JP6479331B2

JP6479331B2 - 脊髄組織標的化ペプチド及びその利用

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Publication number: JP6479331B2
Application number: JP2014082766A
Authority: JP
Inventors: 智也寺島; 前川　聡; 聡前川; 秀人小島
Original assignee: Shiga University of Medical Science NUC
Current assignee: Shiga University of Medical Science NUC
Priority date: 2014-04-14
Filing date: 2014-04-14
Publication date: 2019-03-06
Anticipated expiration: 2034-04-14
Also published as: JP2015203014A

Description

本発明は、脊髄組織標的化ペプチド及びその利用に関する。

これまでのバイオテクノロジーの発展によって、標的遺伝子に対する発現抑制作用を有する核酸をはじめとして、有用作用を備える物質が数多く報告されている（非特許文献１）。また、このような有用作用を備える物質を組織や細胞などへ送達する手段も数多く報告されている。このような送達手段の代表的なものとしてはリポソームが例示でき、リポソームはその内部に種々の被送達物質を封入できることから、核酸や薬物といった様々な被送達物質の送達に利用しやすい。

一方、このような送達技術においては、例えば特定の組織や細胞において有用作用を発揮させたい場合には、被送達物質を目的とする組織や細胞に効率良く送達することが求められる。このような送達技術の向上は疾患の診断、予防、治療、更には疾患の原因解明の進展などに大きく寄与することが期待されるため、被送達物質を目的とする組織や細胞に効率良く送達できる新たな技術を提供することは非常に重要である。

金玲ら、ＲＮＡ医薬、実験医学（「ＲＮＡの機能解明と医療応用」林崎良英、安田純編）、Vol.26、NO.10、 p.1651-1656、2008

このことから、本発明は、目的とする組織や細胞に被送達物質を効率良く送達できる新たな技術を提供することを目的とする。具体的には、本発明は、脊髄組織に被送達物質を効率良く送達できるペプチド等を提供することを目的とする。

本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討したところ、脊髄組織を効率良く標的化できるペプチドを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成されたものである。

すなわち、本発明は、以下に掲げる発明を提供する。
項１．以下の（１−１）または（１−２）で表される脊髄組織標的化ペプチド：
（１−１）配列番号１〜５からなる群より選択される少なくとも１種で表されるアミノ酸配列の両末端にそれぞれ少なくとも１つのシステイン残基が直接連結してなるペプチド、
（１−２）前記（１−１）のペプチドにおいて、配列番号１〜５からなる群より選択される少なくとも１種で表されるアミノ酸配列が、１または複数のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、脊髄組織を標的とするペプチド。
項２．前記両末端のシステイン残基において、片端のシステイン残基が他端のシステイン残基とジスルフィド結合を形成してなる、項１に記載のペプチド。
項３．脊髄組織が、脊髄組織全体、脊髄組織内のアストロサイト及び脊髄組織内のミクログリアからなる群より選択される少なくとも１種である、項１または２に記載のペプチド。
項４．以下の（２−１）または（２−２）で表されるポリヌクレオチド：
（２−１）前記（１−１）及び（１−２）のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（２−２）前記（２−１）のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、脊髄組織標的化ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
項５．項１〜３のいずれかに記載のペプチドを含有する医薬組成物。
項６．更に被送達物質を含有する、項５に記載の医薬組成物。
項７．項１〜３のいずれかに記載のペプチドまたは項５及び６のいずれかに記載の医薬組成物を対象物に投与する工程を含有する、対象物中の脊髄組織を標的化する方法。
項８．項６に記載の医薬組成物を対象物に投与する工程を含有する、被送達物質の脊髄組織への送達方法。

本発明のペプチドによれば脊髄組織を標的化できる。このため、本発明のペプチドと被送達物質とを併用することによって、脊髄組織に被送達物質を効率良く送達することができる。

また、このような本発明によれば被送達物質を脊髄組織へより高効率で送達できることから、被送達物質に起因する有用作用を脊髄組織においてより効率良く発揮させることができる。これによって、脊髄組織の分子イメージング、脊髄疾患の病状観察、被送達物質による疾患治療などを一層効果的に行うことができる。

図１は、ループ状にあるペプチドのモデル形態の例示である。図２は、ペプチド１及び２を用いて脊髄組織を標的化した結果を示す。図３は、ペプチド１及び２を用いて脊髄組織を標的化した結果を示す。図４は、ペプチド３を用いて脊髄組織を標的化した結果を示す。図５は、ペプチド３を用いて脊髄組織を標的化した結果を示す。図６は、ペプチド４及び５を用いて脊髄組織を標的化した結果を示す。図７は、得られた複合体のモデルを示す。図８は、得られた複合体の電気泳動パターンを示す。図９は、得られた複合体を投与したマウスにおいて変異型hSOD1タンパク質の発現が有意に抑制されていることを示す。図１０は、変異型hSOD1(G93A)の発現抑制効果を示す。

１．ペプチド
本発明は、以下の（１−１）または（１−２）で表される脊髄組織標的化ペプチドを提供する。すなわち、本発明は、（１−１）配列番号１〜５からなる群より選択される少なくとも１種で表されるアミノ酸配列の両末端にそれぞれ少なくとも１つのシステイン残基が直接連結してなるペプチド、また、（１−２）前記（１−１）のペプチドにおいて、配列番号１〜５からなる群より選択される少なくとも１種で表されるアミノ酸配列が、１または複数のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、脊髄組織を標的とするペプチドを提供する。

前記（１−１）において「配列番号１〜５からなる群より選択される少なくとも１種で表されるアミノ酸配列」とは、配列番号１〜５で表されるそれぞれのアミノ酸配列が、それぞれその配列を保持しながら１または複数の配列が連結したアミノ酸配列をいう。該連結は、本発明のペプチドが脊髄組織を標的化できることを限度として特に制限されないが、好ましくはペプチド結合によって連結しているものが例示される。該（１−１）において「１または複数の配列」の範囲は本発明のペプチドが脊髄組織を標的化できることを限度として制限されないが、十分に標的化できる観点から、例えば１〜３つの配列、好ましくは１〜２つの配列、より好ましくは１つの配列が挙げられ、また、例えば同種のアミノ酸配列が連結しているものであっても異種のアミノ酸配列が連結しているものであってもよく、脊髄組織を標的化できることを限度としてその種類や順序も制限されない。配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列は、いずれも７つのアミノ酸残基からなる。

後述の実施例に示されるように、配列番号１及び２のいずれかで表されるアミノ酸配列は特に脊髄組織全体に対する特異性が高く、配列番号３で表されるアミノ酸配列は特に脊髄組織内のアストロサイトに対する特異性が高く、配列番号４及び５のいずれかで表されるアミノ酸配列は特に脊髄組織内のミクログリアに対する特異性が高い。このことから、特異性をより高める観点から、例えば脊髄組織全体を特に標的化したい場合には、配列番号１及び２からなる群より選択される少なくとも１種で表されるアミノ酸配列が１または複数連結したアミノ酸配列を用いることが好ましい。また、同様の観点から、例えば脊髄組織内のアストロサイトを特に標的化したい場合には配列番号３で表されるアミノ酸配列が１または複数連結したアミノ酸配列を用いることが好ましく、脊髄組織内のミクログリアを特に標的化したい場合には配列番号４及び５からなる群より選択される少なくとも１種で表されるアミノ酸配列が１または複数連結したアミノ酸配列を用いることが好ましい。

また、該（１−１）において、前記アミノ酸配列の両末端にはそれぞれ少なくとも１つのシステイン残基が直接連結している。該連結は、本発明のペプチドが脊髄組織を標的化できることを限度として特に制限されないが、好ましくは前記アミノ酸配列の末端にペプチド結合によって直接連結しているものが例示される。両末端のシステイン残基数は、本発明のペプチドが脊髄組織を標的化できることを限度として特に制限されず、また、両末端のシステイン残基数は同じであってもよく異なってもよく、例えば各末端においてそれぞれ１〜３個、好ましくは１〜２個、より好ましくは１個が挙げられる。

また、本発明のペプチドは、脊髄組織を標的化できることを限度として特に制限されず、直鎖状、ループ状などの任意の形態が挙げられるが、好ましくはループ状であり、より好ましくは前記両末端のシステイン残基において片端のシステイン残基が他端のシステイン残基とジスルフィド結合を形成してなるループ状が例示される。本発明を限定するものではないが、ループ状にあるペプチドのモデル形態は図１のように例示できる。図１は、両末端に１つずつシステイン残基が連結した、合計９つのアミノ酸残基からなるループ状にあるペプチドのモデル形態であり、Ｃはシステイン残基を示し、Ｘ_１〜Ｘ_７は脊髄組織を標的化できる前述のアミノ酸配列を示す。本発明においてペプチドは、アミノ酸残基の数によってはオリゴペプチド、ポリペプチドと称されるものも含む。

該（１−１）においてペプチドのアミノ酸残基数は本発明のペプチドが脊髄組織を標的化できることを限度として特に制限されないが、好ましくは９〜２３個、より好ましくは９〜１６個、更に好ましくは９〜１４個、特に好ましくは９個が挙げられる。該（１−１）において９個のアミノ酸残基からなるペプチドの例示としては、配列番号１〜５のいずれか１種で表されるアミノ酸配列の両末端にそれぞれ１つのシステイン残基が直接連結してなるペプチドが挙げられる。

前記（１−２）において、「１または複数のアミノ酸」の範囲は、該（１−２）に記載されるペプチドが脊髄組織を標的化できることを限度として特に制限されないが、例えば１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、更に好ましくは１または２個、特に好ましくは１個が挙げられる。特定のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸を欠失、置換及び／または付加させる技術は公知である。なお、このように欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列として、「配列番号１〜５からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸配列」に対して５７％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、脊髄組織を標的化できる配列が例示される。また、該アミノ酸配列として、アミノ酸の同一性は好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、更に特に好ましくは９７％以上、一層好ましくは９８％以上である。

本発明のペプチドは、従来公知の化学合成法や遺伝子工学的手法などによって作製できる。例えば、本発明のペプチドをコードするアミノ酸配列やヌクレオチド配列の情報に従って、本発明のペプチドを従来公知の化学合成法により合成、精製して取得してもよい。なお、化学合成法には、液相法や固相法によるペプチド合成法が包含される。また、本発明のペプチドは後述の実施例に基づいて作製できる。このほか、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをベクター等に挿入し、次いで、該ベクターが組み込まれた形質転換体を培養したのち、所望のペプチドを取得してもよい。

本発明において「脊髄組織標的化」、「標的とする」とは、本発明のペプチドが他の組織と比較して脊髄組織に高い親和性を有する、あるいは脊髄組織を高効率で認識できることを意味する。特に、本発明のペプチドは、他の組織や細胞と比較して、脊髄組織全体、脊髄組織内のアストロサイト及び脊髄組織内のミクログリアからなる群より選択される少なくとも１種の脊髄組織に高い親和性を有する、あるいは脊髄組織を高効率で認識できることを意味する。

本発明のペプチドを用いて脊髄組織を標的化するにあたって、その方法は特に制限されず、該ペプチドを脊髄組織に接触させればよい。また、本発明のペプチドによる標的化はin vivo、in vitro及びex vivoのいずれであってもよい。例えば、本発明のペプチドをin vitroやex vivoで標的化させる場合、脊髄組織や脊髄組織を含む対象物に該ペプチドの適当量を接触させ、また、必要に応じてインキュベートすればよい。また、本発明のペプチドをin vivoで標的化させる場合には、組織への直接注入、静脈、皮下、筋肉または腹腔への注射をはじめ、髄腔内（脊髄腔内を含む）投与、経口投与、吸入投与、経粘膜投与等により本発明のペプチドを投与すればよい。本発明のペプチドの適用対象（対象物）は本発明の効果が得られる限り制限されず、ヒトやヒト以外の霊長類をはじめとする哺乳動物、またこれらに由来する脊髄組織に適用される。

本発明のペプチドはこのように脊髄組織を標的化できるので、脊髄組織の観察や診断等に有用である。該ペプチドは例えば医薬分野において、脊髄組織の分子イメージング、脊髄組織における疾患の予防、軽減または治療、オーターメード医療、創薬、疾患の原因解明、また、疾患の治療効果を評価するためのツールなど様々な用途に用いることができる。また、本発明のペプチドは、単独で優れた脊髄組織標的化能を示すので、被送達物質の脊髄組織への送達に好適に使用される。また、本発明のペプチドをこのように医薬分野で使用する場合、例えば後述する医薬組成物としても使用され得る。

このように本発明のペプチドによれば脊髄組織を効率良く標的化できる。このため、本発明のペプチドと被送達物質とを併用することによって、脊髄組織に被送達物質をより効率よく送達することができる。また、このような本発明によれば被送達物質の脊髄組織への運搬をより高効率で行うことができることから、被送達物質に起因する有用作用を脊髄組織において効率良く発揮させることができる。また、このような本発明によれば、脊髄組織以外の他組織や他細胞への副作用を軽減あるいは回避することができる。また、本発明のペプチドの利用においては複雑な工程を必要とせず、組み合わせる被送達物質も自由に選択でき、汎用性が非常に高い。従って、本発明によれば、前述のように脊髄組織の分子イメージング、脊髄疾患の病状観察、被送達物質による疾患治療などを一層効果的に行うことができる。また、本発明によって脊髄組織の様子を一層明らかにすることによって、疾患の診断方法、予防方法、治療方法、また、オーダーメード医療、創薬、疾患の原因解明などにおける更なる進展につながる。

２．ポリヌクレオチド
本発明は、更に脊髄組織標的化ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明においてポリヌクレオチドは、前記脊髄組織標的化ペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り制限されず、以下のポリヌクレオチドが挙げられる；
（２−１）前記（１−１）及び（１−２）のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（２−２）前記（２−１）のポリヌクレオチドの相補鎖に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、脊髄組織標的化ペプチドをコードするポリヌクレオチド。

ここで、前記（２−１）のポリヌクレオチドは、当業者であれば前記ペプチドのアミノ酸配列に基づいて、従来公知の手法に基づき容易に解析、入手することができる。本発明を制限するものではないが、配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号６〜１０のいずれかで表される塩基配列が例示される。配列番号６は、配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。同様に、配列番号７は配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、配列番号８は配列番号３で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、配列番号９は配列番号４で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、配列番号１０は配列番号５で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。そして、これらをはじめとする前述のアミノ酸配列をコードする塩基配列の両末端にそれぞれ少なくとも１つのシステイン残基をコードする塩基配列を設けたものが、前記（１−１）及び（１−２）のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドとして例示される。これらの塩基配列に従って前記（２−１）のポリヌクレオチドを従来公知の手法に基づき解析、入手してもよく、また、システイン残基をコードする塩基配列も公知である。

前記（２−２）において「ストリンジェントな条件」とは、例えば６５℃で５×ＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）中でハイブリダイズさせ、更に０．１％のＳＤＳを含有する０．５×ＳＳＣ溶液で６５℃で洗浄する条件を意味する。ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションの各操作は、「Molecular Cloning (Third Edition)」(J. Sambrook & D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)に記載されている方法など、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、また、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる。

前記相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、通常、前記（２−１）のいずれかのヌクレオチド配列と一定以上の同一性を有し、その同一性は例えば５７％以上が例示され、好ましくは７０％以上、より好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、更に特に好ましくは９８％以上、一層好ましくは９９％以上である。ヌクレオチド配列の同一性は市販のまたはインターネット等の電気通信回線を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、ＳＳＥＡＲＣＨ等のソフトウェアを用いて、計算、決定できる。

ここで「脊髄組織標的化」とは前述と同様に説明され、また、前記ポリヌクレオチドを用いて作製されるペプチドは他の組織と比較して脊髄組織に高い親和性を有し、あるいは脊髄組織を高効率で認識できる。特に、前記ポリヌクレオチドを用いて作製されるペプチドは、他の組織や細胞と比較して、脊髄組織全体、脊髄組織内のアストロサイト及び脊髄組織内のミクログリアからなる群より選択される少なくとも１種の脊髄組織に高い親和性を有し、あるいは脊髄組織を高効率で認識できる。前記ポリヌクレオチドからのペプチドの作製は、当該分野において従来公知の化学合成法や遺伝子工学的手法などを用いて行えばよく、前述の通りこれは当業者にとって容易である。

また、本発明のポリヌクレオチドも、従来公知の化学合成法や遺伝子工学的手法などを用いて作製できる（Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981)；Science, 222, 778 (1983)；Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press(1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、II、III」、日本生化学会編（1986）等参照）。例えば、配列番号１〜５のいずれかで表されるアミノ酸の配列情報や、配列番号６〜１０のいずれかで表されるヌクレオチドの配列情報に基づいて、従来公知の化学的合成法により作製、取得すればよい。

３．医薬組成物
本発明は、前記ペプチドを含有する医薬組成物を提供する。すなわち、本発明は、前記（１−１）及び（１−２）からなる群より選択される少なくとも１種の脊髄組織標的化ペプチドを含有する医薬組成物を提供する。

本発明の医薬組成物は、脊髄組織に対して脊髄組織標的化ペプチドを標的化させるために使用されるものであり、該ペプチドは前述の通りである。本発明の医薬組成物における前記ペプチドの含有量は、該医薬組成物を用いることによって前記ペプチドを脊髄組織に対して標的化できる限り制限されず、該医薬組成物の形態、使用態様、接触される脊髄組織の重量、種類、状態などによって当業者が適宜設定すればよい。例えば、後述の実施例では前記ペプチド１５μｇを静脈投与することで脊髄組織を標的化することが可能であり、該ペプチドの含有量等は該適用量に基づいて、当業者が適宜設定すればよい。

本発明の医薬組成物には必要に応じて更に被送達物質が含有されていてもよい。被送達物質としては脊髄組織に送達させたいものであれば何ら制限されず、目的に応じて当業者が適宜決定すればよい。被送達物質として例えば、蛍光物質、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどのｓｍａｌｌＲＮＡやＤＮＡをはじめとするオリゴヌクレオチドなどの核酸、ペプチド、タンパク質、薬物などが挙げられる。被送達物質を前記ペプチドと共に用いることによって、被送達物質を脊髄組織に効率よく送達できる。

被送達物質を脊髄組織に更に効率よく送達する観点から、被送達物質は前記ペプチドと連結していることが好ましい。該連結は被送達物質が前記ペプチドと連結しており、且つ、被送達物質の有する有用作用と前記ペプチドの有する標的化能を阻害しないことを限度として制限されない。この限りにおいて、前記ペプチドと被送達物質は、直接またはリンカーを介して連結されていればよく、例えば静電気的結合、塩基性アミノ酸を介した結合、グリシンを介した結合、アミノカプロン酸を介した結合などが例示できる。これらは１種単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。

本発明を制限するものではないがこれらの連結について例示すると、例えば被送達物質が脊髄組織の細胞内等に働きかけて有用作用を発揮するような場合には、前記ペプチドにより脊髄組織が標的化された後に、被送達物質が前記ペプチドから離れることにより細胞内で効率良く有用作用を発揮することが考えられる。このような場合には、被送達物質は、前記ペプチドの脊髄組織への標的後に被送達物質が前記ペプチドから分離可能な状態で、前記ペプチドに連結されていることが好ましく、例えば静電気的結合が例示される。また、例えば被送達物質が負電荷を帯びているものであれば、被送達物質は正電荷を帯びたリンカーを介して前記ペプチドに連結されていてもよく、正電荷を帯びたリンカーとしてはアルギニン、リジン及び／またはヒスチジンなどの塩基性アミノ酸を含むリンカーが例示される。このようなリンカーの長さは本発明の効果が得られる限り制限されず、当業者が適宜設定すればよい。また、本発明を制限するものではないが、被送達物質の細胞内への導入効率を高める観点から、リンカーは被送達物質の細胞内への導入効率を高める作用を有しているものが好ましく、このようなリンカーとして正電荷を有するリンカーが例示される。

また、本発明を制限するものではないが、例えば被送達物質が前記ペプチドから分離されることなくその有用作用を発揮させたい場合には、前記ペプチドの脊髄組織への標的後に被送達物質が前記ペプチドに連結されたままとなっていることが好ましく、この場合には化学的な結合が例示される。また、後述の実施例に示されているように、リンカーは、グリシンリンカー等の別のリンカーを介して更に連結されていてもよい。

また、前記被送達物質または前記リンカーは、被送達物質が有する有用作用と前記ペプチドの有する標的化能を阻害しないことを限度として、前記ペプチドの任意の部分に連結させればよいが、前記ペプチドの前記末端のシステイン残基に連結させることが好ましい。また、本発明の効果が得られる限り制限されないが、被送達物質は片端のシステイン残基のみに連結していてもよく、両端のシステイン残基に連結していてもよい。例えば、後述の実施例のように、被送達物質として蛍光物質と核酸とを用いる場合には、蛍光物質と核酸の有用作用の相違、電荷、物理的な障害等を考慮して、片端のシステイン残基には蛍光物質を、他端のシステイン残基には核酸を連結させてもよい。

本発明の医薬組成物における前記被送達物質の含有量は、脊髄組織において被送達物質の有用作用が発揮される限り制限されず、該医薬組成物の形態、使用態様、脊髄組織の重量、種類、状態などによって当業者が適宜設定すればよい。本発明を制限するものではないが、例えば、後述の実施例では前記ペプチドと被送達物質とは重量比３：１で併用することにより脊髄組織を標的化し、また、被送達物質に由来する有用作用を発揮させることが可能であり、該被送達物質の含有量等は、該適用量に基づいて、更に使用する被送達物質を鑑みて当業者が適宜設定すればよい。

また、本発明の医薬組成物には必要に応じて薬学的に許容可能な担体が含有されていてもよい。担体としては本発明の効果が得られる限り制限されないが、精製水、緩衝液、生理食塩水、RNase free水、DNAse free水、プロテアーゼフリー水、グルコース水溶液、等張化剤、賦形剤、希釈剤、増粘剤、安定化剤、緩衝剤、保存剤等が例示され、使用形態に応じて当業者が適宜決定すればよい。

本発明の医薬組成物を脊髄組織に接触させることによって、前記ペプチドによって脊髄組織を標的化でき、また、例えば前記被送達物質を併用する場合には標的化された脊髄組織に該被送達物質が効率良く送達される。本発明の医薬組成物はin vitro、ex vivo及びin vivoのいずれにおいて使用されてもよい。例えば、本発明の医薬組成物をin vitroやex vivoで標的化させる場合、脊髄組織や脊髄組織を含む対象物に該医薬組成物の適当量を接触させ、また、必要に応じてインキュベートすればよい。また、本発明の医薬組成物をin vivoで標的化させる場合には、組織への直接注入、静脈、皮下、筋肉または腹腔への注射をはじめ、髄腔内（脊髄腔内を含む）投与、経口投与、吸入投与、経粘膜投与等により本発明の医薬組成物を投与すればよい。

このことから本発明の医薬組成物の製剤形態は本発明の効果が得られる限り制限されず、液剤（シロップ等を含む）、点滴剤、注射剤などの液状製剤；ゲル剤などの半固形製剤；凍結乾燥製剤、ドライシロップ剤、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤（ソフトカプセルを含む）などの固形状製剤が例示される。また、本発明の医薬組成物が固形製剤である場合は、使用時に注射用蒸留水、滅菌水などを加えて再度溶解して使用してもよい。

また、本発明の医薬組成物が適用される疾患または症状は脊髄組織が関与しているものである限り制限されない。脊髄組織と疾患または症状の関係については当該技術分野において公知である。また、本発明の医薬組成物の適用対象（対象物）は本発明の効果が得られる限り制限されず、ヒトやヒト以外の霊長類をはじめとする哺乳動物、またこれらに由来する脊髄組織が好ましく例示される。

本発明の医薬組成物によればこのように脊髄組織を標的化できるので、該医薬組成物は脊髄組織の分子イメージング、脊髄組織における疾患の予防、軽減または治療、オーターメード医療、創薬、疾患の原因解明、また、疾患の治療効果を評価するためのツールなど様々な用途に用いることができる。

このように本発明の医薬組成物によれば脊髄組織を効率良く標的化できる。また、本発明の医薬組成物が被送達物質を更に含有する場合には、脊髄組織に被送達物質をより効率よく送達することができる。また、このような本発明によれば被送達物質の脊髄組織への運搬をより高効率で行うことができることから、被送達物質に起因する有用作用を脊髄組織において一層効率良く発揮させることができる。また、このような本発明によれば、脊髄組織以外の他組織や他細胞への副作用を軽減あるいは回避することができる。また、本発明の医薬組成物の利用においては複雑な工程を必要とせず、組み合わせる被送達物質も自由に選択でき、汎用性も非常に高い。従って、本発明によれば、脊髄組織の分子イメージング、脊髄疾患の病状観察、被送達物質による疾患治療などを一層効果的に行うことができる。また、本発明によって脊髄組織の様子を一層明らかにすることによって、疾患の診断方法、予防方法、治療方法、また、オーダーメード医療、創薬、疾患の原因解明などにおける更なる進展につながる。

４．方法
本発明は、更に、前記脊髄組織標的化ペプチドまたは前記医薬組成物を対象物に投与する工程を含有する、対象物中の脊髄組織を標的化する方法を提供する。また、本発明は、更に、前記被送達物質を含有する医薬組成物を対象物に投与する工程を含有する、被送達物質の脊髄組織への送達方法を提供する。

これらの方法において、脊髄組織標的化ペプチド、医薬組成物、被送達物質、対象物、投与、標的化、被送達物質の脊髄組織への送達方法等については前述と同様に説明される。本発明の対象物中の脊髄組織を標的化する方法を実施することによって、脊髄組織を効率良く標的化できる。また、該方法において医薬組成物が被送達物質を含有している場合には、あるいは、前記被送達物質の脊髄組織への送達方法によれば、脊髄組織に被送達物質をより効率よく送達することができ、従って、被送達物質に起因する有用作用を脊髄組織において効率良く発揮させることができる。また、これらの方法によれば、脊髄組織以外の他組織や他細胞への副作用を軽減あるいは回避することができる。従って、これらの方法によれば、脊髄組織の分子イメージング、脊髄疾患の病状観察、被送達物質による疾患予防、軽減または治療などを一層効果的に行うことができる。また、これらの方法によって脊髄組織の様子を一層明らかにすることによって、疾患の診断方法、予防方法、治療方法、また、オーダーメード医療、創薬、疾患の原因解明などにおける更なる進展につながる。

以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
試験例１：脊髄組織標的化ペプチドの作製
配列番号１で表されるアミノ酸配列（ＬＨＱＳＰＨＩ）の両末端にそれぞれ１つのシステイン残基がペプチド結合により連結し、片端のシステイン残基が他端のシステイン残基とジスルフィド結合することによってループ状を形成してなるペプチドを、化学合成により作製した。これを、ペプチド１とした。すなわち、ペプチド１は、９つのアミノ酸残基（Ｃ−配列番号１−Ｃ；Ｃはシステイン残基）からなる。

同様に、配列番号２〜５のそれぞれで表されるアミノ酸配列（それぞれＰＴＮＮＰＲＳ、ＬＮＳＳＱＰＳ、ＨＨＳＳＳＡＲ、ＮＴＧＳＰＹＥ）についても、各アミノ酸配列の両末端にそれぞれ１つのシステイン残基が連結し、片端のシステイン残基が他端のシステイン残基とジスルフィド結合することによってループ状を形成してなる４種のペプチドを、化学合成により作製した。これらを、それぞれペプチド２〜５とした。ペプチド２〜５も、それぞれ９つのアミノ酸残基（それぞれＣ−配列番号２−Ｃ、Ｃ−配列番号３−Ｃ、Ｃ−配列番号４−Ｃ、Ｃ−配列番号５−Ｃ；Ｃはシステイン残基）からなる。

試験例２：脊髄組織標的化ペプチド（ペプチド１及び２）の脊髄組織への標的化評価
１．手順
Ｍ１３ファージのコートタンパク質をコードする遺伝子（ＰＩＩＩ）に前記ペプチド１をコードするＤＮＡ配列（ｔｇｔ−配列番号６−ｔｇｃ）を組み込むことにより、ペプチド１を特異的に発現可能なＭ１３ファージを作製した。次いで、このように作製したＭ１３ファージを１０^１２個含有する５０ｍＭ Tris-Buffered Saline（ＴＢＳ）溶液（１００μｌ）を調製した。

同様に、Ｍ１３ファージのコートタンパク質をコードする遺伝子（ＰＩＩＩ）に前記ペプチド２をコードするＤＮＡ配列（ｔｇｔ−配列番号７−ｔｇｃ）を組み込むことにより、ペプチド２を特異的に発現可能なＭ１３ファージを作製し、次いで、これを１０^１２個含有するＴＢＳ溶液（１００μｌ）を作製した。また、同様に、ランダムにペプチドを発現するライブラリー由来のＤＮＡ配列（商品名Ph.D.-C7C Phage Display Peptide Library、ニューイングランドバイオラボ社製）を組み込んだＭ１３ファージを１０^１２個含有するＴＢＳ溶液（１００μｌ）を調製した。

調製した各溶液１００μｌをそれぞれ別々のＣ５７ＢＬ／６マウス（ジャクソンラボラトリー社製、８週齢以上のadultマウス）に尾静脈経由で投与した（ｎ＝３）。投与５分後にマウスを脱血し、ＰＢＳにて経心臓的に還流を行い、臓器を摘出し重量を測定した。次いで、プロテアーゼ阻害剤（商品名protease inhibitor cocktail、シグマ社製）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で脊髄、脳、心臓をそれぞれホモゲナイズし、得られた溶液を大腸菌と混合してファージを大腸菌に感染させ、これをＬＢ寒天培地（０．７％アガロース）に混ぜ込み、あらかじめ固めておいたＬＢ寒天培地（１．５％アガロース）に重層し、３７℃で一晩静置培養してファージのプラーク形成を確認した。プラーク数を数えることにより各臓器に含まれていたファージのタイターを求め、臓器重量あたりに計算して比較した。結果を図２に示す。

２．結果
図２から明らかなように、ペプチド１またはペプチド２を用いた場合において、脳や心臓と比較して、脊髄におけるファージ力価が高かった。このことから、ペプチド１またはペプチド２によれば脊髄を非常に高効率で認識できることが分かった。

試験例３：脊髄組織標的化ペプチド（ペプチド１及び２）の脊髄組織への標的化評価
１．手順
前記試験例２で調製した、ペプチド１を特異的に発現可能なＭ１３ファージを１０^１２個含有するＴＢＳ溶液（１００μｌ）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに尾静脈経由で投与した（ｎ＝３）。投与５分後にマウスを脱血し、パラフォルムアルデヒドにて経心臓的に還流固定を行った。次いで脊髄を取り出して切片を作成し、抗ファージ抗体（商品名rabbit anti-fd Bacteriophage antibody、シグマ社製）及び二次抗体（商品名Anti-Alexa Fluor（登録商標）488 Rabbit IgG Antibody、モレキュラプローブ社製）にて免疫染色を行った。

前記試験例２で調製した、ペプチド２を特異的に発現可能なＭ１３ファージを１０^１２個含有するＴＢＳ溶液（１００μｌ）、ランダムにペプチドを発現するライブラリー由来のＭ１３ファージを１０^１２個含有するＴＢＳ溶液（１００μｌ）についても同様にしてマウスに投与し、脱血、パラフォルムアルデヒドによる固定を行った後に脊髄の切片を作成し、抗ファージ抗体及び二次抗体にて免疫染色を行った。

染色後、各切片を共焦点レーザー顕微鏡（商品名C1si、ニコン社製）にて観察した。結果を図３に示す。

２．結果
図中、下段の写真はそれぞれ上段の写真を拡大したものである。図３から明らかなように、ペプチド１またはペプチド２を用いた場合において、脊髄部分において抗ファージ抗体由来の蛍光が特異的に観察された。一方、ライブラリーを用いた場合には、このような特異的なシグナルは観察されなかった。このことから、ペプチド１またはペプチド２によれば脊髄を選択的に認識できることが分かった。

試験例４：脊髄組織標的化ペプチド（ペプチド３）の脊髄組織への標的化評価
１．手順
前記試験例２と同様にして、ペプチド３をコードするＤＮＡ配列（ｔｇｔ−配列番号８−ｔｇｃ）を用いて調製したペプチド３を特異的に発現可能なＭ１３ファージを１０^１２個含有するＴＢＳ溶液（１００μｌ）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに尾静脈経由で投与した（ｎ＝3）。投与５分後にマウスを脱血し、パラフォルムアルデヒドにて経心臓的に還流固定を行った。次いで脊髄を取り出し切片を作成し、前述と同様に抗ファージ抗体及び二次抗体にて免疫染色を行った。また、前述と同様にして調製したランダムにペプチドを発現するライブラリー由来のＭ１３ファージを１０^１２個含有するＴＢＳ溶液（１００μｌ）についても同様にしてマウスに投与し、脱血、パラフォルムアルデヒドによる固定を行った後に脊髄の切片を作成し、抗ファージ抗体及び二次抗体にて免疫染色を行った。染色後、各切片を共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。結果を図４に示す。

２．結果
図４から明らかなように、ペプチド３を用いた場合において、脊髄部分において抗ファージ抗体由来のシグナルが特異的に観察された。一方、ライブラリーを用いた場合には、このような特異的なシグナルは観察されなかった。このことから、ペプチド３によれば脊髄を選択的に認識できることが分かった。

試験例５：脊髄組織標的化ペプチド（ペプチド３）の脊髄組織への標的化評価
１．手順
末端システイン残基の一方にアミノカプロン酸を介してＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）を連結させたペプチド３(１５μｇ) を含有する５％ブドウ糖液（１００μｌ）をＣ５７ＢＬ／６マウスに尾静脈より静脈注射した（ｎ＝３〜５）。投与５分後にマウスを脱血し、パラフォルムアルデヒドにて経心臓的に還流固定を行った。次いで脊髄を取り出し切片を作成し、アストロサイトマーカーである抗ＧＦＡＰ抗体（商品名rabbit anti-GFAP antibody、プロメガ社製）及び二次抗体（商品名Anti-Alexa Fluor（登録商標）555 Rabbit IgG Antibody、モレキュラプローブ社製）にて免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。ＦＩＴＣ由来のシグナルは励起波長４８８ｎｍで観察し、抗ＧＦＡＰ抗体由来のシグナルは励起波長５６１ｎｍで観察した。結果を図５に示す。

２．結果
図中、左の図はＦＩＴＣ由来のシグナルを示し、前記ペプチド３の存在を示す。真ん中の図は抗ＧＦＡＰ抗体由来のシグナルを示し、脊髄組織内のアストロサイトの存在を示す。右の図は、該左の図と真ん中の図を重ね合わせた図である。これらの図から明らかなように、前記ペプチド３は脊髄組織を認識し、特に脊髄組織内のアストロサイトを認識していることから、前記ペプチド３によれば脊髄を認識でき、なかでも脊髄組織内のアストロサイトに対する特異性が高いことが分かった。

試験例６：脊髄組織標的化ペプチド（ペプチド４及び５）の脊髄組織への標的化評価
１．手順
前記試験例２と同様にして、ペプチド４をコードするＤＮＡ配列（ｔｇｔ−配列番号９−ｔｇｃ）を用いて調製した、ペプチド４を特異的に発現可能なＭ１３ファージを１０^１２個含有するＴＢＳ溶液（１００μｌ）をマウスに尾静脈経由で投与した。投与５分後にマウスを脱血し、パラフォルムアルデヒドにて経心臓的に還流固定を行った。次いで脊髄を取り出し切片を作成し、前述と同様に抗ファージ抗体及び二次抗体にて免疫染色を行った。また、前記試験例２と同様にして、ペプチド５をコードするＤＮＡ配列（ｔｇｔ−配列番号１０−ｔｇｃ）を用いて調製した、ペプチド５を特異的に発現可能なＭ１３ファージを１０^１２個含有するＴＢＳ溶液（１００μｌ）についても同様にしてマウスに投与し、脱血、パラフォルムアルデヒドによる固定を行った後に脊髄切片を作成し、抗ファージ抗体及び二次抗体にて免疫染色を行った。染色後、各切片を共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。結果を図６に示す。

２．結果
図６から明らかなように、ペプチド４や５を用いた場合においても、脊髄部分に抗ファージ抗体由来のシグナルが特異的に観察された。このことから、ペプチド４や５によれば脊髄を選択的に認識できることが分かった。また、ここには結果は示さないが、ペプチド４や５は、脊髄組織のなかでもミクログリアに対する特異性が高いことが分かった。

試験例７
本試験は、遺伝的にhuman superoxide dismutase 1（SOD1）の変異型hSOD1(G93A)を発現することにより、運動機能の低下、致死性を示すマウス（hSOD1(G93A)tg筋萎縮性側索硬化症モデルマウス）を用いて行った。具体的には、hSOD1(G93A)tgマウスとして、hSOD1(G93A)^1Gur/Jマウス（ジャクソンラボラトリー社製、８週齢のadultマウス）を用いて行った。

このマウスは、SOD1遺伝子（正常型も変異型も含む）の発現を抑制することにより、症状の進行や致死性が抑制されることが報告されており、siRNA-SOD1-396により、SOD1遺伝子の発現が抑制させることが報告されている。このことから、本試験では被送達物質としてsiRNA-SOD1-396を用い、また、前記ペプチドを用いて脊髄組織を標的化し、その治療効果を検討することにより、その有用性を検証した。なお、siRNA-SOD1-396 は配列番号１１の３’末端にチミン（ＴＴ）を備え、また、配列番号１２の５’ 末端にチミン（ＴＴ）を備え、これら２塩基ＴＴにおいてそれぞれオーバーハングを形成して対になっている。siRNA-SOD1-396のモデルを図７に示す。

本試験例では具体的には、前記ペプチド１のＮ末端側のシステイン残基にアミノカプロン酸を介してＦＩＴＣを連結させ、また、前記ペプチド１のＣ末端側のシステイン残基に、３つのグリシン残基（Ｇ）からなるリンカーを介して、９つのアルギニン残基（Ｒ）からなる陽性に荷電したリンカーを連結させた。これに陰性荷電のsiRNA-SOD1-396を静電的結合作用により連結させて複合体を作製した。前記ペプチド２についても同様にしてsiRNA-SOD1-396との複合体を作製した。このようにして得られた複合体のモデルを図７に示す。図中、Ａ〜Ｇは配列番号１または２で表されるアミノ酸配列を意味する。

このように連結させた複合体について電気泳動を行ったところ、図８に示すように、ＦＩＴＣやリンカーを連結させた前記ペプチド１または２と、siRNA-SOD1-396との重量比を、例えば３：１とした複合体において電気泳動パターンの変化が認められ、すなわち前記ペプチド１や２にsiRNA-SOD1-396が十分に結合していることが確認された。

前述のようにしてＦＩＴＣやリンカーを連結させた前記ペプチド１(１５μｇ)とsiRNA-SOD1-396 (５μｇ)とを連結させた複合体（５％ブドウ糖液、１００μｌ）を、週に１または３回尾静脈よりhSOD1(G93A)tgマウスに投与した（ｎ＝３〜５）。該投与は、マウス週齢８週より、運動機能が廃絶するまで継続し、運動機能テストを毎週行い、評価した。運動機能テストは、ロータロッドテスト（5rpm/min-50rpm/min(acceleration 9rpm/min²)、Max 5min、(ウゴバジレ社製)）を用いて行い、マウス１匹あたり３分以上のインターバルで５回施行し、得られた中央値３つを平均することによって評価した。

前記ペプチド２を用いた複合体についても同様に投与し、評価した。また、コントロール群として、これらの複合体を投与していないhSOD1(G93A)tgマウスについても同様に評価した。

その結果、前記ペプチド１、前記ペプチド２のいずれの複合体を用いた場合においても、コントロール群と比較して、１〜２週の運動機能低下の進行遅延が認められた。

また、前記運動機能評価の終了後、各マウスの脊髄組織より抽出したタンパク質を用いて、抗hSOD1抗体によるウエスタンブロットを行った。具体的には、各マウスより深麻酔下に脊髄を摘出した。摘出した脊髄組織を、プロテアーゼ阻害剤（商品名protease inhibitor cocktail、シグマ社製）を添加したRIPA buffer（150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% nonidet P-40, 1% sodiumdeoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 50 mM NaF, 20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.4）でホモゲナイズ後、溶液中のタンパク質濃度を測定し、タンパク質濃度をサンプル間で合わせて、sample buffer（×２)（2% SDS, 10% glycerol, 0.1% bromophenol blue, 10% b-mercaptoethanol, 0.5 m Tris-HCl, pH 6.8）を等量加えてボイル（１００℃、５分）した。その後、SDS-PAGEにて二次元展開し（アクリラマイドゲルにてサンプルを泳動）、PVDF膜に転写後、10% milkにてブロッキング後、抗ｈＳＯＤ１抗体（商品名rabbit anti-human SOD1 antibody、ミリポア社製）にて一晩インキュベーションし、その後、HRP標識の二次抗体（ECL Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody、GEヘルスケアUK社製）、更に使用説明書に従いECL regent （商品名Western Lightning Plus-ECL、パーキンエルマー社製）を用いて発光し、フィルムに感光した。

その結果、図９に示されるように、ペプチド１及び２のいずれにおいても前記複合体を投与したマウスにおいて変異型ｈＳＯＤ１タンパク質の発現が有意に抑制されていることが認められた。

また、前記運動機能評価の終了後、各マウスより脊髄を摘出し、脊髄切片を作成した。次いで、抗ｈＳＯＤ１抗体及び二次抗体（商品名Anti-Alexa Fluor（登録商標）555 Rabbit IgG Antibody、モレキュラプローブ社製）、ＤＡＰＩ（4’,6-diamidino-2-phenylindole）にて染色後、Vectashield Mounting Medium with DAPI （ベクターラボラトリーズ社製）を用いて使用説明書に従いマウントし、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。ＦＩＴＣ由来のシグナルは励起波長４８８ｎｍで観察し、抗ｈＳＯＤ１抗体由来のシグナルは励起波長５６１ｎｍで観察し、ＤＡＰＩ由来のシグナルは励起波長４０８ｎｍで観察した。結果を図１０に示す。なお、コントロールとして、前記複合体を与えていないマウスから同様にして作成、染色した切片についても観察した。

図１０において、上段はコントロール群の結果を、中段はペプチド１を用いた複合体を投与した結果を、下段はペプチド２を用いた複合体を投与した結果を示す。また、図１０において、左の図はＦＩＴＣ由来のシグナルを、真ん中の図は抗ｈＳＯＤ１抗体由来のシグナルを、右の図はＦＩＴＣ、抗ｈＳＯＤ１抗体、ＤＡＰＩ由来のそれぞれのシグナルを重ね合わせた図である。

図１０から明らかなように、コントロール群の切片では抗ｈＳＯＤ１抗体由来のシグナルが明らかに認められ、すなわち、脊髄において変異型hSOD1(G93A)の発現が確認された。これに対して、ペプチド１を用いた複合体やペプチド２を用いた複合体を投与したマウスから作成した切片では、ＦＩＴＣ由来のシグナルやＤＡＰＩ由来のシグナルが認められるものの、抗ｈＳＯＤ１抗体由来のシグナルがほとんど認められなかった。この結果は、前記複合体によって、変異型hSOD1(G93A)の発現が効果的に抑制されていることを示す。

これらのことから、前記ペプチド１などの脊髄標的化ペプチドによれば脊髄組織を標的化でき、また、siRNAといった被送達物質を脊髄組織に効率よく送達できるとともに、該組織において被送達物質に由来する有用作用を効果的に発揮できることが分かった。このことから、前記脊髄標的化ペプチドは、医薬組成物としても有用であることが確認された。

Claims

以下の（１−１）で表される脊髄組織標的化ペプチド；
（１−１）配列番号１〜５からなる群より選択される少なくとも１種で表されるアミノ酸配列の両末端にそれぞれ１つのシステイン残基が直接連結してなるペプチド。
前記両末端のシステイン残基において、片端のシステイン残基が他端のシステイン残基とジスルフィド結合を形成している、請求項１に記載のペプチド。
脊髄組織が、脊髄組織全体、脊髄組織内のアストロサイト及び脊髄組織内のミクログリアからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１または２に記載のペプチド。
以下の（２−１）で表されるポリヌクレオチド：
（２−１）以下の（１−１）に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（１−１）配列番号１〜５からなる群より選択される少なくとも１種で表されるアミノ酸配列の両末端にそれぞれ１つのシステイン残基が直接連結してなるペプチド。
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドを含有する医薬組成物。
更に被送達物質を含有する、請求項５に記載の医薬組成物。
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドまたは請求項５及び６のいずれかに記載の医薬組成物を対象物に投与する工程を含有する、対象物中の脊髄組織を標的化する方法（但し、人間に対する医療行為を除く）。
請求項６に記載の医薬組成物を対象物に投与する工程を含有する、被送達物質の脊髄組織への送達方法（但し、人間に対する医療行為を除く）。