KR102157813B1

KR102157813B1 - Ccsp-2에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102157813B1
Application number: KR1020190011172A
Authority: KR
Inventors: 명승재; 도은주; 강자영; 손혜남; 김효리; 이아늠; 조영희
Original assignee: 재단법인 아산사회복지재단; 주식회사 에디스바이오텍; 울산대학교 산학협력단
Priority date: 2019-01-29
Filing date: 2019-01-29
Publication date: 2020-09-18
Also published as: WO2020159229A1; KR20200093894A; EP3919519A4; CN113784988A; EP3919519A1; US20220089774A1

Abstract

본 발명은 인간 CCSP-2(colon cancer secreted protein-2)의 EGF2 도메인에 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 또는 그의 항원결합 단편에 관한 것이다.
본 발명의 단일클론항체, 또는 그의 항원결합 단편은 CCSP-2의 EGF2 도메인에 특이적으로 결합함으로써 기존의 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드에 비해 친화도(affinity)가 현저히 증진되었으며, 기존의 CCSP-2에 대한 항체에 비해 특이성이 더욱 증진되었다. 이에 따라, 향후 CCSP-2를 단백질 수준에서 특이적으로 검출하여 정확한 진단을 가능하게 할 수 있다.

Description

CCSP-2에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도{CCSP-2 Specific Monoclonal Antibody and Use thereof}

본 발명은 인간 CCSP-2(colon cancer secreted protein-2)의 EGF2 도메인에 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 또는 그의 항원결합 단편에 관한 것이다.

대장은 소화기관에 속하며 소장과 항문 사이에 위치하는 장기이다. 전체 길이가 평균 약 1.5미터 정도이며, 우측에서부터 맹장, 상행결장, 횡행결장, 하행결장, S자결장, 직장으로 나누어 분류된다. 대장암은 결장과 직장에 생기는 악성 종양으로, 주로 상피세포에서부터 악성 종양세포 (암세포)가 발생하게 된다. 암이 발생하는 위치에 따라서, 결장에 생기는 암을 결장암, 직장에 생기는 암을 직장암이라고 하며, 이들을 총칭하여 대장암이라고 한다.

국가 암등록 통계에 의하면 2011년에 우리나라에 발생한 대장암은 총 28,112건으로 전체 암 발생 (218,017건)의 12.9%를 차지하며 암 발생빈도 3위, 암 사망률 4위를 차지한다.

대장암 사망률이 계속해서 증가하는 다른 원인은 바로 대장암의 초기증상이 거의 없다는 것과 그로 인해 우리나라 대장암 조기 발견율이 10%도 채 넘지 않을 정도로 낮다는 것에 있다. 많은 대장암 환자들이 다른 장기로 전이가 시작되는 3기와 4기의 전이성 대장암이 되어서야 암을 진단 받는다. 대장암 3기 생존율은 28%로 상당히 낮은 편이고, 대장암 4기는 생존율 6%로 대장암 3기 생존율에 비해 더 낮다. 따라서, 대장암의 조기 진단이 매우 중요하다.

현재, 대장암 진단에 가장 많이 이용되는 방법으로 대장 촬영술(Double contrast Barium-enema)과 대장내시경검사가 있다. 대장촬영술은 대장을 깨끗이 청소한 후 항문을 통해 작은 관을 삽입하여 바륨이라는 조영제를 주입하고, 이에 다시 공기를 주입하여 대장을 팽창시키면서 바륨을 대장벽에 얇게 도포하여 X-선 투시장치로 영상을 획득하는 검사법이다. 장점으로는 대장의 전체적 윤곽과 형태를 알 수 있고, 대장암의 전반적 위치파악이 용이하며, 염증성 변화나 허혈성 변화 등의 대장벽 변화 및 소장말단부를 검사하는 데에 좋다는 것이다. 그러나 검사와 함께 조직을 얻을 수 없고, 작은 용종에 대한 정확도가 대장내시경보다 떨어지는 단점이 있다.

대장내시경검사란 불빛과 유연성이 있는 튜브를 이용하여 대장을 직접 보는 검사 방법으로 대장질환의 가장 정확한 진단 방법인데, 그 이유는 의사가 직접 출혈 부위와 병변의 표면을 관찰할 수 있고 조직 상태를 파악할 수 있기 때문이다. 내시경 검사와 동시에 조직 검사(생검)도 가능하며, 짧은 시간 동안만 작용하는 수면제를 정맥 주사하여 환자가 자는 동안 수면 내시경을 시행하면 불편감 없이 검사를 받을 수 있다.

대장내시경검사는 대장암을 발견하는 가장 좋은 진단적 도구이지만, 검사에서 놓친 용종이 해당 환자의 다음 검사에서 암으로 진행된 상태로 발견되는 빈도가 높다. 1cm 이상의 용종은 시간이 경과함에 따라 암으로의 이행 가능성이 비교적 유의적으로 증가하므로, 내시경 검사시 작은 크기의 용종도 놓치지 않도록 기술적인 향상과 더불어 후퇴관찰 시 충분한 여유를 가지고 만곡부 및 점막주름 뒤에 숨은 병변을 놓치지 않는 노력이 필요하다. 이러한 노력의 하나로 종양 발견율 향상을 위한 분자 영상에 사용되는 바이오마커 및 표지자 물질 개발에 대한 연구가 진행되고 있다.

한편, CCSP(colon cancer secreted protein; 예컨대, CCSP-2)는 대장암 특이적 표지자(바이오마커)로서, 이를 암호화하는 유전자의 정보는 관련 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예컨대, 상기 CCSP-2는 인간 CCSP-2일 수 있고, 인간 CCSP-2의 단백질 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 Accession No. AAT77225.1 등에 등록되어 있으며, 이를 암호화하는 유전자의 정보는 NCBI Accession No. AY572972.1 등에 등록되어 있다. 상기 CCSP-2의 기능 및 역할은 잘 알려져 있지 않지만, RNA 레벨에서, 정상 조직(대장암 세포가 존재하지 않는 조직)에 비해 대장암 세포 및/또는 조직에서 평균 78배 정도 발현 수준이 높음이 알려져 있다. 또한, 상기 CCSP-2는 대장암 특이적으로 발현 증가하는 분비 단백질이자 세포외기질(ECM) 단백질로, 혈액을 이용한 대장암 진단 뿐만 아니라 대장암 조직에 축적된 CCSP-2 단백질의 추적을 통해 대장암 조직의 표지가 가능하다는 이점을 갖는다. 따라서, CCSP-2의 발현 여부 및/또는 발현 수준을 유전자 및/또는 단백질 수준에서 측정하는 경우, 대장암의 존재 여부 및/또는 대장암 진행 정도를 정확하고 용이하게 확인할 수 있다.

현재 시판되는 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 항체의 경우, 특이성이 낮아 대장암 세포(또는 조직)가 아닌 약 50%의 정상 세포(또는 조직)에도 결합하여 표지가 되는 문제점이 있었다.

이와 관련하여, 본 출원의 발명자들은 CCSP-2와 특이적으로 결합하는 펩타이드를 개발하여, CCSP-2를 단백질 수준에서 특이적으로 검출하는 효과를 확인하고 대장암 및/또는 대장암 세포 및/또는 조직의 진단을 할 수 있음을 입증하여, 이를 특허출원한 바 있다(특허문헌 1).

본 출원의 발명자들은 상기 CCSP-2를 특이적으로 검출할 수 있는 기술에 대하여 연구를 계속하던 중 CCSP-2의 EGF2 도메인에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 개발하였으며, 상기 항체가 종래의 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드에 비해 친화도(affinity)가 현저히 증진되었으며, 특이성이 더욱 증진되었음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

KR 10-2018-0060184 A

본 발명의 하나의 목적은 CCSP-2(colon cancer secreted protein-2)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 또는 그의 항원결합 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 단일클론항체, 또는 그의 항원결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체, 또는 그의 항원결합 단편을 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체, 또는 그의 항원결합 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체, 또는 그의 항원결합 단편을 이용하여 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료의 CCSP-2 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기의 1) 내지 4)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하며, 인간 CCSP-2(colon cancer secreted protein-2)의 EGF2 도메인에 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 또는 그의 항원결합 단편을 제공한다:

1) 서열번호 1로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 2로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 3으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 4로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 5로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 6으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역;

2) 서열번호 7로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 8로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 9로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 10으로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 11로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 12로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역;

3) 서열번호 13으로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 14로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 15로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 16으로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 17로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 18로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역; 및

4) 서열번호 19로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 20으로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 21로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 22로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 23으로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 24로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 항원결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, dsFv, diabody, Fd 및 Fd'로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

삭제

또한, 본 발명은 상기 단일클론항체, 또는 그의 항원결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 발현 벡터가 도입된, 인간을 제외한 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단일클론항체, 또는 그의 항원결합 단편을 포함하는, 암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 암은 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 연부조직육종(soft tissue sarcoma), 림프종 및 다발성 골수종 혈액암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단일클론항체, 또는 그의 항원결합 단편을 이용하여 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료에서 CCSP-2(colon cancer secreted protein-2) 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공한다.

본 발명의 단일클론항체, 또는 그의 항원결합 단편은 CCSP-2의 EGF2 도메인에 특이적으로 결합함으로써 기존의 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드에 비해 친화도(affinity)가 현저히 증대되었으며, 기존의 CCSP-2에 대한 항체에 비해 특이성이 더욱 개선되었다. 이에 따라, 향후 CCSP-2를 단백질 수준에서 특이적으로 검출하여 정확한 진단을 가능하게 할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따라 실시되는 scFv 항체의 가변성 부위의 클로닝 전략을 개략적으로 나타내는 모식도이다.
도 2는 CCSP-2 중 항원 CCSP-2-NT, CCSP-2-CT 및 CCSP-2-EGF2 각각의 부위를 나타내는 모식도이다.
도 3은 CCSP-2-CT 및 CCSP-2-EGF2 항원 각각의 발현 벡터를 나타내는 모식도이다.
도 4a 및 도 4b는 각각 3차 및 4차 바이오 패닝의 생산 파지(output)에서 각각 48개의 클론에 대하여 ELISA를 진행한 파아지 ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 발현 벡터의 일 구현예를 나타내는 유전자 지도이다.
도 6은 본 발명에 의해 생산된 scFv 중 HN-1의 분자량을 나타내는 SDS-PAGE 겔 사진이다.
도 7은 본 발명의 scFv 중 HN-1의 항원(CCSP-2) 도메인별 결합능을 확인하기 위한 웨스턴블로팅 결과이다.
도 8은 본 발명의 scFv 중 HN-1의 항원(CCSP-2) 결합능을 ELISA로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9a, 도 9b 및 도 9c는 각각 닭 1, 2, 3 라이브러리 바이오 패닝의 생산 파지(output)에서 각각 96개의 클론에 대하여 ELISA를 진행한 파아지 ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 발현 벡터의 일 구현예를 나타내는 유전자 지도이다.
도 11은 본 발명에 의해 생산된 scFv 중 CH-1, CH2 및 CH3의 분자량 및 도메인별 결합능을 확인하기 위한 웨스턴블로팅 결과이다.
도 12는 본 발명의 scFv 중 CH-1, CH2 및 CH3의 항원(CCSP-2) 결합능을 ELISA로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 13a는 CCSP2 항체의 각 도메인별 위치와, 상기의 CCSP-2 항체들이 어떠한 도메인을 인식하고 있는지를 나타내는 모식도이다. 도 13b는 CWRU의 항체가 EGF2 도메인을 특이적으로 인식하는 것을 나타내는 웨스턴블로팅 결과이고, 도 13c는 Proteintech 사의 항체가 VWFA2 도메인을 특이적으로 인식하는 것을 나타내는 웨스턴블로팅 결과이다.
도 14a는 본 발명의 실시예 1에 의한 HN-1(scFv)으로 처리한 사진이고, 도 14b는 비교예의 항체로 처리한 사진이다.
도 15는 현재 시판되고 있는 항 CCSP-2 항체들의 결합(검출) 부위를 비교하여 나타내는 모식도이다.
도 16은 종래의 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드(한국특허출원 제10-2018-0060184호)의 친화도(affinity)를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 인간 CCSP-2(colon cancer secreted protein-2)의 EGF2 도메인에 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 또는 그의 항원결합 단편을 제공한다. 상기 CCSP-2는 대장암에 특이적(예컨대, 대장암에서 특이적으로 발현)인 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은 CCSP-2를 특이적으로 인식하는 항체를 동정하고, 이의 중쇄 가변영역의 아미노산, 경쇄 가변영역의 아미노산 및 코딩 뉴클레오타이드 서열을 규명하였다.

또한, 본 발명은 바람직한 일 실시예로서, CCSP-2에 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 또는 그의 항원결합 단편을 제공함으로써, CCSP-2를 특이적으로 검출하여 대장암 및/또는 대장암 세포 및/또는 조직의 정확한 진단을 가능하게 할 수 있으며, 특히, 상기 항체에 가시화 가능한 표지물질을 접합시켜 사용함으로써, 대장 조직을 가시화시켜 대장암 내시경 진단에 유용하게 적용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론항체, 단일클론항체, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원결합 단편(항체 단편)을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody) 및 이가(bivalent) 또는 양특이성 분자(예를 들어, 양특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다.

상기 "완전한 항체"는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 완전한 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.

본 명세서에서 용어"항체의 항원결합 단편"은 완전한 항체 분자 내에서 항원-항체 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, dsFv, diabody, Fd 및 Fd'등을 포함한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중사슬 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고, 단일사슬 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중사슬 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. diabody(디아바디)는 2개 또는 그 이상의 폴리펩티드쇄 또는 단백질의 복합체로서, 각각 적어도 1개의 VL 및 VH 도메인 또는 그 단편을 포함하고, 양 도메인이 단일의 폴리펩티드쇄 내에 포함되어 있는 복합체를 말한다. 어떠한 실시형태에서, diabody에는 Fc 또는 힌지-Fc 도메인을 포함하는 분자가 포함된다. 이러한 복합체의 폴리펩티드쇄는 동일하여도 달라도 좋고, 즉 diabody는 모노 다량체 또는 헤테로 다량체일 수 있다.

이러한 항원결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 완전한 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

본 명세서에서 용어"중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서 용어"경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.

본 발명에서 용어, "단일클론항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일클론항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역(상기 부위는 도메인으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region, FR)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.

본 명세서에서, 용어"CDR(complementarity determining region)"은 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다(Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). 중쇄(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 경쇄(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)에는 각각 3개의 CDR이 포함되어 있으며, 이들 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.

한편, 상기 단일클론항체는 상기에서 설명한 바와 같이 인체에 적용하기 위해 면역원성을 감소시킨 키메라성 항체 또는 인간화 항체의 형태일 수 있다.

본 발명에서 용어, "키메라성 항체(chimeric antibody)"는 DNA 재조합 기술에 의하여 생쥐, 닭 등 사람에 대해서는 이종(異種)인 항체의 가변영역과 인간 항체의 불변영역을 재조합시킨 형태의 항체이며, 상기 키메라성 항체의 면역반응은 생쥐, 닭 등 사람에 대해서는 이종(異種)인 항체에 비하여 크게 개선되므로, 임상적으로 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "인간화 항체(humanized antibody)"는 생쥐, 닭 등 사람에 대해서는 이종(異種)인 단일클론항체의 CDR 서열의 전부 또는 일부를 인간 항체에 이식시킨 형태의 항체를 의미하며, 그 예로 닭 또는 생쥐 단일클론항체의 CDRs를 인간 항체 유래의 FR과 재조합시켜 인간화 가변영역을 제조하고 이를 바람직한 인간 항체의 불변영역과 재조합시켜 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 닭 또는 생쥐 유래의 CDRs만을 이식하는 경우 인간화 항체의 친화도가 떨어지므로 CDR의 3차원 구조에 영향을 줄 것으로 생각될 수 있는 FR 아미노산 잔기를 닭 또는 생쥐 항체의 아미노산으로 치환시켜 친화도를 증진시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "CCSP-2(colon cancer secreted protein-2)의 EGF2 도메인에 특이적으로 결합하는 단일클론항체"는 CCSP-2에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 의미하며, 본 발명에서 항-CCSP-2 항체와 혼용되어 사용될 수 있다. 상기 CCSP-2 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체는 CCSP-2에 결합하여 CCSP-2의 생물학적 활성을 저해하는 단일클론항체라면 제한없이 포함한다. 또한, 상기 단일클론항체의 형태는 상기에서 설명한 바와 같이, 완전한 항체 및 항원결합 단편을 모두 포함할 수 있으며, 키메라성 항체 또는 인간화 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 단일클론항체는 CCSP-2의 EGF2 도메인에 특이적으로 결합하여, CCSP-2에 의한 신호전달을 억제하여, 생물학적 활성을 저해시키므로, CCSP-2가 관여하는 암과 같은 질병의 예방 또는 치료에 있어 유용하게 사용할 수 있다. 또한 CCSP-2의 과발현은 암에 있어 특이적인 현상으로 보고되고 있으므로, CCSP-2에 특이적으로 결합할 수 있는 본 발명의 항체는 암의 진단에 있어 높은 민감도 및 특이도를 갖는 진단 능력을 가지므로, 암의 진단에 있어 유용하게 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 CCSP-2의 EGF2 부위를 항원 단백질로 이용하여 본 발명의 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 항원결합 단편을 제작하였다.

상기 인간 CCSP-2(colon cancer secreted protein-2)의 EGF2 도메인에 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 또는 그의 항원결합 단편은 하기의 1) 내지 4)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항원결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, dsFv, diabody, Fd, Fd', 상기 본 발명의 CDR 부위를 포함하는 경쇄 또는 중쇄, 또는 상기 본 발명의 CDR 부위를 포함하는 가변 도메인(Variable domain)인 것이 바람직하나 이에 한정되지는 않는다.

삭제

본 발명의 항체 또는 그의 항원결합 단편은 상기 서열로 한정된 항체에 하나 이상의 치환, 결손, 역위 또는 전좌 등 돌연변이를 통하여 본 발명의 목적하고자 하는 효과를 달성하는 모든 돌연변이체도 본 발명의 보호 범위에 포함된다.

또한, 본 발명은 상기 단일클론항체, 또는 그의 항원결합단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 33 내지 서열번호 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 제공하는 상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 바람직하게는 숙주세포에서 상기 뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동 가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있다. 그 예로 파아지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스 또는 레트로바이러스벡터 등에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형태가 될 수 있다.

상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 상기 단일클론항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 발현벡터 또는 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 발현벡터일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현벡터가 도입되어 형질전환된 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, chinese hamster ovary cells), SP2/0(마우스 골수종), 인간 림프아구(human lymphoblastoid), COS, NSO(마우스 골수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, baby hamster kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, human embryonic kidney cells), PERC.6(인간망막세포) 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.

본 발명에서 용어, "도입"은 상기 단일클론항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시키는 것을 의미한다. 아울러, 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명에서 도입은 형질전환과 혼용되어 사용될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 단일클론항체를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "암"은 CCSP-2를 발현하는 암이라면 종류에 제한없이 포함하나, 그 예로 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 연부조직육종(soft tissue sarcoma), 림프종 또는 다발성 골수종 혈액암일 수 있고, 바람직하게는 대장암 또는 췌장암일 수 있다.

본 발명에서 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 여부, 정도 (증세), 및/또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바로서, "대장암의 진단"은 대장암의 발병 여부, 대장암 부위의 정도, 대장암 (대장암 세포)의 위치, 대장암의 정도 등의 대장암의 병리 상태를 확인하는 것으로, 보다 정확한 진단을 위하여 대장암 세포 또는 대장암 세포 및/또는 조직을 정상 세포 또는 정상 조직과 정확하고 신속하게 구별하는 것이 중요하다.

본 발명의 구체적인 일례로서, 본 발명은 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공함으로써, CCSP-2를 단백질 수준에서 CCSP-2를 특이적으로 검출하여 대장암 및/또는 대장암 세포 및/또는 조직의 정확한 진단을 가능하게 할 수 있으며, 특히, 상기 항체에 가시화 가능한 표지물질을 접합시켜 사용함으로써, 대장 조직을 가시화시켜 대장암 내시경 진단에 유용하게 적용될 수 있다.

상기 단일클론항체 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 본 발명의 CCSP-2에 특이적인 단일클론항체를 포함하는 진단용 조성물을 사용하여 CCSP-2의 발현 여부나 발현 정도와 관련된 질환 또는 CCSP-2에 의해 매개되는 질환 예컨대, 암을 진단할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

상기 조성물 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 또한, 상기 암 진단용 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.

본 명세서에서는 대장암에 특이적으로 발현하는 바이오마커인 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 항체를 제공함으로써, CCSP-2의 발현 여부 및/또는 발현 수준의 측정에 유용한 수단을 제공하며, 이를 통하여, 암 진단, 특히 대장암 진단에 유용하게 적용될 수 있다. 또한, 상기 항체는 다양한 표지물질과 결합되어 사용되는 경우 암의 가시화에 사용될 수 있으며, 특히, 대장암 내시경 검사 시에 적용되어 대장암의 존재 여부 확인, 병변 부위 확인, 암 부위의 형태학적 관찰에 있어서 보다 정확한 정보를 제공할 수 있고, 대장암과 관련된 오진률을 낮추고 조기 진단에 기여할 수 있다. 또한, 상기 항체에 약물 등의 생체활성물질을 결합시킨 경우, 상기 생체활성물질을 대장암에 특이적으로 전달할 수 있어서, 생체활성물질의 대장암 표적 전달용 조성물로서 사용될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 단일클론항체를 이용하여 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료의 CCSP-2 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공한다.

상기 단일클론항체, 암, 개체 및 CCSP-2 단백질에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 암의 진단을 위한 정보의 제공방법은 본 발명의 CCSP-2에 특이적인 단일클론항체를 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료와 반응시키고 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 CCSP-2 단백질을 검출할 수 있으며, 이를 통해 암의 진단을 위한 정보의 제공을 할 수 있다. 상기 CCSP-2는 대장암 또는 췌장암과 다양한 암세포에서 과발현되어 있으므로, 정상 세포 또는 조직과 같은 대조군과 발현량을 비교하여 암을 진단할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "생물학적 시료"란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체와 반응시켜 CCSP-2 단백질의 존재 또는 암의 유무를 확인할 수 있다.

본 발명에서 용어, "항원-항체 복합체"란 시료 중의 CCSP-2 단백질 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 단일클론항체의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.

본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다.

검출 표지체로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu³⁺, Eu³⁺ 킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 ⁵⁷Co, ³H, ¹²⁵I, ¹²⁵I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다.

바람직하게는, 항원-항체 복합체를 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있다. 효소면역흡착법(ELISA)에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA,고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.

상기 단일클론항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 이들 단일클론 항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 항원-항체 반응을 이용하여 본 발명의 항-CCSP-2 항체가 CCSP-2를 특이적으로 인지함을 확인함으로써, 본 발명의 항체는 대장암과 같은 다양한 암의 진단에 유용하게 사용할 수 있음을 나타내었다.

이하, 본 발명에 따른 단일클론항체, 또는 그의 항원결합 단편에 대해 실시예를 들어 상세히 설명하기로 한다.

실시예

제조예. CCSP-2 항원 제작

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따라 실시되는 scFv 항체의 가변성 부위의 클로닝 전략을 개략적으로 나타내는 모식도이다.

또한, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 CCSP-2 항원(NT, CT, EGF2)을 나타내는 모식도이다.

상기 항원 중에서, EGF2 도메인을 포함하는 것은 CCSP-2-CT 및 CCSP-2-EGF2이다.

구체적으로, CCSP-2-CT(268 aa - 755 aa of AY57297231)는 pBT7-C-His vector(Bioneer, Korea)에 삽입하여 Origami2(DE2)(Novagen, MA, USA)에 형질도입하였다.

CCSP-2-EGF2(712 aa - 755 aa of AY572972.1)는 pBT7-N-His vector(Bioneer, Korea)에 삽입하여 Origami2(DE3)(Novagen, MA, USA)에 형질도입하였다.

도 3은 CCSP-2-CT 및 CCSP-2-EGF2 각각의 발현 벡터를 나타내는 모식도이다.

상기 CCSP-2-CT와 CCSP-2-EGF2는 Ni-NTA agarose bead(Qiagen, USA)로 정제하였다.

실시예 1. 사람 유래 항 EGF2 항체의 제조

1-1. 사람 naive 항체 라이브러리로부터의 항 EGF2 항체 선별

1-1-1. 사람 단핵세포 분리

16명의 사람의 편도조직에 Ficoll-Paque 용액(GE Healthcare)을 처리하여 말초혈액단핵세포를 수집하고, TRI 시약 (Invitrogen)을 사용하여 total RNA를 추출하였다. 올리고-dT 프라이머 및 Superscript™ III First-Strand Synthesis System(Invitrogen)을 사용하여 First strand cDNA를 합성하였다.

1-1-2. 사람 scFv 라이브러리 제작

상기 사람 단핵세포로부터 얻어진 cDNA에 대해, 면역 글로불린의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역에 특이적인 하기 표 1의 프라이머 및 Expand High Fidelity PCR 시스템(Roche Molecular Systems)을 사용하여 scFv 라이브러리를 제작하였다.

Vκ Primers
Forward
HSCK1-F	GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCC
HSCK24-F	GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGTGATGACYCAGTCTCC
HSCK3-F	GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGTGWTGACRCAGTCTCC
HSCK5-F	GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCACACTCACGCAGTCTCC
Reverse
HSCJK14o-B	GGAAGATCTAGAGGAACCACCTTTGATYTCCACCTTGGTCCC
HSCJK2o-B	GGAAGATCTAGAGGAACCACCTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC
HSCJK3o-B	GGAAGATCTAGAGGAACCACCTTTGATATCCACTTTGGTCCC
HSCJK5o-B	GGAAGATCTAGAGGAACCACCTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC
Vλ Primers
Forward
HSCLam1a	GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGTGBTGACGCAGCCGCCCTC
HSCLam1b	GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGTGCTGACTCAGCCACCCTC
HSCLam2	GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGCCCTGACTCAGCCTCCCTCCGT
HSCLam3	GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGAGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTC
HSCLam4	GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGTGCTGACTCAATCGCCCTC
HSCLam6	GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCATGCTGACTCAGCCCCACTC
HSCLam78	GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGTGGTGACYCAGGAGCCMTC
HSCLam9	GGGCCCAGGCGGCCGAGCTCGTGCTGACTCAGCCACCTTC
Reverse
HSCJLam1236	GGAAGATCTAGAGGAACCACCGCCTAGGACGGTCASCTTGGTSCC
HSCJLam57	GGAAGATCTAGAGGAACCACCGCCGAGGACGGTCAGCTSGGTSCC
VH Primers
Forward
HSCVH1-FL	GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCTCCTCTGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG
HSCVH2-FL	GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCTCCTCTGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGCAGATCACCTTGAAGGAGTCTGG
HSCVH35-FL	GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCTCCTCTGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGGAGGTGCAGCTGGTGSAGTCTGG
HSCVH3a-FL	GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCTCCTCTGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGGAGGTGCAGCTGKTGGAGTCTG
HSCVH4-FL	GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCTCCTCTGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG
HSCVH4a-FL	GGTGGTTCCTCTAGATCTTCCTCCTCTGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGG
Reverse
HSCG1234-B	CCTGGCCGGCCTGGCCACTAGTGACCGATGGGCCCTTGGTGGARGC
HSCM-B	CCTGGCCGGCCTGGCCACTAGTAAGGGTTGGGGCGGATGCACTCCC
Overlap Extension Primers
RSC-F	GAGGAGGAGGAGGAGGAGGCGGGGCCCAGGCGGCCGAGCTC
RSC-B	GAGGAGGAGGAGGAGGAGCCTGGCCGGCCTGGCCACTAGTG

각 반응에서, 2㎕의 cDNA를 60 pmol의 각 프라이머, 10㎕의 10X 반응 완충액, 8㎕의 2.5mM dNTP(Promega), 0.5㎕의 Tap DNA 중합 효소 및 물과 혼합하여 최종 부피를 100㎕로 하였다. PCR 반응은 하기 조건 하에서 수행되었다: 30사이클 15초 94℃, 30초 56℃, 및 90초 72℃에 이어서 최종 연장 10분 72℃. 약 350bp의 길이를 갖는 단편을 1.5% 아가로스 젤에 로딩하여 전기 영동한 후, QIAGEN II Gel Extraction Kit(QIAGEN)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 OD 260nm에서 판독하여 정량하였다(1 OD 단위 = 50㎍ /ml).

두 번째 PCR에서 첫 번째 V_L 및 V_H 생성물은 중복 연장 PCR (Overlap extension PCR)에 의해 무작위적으로 연결되었다. 각각의 PCR 반응은 100ng의 정제 된 V_L 및 V_H 생성물, 60pmol의 각각의 프라이머, 10㎕의 10X 반응 완충액, 8㎕의 2.5mM dNTP 및 0.5㎕의 Taq DNA 중합효소 및 물과 혼합하여 최종 부피 100㎕의 혼합물로 수행되었다. PCR은 하기 조건에서 수행되었다: 25사이클 15초 94℃, 30초 56℃, 및 2분 72℃, 이어서 최종 연장 10분 72℃. 약 700bp의 길이를 갖는 scFv 절편을 1.5% 아가로스 젤에 로딩하여 전기 영동한 후, QIAGEN II Gel Extraction Kit(QIAGEN)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 OD 260nm에서 판독하여 정량 하였다(1 OD 단위 = 50㎍/ml).

1-1-3. 라이브러리 라이게이션 및 형질 전환

상기의 PCR 산물인 scFv 절편 및 pComb3X-SS 벡터(The Scripps Research Institute)의 클로닝을 위해 SfiI 제한 효소로 절단하였다.

구체적으로, 10㎍의 정제된 오버랩 PCR 산물을 360 유닛의 SifI(㎍ DNA 당 16 유닛, Roche Molecular Systems), 20㎕의 10X 반응 완충액 및 물과 혼합하여 최종 부피를 200㎕로 조정하였다. 20㎍의 pComb3X-SS 벡터를 120 유닛의 SfiI(㎍ DNA 당 6 유닛), 20㎕의 10X 반응 완충액 및 물과 혼합하여 최종 부피를 200㎕로 조정하였다. 상기 혼합물을 8시간 동안 50℃에서 절단하였다. 약 700bp 길이의 scFv 절편 및 3400bp 길이를 갖는 벡터를 1% 아가로즈 젤에 로딩하여 전기 영동한 후, QIAGEN II Gel Extraction Kit (QIAGEN)를 이용하여 정제하였다. 1400ng의 SfiI-절단된 pComb3X 벡터 및 700ng의 scFv 절편을 40㎕의 5X 라이게이즈 완충액, 10㎕의 T4 DNA 라이게이즈(Invitrogen) 및 물과 혼합하여 최종 부피를 200㎕로 맞추어 16℃ 에서 16시간 동안 배양하여 라이게이션을 수행하였다. 이후 에탄올로 침전하여 DNA 펠렛만을 15㎕의 물에 용해시켰다.

상기 라이게이션된 라이브러리 샘플은 E.coli 균주인 ER2738(New England Biolabs Inc)에 유전자 진동기(Gene pulser: Bio-Rad Laboratories)를 이용해 전기 천공법에 의해 형질전환 시켰다. 세포를 37℃, 5ml Super Broth(SB) 배지에서 혼합하고, 1시간 동안 250rpm으로 교반하여 배양하였다. 그 다음, 10ml SB 배지 및 3㎕의 100mg/ml 카베니실린이 배양액에 첨가하였다. 50㎍/ml의 카베니실린을 함유하는 Luria Broth(LB) agar 플레이트에 상기 배양물 0.1㎕, 1㎕ 및 10㎕를 도말하여 라이브러리 크기를 결정하였다. 배양물을 1시간 동안 추가 교반 후 상기 배양물에 4.5㎕의 100mg/ml 카베니실린을 첨가하여 1시간 더 교반하였다. 상기 배양물에 2ml의 VCM13 헬퍼 파아지(>1011cfu/ml), 183ml의 미리 가온된 SB 및 92.5㎕의 100mg/ml 카베니실린을 첨가하여 250rpm, 37℃에서 2 시간 동안 교반 하였다. 상기 배양물에 280㎕(50mg/ml)의 카나마이신을 첨가하고, 250rpm, 37℃ 에서 밤새 교반하였다.

다음날, 배양물을 고속 원심분리기(Beckman, JA-10 rotor)를 이용해 3,000g, 4℃에서 원심 분리하였다. 그 다음, 박테리아 펠렛은 phagemid DNA제조를 위해 저장하고, 상층액은 멸균된 원심분리 병으로 옮겼다. 이후 8g 폴리에틸렌글리콜-8000(PEG-8000, Sigma) 및 6g의 염화나트륨(NaCl, Merck)을 첨가하고, 얼음에서 30분간 보관한 후, 상층액을 15,000g, 4℃ 에서 15분간 원심 분리하였다. 상층액을 버리고, 파지 펠렛은 1% BSA를 함유하는 트리스-완충 식염수(TBS)에 재현탁시켰다.

실시예 1-2. 고정화된 항원 상에서의 라이브러리 패닝(바이오 패닝, Bio-panning)

자성 비드(Dynabeads M-270 Epoxy, Invitrogen)를 이용하여 바이오 패닝을 수행하였다. 1X10⁷ 비드에 3㎍의 C-말단 절편 EGF2 재조합 단백질을 실온에서 20시간 동안 회전 교반시키면서 항원을 코팅하였다. 코팅된 비드를 PBS로 4회 세척한 후 3%BSA를 함유하는 인산완충식염수(PBS)로 상온에서 한 시간 동안 블로킹한 후 상기 실시예 3-3.에서 수득한 Phage-dislayed scFv와 함께 실온에서 두 시간 동안 배양하였다. 비드에 코팅된 항원에 결합되지 않은 phage를 제거하기 위해 0.05% Tween20/PBS로 세척한 후, 결합된 파지를 50㎕의 0.1M 글리신/염화수소(0.1M Glycine-HCl, pH 2.2)를 이용하여 용출시키고, 3㎕의 2M 트리스-염화수소(Tris-HCl, pH 9.1)로 중화 시켰다. 이러한 파지 함유 상등액을 사용하여 E.coli ER2738을 감염시키고, 파지의 밤샘 증폭을 위해 VCSM13 헬퍼 파지를 이용하여 rescue 하였다. 또한 상기 파지로부터 감염된 배양물을 50㎍/ml의 카베니실린을 함유하는 LB agar 플레이트 상에 도말하여 투입(input) 및 생산(output) 파지 역가를 결정하였다. 다음날, PEG-8000 및 NaCl를 첨가하여 파지만을 침전시키고, 상기 침전된 파지를 다음 차수 바이오 패닝에 사용하였다.

상기 과정을 반복하여 4차까지 패닝을 수행하였다. 또한 세척 단계를 1차에서는 1회 이후 세척 회수를 점차적으로 증가시켜 4차에서는 3회로 수행하면서 높은 친화도를 갖는 파지를 선별 및 enrichment 시켰다.

실시예 1-3. 파아지 ELISA에 의한 클론의 선별

바이오 패닝으로부터 선별된 클론을 분석하기 위하여 무작위로 선택된 phage-displayed scFv 개별 클론 중 C term EGF2 재조합 단백질(monomer)에 결합력을 갖는지를 확인하고자 ELISA를 수행하였다.

C term EGF2 재조합 단백질(monomer)을 0.1M NaHCO3 완충액에 희석하여 96well 마이크로타이터 플레이트에 100ng/well로 4℃에서 16시간 동안 코팅한 후 다음날 3%BSA/PBS로 37 ℃에서 1시간 동안 블로킹하였다. 이후, 파지 상등액을 6%BSA/PBS와 동일하게 혼합하고, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 0.05% Tween20/PBS로 세척한 후, 플레이트에 HRP conjugated 항-M13 항체(a-M13-HRP, Pierce Chemical Co)를 1/5000으로 희석하여 50㎕씩 첨가 후 1시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 배양이 끝나고 세척을 수행한 후에 색상 반응을 위해, 0.05M 구연산 완충 용액 내, 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS, Amresco) 1㎍/ml 및 0.1% H2O2를 각각의 well에 첨가하고 발색하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 4a 및 도 4b는 각각 3차 및 4차 바이오 패닝의 생산 파지(output)에서 각각 48개의 클론의 흡광도를 분석한 결과를 나타낸다. C term EGF2 재조합 단백질에 결합하는 클론 중 흡광도가 높은 24개의 클론의 유전자 서열을 분석하여, 총 11종의 서로 다른 서열을 가진 scFv 클론을 수득하였다.

실시예 1-4. 항 CCSP-2-EGF2 scFv hFc1 융합 단백질 제작

1-4-1. 포유류 발현 벡터로 항 CCSP-2-EGF2 scFv 서브 클로닝(scFv-hFc1)

HindⅢ(New England Biolabs) 및 XhoⅠ(New England Biolabs) 제한 효소에 의해 pCEP4 벡터(Invitrogen)로 IgG2 힌지(hinge) 및 인간 IgG1 하이브리드 CH2-CH3을 코딩하는 유전자가 삽입되었다. 항-CCSP-2-EGF2 scFv를 코딩하는 유전자는 두 SfiⅠ 제한 부위에 의해 Fc 영역의 5' 말단으로 서브클로닝되었다. 경쇄에 대하여, 인간 면역글로블린 Fc 유전자는 포유류 발현 벡터로 서브클로닝되었다. 중쇄에 대하여, 인간 CH1 및 IgG2의 hinge부터 인간 IgG1 하이브리드 CH2-CH3 영역까지 유전자는 포유류 발현 벡터로 서브클로닝되었다(도 5 참조).

도 5는 본 발명의 발현 벡터의 일 구현예를 나타내는 유전자 지도이다.

1-4-2. 형질주입 및 단백질 정제

형질주입은 과발현 재조합 단백질에 대해 수행되었다. 배양 부피의 ml당 2㎍의 포유류 발현 벡터와 4㎍의 폴리에틸렌이민(PEI, Polysciences, Warrington, PA, USA)을 세포 배양부피의 1/10에 해당하는 150mM 염화나트륨(NaCl, Merck)에 혼합하고, 상온에서 15분간 방치하였다. 단백질 과발현 시스템에 사용되는 포유세포 HEK293F(1X10⁶ 세포/ml, Invitrogen)에 상기 혼합물을 첨가하여, 6일 동안 100U/ml 페니실린 및 스트렙토마이신(Invitrogen)을 함유하는 Freestyle^TM293 발현 배양액(Invitrogen)에서, 37℃, 7% CO₂ 및 135rpm의 교반 조건하에 배양하였다.

세포 배양액의 상층액은 수거되었고 Fc 융합 단백질의 정제를 위하여 단백질 A를 이용한 친화도 젤 크로마토그래피 방법을 사용하였다. 분리된 scFv는 PBS 완충용액으로 투석을 통하여 정제를 완료한 후, SDS-PAGE를 실시하여 약 55 kDa의 분자량을 확인하였다(도 6 참조).

도 6은 본 발명에 의해 생산된 scFv 중 HN-1의 분자량을 나타내는 SDS-PAGE 겔 사진이다.

실시예 1-5. 재조합항체의 결합능 확인

1-5-1. 웨스턴블로팅

CCSP-2 단백질을 domain별로 준비하여 변성완충액을 첨가하고 10분간 가열한 후 변성된 시료를 준비된 젤에 적제하여 SDS-PAGE 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 완료된 후 젤은 염색하지 않고 면역학적 분석을 위해 전기이동(Eletro-transfer)방법으로 단백질을 Trans-Blot Turbo™ Mini PVDF Transfer Packs(Bio-Rad)으로 이동시켰다. 비특이적 반응을 억제하기 위해 5% Skim milk/TBST 용액에 담궈 교반기위에서 1시간동안 처리하였다. 1차 항체는 실시예 1-4-2에 따라 얻어진 scFv를 정해진 농도로 희석하여 사용하였고, 2차 항체는 HRP가 결합된 항 인간 면역글로불린 Fc 2차 항체(HRP conjugated anti-Human IgG Fc Secondary Antibody, Invigrogen)를 사용하였다. 각 항체 반응은 1시간씩 실시하였고, 각 단계 후 0.1% Tween 20이 함유된 PBS 완충용액을 이용하여 3회 세척하였다. 마지막으로 항원-항체반응을 확인하기 위해 ECL(enhanced chemiluminescent) 기질을 사용하였다(도 7 참조).

도 7은 본 발명의 scFv 중 HN-1의 항원(CCSP-2) 도메인별 결합능을 확인하기 위한 웨스턴블로팅 결과이다.

상기 도 7을 살펴보면, 본 발명에 따른 scFv 항체가 EGF2 도메인에 특이적으로 결합하는 것을 확인할 수 있다.

1-5-2. 효소면역분석법(sandwich ELISA)

96웰 플레이트에 10㎍/㎖ 농도로 실시예 1-4-2에 따라 얻어진 scFv를 코팅한 뒤 5% Skim milk/TBST를 이용하여 1시간동안 blocking을 실시하였다. 상기 항원이 고정화된 well은 그 후 0.1% Tween 20이 함유된 PBS 완충용액을 이용하여 3차례 세척을 실시하였고, 900ng/㎖ 300ng/㎖, 100ng/㎖, 33.3ng/㎖, 11.1ng/㎖ 농도로 CCSP-2 단백질을 분주하여 1시간동안 항원-항체간 반응을 유도하였다. 항원과 반응한 항체의 양을 측정하기 위해 1:500의 비율로 희석된 Anti-CCSP-2(Cloud-Clone Corp.,TX, USA) 1차 항체와 1:2000의 비율로 희석된 HRP가 결합된 항 토끼 면역글로불린 2차 항체(HRP conjugated anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Invigrogen)를 차례대로 이용하여 1시간 동안 반응을 실시하였다. 이 후 상기 well에 TMB(Tetramethylbenzidine) 기질을 분주하여 상온에서 20 분간 발색을 유도한 뒤 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였다(도 8 참조).

도 8은 본 발명의 scFv 중 HN-1의 항원(CCSP-2) 결합능을 ELISA로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

상기 도 8을 살펴보면, 본 발명에 따른 scFv 항체가 CCSP-2 단백질에 대하여 양-의존적 반응성을 나타냄을 확인할 수 있다.

본 발명에 의해 구축된 scFv 항체는 상기한 바와 같이 그 크기가 약 55 kDa이고, 항원에 대한 결합능을 갖는 항체로서의 기능을 갖는 것이다.

실시예 1-6. 항체 라이브러리 서열 분석

선별된 항체 라이브러리의 가변영역 서열 분석을 위해 임의의 형질전환체 배양하여 각각의 플라스미드 획득한 후 서열 분석을 수행하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. abYsis (http://www.abysis.org/)에서 Chothia numbering 분석법을 이용하여 VL-VH의 상보성 결정부위와 뼈대부위의 서열을 확인하였다.

	VL			VH
Clone	CDR1	CDR2	CDR3	CDR1	CDR2	CDR3
HN-1	SGSSRWY	SNDKRPS	GSGDSSSNPGI	GFTFSDR	SNAGGY	GASYDAIDA

실시예 2. 닭 유래 항 EGF2 항체 제조

실시예 2-1. 면역 항체 라이브러리로부터 항 EGF2 항체 선별

2-1-1. 면역화

상기 실시예 1에서 제작된 C-말단 절편 EGF2 단백질 30 μg을 항원으로서 2% 스쿠알렌 중에 독소가 제거된 내독소인 MPL (monophosphorylate lipid A species) 및 마이코박테리아 (mycobacteria)의 세포벽 성분인 TDW 및 CWS를 함유하는 유중수 유화액인 보조제 (RIBI+MPL+TDM+CWS adjuvant, Sigma, St. Louis, Mo, USA)에 유화시키고, 3마리의 닭 피하에 주사하였다. 동일 방법으로 3주 및 그 다음 2주 후에 추가 접종하여 총 3회의 면역을 수행하였다. 면역화된 닭의 항체 역가 (titer)는 이차 항체로 HRP (horseradish peroxidase) conjugated 항 닭 IgG(Y) 다클론 항체 (Rabbit anti-chicken IgG(Y)-HRP, Millipore corporation, Billeria, MA, USA)를 사용하여 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 결정되었다.

2-1-2. 닭 scFv 라이브러리 제작

상기 2-1-1.에서 면역화된 닭의 비장, 활액낭 및 골수로부터 TRI 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 total RNA를 추출하였다. 올리고-dT 프라이머 및 Superscript™ III First-Strand Synthesis System (Invitrogen)을 사용하여 First strand cDNA를 합성하였다.

닭의 면역기관으로부터 얻어진 cDNA에 대해 Expand High Fidelity PCR 시스템 (Roche Molecular Systems, IN, USA)을 이용해 면역 글로불린의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역에 특이적인 하기 표 3의 프라이머를 사용하여 scFv 라이브러리를 제작하였다.

Vλ Primers
CSCVK	GTG GCC CAG GCG GCC CTG ACT CAG CCG TCC TCG GTG TC
CKJo-B	GGA AGA TCT AGA GGA CTG ACC TAG GAC GGT CAG G
VH Primers
CSCVHo-FL	GGT CAG TCC TCT AGA TCT TCC GGC GGT GGT GGC AGC TCC GGT GGT GGC GGT TCC GCC GTG ACG TTG GAC GCG
CSCG-B	CTG GCC GGC CTG GCC ACT AGT GGA GGA GAC GAT GAC TTC GGT CC
Overlap Extension Primers
CSC-F	GAG GAG GAG GAG GAG GAG GTG GCC CAG GCG GCC CTG ACT CAG
CSC-B	GAG GAG GAG GAG GAG GAG GAG CTG GCC GGC CTG GCC ACT AGT GGA GG

각 반응에서, 2㎕의 cDNA를 60 pmol의 각 프라이머, 10㎕의 10X 반응 완충액, 8㎕의 2.5mM dNTP(Promega, Madison, WI, USA), 0.5㎕의 Tap DNA 중합 효소 및 물과 혼합하여 최종 부피를 100㎕로 하였다. PCR 반응은 하기 조건 하에서 수행되었다: 30사이클 15초 94℃, 30초 56℃, 및 90초 72℃에 이어서 최종 연장 10분 72℃. 약 350bp의 길이를 갖는 단편을 1.5% 아가로스 젤에 로딩하여 전기 영동한 후, QIAGEN II Gel Extraction Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 OD 260nm에서 판독하여 정량하였다(1 OD 단위 = 50㎍ /ml).

두 번째 PCR에서 첫 번째 VL 및 VH 생성물은 중복 연장 PCR(Overlap extension PCR)에 의해 무작위적으로 연결되었다. 각각의 PCR 반응은 100ng의 정제 된 VL 및 VH 생성물, 60pmol의 각각의 프라이머, 10㎕의 10X 반응 완충액, 8㎕의 2.5mM dNTP 및 0.5㎕의 Taq DNA 중합효소 및 물과 혼합하여 최종 부피 100㎕의 혼합물로 수행되었다. PCR은 하기 조건에서 수행되었다: 25사이클 15초 94℃, 30초 56℃, 및 2분 72℃, 이어서 최종 연장 10분 72℃, 약 700bp의 길이를 갖는 scFv 절편을 1.5% 아가로스 젤에 로딩하여 전기 영동한 후, QIAGEN II Gel Extraction Kit (QIAGEN)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 OD 260nm에서 판독하여 정량 하였다(1 OD 단위 = 50㎍/ml).

2-1-3. 면역 항체 라이브러리 라이게이션 및 형질 전환

PCR 산물인 scFv 절편 및 pComb3X-SS 벡터(The Scripps Research Institute, CA, USA)를 클로닝을 위해 SfiI 제한 효소로 절단하였다. 10㎍의 정제된 오버랩 PCR 산물을 360 유닛의 SifI(㎍ DNA 당 16 유닛, Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA, USA), 20㎕의 10X 반응 완충액 및 물과 혼합하여 최종 부피를 200㎕로 조정하였다. 20㎍의 pComb3X-SS 벡터를 120 유닛의 SfiI(㎍ DNA 당 6 유닛), 20㎕의 10X 반응 완충액 및 물과 혼합하여 최종 부피를 200㎕로 조정하였다. 상기 혼합물을 8시간 동안 50℃에서 절단하였다. 약 700bp 길이의 scFv 절편 및 3400bp 길이를 갖는 벡터를 1% 아가로즈 젤에 로딩하여 전기 영동한 후, QIAGEN II Gel Extraction Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA)를 이용하여 정제하였다. 1400ng의 SfiI-절단된 pComb3X 벡터 및 700ng의 scFv 절편을 40㎕의 5X 라이게이즈 완충액, 10㎕의 T4 DNA 라이게이즈(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 물과 혼합하여 최종 부피를 200㎕로 맞추어 16℃ 에서 16시간 동안 배양하여 라이게이션을 수행하였다. 이후 에탄올로 침전하여 DNA 펠렛만을 15㎕의 물에 용해시켰다.

상기 라이게이션된 라이브러리 샘플은 E.coli 균주인 ER2738(New England Biolabs Inc, Hitchin, Hertfordshine, SG4 OTY, England, UK)에 유전자 진동기(Gene pulser: Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 이용해 전기 천공법에 의해 형질전환 시켰다. 세포를 37℃, 5ml Super Broth(SB) 배지에서 혼합하고, 1시간 동안 250rpm으로 교반하여 배양하였다. 그 다음, 10ml SB 배지 및 3㎕의 100mg/ml 카베니실린이 배양액에 첨가하였다. 50㎍/ml의 카베니실린을 함유하는 Luria Broth(LB) agar 플레이트에 상기 배양물 0.1㎕, 1㎕ 및 10㎕를 도말하여 라이브러리 크기를 결정하였다. 배양물을 1시간 동안 추가 교반 후 상기 배양물에 4.5㎕의 100mg/ml 카베니실린을 첨가하여 1시간 더 교반하였다. 상기 배양물에 2ml의 VCM13 헬퍼 파아지(>1011cfu/ml), 183ml의 미리 가온된 SB 및 92.5㎕의 100mg/ml 카베니실린을 첨가하여 250rpm, 37℃에서 2 시간 동안 교반 하였다. 상기 배양물에 280㎕(50mg/ml)의 카나마이신을 첨가하고, 250rpm, 37℃ 에서 밤새 교반 하였다.

다음날, 배양물을 고속 원심분리기(Beckman, JA-10 rotor)를 이용해 3,000g, 4℃에서 원심 분리하였다. 그 다음, 박테리아 펠렛은 phagemid DNA제조를 위해 저장하고, 상층액은 멸균된 원심분리 병으로 옮겼다. 이후 8g 폴리에틸렌 글리콜-8000(PEG-8000, Sigma) 및 6g의 염화나트륨 (NaCl, Merck)을 첨가하고, 얼음에서 30분간 보관한 후, 상층액을 15,000g, 4℃ 에서 15분간 원심 분리하였다. 상층액을 버리고, 파지 펠렛은 1% BSA를 함유하는 트리스-완충 식염수(TBS)에 재현탁시켰다.

실시예 2-2. 고정화된 항원 상에서의 라이브러리 패닝 (바이오 패닝, Bio-panning)

자성 비드 (Dynabeads M-270 Epoxy, Invitrogen)을 이용하여 바이오 패닝을 수행하였다. 1X10⁷비드에 3㎍의 C-말단 절편 EGF2 재조합 단백질을 실온에서 20시간 동안 회전 교반시키면서 항원을 코팅하였다. 코팅된 비드를 PBS로 4회 세척한 후 3%BSA를 함유하는 인산완충식염수(PBS)로 상온에서 한 시간 동안 블로킹한 후 상기 실시예 2-3.에서 수득한 Phage-dislayed scFv와 함께 실온에서 두 시간 동안 배양하였다. 비드에 코팅된 항원에 결합되지 않은 phage를 제거하기 위해 0.05% Tween20/PBS로 세척한 후, 결합된 파지를 50㎕의 0.1M 글리신/염화 수소(0.1M Glycine-HCl, pH 2.2)를 이용하여 용출시키고, 3㎕의 2M 트리스-염화수소(Tris-HCl, pH 9.1)로 중화 시켰다. 이러한 파지 함유 상등액을 사용하여 E.coli ER2738을 감염시키고, 파지의 밤샘 증폭을 위해 VCSM13 헬퍼 파지를 이용하여 rescue 하였다. 또한 상기 파지로부터 감염된 배양물을 50㎍/ml의 카베니실린을 함유하는 LB agar 플레이트 상에 도말하여 투입(input) 및 생산(output) 파지 역가를 결정하였다. 다음날, 실시예 2-3.에서와 같이 PEG-8000 및 NaCl를 첨가하여 파지만을 침전시키고, 상기 침전된 파지를 다음 차수 바이오 패닝에 사용하였다.

상기 과정을 반복하여 4차까지 패닝을 수행하였다. 또한 세척 단계를 1차에서는 1회 이후 세척 회수를 점차적으로 증가시켜 4차에서는 4회로 수행하면서 높은 친화도를 갖는 파지의 선별 및 enrichment 시켜나갔다.

실시예 2-3. 파아지 ELISA에 의한 클론의 선별

바이오 패닝으로부터 선별된 클론을 분석하기 위하여 무작위로 선택된 phage-displayed scFv 개별 클론 중 EGF2를 포함하고 있는 CCSP2-C 말단 재조합 단백질(monomer)에 결합력을 갖는 지를 확인하고자 ELISA를 수행하였다.

EGF2를 포함하고 있는 CCSP2-C 말단 재조합 단백질(monomer)을 0.1M NaHCO3 완충액에 희석하여 96well 마이크로타이터 플레이트에 100ng/well로 4℃에서 16시간 동안 코팅한 후 다음날 3%BSA/PBS로 37 ℃에서 1시간 동안 블로킹하였다. 이후, 파지 상등액을 6%BSA/PBS와 동일하게 혼합하고, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 0.05% Tween20/PBS로 세척한 후, 플레이트에 HRP conjugated 항-M13 항체(a-M13-HRP, Pierce Chemical Co, Rockford, IL, USA)를 1/5000으로 희석하여 50㎕씩 첨가 후 1시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 배양이 끝나고 세척을 수행한 후에 색상 반응을 위해, 0.05M 구연산 완충 용액 내, 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS, Amresco, Solon, OH, USA) 1㎍/ml 및 0.1% H2O2를 각각의 well에 첨가하고 발색하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 도 9a, 도 9b 및 도 9c는 각각 닭 1, 2, 3 라이브러리 바이오 패닝의 생산 파지(output)에서 각각 96개씩의 클론을 분석한 결과를 나타낸다. EGF2를 포함하고 있는 CCSP2-C 말단 재조합 단백질에 동시에 결합하는 클론 중 흡광도가 높은 58개의 클론의 유전자 서열을 분석하여, 총 8종의 서로 다른 서열을 가진 scFv 클론을 수득하였다.

실시예 2-4. 항 CCSP-2-EGF2 scFv hFc1 융합 단백질 제작

2-4-1. 포유류 발현 벡터로 항 CCSP-2-EGF2 scFv 서브 클로닝(scFv-hFc1)

HindⅢ(New England Biolabs) 및 XhoⅠ(New England Biolabs) 제한 효소에 의해 pCEP4 벡터(Invitrogen)로 IgG2 힌지(hinge) 및 인간 IgG1 하이브리드 CH2-CH3을 코딩하는 유전자가 삽입되었다. 항-CCSP-2-EGF2 scFv를 코딩하는 유전자는 두 SfiⅠ 제한 부위에 의해 Fc 영역의 5' 말단으로 서브클로닝되었다. 경쇄에 대하여, 인간 면역글로블린 Fc 유전자는 포유류 발현 벡터로 서브클로닝되었다. 중쇄에 대하여, 인간 CH1 및 IgG2의 hinge부터 인간 IgG1 하이브리드 CH2-CH3 영역까지 유전자는 포유류 발현 벡터로 서브클로닝되었다(도 10 참조).

도 10은 본 발명의 발현 벡터의 일 구현예를 나타내는 유전자 지도이다.

2-4-2. 형질주입 및 단백질 정제

형질주입은 과발현 재조합 단백질에 대해 수행되었다. 배양 부피의 ml당 2㎍의 포유류 발현 벡터와 4㎍의 폴리에틸렌이민(PEI, Polysciences, Warrington, PA, USA)을 세포 배양부피의 1/10에 해당하는 150mM 염화나트륨(NaCl, Merck)에 혼합하고, 상온에서 15분간 방치하였다. 단백질 과발현 시스템에 사용되는 포유세포 HEK293F(1X10⁶ 세포/ml, Invitrogen)에 상기 혼합물을 첨가하여, 6일 동안 100U/ml 페니실린 및 스트렙토마이신(Invitrogen)을 함유하는 FreestyleTM 293 발현 배양액(Invitrogen)에서, 37℃, 7% CO₂ 및 135rpm의 교반 조건하에 배양하였다.

세포 배양액의 상층액은 수거되었고 Fc 융합 단백질의 정제를 위하여 단백질 A를 이용한 친화도 젤 크로마토그래피 방법을 사용하였다. 분리된 scFv는 PBS 완충용액으로 투석을 통하여 정제를 완료한 후, SDS-PAGE를 실시하여 약 55 kDa의 분자량을 확인하였다(도 11 참조).

실시예 2-5. 재조합 항체의 결합능 확인

2-5-1. 웨스턴블로팅

CCSP-2 단백질을 domain별로 준비하여 변성완충액을 첨가하고 10분간 가열한 후 변성된 시료를 준비된 젤에 적제하여 SDS-PAGE 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 완료된 후 젤은 염색하지 않고 면역학적 분석을 위해 전기이동(Eletro-transfer)방법으로 단백질을 Trans-Blot Turbo™ Mini PVDF Transfer Packs(Bio-Rad)으로 이동시켰다. 비특이적 반응을 억제하기 위해 5% Skim milk/TBST 용액에 담궈 교반기위에서 1시간동안 처리하였다. 1차 항체는 실시예 1-4-2에 따라 얻어진 scFv를 정해진 농도로 희석하여 사용하였고, 2차 항체는 HRP가 결합된 항 인간 면역글로불린 Fc 2차 항체(HRP conjugated anti-Human IgG Fc Secondary Antibody, Invigrogen)를 사용하였다. 각 항체 반응은 1시간씩 실시하였고, 각 단계 후 0.1% Tween 20이 함유된 PBS 완충용액을 이용하여 3회 세척하였다. 마지막으로 항원-항체반응을 확인하기 위해 ECL(enhanced chemiluminescent) 기질을 사용하였다(도 11 참조).

도 11은 본 발명에 의해 생산된 scFv 중 CH-1, CH2 및 CH3의 분자량 및 도메인별 결합능을 확인하기 위한 웨스턴블로팅 결과이다.

2-5-2. 효소면역분석법(sandwich ELISA)

96웰 플레이트에 10㎍/㎖ 농도로 실시예 1-4-2에 따라 얻어진 scFv를 코팅한 뒤 5% Skim milk/TBST를 이용하여 1시간동안 blocking을 실시하였다. 상기 항원이 고정화된 well은 그 후 0.1% Tween 20이 함유된 PBS 완충용액을 이용하여 3차례 세척을 실시하였고, 900ng/㎖ 300ng/㎖, 100ng/㎖, 33.3ng/㎖, 11.1ng/㎖ 농도로 CCSP-2 단백질을 분주하여 1시간동안 항원-항체간 반응을 유도하였다. 항원과 반응한 항체의 양을 측정하기 위해 1:500의 비율로 희석된 Anti-CCSP-2(Cloud-Clone Corp.,TX, USA) 1차 항체와 1:2000의 비율로 희석된 HRP가 결합된 항 토끼 면역글로불린 2차 항체(HRP conjugated anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Invigrogen)를 차례대로 이용하여 1시간 동안 반응을 실시하였다. 이 후 상기 well에 TMB(Tetramethylbenzidine) 기질을 분주하여 상온에서 20 분간 발색을 유도한 뒤 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였다(도 12 참조).

도 12는 본 발명의 scFv 중 CH-1, CH2 및 CH3의 항원(CCSP-2) 결합능을 ELISA로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

상기 도 12를 살펴보면, 본 발명에 따른 scFv 항체가 CCSP-2 단백질에 대하여 양-의존적 반응성을 나타냄을 확인할 수 있다.

실시예 2-6. 항체 라이브러리 서열 분석

선별된 항체 라이브러리의 가변영역 서열 분석을 위해 임의의 형질전환체 배양하여 각각의 플라스미드 획득한 후 서열 분석을 수행하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. abYsis (http://www.abysis.org/)에서 Chothia numbering 분석법을 이용하여 VL-VH의 정상적인 상보성 결정부위와 뼈대부위의 서열을 확인하였다.

	VL			VH
Clone	CDR1	CDR2	CDR3	CDR1	CDR2	CDR3
CH-1	SGGSNSYYG	DNTNRPS	GSTDSSYVDI	GFSFSGV	SSTGSG	DAYGYRISGSWSYGYSIDA
CH-2	SGGGSYYG	DNTNRPS	GSADSSAEPV	GFTFSSV	SNTGSG	DAYGYTISGSWSYGYSIDA
CH-3	SGDNSWYG	DSDQRPS	CGSYDSSAGYIGI	GFSFSDR	RSDGSS	DYGNGGWIAGDIDA

실험예 1. CCSP-2의 EGF2 도메인에 특이적으로 결합함으로 인한 효과

본 발명의 실시예에 의한 항체와 종래의 CCSP-2에 대한 항체를 비교하여 CCSP-2 중 EGF2 도메인에 특이적으로 결합함으로 인한 효과를 알아보고자 하였다.

먼저, 각 CCSP2 항체의 도메인별 인식 부위를 확인하고자 하였다.

CCSP-2(CT)와, 상기 CCSP-2의 각 도메인인 EGF1, VWFA2, VWFA3 및 EGF2의 재조합 단백질을 각각 제작하였다. 그리고, His-tag 및 Ni-NTA 레진의 친화력을 이용하여 상기 재조합 단백질들을 정제하였다. 상기 정제된 재조합 단백질들은 12% SDS-PAGE gel에 100 ng/well로 로딩 후, 다양한 CCSP-2 항체들로 CCSP-2 및 상기 CCSP-2의 각 도메인을 검출하였다. 실험에 사용한 CCSP-2 항체들은 ① Case Western Reserve University에서 제공한 항체(시판되고 있는 항체 아님; 이하 CWRU 항체), ② Proteintech 사의 항체 및 ③ Cloud-clone 사의 항체였다.

도 13a는 CCSP2 항체의 각 도메인별 위치와, 상기의 CCSP-2 항체들이 어떠한 도메인을 인식하고 있는지를 나타내는 모식도이다.

도 13b는 CWRU의 항체가 EGF2 도메인을 특이적으로 인식하는 것을 나타내는 웨스턴블로팅 결과이고, 도 13c는 Proteintech 사의 항체가 VWFA2 도메인을 특이적으로 인식하는 것을 나타내는 웨스턴블로팅 결과이다.

상기 도 13을 살펴보면, 상기 CWRU 항체, Proteintech 사의 항체 및 Cloud-clone 사의 항체 중에서 CWRU의 항체는 EGF2 도메인(CCSP-2의 755번째 아미노산 서열까지 포함함)을 특이적으로 인식하고, Proteintech 사의 항체 및 Cloud-clone 사의 항체는 VWFA2 도메인을 특이적으로 인식하는 것을 구체적으로 확인할 수 있다.

또한, CCSP2의 EGF2 도메인을 인식하는 항-CCSP2 항체와 인식하지 못하는 항-CCSP2 항체를 면역염색방법에 적용함으로써 정상 조직과 병변 부위의 명확한 구별이 가능한지를 확인하고자 하였다.

이를 위하여, 대장암 환자로부터 암 조직과 대장 정상 조직을 취하여 각각 파라핀 블록을 제작하고, CCSP-2 발현 특이적 항체인 CWRU 항체와 Proteintech 사의 항체를 이용하여 면역염색방법으로 분석하였다. 면역염색방법은 자동화 기기(Ventana Medical System)를 이용하여 진행하였으며, 항체는 1:100의 농도로 32분 반응 후에 Nentana OptiView DAB 키트를 이용하여 발색시켰다. CWRU 항체는 정상 조직에서는 염색이 되지 않고 병변 부위에서만 염색이 되었지만, Proteintech 사의 항체에서는 정상 부분에서도 50%가 염색이 되어 병변 부위와 확실히 구분해주지는 못했다.

이러한 결과로부터, 질환을 구별하는, 즉 정상 조직과 병변 부위를 구별하는 CCSP2의 부위가 CWRU 항체가 특이적으로 인식하고 있는 EGF2 도메인 이하의 아미노산 서열인 것으로 추측할 수 있다. 이러한 추측을 근거로, 본 발명자들은 CCSP2의 EGF2 도메인에서 끝 부분까지의 서열(CCSP2의 아미노산 서열 712 내지 755)로 이루어진 단백질을 이용하여 항체 스크리닝을 진행한 것이다.

도 14a는 Case Western Reserve University의 항체로 처리한 사진이고, 도 14b는 비교예의 항체로 처리한 사진이다.

상기 도 14를 살펴보면, Case Western Reserve University의 항체로 처리한 경우 paired normal cell에서는 0%가 염색되고, 비교예의 항체로 처리한 경우 paired normal cell에서 50% 가량이 염색된 것을 확인할 수 있다.

즉, CCSP-2의 EGF2 도메인에 특이적으로 결합하는 항체는 기존의 정상 및 병변 부위를 구별하는데 의미가 있는 EGF2 도메인을 검출할 수 없는 항 CCSP-2 항체에 비해 정상 조직과 병변 부위의 구별을 더욱 명확하게 하므로 더욱 정확한 진단을 가능하게 한다.

도 15는 현재 시판되고 있는 항 CCSP-2 항체들의 결합(검출) 부위를 비교하여 나타내는 모식도이다.

도 15를 살펴보면, Protein tech 사의 항체는 CCSP-2의 아미노산 서열 341 내지 517 부위에 결합하고, Abcam 사의 항체는 아미노산 서열 201 내지 373 부위에 결합하며, Cloud-clone 사의 항체는 아미노산 서열 547 내지 517 부위에 결합하므로, 상기 Protein tech 사, Abcam 사 및 Cloud-clone 사의 항체들은 정상과 병변 부위를 구별하는데 의미가 있는 CCSP-2의 아미노산 서열 712 내지 748 부위인 EGF2 도메인 부분을 전혀 검출할 수 없게 된다.

실험예 2. 종래 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드와의 친화도(affinity) 비교

본 발명의 실시예에 의한 항체(scFv)와 종래의 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드(한국특허출원 제10-2018-0060184호)의 친화도(affinity)를 비교하고자 하였다.

그러나, 펩타이드와 항체의 물질의 특성상 동일한 실험 방법을 이용하여 친화도를 비교할 수는 없었다. 따라서, 펩타이드와 항체 모두 CCSP-2 단백질의 농도 구간을 정하여 펩타이드와 CCSP-2 단백질 결합력은 FCS(한국특허출원 제10-2018-0060184 참조)로, 항체와 CCSP-2 단백질의 결합력은 ELISA(본 발명의 실시예 2-5-2 참조)로 측정한 후 해리 상수를 구하였다.

도 16은 종래의 CCSP-2에 특이적으로 결합하는 펩타이드(한국특허출원 제10-2018-0060184호)의 친화도(affinity)를 나타내는 그래프이다.

도 16을 살펴보면, 종래의 펩타이드와 CCSP-2의 결합에 대한 K_D값(친화도)은 μM 단위인 것을 확인할 수 있다.

본 발명의 실시예 1에 의한 HN-1(scFv)와 CCSP-2의 결합에 대한 K_D값(친화도)은 nM 단위이므로(도 1 참조), 본 발명에 따른 항체의 CCSP-2에 대한 친화도가 현저히 높은 것을 확인할 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> UNIVERSITY OF ULSAN FOUNDATION FOR INDUSTRY COOPERATION THE ASAN FOUNDATION EdisBiotech Co., Ltd. <120> CCSP-2 Specific Monoclonal Antibody and Use thereof <130> HP8450, PA-20180444 <160> 36 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH_CDR1 FOR HN-1 <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Arg 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH_CDR2 FOR HN-1 <400> 2 Ser Asn Ala Gly Gly Tyr 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH_CDR3 FOR HN-1 <400> 3 Gly Ala Ser Tyr Asp Ala Ile Asp Ala 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL_CDR1 FOR HN-1 <400> 4 Ser Gly Ser Ser Arg Trp Tyr 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL_CDR2 FOR HN-1 <400> 5 Ser Asn Asp Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL_CDR3 FOR HN-1 <400> 6 Gly Ser Gly Asp Ser Ser Ser Asn Pro Gly Ile 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> 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20 25 30 <210> 28 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL FOR CH-1 <400> 28 Ser Gly Gly Ser Asn Ser Tyr Tyr Gly Asp Asn Thr Asn Arg Pro Ser 1 5 10 15 Gly Ser Thr Asp Ser Ser Tyr Val Asp Ile 20 25 <210> 29 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH FOR CH-2 <400> 29 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Val Ser Asn Thr Gly Ser Gly Asp Ala Tyr 1 5 10 15 Gly Tyr Thr Ile Ser Gly Ser Trp Ser Tyr Gly Tyr Ser Ile Asp Ala 20 25 30 <210> 30 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL FOR CH-2 <400> 30 Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Tyr Gly Asp Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly 1 5 10 15 Ser Ala Asp Ser Ser Ala Glu Pro Val 20 25 <210> 31 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH FOR CH-3 <400> 31 Gly Phe Ser Phe Ser Asp Arg Arg Ser Asp Gly Ser Ser Asp Tyr Gly 1 5 10 15 Asn Gly Gly Trp Ile Ala Gly Asp Ile Asp Ala 20 25 <210> 32 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL FOR CH-3 <400> 32 Ser Gly Asp Asn Ser Trp Tyr Gly Asp Ser Asp Gln Arg Pro Ser Cys 1 5 10 15 Gly Ser Tyr Asp Ser Ser Ala Gly Tyr Ile Gly Ile 20 25 <210> 33 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HN-1 <400> 33 ctgactcagc cgtcctcggt gtcagcgaac ccgggagaaa ccgtcaagat cacctgctcc 60 gggagtagca gatggtacgg ctggttccag cagaagtctc ctggcagtgc ccctgtcact 120 ctgatctata gcaacgacaa gagaccctcg gacatccctt cacgattctc cggttccaca 180 tccggctcca caagcacatt aaccatcact ggggtccaag ccgacgacga ggctgtctat 240 tactgtggga gtggagacag cagcagtaat cctggtatat ttggggccgg gacaaccctg 300 accgtcctag gtcagtcctc tagatcttcc ggcggtggtg gcagctccgg tggtggcggt 360 tccgccgtga cgttggacga gtccgggggc ggcctccaga cgcccggagg agggctcagc 420 ctcgtctgca aggcctccgg gttcaccttc agtgaccgtg gcatgcactg ggtgcgacag 480 gcgcccggca aggggttgga actcgtcgca agtattagca acgctggtgg ttacacaaac 540 tacgggtcgg cggtgaaggg ccgtgccacc atctcgaggg acaacgggca gagcacactg 600 aggctgcagc tgaacaacct cagggctgag gacaccgcca cctactactg cgccagaggt 660 gctagttatg atgcaatcga cgcatggggc cacgggaccg aagtcatcgt ctcctccact 720 agt 723 <210> 34 <211> 753 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CH-1 <400> 34 ctgactcagc cgtcctcggt gtcagcaaac ccaggagaaa ccgtcgagat cacctgctcc 60 gggggtagca acagctacta tggctggtac cagcagaagt ctcctggcag tgcccctgtc 120 actgtgatct atgacaacac caacagaccc tcgaacatcc cttcacgatt ctccggttcc 180 acatccggct ccacaagcac attaaccatc actggggtcc aagccgacga cgaggctgtc 240 tattactgtg ggagcacgga cagcagctat gttgatatat ttggggccgg gacaaccctg 300 accgtcctag gtcagtcctc tagatcttcc ggcggtggtg gcagctccgg tggtggcggt 360 tccgccgtga cgttggacga gtccgggggc ggcctccaga cgcccggagg agcgctcagc 420 ctcgtctgca aggcctccgg gttctccttc agcggcgtca acatgcactg ggtgcgccag 480 gctccaggca aggggttgga atacgtcgct caaattagca gcactggtag tggcacagga 540 tacgggtcgg cggtgcaggg ccgtgccacc atctcgaggg acaacgggca gagcacagtg 600 aggctgcagc tgaacaacct cagggctgag gacaccggca tctactactg tgccaaagat 660 gcttacggtt atcgtattag tggtagttgg agttatggtt acagtatcga cgcatggggc 720 cacgggaccg aagtcatcgt ctcctccact agt 753 <210> 35 <211> 750 <212> DNA 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Claims

하기의 1) 내지 4)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하며, CCSP-2(colon cancer secreted protein-2)의 EGF2 도메인에 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 또는 그의 항원결합 단편:
1) 서열번호 1로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 2로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 3으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 4로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 5로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 6으로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역;
2) 서열번호 7로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 8로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 9로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 10으로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 11로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 12로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역;
3) 서열번호 13으로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 14로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 15로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 16으로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 17로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 18로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역; 및
4) 서열번호 19로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 20으로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 21로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 22로 기재되는 CDR1 영역, 서열번호 23으로 기재되는 CDR2 영역 및 서열번호 24로 기재되는 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역.
제1항에 있어서,
상기 항원결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, dsFv, diabody, Fd 및 Fd'로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단일클론항체, 또는 그의 항원결합 단편.
제1항 또는 제2항의 단일클론항체, 또는 그의 항원결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제3항에 있어서,
서열번호 33 내지 서열번호 36 중에서 선택되는 어느 하나의 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
제5항의 발현 벡터가 도입된, 인간을 제외한 형질전환체.
제1항 또는 제2항의 단일클론항체, 또는 그의 항원결합 단편을 포함하는, 암 진단용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 암은 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 연부조직육종(soft tissue sarcoma), 림프종 및 다발성 골수종 혈액암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제7항의 조성물을 포함하는 암 진단용 키트.
제1항 또는 제2항의 단일클론항체, 또는 그의 항원결합 단편을 이용하여 암이 의심되는 개체의 분리된 생물학적 시료에서 CCSP-2(colon cancer secreted protein-2) 단백질을 항원-항체 반응을 통하여 검출하는 단계를 포함하는, 암의 진단을 위한 정보의 제공방법.