KR102259726B1 - Ccsp-2와 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

Ccsp-2와 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

CCSP-2 (colon cancer secreted protein-2)에 특이적으로 결합하는 펩타이드; 상기 펩타이드와 표지물질 또는 생체활성물질이 결합된 접합체; 상기 펩타이드 또는 접합체를 포함하는 대장암 진단용 조성물, 상기 접합체를 포함하는 대장암 가시화용 조성물, 및 생체활성물질의 전달용 조성물; 및 이를 이용한 대장암 진단에 정보를 제공하는 방법, 대장암 가시화 방법, 및 생체활성물질의 전달 방법이 제공된다.

Description

CCSP-2와 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도{CCSP-2 Specific Peptide and Use thereof}
CCSP-2 (colon cancer secreted protein-2)에 특이적으로 결합하는 펩타이드; 상기 펩타이드와 표지물질 또는 생체활성물질이 결합된 접합체; 상기 펩타이드 또는 접합체를 포함하는 대장암 진단용 조성물, 상기 접합체를 포함하는 대장암 가시화용 조성물, 및 생체활성물질의 전달용 조성물; 및 이를 이용한 대장암 진단에 정보를 제공하는 방법, 대장암 가시화 방법, 및 생체활성물질의 전달 방법이 제공된다.
대장은 소화기관에 속하며 소장과 항문 사이에 위치하는 장기이다. 전체 길이가 평균 약 1.5미터 정도이며, 우측에서부터 맹장, 상행결장, 횡행결장, 하행결장, S자결장, 직장으로 나누어 분류된다. 대장암은 결장과 직장에 생기는 악성 종양으로, 주로 상피세포에서부터 악성 종양세포 (암세포)가 발생하게 된다. 암이 발생하는 위치에 따라서, 결장에 생기는 암을 결장암, 직장에 생기는 암을 직장암이라고 하며, 이들을 총칭하여 대장암이라고 한다.
국가 암등록 통계에 의하면 2011년에 우리나라에 발생한 대장암은 총 28,112건으로 전체 암 발생 (218,017건)의 12.9%를 차지하며 암 발생빈도 3위, 암 사망률 4위를 차지한다.
대장암 사망률이 계속해서 증가하는 다른 원인은 바로 대장암의 초기증상이 거의 없다는 것과 그로 인해 우리나라 대장암 조기 발견율이 10%도 채 넘지 않을 정도로 낮다는 것에 있다. 많은 대장암 환자들이 다른 장기로 전이가 시작되는 3기와 4기의 전이성 대장암이 되어서야 암을 진단 받는다. 대장암 3기 생존율은 28%로 상당히 낮은 편이고, 대장암 4기는 생존율 6%로 대장암 3기 생존율에 비해 더 낮다. 따라서, 대장암의 조기 진단이 매우 중요하다.
현재, 대장암 진단에 가장 많이 이용되는 방법으로 대장 촬영술(Double contrast Barium-enema)과 대장내시경검사가 있다. 대장촬영술은 대장을 깨끗이 청소한 후 항문을 통해 작은 관을 삽입하여 바륨이라는 조영제를 주입하고, 이에 다시 공기를 주입하여 대장을 팽창시키면서 바륨을 대장벽에 얇게 도포하여 X-선 투시장치로 영상을 획득하는 검사법이다. 장점으로는 대장의 전체적 윤곽과 형태를 알 수 있고, 대장암의 전반적 위치파악이 용이하며, 염증성 변화나 허혈성 변화 등의 대장벽 변화 및 소장말단부를 검사하는 데에 좋다는 것이다. 그러나 검사와 함께 조직을 얻을 수 없고, 작은 용종에 대한 정확도가 대장내시경보다 떨어지는 단점이 있다.
대장내시경검사란 불빛과 유연성이 있는 튜브를 이용하여 대장을 직접 보는 검사 방법으로 대장질환의 가장 정확한 진단 방법인데, 그 이유는 의사가 직접 출혈 부위와 병변의 표면을 관찰할 수 있고 조직 상태를 파악할 수 있기 때문이다. 내시경 검사와 동시에 조직 검사(생검)도 가능하며, 짧은 시간 동안만 작용하는 수면제를 정맥 주사하여 환자가 자는 동안 수면 내시경을 시행하면 불편감 없이 검사를 받을 수 있다.
대장내시경검사는 대장암을 발견하는 가장 좋은 진단적 도구이지만, 검사에서 놓친 용종이 해당 환자의 다음 검사에서 암으로 진행된 상태로 발견되는 빈도가 높다. 1cm 이상의 용종은 시간이 경과함에 따라 암으로의 이행 가능성이 비교적 유의적으로 증가하므로, 내시경 검사시 작은 크기의 용종도 놓치지 않도록 기술적인 향상과 더불어 후퇴관찰 시 충분한 여유를 가지고 만곡부 및 점막주름 뒤에 숨은 병변을 놓치지 않는 노력이 필요하다. 이러한 노력의 하나로 종양 발견율 향상을 위한 분자 영상에 사용되는 바이오마커 및 표지자 물질 개발에 대한 연구가 진행되고 있다.
본 발명은 CCSP(colon cancer secreted protein-2)에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공한다. 상기 CCSP는 대장암에 특이적(예컨대, 대장암에서 특이적으로 발현)인 것을 특징으로 하며, 예컨대, CCSP-2 (colon cancer secreted protein-2)일 수 있다.
다른 예는 상기 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드와 표지 물질 또는 생체활성물질을 포함하는 접합체를 제공한다. 상기 접합체에서, 상기 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드와 표지 물질 또는 생체활성물질은 직접 또는 펩타이드 링커 등의 링커를 통하여 화학적으로 결합된 것일 수 있다.
다른 예는 상기 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 상기 접합체를 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드와 표지물질이 결합된 접합체를 포함하는 대장암 가시화용 조성물을 제공한다. 상기 대장암 가시화용 조성물은 대장내시경 검진용 조영제로서 적용될 수 있다.
다른 예는 상기 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드와 생체활성물질이 결합된 접합체를 포함하는 생체활성물질의 대장암 표적 전달용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서는 대장암에 특이적으로 발현하는 바이오마커인 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공함으로써, CCSP-2의 발현 여부 및/또는 발현 수준의 측정에 유용한 수단을 제공하며, 이를 통하여, 대장암 진단에 유용하게 적용될 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 다양한 표지물질과 결합되어 사용되는 경우 대장암의 가시화에 사용될 수 있으며, 특히, 대장암 내시경 검사 시에 적용되어 대장암의 존재 여부 확인, 병변 부위 확인, 암 부위의 형태학적 관찰에 있어서 보다 정확한 정보를 제공할 수 있고, 대장암과 관련된 오진률을 낮추고 조기 진단에 기여할 수 있다. 또한, 상기 펩타이드에 약물 등의 생체활성물질을 결합시킨 경우, 상기 생체활성물질을 대장암에 특이적으로 전달할 수 있어서, 생체활성물질의 대장암 표적 전달용 조성물로서 사용될 수 있다.
용어 "진단"은 병리 상태의 존재 여부, 정도 (증세), 및/또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바로서, "대장암의 진단"은 대장암의 발병 여부, 대장암 부위의 정도, 대장암 (대장암 세포)의 위치, 대장암의 정도 등의 대장암의 병리 상태를 확인하는 것으로, 보다 정확한 진단을 위하여 대장암 세포 또는 대장암 세포 및/또는 조직을 정상 세포 또는 정상 조직과 정확하고 신속하게 구별하는 것이 중요하다.
대장암 특이적 표지자 (바이오마커)인 CCSP (colon cancer secreted protein; 예컨대, CCSP-2) 및 이를 암호화하는 유전자의 정보는 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예컨대, 상기 CCSP-2는 인간 CCSP-2일 수 있고, 인간 CCSP-2의 단백질 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에 Accession No. AAT77225.1 등에 등록되어 있으며, 이를 암호화하는 유전자의 정보는 NCBI Accession No. AY572972.1 등에 등록되어 있다. 상기 CCSP-2의 기능 및 역할은 잘 알려져 있지 않지만, RNA 레벨에서, 정상 조직 (대장암 세포가 존재하지 않는 조직)에 비해 대장암 세포 및/또는 조직에서 평균 78배 정도 발현 수준이 높음이 알려져 있다. 또한, 상기 CCSP-2는 대장 조직의 대장관에 노출된 표면에서 발현하므로, 대장관에의 국소 도포, 분사 등의 간단한 방법으로 대장암 세포 및/또는 조직의 표지가 가능하다는 이점을 갖는다. 따라서, CCSP-2의 발현 여부 및/또는 발현 수준을 유전자 및/또는 단백질 수준에서 측정함으로써, 대장암의 존재 여부 및/또는 대장암 진행 정도를 정확하고 용이하게 확인할 수 있다.
본 발명은 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공함으로써, CCSP-2를 단백질 수준에서 CCSP-2를 특이적으로 검출하여 대장암 및/또는 대장암 세포 및/또는 조직의 정확한 진단을 가능하게 할 수 있으며, 특히, 상기 펩타이드에 가시화 가능한 표지물질을 접합시켜 사용함으로써, 대장 조직을 가시화시켜 대장암 내시경 진단에 유용하게 적용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 대장암 진단용 마커로서의 다양한 용도를 제공한다.
우선, 일 예는 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공한다. 상기 펩타이드는 총 아미노산 개수가 5 내지 50개, 5 내지 40개, 5 내지 30개, 5 내지 20개, 5 내지 17개, 5 내지 15개, 5 내지 12개, 5 내지 10개, 7 내지 50개, 7 내지 40개, 7 내지 30개, 7 내지 20개, 7 내지 17개, 7 내지 15개, 7 내지 12개, 또는 7 내지 10개인 것이 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예에서, 상기 펩타이드는 하기의 표 1에 기재된 펩타이드들 중 하나 이상, 또는 상기 펩타이드의 아미노산 서열 중의 5개 이상의 아미노산 (예컨대, 연속하는 5개 이상의 아미노산) 길이의 펩타이드 단편을 포함하는 5 내지 50개, 5 내지 40개, 5 내지 30개, 5 내지 20개, 5 내지 17개, 5 내지 15개, 5 내지 12개, 5 내지 10개, 7 내지 50개, 7 내지 40개, 7 내지 30개, 7 내지 20개, 7 내지 17개, 7 내지 15개, 7 내지 12개, 또는 7 내지 10개 아미노산 길이의 펩타이드일 수 있다.
아미노산 서열
NTGSPYE
EFSKFRS
MSTGLSS
YSMKYGS
YTHNPRH
LKLGEKW
SSQYTLT
MARYMSA
SVTNYSS
WWNPLRP
GYSSFNR
AGHNRDR
EGQRWMQ
FDHSTRK
TNANHYF
일 구체예에서, 상기 펩타이드는 LKLGEKW, MSTGLSS, EFSKFRS, 또는 GYSSFNR의 펩타이드, 또는 상기 펩타이드의 아미노산 서열 중의 연속하는 5개 이상의 펩타이드 단편을 포함하는 5 내지 50개, 5 내지 40개, 5 내지 30개, 5 내지 20개, 5 내지 17개, 5 내지 15개, 5 내지 12개, 5 내지 10개, 7 내지 50개, 7 내지 40개, 7 내지 30개, 7 내지 20개, 7 내지 17개, 7 내지 15개, 7 내지 12개, 또는 7 내지 10개 아미노산 길이의 펩타이드일 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드는 LKLGEKW의 펩타이드, 또는 상기 펩타이드의 아미노산 서열 중의 연속하는 5개 이상의 펩타이드 단편을 포함하는 5 내지 50개, 5 내지 40개, 5 내지 30개, 5 내지 20개, 5 내지 17개, 5 내지 15개, 5 내지 12개, 5 내지 10개, 7 내지 50개, 7 내지 40개, 7 내지 30개, 7 내지 20개, 7 내지 17개, 7 내지 15개, 7 내지 12개, 또는 7 내지 10개 아미노산 길이의 펩타이드일 수 있다.
다른 예는 상기 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드와 표지 물질을 포함하는 펩타이드-표지물질 접합체를 제공한다. 또 다른 예는 상기 상기 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드와 생체활성물질을 포함하는 펩타이드-생체활성물질 접합체를 제공한다.
상기 표지 물질은 펩타이드를 가시화시킬 수 있는 모든 물질일 수 있으며, 형광 물질, 발광 물질, 방사선 동위원소, 발광 효소 기질 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 표지 물질은 Cy-5. Cy-3, 플루오레신 (예컨대, fluorescein isothiocyanate (FITC) 등), DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), TRITC (Tetramethylrhodamine), ICG (Indocyanine green), QD (Quantum dot), 나노파티클(nanoparticles) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 제한되지 않고 형광, 발광, 방사선, 효소 반응 등의 검출 신호를 나타낼 수 있는 모든 물질 중에서 선택될 수 있다.
상기 생체활성물질은 생체 내 또는 세포 내에서 생물학적 효과를 나타낼 수 있는 모든 물질 (예컨대, 소분자 화합물 (예컨대, 항암제 등의 약물 등), 펩타이드 (예컨대, 펩타이드 약물, 펩타이드 압타머 등), 단백질 (예컨대, 항체, 단백질 약물 등), 핵산 분자 (예컨대, 뉴클레오타이드 압타머, antisense RNA, siRNA, shRNA, microRNA 등의 RNAi 관련 RNA 등)들 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, 항암제, 항체, 단백질 약물, 펩타이드 압타머, 펩타이드 약물, 뉴클레오타이드 압타머, antisense RNA, siRNA, shRNA, microRNA 등의 RNAi 관련 RNA 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 상기 생체활성물질은 대장암에 대하여 항암 활성을 나타내는 모든 물질 (예컨대, 대장암에 대한 항암제 (small molecule), 항체, 그 외의 단백질 항암제, 펩타이드 항암제, RNA 항암제 등) 중에서 선택될 수 있다. 본 명세서에서 항암 활성은 암 (대장암)의 세포 및/또는 조직의 사멸, 성장 억제, 전이 억제, 또는 이로 이한 암 증상의 완화를 포괄적으로 포함한다.
상기 접합체에 있어서, 상기 표지 물질 또는 생체활성물질은 상기 펩타이드의 N-말단, C- 말단, 또는 내부에 위치하는 아미노산 잔기의 적절한 관능기에 직접 (링커 없이) 또는 펩타이드 링커 등의 링커를 통하여 화학적 (예컨대 공유결합 등의 화학적 결합)으로 결합된 것일 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 총 아미노산 개수가 2 내지 30개, 2 내지 25개, 2 내지 20개, 2 내지 15개, 2 내지 10개, 또는 2 내지 5개인 펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 각각의 아미노산 잔기의 종류는 제한이 없으며, 각각 독립적으로 모든 아미노산 중에서 선택된 것일 수 있다.
상기 펩타이드 및 접합체는 생체로부터 분리된 것, 생체에 존재하지 않는 것, 및/또는 비자연적으로 생산 (non-naturally occurring)된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드 및 접합체는 화학적인 합성 방법 또는 재조합적 방법 등의 인공적 방법으로 생산된 것일 수 있다.
다른 예는 상기 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 상기 펩타이드-표지물질 접합체를 포함하는 CCSP-2 검출용 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 상기 펩타이드-표지물질 접합체를 생물 시료에 접촉시키는 단계 및 생물 시료와 상기 펩타이드 또는 펩타이드-표지물질 접합체와의 상호작용(예컨대, 결합, 복합체 형성 등)을 측정하는 단계를 포함하는 CCSP-2 검출 방법을 제공한다. 상기 CCSP-2 검출은 CCSP-2의 존재 여부 및/또는 수준을 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 CCSP-2 검출 방법에서, 상기 상호작용이 존재하는 것으로 검출되는 경우 (예컨대, 펩타이드와 생물 시료 간 복합체 형성의 검출, 표지물질의 표지 신호의 검출 등), 상기 생물 시료에 CCSP-2가 존재하는 것으로 결정(확인)할 수 있고, 상호작용의 신호 강도에 따라서 생물 시료 내의 CCSP-2 수준(발현 정도, 농도)을 결정(확인)할 수 있다 (예컨대, 상호 작용의 신호 강도가 셀수록 상기 생물 시료의 CCSP-2 수준이 높다고 결정할 수 있다).
앞서 설명한 바와 같이, CCSP-2는 대장암에 특이적으로 발현하는 단백질이므로, 상기 CCSP-2 검출에 의하여 CCSP-2의 존재 여부 및/또는 수준을 확인함으로써, 대장암의 존재 여부 (대장암 세포 및/또는 조직의 존재 여부), 대장암 세포 및/또는 조직 위치, 대장암 세포 및/또는 조직의 분포 양상 및/또는 정도, 대장암의 증세 등을 확인할 수 있다. 따라서, 상기 CCSP-2 검출 방법에 의하여 CCSP-2가 존재하는 것으로 결정된 경우, 대장암 (또는 대장암 세포 및/또는 조직)이 존재하는 것으로 결정할 수 있고, 그 위치를 확인함으로써 대장암 세포 및/또는 조직의 위치 및/또는 분포를 확인할 수 있으며, CCSP-2 수준에 따라서 대장암 증세를 진단할 수 있다.
따라서, 다른 예는 상기 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 상기 펩타이드-표지물질 접합체를 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 상기 펩타이드-표지물질 접합체를 생물 시료에 접촉시키는 단계 및 생물 시료와 상기 펩타이드 또는 펩타이드-표지물질 접합체와의 상호작용(예컨대, 결합, 복합체 형성 등)을 측정하는 단계를 포함하는 대장암 진단에 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 대장암 진단은 대장암의 존재 여부, 대장암 세포 및/또는 조직 위치 및/또는 분포, 대장암 증세 등을 확인하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 에컨대, 상기 진단에 정보를 제공하는 방법에서, 상기 상호작용이 존재하는 것으로 검출되는 경우 (예컨대, 펩타이드와 생물 시료 간의 복합체 형성의 검출, 표지물질의 표지 신호의 검출 등), 상기 생물 시료에 대장암 또는 대장암 세포 및/또는 조직이 존재하는 것으로 결정(확인)하거나 상기 생물 시료 또는 생물 시료가 생체로부터 분리된 것인 경우 상기 생물시료가 유래하는 환자를 대장암 환자로 확인할 수 있고, 상기 신호작용 존재 위치를 대장암 세포 및/또는 조직 위치로 결정(확인)할 수 있으며, 상호작용의 신호 강도에 따라서 대장암 증세를 결정(확인)할 수 있다 (예컨대, 상호작용의 신호 강도가 셀수록 상기 생물 시료의 대장암 증세가 심하다고 결정할 수 있다).
또한, 대장암에 특이적으로 발현하는 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드에 신호 방출이 가능한 표지물질을 접합시켜 사용함으로써, 대장암 세포 및/또는 조직을 가시화시켜서 대장암의 존재 여부뿐 아니라 대장암 세포 및/또는 조직의 위치, 분포, 크기 등을 판단하는데 매우 중요한 정보를 제공할 수 있다.
따라서, 다른 예는 상기 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드와 표지물질이 결합된 펩타이드-표지물질 접합체를 포함하는 대장암 가시화용 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 펩타이드-표지물질 접합체를 생물 시료에 접촉시키는 단계 및 생물 시료와 펩타이드-표지물질 접합체 간의 상호작용을 측정하는 단계를 포함하는 대장암 가시화 방법을 제공한다. 상기 상호 작용을 측정하는 단계는 표지물질로부터 발생하는 신호를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 펩타이드-표지물질 접합체는 대장내시경 검진용 조영제로서 적용될 수 있다.
따라서, 다른 예는 상기 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드와 표지물질이 결합된 펩타이드-표지물질 접합체를 포함하는 대장내시경 검진용 조영제 조성물을 제공한다. 다른 예는 대장내시경 검진에 있어서, 상기 펩타이드-표지물질 접합체를 대장에 분사 또는 도포하는 단계 및 상기 표지물질로부터 방출되는 신호를 검출(확인, 측정)하는 단계를 포함하는, 대장내시경 검진 방법을 제공한다. 상기 분사 또는 도포는 대장 전체 또는 목적 부위만 국부적으로 진행할 수 있다. 효율적인 분사 또는 도포를 위하여, 상기 펩타이드-표지물질 접합체는 제조시에 또는 대장내시경 검진 적용 전에 분사 또는 도포에 적절한 제형으로 제형화될 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드-표지물질 접합체는 분말상 또는 생리 식염수, 주사액, 버퍼 등의 액상 매질에 현탁된 현탁제 형태 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드의 특성을 이용하여, CCSP-2 및/또는 이를 발현하는 대장암 세포 및/또는 조직을 표적화하는 기술을 제공할 수 있다.
일 예는 상기 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 CCSP-2 및/또는 이를 발현하는 대장암 세포 및/또는 조직의 표적화 분자 또는 표적화 조성물을 제공한다. 본 명세서에 사용된 바로서, 상기 용어 "표적화"는 특정 세포 및/또는 조직, 즉 대장암 세포 또는 조직과 특이적으로 상호작용 (예컨대, 표면 단백질과 특이적으로 결합 등)하여 상기 특정 세포 및/또는 조직 또는 그 인접 부위에 특이적으로 위치화하는 것을 의미할 수 있다. 상기 표적화 분자는 CCSP-2를 항원(표적)으로 하는 통상적인 항체, 항원결합 단편, 항체와 유사한 골격구조를 갖는 항체 유사체 (예컨대, 나노바디, 펩티바디 등)에 포함되어, CCSP-2에 특이적으로 결합하는 항원결합부위로서의 기능을 할 수 있다.
다른 예는 상기 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드와 생체활성물질이 결합된 접합체를 포함하는 생체활성물질의 대장암 전달용 조성물을 제공한다. 다른 예는 CSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드와 생체활성물질이 결합된 접합체를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 생체활성물질의 전달 방법을 제공한다. 상기 생체활성물질의 대장암 전달은 대장암 세포 및/또는 조직으로의 특이적 전달을 의미하며, 생체 내 (in vivo) 또는 생체 외 (in vitro)에서 이루어지는 것일 수 있다. 상기 생체활성물질은 생체 내 또는 세포 내에서 소망하는 생물학적 효과를 발휘할 수 있는 모든 물질들, 예컨대, 대장암에 대하여 항암 효과를 나타낼 수 있는 모든 물질 중에서 선택될 수 있다. 상기 대장암에 대하여 항암효과를 나타낼 수 있는 물질은 대장암에 대한 항암제 (small molecule), 항체, 그 외의 단백질 항암제, 펩타이드 항암제, RNA 항암제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예는 상기 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드와 대장암에 대하여 항암 활성을 갖는 생체활성물질이 결합된 접합체를 포함하는 대장암의 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드와 대장암에 대하여 항암 활성을 갖는 생체활성물질이 결합된 접합체를 대장암의 예방 대장암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 대장암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 생체활성물질은 앞서 설명한 바와 같다.
상기 방법에 있어서, 상기 생물 시료는 동물, 예컨대, 인간 등의 영장류, 마우스 등의 설치류를 포함하는 포유류, 또는 이로부터 얻어진 (분리된) 세포, 조직, 체액, 또는 이들의 배양물일 수 있다. 예컨대, 대장암의 진단 대상 환자, 대장암 위험이 있는 환자, 또는 대장암 환자, 또는 상기 환자로부터 분리된 세포, 조직, 체액, 또는 이들의 배양물일 수 있으며, 상기 환자는 동물, 예컨대, 인간 등의 영장류, 마우스 등의 설치류를 포함하는 포유류 중에서 선택될 수 있다.
상기 방법에 있어서, 표지 물질의 신호는 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 등의 신호 검출 수단을 통하여 검출 (측정)될 수 있다.
다른 예는 상기 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 상기 핵산 분자는 표지 물질 (표지 물질이 단백질인 경우)을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 임의로 펩타이드 링커를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
다른 예는 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입시킨 재조합 세포를 제공한다.
본 발명은 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 제공함으로써, CCSP-2를 단백질 수준에서 CCSP-2를 특이적으로 검출하여 대장암 및/또는 대장암 세포 및/또는 조직의 정확한 진단을 가능하게 할 수 있으며, 특히, 상기 펩타이드에 가시화 가능한 표지물질을 접합시켜 사용함으로써, 대장 조직을 가시화시켜 대장암 내시경 진단에 사용되는 조영제로서 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 인간 대장암 환자로부터 얻은 대장암의 선종 (adenoma) 단계의 조직 및 암 (adenocarcinoma) 단계의 조직에서의 CCSP-2 발현 양상을 분석한 결과를 이미지로 보여주는 사진 및 이를 정량화하여 보여주는 그래프이다.
도 2는 CCSP-2에 결합하는 펩타이드 개발을 위한 스크리닝 과정을 예시적으로 보여주는 모식도이다.
도 3은 선별된 CCSP-2 파아지의 펩타이드 서열분석 과정 및 결과를 보여준다.
도 4는 선별된 펩타이드의 CCSP-2에 대한 결합 특이성을 ELISA를 통하여 측정한 결과를 정량화하여 보여주는 그래프이다.
도 5는 선별된 펩타이드의 CCSP-2에 대한 결합 특이성을 FCS를 통하여 측정한 결과를 정량화하여 보여주는 그래프이다.
도 6은 선별된 펩타이드의 CCSP-2에 대한 결합 특이성을 보여주는 형광 이미지이다.
도 7은 선별된 펩타이드 MSJ3의 CCSP-2에 대한 결합 특이성을 대장암 세포가 주입된 동물 모델에서 확인한 결과를 보여주는 형광 이미지이다.
도 8은 선별된 펩타이드 MSJ6의 CCSP-2에 대한 결합 특이성을 대장암 세포가 주입된 동물 모델에서 확인한 결과를 보여주는 형광 이미지이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 대장암 세포 및/또는 조직에서의 CCSP -2 발현 양상 분석
대장암 환자로부터 대장암 세포 및/또는 조직과 대장의 정상 조직을 취하여 파라핀 블록으로 제작하고, CCSP-2 발현 특이적 항체 (Case Western Reserve University 제공)를 이용한 면역염색방법을 이용하여 분석하였다. 상기 대장암 세포 및/또는 조직은 선종 (adenoma) 단계의 조직과 암 (adenocarcinoma) 상태의 조직을 모두 취하여 시험에 사용하였다. 면역염색방법은 자동화 기기 (Ventana Medical System)를 이용하여 진행하였으며, 항체는 1:100의 농도로 32분 반응 후에 Ventana OptiView DAB 키트를 이용하여 발색시켰다.
그 결과 얻어진 이미지 및 이를 정량화한 결과를 도 1에 나타내었다. 상기 정량화 결과는 Perkin Elmer의 Nuance로 면역 염색된 슬라이드의 4곳을 영상화 하고 Inform 프로그램을 통해 CCSP-2의 발현 면적과 전체 암의 면적을 학습시켜 값을 얻었으며 그 값을 이용하여 CCSP-2의 값을 퍼센트(CCSP-2의 발현 면적/전체 암의 면적)*100 로 나타내었다.
도 1에서 보여지는 바와 같이, adenoma와 adenocarcinoma 단계에서 CCSP-2의 발현이 정상 조직보다 현저히 높은 것으로 확인되었다. 이러한 결과는, CCSP-2이 암이 진행된 조직뿐 아니라 선종 조직과 같은 조기 대장암 세포 및/또는 조직의 검출 능력도 매우 우수함을 보여주며, 이는 CCSP-2이 대장암 진단을 위한 훌륭한 biomarker임을 입증하는 것이다.
실시예 2. CCSP -2에 결합하는 펩타이드의 선별
상기 실시예 1에서 대장암 특이적 바이오마커로 입증된 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 선별하기 위하여, 7개의 아미노산으로 구성된 무작위 배열을 통하여 수십억개의 다양한 아미노산 서열을 가지도록 제작된 루프형태의 펩타이드 라이브러리 (M13 파아지 라이브러리; Ph.DTM phage display library kit, New England Biolabs (NEB))를 준비하였다. 많은 경우에 수를 가진 phage library는 한꺼번에 많은 종류의 펩타이드를 탐색하여 원하는 단백질을 표적하는 펩타이드를 찾는데 유용한 기술이다.
CCSP-2 과발현 Hela 세포주 (Case Western Reserve University 제공)를 배양한 후, 세포 배양액을 Opti-MEM(Gibco)으로 바꿔주고 24시간 배양하여 배양액만 걷어내었다. 배양액은 Ni-NTA agarose (Qiagen)와 24시간 반응시켜주고, His 태그 캡처에 의해 CCSP-2를 정제하였다. 상기 정제된 CCSP-2를 10㎍/ml의 농도로 마이크로웰에 코팅하고 파아지 라이브러리의 각각의 M13 파아지를 1010개의 양으로 첨가하여 1시간 동안 반응시키고, 반응하지 않은 파아지는 세척하여 제거하였다.
반응된 파아지는 pH를 이용하여 따로 모아주었다. 파아지 일부는 희석하여 숙주인 대장균(ER2738)과 용해한 아가로즈에 혼합시킨 후, 이것을 한천배지에 중층하여 37에서 배양하였다. 대장균이 파지에 의해 용균되어 생긴 원형 용균반으로 타이터를 확인하였다.
나머지 파아지는 대장균과 혼합하여 37도에서 4시간동안 배양하였고, 배양액을 원심분리(4500g, 10분)하여 상층액만 분리하였다. 분리된 상층액에 NaCl/PEG-8000용액(2.5M NaCl;Sigma-aldrich, 20% PEG-8000;바이오세상)을 넣어주어 파아지만 침전시켜주었다. 이렇게 증폭된 파아지는 다시 CCSP-2와 반응을 시키는 방법을 4회 반복하여 CCSP-2에 특이적으로 반응하는 파아지를 선별하였다.
상기 CCSP-2 특이적 파아지를 선별하는 과정을 모식적으로 도 2에 나타내었다.
상기 선별된 CCSP-2 특이적 파아지에 디스플레이된 펩타이드의 서열을 분석하였다. 이를 위하여, 각각의 대장균 세포에 대해 무작위로 100개의 파아지 클론을 선택하고, 파아지에 삽입된 DNA를 PCR로 증폭한 후 서열분석 (마크로젠 회사에서 진행)을 하였다. 이 때, PCR은 5'-프라이머로 올리고뉴클레오타이드 (GCA ACT ATC GGT ATC AAG CTG) 및 3'-프라이머로 올리고뉴클레오타이드 (CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG)를 각각 사용하였다. PCR 진행의 조건은 94℃에서 2분 동안 가열하여 주형 DNA를 전변성 시킨 후, 94℃에서 30초; 50℃에서 30초; 72℃ 1분을 하나의 사이클로 하여 총 30회 반복 수행한 다음, 72℃에서 10분 동안 최종적으로 반응시켜 수행하였다.
상기 분석 과정 및 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 분석 결과, 100개의 PCR 중 56개의 서열분석에서 파아지의 펩타이드가 들어간 것을 확인하였다.
도 3의 analysis 부분에 기재된 서열을 다시 기재하면 아래와 같다:
Figure 112016116318348-pat00001
상기 56개의 펩타이드의 서열을 분석한 결과 얻어진 아미노산 서열의 반복 빈도를 아래의 표 2에 나타내었다.
선별된 CCSP-2 결합 펩타이드 서열
펩타이드 번호 펩타이드 서열 빈도
MSJ1 NTGSPYE 9/56 (16.1%)
MSJ2 EFSKFRS 4/56 (7.1%)
MSJ3 MSTGLSS 4/56 (7.1%)
MSJ4 YSMKYGS 2/56 (3.6%)
MSJ5 YTHNPRH 2/56 (3.6%)
MSJ6 LKLGEKW 6/56 (10.7%)
MSJ7 SSQYTLT 2/56 (3.6%)
MSJ8 MARYMSA 2/56 (3.6%)
MSJ9 SVTNYSS 3/56 (5.4%)
MSJ10 WWNPLRP 7/56 (12.5%)
MSJ11 GYSSFNR 3/56 (5.4%)
MSJ12 AGHNRDR 4/56 (7.1%)
MSJ13 EGQRWMQ 2/56 (3.6%)
MSJ14 FDHSTRK 3/56 (5.4%)
MSJ15 TNANHYF 3/56 (5.4%)
예컨대, 표 2에 나타난 바와 같이, MSJ1로 표시된 아미노산 서열 NTGSPYE, MSJ10로 표시된 아미노산 서열 WWNPLRP, MSJ6로 표시된 아미노산 서열 LKLGEKW, MSJ2로 표시된 아미노산 서열 EFSKFRS, 및 MSJ3로 표시된 아미노산 서열 MSTGLSS을 가지는 펩타이드가 56개의 서열 중 각각 9개 (16.1%), 7개 (12.5%), 6개 (10.7%), 4개 (7.1%) 빈도로 나타나 비교적 높은 빈도수를 나타냈었으며, 이는 이들 펩타이드가 CCSP-2 단백질에 특히 특이적으로 결합함을 보여준다.
실시예 3: 선별된 펩타이드의 CCSP - 2에 대한 결합 특이성 확인: ELISA
상기 실시예 2에서 선별된 펩타이드의 CCSP-2에 대한 결합 특이성을 확인하기 위해 ELISA를 진행하였다. CCSP-2 단백질 (10ng/ml)을 ELISA 플레이트에 coating을 하였다. 비교를 위하여, M13 파아지를 대조군 (빨간색 막대 그래프)으로 준비하였다. 상기 선별된 펩타이드의 파아지를 실험군으로 준비하여 대조군에 비해 10배 이상 증가하는 펩타이드만 확실한 후보군으로 선별하였다.
선별된 펩타이드는 특이도 검증을 위해 표 1에 기재된 각각의 (아미노산 서열)-(링커: GGGSK)-FITC-NH2 형태의 접합체를 제조하여 사용하였다 (펩트론 제작).
ELISA값을 얻기 위해 CCSP-2단백질을 96well 플레이트에 코팅을 하고, 1% BSA의 Blocking Buffer(1% BSA in PBS, MP bio)에 실온에 한 시간 반응 시킨 후 M13 (대조군)과 파아지 후보군들을 실온에서 한 시간을 반응시켰다. Washing Buffer(0.05% Tween-20 in PBS, Sigma-aldrich)로 5회 세척 한 후, substrate(1-step turbo TMB-ELISA, Thermo scientific)를 넣어 실온에 25분 반응하여 흡광도를 구하였다. M13의 흡광도값을 1로 설정하여, 파아지 후보군들의 값을 설정하였으며 M13의 값보다 10배 이상 증가한 후보군들만 선별하였다.
상기 얻어진 ELISA 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 표 1에 나타난 15종의 펩타이드 모두 대조군과 비교하여 CCSP-2에 대한 결합 특이성이 우수함을 확인할 수 있다.
실시예 4: 선별된 펩타이드의 CCSP - 2에 대한 결합 특이성 확인: FCS
상기 선별된 CCSP-2 표적 펩타이드의 해리상수 (Dissociation constant, Kd)를 구하기 위해 Fluorescence correlation spectroscopy (FCS)를 측정하였다. ㈜ 펩트론에서 제작된 (펩타이드)-(GGGSK)-FITC-NH2 접합체와 CCSP-2 단백질의 농도 구간을 0, 5, 10, 20, 40, 80, 150, 300 uM(micromole)로 희석하여 그들간의 결합력을 Cal Zaiss 공초점 현미경의 FCS 프로그램으로 분석하였다. 선별된 펩타이드들은 CCSP-2 단백질과 수십에서 수백 uM 범위에서 해리상수를 가졌다. 상기 선별된 펩타이드들 중에서 펩타이드 MSJ2, MSJ3, MSJ6, 및 MSJ11의 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 펩타이드 MSJ2의 해리상수는 55 uM, MSJ3의 해리상수는 25 uM, MSJ6의 해리상수는 62 uM, MSJ11의 해리상수는 61 uM로 각각 측정되어, 이들을 우수한 후보군으로 선별하였다.
실시예 5: 선별된 펩타이드의 CCSP-2에 대한 결합 특이성 확인: 세포 타겟팅
상기 실시예 4에서 선별된 4개의 펩타이드 중 MSJ3 및 MSJ6의 CCSP-2에 대한 결합 특이성을 평가하기 위하여 세포 실험을 진행하였다. CCSP-2가 과발현된 Hela 세포 (Case Western Reserve University)를 이용하여 펩타이드의 성능 평가를 진행하였다.
CCSP-2 비발현 Hela 세포 (negative control; Hela MOCK)와 CCSP-2 과발현 Hela 세포군 (Hela-CCSP-2)을 μ-Dish 35mm (Ibidi사) 플레이트에 30000개의 세포를 Seeding하고 다음 날 배지를 제거하였다. PBS로 3회 세척하고, 각 펩타이드를 37℃에서 10분 정도 반응시켰다. 반응 후 PBS로 3회 세척하고 4% paraldehyde solution로 세포를 고정시키고 (실온, 10분) PBS로 3회 세척하고, DAPI (1:10000)으로 실온에 2분 반응 후 PBS 3회 세척한 뒤 형광 이미지를 관찰하였다. 에 처리하여 형광 이미징을 관찰하였다.
상기 이미징 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이, 펩타이드 MSJ3과 펩타이드 MSJ6은 Hela-CCSP-2 세포군에서 CCSP-2가 발현된 부위에 표적화되어 CCSP-2가 발현된 부위 특이적으로 형광 신호가 관찰됨을 확인할 수 있다. 반면, CCSP-2가 발현되지 않는 Hela-Mock 세포주에서는 형광 신호가 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 상기 2가지 펩타이드가 세포 시료의 CCSP-2가 발현된 부위에 표적화 효율이 우수함을 보여준다.
실시예 6: 동물모델에서의 선별된 펩타이드의 CCSP -2에 대한 표적화 검증
상기 실시예 5에서 표적화 효율이 우수한 것으로 나타난 펩타이드 중에서 펩타이드 MSJ6를 선택하여, 동물모델에서의 표적화 효율을 시험하였다.
이를 위하여, CCSP-2가 과발현된 Hela 세포 (Hela-CCSP2로 표시)가 이식된 CCSP-2와 과발현 마우스 모델 (CCSP+ 모델)과 CCSP-2가 발현되지 않는 Hela 세포 (Hela-MOCK으로 표시)가 이식된 마우스 모델 (CCSP- 모델)을 준비하였다. 상기 마우스 모델은 각각의 세포를 각 마우스 당 1x106개씩 누드 마우스의 오른쪽 다리에 주입하여 준비하였다.
동물의 자가형광을 배제하기 위해, 펩타이드 MSJ3 (도면 7)과 MSJ6 (도면 8) 에 Cy5.5 형광물질을 접합시킨 접합체를 준비하였다 (바이오액츠에서 제작). 상기 준비된 마우스 모델을 종양 크기가 대략 8~9mm 정도가 될 때까지 키운 후, 상기 마우스에 (펩타이드 MSJ3)-(Cy5.5) 접합체와 (펩타이드 MSJ6)-(Cy5.5) 접합체를 DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 현탁시켜 마우스의 꼬리 정맥을 통해 200 ul(10 mg/kg) 농도로 주입하고, 영상 전(pre), 1시간, 6시간, 12시간, 24시간 구간으로 CCSP-2 표적 검증을 위한 영상화를 진행하였다.
상기 얻어진 결과를 도 7 (MSJ3) 및 도 8 (MSJ6)에 나타내었다. 도 7 및 도 8에 나타난 바와 같이, CCSP+ 모델 (Hela-CCSP2로 표시)에서는 펩타이드 주입 후, 1시간째에 동물의 몸 전체에서 펩타이드가 퍼져 있다가 6시간째에 CCSP-2가 과발현 중인 암에 최적의 상태로 표적화되는 것을 확인하였다. 6시간이 지난 후에는 펩타이드 프로브들이 몸 밖으로 빠져나감으로 체내에 남아있지 않을 것이 예상되었다. 반면, CCSP- 모델(Hela-MOCK으로 표시)에서는 형광 영상이 거의 관측 되지 않았다. 이러한 결과는 본 명세서에서 선별된 펩타이드가 CCSP-2에 대한 표적 효율이 매우 우수함을 보여준다.
<110> THE ASAN FOUNDATION UNIVERSITY OF ULSAN FOUNDATION FOR INDUSTRY COOPERATION <120> CCSP-2 Specific Peptide and Use thereof <130> HPC-7692 <140> 10-2016-0159380 <141> 2016-11-28 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSJ1 <400> 1 Asn Thr Gly Ser Pro Tyr Glu 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSJ2 <400> 2 Glu Phe Ser Lys Phe Arg Ser 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSJ3 <400> 3 Met Ser Thr Gly Leu Ser Ser 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSJ4 <400> 4 Tyr Ser Met Lys Tyr Gly Ser 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSJ5 <400> 5 Tyr Thr His Asn Pro Arg His 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSJ6 <400> 6 Leu Lys Leu Gly Glu Lys Trp 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSJ7 <400> 7 Ser Ser Gln Tyr Thr Leu Thr 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSJ8 <400> 8 Met Ala Arg Tyr Met Ser Ala 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSJ9 <400> 9 Ser Val Thr Asn Tyr Ser Ser 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSJ10 <400> 10 Trp Trp Asn Pro Leu Arg Pro 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSJ11 <400> 11 Gly Tyr Ser Ser Phe Asn Arg 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSJ12 <400> 12 Ala Gly His Asn Arg Asp Arg 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSJ13 <400> 13 Glu Gly Gln Arg Trp Met Gln 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSJ14 <400> 14 Phe Asp His Ser Thr Arg Lys 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSJ15 <400> 15 Thr Asn Ala Asn His Tyr Phe 1 5

Claims (15)

  1. 다음의 아미노산 서열 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 포함하는 CCSP-2 검출용 조성물:
    Figure 112021011407099-pat00002
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 LKLGEKW, MSTGLSS, EFSKFRS, 또는 GYSSFNR의 아미노산 서열로 이루어진 CCSP-2 검출용 조성물.
  3. 제1항의 펩타이드 및 상기 펩타이드에 결합된 표지물질을 포함하는 펩타이드-표지물질 접합체를 포함하는 CCSP-2 검출용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 표지물질은 형광 물질, 발광 물질, 방사선 동위원소, 및 발광 효소 기질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, CCSP-2 검출용 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 표지물질은 Cy-5. Cy-3, 플루오레신, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), TRITC (Tetramethylrhodamine), ICG (Indocyanine green), QD (Quantum dot), 및 나노파티클(nanoparticles)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, CCSP-2 검출용 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 펩타이드와 표지물질을 연결하는 펩타이드 링커를 추가로 포함하는, CCSP-2 검출용 조성물.
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