係を示す。

図１０は、分解率（パーセント）とKonの相関関係を示す。

図１１は、抗RNF43アラニン変異体のウェスタンブロットを示す。変異体は、RNF43に対するKdによって識別される。１２．５ｎＭは野生型、４０ｎＭはS113A、１２５ｎＭはF115Aである。

図１２は、膜結合性Ｅ３リガーゼおよび対象のタンパク質（POI）に結合した免疫複合体の模式図である。

図１３は、免疫複合体を生成する結合手順の例示的な模式図である。

図１４は、本開示で用いたいくつかの例示的な小分子である。

図１５は、免疫複合体分解薬で２４時間治療後の、MOLT-4 CCR5+細胞におけるアデノシン２ａ受容体（A2aR）の投与量に依存した分解を示す。

図１６は、CGS21680（作動薬）で２４時間治療後の、MOLT-4 CCR5+細胞におけるA2aR量を示す。

発明の詳細な説明
本開示は、一般に、二重特異性結合剤、操作された膜貫通タンパク質、およびこれらの免疫複合体を含む結合剤に関する。これらは、膜結合性ユビキチンＥ３リガーゼ、および標的細胞の表面に存在する標的表面タンパク質の両方に結合している。いくつかの実施形態では、本開示は、膜結合性ユビキチンＥ３リガーゼ、および標的細胞の表面に存在する標的表面タンパク質の両方に結合する二重特異性結合剤を提供する。他の実施形態では、本開示は、修飾膜結合性Ｅ３リガーゼに基づく、標的表面タンパク質結合ドメインを有する操作された膜貫通タンパク質を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、二重特異性IgG、１つのアームに単鎖Fabを有する二重特異性IgG、Fab-scFV融合体など、特定の種類のコンストラクトを生成する例示的な方法を提供する。本開示は、二重特異性IgG、１つのアームに単鎖Fabを有する二重特異性IgG、Fab-scFV融合体を試験する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の二重特異性結合剤が様々な臨床的に適切な細胞株にある標的を分解することができることを示す。

いくつかの実施形態では、本開示は、標的タンパク質の分解における操作された膜貫通タンパク質の合成および試験を提供する。特定の実施形態では、本開示は、本明細書で提供される操作された膜貫通タンパク質が標的タンパク質の内在化およびリソソーム凝集を生じさせることができることを示す。よって、本開示は、本明細書で提供される操作された膜貫通タンパク質を用いて内因性タンパク質のタンパク質分解を誘発することができることを示す。いくつかの実施形態では、本開示は、操作された膜貫通タンパク質を標的細胞に挿入するためのAAVトランスフェクションベクターを生成する方法をさらに提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、提供された結合剤とそれらの標的との強い結合親和性が利点であることを示す。また、本開示の二重特異性結合剤および操作された膜貫通タンパク質を含む免疫複合体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の結合剤を含む免疫複合体が標的に動員されて、その分解を誘導することができることを示す。

本開示はまた、前記二重特異性結合剤または前記操作された膜貫通タンパク質をコードする核酸を提供する。また、前記二重特異性結合剤、前記操作された膜貫通タンパク質、および／または前記二重特異性結合剤もしくは操作された膜貫通タンパク質をコードする核酸を含む治療組成物、ならびに前記核酸をコードする細胞を提供する。本開示はまた、二重特異性結合剤または操作された膜貫通タンパク質を用いた治療方法、免疫複合体を用いた治療方法、二重特異性結合剤または操作された膜貫通タンパク質をコードする核酸を用いた治療方法、もしくは前記二重特異性結合剤、操作された膜貫通タンパク質、免疫複合体、および／または前記二重特異性結合剤または操作された膜貫通タンパク質をコードする核酸を用いた治療組成物を提供する。本開示はまた、このような薬剤を製造するのに有用な組成物および方法を提供する。また前記薬剤をコードする核酸、前記核酸で遺伝的に修飾された宿主細胞を製造するのに有用な組成物および方法、細胞の活性の調節および／または癌などの様々な病気の治療を行うための方法を提供する。

以下の詳細な説明では、説明の一部を成す添付の図面を参照する。これら図面では、文脈で決定されなければ、一般に同様の記号は同様の構成要素を示す。詳細な説明に記載される例示的な代替手段、図面、および請求項は限定を意味するものではない。他の代替手段を用いてもよく、また本発明で示される主題の精神または範囲を逸脱することなく他の変更を行ってもよい。自明ではあるが、一般に本明細書で記載するように、また図で示されるように、これらの側面は多様な異なる構成において配列、置換、組合せ、設計することができ、これらはすべて明示的に考慮され、本願の一部を成している。

定義
単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈で決定されなければ複数を含む。例えば、用語「a cell」は、その混合物を含む１つ以上の細胞を含む。本明細書で用いる「Aおよび／またはB」は、「A」、「B」、「AまたはB」、および「AおよびB」のすべての選択肢を含む。

用語「投与」および「投与する」は本明細書では互いに言い換え可能であって、投与経路による組成物または製剤の送達を指す。この投与経路は、静脈内投与、動脈内投与、脳内投与、髄腔内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。この用語は、医療専門家による投与および自己投与を含むが、これに限定されない。

用語「宿主細胞」および「組み換え細胞」は、本明細書では互いに言い換え可能である。自明だが、これらの用語や、「細胞培養物」、「細胞株」は、導入の回数に関わらず、特定の対象細胞または細胞株だけでなく、そのような細胞または細胞株の子孫または子孫であり得るものを指す。自明だが、すべての子孫が親細胞と全く同一ということはない。これは、特定の修飾が、突然変異（例えば、意図した突然変異または不注意による突然変異）または環境からの影響によって次の世代で起こることがあるが、そのような子孫は、実際は親細胞と同じでない場合もあるためである。しかしながら、これら子孫も、元の細胞または細胞株と同じ機能を保持している限り、本発明で用いる用語の範囲内に含める。

本明細書で用いられる用語「操作可能に結合された」は、意図したように動作するような、２つ以上の要素（例えば、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列）間の物理的または機能的結合を指す。

用語「異種性」は、操作可能に結合されていないか、あるいは元々互いに近接していない核酸コンストラクトまたはキメラポリペプチドに、操作可能に結合されたか、そうでなければ連結された核酸配列またはアミノ酸配列を指す。

本明細書で２つ以上の核酸またはタンパク質の文脈で用いられる用語「同一性割合」は、以下で記載するデフォルトのパラメータでBLASTまたはBLAST2.0配列比較アルゴリズムを用いて、あるいは手動で並べて目視にて観察して測定したときに、同じヌクレオチドまたはアミノ酸であるか、または同じヌクレオチドまたはアミノ酸の特定の百分率（例えば、配列同一性が約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または比較窓または指定領域に対して一致が最大になるように並べて比較した際の特定の領域についてより高い同一性割合）を有する２つ以上配列または下位配列を指す。例えば、NCBIのウェブサイトncbi.nlm.nih.gov/BLASTを参照のこと。この定義はまた、試験用配列の補体を指す、あるいは補体に適用されることがある。この定義はまた、欠失および／または付加、置換を有する配列をも含む。配列の同一性は、典型的には、長さが少なくとも約２０個のアミノ酸またはヌクレオチドの領域、長さが１０～１００個のアミノ酸またはヌクレオチドの領域、または所与の配列の全長に対して算出される。配列の同一性は、公開された技術および広く入手可能なコンピュータープログラム、例えば、GCSプログラムパッケージ(Devereux et al, Nucleic Acids Res (1984) 12:387), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul et al., J Mol Biol (1990) 215:403)を用いて算出することができる。配列の同一性は、配列分析ソフトウェア、例えば、ウィスコンシン大学バイオ技術センター（５３７０５、ウィスコンシン州マジソン、ユニバーシティアベニュー１７１０）のSequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Groupを用いてそのデフォルトのパラメータで測定することができる。

疾患または状態を言及するのに用いられる用語「治療」は、個体が煩っている状態に関連した症状が少なくとも改善したことを意味する。ここで、改善は、広義の意味で、例えば、治療している状態に関連する症状など、パラメータの度合いが少なくとも低下することを指すのに用いられる。治療はまた、病態、または少なくともそれに関連した症状が完全に阻害されること、例えば、発症が防止される、あるいは宿主がその状態、または少なくともその状態を特徴付ける症状から苦しむことがないように完全に除去されるような状況を含む。よって、治療は、（i）予防（すなわち、例えば、病気の進行の防止など臨床的症状が進行しないことを含む、臨床的症状の進行リスクの低減）、および（ii）阻害（すなわち、例えば、活性している病気の緩和または完全な阻害など、臨床的症状の進行あるいはそのさらなる進行を阻むことを含む。

本明細書を通して、特に断りのない限り、薬剤の「治療有効量」は、癌の治療または管理に治療の恩恵をもたらす、あるいは癌に関連した１つ以上の症状を遅延または最小限にするのに十分な量である。化合物の治療有効量は、単独で、または他の治療薬と組み合わせて癌の治療または管理において治療の恩恵をもたらす治療薬の量を意味する。用語「治療有効量」は、治療全体を向上させる、癌の症状または原因を軽減または回避する、あるいは他の治療薬の治療有効性を高めるような量を含むことができる。「有効量」の一例は、病気の１つまたは複数の症状の治療、予防、または軽減に貢献するのに十分な量であり、これもまた「治療有効量」と言う場合がある。症状の「軽減」は、（複数の）症状の重症度または頻度を軽減する、あるいは取り除くことを意味する。「治療有効量」を含む組成物の正確な量は治療の目的に依存し、当業者によって周知の技術を用いて確認することができる（例えば、Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 2010); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (2016); Pickar, Dosage Calculations (2012); and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, 2012, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkinsを参考のこと）。

本明細書を通して、「対象」または「個体」は、動物、例えば、ヒト（例えば、ヒトの個体）および非ヒト動物を含む。いくつかの実施形態では、「対象」または「個体」は、医師が治療している患者であってもよい。よって、対象は、目的とする病気（例えば、癌）および／またはその病気の１つ以上の症状を有する危険性がある、あるいはその疑いがあるヒトの患者または個体であってもよい。対象はまた、診断時またはその後で目的とする状態の危険性があると診断された個体であってもよい。用語「非ヒト動物」は、すべての脊椎動物、例えば、げっ歯類（例えば、マウス）、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリなどの哺乳類、および両生類、爬虫類などの非哺乳類を含む。

用語「誘導体」、「その機能的断片」または「その機能的多様体」は、断片または誘導体が由来する野生型分子と共通の生物学的活性を有する分子を指す。抗体の機能的断片または機能的多様体は、機能的断片または機能的多様体が由来する抗体と本質的に同じエピトープに結合する能力を保持するものである。例えば、細胞表面受容体のエピトープに結合することができる抗体は、Ｎ末端および／またはＣ末端で切断されてもよく、エピトープ結合活性を保持するか否かは当業者に周知のアッセイで評価してもよい。抗体誘導体は、一般に、既存の抗体に直接類似していなくても、抗体の一般的な結合特性に基づいたコンストラクトをさらに含んでいてもよい。例えば、既存の抗体に基づいていないナノボディ(低分子抗体タンパク質)およびscFv剤などの結合剤を得るために所望の標的に結合するようなファージに基づくライブラリーを適切に選別することができる。

値の範囲が示される場合、自明であるが、文脈で決定されなければ、その範囲の上限および下限の間の値、ならびにその指定された範囲で記載された値またはその範囲内の値は、下限の単位の１０分の１まで本開示に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してそのより小さい範囲に含まれていてもよく、その記載された範囲内で具体的に除外された制限を条件として本開示に包含される。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、これら含まれている限界のどちらか、あるいは両方を除外した範囲もまた、本開示に含まれる。

本明細書で開示されるすべての範囲はまた、任意のすべてのあり得る部分範囲およびその部分範囲の組み合わせをも包含する。指定された範囲はいずれも十分に記載されたものと認識することができ、同じ範囲を少なくとも二等分、三等分、四等分、五等分、十等分などと分割することができる。非限定的な例として、本明細書で述べる各範囲は、下三分の一、中三分の一、上三分の一などに容易に分割することができる。また、当業者には自明だが、「まで」、「より小さい」などの表現はすべて、引用された数字を含み、上記のように下位範囲に順次分割することができる範囲を指す。最後に、当業者には自明だが、１つの範囲は個々の構成要素を含む。よって、例えば、１～３個の項目を有する１群は、１個の項目を有する群、２個の項目を有する群、または３個の項目を有する群を指す。同様に、１～５個の項目を有する１群は、１個の項目を有する群、２個の項目を有する群、３個の項目を有する群、４個の項目を有する群、または５個の項目を有する群を指す。

明確にするため、本開示の特定の構成は、別々の実施形態の文脈で記載されるが、単一の実施形態で組み合わせとして提供されてもよい。逆に、本開示の様々な構成は、簡潔さのため、単一の実施形態の文脈で記載されるが、別々に提供されてもよく、あるいは任意の好適な下位の組み合わせとして提供されてもよい。本開示に係る実施形態のすべての組み合わせは、具体的に本開示によって包含され、組み合せのそれぞれ、およびすべてが個別に、かつ明示的に開示されたものとして本明細書で開示される。また、様々な実施形態およびそれらの要素の下位の組み合わせは、すべて、具体的に本開示によって包含され、下位の組み合せのそれぞれ、およびすべてが個別に、かつ明示的に開示されたものとして本明細書で開示される。

本開示の構成は単一の実施形態の文脈で記載されてもよいが、これら構成は別々に提供されてもよく、あるいは任意の好適な組み合わせで提供されてもよい。逆に、本開示は本明細書において、明確にするため、別々の実施形態の文脈で記載されてもよいが、本開示はまた単一の実施形態で実施されてもよい。公開された特許出願およびその他の公開された参考文献、本明細書で引用された文献、原稿、および科学文献は、いずれも任意の目的で参照により本明細書に組み込まれる。対立が生じた場合は、定義を含む本明細書が統制する。また、材料、方法、および例は例示的であり、限定を意図するものではない。

ユビキチン
真核細胞でのタンパク質分解の主要な経路は、迅速なタンパク質分解のため細胞タンパク質を標的するユビキチン化を含む。ユビキチン化は、ユビキチンが標的タンパク質のリジン残基に共有結合によって転移することにより生じる高度に調節された翻訳後過程である。ユビキチンの付加は、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）、およびユビキチンタンパク質リガーゼ（Ｅ３）という３種類の酵素の協同作用によって介在される。ユビキチン活性化酵素Ｅ１は、ユビキチンのＣ末端グリシンとＥ１活性部位のシステイン残基との間のチオエステル結合を形成するＡＴＰ依存過程においてユビキチンを活性化する。すると、活性化されたユビキチンは、ユビキチン結合酵素Ｅ２のシステイン残基に転移される。次いで、ユビキチンタンパク質リガーゼＥ３は、ユビキチンのＥ２酵素からタンパク質基質のリジン残基への転移を促進する。ヒトゲノムは、２種類のＥ１酵素、約４０種類のＥ２酵素、および８００種類超のＥ３リガーゼをコードしているので、タンパク質分解過程における基質特異性の付与にはＥ３リガーゼが主に関わっている。従って、Ｅ３リガーゼの基質特異性の操作は、対象のタンパク質の標的されたタンパク質分解に細胞分解機構を向け直す方法を提供する。

本開示の組成物
以下でさらに詳細に記載するように、本開示は、本明細書で提供される二重特異性結合剤および操作された膜貫通タンパク質など、標的細胞の表面に存在する標的表面タンパク質を分解するのに有用な結合剤を提供する。何れか特定の理論に束縛されるわけではないが、これらの薬剤は、標的表面タンパク質と膜結合性Ｅ３リガーゼの両方に結合し、その結合の結果、標的表面タンパク質がユビキチン化されて分解されるよう機能するように設計されている。また、膜結合性Ｅ３リガーゼドメインおよび標的表面タンパク質結合ドメインを有する操作された膜貫通タンパク質が開示される。何れか特定の理論に束縛されるわけではないが、これら薬剤は、標的表面タンパク質が膜結合性Ｅ３リガーゼドメインによってユビキチン化されて、その結合の結果、分解されるように標的表面タンパク質と結合することで機能するように設計されている。

本明細書の実施例に記載されるように、二重特異性結合剤および操作された膜貫通タンパク質は腫瘍細胞株で試験・実証されている。いかなる特定の理論に束縛されるわけではないが、これらの新規な薬剤は、マウスモデルおよび他の哺乳類の細胞中で、またヒトを含む哺乳類の対象において同様の性能を示すと思われる。本明細書で開示される薬剤を様々な細胞種に導入して、識別を高めるため、および腫瘍を除去するための操作された細胞を作成してもよい。従って、本明細書で開示される薬剤のうちの１つ以上を発現するように改変された操作された細胞もまた、本開示の範囲内である。

二重特異性結合剤
構造
本開示の二重特異性結合剤は２つの結合ドメインを含む。１つは膜結合性Ｅ３リガーゼに特異的な結合ドメインであり、もう１つは標的表面タンパク質に特異的な結合ドメインである。本開示の二重特異性結合剤は、Ｅ３リガーゼ結合ドメインおよび標的表面タンパク質結合ドメインがそれぞれ独立して、抗体（または抗体の半分）、ナノボディ、ミニボディ、Fab断片、単一鎖可変断片（scFv）、および単一ドメイン抗体（sdAb）、またはその機能的断片から選択される薬剤を含むが、これらに限定されない。これら２つの結合ドメインは、種類が同じ分子であってもよく、また異なる分子であってもよい。例えば、本開示の二重特異性結合剤は、Ｅ３リガーゼに結合するIgG、および標的表面タンパク質に結合するscFvドメインを有する二重特異性結合剤を含むが、これらに限定されない。前記二重特異性結合剤の２つの結合ドメインは、共有結合、非共有結合的相互作用、またはこれらの組み合わせにより結合させることができる。

前記二重特異性結合剤は、一般に、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、リンタンパク質などの形態を取り得る。いくつかの本開示の二重特異性結合剤は、二重特異性抗体または抗体誘導体の形態を取り得る。いくつかの実施形態では、前記標的タンパク質結合ドメインは、半抗体、ナノボディ、またはミニボディ、F(ab')₂断片、Fab断片、単一鎖可変断片（scFv）、および単一ドメイン抗体（sdAb）、またはその機能的断片からなる群より選択される。前記２つの結合ドメインは共に、二重特異性抗体、二重特異性ダイアボディ、二重特異性ラクダ抗体、または二重特異性ペプチボディなどの形態を取ってもよい。抗体誘導体は、特定の野生型抗体に由来している必要はない。例えば、抗体相補性決定領域（CDR）に類似した結合ドメインを有する小タンパク質を生成・選別するファージ提示法など、周知の技術を用いることができる。いくつかの実施形態では、抗原結合部位はscFvを含む。前記結合ドメインはまた、これらに限定されないが、例えば、PD-1、EGFなど、可溶性か膜結合に関わらず標的表面タンパク質に特異的に結合する天然または合成のリガンドまたは受容体に由来し得る。

前記抗原結合部位は、天然発生のアミノ酸配列を含むことができるか、所望の特性および／または向上した特性（例えば結合親和性）を提供するように改変、設計、または修飾することができる。一般に、標的抗原（例えば、CD19抗原）に対する抗原結合部位（例えば、抗体）の結合親和性は、Frankel et al., Mol Immunol (1979) 16:101-06に記載されているスキャッチャード法によって算出することができる。いくつかの実施形態では、結合親和性は抗原／抗体解離率によって測定される。いくつかの実施形態では、結合親和性は競合放射免疫アッセイによって測定される。いくつかの実施形態では、結合親和性はELISAによって測定される。いくつかの実施形態では、抗体親和性はフローサイトメトリーによって測定される。いくつかの実施形態では、結合親和性はバイオ層干渉法によって測定される。ある抗原（CD19など）に高い親和性で結合することができる場合にその抗原に選択的に結合する抗体は、他の抗原と有意に結合しない。

二重特異性抗体を公知の方法で作製することができる。本開示の実施形態は、二重特異性結合剤の対称性二量化領域が非対称になるように変更された「ノブ・イントゥ・ホール」二重特異性抗体を含む。例えば、抗原Ａおよび抗体Ｂに特異的なノブ・イントゥ・ホール二重特異性IgGを、A-結合鎖のFc部分が１つ以上の突起（「ノブ」）を有し、B-結合鎖のFc部分が１つ以上の中空（「ホール」）有するように改変することができる。ここで、これらのノブおよびホールは相互作用するように配置されている。これにより、ホモ二量化（A-AおよびB-B 抗体）を低減して、二重特異性結合剤に望ましいヘテロ二量化が促進される。例えば、Y. Xu et al., mAbs (2015) 7(1):231-42を参照のこと。いくつかの実施形態では、前記二重特異性結合剤はノブ・イントゥ・ホール設計である。いくつかの実施形態では、「ノブ」はCH3ドメインのT336W改変を含む、すなわち、位置３３６のトレオニンがトリプトファンによって置換されている。いくつかの実施形態では、「ホール」はT366S、L368A、およびY407Vの１つまたはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、「ホール」は、T366S、L368A、およびY407Vを含む。例えば、図３に例示されている。いくつかの実施形態では、「ノブ」定常領域は配列番号１４を含む。いくつかの実施形態では、重鎖Fc「ノブ」定常領域はヒスチジンタグを有する。いくつかの実施形態では、重鎖Fc「ホール」定常領域は配列番号１５を含む。特定の実施形態では、N297Gを有するノブコンストラクトの例示的なCH2-CH3ドメイン配列は配列番号335で提供される。他の実施形態では、N297Gを有するホールコンストラクトの例示的なCH2-CH3ドメイン配列は配列番号３３６で提供される。いくつかの実施形態では、例示的な野生型CH2-CH3ドメイン配列は配列番号３３７によって提供される。他の実施形態では、「ノブ」および「ホール」定常領域は、本明細書で提供される配列に約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％同一の配列を含む。

いくつかの実施形態では、前記二重特異性結合剤は、２つの結合ドメインを有する融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、前記Ｅ３結合ドメインは、半抗体、Fab、単鎖Fab、またはscFvを含む。いくつかの実施形態では、前記Ｅ３結合ドメインは半IgGを含む。いくつかの実施形態では、前記標的表面タンパク質結合ドメインは、Ｅ３結合ドメインの形態の選択とは独立して半抗体、Fab、単鎖Fab、またはscFvを含む。いくつかの実施形態では、前記Ｅ３結合ドメインは半抗体を含み、前記標的表面タンパク質結合ドメインは半抗体を含む。いくつかの実施形態では、前記半抗体はそれぞれ半IgG抗体である。いくつかの実施形態では、前記半抗体はそれぞれ半ノブ・イントゥ・ホールIgG抗体である。いくつかの実施形態では、前記Ｅ３結合ドメインは半抗体を含み、前記標的表面タンパク質結合ドメインはscFabを含む。いくつかの実施形態では、前記Ｅ３結合ドメインは半抗体を含み、前記標的表面タンパク質結合ドメインはscFvを含む。いくつかの実施形態では、前記Ｅ３結合ドメインはscFvを含み、前記標的表面タンパク質結合ドメインはscFabを含む。

いくつかの実施形態では、前記二重特異性結合剤は、内在化されるとその二重特異性結合剤を細胞外空間に戻すことを促進するFcRn受容体認識ドメインを含む。

標的表面タンパク質
本明細書で開示される二重特異性結合剤は、膜結合性Ｅ３リガーゼに加えて、１種以上の標的表面タンパク質に対する結合親和性を有する。標的表面タンパク質は、免疫抑制への関与、腫瘍細胞の免疫監視回避、または腫瘍細胞の増殖または転移への参画に基づいて選択される。本開示の方法によって標的することができる表面タンパク質は、膜ステロイド受容体、EGF受容体、TGF受容体、トランスフェリン受容体、CD19、CD20、CDCP1などのタンパク質を含む。その他の好適な標的表面タンパク質は、T細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージなどの免疫細胞による攻撃を阻害するPD-L1、PD-L2、CTLA-4、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、KIR、LAG3、NKG2D、TIM-3、VISTA、およびSIGLEC7などのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、前記標的表面タンパク質は標的細胞によって過剰発現されたタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記標的表面タンパク質は、標的細胞の増殖能力、転移能力、または免疫系回避能力に寄与するタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記標的表面タンパク質は免疫チェックポイントタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記標的表面タンパク質は、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、KIR、LAG3、NKG2D、TIM-3、VISTA,またはSIGLEC7である。いくつかの実施形態では、前記標的表面タンパク質は膜ステロイド受容体、EGF受容体、TGF受容体、トランスフェリン受容体、CDCP1、CD19、およびCD20より選択される。

いくつかの実施形態では、前記標的表面タンパク質はT細胞受容体(TCR)ポリペプチド、TCR共刺激性表面タンパク質、CD4、CD8、またはCAR-Tである。この特異性を有する二重特異性結合剤は、T細胞およびCAR-T細胞を下方調節または抑制するのに有用である。

いくつかの実施形態では、前記二重特異性結合剤は腫瘍関連抗原（TAA）または腫瘍特異性抗原（TSA）と結合することができる。TAAは、例えば、腫瘍細胞表面および正常細胞の下位集団の表面に存在するタンパク質、または腫瘍細胞表面よりもずっと低濃度で多くの正常細胞に存在するタンパク質などの分子を含む。その例としては、これらに限定されないが、CEA、AFP、HER2、CTAG1B、およびMAGEA1が挙げられる。それに対して、一般に、TSAは、腫瘍細胞表面に存在するが正常細胞表面には発現しないタンパク質などの分子を含む。例えば、腫瘍ウイルス抗原および変異タンパク質（新抗原として周知）が挙げられるが、これらに限定されない。

場合によっては、前記標的表面タンパク質結合ドメインは、例えば、腫瘍関連抗原または腫瘍特異性抗原など、悪性腫瘍細胞によって発現された抗原に存在するエピトープに特異的である。この腫瘍関連抗原または腫瘍特異性抗原は、例えば、乳癌細胞、B細胞リンパ腫、膵臓癌、ホジキンリンパ腫細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、中皮腫、肺癌細胞、非ホジキンB細胞リンパ腫（B-NHL）細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、中皮腫細胞、メラノーマ細胞、慢性リンパ性白血病細胞、急性リンパ性白血病細胞、神経芽細胞腫細胞、神経膠腫、膠芽細胞腫、膀胱癌細胞、結腸直腸癌細胞などに関連する抗原であり得る。また自明であるが、腫瘍関連抗原は非癌性細胞によって発現されてもよい。いくつかの実施形態では、前記抗原結合ドメインは組織特異性抗原に存在するエピトープに特異的である。いくつかの実施形態では、前記抗原結合ドメインは疾患関連抗原に存在するエピトープに特異的である。

Ｅ３リガーゼ
本開示の二重特異性結合剤はまた、膜結合性Ｅ３リガーゼに結合する。本開示において有用なＥ３リガーゼは、標的細胞の細胞膜（細胞膜）に関連して見られるリガーゼを含む。これらの膜結合性Ｅ３リガーゼは、例えば、RNF43、ZNRF3、RNF128 (GRAIL)、MARCH11などを含む。RNF128はT細胞に特徴に発現されるので、RNF128に結合する二重特異性結合剤の活性はT細胞およびRNF128を発現する他の何れかの細胞に限定される。

例示的コンストラクト
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性結合剤は、Ｅ３リガーゼとの結合アーム、および本明細書で提供される標的表面タンパク質との結合アームを含む。いくつかの実施形態では、Ｅ３リガーゼとの結合アームは、Ｅ３リガーゼに結合させた細胞外タンパク質、またはＥ３リガーゼと相互作用する膜貫通タンパク質に結合する。

特定の実施形態では、前記Ｅ３リガーゼとの結合アームは軽鎖および重鎖を含む。いくつかの実施形態では、前記軽鎖および前記重鎖はそれぞれ可変領域を含む。一般に、前記重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変部として周知の相補性決定領域（CDR）によって結合された４つのフレームワーク領域（FR）からなる。各鎖のCDRはFRによって互いに近接するように保持されて、他方の鎖のCDRと共に結合剤の抗原結合部位の形成に寄与する。CDRを決定するための少なくとも２つの技術がある。（１）異種間配列可変性に基づく方法、および（２）抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づく方法である。また、当該分野ではこれら２つの方法の組み合わせを用いてCDRを決定することがある。

いくつかの実施形態では、前記第一の結合ドメインは、配列番号１２または３２０で示される重鎖フレームワーク領域配列、および配列番号１１または３１９で示される軽鎖フレームワーク領域配列を含む。いくつかの実施形態では、前記第二の結合ドメインは、配列番号１２または３２０で示される重鎖フレームワーク領域配列、および配列番号１１または３１９で示される軽鎖フレームワーク領域配列を含む。いくつかの実施形態では、前記重鎖フレームワーク領域配列および前記軽鎖フレームワーク領域配列は、本明細書で提供される配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％同一である配列を含む。

いくつかの実施形態では、前記第一の結合ドメインは、それぞれ表２に示される配列を含む軽鎖可変領域CDR3(LC-CDR3)配列、重鎖可変領域CDR1(HC-CDR1)配列、HC-CDR2配列、およびHC-CDR3配列、または１個、２個、３個、または４個の保存的アミノ酸置換を含むこれらの多様体を含む。いくつかの実施形態では、前記第二の結合ドメインは、それぞれ表３に示される配列を含むLC-CDR3配列、HC-CDR1配列、HC-CDR2配列、およびHC-CDR3配列、または１個、２個、３個、または４個の保存的アミノ酸置換を含むこれらの多様体を含む。

他の実施形態では、前記二重特異性結合剤の第一の結合ドメインは重鎖可変領域を含み、前記二重特異性結合剤の第二の結合ドメインは配列番号１２または３２０で示される重鎖FR配列と配列番号１１または３１９で示される軽鎖FR配列とを含む。本明細書を通して、このような二重特異性結合剤を「ＶＨ結合剤」とも言う。一例示的な実施形態では、前記第一の結合ドメインの重鎖可変領域は配列番号３２１で示されるFR配列を含む。VH結合剤の実施形態によって、前記第一の結合ドメインは、それぞれ表４に示される配列を含むVH-CDR1配列、VH-CDR2配列、およびVH-CDR3配列、または１個、２個、３個、または４個の保存的アミノ酸置換を含むこれらの多様体を含む。VH結合剤のいくつかの実施形態では、前記第二の結合ドメインは、それぞれ表３に示される配列を含むLC-CDR3配列、HC-CDR1配列、HC-CDR2配列、およびHC-CDR3配列、または１個、２個、３個、または４個の保存的アミノ酸置換を含むこれらの多様体を含む。

「保存的アミノ酸置換」は、１つのアミノ酸残基が類似の側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換されていることを示す。類似の側鎖を有するアミノ酸残基の族は、当該分野で規定されており、例えば、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β－分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。例えば、フェニルアラニンのチロシンへの置換は保存的置換である。特定の実施形態では、本開示の結合剤の配列での保存的置換は、このアミノ酸配列を含む結合剤の抗原（すなわち、前記結合剤が結合するＥ３リガーゼおよび／または標的表面タンパク質）への結合を無効にすることはない。抗原の結合を排除しないヌクレオチド保存的置換およびアミノ酸保存的置換を同定する方法は当該分野でよく知られている。

合成

二重特異性結合剤は、組み換えＤＮＡおよびタンパク質発現技術を用いて製造される。例えば、本開示の二重特異性IgGをコードするＤＮＡの合成には、重鎖および軽鎖の定常領域をコードする好適なＤＮＡ配列が広く入手可能である。選択した可変領域をコードする配列は一般的な方法で挿入され、完全な長さの重鎖および軽鎖をコードする得られた核酸を好適な宿主細胞に形質導入し、発現させる。あるいは、これら核酸を、酸化還元条件、ｐＨ、折りたたみ、グリコシル化などをより制御することができる無細胞発現系で発現させることができる。

二重特異性IgGタンパク質は、それぞれ前記標的表面タンパク質または前記膜結合性Ｅ３リガーゼの何れかに特異的である２つの異なる相補決定領域（CDR）を有する。よって、２つの異なる重鎖と２つの異なる軽鎖が必要である。これらは、同じ宿主細胞で発現させてもよく、得られた生成物はホモ二量体と二重特異性ヘテロ二量体の混合物を含んでいる。ホモ二量体は、（例えば、まず一方の抗原で被覆したビーズ、次いで他方の抗原で被覆したビーズを用いて）親和性精製により二重特異性抗体から分離し、単量体に還元し、再会合させることができる。あるいは、「ノブ・イントゥ・ホール」設計を採用することもできる。この設計では、重鎖定常領域の二量化領域を改変して、その表面が（野生型構造に比べて）突出する（「ノブ」）か、または２つの修飾表面が二量体化することができるようにキャビティ（「ホール」）を形成するかの何れかである。そして、ノブ重鎖およびその関連した軽鎖をある宿主細胞で発現させ、ホール重鎖およびその関連した軽鎖を異なる宿主細胞で発現させ、これら発現したタンパク質を結合させる。これら二量化領域が非対称であることは、ヘテロ二量体の形成を促進する。（例えば、以下の実施例１および野生型と比べて変更した箇所を示す図３を参照のこと。）二量化を得るためには、これら２つの「単量体」（それぞれ、重鎖および軽鎖からなる）を還元条件化、穏やかな塩基性ｐＨ（例えば、約ｐＨ８～９）で結合させて適切な重鎖領域間のジスルフィド結合の形成を促進する。例えば、US8216805およびEP1870459Alを参照のこと。これらは参照により本明細書に組み込まれる。

他の方法を用いて二重特異性抗体の第一および第二のポリペプチド鎖の重鎖ヘテロ二量化を促進することができる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で開示される改変抗体の第一および第二のポリペプチド鎖の重鎖ヘテロ二量化は、F.L. Aran et al., Proc Natl Acad Sci USA (2013) 110(13):5145-50に記載された制御されたFabアーム交換方法により達成することができる。

この二量化過程により、異なる重鎖単量体間で軽鎖の交換が起こり得る。そのような結果を回避する方法の一つは、「単鎖Fab」で抗体の結合ドメインを置換することである。例えば、連結ポリペプチドにより軽鎖CDRを重鎖CDRに融合させるなどである。また、IgG（または他の抗体）のFab領域は、scFv、ナノボディなどで置換されてもよい。

本開示の改変抗体の結合活性は、当該分野で周知の何れかの好適な方法でアッセイすることができる。例えば、本開示の改変抗体の結合活性はスキャッチャード分析（Munsen et al., Analyt Biochem (1980) 107:220-39)で決定することができる。特異的結合は、当該分野で周知の技術で評価されてもよく、競合ELISA、BIACORE（登録商標）アッセイ、および／または KINEXA（登録商標）アッセイなどが挙げられるが、これらに限定されない。標的抗原または標的のエピトープに優先的または特異的（本明細書では互いに言い換え可能である）に結合する抗体は、当該分野ではよく理解されている用語であり、そのような特異的、すなわち優先的な結合を決定する方法もまた当該分野で周知である。抗体が別の抗原またはエピトープよりも特定の抗原またはエピトープにより頻繁に、素早く、より長く、かつ／またはより強い親和性で反応あるいは会合する場合、その抗体は特異的、すなわち優先的な結合を示すという。抗体が他の物質に結合するよりもより強い親和性、結合活性でより容易に、かつ／またはより長く結合する場合、その抗体は特異的、すなわち優先的に標的に結合する。また、抗体が試料中に存在する他の物質と結合するよりもより強い親和性、結合活性でより容易に、かつ／またはより長く試料中の標的と結合する場合、その抗体は標的に特異的、すなわち優先的に結合する。例えば、HER2エピトープに特異的、すなわち優先的に結合する抗体は、その抗体が他のHER2エピトープまたは非HER2エピトープと結合するよりもより強い親和性、結合活性でより容易に、かつ／またはより長くこのエピトープに結合する抗体である。この定義から理解できるように、例えば、第一の標的抗原に特異的、すなわち優先的に結合する抗体は、第二の標的抗原に特異的、すなわち優先的に結合してもしなくてもよい。よって、特異的結合および優先的結合は、（含むことはあり得るが）必ずしも排他的結合が要求されるものではない。

改変膜タンパク質
本明細書で開示される操作された膜貫通タンパク質は、１種以上の標的表面タンパク質に対する結合親和性を有し、膜結合性Ｅ３リガーゼユビキチンリガーゼ活性を有するドメインを組み込む。二重特異性結合剤に関して本明細書で記載する標的表面タンパク質のすべてはまた、操作された膜貫通タンパク質に好適な標的である。いくつかの実施形態では、前記操作された膜貫通タンパク質はCD19、B7H3(CD276)、BCMA、CD123、CD171、CD179a、CD20、CD213A2、CD22、CD24、CD246、CD272、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD46、CD71、CD97、CEA、CLDN6、CLECL1、CS-1、EGFR、EGFRvIII、ELF2M、EpCAM、EphA2、エフリンB2、FAP、FLT3、GD2、GD3、GM3、GPRC5D、HER2(ERBB2/neu)、IGLL1、IL-11Ra、KIT(CD117)、MMP14、MUC1、NCAM、PAP、PDGFR-β、PRSS21、PSCA、PSMA、ROR1、SSEA-4、TAG72、TEM1/CD248、TEM7R、TSHR、VEGFR2、BCMA(CD269)、ALPI、シトルリン化ビメンチン、cMet、またはAxlに対して結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、前記操作された膜貫通タンパク質はPD-L1、PD-L2、CTLA-4、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、KIR、LAG3、NKG2D、TIM-3、VISTA、またはSIGLEC7に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、前記操作された膜貫通タンパク質は膜ステロイド受容体、EGF受容体、TGF受容体、トランスフェリン受容体、CD19、またはCD20に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態では、前記操作された膜貫通タンパク質はT細胞受容体(TCR)ポリペプチド、TCR共刺激性表面タンパク質、CD4、CD8、またはCAR-Tに対する結合親和性を有する。

前記Ｅ３リガーゼドメインは、二重特異性結合剤の標的として上で記載したＥ３リガーゼの何れかより選択することができる。さらに、選択されたＥ３リガーゼは、内因性Ｅ２ユビキチン結合酵素からユビキチンまたは結合されたユビキチン鎖を転移することができる限りにおいて、標的細胞に固有である、あるいは標的細胞によって発現されている必要はない。これにより、例えば、マウスＥ３リガーゼをヒト対象に使用するなど、標的細胞の種とは異なる種の哺乳類に由来するＥ３リガーゼを使用することができる。また、これにより、悪性腫瘍細胞が１種のＥ３リガーゼの発現を下方調節することで治療効果を回避することを防止する。本明細書で提供される操作された膜貫通タンパク質はＥ３リガーゼ活性を含むので、悪性腫瘍細胞は、操作された膜貫通タンパク質活性を回避するためにはすべての内因性Ｅ２ユビキチン結合酵素の発現を下方調節または抑制する必要がある。いくつかの実施形態では、前記Ｅ３リガーゼドメインは膜結合性Ｅ３リガーゼまたはその機能的部分を含む。いくつかの実施形態では、前記膜結合性Ｅ３リガーゼはヒト膜結合性Ｅ３リガーゼである。いくつかの実施形態では、前記膜結合性Ｅ３リガーゼはRNF43、ZNRF3、RNF128 (GRAIL)、またはMARCH11である。

前記操作された膜貫通タンパク質は、選択された標的表面タンパク質に特異的な結合ドメインを含む。この結合ドメインは、本明細書で記載する標的表面タンパク質結合ドメインの何れかの形態を取ることができ、例えば、抗体、ナノボディ、ミニボディ、Fab断片、単一鎖可変断片(scFv)、および単一ドメイン抗体(sdAb)、またはその機能的断片が挙げられる。前記結合ドメインはまた、可溶性か膜結合性かに関わらず、標的表面タンパク質に特異的に結合する天然あるいは合成のリガンドまたは受容体に由来し得る。この標的表面タンパク質としては、PD-1、HER2、HER3などが挙げられるが、これらに限定されない。

前記結合ドメインと前記Ｅ３リガーゼドメインは、融合タンパク質として一緒に発現させることができる。あるいは、共有結合（例えば、２つのシステイン残基間のジスルフィド結合により、また非共有結合の親和性によって会合させることができる。いくつかの実施形態では、前記操作された膜貫通タンパク質は融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記操作された膜貫通タンパク質のＥ３リガーゼドメインと標的表面タンパク質結合ドメインはジスルフィド結合により結合されている。GFP結合ドメインおよび膜結合性Ｅ３リガーゼドメインを有する例示的な操作された膜貫通タンパク質を図２に示す。

一例としての実施形態では、本開示の操作された膜貫通タンパク質は、配列番号３で示される結合ドメインと共に配列番号２（軽鎖）および配列番号４（重鎖）の配列を有する抗GFP scFab配列を含む。短いリンカー（配列番号５）は、抗GFP scFabドメインとRNF43ドメイン（配列番号６）を結合する。この例示的な実施形態では、操作された膜貫通タンパク質の完全な配列は配列番号１で示されている。

他の例示的な実施形態では、レポーターコンストラクトはGFPドメイン（配列番号８）、貫通膜／リンカードメイン（配列番号９）、およびナノルシフェラーゼドメイン（配列番号１０）から組み立てられる。この例示的な実施形態では、レポーターコンストラクトの完全な配列は配列番号７で示されている。

免疫複合体
本開示は、本明細書で開示される結合剤の何れかを含む免疫複合体をさらに含む。いくつかの実施形態では、本開示の免疫複合体は本明細書で提供される二重特異性結合剤を含む。他の実施形態では、本開示の免疫複合体は本明細書で開示される操作された膜貫通タンパク質を含む。本明細書で用いられる用語「免疫複合体」または「複合体」は、本明細書で提供される二重特異性結合剤または操作された膜貫通タンパク質などの結合剤に結合された化合物またはその誘導体を言う。本開示の免疫複合体は、一般に、本明細書で提供される二重特異性結合剤または操作された膜貫通タンパク質、および小分子などの結合剤を含む。いくつかの実施形態では、免疫複合体はリンカーをさらに含む。

「リンカー」は、化合物（例えば、本明細書で開示される小分子など）を結合剤（例えば、本明細書で提供される二重特異性結合剤または操作された膜貫通タンパク質）に共有結合により安定した状態で結合することができる任意の化学的部分である。リンカーは、前記化合物または抗体が活性であるような条件で酸誘導切断、光誘導切断、ペプチダーゼ誘導切断、エストラーゼ誘導切断、およびジスルフィド結合切断の影響を受けやすくても、実質的にこれらに対して耐性があってもよい。適切なリンカーは当該分野でよく知られており、例えば、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、光解離性基、ペプチダーゼ不安定基および、エストラーゼ不安定基などが挙げられる。リンカーはまた、本明細書で記載する荷電リンカーおよびそれらの親水性形態、および当該分野で周知の荷電リンカーおよびそれらの親水性形態をも含む。特定の実施形態では、前記リンカーは、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、親水性リンカー、およびジカルボン酸系リンカーからなる群より選択される。例示的な一実施形態では、前記リンカーは切断不可能なリンカーである。他の例示的な実施形態では、前記リンカーはPEG4などのスペーサーである。他の実施形態では、前記小分子は前記結合剤から解離しない。

本開示によって包含される小分子は、例えば、対象タンパク質の標的された分解などの使用に当業者が好適であると考える何れかの小分子であり得る。他の例示的な実施形態では、前記小分子は、CGS21680などの作動薬を含むが、これらに限定されない。追加の例示的な実施形態では、前記小分子は、ZN241385、プレリキサフォル、マラビロク、またはアプラビロクなどの拮抗薬を含むが、これらに限定されない。前記小分子は、当該分野で周知の方法により本明細書で提供される二重特異性結合剤または操作された膜貫通タンパク質などの結合剤に結合させることができる。いくつかの例示的な結合方法としては、これらに限定されないが、オキサジリジン系試薬（図１３に図示）を用いたメチオニン、マレイミド系試薬またはジスルフィド交換試薬で標識されたシステイン、リジン反応性活性化エステル、結合のための反応性ハンドルを含む非天然のアミノ酸の組み込み、およびＮ末端またはＣ末端結合が挙げられる。方法によっては、アルデヒドなど、反応性結合のための改変アミノ酸を用いる。他の方法としては、Tagに基づくバイオ結合法が挙げられる。本開示は、結合のための例示的な方法をいくつか提供する。例えば、実施例６を参照のこと。自明だが、本開示は本明細書に示したいくつかの例に限定されず、本明細書で開示される免疫複合体の作製には他の一般に知られている結合方法も用いることができる。

核酸分子
一側面では、本明細書で開示されるいくつかの実施形態は、本開示の二重特異性結合剤および操作された膜貫通タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関し、発現カセット、および例えば、宿主細胞内での操作された膜貫通タンパク質のインビボ発現に向けられた調節配列など、異種性の核酸配列に操作可能に結合されたこれら核酸分子を含む発現ベクターを含む。

本開示の核酸分子は、任意の長さの核酸分子であり、一般に、約５Ｋｂ～約５０Ｋｂの核酸分子、例えば、約５Ｋｂ～約４０Ｋｂ、約５Ｋｂ～約３０Ｋｂ、約５Ｋｂ～約２０Ｋｂ、または約１０Ｋｂ～約５０Ｋｂ、例えば、約１５Ｋｂ～３０Ｋｂ、約２０Ｋｂ～約５０Ｋｂ、約２０Ｋｂ～約４０Ｋｂ、約５Ｋｂ～約２５Ｋｂ、または約３０Ｋｂ～約５０Ｋｂの核酸分子を含む。

いくつかの実施形態では、前記ヌクレオチド配列は発現カセットまたは発現ベクターに組み込まれている。自明であるが、発現カセットは一般に、コード配列と、受容細胞、生体内、および／または生体外でコード配列の適切な転写および／または翻訳を向けるのに十分な調節情報とを含む遺伝子材料のコンストラクトを含む。一般に、前記発現カセットは、所望の宿主細胞または組織および／または個体を標的するためのベクターに挿入されてもよい。よって、いくつかの実施形態では、本開示の発現カセットは、生体内でのカセットの発現を導くのに十分な発現制御要素に操作可能に結合された二重特異性結合剤または操作された膜貫通タンパク質のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記発現制御要素は、プロモーターおよび／または転写促進因子と、任意で前記コード配列の転写および／また翻訳を達成することができる他の核酸配列の何れかまたはその組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、前記ヌクレオチド配列は発現ベクターに組み込まれている。一般に、形質転換、すなわち、異種性DNAの宿主細胞への導入を目的としてベクターを用いてもよい、宿主細胞間の転移のために設計された組み換えポリヌクレオチドコンストラクトを含む。従って、いくつかの実施形態では、前記ベクターは、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコンであり得る。このベクターには、他のDNAセグメントを挿入してその挿入されたセグメントが複製されてもよい。発現ベクターは、適切な条件で適切な細胞内で組み換えポリヌクレオチドが発現するように、その組み換えポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記発現ベクターは宿主核酸に組み込むことができる組み込みベクターである。

いくつかの実施形態では、前記発現ベクターはウイルスベクターである。このウイルスベクターは、細胞ゲノムまたは核酸導入を媒介するウイルス粒子への核酸分子の導入または組み込みを典型的に容易にするウイルス由来核酸要素をさらに含む。ウイルス粒子は、典型的には、様々なウイルス成分を含み、また、核酸に加えて宿主細胞成分を含む場合がある。用語「ウイルスベクター」は、細胞または導入される核酸自体に核酸を導入することができるウイルスまたはウイルス粒子を指してもよい。ウイルスベクターおよび導入プラスミドは、主にウイルスに由来する構造的および／または機能的遺伝要素を含む。レトロウイルスベクターは、主にレトロウイルスに由来する構造的および／または機能的遺伝要素またはその一部を含む。レンチウイルスベクターは、主にレンチウイルスに由来する長い末端反復LTRを含む、構造的および／または機能的遺伝要素またはその一部を含むウイルスベクターまたはプラスミドである。

前記核酸配列は、対象の宿主細胞内での発現に最適にすることができる。例えば、ある宿主細胞内で発現する周知の遺伝子を基準に計算するなど、配列のＧ－Ｃ含有量をその細胞宿主に平均的な量に調節することができる。コドン最適化のための方法が当該分野で周知である。コード配列内のコドンの約１％、約５％、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、１００％が特定の宿主細胞内での発現に最適であるように本明細書で開示されるタンパク質のコード配列内でのコドン使用頻度を最適にして、宿主細胞内での発現を高めることができる。

本明細書で開示されるいくつかの実施形態は、本明細書で開示されるタンパク質をコードする組み換え核酸分子を含むベクターまたは発現カセットに関する。一般に、前記発現カセットは、コード配列と、受容細胞、生体内、および／または生体外でコード配列の適切な転写および／または翻訳を向けるのに十分な調節情報を含む。前記発現カセットは、所望の宿主細胞および／または個体を標的するためのベクターに挿入されてもよい。発現カセットは、１つ以上の核酸配列が機能的に操作可能な方法で、すなわち、操作可能に結合された核酸分子を含む、任意の供給源に由来する、ゲノムへの組み込みまたは自己複製が可能な線状または環状の一本鎖または二本鎖DNAまたはRNAポリヌクレオチドとして、プラスミド、コスミド、ウイルス、自己複製ポリヌクレオチド分子、またはバクテリオファージに挿入することができる。

また、本明細書では、本明細書で開示される何れかの二重特異性結合剤または改変タンパク質をコードする核酸分子の１種以上を含むベクター、プラスミド、またはウイルスが提供される。前記核酸分子は、例えば、ベクター内に含めることができて、そのベクターを用いて形質変換／形質導入された細胞内での発現を向けることができる。真核細胞および原核細胞に用いるのに好適なベクターは、当該分野で知られており、市販されているか、当業者によって容易に作製される。例えば、Sambrook, J., & Russell, D. W. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory and Sambrook, J., & Russel, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory (jointly referred to herein as “Sambrook”); Ausubel, F. M. (1987). Current Protocols in Molecular Biology. New York, NY: Wiley (including supplements through 2014); Bollag, D. M. et al. (1996). Protein Methods. New York, NY: Wiley-Liss; Huang, L. et al. (2005). Nonviral Vectors for Gene Therapy. San Diego: Academic Press; Kaplitt, M. G. et al. (1995). Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications. San Diego, CA: Academic Press; Lefkovits, I. (1997). The Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques. San Diego, CA: Academic Press; Doyle, A. et al. (1998). Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology. New York, NY: Wiley; Mullis, K. B., Ferre, F. & Gibbs, R. (1994). PCR: The Polymerase Chain Reaction. Boston: Birkhauser Publisher; Greenfield, E. A. (2014). Antibodies: A Laboratory Manual (2nd ed.). New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; Beaucage, S. L. et al. (2000). Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. New York, NY: Wiley, (including supplements through 2014); and Makrides, S. C. (2003). Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. Amsterdam, NL: Elsevier Sciences B.V.を参照のこと。これらの開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。

ＤＮＡベクターは、従来の形質転換または形質移入技術により真核細胞に導入することができる。宿主細胞を形質転換または形質移入する好適な方法は、またはSambrook et al.（2012、上記参照）に記載のもの、および他の一般的な分子生物学実験手順、例えば、リン酸カルシウム形質移入、DEAE-デキストラン媒介形質移入、形質移入、ミクロ注入法、カチオン性脂質媒介形質移入、電気穿孔、形質導入、スクレイプローディング、バリスティック導入、核穿孔、流体力学ショック、および感染が挙げられる。

本開示で用いることができるウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルス、類人猿ウイルス４０（SV40）、およびウシパピローマウイルスベクター（例えば、Gluzman (Ed.), Eukaryotic Viral Vectors, CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照のこと）が挙げられる。

発現系の正確な成分は重要ではない。例えば、本明細書で開示される二重特異性結合剤は、哺乳類細胞（例えば、COS細胞、NIH 3T3細胞、またはHeLa細胞）などの真核生物宿主内で産生することができる。これらの細胞は、アメリカ培養細胞系統保存機関（バージニア州マナサス）を含む多くの供給源から入手可能である。発現系の選択においては、成分が互いに相溶であることのみが重要である。当業者であれば、そのような判断をすることができる。さらに、発現系の選択にガイダンスが求められる場合に当業者であれば、P. Jones, “Vectors: Cloning Applications”, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 2009)を調べてもよい。

提供される核酸分子は、天然発生の配列、または天然発生のものとは異なるが遺伝子コードが縮重しているため同じ遺伝子産物をコードする配列を含むことができる。これらの核酸分子は、RNAまたはDNA（例えば、ホスホロアミダイト系合成によって作製されるゲノムDNA、cDNA、または合成DNA）、またはこれらの種類の核酸内でのヌクレオチド組み合わせまたは修飾からなることができる。また、前記核酸分子は二本鎖または一本鎖（例えば、センス鎖またはアンチセンス鎖の何れかを含む）であり得る。

前記核酸分子は、ポリペプチド（例えば、抗体）をコードする配列に限定されない。コード配列（例えば、二重特異性結合剤または操作された膜貫通タンパク質のコード配列）の上流または下流にある非コード配列のいくつか、またはすべてが含まれ得る。分子生物学の一般の当業者であれば核酸分子を単離する手順に精通している。例えば、前記核酸分子は、ゲノムDNAを制限エンドヌクレアーゼで処理するか、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって生成することができる。その場合、核酸分子はリボ核酸（RNA）であり、転写物は例えば、生体外転写によって産生することができる。

組み換え細胞および細胞培養物
本開示の核酸をヒトBリンパ球などの宿主細胞に導入して、核酸分子を含む組み換え細胞を産生することができる。従って、本開示のいくつかの実施形態は、組み換え細胞を作製する方法に関し、上記方法は（ａ）タンパク質を発現させることができる細胞を準備する工程、および（ｂ）準備した細胞を本明細書で記載する組み換え核酸の何れかと接触させる工程を含む。

本開示の核酸分子の細胞への導入は、ウイルス感染、形質移入、結合、原形質体融合、リポフェクション、電気穿孔、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン(PEI)媒介形質移入、DEAE-デキストラン媒介形質移入、リポソーム媒介形質移入、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介核酸送達などによって達成することができる。

従って、いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、当該分野で周知のウイルスまたは非ウイルス送達媒体により細胞に送達される。例えば、前記核酸分子は、宿主ゲノムに安定して組み込まれるか、エピソーム複製されるか、または安定性または一過性発現のための短い環状の発現ベクターとしての組み換え宿主細胞内に存在することができる。従って、本明細書で開示されるいくつかの実施形態では、前記核酸分子は、エピソーム単位として組み換え宿主細胞内で維持、複製される。いくつかの実施形態では、前記核酸分子は組み換え細胞のゲノムに安定して組み込まれる。安定した組み込みは、従来のランダムゲノム組み換え技術またはより精密なゲノム編集技術（例えば、ガイドRNAに向けたCRISPR/Cas9、またはＤＮＡガイドエンドヌクレアーゼゲノム編集NgAgo（Natronobacterium gregoryi Argonaute）、またはTALENsゲノム編集（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ））を用いて完成させることができる。いくつかの実施形態では、前記核酸分子は、安定性または一過性発現のための短い環状の発現ベクターとしての組み換え宿主細胞内に存在する。

前記核酸分子は、ウイルスカプシドまたは脂質ナノ粒子内に封入させることができる。例えば、核酸の細胞への導入はウイルス形質導入による達成されてもよい。非限定的な一例では、アデノ随伴ウイルス（AAV）は、ウイルス形質導入により核酸を標的細胞に送達するように改変することができる非エンベロープウイルスである。数種のAAV血清型が記載されており、周知の血清型のすべてが複数の多様な種類の組織に由来する細胞を感染させることができる。AAVは、毒性を示さずに生体内で広範囲の種および組織を形質導入することができ、比較的穏やかな自然免疫反応および獲得免疫応答を生成する。一実施形態は、本開示の操作された膜貫通タンパク質をコードするAAVベクターである。

レンチウイルス系はまた、ウイルス形質導入による核酸の送達および遺伝子治療に好適である。レンチウイルスベクターは、遺伝子送達媒体としていくつかの魅力的な特性を提供するが、（i）宿主ゲノムにベクターを安定して組み込むことにより、遺伝子送達が持続すること、（ii）分裂細胞および非分裂細胞の両方を感染させることができること、（iii）重要な遺伝子および細胞治療の標的細胞種を含む広い組織親和性、（iv）ベクター形質導入後はウイルスタンパク質を発現しないこと、（v）多シストロン性配列またはイントロン含有配列などの複雑な遺伝要素を送達することができること、（vi）より安全な組み込み部位プロファイルが可能なこと、および（vii）ベクターの操作および作製が比較的容易な系であることが挙げられる。

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、例えば、本明細書で記載する操作された膜貫通タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターで遺伝的に改変（例えば、形質導入、形質変換、または形質移入）されている。前記ベクターは、ウイルス由来発現ベクターであるか、または宿主細胞のゲノムの一部と相同の核酸配列を含む相同組み換え用ベクターであるか、何れかである。宿主細胞は、形質変換されていない細胞であるか、または１種以上の核酸分子で既に形質移入されている細胞であるかの何れかであり得る。

いくつかの実施形態では、前記組み換え細胞は原核細胞または真核細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は生体内で形質変換されている。いくつかの実施形態では、前記細胞は生体外で形質変換されている。いくつかの実施形態では、前記細胞は生体外で形質変換されている。いくつかの実施形態では、前記組み換え細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、前記組み換え細胞は動物細胞である。いくつかの実施形態では、前記動物細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、前記動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は非ヒト霊長類細胞である。いくつかの実施形態では、前記哺乳類細胞は免疫細胞、神経細胞、上皮細胞、および内皮細胞、または幹細胞である。いくつかの実施形態では、前記組み換え細胞は免疫系細胞、例えば、リンパ球（例えば、T細胞またはNK細胞）、または樹状細胞である。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞はＢ細胞、単球、ナチュラルキラー（NK）細胞、好塩基球、好酸球、好中球、樹状細胞、マクロファージ、制御性T細胞、ヘルパーT細胞、細胞毒性T細胞、または他のT細胞である。いくつかの実施形態では、前記免疫系細胞はTリンパ球である。

いくつかの実施形態では、前記細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞はリンパ球である。前記細胞のいくつかの実施形態では、前記細胞は前駆体Ｔ細胞または制御性T（Treg）細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞はCD34+細胞、CD8+細胞、またはCD4+細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞はナイーブCD8+T細胞、中央メモリCD8+T細胞、エフェクターメモリCD8+T細胞、およびバルクCD8+T細胞からなる群より選択されるCD8+T細胞毒性リンパ球細胞である。前記細胞のいくつかの実施形態では、前記細胞は、ナイーブCD4+T細胞、中央メモリCD4+T細胞、エフェクターメモリCD4+T細胞、およびバルクCD4+T細胞からなる群より選択されるCD4+Tヘルパーリンパ球細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は、ヒト対象者から得た試料を白血球分離して得ることができる。

他の側面では、本明細書で開示される少なくとも１種の組み換え細胞を含む様々な細胞培養物、および培養培地が本明細書で提供される。一般に、前記培養培地は、本明細書で記載する細胞培養物に好適な培養培地の何れか１種であり得る。上述した多様な宿主細胞および種を形質転換する技術は当該分野で周知であり、技術文献および科学文献に記載されている。従って、本明細書で開示される少なくとも１種の組み換え細胞を含む細胞培養物は本願の範囲内である。細胞培養物を生成、維持するのに好適な方法および系は当該分野で周知である。

医薬組成物
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性結合剤、操作された膜貫通タンパク質、核酸、および組み換え細胞は、医薬組成物を含む組成物に組み込むことができる。このような組成物としては、典型的には、二重特異性結合剤、操作された膜貫通タンパク質、核酸、および／または組み換え細胞、および薬学的に許容される賦形剤（例えば、担体）が挙げられる。

本開示の二重特異性結合剤は、抗体を投与するのに用いられる製剤、および抗体に基づく治療法、またはそれが基づく製剤を用いて投与することができる。本開示の核酸は、オリゴヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ剤を投与するのに用いられる製剤、および／またはCRISPR/Cas9 系治療法などの遺伝子治療を用いて投与される。操作された膜貫通タンパク質は、標的細胞内で発現する核酸として、または標的細胞膜と融合することができる担体内のタンパク質（例えば、以下で記載する融合性担体）として投与される。

注射可能な使用に好適な医薬組成物としては、殺菌水溶液（ここでは水溶性）または分散溶液、および注射可能な殺菌溶液または殺菌分散溶液のその場での調製用の殺菌粉末が挙げられる。静脈内投与の場合、好適な担体としては、生理食塩水、静菌性水、Cremophor EL（商標）（BASF、ニュージャージー州パーシパニー）、またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）が挙げられる。すべての場合で、前記組成物は殺菌されていなければならず、また注射器で投与できる程度に流動しなければならない。製造および保存の条件下で安定でなければならず、バクテリアおよび菌類などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。前記担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの好適な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチンなどの被覆を用いて、分散溶液の場合は要求される粒径を維持することで、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）を用いて、適切な流動性を維持することができる。微生物の活動は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど様々な抗菌剤および抗真菌剤で予防することができる。多くの場合、一般に、組成物中に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール（マンニトール、ソルビトールなど）、または塩化ナトリウムが含まれる。組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含ませることにより、注射可能な組成物の吸収を長期間持続させることができる。

上記の成分の１種または組み合わせと共に、適切な溶媒に必要量の活性化合物を組み込んで、濾過殺菌して注射可能な殺菌溶液を調製することができる。一般に、塩基性分散媒と、上記の成分のうち必要な他の成分を含む殺菌媒体に活性化合物を組み込んで分散溶液を調製する。注射可能な殺菌溶液の調製用の殺菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および冷凍乾燥である。これにより、薬効成分と、予め殺菌濾過した溶液に由来する何れかの所望の追加成分とを含む粉末が得られる。

いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性結合剤または操作された膜貫通タンパク質は、当該分野で周知の方法を用いてこれらをコードする核酸で形質移入または感染させることにより投与される。そのような方法としては、McCaffrey et al., Nature (2002) 418:6893, Xia et al., Nature Biotechnol (2002) 20:1006-10, およびPutnam, Am J Health Syst Pharm (1996) 53:151-60, erratum at Am J Health Syst Pharm (1996) 53:325に記載された方法が挙げられるが、これらに限定されない。

本開示の操作された膜貫通タンパク質は、融合性担体を含む製剤を用いて投与することができる。これらは、哺乳類細胞の細胞膜と融合することができる担体である。融合性担体としては、膜封入ウイルス粒子およびそれに基づく担体、エキソソームおよび微小小胞体（例えば、Y. Yang et al., J Extracellular Vessicles (2018) 7:144131を参照のこと）、融合性リポソーム（例えば、Bailey et al., US 5552155; Martin et al., US 5891468; Holland et al., US 5885613;およびLeamon, US 6379698を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態は、操作された膜貫通タンパク質および融合性担体を含む製剤である。

本開示の方法
二重特異性結合剤の投与
例えば、二重特異性結合剤、操作された膜貫通タンパク質、核酸、組み換え細胞、および医薬組成物など、本明細書で記載する治療組成物の何れか１種以上を投与して、癌などの腫瘍性疾患を有する個体を治療することができる。いくつかの実施形態では、二重特異性結合剤、操作された膜貫通タンパク質、核酸、組み換え細胞、および医薬組成物が、CAR-T細胞などのT細胞を下方調節または不活性化する方法に使用する治療組成物に組み込まれる。

従って、一側面では、本明細書において、個体内の標的細胞の活性を阻害する方法が提供される。前記方法は、本明細書で提供される１種以上の二重特異性結合剤、操作された膜貫通タンパク質、核酸、組み換え細胞、および医薬組成物を含む第一の治療を前記個体に投与する工程を含み、前記第一の治療は、標的表面タンパク質を分解することにより前記標的細胞の活性を阻害する。例えば、標的細胞の増殖が低減される、その病理学的挙動または病原性挙動が低減される、またはその標的細胞が破壊あるいは殺傷されると、標的細胞の活性は阻害されている場合がある。阻害は、測定量が少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％低減することを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、本明細書で開示される組み換え細胞の有効数を前記個体に投与することを含み、前記組み換え細胞は二重特異性結合剤の発現により前記個体内の標的細胞を阻害する。一般に、開示される方法の標的細胞は、例えば、急性骨髄腫白血病細胞、未分化リンパ腫細胞、星状細胞腫細胞、Ｂ細胞癌細胞、乳癌細胞、大腸癌細胞、上衣腫細胞、食道癌細胞、膠芽細胞腫細胞、膀胱癌細胞、神経膠腫細胞、平滑筋肉腫細胞、脂肪肉腫細胞、肝臓癌細胞、肺癌細胞、外套細胞リンパ腫細胞、メラノーマ細胞、神経芽細胞腫細胞、非小細胞肺癌細胞、乏突起膠腫細胞、卵巣癌細胞、膵臓癌細胞、末梢Ｔ細胞リンパ腫細胞、腎臓癌細胞、肉腫細胞、胃癌細胞、上皮性悪性腫瘍細胞、中皮腫細胞、または肉腫細胞など、何れかの細胞であり得る。いくつかの実施形態では、前記標的細胞は病原性細胞である。

本開示の二重特異性結合剤は、典型的には、注射または点滴により溶液または懸濁液製剤で投与される。一実施形態では、二重特異性結合剤は腫瘍塊に直接注射して投与される。他の実施形態では、二重特異性結合剤は全身性の点滴により投与される。

本開示の二重特異性結合剤のいくつかは、１０ｎＭの濃度で有効である。他の二重特異性結合剤は、各リガンドとの結合親和性および各リガンドの発現の程度によってそれよりも高濃度または低濃度で最も有効な場合がある。しかしながら、有効濃度の範囲は、本開示および本明細書で提供される実験プロトコルを用いて一般の当業者によって決定することができる。同様に、有効濃度を用いて有効投与量または投与に必要な投与量の範囲を決定することができる。

治療する病気または障害、病気の重症度や程度、対象の健康、他の治療の共投与によっては、反復投与量を投与してもよい。あるいは、連続投与を必要とする場合がある。しかしながら、二重特異性結合剤の各分子が標的表面タンパク質の複数の分子をユビキチン化して分解することができるよう、二重特異性結合剤は細胞に近接して留まることが期待される。よって、本開示の二重特異性結合剤は、抗体競合結合に基づく治療よりも少ない投与量、または少ない投与頻度が求められる場合がある。

個体への組み換え細胞の投与
いくつかの実施形態では、前記方法は、その方法を必要とする個体に前記組み換え細胞を投与することを含む。この投与工程は、当該分野で周知の何れかの注入法を用いて達成することができる。例えば、前記組み換え細胞を直接個体の血流に静脈注射することもできるし、それ以外の方法で個体に投与することもできる。

用語「投与」、「導入」、および「移植」は本明細書では互いに言い換え可能であって、本明細書で提供される二重特異性結合剤を発現する組み換え細胞を個体に送達する方法を指す。いくつかの実施形態では、前記方法は、所望の効果が得られるように所望の部位で導入された細胞が少なくとも部分的に局在化する方法または投与経路で個体に組み換え細胞を投与することを含む。組み換え細胞またはその分化した子孫は、個体内の所望の場所まで送達する何れかの適切な経路で投与することができる。ここで、投与された細胞または細胞成分の少なくとも一部は生存したままである。個体への投与後の細胞の生存期間は、数時間、例えば２４時間から数日と短い場合から、数年、あるいは個体の生涯に亘って長期に生着するなど、長い場合がある。

予防的に与えられる場合、いくつかの実施形態では、治療する疾患または状態の何れかの症状の前に本明細書で記載する組み換え細胞が個体に投与される。従って、いくつかの実施形態では、組み換え幹細胞集団の予防的な投与は、疾患または状態の症状の発症を予防するように作用する。

治療として与えられる場合、いくつかの実施形態では、症状の発症または疾患または状態の兆候が出た時（または後）、例えば疾患または状態の発症時に組み換え幹細胞を与える。

本明細書で記載する様々な実施形態で使用する場合、本明細書で開示される組み換え細胞の有効量は少なくとも１０²細胞、少なくとも５×１０²細胞、少なくとも１０³細胞、少なくとも５×１０³細胞、少なくとも１０⁴細胞、少なくとも５×１０⁴細胞、少なくとも１０⁵細胞、少なくとも２×１０⁵細胞、少なくとも３×１０⁵細胞、少なくとも４×１０⁵細胞、少なくとも５×１０⁵細胞、少なくとも６×１０⁵細胞、少なくとも７×１０⁵細胞、少なくとも８×１０⁵細胞、少なくとも９×１０⁵細胞、少なくとも１×１０⁶細胞、少なくとも２×１０⁶細胞、少なくとも３×１０⁶細胞、少なくとも４×１０⁶細胞、少なくとも５×１０⁶細胞、少なくとも６×１０⁶細胞、少なくとも７×１０⁶細胞、少なくとも８×１０⁶細胞、少なくとも９×１０⁶細胞、またはこれらの倍数であり得る。前記組み換え細胞は、１種以上の供与体に由来していてもよく、また自己供給源（すなわち、治療中のヒト対象者）から得ることができる。いくつかの実施形態では、前記組み換え細胞はそれを必要とする個体に投与する前に培養物内で発現されている。

いくつかの実施形態では、ある方法または経路によって組み換え細胞を含む組成物（すなわち、本明細書で提供される二重特異性結合剤の複数の組み換え細胞を含む組成物）を個体へ送達すると、所望の部位で細胞組成物が少なくとも部分的に局在化する。個体で治療が有効になるような何れかの適切な経路で細胞組成物を投与することができる。例えば、投与すると、個体内の所望の場所に送達されて、前記組成物の少なくとも一部、例えば、少なくとも１×１０⁴細胞がある期間、所望の部位に送達される。投与の形態としては、注射、点滴、点滴注入などが挙げられる。注射の形態としては、これらに限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、心室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管内、皮下、表皮下、被膜下、クモ膜下、髄腔内、脳脊髄内および胸骨内注射および点滴などが挙げられる。いくつかの実施形態では、前記経路は静脈内投与である。細胞の送達は、注射または点滴による投与によって行うことができる。

いくつかの実施形態では、前記組み換え細胞は全身に投与される。言い換えると、組み換え細胞の集団を標的の部位、組織、または器官に直接投与するのではなく、組み換え細胞の集団が個体の循環系に入って、代謝および他の過程を受けるように投与される。

病気または疾患の治療用の組成物による治療の有効性は、当業者の臨床医によって決定することができる。しかしながら、当業者であれば自明だが、病気の兆候、症状、またはマーカーの何れか１つ、またはすべてが向上あるいは改善すれば治療は有効と見なされる。また、入院または医療介入の必要性によって評価される悪化する個体の不全から有効性を測定することもできる（例えば、病気の進行を停止、または少なくとも遅らせた）。これらの兆候を測定する方法は、当業者に周知であり、かつ／または本明細書で記載されている。治療は、個体または動物（非限定的な例によっては、ヒトまたは哺乳類が挙げられる）での病気の何れかの治療を含み、（１）例えば、症状の進行を阻む、あるいは遅らせるなど、病気の進行を阻害すること、または（２）例えば、症状を軽減するなど、病気を緩和すること、および（３）症状の発症を防ぐ、またはその尤度を低減することを含む。

上述の通り、治療有効量は、病気を煩っている疑いがある、またはその危険性がある個体に投与すると、特定の効果を促進するのに十分な治療組成物の量を含む。いくつかの実施形態では、有効量は、病気の症状の発症を防ぐ、または遅らせる、病気の症状の経過を変える（例えば、病気の症状の進行を遅らせるなどであるが、これに限定されない）、病気の症状を反転させるのに十分な量を含む。自明であるが、何れかの場合も、適切な有効量は通常の実験を用いて一般の当業者によって決定することができる。

開示された病気の治療のための治療組成物を含む治療の有効性は、当業者の臨床医によって決定することができる。しかしながら、病気の兆候または症状の少なくとも何れか１つ、またはすべてが向上あるいは改善された場合、治療は有効であると見なされる。また、入院または医療介入の必要性によって評価される悪化する個体の不全から有効性を測定することもできる（例えば、病気の進行を停止、または少なくとも遅らせた）。これらの兆候を測定する方法は、当業者に周知であり、かつ／または本明細書で記載されている。治療は、個体または動物（非限定的な例によっては、ヒトまたは哺乳類が挙げられる）での病気の何れかの治療を含み、（１）例えば、症状の進行を阻む、あるいは遅らせるなど、病気を阻害すること、（２）例えば、症状を軽減するなど、病気を緩和すること、または（３）症状の発症を防ぐ、またはその尤度を低減することを含む。

いくつかの実施形態では、前記個体は哺乳類である。いくつかの実施形態では、前記哺乳類はヒトである。いくつかの実施形態では、前記個体は、細胞表面タンパク質によって媒介される細胞シグナル伝達に関連する病気を煩っている、あるいはその疑いがある。いくつかの実施形態では、前記病気は癌または慢性感染症である。

システムおよびキット
また、本明細書では、本明細書で記載され、提供される二重特異性結合剤、操作された膜貫通タンパク質、組み換え核酸、組み換え細胞、または医薬組成物を含むシステムおよびキット、およびこれらを作製・使用するための指示書が提供される。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で記載する二重特異性結合剤、本明細書で記載する操作された膜貫通タンパク質、本明細書で記載する組み換え核酸、本明細書で記載する組み換え細胞、または本明細書で記載する医薬組成物のうち、１種以上を含むシステムおよび／またはキットが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本開示のシステムおよび／またはキットは、前記提供された二重特異性結合剤、操作された膜貫通タンパク質、組み換え核酸、組み換え細胞、または医薬組成物の何れか１種を個体に投与するのに用いる１種以上の注射器（予め充填された注射器を含む）および／またはカテーテルをさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、例えば、細胞の活性を調節する、標的癌細胞を阻害する、または必要とする個体の病気を治療するなど、所望の目的で他のキット成分と同時または順次投与することができる１種以上の追加の治療薬を含むことができる。

上述のシステムおよびキットの何れかは、１種以上の追加の試薬をさらに含むことができ、そのような追加の試薬は、希釈緩衝剤、再構成溶液、洗浄緩衝剤、調整試薬、調整発現ベクター、陰性対照ポリペプチド、陽性対照ポリペプチド、二重特異性結合剤または操作された膜貫通タンパク質の生体外生成用試薬から選択することができる。

いくつかの実施形態では、システムまたはキットは、前記方法を実施するためのキットの成分を使用する指示書をさらに含むことができる。前記方法を実施するための指示は、一般に、好適な記録媒体に記録されている。例えば、前記指示は、紙またはプラスチックなどの基材に印刷することができる。前記指示は、包装袋の折り込み、キットまたはその成分の容器のラベル（すなわち、包装またはその中の包装と関連させて）など、キット中に存在させることができる。前記指示は、好適なコンピュータ読取り可能記憶媒体（例えば、CD-ROM、ディスケット、フラッシュドライブなど）に電子的保存データファイルとして存在させることができる。場合によっては、実際の指示はキットに存在するのではなく、離れた供給源から（例えば、インターネットを介して）指示を得る手段を提供することができる。この実施形態の一例は、前記指示を閲覧および／またはダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。前記指示と共に、この指示を得るための手段を好適な基材に記録することができる。

本開示で述べたすべての出版物および特許出願は個々の出版物および特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同様に、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で引用したいずれの参考文献も従来技術を構成するとは認められない。参考文献の議論はそれらの著者の主張を述べたものであり、本発明者らは引用した文献の正確さおよび適切性に挑む権利を保留する。自明だが、科学論文雑誌、特許文献、および教科書を含む複数の情報源が本明細書で参照されているが、この参照は、これら文献の何れかが当該分野で一般的な知識の一部を成していることを認めるものではない。

本明細書で示した一般的な方法の議論は、例示のみを目的としたものである。他の代替方法および代替え物は、本開示について考察すれば当業者には自明であり、本願の精神と範囲内に含まれる。

本開示の実践は、特に断りがなければ、当業者によく知られている、分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学の従来技術を採用する。そのような技術は上で引用した文献に十分に説明されている。

以下の実施例ではさらなる実施形態がより詳細に開示される。これらの実施例は、例示のために提供されるものであり、いかなる点でも本開示または請求項の範囲を限定するものではない。

実施例１
二重特異性結合剤および操作された膜貫通タンパク質の合成
本実施例では、二重特異性IgG、１つのアームに単鎖Fabを有する二重特異性IgG、Fab-scFV融合体というコンストラクトの種類のそれぞれを生成するのに行った実験について記載する。図１に、二重特異性分解剤の作用モードが示されている。図２に、RNF43に融合した抗GFPドメイン制御を有する操作された膜貫通タンパク質が示されている。

半IgGの発現
これらコンストラクトの半IgG（half IgG）を発現させるため、以下の６日間の過程を行った。１日目に、形質移入ごとに７．５×１０⁷個のExpi293F（商標）細胞（ThermoFisher Scientific）を１２５ｍＬのフラスコ内の２５．５ｍＬのExpi293（商標）成長培地に分け入れた。Expi（商標）形質移入試薬を製造者のプロトコルに従って使用した。まず、１．５ｍＬのOptiMEM（商標）を１５ｍＬの試験管に加えて、３０μｇのプラスミドＤＮＡを加えて混合した（１５μｇの重鎖プラスミドおよび軽鎖プラスミド）。別々の試験管に、各形質移入につき１．５ｍＬのOptiMEM（商標）を等分して、各形質移入につき８１μＬのExpiFectamine（商標）試薬を各試験管に加えた。この溶液を混合して、室温（ＲＴ）で５分間インキュベートした。そして、ＤＮＡをExpiFectamine（商標）（最終体積：３ｍＬ）に加えて２０分間インキュベートした。最後に３ｍＬのＤＮＡとExpiFectamine（商標）の混合物を、Expi293F（商標）細胞を含む各培養フラスコのOptiMEM（商標）に加えた。各形質移入につき、最終培養体積は２８．５ｍＬ（＋Fc融合のための３ｍＬの１ｍＭビオチン）であった。

２日目、１日目の最後の工程から２０時間後に、ExpiFectamine（商標）転写促進因子を各培養物に加えて最終培養体積を３０ｍＬにした。次いで、ExpiFectamine（商標）形質移入増強剤１（１５０μＬ）およびExpiFectamine（商標）形質移入増強剤２（１．５ｍＬ）を各フラスコに加えた。

６日目に、遠心分離器にて培養物を４１３７ｒｐｍ、４ｘｇ、４℃で２０分間遠心分離した。次いで、一般的なタンパク質Ａプロトコルを用いて半IgGを精製し、最終のノブコンストラクトまたはホールコンストラクトを緩衝剤交換により１０ｎＭのトリス（ｐＨ：７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌに回収した。

半IgG生体外組み立て
これらのコンストラクトの半IgG生体外組み立てのため、また二重特異性IgGを精製するため、半IgGノブコンストラクトおよび半IgGホールコンストラクト（以下の表２および表５を参照のこと）の１対１混合物を１０ｎＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ：７．５）で調製した。２０％の８００ｍＭのL-Arg（ｐＨ：１０）を加えて混合物のｐＨを約８．５に調節した。８００ｍＭのL-Arg（ｐＨ：１０）で２００倍にした過剰の還元グルタチオンをこの混合物に加えて、３７℃で１６時間インキュベートした。１６時間インキュベートした後、３０ｋＤａ回転濃縮器を用いて、この二重特異性IgGを緩衝剤交換して、リン酸緩衝食塩水（PBS）に回収した。最後に、この二重特異性IgGをhis-tag精製により精製した。

scFab系二重特異性IgGおよび二重特異性Fab-scFvの生成
scFab系二重特異性IgGおよび二重特異性Fab-scFvの生成のため、以下のように６日間の工程を行った。

１日目に、形質移入ごとに７．５×１０⁷個のExpi293F（商標）細胞を１２５ｍＬのフラスコ内の２５．５ｍＬのExpi293（商標）成長培地に分け入れた。Expi（商標）形質移入試薬を製造者のプロトコルに従って使用した。まず、１．５ｍＬのOptiMEM（商標）を１５ｍＬの試験管に加えて、３０μｇのプラスミドＤＮＡを加えて混合した（１５μｇの重鎖プラスミドおよび軽鎖プラスミド）。別々の試験管に、各形質移入につき１．５ｍＬのOptiMEM（商標）を等分して、各形質移入につき８１μＬのExpiFectamine（商標）試薬を各試験管に加えた。この溶液を混合して、室温（ＲＴ）で５分間インキュベートした。そして、ＤＮＡをExpiFectamine（商標）（最終体積：３ｍＬ）に加えて２０分間インキュベートした。最後に３ｍＬのＤＮＡとExpiFectamine（商標）の混合物を、Expi293F（商標）細胞を含む各培養フラスコのOptiMEM（商標）に加えた。.各形質移入につき、最終培養体積は２８．５ｍＬ（＋Fc融合のための３ｍＬの１ｍＭビオチン）であった。

２日目、１日目の最後の工程から２０時間後に、ExpiFectamine（商標）転写促進因子を各培養物に加えて最終培養体積を３０ｍＬにした。この後、１５０μＬのExpiFectamine（商標）形質移入増強剤１および１．５ｍＬのExpiFectamine（商標）形質移入増強剤２を各フラスコに加えた。

６日目に、遠心分離器にて培養物を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。この二重特異性Fab-scFvコンストラクトをタンパク質Ａで精製して、scFab系二重特異性IgGをhis-tag精製した。これら最終コンストラクトを緩衝剤交換してPBSに回収した。

生成されたコンストラクト
上記の手順で生成したコンストラクトは以下のものを含む。

配列番号１１の軽鎖フレームワーク領域、配列番号１２の重鎖Fabフレームワーク領域、配列番号１３の１つのアームに単鎖Fabを有する二重特異性IgG、His tagを有する配列番号１４の重鎖Fc「ノブ」定常領域、および配列番号１６および１７のFab-scFvコンストラクト－重鎖scFv融合を用いて表１のＥ３リガーゼアーム用コンストラクトを作製した。表２のＡ５に示すLC-CDR3、HC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3は、すべてのRNF43結合アーム（RNF43結合剤とも言う）で用いられた。表２のＡ２２に示すLC-CDR3、HC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3は、すべてのZNRF3結合アームで用いられた。

配列番号１１の軽鎖定常領域、配列番号１２の重鎖Fab定常領域、配列番号１３の１つのアームに単鎖Fabを有する二重特異性IgG、配列番号１５の重鎖Fc「ホール」定常領域、および配列番号１６および１７のFab-scFvコンストラクト－重鎖scFv融合を用いて標的タンパク質用のコンストラクトを作製した。標的表面タンパク質PD-L1、HER2、EGFR、CTLA-4、MMP14、およびCDCP1に用いられるLC可変領域およびHC可変領域を以下の表５に示す。

Ｅ３リガーゼRNF43、ZNRF3、およびGRAIL (RNF128)に用いられる別のLC-CDR3、HC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を以下の表２に示す。配列番号３１９の軽鎖定常領域および配列番号３２０の重鎖Fab定常領域を用いて、さらにコンストラクトを作製した。

他の例では、RNF43へのFab結合アームをVH結合剤で置換した。ＶＨフレームワーク領域用の配列は配列番号３２１で提供される。RNF43用のVH CDR配列は表４で提供される。

実施例２
本実施例では以下のコンストラクト、すなわち、二重特異性IgG、１つのアームに単鎖Fabを有する二重特異性IgG、およびFab-scFV融合体のぞれぞれの試験のために行われた実験について記載される。

ウェスタンブロット
以下の３日間の過程に従って細胞株MDA-MB-231、HCC827、H460、およびT24をPD-L1分解についてウェスタンブロットにより試験した。

１日目に、６ウェルプレートで約６０～７０％の密集度になった細胞に、１ｍＬの新しい成長培地で異なる濃度の二重特異性抗体を加えた。次いで、これらの細胞を設定時間（２４時間）静置した。

２日目、二重特異性抗体と共にインキュベートして２４時間目に、試料はウェスタンブロット解析をする準備が整ったと見なされた。これを行うために、細胞培養培地を吸引し、細胞を冷PBSで洗浄した。次いで、細胞をGibco（登録商標）ヴェルセン溶液で浮遊させて、遠心分離した。次いで、上澄みを除去して、細胞ペレットを個別に１４０μＬのRIPA溶解緩衝剤＋cOmplete（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル(Millipore Sigma, #11836170001)で再懸濁させ、エッペンドルフ管に移した。次いで、再懸濁させた細胞を溶解緩衝剤と共に４℃で３０分間インキュベートした。（溶解緩衝剤：５ＭのＮａＣｌ（３ｍＬ）、１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（５ｍＬ、ｐＨ：８．０）、Nonidet（商標）Ｐ－４０（１ｍＬ）、１０％のデオキシコール酸ナトリウム（５ｍＬ）、１０％のＳＤＳ（１ｍＬ）、ｄｄＨ₂Ｏ（適量から１００ｍＬ））。次いで、細胞溶解物を１５０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、１００μＬの可溶性画分を取り出し、ビシンコニン酸アッセイ（BCAアッセイ、スミスアッセイとしても知られる）を用いてタンパク質濃度を正規化した。希釈溶解物を２０μＬのLDL緩衝剤＋２μＬのBMEに加えて、この溶液を１０分間煮沸した。溶解物をSDS pageゲル（２００Ｖ、３７分間）電気泳動させて、このゲルを２０％エタノール溶液でブロックした。iBlot2（登録商標）プラットフォームを用いてブロックしたゲルをポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜に転写した。製造者のブロッキング緩衝剤を用いて６０分間、膜をブロッキング処理した。一次抗体を７．５ｍＬのブロッキング緩衝剤＋０．２％のTween（登録商標）20に加えた。抗PD-L1との比は１：１０００であり、抗チューブリンとの比は１：２０００であった。最後に、黒色ボックス内にて４℃で一晩、膜を穏やかに振とうした。

３日目に、この一晩緩衝剤を除去して、膜を１倍のTBS-T(0.1% Tween（登録商標）20)で洗浄し、１倍のTBS-T(0.1% Tween（登録商標）20）で覆って、室温で５分間振とうした。洗浄溶液を捨てて、この洗浄工程をさらに３回繰り返した。二次抗体を８ｍＬのブロッキング緩衝剤＋0.2%のTween（登録商標）20（１６０μＬ）+0.01% SDS（８μＬ）で希釈した。２種類の二次抗体、ヤギ－抗ウサギ（８００ｎｍ）およびヤギ－抗マウス（６８０ｎｍ）を用いた。穏やかに振とうしながら、二次抗体と共に膜を暗部にて室温で１時間インキュベートした。このインキュベーションに続いて、膜を１倍のTBS-T(0.1% Tween（登録商標）20)で洗浄し、１倍のTBS-T(0.1% Tween（登録商標）20）で覆って、室温で５分間振とうした。洗浄溶液を捨てて、この洗浄工程をさらに３回繰り返した。最終に１倍のPBSで膜を洗浄して、残留しているTween（登録商標）20を除去し、膜をLi-Cor（登録商標）画像形成システムで画像処理した。

試験した二重特異性IgGまたはアテゾリズマブ（Tecentriq（登録商標）、いずれも溶液中１０ｎＭ）で２４時間治療した後のMDA-MB-231、HCC827、またはT24細胞株でのPD-L1量に及ぼす効果について、例示的なウェスタンブロットの結果を図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃ示す。要するに、試験した二重特異性IgGは、これら３種の異なる臨床的に適切な細胞株（MDA-MB-231、HCC827、またはT24）でPD-L1を分解することができたが、アテゾリズマブはほとんど、あるいは全く分解しなかった。

また、図６は、三種陰性乳癌細胞株MDA-MB-231に由来するPD-L1の分解に及ぼす二重特異性RNF43-PD-L1 IgGの効果を示している。各棒グラフは左から右へPBS対照、１０ｎＭのRNF43 A5とのコンストラクト（配列番号３３２および３３３）、１０ｎＭのRNF43 A4とのFabコンストラクト（配列番号３２２および３２３）、および１０ｎＭのRNF43 A6のFabコンストラクト（配列番号３２４および３２５）を示す。すべてのコンストラクトは、RNF43を標的する１つのアームと、結合アームとしてTecentriqでPD-L1に結合する他の結合を有する二重特異性IgGあった。PD-L1結合可変領域は、すべてのコンストラクトで同じで、配列番号１０６および１０７で示されるものであった。ウェスタンブロットは、本開示の実施例２の記載と同様に行った。

フローサイトメトリー
以下に記載する２日間の工程に従って、フローサイトメトリーにより細胞株MDA-MB-231、HCC827、H460、およびT24をPD-L1を試験した。

２日目、二重特異性抗体と共にインキュベートして２４時間目に、試料はウェスタンブロット解析をする準備が整ったと見なされた。これを行うために、細胞培養培地を吸引し、細胞を冷PBSで洗浄した。次いで、細胞をGibco（登録商標）ヴェルセン溶液に浮遊させて、遠心分離した。次いで、上澄みを除去して、細胞ペレットを個別に１倍のPBSで洗浄した。次いで、細胞をPBS+3% BSAでブロックして、ビオチン化抗体を試料に加えて、振とうしながら４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞をPBS+3% BSAで３回洗浄した。次いで、Alexa Fluor（登録商標）647ストレプトアビジン（ThermoFisher Scientific）を加えて、振とうしながら細胞を４℃で３０分間インキュベートした。細胞をPBS+3% BSAで３回洗浄した。最後に、細胞を２００μＬのPBSに再懸濁させて、フローサイトメーターにかけた。

フローサイトメトリーの結果から、試験した二重特性IgGはこれら３種の異なる臨床的に適切な細胞株（MDA-MB-231、HCC827、およびT24）でPD-L1を分解することができたが、アテゾリズマブはほとんど、あるいは全く分解しなかったことが分かる。

実施例３
改変膜タンパク質
本実施例では、RNF43操作された膜貫通タンパク質の合成およびレポーターコンストラクト分解試験に関して行った実験について記載される。

形質移入および合成
すべてのDNA断片をIDTから購入し、Gibson Cloningを用いて組み立てた。３０ｂｐ個の重複を有するDNA断片を切断ベクターpFUSEベクターおよび Gibsonマスターミックスと共に５０℃で３０分間インキュベートした。操作された膜貫通タンパク質をRNF43および抗GFPscFabに基づいて設計した。配列番号３で示される結合ドメインと共に抗GFPsc Fab配列は配列番号２（軽鎖）および配列番号４（重鎖）で提供される。短いリンカー（配列番号５）は、scFabドメインをRNF43ドメイン（配列番号６）に結合させる。完全な配列は配列番号１で示される。

レポーターコンストラクトは、GFPドメイン（配列番号８）、貫通膜/リンカードメイン（配列番号９）、ナノルシフェラーゼドメイン（配列番号１０）から組み立てられた。レポーターコンストラクトの完全な配列は配列番号７で提供される。

熱ショックにてGibson生成物をXL10コンポーネント細胞に形質変換した。形質変換された細胞は、３７℃、１時間で回収できた。回収された細胞を蒔いて、LB/Carbenicillinプレートを３７℃で一晩置いた。

２日目に、一晩置いたプレートの単一コロニーを採取して、５ｍＬの低塩LB/Carbenicillinに加えて、集密になるまで３７℃でインキュベートした。細胞が集密になったら、DNAをミニプレップして、その配列を確認した。

RNF43操作された膜貫通タンパク質の合成については、TransIT（登録商標）-293形質移入試薬を用いてHek293またはHeLa細胞をレポーターGFP-NanolucコンストラクトおよびRNF43操作された膜貫通タンパク質の両方に一過的に形質移入した。６ウェルプレートの細胞を６０～７０％の密集度まで成長させた。DNA（２．５μｇ）をOpti-memにて７．５μＬのTransIT-293試薬と共に室温で２０分間インキュベートし、DNA-TransIt混合物を細胞に加えた。

Hek293 FLP/IN細胞を用いて、GFP-NanoLucコンストラクトを発現する安定した細胞株を作製した。この細胞株については、GFP-NanoLucがすでに存在していたので、以下の実験（ナノルシフェラーゼの読み出し）はこの細胞株にRNF43融合を一過的に形質転換して行った。一過性形質移入は、約６０％の密集度の細胞で６ウェルプレートにて行った。

ナノルシフェラーゼの読み出し
上記のナノルシフェラーゼの読み出し（readout）については、適切な１個または複数個のコンストラクトで形質移入して２４時間後、形質移入された細胞を９６ウェルプレートに分け入れて、２４時間静置した。Nano-Glo（登録商標）試薬を室温で解凍して、１：５０で混合した。等しい容積の試薬を細胞（１００μＬ）に加えて、細胞を室温で１０分間振とうした。最後に、プレートリーダーで化学発光を読み取った。陰性対照に比べて、抗GFP-RNF43融合に加えたレポータータンパク質ではナノルシフェラーゼ信号が有意に減少した。

共焦点顕微鏡
共焦点顕微鏡および続く共焦点蛍光画像形成について、細胞を上記のように形質移入して、４８時間インキュベートした。４８時間後、画像形成の前に、細胞を１２時間、ガラス底のペトリ皿に蒔いた。画像形成の前に、細胞培養液を入れ替えて、LysoTracker（登録商標）をこの溶液に加えた。細胞を４％のPFAで固定して、０．５％のTriton（商標）-XのPBSを用いて透過処理した。DAPI（４′，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）を透過処理した細胞と共にインキュベートした。最後に、細胞をPBSで３回洗浄して、１００ｘの回転台付き共焦点顕微鏡で画像処理した。

共焦点顕微鏡により、可溶性GFP FabのみではGFPレポーターの局在化には効果がないが、抗GFP-RNF4３操作された膜貫通タンパク質では内在化とGFPレポーターのリソソーム凝集が起きたことが示された。これらのデータは、RNF43を用いて内因性タンパク質のタンパク質分解を誘導することができることが示唆された。

実施例４
本実験は、操作された膜貫通タンパク質を標的細胞に挿入するAAV形質移入ベクターを生成するために設計された。

AAV導入プラスミドは、CAG、EF1、または組織特異性プロモーターの下にscFab-Ｅ３操作された膜貫通タンパク質を発現する遺伝子を置くことで構築される。HEK293T細胞をAAVヘルパープラスミド(pHelper)、Rep-Capプラスミド(pAAV-RC1またはpAAV-RC9)、およびAAV導入プラスミドを１：１：２の比で形質移入する。細胞を５％のCO₂下、３７℃で３日間インキュベートする。次いで、細胞を採取して、０．００１％プルロニック（登録商標）酸および２００ｍＭのＮａＣｌを加えたPBS緩衝剤中で超音波処理をして溶解させる。細胞残差を４℃、３，２００ｘｇで１５分間ペレット状にして、上澄みを他の試験管に移す。Benzonase（５０単位／ｍＬ）を上澄みに加えて、３７℃で４５分間、さらにインキュベートする。上澄みを４℃、２，４００ｇで１０分間、遠心分離にて精製する。次いで、イオジキサノール勾配超遠心分離（１５％、２５％、４０％および６０％イオジキサノールのPBS-MK勾配緩衝剤希釈液）で組み換えAAVを２回精製し、４０％画分を貯蔵して、MWCO 100kDa遠心分離濃縮装置で脱塩する。次いで、０．００１％プルロニック（登録商標）酸および２００ｍＭのＮａＣｌを加えたPBS緩衝剤中で脱塩AAVを－８０℃で保存する。

エキソソーム関連AAV（exoAAV）の生成については、CD9-GFPを過剰発現し得るHEK293Tの安定細胞株をレンチウイルス形質導入により構築する。HEK293TCD9-GFP細胞を、AAVヘルパープラスミド(pHelper)、Rep-Capプラスミド(pAAV-RC1またはpAAV-RC9)、およびAAV導入プラスミドを１：１：２の比で形質移入する。次いで、細胞を５％のCO₂下、３７℃のエキソソーム欠乏培地で３日間インキュベートし、その後、細胞培地を集めて、３００ｘｇで５分間、１０００ｇで１０分間、消耗させた。上澄みを１５℃、２０，０００ｇで１時間遠心分離して、再度１５℃、１００，０００ｘｇで１．５時間遠心分離する。次いで、最終のexoAAV生成物を４℃で保存する。

AAVの生体外での標的
GFP-ナノルシフェラーゼ（GFP-Nluc、配列番号７）レポーター遺伝子を安定して発現するヒーラ細胞の細胞株をFlp-In（商標）システム組み換えシステム（ThermoFisher Scientific）により構築する。形質導入の前に、Hela^GFP-Nluc細胞を９６ウェルプレートに５０，０００細胞／ウェルで２４時間、播種する。５％のCO₂下、３７℃で一晩、細胞を一般的なAAVまたはexoAAVの１０⁸個のゲノムコピーで形質導入する。培養培地を、１０％のFBSを含むDulbecco/Vogt改変イーグル最小必須培地（DMEM）と交換し、５％のCO₂下、３７℃で細胞をさらにインキュベートする。形質導入の４８時間後に、上記と同じ手順でルシフェラーゼアッセイおよびフロー分析を行う。

実施例５
動力学要件
本実施例では、RNF43を動員することでPD-L1を分解する二重特異性抗体の使用についてさらなるデータを提供する。結果は、予想とは若干異なるものであった。分解剤としての利点を決定づける二重特異性抗体の各成分に対する親和性要件があるという結論が得られた。しかしながら、当初、強い結合は理想的ではなく、若干弱い結合剤が分解過程の代謝回転を向上させ、これにより分解量が増加すると仮定された。驚くべきことに、実際には遅いオフ速度を持つ強い結合剤が分解を誘導するのに必要であった。

PD-L1との結合に関与する重要な残基のアラニン走査をPD-L1結合成分Tecentriqに対して行った。変異体はFabとして発現させて、これらの動力学的パラメータ（Kd、Kon、Koff）を測定した。次いで、これらを他方が抗RNF43 A5コンストラクトである二重特異性抗体にした。次いで、上記実施例２に記載したのと同じプロトコルを用いて、分解を定量するウェスタンブロットにて１０ｎＭの二重特異性IgGのMDA-MB-231細胞に対する分解実験を行った。これらのデータから、異なる動力学的パラメータに対する分解量をプロットした。このデータから、Koffと分解量との間に相関関係（Ｒ²＝０．６７）があることが分かる。これはオフ速度が遅いほど、分解量が多いことを意味している。

次いで、クローン抗RNF43のRNF43 A5結合剤のアラニン走査を行うことで、同様の実験を行った。CDR H3のアラニン変異体が作製された。２個のクローンを除くすべてのクローンの結合が完全に弱まったが、２個のクローンはいくらか結合を維持していた。いくらか結合を維持していた２個の変異体は、４０ｎＭおよび１２５ｎＭのRNF43（それぞれ、S113AおよびF115A）に親和性を有していた。配列番号１０６および１０７の野生型PD-L1結合剤と共に用いてこれらを二重特異性IgGとし、上記の分解実験を繰り返した。この時、分解は、１２．５ｎＭの親和性を有する野生型RNF43結合剤の場合にのみ見られ、RNF43への結合が４０ｎＭまたは１２５ｎＭまで低減した場合にはPD-L1量には変化がなかった。ここでも、このデータから、二重特異性抗体の各側に強い結合剤が必要とされることが示唆されている。

図７は、各Ala変異体のバイオ層干渉法(BLI)のグラフを合わせて示す。図７のバイオ層干渉法(BLI)のグラフに示す各アラニン変異体の動力学的パラメータを以下の表６に示す。

図８は、分解率（パーセント）とKoffとの相関関係を示す。オフ速度が遅いほど、分解量が多い。さらに、図９は分解率（パーセント）とKdとの相関関係を示す。図示のように、若干の相関関係があり、結合剤が強いほど分解量が多いことを意味している。図１０は、分解率（パーセント）とKonには相関関係がないことを示す。図１１は、抗RNF43アラニン変異体のウェスタンブロットを示している。変異体は、RNF43に対するKdで識別される。１２．５ｎＭは野生型RNF43 A5、４０ｎＭはＳ１１３Ａ、１２５ｎＭはＦ１１５Ａである。この結果は、１０ｎＭの二重特異性結合剤で２４時間治療した後、最も結合が強い抗RNF43コンストラクトのみがPD-L1を分解したことを示す。

実施例６
ここでは、Fabコンストラクトと小分子を結合する例示的な方法を記載する。これらのデータは、本開示の結合剤を含む免疫複合体を標的に動員してその分解を誘導することができることを示唆する。本明細書で開示される抗体－薬物複合体の例示的な図を図１２に示す。

細胞株。３７℃、５％のCO₂で細胞株をT75（Thermo Fisher Scientific）フラスコ中で成長、維持した。MOLT-4 CCR5+細胞を、１０％ウシ胎児血清（FBS）および２％のgeneticinを加えたRPMI-1640中で成長させた。MOLT-4 CCR5+細胞は、NIH AIDS Reagent Programから得た。

抗体のクローニング、発現、および精製。Gibson Assemblyを用いて抗RNF43 Fab LC S7M単一変異を導入した。最適化した自己誘導培地を用いてFabを大腸菌C43(DE3) Pro+中で発現させ、タンパク質A親和性クロマトグラフィーで精製した(Hornsby, M. et al. A High Through-put Platform for Recombinant Antibodies to Folded Proteins. Mol. Cell. Proteomics 14, 2833-2847 (2015))。Fabの純度および完全性をSDS-PAGEおよびインタクト質量分析で評価した。抗体－薬物複合体で用いた抗RNF43 Fabの軽鎖配列および重鎖配列を、それぞれ配列番号３２６および３２７で示す。

DBCO-CGS21680の合成。商業的に入手可能なCGS21680（Cayman Chemical、17126、５ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を１．５当量の１－［ビス（ジメチルアミノメチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（HATU、６ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）および４当量のＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（７μＬ、０．０４ｍｍｏｌ）の２ｍＬのジメチルホルムアミド溶液を４当量に加えて、室温で１０分間撹拌した。次いで、１．５当量のDBCO-PEG4-アミン（BroadPharm, BP-23958、５ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を反応フラスコに加えて、室温で一晩撹拌した。反応混合物を減圧して濃縮した。粗生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製した。最終生成物を凍結乾燥して、淡黄色の粉末として単離した（４．８ｍｇ、収率：４８％）。計算値ESI-HRMS [M+H⁺]＝１００５．４８；実測値１００５．５４

改変抗RNF43 FabのオキサジリジンおよびDBCO-CGS21680との結合。図１３に、結合過程の例示的な図を示す。オキサジリジンと結合させる場合、室温で、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中、５０μＭのFabを５モル当量のオキサジリジンアジドと共に３０分間インキュベートした (A. H. Christian et al., A physical organic approach to tuning reagents for selective and stable methionine bioconjugation. J. Am. Chem. Soc. 141, 12657-12662 (2019))。反応を１０モル当量のメチオニンで止めた。抗体を緩衝剤交換してPBSで回収し、０．５ｍＬのZeba 7-kDa脱塩カラム（Thermo Fisher Scientific）で脱塩した。次いで、１０モル当量のDBCO-CGS21680を加えて、室温で一晩インキュベートした。０．５ｍＬ Zeba 7-kDa脱塩カラムを用いて作動薬－標識複合体を脱塩して、過剰なDBCO-CGS21680を除去した。Xevo G2-XS Mass Spectrometry（Waters）を用いてインタクト質量分析により各工程での完全な結合を監視した。結合に用いたいくつかの例示的な小分子を図１４に示す。これは、結合に用いることができる小分子の包括的リストを意味するものではなく、当業者には自明だが、効用に基づいて代わりの小分子を本開示で提供する抗原結合剤に結合させることができる。

分解アッセイ完全増殖培地にて、１００万細胞／ｍＬの細胞を抗体－薬物複合体、作動薬、または拮抗薬で処理した。２４時間後、遠心分離（３００ｘｇ、５分間、４℃）にて細胞をペレット状にした。氷上にて４０分間、cOmplete（商標）ミニプロテアーゼ阻害剤カクテルを含むRIPA緩衝剤に細胞ペレットを溶解した。溶解物を１６，０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離し、BCAアッセイを用いてタンパク質濃度を正規化した。４倍のNuPAGE LDS試料緩衝剤および２－メルカプトエタノール（BME）を溶解物に加えた。等量の溶解物を４～１２％のBis-Trisゲルに充填して、２００Ｖで３７分間泳動した。このゲルを２０％エタノール中で１０分間インキュベートし、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜に移した。穏やかに振とうしながら、室温で３０分間、PBS中でこの膜を０．１％のTween20＋５％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロックした。PBS+0.2% Tween20+5% BSA中で穏やかに振とうしながら、膜をウサギ－抗A2aR（Abcam、ab3461、１：１０００）およびマウス－抗チューブリン（Cell Signaling Technologies、DM1A、１：１６００）と共に４℃で一晩共インキュベートした。トリス緩衝生理食塩水（TBS）＋０．１％のTween20で膜を4回洗浄し、次いで、室温で１時間、PBS+0.2% Tween20+5% BSA中でHRP-抗ウサギIgG（Cell Signaling Technologies、7074S、１：２０００）および680RDヤギ抗マウスIgG（LI-COR、926-68070、１：１００００）と共インキュベートした。TBS+0.1% Tween20で膜を４回洗浄し、次いでPBSで洗浄した。膜をまず、OdysseyCLxImager（LI-COR）を用いて画像処理した。次いで、SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrateを加えて、ChemiDoc Imager（BioRad）を用いて画像処理した。Image Studio Software（LI-COR）を用いてバンド強度を定量した。図１５および図１６に例示的な結果を示す。特に、図１５は、２４時間治療した後のMOLT-4 CCR5+細胞でのアデノシン2a受容体(A2aR)の分解を示し、図１６は、CGS21680（作動薬）またはZM241385（拮抗薬）で２４時間治療した後のA2aR量を示している。これらのデータは、免疫複合体を用いてRNF43を A2aRに動員して、２４時間後に１ｎＭの濃度でその分解を誘導することができることを示唆している（図１５）。図１６は、抗RNF43 Fabに結合せず、小分子（１００ｎＭの作動薬）のみで治療してもA2aR量に何ら効果を及ぼさないことを示す対照である。

他の標的としては、これらに限定されないが、CXCR4、CCR5、スムーズンド、CCR2、CCR9、プロテイナーゼ活性化受容体１(PAR1)、PAR2、μオピオイド受容体、δオピオイド受容体、κオピオイド受容体、およびニューロキニン受容体１が挙げられる。

本開示の特定の代替えを開示しが、自明のとおり、様々な変更および組み合わせが可能であり、付属の請求項の真の精神および範囲内で考えられる。従って、本明細書で示された要約および開示に限定の意図はない。

Claims

二重特異性結合剤であって、以下：
ａ）Ｅ３リガーゼに特異的に結合する第一の結合ドメイン、および
ｂ）標的細胞の標的タンパク質上の細胞外エピトープに特異的に結合する第二の結合ドメイン、
を含み、
前記Ｅ３リガーゼおよび前記標的タンパク質の両方が膜結合性である、二重特異性結合剤。
前記二重特異性結合剤の、前記Ｅ３リガーゼおよび前記標的タンパク質の両方への結合が、前記標的タンパク質のユビキチン化をもたらす、請求項１に記載の二重特異性結合剤。
前記標的細胞は腫瘍細胞（neoplastic cell）である、請求項１または２に記載の二重特異性結合剤。
前記細胞は、乳癌、Ｂ細胞リンパ腫、膵臓癌、ホジキンリンパ腫、卵巣癌、前立腺癌、中皮腫、肺癌、非ホジキンＢ細胞(B-NHL)、メラノーマ、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、神経芽細胞腫、神経膠腫、膠芽細胞腫、膀胱癌、および結腸直腸癌からなる群より選択される癌細胞である、請求項１～３の何れか一項に記載の二重特異性結合剤。
前記標的タンパク質は免疫チェックポイントタンパク質である、請求項１～４の何れか一項に記載の二重特異性結合剤
前記標的タンパク質は、PD-L1、PD-1、CTLA-4、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、KIR、LAG3、NKG2D、TIM-3、VISTA、およびSIGLEC7からなる群より選択される、請求項１～５の何れか一項に記載の二重特異性結合剤。
前記第一の結合ドメインは、Ｅ３リガーゼに結合した細胞外タンパク質、またはＥ３リガーゼと相互作用する膜貫通タンパク質と特異的に結合する、請求項１～６の何れか一項に記載の二重特異性結合剤。
前記標的タンパク質の分解は標的細胞の増殖能力を低減する、請求項１～７の何れか一項に記載の二重特異性結合剤。
前記標的タンパク質はHER2、CD19、CD20、CDCP1、PD-L1、EGFR、MMP14、およびCTLA-4からなる群より選択される、請求項１～８の何れか一項に記載の二重特異性結合剤。
前記Ｅ３リガーゼは膜貫通タンパク質である、請求項１～９の何れか一項に記載の二重特異性結合剤。
前記Ｅ３リガーゼはRNF43、RNF128 (GRAIL)、ZNRF3、およびMARCH11からなる群より選択される、請求項１～１０の何れか一項に記載の二重特異性結合剤。
前記第一の結合ドメインと前記第二の結合ドメインがそれぞれ独立して、半抗体（half antibodies）、単一ドメイン抗体、ナノボディ、単一特異的Fab₂、scFv、scFv-Fc、ミニボディ、IgNAR、V-NAR、hcIgG、VhH、ラクダ抗体、およびペプチボディからなる群より選択される、あるいは前記第一の結合ドメインと前記第二の結合ドメインは共に、二重特異性抗体、二重特異性ダイアボディ、二重特異性Fab₂、二重特異性ラクダ抗体、または二重特異性ペプチボディを形成する、請求項１～１１の何れか一項に記載の二重特異性結合剤。
ｉ）前記第一の結合ドメインは、配列番号１２または３２０で示される重鎖フレームワーク領域（FR）配列、および配列番号１１または３１９で示される軽鎖FR配列を含み、かつ
ｉｉ）前記第二の結合ドメインは、配列番号１２または３２０で示される重鎖FR配列、および配列番号１１または３１９で示される軽鎖FR配列を含む、請求項１～１２の何れか一項に記載の二重特異性結合剤。
ｉ）前記第一の結合ドメインは、それぞれ表２に示される配列を含む軽鎖可変領域CDR3(LC-CDR3)配列、および重鎖可変領域CDR1(HC-CDR1)配列、HC-CDR2配列、およびHC-CDR3配列を含み、かつ
ｉｉ）前記第二の結合ドメインは、それぞれ表３に示される配列を含むLC-CDR3配列、HC-CDR1配列、HC-CDR2配列、およびHC-CDR3配列を含む、請求項１～１３の何れか一項に記載の二重特異性結合剤。
ｉ）前記第一の結合ドメインは、重鎖可変領域（VH）を含み、前記VHは、配列番号３２１で示されるFR配列を含み、かつ
ｉｉ）前記第二の結合ドメインは、配列番号１２または３２０で示される重鎖FR配列、および配列番号１１または３１９で示される軽鎖FR配列を含む、請求項１～１４の何れか一項に記載の二重特異性結合剤。
ｉ）前記第一の結合ドメインは、それぞれ表４に示されるVH-CDR1配列、VH-CDR2配列、およびVH-CDR3配列を含み、かつ
ｉｉ）前記第二の結合ドメインは、それぞれ表３に示される配列を含むLC-CDR3配列、HC-CDR1配列、HC-CDR2配列、およびHC-CDR3配列を含む、請求項１５に記載の二重特異性結合剤。
前記二重特異性結合剤は二重特異性抗体を含む、請求項１～１６の何れか一項に記載の二重特異性結合剤。
前記二重特異性結合剤は二重特異性IgGを含む、請求項１～１７の何れか一項に記載の二重特異性結合剤。
前記二重特異性結合剤はノブ・アンド・ホール（knob and hole）二重特異性IgGを含む、請求項１～１８の何れか一項に記載の二重特異性結合剤。
前記第一の結合ドメインは二重特異性抗体を含み、前記第二の結合ドメインは単鎖Fabを含む、請求項１～１９の何れか一項に記載の二重特異性結合剤。
前記第一の結合ドメインはFabを含み、前記第二の結合ドメインはscFvを含む、請求項１～２０の何れか一項に記載の二重特異性結合剤。
請求項１～２１の何れか一項に記載の二重特異性結合剤をコードする核酸。
前記核酸は操作可能に（operably）プロモーターに結合されている、請求項２２に記載の核酸。
請求項２２または２３に記載の核酸を含むタンパク質を発現することができる操作された細胞。
前記細胞は、Ｂ細胞、Ｂメモリ細胞、または形質細胞である、請求項２３に記載の細胞。
二重特異性結合剤を作製する方法であって、
ａ）タンパク質を合成することができ、請求項２０または２１に記載の核酸を含む細胞を提供すること、および
ｂ）前記二重特異性結合剤の発現を誘導すること、
を含む、方法。
請求項２２または２３に記載の核酸を含む、ベクター。
プロモーターをさらに含み、前記プロモーターが、前記核酸に操作可能に結合されている、請求項２４に記載のベクター。
ｉ）請求項１～２１の何れか一項に記載の二重特異性結合剤、
ｉｉ）小分子、および
ｉｉｉ）リンカー、
を含む、免疫複合体。
前記リンカーは、切断可能なリンカー、切断不可能なリンカー、親水性リンカー、およびジカルボン酸系リンカーからなる群より選択される、請求項２９に記載の免疫複合体。
前記リンカーはPEG4である、請求項２９または３０に記載の免疫複合体。
前記小分子は、アミン、CGS21680、オキサジリジン－アジド、ZM241385、プレリキサフォル、マラビロク、およびアプラビロクを含む、請求項２９～３１の何れか一項に記載の免疫複合体。
（１）請求項１～２１の何れか一項に記載の二重特異性結合剤、請求項２２または２３に記載の核酸、または請求項２９～３２の何れか一項に記載の免疫複合体、および
（２）薬学的に許容される担体、
を含む、医薬組成物。
標的タンパク質が腫瘍細胞の表面に存在する腫瘍性疾患を治療するための、操作された膜貫通タンパク質であって、
ａ）膜結合性Ｅ３リガーゼ、および
ｂ）前記膜結合性Ｅ３リガーゼに結合された、前記標的タンパク質に特異的な標的タンパク質結合ドメイン、
を含む、操作された膜貫通タンパク質。
前記Ｅ３リガーゼと前記標的タンパク質結合ドメインは共有結合している、請求項３４に記載の操作された膜貫通タンパク質。
前記Ｅ３リガーゼと前記標的タンパク質結合ドメインは、融合タンパク質として発現される、請求項３４または３５に記載の操作された膜貫通タンパク質。
前記Ｅ３リガーゼと前記標的タンパク質結合ドメインは、ジスルフィド結合で共有結合している、請求項３４～３６の何れか一項に記載の操作された膜貫通タンパク質。
前記標的タンパク質結合ドメインが、HER2、EGFR、CDCP1、PD-L1、PD-1、CTLA-4、CD19、CD20、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、KIR、LAG3、NKG2D、TIM-3、VISTA、およびSIGLEC7からなる群より選択される標的タンパク質に特異的である、請求項３４～３７の何れか一項に記載の操作された膜貫通タンパク質。
請求項３４～３８の何れか一項に記載の操作された膜貫通タンパク質をコードする核酸。
前記核酸はベクターをさらに含む、請求項３９に記載の核酸。
前記核酸は操作可能にプロモーターに結合されている、請求項３９または４０に記載の核酸。
請求項３４～３８の何れか一項に記載の操作された膜貫通タンパク質、または請求項３９～４１の何れか一項に記載の核酸を含む、操作された細胞。
標的タンパク質が腫瘍細胞の表面に存在する腫瘍性疾患を治療するための組成物であって、
ａ）治療量の請求項３４～３８の何れか一項に記載の操作された膜貫通タンパク質、および
ｂ）前記腫瘍細胞の細胞膜と融合することができる融合性担体、
を含む、組成物。
前記担体は融合性リポソームである、請求項４３に記載の組成物。
標的タンパク質が腫瘍細胞の表面に存在する腫瘍性疾患を治療するための組成物であって、
ａ）治療量の請求項３９～４１の何れか一項に記載の核酸、および
ｂ）前記核酸を前記腫瘍細胞の細胞質ゾルに送達することができる薬学的に許容される担体、
を含む、組成物。
前記担体はウイルス粒子を含む、請求項４５に記載の組成物。
前記担体はリポソームを含む、請求項４５に記載の組成物。
対象の腫瘍性疾患または障害を治療する方法であって、治療有効量の：
ａ）請求項１～２１の何れか一項に記載の二重特異性結合剤；
ｂ）請求項２９～３２の何れか一項に記載の免疫複合体；
ｃ）請求項３４～３８の何れか一項に記載の操作された膜貫通タンパク質；
ｄ）請求項２２または２３または３９～４１の何れか一項に記載の核酸；あるいは
ｅ）請求項２４、２５、または４２の何れか一項に記載の細胞、
を、それを必要とする対象に投与すること、を含む、方法。
ａ）請求項１～２１の何れか一項に記載の二重特異性結合剤、
ｂ）請求項２９～３２の何れか一項に記載の免疫複合体、
ｃ）請求項３４～３８の何れか一項に記載の操作された膜貫通タンパク質、
ｄ）請求項２２または２３または３９～４１の何れか一項に記載の核酸、あるいは
ｅ）請求項２４、２５、または４２の何れか一項に記載の細胞、
の、腫瘍性疾患の治療での使用。
ａ）請求項１～２１の何れか一項に記載の二重特異性結合剤、
ｂ）請求項２９～３２の何れか一項に記載の免疫複合体、
ｃ）請求項３４～３８の何れか一項に記載の操作された膜貫通タンパク質、
ｄ）請求項２２または２３または３９～４１の何れか一項に記載の核酸、あるいは
ｅ）請求項２４、２５、または４２の何れか一項に記載の細胞、
の、腫瘍性疾患を治療するための薬剤の製造での使用。