CN107106707B - 用于体外和体内检测革兰氏阴性细菌的分子探针 - Google Patents

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Abstract

提供了包含标签和结合部分的探针，其中结合部分适于结合革兰氏阴性细菌并且基本上不结合动物细胞或革兰氏阳性细菌。还提供了在靶区域中检测细菌的存在的方法，其通常允许检测细菌和确定该细菌是革兰氏阴性的还是革兰氏阳性的。

Description

用于体外和体内检测革兰氏阴性细菌的分子探针
发明领域
本发明涉及分子探针领域，更具体地涉及用于检测微生物诸如细菌和真菌的分子探针。
发明背景
在世界各地存在日益增加的感染负担，且准确诊断仍然是提供准确治疗的基础。
医院内和保健所的患者通常有感染的危险。医院获得性感染(HAI)变得更加普遍，且迅速准确地应对此类感染的能力越来越重要。严重患病的患者的免疫系统往往至少部分受损，使患者特别容易受到HAI的伤害。
重症监护的用呼吸机供氧的患者和所有免疫受损的患者特别容易受到HAI的伤害，最具破坏性的HAI之一仍然是呼吸机相关性肺炎(VAP)。众所周知地，VAP仍然难以准确诊断，并且已经显示不恰当的治疗对患者有害。因此，VAP具有高死亡率、高发病率并且仍然是医疗资源的负担。在诊断方面，发烧、增加的氧依赖性和心动过速的临床征象仍然是检测炎症或急性肺损伤的非特异性手段，而金标准仍然是肺活组织检查，其是侵入性的并且由于该测试的固有侵入性性质而是很少被使用的探查。其他方法诸如支气管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage)仍然存在争议，而非培养方法没有任何显著影响或稳健的验证。因此，需要允许准确且及时诊断VAP的可选择的方法，其将允许进行快速的医疗决定和以恰当的疗法改善患者结局。
目前，关于何时和是否开始抗微生物治疗、选择使用的剂以及如果开始了治疗，何时逐步降级治疗，临床医师面对极大的不确定性。这些问题是有效的抗生素管理的障碍，因为延迟和不足的抗生素治疗与不良临床结果之间存在已被证明的关联。
分子成像技术可以允许使用微生物特异性示踪剂，并且当与成像模态(modalities)诸如正电子发射断层扫描(PET)组合时，具有描绘无菌部位的感染性的能力。然而，此方法不适用于一些患者组，诸如需要现场护理诊断测试的重症监护组群体，并且施用放射性剂可能造成困难且是限制性的。这些还涉及辐射并且不容易适用于在医院环境以外成像。
本领域中可选择的方法是应用光学探针，以允许通过使用内镜来使患者的靶区域直接可视化。属于Visen Medical,Inc.的WO 2003/079015公开了用于鉴定和表征正常和关于改变的代谢活性的患病组织的光学成像探针。
属于本申请人的WO 2012/136958公开了当染料被特定细胞类型内化时，通过增加荧光来允许细胞在体内可视化的支化染料(branched dye)。
然而，仍存在对于确定炎症的起因的改善的方法的需求，该方法将允许在原位、现场护理确定患者的状况是否由感染引起，并且如果是，确定该感染是细菌感染或真菌感染。
因此，本发明的目的是提供适于快速和准确的现场护理诊断的改进的成像/检测方法。
发明描述
根据本发明的第一方面，提供了在靶区域中检测细菌和/或真菌的方法，所述方法包括步骤：
(1)提供适于标记细菌和/或真菌的第一探针；
(2)将所述第一探针递送到所述靶区域；
(3)用适当波长的光照射所述靶区域以激发所述第一探针；
(4)确定所述靶区域中的细菌和/或真菌是否已被所述第一探针标记；
如果确定所述靶区域中的细菌已经被所述第一探针标记，则所述方法还包括步骤：
(5)提供适于仅标记革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌的第二探针；
(6)将所述第二探针递送到所述靶区域；
(7)用适当波长的光照射所述靶区域以激发所述第二探针；
(8)确定所述第二探针是否已经标记了所述靶区域中的细菌；
其中，在所述靶区域中被所述第二探针标记的细菌被鉴定为革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。
如果细菌没有被第一探针标记，则靶区域内没有细菌，并且没有必要进行我们的步骤(5)至(8)。如果靶区域中的细菌被第一探针标记，则进行步骤(5)至(8)确定该细菌是革兰氏阴性的或革兰氏阳性的。
例如，如果第二探针适于标记革兰氏阴性细菌，则已经在步骤(4)中确定被第一探针标记并随后在步骤(8)中确定被第二探针标记的细菌是革兰氏阴性细菌。已经在步骤(4)中确定被第一探针标记并随后确定不被第二探针标记(步骤(8))的细菌是革兰氏阳性细菌。
因此，本发明的方法允许确定靶区域中细菌的存在，并且如果靶区域中存在细菌，确定该细菌是革兰氏阴性的或革兰氏阳性的。此外，该方法允许确定靶区域中真菌的存在。
在其中靶区域包括革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌的实施方案中，第一探针将标记靶区域中的所有细菌，并且第二探针将标记革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌，从而直接地(通过标记它们)或间接地(通过不标记它们)鉴定两种革兰氏细菌。
优选地，靶区域是患者内的组织的一部分，并且所述方法可以在体内进行。例如，靶区域可以是患者的肺的一部分，并且该方法可以使用支气管镜(bronchoscope)的工作通道进行，以将探针递送到靶区域、将光传送到靶区域以及检测来自靶区域的荧光。可选择地，可以使用单个仪器将探针递送到靶区域、将光传送到靶区域以及检测来自靶区域的荧光。
例如，可以使用光学发射显微镜(OEM)诸如纤维共聚焦荧光显微镜(FCFM)检测来自患者的组织的荧光。
靶区域可以在患者的皮肤上、关节中、循环系统中、上皮膜(linings)，诸如但不限于消化系统或生殖系统，或人中可通过术中程序接近的任何区域，并且探针可以通过内镜或例如通过直接喷雾来递送和/或观察。
可选择地，靶区域可以是细胞培养物的一部分、组织样品诸如活组织检查样品或液体样品诸如体液样品，并且该方法可以在体外进行。
优选地，在其中靶区域是患者的组织的一部分的实施方案中，患者是人类患者。然而，患者可以是非人动物，诸如例如马、羊、牛或啮齿动物。
在医疗保健的许多领域，诸如危重或重症监护中，有必要鉴定肺部炎症是否为，例如，无菌的、细菌性的或真菌性的，并且如果是细菌性的，该细菌是革兰氏阳性还是革兰氏阴性的，或两者的混合物。然而，通常不可能使用标准方法诸如PET扫描来检查不能安全地移动的患者，特别是用呼吸机供氧的患者的炎症。因此，临床医师通常没有足够的信息来自信地诊断炎症的原因并开出合适的矫正措施。例如，如果炎症是无菌的，给予患者的抗生素就不会有帮助，并且可能会有不良的副作用。再次，如果细菌是革兰氏阴性的而给予患者仅对革兰氏阳性细菌有效的抗生素或反之，则抗生素将不会清除细菌并且可能具有不利的和有害的副作用。
本发明的方法可以由临床医生在护理现场原位进行，并确定细菌和/或真菌是否存在于患者的靶区域内(诸如肺或肺的一部分内)，以及任何细菌是革兰阴性还是革兰氏阳性的。因此，本发明的方法有利地为临床医师提供了他们所需要的信息，以便自信地确定炎症的原因和确定最佳的行动步骤，诸如例如向患者给予适当的抗生素或抗真菌剂。
如果在靶区域中检测到细菌并向患者给予合适的抗生素，则可以进行该方法以确定抗生素的功效。例如，细菌数量的减少或靶区域中不存在细菌通常指示治疗过程有效地清除细菌感染。类似地，如果在靶区域中检测到真菌并向患者给予合适的抗真菌剂，则可以进行该方法以确定抗真菌剂的功效。
优选地，第一探针包含至少一个第一探针元件。第一探针可以包含至少两个第一探针元件。第一探针可以包含至少三个第一探针元件。
所述第一探针元件或每个第一探针元件可以包含第一标签和第一结合部分。
优选地，第二探针包含至少一个第二探针元件。第二探针可以包含至少两个第二探针元件。第二探针可以包含至少三个第二探针元件。
所述第二探针元件或每个第二探针元件可以包含第二标签和第二结合部分。
第一标签和/或第二标签可以是荧光团，并且第一探针和/或第二探针可以适于荧光标记细菌和/或真菌。
第一标签和/或第二标签可以是放射性标签。放射性标签可以包括放射性核苷酸。放射性标签可以包括18F、64Cu、68Ga、99Tc、111In、123I、124I、90Y、177Lu、11C、14C、3H、32P、33P、186Re、188Re或86Zr中的一种或更多种。
第一标签和/或第二标签可以是磁共振标签或核心。磁共振标签或核心可以是例如Fe、Mn或Gd。
第一探针和/或第二探针可以包含二级标签。例如，第一探针可以包含荧光团和放射性标签，或者第一探针可以包含荧光团和二级荧光团等。本领域技术人员将理解其它变化和组合。
优选地，第一探针包含第一荧光团且第二探针包含第二荧光团。第一荧光团和/或第二荧光团可以是任何合适的荧光团，诸如荧光素或其衍生物，诸如荧光素、基于花青的荧光团、基于罗丹明的荧光团或基于硼-二吡咯亚甲基(BODIPY)的荧光团。
第一荧光团和/或第二荧光团可以发射光谱的红、近红外或红外范围内的光。例如，第一荧光团和/或第二荧光团可以是Cy7或类似的荧光团。红外光可以穿过大多数组织以允许整个身体或身体的大部分被成像。此外，红外光的吸收可以引起可通过光声成像检测的热膨胀，从而允许间接地检测存在的感染剂。
优选地，第一荧光团和/或第二荧光团是环境敏感性荧光团，使得第一荧光团和/或第二荧光团的荧光的强度/量子收率取决于第一荧光团和/或第二荧光团的环境。例如，在游离水性环境中，第一荧光团和/或第二荧光团的量子收率或强度可能与该第一荧光团和/或第二荧光团在疏水环境(诸如在细胞膜)中时不同。优选地，第一荧光团和/或第二荧光团的量子收率或荧光强度在疏水性环境诸如在细胞膜内较高。因此，当第一荧光团和/或第二荧光团在细胞膜内时，诸如例如当第一探针元件和/或第二探针元件结合在细菌的细胞膜内时，由第一荧光团和/或第二荧光团发射的荧光的强度增加。因此，当第一荧光团和/或第二荧光团在本发明的方法中用于通过它们的细胞膜荧光标记细胞时，第一荧光团和/或第二荧光团可能特别有效。
例如，第一荧光团和/或第二荧光团可以是7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑(NBD)、孔雀绿、苯乙烯基染料、瀑布黄(Cascade Yellow)、prodan(也被称为1-丙酮,1-(6-(二甲基氨基)-2-萘基)、丹磺酰(也被称为5-(二甲基氨基)萘-1-磺酰基)、Dapoxyl、PyMPO(也被称为1-(3-(琥珀酰亚胺氧基羰基)苄基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)吡啶鎓、芘和二乙基氨基香豆素或其衍生物或变体。
优选地，第一荧光团和/或第二荧光团是NBD部分。发明人已经发现NBD是本发明的探针的特别合适的荧光团，当探针与细菌或至少一些真菌结合时提供强荧光，和低背景荧光，与测试的其他荧光团相比允许清晰且可靠地标记细菌和至少一些真菌。
多个探针元件中的一个或更多个探针元件的荧光团可以具有长荧光寿命，并且荧光团的长荧光寿命允许相对于背景自体荧光检测探针。例如，在使用期间，荧光团的荧光可能具有比靶区域的背景的自体荧光显著更长的寿命，使得来自荧光团的荧光容易地与背景的荧光区分开。
例如，荧光团是氮杂二氧杂三角烯(azadioxatriangulene，ADOTA)染料或二氮杂氧杂三角烯(diazaoxatriangulene，DAOTA)或其衍生物。
来自第一荧光团和/或第二荧光团的荧光可以通过由第一荧光团和/或第二荧光团发射的被引导到检测设备(诸如例如电荷耦合器件(CCD)或互补金属氧化物-半导体(CMOS)设备)的荧光被直接成像。来自第一荧光团和/或第二荧光团的荧光可以被间接地成像。例如，通过使用光声成像可以将荧光转换成声波。光声成像可以允许产生靶区域的高分辨率图像。在其中第一荧光团和/或第二荧光团发射近红外或红外波长范围的光(～700nm至1mm)的实施方案中，患者的整个身体或基本上整个身体可以被成像。可选择地，在其中第一荧光团和/或第二荧光团发射可见波长范围内的光(～390nm至700nm)的实施方案中，可以对患者的特定靶区域成像，并且通过例如光纤可以将光递送到靶区域或从靶区域接收光。
该方法可以包括使用光声超声观察靶区域以确定在靶区域中检测到的感染剂(细菌或真菌)的身份的步骤。该方法可以包括使用光声仪器观察靶区域以鉴定靶区域内的微生物的步骤，并且可以利用直接荧光检测使用第一探针和第二探针来确定那些微生物的身份。
该方法可以包括在白光或荧光下观察靶区域，以确定在靶区域中鉴定的任何感染剂(细菌或真菌)的形态的步骤。该方法可以包括在白光或荧光下观察靶区域以鉴定靶区域内的微生物的步骤，并且第一探针和第二探针可以被用于确定这些微生物的身份。
例如，另外设想，如果通过白光或荧光或自体荧光鉴定了细菌，则进行步骤(5)至(8)确定该细菌是革兰氏阴性或革兰氏阳性的。
第一结合部分可以选择性地结合至少一些细菌，并且不结合或者微弱地结合动物细胞诸如例如哺乳动物细胞。因此，第一结合部分可以是第一细菌结合部分。第一细菌结合部分可以基本上结合所有的细菌，但不结合或者微弱地结合动物细胞。
第二结合部分可以选择性地结合至少一些细菌，并且不结合或微弱地结合动物细胞诸如例如哺乳动物细胞。因此，第二结合部分可以是第二细菌结合部分。第二细菌结合部分可以选择性地基本上结合革兰氏阴性细菌，但不结合或微弱地结合革兰氏阳性细菌或动物细胞诸如哺乳动物细胞。第二细菌结合部分可以选择性地基本上结合革兰氏阳性细菌，但不结合或微弱地结合革兰氏阴性细菌或动物细胞诸如哺乳动物细胞。
第一结合部分和/或第二结合部分可以选择性地结合真菌，并且不结合动物细胞诸如例如哺乳动物细胞。因此，第一结合部分和/或第二结合部分可以是第一真菌结合部分和/或第二真菌结合部分并且可以结合真菌菌丝。
第一结合部分和/或第二结合部分可以选择性地结合至少一些细菌和至少一些真菌，并且不结合动物细胞诸如哺乳动物细胞。因此，第一探针和/或第二探针可以允许检测靶区域中的真菌和/或至少一些细菌。例如，结合部分可以适于结合烟曲霉(A.fumigatus)的真菌菌丝。
第一结合部分可以是ubiquicidin部分，诸如全长ubiquicidin(SEQ ID NO.1)或其片段或变体。优选地，ubiquicidin部分能够相对于哺乳动物细胞选择性地结合细菌。第一结合部分可以是包含ubiquicidin的至少10个连续氨基酸或ubiquicidin的至少12个连续氨基酸的ubiquicidin片段。例如，第一结合部分可以是氨基酸29至41的ubiquicidin片段(UBI29-41，SEQ ID NO.2)。第一结合部分可以是包含一个或更多个取代的ubiquicidin部分。该取代或每个取代可以是保守取代，并且对ubiquicidin部分的细菌结合性质几乎没有影响或优选地没有影响。该取代或每个取代可以向ubiquicidin部分提供抗降解或氧化的增加的稳定性。例如，结合部分可以是包含正亮氨酸氨基酸取代原始的甲硫氨酸氨基酸的UBI29-41(UBI29-41Nle，SEQ ID NO.3)。
ubiquicidin是存在于呼吸道上皮细胞、肠粘膜和巨噬细胞中的哺乳动物抗微生物肽。ubiquicidin特异性地结合原核生物如细菌的细胞膜，并且不结合哺乳动物细胞。
第二结合部分可以选择性地结合革兰氏阳性细菌并且可以基本上不结合革兰氏阴性细菌。优选地，第二结合部分选择性地结合革兰氏阴性细菌并且基本上不结合革兰氏阳性细菌。因此，在其中第二结合部分选择性结合革兰氏阴性细菌的实施方案中，第二探针可以随机分布在不包含革兰氏阴性细菌的靶区域中，并且定位于存在于靶区域的任何革兰氏阴性细菌的细胞膜，从而标记革兰氏阴性细菌。因此，第二探针可以适于选择性地指示靶区域中存在或不存在革兰氏阴性细菌。
例如，第二结合部分可以是多粘菌素部分，诸如全长多粘菌素(SEQ ID NO.4)或其片段或变体。多粘菌素选择性地结合革兰氏阴性细菌，并且因此，包含多粘菌素部分的细菌结合部分将选择性地仅将相应探针部分结合至革兰氏阴性细菌，从而允许检测靶区域中任何革兰氏阴性细菌。第二结合部分可以是包含多粘菌素的至少6个连续氨基酸或至少8个连续氨基酸的多粘菌素片段。第二结合部分可以是包含一个或更多个取代的多粘菌素部分。该取代或每个取代可以是保守取代，并且对多粘菌素部分的革兰氏阴性细菌结合性质几乎没有影响或优选地没有影响。该取代或每个取代可以向多粘菌素部分提供抗降解或氧化的增加的稳定性。
在其中第一荧光团和第二荧光团相同(例如，第一荧光团是NBD且第二荧光团是NBD)的实施方案中，该方法可以包括在使第二探针接触靶区域前洗涤靶区域或以其他方式从靶区域去除第一探针的步骤。因此，防止当确定靶区域中的细菌是革兰氏阴性或革兰氏阳性时第一探针对靶区域的污染，或至少使其最小化。
第一荧光团和第二荧光团可以不同。在其中第一荧光团和第二荧光团不同的实施方案中，优选地第一荧光团具有与第二荧光团的发射峰显著不同的发射峰。(即，第一荧光团的荧光与第二荧光团的荧光在不同的波长，并且因此可以选择性地检测来自第一荧光团的荧光和来自第二荧光团的荧光)。例如，第一荧光团可以是NBD而第二荧光团可以是TAMRA。
在其中第一荧光团不同于第二荧光团的实施方案中，将第二探针递送到靶区域的步骤可以与将第一探针递送到靶区域的步骤同时进行，并且靶区域可以用一个或更多个合适波长的光照射以激发第一荧光团和第二荧光团，使得可能同时确定细菌是否已经被第一探针标记和细菌是否已经被第二探针标记。因此，可能检测细菌和/或真菌并在单一程序中确定任何检测到的细菌是革兰氏阴性或革兰氏阳性的。
优选地，荧光团的荧光可直接或间接地在背景上检测，或者在靶区域的自体荧光上(当存在时)检测。靶区域内的固有细胞(indigenous cell)或组织的自体荧光可以具有比第一探针的荧光团更短的荧光寿命。与探针的荧光团相比，靶区域内的固有细胞或组织的自体荧光可以以更快的速度随时间降低。因此，在靶区域中观察到的随时间更慢地降低的荧光可以指示第一探针，且在靶区域中观察到的随时间更快地降低的荧光可以指示自体荧光。例如，荧光团可以是氮杂二氧杂三角烯(ADOTA)染料或二氮杂氧杂三角烯(DAOTA)或其衍生物。
在其中第一探针和/或第二探针包含至少两个探针元件的实施方案中，第一探针和/或第二探针可以包含核心并且所述至少两个探针元件中的每一个可以连接到核心。
术语“核心”意指连接多个探针元件以形成单个单元的共同部分。因此，核心可以是单个原子或包含官能团、饱和的或不饱和的烃链或聚乙二醇(直链的、支链的或环状的)、肽序列或聚合物。
通常，至少两个探针元件的每个探针元件包含荧光团和结合部分。例如，包含三个第一探针元件的第一探针包含三个第一荧光团和三个第一结合部分。
可以预期，包含至少两个荧光团的第一探针和/或第二探针的每个探针更亮，从而允许用更少的探针获得相同的信号。因此，可以预期，需要将较低剂量的第一探针和/或第二探针应用到靶区域以允许可靠地检测细菌。
然而，在至少一些实施方案中，至少两个荧光团可以自猝灭，诸如第一荧光团非辐射地耗散被第二荧光团作为热量吸收的能量。因此，包含至少两个荧光团的第一探针或第二探针可以是或不是荧光的，并且实际上可以由本领域技术人员预期由于自猝灭而具有较差的荧光。
令人惊讶的是，发明人已经发现，在包含多个荧光团的探针中自猝灭的至少一些荧光团在疏水环境中不能自猝灭。例如，包含多个NBD荧光团的第一探针在水性环境中显示出很少的荧光，但是当至少部分地嵌入细胞膜中时发出明亮的荧光。
本领域已知的光学探针通常在体内难以保留在靶区域中，其中挑战性的条件可以引起探针的降解或氧化和/或蛋白酶分解，并且结果是，探针不能保持与其靶的结合以允许靶的可靠的检测。例如，用于肺内(其中存在高表面活性剂浓度)成像的光学探针通常不允许检测其靶。肺内的另外的挑战包括通过在其中的循环液体“洗去”探针。
令人惊讶的是，发明人已经发现，与本领域已知的探针相比，包含多个探针元件的第一探针和/或第二个探针对氧化、降解和蛋白酶活性更稳定，并且此类探针允许使用本发明的方法在体内甚至在有挑战性的条件诸如在肺中发现的条件下可靠地检测细菌。
第一探针和/或第二探针可以包含通过可裂解的接头连接到至少一个第一探针元件和/或第二探针元件的猝灭剂。当至少一个第一探针元件和/或第二探针元件通过可裂解的接头连接到猝灭剂时，所述或每个第一荧光团和/或第二荧光团可以基本上被淬灭剂荧光淬灭；其中当可裂解的接头被裂解时，至少一个第一探针元件和/或第二探针元件与猝灭剂分离。
优选地，可裂解的接头包含酶可裂解肽序列，并且当裂解酶裂解该酶可裂解肽序列时，接头被裂解。
因此，酶可裂解肽序列的裂解通常对应于接头的裂解，从而猝灭剂从第一探针和/或第二探针的至少一个探针元件裂解。因此，除非另有说明，在其中可裂解接头包含酶可裂解肽序列的实施方案中，术语“接头的裂解”指酶可裂解肽序列的裂解。
本领域已知的光学探针通常是在任何时候都是荧光的(所谓的“始终开启(alwayson)”荧光团)，并且这些探针的位置是确定的，或是当探针的环境改变时，例如去除猝灭剂或从猝灭剂分离(例如对于基于荧光共振能量转移或FRET的探针)或被细胞内化，，它们改变其荧光。
然而，在其中第一探针和/或第二探针包含一个荧光团或包含不自猝灭的至少两个荧光团的实施方案中，包含猝灭剂和可裂解接头的第一探针和/或第二探针由于该可裂解接头是否已经被裂解剂(诸如裂解酶)裂解而有利地改变其荧光，并且在观察时第一探针和/或第二探针的位置可以指示细菌和/或真菌的存在。因此，与使用本领域已知的光学探针的方法相比，本发明的方法可以提供更具体和更详细的信息。
在其中第一探针包含猝灭剂和可裂解接头的实施方案中，本发明的方法可以(a)确定是否存在裂解剂，其由第一探针的荧光的增加或第一探针的荧光的颜色变化指示，(b)确定是否存在细菌和/或真菌，其由第一探针标记细菌和/或真菌指示，并且如果存在细菌，(c)根据细菌是否被第二探针标记确定该细菌是革兰氏阴性还是革兰氏阳性的。
裂解剂可以由靶区域内的固有细胞产生或表达。裂解剂可以由患者产生的、已经迁移到靶区域的另外的细胞诸如例如中性粒细胞产生或表达。裂解剂可以由靶区域内的感染性细胞诸如例如细菌或真菌产生或表达。
优选地，裂解剂是裂解酶。裂解酶是弹性蛋白酶并且酶可裂解肽序列的裂解指示弹性蛋白酶的存在。通常，弹性蛋白酶是中性粒细胞弹性蛋白酶并且该弹性蛋白酶由中性粒细胞产生或表达。通常，弹性蛋白酶是能够进行蛋白水解裂解的酶的活性形式。中性粒细胞通常靶向身体内正在经历炎性反应(病理生理的或正常功能的一部分)的部位。因此，患者体内的靶区域中存在中性粒细胞指示靶区域内的组织或组织的一部分发炎。优选地，在其中患者是人的实施方案中，裂解酶是人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)。因此，荧光或由接头裂解引起的第一荧光团和/或第二荧光团的荧光增加指示存在中性粒细胞弹性蛋白酶，从而指示靶区域中存在中性粒细胞，并因此指示靶区域内的组织的炎症。因此，本发明的方法适于确定靶区域内的组织是否发炎。
因此，有利地，本发明的方法是可以在体内或体外进行的确定(a)组织是否发炎，(b)是否存在细菌和/或真菌，以及(c)存在的任何细菌是革兰氏阳性或革兰氏阴性的方法。因此，该方法可以提供信息以允许医疗保健专业人员确定适当的治疗以清除炎症。
优选地，使得可裂解的接头的尺寸为使得猝灭剂足够接近所述或每个第一荧光团和/或第二荧光团以淬灭所述或每个第一荧光团和/或第二荧光团。通常，猝灭剂距离所述或每个第一荧光团和/或第二荧光团小于10nm。优选地，猝灭剂距离所述或每个第一荧光团和/或第二荧光团小于5nm。
通常，酶可裂解的肽接头是裂解酶的一个裂解位点的肽序列或是裂解酶的裂解位点的肽序列。优选地，裂解酶的所述或每个裂解位点包含多个氨基酸。在其中裂解酶是弹性蛋白酶的实施方案中，优选地，酶可裂解的肽序列包含氨基酸序列A-A-P-V(即丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-缬氨酸或Ala-Ala-Pro-Val)或E-E-I-Nle-R-R。酶可裂解的肽序列可以在序列AAPV的任一侧的位置x和/或y处包含一个或更多个另外的氨基酸，诸如例如xAAPVy、xAAPV或AAPVy。
可选择地，裂解酶可以是基质金属蛋白酶(MMP)，诸如MMP-9，并且酶可裂解的肽序列可以包含G-P-K-G-L-K-G。裂解酶可以是蛋白酶3并且酶可裂解的肽序列可以包含V-A-D-C-A-D-Y。裂解酶可以是组织蛋白酶G并且酶可裂解的肽序列可以包含A-A-P-F或F-V-T-Gnf-S-W(其中Gnf＝4-胍-L-苯丙氨酸)。裂解酶可以是胱天蛋白酶(caspase)并且酶可裂解的肽序列可以包含D-E-V-D。
在可选择的实施方案中，可裂解接头可以被微生物的存在或炎症过程诸如活化的中性粒细胞产生的活性氧诸如超氧化物(O2 -)或过氧化氢(H2O2)裂解。因此，活性氧可以是裂解剂。例如，接头可以是经修饰的硼酸基接头，诸如J.Am.Chem.Soc,2014,874,RogerY.Tsien中描述的。
在其中第一探针和/或第二探针包含猝灭剂的实施方案中，所述或每个第一探针元件和/或第二探针元件的所述或每个第一荧光团和/或第二荧光团可以是能够与合适的猝灭剂形成FRET对的任何荧光团。通常，成对选择荧光团和猝灭剂以确保它们具有用于将能量从荧光团转移到猝灭剂的适当的激发和发射光谱(即它们形成FRET对)。例如，典型的荧光团/猝灭剂对包括Cy3/Cy5、Cy3/QSY21、荧光素/四甲基罗丹明、荧光素/甲基红、青色荧光蛋白(CFP)/黄色荧光蛋白(YFP)等。FRET对的另外的实例可以由技术人员容易地鉴定。
猝灭剂可以是暗猝灭剂(dark quencher)。暗猝灭剂是能够接受来自被激发的荧光团的能量并例如通常以热或声能非辐射地耗散能量的部分。因此，当荧光团/猝灭剂对充分靠近在一起并用在荧光团的激发光谱内的波长的光辐照时，淬灭剂以非辐射方式耗散荧光团从光吸收的能量并且观察不到荧光。以这种方式，暗猝灭剂抑制荧光团的荧光。
在其中猝灭剂是暗猝灭剂的实施方案中，淬灭剂可以是例如甲基红、二甲氨基偶氮苯磺酸(DABSYL)、Iowa黑FQ或Iowa黑RQ(Integrated DNA Technologies,Inc.Iowa,USA)、BHQ1、BHQ2或BHQ3。
猝灭剂可以是荧光猝灭剂。荧光猝灭剂是能够接受来自被激发的荧光团的能量并辐射该能量的部分。因此，荧光猝灭剂通常是荧光团并且发射不同于它们从其接受能量的荧光团发射的波长的光。以这种方式，荧光的颜色变化指示猝灭剂与荧光团相对接近。
在其中淬灭剂是荧光猝灭剂的实施方案中，猝灭剂可以是罗丹明或其衍生物，诸如羧基四甲基罗丹明(TAMRA)，例如荧光素或其衍生物、花青荧光团或BODIPY荧光团。
在其中猝灭剂是荧光猝灭剂的实施方案中，猝灭剂可以适于标记中性粒细胞。因此，在其中裂解酶由中性粒细胞产生的实施方案中，本发明的方法可以适于确定裂解酶如弹性蛋白酶的存在，以确定中性粒细胞的存在、以标记可能存在的任何细菌和/或真菌并确定该细菌是革兰氏阳性或革兰氏阴性的。
例如，在其中裂解酶是HNE的实施方案中，荧光猝灭剂可以被例如由细菌的存在或诸如钙离子载体的刺激物活化的中性粒细胞通过胞吞摄取。因此，荧光猝灭剂可以选择性地标记靶区域内的中性粒细胞。发明人已经观察到，荧光猝灭剂诸如TAMRA被中性粒细胞选择性地摄取，并且不被或以更低的程度被细菌和其它炎性细胞诸如单核细胞摄取。不希望囿于理论，发明人推测在荧光猝灭剂的摄取中观察到的差异可能是由于高吞噬细胞诸如中性粒细胞的较高的胞吞和胞饮活性。
在其中所述或每个第一探针元件和/或第二探针元件的所述或每个第一荧光团和/或第二荧光团是NBD的实施方案中，猝灭剂优选为能够接受来自NBD的能量以与NBD形成FRET对的部分。优选地，猝灭剂是甲基红或四甲基罗丹明或其衍生物。例如，猝灭剂可以是羧基四甲基罗丹明(TAMRA)。其他合适的荧光团/猝灭剂对可以由本领域技术人员确定。
优选地，在其中该方法是确定靶区域中的组织是否发炎以及组织的炎症是无菌的或感染性的方法的实施方案中，第一探针包含猝灭剂和可裂解的接头。因此，在第二探针被递送到靶区域之前，该方法可以检测炎症以及该炎症是否是感染性的/由靶区域中存在的细菌和/或真菌引起的。
在其中第一探针和/或第二探针包含猝灭剂和可裂解接头的实施方案中，第一探针和/或第二探针的结合部分可以在探针元件距接头的远端。可选择地，细菌结合部分可以在探针元件的近端，靠近接头。荧光团可以通过结合部分连接到接头。荧光团可以直接连接到接头。
结合部分可以在可裂解的接头裂解之前结合细菌和/或真菌。可选择地，结合部分可以在可裂解的接头裂解之后结合细菌和/或真菌。
在其中第一探针和/或第二探针包含至少两个探针元件、核心、猝灭剂和可裂解接头的实施方案中，核心将每个探针元件连接到接头。因此，当可裂解接头被裂解时(例如接头的酶可裂解的肽序列被裂解酶裂解)，探针被分成猝灭剂和至少两个探针元件以及核心，并且该至少两个探针元件保持连接到核心。
通常，提供包含至少两个探针元件的第一探针和/或第二探针对应于包含至少两个荧光团和至少两个结合部分的探针。
根据本发明的第二方面，提供了用于在本发明的第一方面的方法中使用的探针，所述探针包含标签和结合部分。
标签可以是荧光团，并且探针可以适于荧光标记细菌和/或真菌。
标签可以是放射性标签。放射性标签可以包含放射性核苷酸。放射性标签可以包含18F、64Cu、68Ga、99Tc、111In、123I、124I、90Y、177Lu、11C、14C、3H、32P、33P、186Re、188Re或86Zr中的一种或更多种。
标签可以是共振标签或核心。磁共振标签或核心可以是例如Fe、Mn或Gd。
探针可以包含二级标签。例如，探针可以包含荧光团和放射性标签，或者探针可以包含荧光团和二级荧光团等。本领域技术人员将理解其它变化和组合。
优选地，荧光团是环境敏感性荧光团。优选地，荧光团是NBD。
优选地，结合部分是ubiquicidin部分，诸如全长ubiquicidin(SEQ ID NO.1)或其片段或变体。优选地，ubiquicidin部分是包含全长ubiquicidin的氨基酸29至41的ubiquicidin片段(UBI29-41，SEQ ID NO.2)。优选地，ubiquicidin部分包含氨基酸取代。优选地，ubiquicidin部分包含ubiquicidin部分的甲硫氨酸残基取代为正亮氨酸的氨基酸取代(UBINle，SEQ ID NO.3)。
荧光团可以直接连接到结合部分。可选择地，荧光团可以通过间隔物连接到结合部分。间隔物可以是烃链、醚、聚合物、聚乙二醇(PEG)、聚二醇(poly glycol)或类似物。间隔物可以是肽。在其中间隔物是肽的实施方案中，肽可以为1-10个氨基酸的长度、1-20个氨基酸的长度或1-30个氨基酸的长度。
优选地，探针包含核心和连接到核心的多个结合部分。优选地，探针包含至少三个结合部分。
例如，在优选的实施方案中，探针包含核心、三个荧光团和三个结合部分，并且三个结合部分的每一个包含UBINle且三个荧光团的每一个都是NBD。
根据本发明的第三方面，提供了用于在本发明第一方面的方法中使用的探针，其包含标签和适于结合革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌并且基本上不分别与动物细胞或革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌结合的结合部分。
标签可以是荧光团，并且探针可以适于荧光标记细菌和/或真菌。
标签可以是放射性标签。放射性标签可以包含放射性核苷酸。放射性标签可以包含18F、64Cu、68Ga、99Tc、111In、123I、124I、90Y、177Lu、11C、14C、3H、32P、33P、186Re、188Re或86Zr中的一种或更多种。
标签可以是磁共振标签或核心。磁共振标签或核心可以是例如Fe、Mn或Gd。
探针可以包含二级标签。例如，探针可以包含荧光团和放射性标签，或者探针可以包含荧光团和二级荧光团等。本领域技术人员将理解其它变化和组合。
优选地，荧光团是环境敏感性荧光团。优选地，荧光团是NBD。
优选地，结合部分适于结合革兰氏阴性细菌，并且基本上不结合动物细胞或革兰氏阳性细菌。
优选地，结合部分是多粘菌素部分，诸如全长多粘菌素(SEQ ID NO.4)或其片段或变体。多粘菌素部分通常是截短的多粘菌素，其中多粘菌素的至少一部分烃尾已经被除去。例如，多粘菌素部分可以衍生自多粘菌素B1并且可以除去6-甲基辛酸基团，或者多粘菌素可以衍生自多粘菌素B2并且可以除去6-甲基庚酸。
荧光团可以直接连接到结合部分。可选择地，荧光团可以通过接头连接到结合部分。接头可以是饱和或不饱和的烃链、醚、聚合物、聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇(polyglycol)、聚醚或类似物。接头可以是肽。在其中接头是肽的实施方案中，肽可以是1-10个氨基酸的长度、1-20个氨基酸的长度或1-30个氨基酸的长度。
在优选的实施方案中，探针包含多粘菌素部分和NBD。
优选地，第二方面的探针适合用作第一方面的方法的第一探针，并且第三方面的探针适合用作第一方面的方法的第二探针。
因此，在第四方面本发明延伸到本发明的第二方面的探针和第三方面的探针在本发明的第一方面的方法中的用途。
在优选的实施方案中，第二方面的探针包含核心和三个结合部分和三个NBD荧光团，并且三个结合部分的每一个包含UBINle，并且第三方面的探针包含多粘菌素部分和NBD。
本发明第一方面的优选的和任选的特征是第二、第三和第四方面的探针的优选的和任选的特征。
现在将通过非限制性实例的方式，参考附图来描述本发明的实施方案。
附图简述
图1：示出了本发明的示例性方法的流程图
图2A：弹性蛋白酶依赖性细菌标记方案。细菌结合组分上的荧光团由暗淬灭剂淬灭，意味着在结合细菌时观察不到荧光。弹性蛋白酶特异性序列AAPV的裂解从暗猝灭剂甲基红(MR)释放细菌结合组分(PV-NBD-UBI)。
图2B：体外的弹性蛋白依赖性细菌标记。用FM-464(红色)复染并与分离的人中性粒细胞共孵育的甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)(MSSA)证明了在中性粒细胞的存在下的细菌标记(绿色)，其在弹性蛋白酶抑制剂的存在下被抑制。
图3A：弹性蛋白酶依赖性细菌标记方案。细菌结合组分上的荧光团被较长波长的不同荧光团猝灭，意味着在结合细菌时观察不到荧光。弹性蛋白酶特异性序列AAPV的裂解从猝灭剂(TAMRA)释放细菌结合组分(PV-NBD-UBI)。TAMRA通过胞吞摄取报告活化的中性粒细胞的存在。
图3B：体外的弹性蛋白依赖性细菌标记。将用PKH 660(紫色)复染的铜绿假单胞菌(Pseudomona auerginosa,PA)与TAMRA-AAPV-NBD-PMX孵育，并证明在未被激活的中性粒细胞的存在下无标记(上图)、以弹性蛋白酶依赖的方式标记细菌(以绿色示出)和以不依赖弹性蛋白酶的方式的标记活化的中性粒细胞(以红色示出)。
图3C：裂解后TAMRA的弹性蛋白酶依赖性荧光增加。分光光度计数据证明了出乎意料的观察结果：与TAMRA-AAPV-NBD-PMX相比，TAMRA-AA(裂解的化合物)的荧光以弹性蛋白酶依赖性方式增加，并被弹性蛋白酶抑制剂(ex 525，Em 580)抑制。
图4：荧光团选择影响以NBD构建体对荧光素(FAM)的改善的信噪比对标记的细菌成像的能力。A)用FM-464(以红色示出)复染并与FAM-UBI或NBD-UBI孵育的细菌(MSSA)证明了NBD的改善的信噪比，其允许检测大部分细菌(以绿色示出)。将其与检测聚集细菌的一个小子集的FAM-UBI进行比较。B)NBD-UBI还显示出相对于哺乳动物细胞(白色箭头)对细菌(铜绿假单胞菌)的特异性。
图5：FAM-PMX不允许在体外检测细菌的足够的信噪比。A)用FM-464(红色)复染并与A549细胞(紫色的人肺上皮细胞)一起孵育的铜绿假单胞菌(PA)证明了没有在背景上观察到细菌标记，并且也不存在上皮细胞标记。B)NBD-PMX(绿色)与核复染剂Syto 82(红色)允许细菌标记，并保持对哺乳动物细胞(紫色)的标记的选择性。
图6：探针的发射光谱证实了在疏水环境中荧光增加。A)当在488nm波长下激发时，在PBS或DMSO(疏水环境)的存在下，NBD-UBI树突(5μM)和NBD-UBINle(15μM)显示的发射光谱。B)当在488nm波长下激发时，在PBS或DMSO(疏水环境)的存在下，NBD-PMX(10μM)显示的发射光谱。在与细菌膜靶结合时存在的疏水条件下，两种探针的荧光显著增加。
图7：NBD-UBI树突在体外相对于哺乳动物细胞选择性标记细菌：A)通过激光扫描共聚焦显微镜成像的用产生荧光的细胞DNA染料Syto-82(红色)复染的具有NBD-UBI树突(5μM；绿色)的临床相关细菌组的示例图像。B)标记NBD-UBI树突5μM(最佳浓度)的细菌组的定量，其中与MSSA和NBD-UBINle 10μM(最佳浓度)相比，组中的每种细菌更亮。C)未染色的细菌(红色)、NBD-UBINle 15μM(蓝色)和NBD-UBI树突5μM标记的细菌(橙色)的流式细胞数据。D)用Syto-82复染的MSSA和NBD-UBI树突(5μM；绿色)和示出了人中性粒细胞(红色箭头)的融合，和E)A549细胞(红色箭头)证明了哺乳动物细胞未被标记。示出的代表性图像，对于所有实验n≥3。
图8：NBD-PMX在体外选择性标记革兰氏阴性细菌。通过激光扫描共焦显微术成像的具有NBD-PMX的细菌组的示例图像。A)具有NBD-PMX 1μM(绿色)并用syto-82(红色)复染的细菌组。与革兰氏阴性细菌相比，革兰氏阳性细菌(由红色方框框出)示出了最少/无标记。B)用NBD-PMX 1μM定量细菌组，白色条的是革兰氏阳性细菌，黑色条的是革兰氏阴性细菌，示出了与革兰氏阳性细菌相比对革兰氏阴性细菌的高强度选择性标记。所有革兰氏阴性细菌显示出相对于所有革兰氏阳性细菌的统计学上显著的增加。C)用NBD-PMX标记的细菌的流式细胞术评估显示了未染色的细菌(红色)和NBD-PMX(蓝色)标记的细菌。没有明显的革兰氏阳性细菌标记(由红色方框框出)。D)用Syto-82复染的MSSA和NBD-PMX1μM(绿色)和示出了人中性粒细胞(红色箭头)的融合，和E)A549细胞(红色箭头)证明了哺乳动物细胞未被标记(从图4复制)。示出的代表性图像，对于所有实验n≥3。
图9：细菌感染的离体模型。A)收获羊肺、用呼吸机供氧并将其置于环境温度为37℃的新生儿培养箱中。经支气管镜向肺段注入PBS(对照)或细菌。然后注入探针并使用488nm激光扫描单元(LSU)用纤维共聚焦荧光显微镜(FCFM)使段成像。B)离体羊模型展示了注入后5小时的活细菌。将细菌(MSSA)注入羊肺段并在1、3和5小时灌洗(n＝3)、铺平板用于CFU/ml并在孵育16小时后计数。
图10：在远端肺的细菌的代表性FCFM图像展示了独特的点状图案。A)当使用FCFM对段成像时，注入PKH标记的金黄色葡萄球菌(S.aureus)、钙黄绿素标记的金黄色葡萄球菌或表达GFP的金黄色葡萄球菌菌株，产生荧光的点状图案。图像被用于产生阳性对照，用于随后的原位标记实验。示出的代表性图像，对于所有实验n＝3。B)PKH染料不染色旁观者细胞(by-stander cells)。共聚焦图像显示与用Syto-82(红色)以及PKH660(紫色)复染的细菌(金黄色葡萄球菌)共培养的上皮细胞。旁观者哺乳动物细胞(红色箭头)被从标记的细菌泄露的Syto-82标记，但不存在PKH660的转移。
图11：NBD-UBI无法在羊肺中标记细菌。通过复染细菌和在光谱不同的成像系统上成像证实在羊肺中不存在细菌的持续标记。A)在注入后1小时含PKH660标记的MSSA的肺段。B)在660nm处成像的对照段(用PBS注入且无细菌)。C)在10μM NBD-UBI注入后，在488nm成像相同段。然而，用复染的PHK660标记的克氏肺炎杆菌(K.pneumonia)(革兰氏阴性)的相同实验在图D中以紫色显示，添加NBD-PMX证明了相同点状信号。
图12：NBD-UBI树突在远端羊肺中原位检测细菌。NBD-UBI树突的代表性FCFM图像示出了在对照区段中观察不到点状信号，而在注入细菌的段的背景荧光上观察到上述图10中描述的独特的点状信号。此外，单独的琼脂糖珠不显示荧光(对照珠)，但是当珠被细菌包被时，在羊肺中原位标记时观察到信号。示出的代表性图像，对于所有实验n≥3。
图13：NBD-PMX在羊肺中原位地选择性标记革兰氏阴性细菌。A)对照段和革兰氏阳性段不显示点状信号，而注入革兰氏阴性的段显示与阳性对照相同的信号。B)来自段的灌洗计数证明了段之间的计数无显著差异，确认了细菌的存在。C)单独的琼脂糖珠不显示荧光，但当珠被细菌包被时，当在羊肺中原位标记时观察到信号。示出的代表性图像，对于所有实验n≥3。
图14：NBD-UBI树突和NBD-PMX抗“洗脱”，允许检测羊肺中的细菌。当灌注到羊肺中时，用NBF-UBI树突或NBD-PMX预先标记的细菌通过FCFM容易地被可视化。然而，当注入用线性NBD-UBINle预先标记的细菌时，没有观察到点状信号。通过在注入肺前使细菌悬液成像(左图)并通过FCFM成像(右图)确认标记。注意对于悬液中的NBD-UBINle标记的细菌，SNR较低。示出的代表性图像，对于每个实验n＝3。
图15：NBD-UBI树突在进行洗涤时保持荧光。A)通过激光扫描共焦显微术在NBD-UBI树突(黑色)的持续存在下和PBS洗涤之后(白色)对细菌组进行成像。定量证明了在持续存在探针(红线)时，高于具有MSSA的线性NBD-UBI的荧光保留。n≥3，每个实验评估三个随机视野。B)在持续存在探针(黑色)或PBS洗涤之后(白色)的情况下用NBD-PMX成像的细菌组证明了在持续存在探针的情况下，所有革兰氏阴性细菌的荧光保留高于具有革兰氏阳性的NBD-PMX。n≥3，每个实验评估三个随机视野。
图16：NBD-UBI树突在ALI BALF中稳定。质谱MALDI-TOF分析证明了共孵育30分钟时，NBD-UBINle在生理盐水存在下的稳定性(箭头表示在1949的质量处观察到正确的峰)，但在ALI灌洗液的存在下降解(在1949的质量处未观察到峰，但箭头显示可预测的降解化合物)。相比之下，通过FTMS评估，NBD-UBI树突保持稳定(显示的数据表示理论图和试验图，它们展示了峰是对应的，峰的对应表明化合物的存在)。NBD-PMX在ALI BALF中稳定。MALDI-TOF分析证明了当共孵育30分钟时，NBD-PMX在生理盐水或ALI灌洗液的存在下的稳定性(箭头表示在1291-1293的质量处观察到的正确峰)。
图17：在羊灌洗液中，NBD-UBI树突比等摩尔量的线性等价物在细菌上保留更高的荧光。A)在存在或不存在含NBD-UBINle(15μM)和NBD-UBI树突(5μM)的羊灌洗液下通过激光扫描共聚焦显微术成像的MSSA。两种NBD-UBI化合物在羊灌洗液中具有降低的荧光，但是NBD-UBI树突保留更高的荧光强度。B)相比之下，在存在或不存在含NBD-PMX(1μM)的羊灌洗液时成像的PA3284不显示荧光强度的显著降低。示出的代表性图像，n＝3。
图18：NBD-UBI树突和NBD-PMX成功地在富含表面活性剂的环境中使细菌成像。从共聚焦显微术图像定量的细菌荧光强度:表面活性剂荧光强度的比。对于等摩尔NBD浓度，NBD-UBI树突和NBD-PMX具有比NBD-UBInle显著更高的细菌:表面活性剂强度。
图19：图像处理算法描绘来自FCFM数据的“阳性”和“阴性”帧。A)被认为是阳性或阴性的帧的原始数据。B)无预处理，点检无效。估计背景噪声C)、高通滤波D)和适当的阈值分割(thresholding)E)后，当前算法检测阴性帧F)中的最小点状信号。
图20：整个FCFM视频(最高达3500帧)的自动图像处理证明了细菌的检测。用80点/帧的阈值分割和10％的任意截止值分析NBD-UBI树突视频使得能够使用高斯拉普拉斯(TheLaplacian of Gaussian)(LoG)和高斯差分(Difference of Gaussians)(DoG)阳性帧的组合客观检测细菌。用80点/帧的阈值处理和10％的任意截止值分析NBD-PMX视频使得能够使用LoG和DoG阳性帧的组合来客观检测革兰氏状态。对于所有分析n＝4，除了肺炎链球菌(S.pneumoniae)，其中n＝3。与对照组比较的统计学分析。
图21：在人肺组织自体荧光的存在下检测细菌。A)用PA3284的人肺组织的FCFM图像显示弹性蛋白自体荧光并且没有细菌信号(左)，且用PA3284的人肺组织与NBD-PMX共孵育(右)显示细菌信号。B)实时共聚焦显微术图像(融合)显示无NBD-PMX标记的核酸复染(红色)的融合图像。可以清楚地看到右图的细菌，其被用NBD-PMX标记并且在背景荧光以上。C)NBD的荧光寿命显著长于肺的固有细胞的自体荧光寿命，由在488nm激光激发和时间分辨单光子计数光谱仪测量，并且这可以被用于在体内鉴定探针和提高测定和成像的信噪比。
图22：NBD-UBI树突或NBD-PMX达到100μM时未观察到溶血现象。溶血测定(n＝3)证明了在最高达100μM的浓度时不溶血。阳性对照为0.2％Triton-X且校正值表示对于Triton-X100％溶血。
图23：A)NBD-PMX在小鼠的2周单次注入模型中不显示器官毒性。在48小时和14天与PBS对照动物相比的NBD-PMX的代表性的组织学图像(x100)。在任何组中没有观察到与对照组的差异(由顾问组织病理学家盲法评分)。
B)NBD-UBI树突在小鼠的2周单次注入模型中不显示器官毒性。在48小时和14天，与PBS对照动物相比的NBD-UBI树突的代表性的组织学图像(x100)。在任何组中没有观察到与对照组的差异(由顾问组织病理学家盲法评分)。
图24：荧光寿命成像容易地区分肺组织与细菌。左图示出了488nm激发的肺和肺组织中的细菌(点)的共聚焦。FLIM(右图)示出了肺组织(绿色)和细菌(蓝色)成像的明显差异。使用NBD-UBI树突和金黄色葡萄球菌在人肺组织上进行成像。
发明的实施方案的详细描述
尽管在下文详细讨论了制作和使用本发明的各种实施方案，但是应当理解，本发明提供了可以在各种具体背景中实现的许多可应用的发明构思。本文讨论的具体实施方案仅仅是制造和使用本发明的具体方式的说明，而不限制本发明的范围。
为了便于理解本发明，以下定义了许多术语。本文定义的术语具有本发明的相关领域的普通技术人员通常理解的含义。诸如“一(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”的术语并不旨在仅指单个实体，而是包括可以被用于说明的特定实例的一般类别。本文中的术语被用于描述本发明的具体实施方案，但是除了权利要求中所概述的以外，其用法不限定本发明的范围。
在本发明的示例性实施方案的以下描述中，包含多粘菌素部分的结合部分被给予代码“PMX”，且包含ubiquicidin部分的结合部分被给予代码“UBI”。例如，包括包含NBD和经修饰的ubiquicidin片段UBINle(“树突探针”)的多个探针元件的本发明的实施方案被称为NBD-UBI树突。
第一实例方法
现在将在本发明的一个实例中描述一种详细的方法。这是本发明的示例性实施方案并且不限制本发明的范围。
使用支气管镜递送500μL第一探针(包含10μg探针)的微剂量到患者肺内的靶区域。第一探针包含三个ubiquicidin片段(UBINle，充当结合部分)和三个NBD荧光团，并因此适于特异性结合细菌和/或真菌，而不是患者的肺内的天然细胞。
经支气管镜内的光纤传送适当波长的光(例如，在NBD的激发最大值488nm附近)到靶区域。通过支气管镜内的第二光纤收集来自靶区域的光，并将其通过共聚焦光学布置或宽场布置入射到电荷耦合器件(CCD)。分析由CCD产生的靶区域的图像，以确定细菌和/或真菌是否已被第一探针标记。
如果细菌和/或真菌清楚可见(即由第一探针标记)，则确定细菌和/或真菌存在于靶区域中，并因此临床医师可以确定应向患者给予抗生素和/或抗真菌剂。
如果细菌清楚可见，为了确定所需的抗生素的类型，需要进一步的研究。
将大量生理盐水缓冲液递送到靶区域以洗去第一探针。一旦靶区域的荧光水平达到背景水平，递送500μL第二探针(包含10μg探针)的微剂量到靶区域。第二探针包含多粘菌素部分(PMX)(充当结合部分)和NBD荧光团，并且因此适于特异性地选择性结合革兰氏阴性细菌而不是革兰氏阳性细菌或患者的肺内的天然细胞。
再次，经支气管镜内的光纤传送适当波长的光(例如，在NBD的激发最大值488nm附近)到靶区域。通过支气管镜内的第二光纤收集来自靶区域的光，并将其通过共聚焦光学布置或宽场布置入射到电荷耦合器件(CCD)。分析由CCD产生的靶区域的图像，以确定细菌是否已被第二探针标记。本领域技术人员将理解，可以使用任何合适的检测器诸如例如CMOS检测器，并且该方法不限于使用CCD检测器。
如果细菌清楚可见(即由第二探针标记)，则确定细菌是革兰氏阴性细菌，并且因此临床医师可以确定应该施用抗革兰氏阴性细菌的抗生素。如果没有细菌清楚可见，则确定细菌是革兰氏阳性的，并因此临床医师可以确定应该施用抗革兰氏阳性细菌的抗生素。
因此，临床医师可以自信地确定患者肺部的任何炎症的原因，其是无菌炎症、由单一感染剂引起还是感染剂的混合物引起。因此，临床医师可以决定采取的适当的行动方案，而不需要明显移动患者，或者除去患者可能正在使用的任何呼吸机，因为支气管镜可以通过呼吸机进入患者的肺部。
第二实例方法
在可选择的方法中，将500μL第一探针(包含20μg探针)的微剂量递送到患者肺内的靶区域并根据第一实例方法照射，所述第一探针包含TAMRA部分(充当荧光猝灭剂)、包含肽序列AAPV的接头、NBD荧光团和ubiquicidin部分(UBINle，充当结合部分)。
仅TAMRA的荧光指示靶区域中不存在HNE，并因此靶区域内的组织不发炎。TAMRA的荧光和未被NBD标记细菌和/或真菌的NBD荧光指示存在HNE(接头已经被HNE裂解以允许NBD发出荧光)。由TAMRA对人中性粒细胞的荧光标记指示靶区域内存在人中性粒细胞，且NBD对细菌和/或真菌的荧光标记指示靶区域内的细菌和/或真菌。
因此，该方法允许检测炎症，包括无菌炎症、细菌炎症和真菌炎症。
如果检测到细菌，则可以使用第一实例方法的第二探针来确定该细菌是革兰氏阴性还是革兰氏阳性的，从而允许确定是否存在炎症、炎症是否由细菌和/或真菌引起以及如果炎症由细菌引起，那么该细菌是革兰氏阴性还是革兰氏阳性的。
第三实例方法
在第三个实例中，可以同时递送根据第一或第二实例方法的第一探针的微剂量和包含多粘菌素部分和孔雀绿荧光团的第二探针的微剂量。可选择地，第二探针可以包含诸如例如cy3或cy5的花青染料。
因此，第一探针、第二探针的荧光以及如果使用第二实例方法的第一探针，则可以同时分析荧光猝灭剂(TAMRA)以及细菌和/或真菌的存在，如果检测细菌，可以同时测定细菌是革兰氏阴性还是革兰氏阳性的。
在本发明的方法中使用的适当探针的表征
实施例1
弹性蛋白酶敏感性探针的第一个实例(在图2A中示意性示出)包含通过肽序列AAPV(充当接头)连接到7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑(NBD)的甲基红(作为暗猝灭剂)和ubiquicidin片段UBI29-41(一起充当探针元件)。因此，NBD荧光被甲基红猝灭并且不会观察到荧光信号(即甲基红和NBD充当FRET对)，并因此无论探针是否与可能存在于靶区域的任何细菌通过UBI29-41结合，使用共焦显微术观察不到信号。
当探针处于人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)存在下时，诸如在发炎的组织中，HNE裂解接头的肽序列从而将探针元件从甲基红猝灭剂释放出来。因此，NBD荧光团不再被猝灭并产生荧光信号。此外，由于NBD的环境敏感性，如果NBD处于疏水环境(诸如在细胞膜内)，则产生的信号被大大放大。
图2B示出了包含探针并且已经与细菌和中性粒细胞的共培养物一起孵育的样品的共聚焦图像。这些图像证实了探针被中性粒细胞衍生的HNE裂解并标记细菌的能力。当弹性蛋白酶抑制剂西维来司(sivelestat)被添加到培养基中时，没有观察到标记，因为探针保持未裂解(并因此NBD被甲基红淬灭)。
实施例2
在第二个实例中，探针包含通过肽序列AAPV(充当接头)与NBD和多粘菌素(充当探针元件)连接的羧基四甲基罗丹明(TAMRA，充当荧光猝灭剂)。因此，NBD荧光被TAMRA猝灭以产生来自TAMRA的荧光信号(即TAMRA接受由NBD吸收的能量且本身是荧光的，TAMRA和NBD充当FRET对)。因此，无论多粘菌素是否与可能存在的任何细菌结合，仅观察到来自TAMRA的信号。
一旦探针被弹性蛋白酶裂解，由于NBD的荧光(图3A)细菌被探针元件标记，而中性粒细胞一被激活就被TAMRA部分标记(图3B)。此外，我们证明了裂解的TAMRA化合物的荧光以弹性蛋白酶依赖的方式增加，并被弹性蛋白酶抑制剂如西维来司抑制(“S”，图3C)。
为了报告细菌，我们合成了仅包含细菌探针元件并用正亮氨酸取代甲硫氨酸的探针“NBD-UBINle”。将该探针与具有另一种“始终开启”的荧光团，荧光素(FAM)的相同的细菌检测部分进行比较，并在报告的NBD的实时台式共聚焦显微镜上显示改善的信噪比(图4)。此外，证实了标记通常对细菌而非细胞膜是特异性的。例如，图4示出的分离的人中性粒细胞未被NBD-UBINle探针标记，而细菌被NBD-UBINle探针标记。
为了证实对于PMX细菌检测部分将观察到相同结果，我们构建了NBD-PMX和FAM-PMX，证明了用NBD-PMX相对于FAM-PMX的改进的信噪比并确认此构建体还对哺乳动物细胞具有特异性(图5)。
“分支/树突”或“多价”探针
在本发明的另外的实例中，制备了包含核心和连接到核心的三个探针元件(“三分支”探针)的探针(NBD-UBI树突)，每个探针元件包含NBD-UBINle部分。
为了确认荧光报告子NBD在与我们的肽部分偶联时保持其特性，我们测量了在模拟疏水环境的条件下(DMSO)化合物的荧光。在488nm激发线性NBD-UBINle、NBD-UBI树突和NBD-PMX(Biotek荧光板读数器)，并且当与磷酸盐缓冲盐水(PBS)(图6)比较时，当探针处于二甲基亚砜(DMSO)(疏水环境)存在下时荧光的显著增加证实了环境敏感性荧光报告。令人惊讶的是，尽管每个探针存在三个NBD拷贝，当使用等摩尔浓度的NBD时，NBD-UBI树突显示出与线性相同的荧光增加。
用NBD-UBI树突标记代表＞70％的引起VAP的病原体的一组细菌(Chastre J等人.AmJ Respir Crit Care Med.2002Apr 1；165(7):867-903)(革兰氏阴性的：铜绿假单胞菌(两个菌株)、鲍曼不动杆菌(A.baumannii)、嗜麦糖寡养食单胞菌(S.maltophilia)、克氏肺炎杆菌、大肠杆菌和流感嗜血杆菌(H.invluenzae)。革兰氏阳性的：耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)、甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)和肺炎链球菌)(在下文表3中列出的菌株)用可变强度观察标记(图7A和B)。然而，所有细菌比用线性NBD-UBINle标记的MSSA更亮(图7B)，并且在流式细胞术上NBD-UBI树突显示比线性NBD-UBINle上增加的标记(图7C)。此外，NBD-UBI树突不标记人中性粒细胞或支持原核选择性的A549细胞。(图7D和E)。
在共聚焦分析上(图8A和B)，与细菌孵育的NBD-PMX在革兰氏阴性细菌(铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦糖寡养食单胞菌、克氏肺炎杆菌、大肠杆菌和流感嗜血杆菌)显示与革兰氏阳性细菌(MRSA、MSSA和肺炎链球菌)相比显著更高的荧光(p＜0.05)，其通过流式细胞术证实(图7C)。此外，不存在人中性粒细胞或A549细胞的标记。(图8D和E)。
在细菌感染的离体羊模型中评估NBD-UBI树突和NBD-PMX的原位特异性和灵敏度(图9)。在此模型中，将PKH荧光染料标记的细菌注入远端羊肺并用FCFM成像显示出每个视野中点状荧光的特性和独特模式(图10A)。我们用被注入到肺并用FCFM成像的钙黄绿素标记的细菌和表达绿色荧光蛋白的金黄色葡萄球菌观察到相同模式(图10A)。通过将用NBD-UBI树突和NBD-PMX“预先标记”的细菌注入肺段，相同地再现了此模式。
在模型和阳性对照的这种彻底表征之后，我们将PBS或VAP相关细菌注入到离体肺模型的不同段，随后递送探针的微剂量。我们证明了线性NBD-UBINle不能原位标记细菌，尽管它具有在体外标记细菌的能力(图11)。对于这些实验，用复染的革兰氏阴性细菌(克氏肺炎杆菌)重复测定，其证明了用NBD-PMX标记(图11)。然而，在注入了细菌的段中，当注入NBD-UBI树突时，我们展示了与用“阳性对照”观察的相同的信号(铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和克氏肺炎杆菌)，但用PBS对照观察到最小/无信号，确认原位标记细菌并用FCFM系统成像的能力(图12)。
在注入了革兰氏阴性细菌铜绿假单胞菌(实验室菌株PA01和临床VAP分离株J3284)、克氏肺炎杆菌和大肠杆菌的段中，我们展示了当注入NBD-PMX时，与用“阳性对照”观察的相同的信号，但用PBS或革兰氏阳性细菌MSSA、MRSA和肺炎链球菌的段没有信号(图13)。在这些实验中，我们通过支气管肺泡灌洗和和在激光扫描单元(LSU)在660nm成像的复染的细菌，证实了在用NBD-UBI树突和NBD-PMS成像的所有段中革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的等密度(证明了段之间的CFU/ml无差异)。
为了进一步证明原位细菌检测和评估探针成像细菌聚集的能力，我们将细菌包埋在琼脂糖珠中，然后将其注入肺中。微剂量探针滴注和FCFM成像表明，细菌珠被清楚和单独地检测，而对照珠(无细菌的珠)没有(图12和13)。
在远端肺部，在递送后可能立即出现探针的明显和快速地耗散。因此，更迫切的是探针-细菌标记在这些条件下保持持久。NBD-UBI树突-标记的细菌在探针“洗脱”时保持标记，如对于NBD-PMX所见的。当注入到羊肺中时，用NBD-UBINle预先标记的细菌不能被FCFM检测，而用NBD-UBI树突或NBD-PMX预先标记的细菌容易地被可视化(图14)。因此，此类对“洗脱”的抵抗力代表探针-细菌亲和力的替代指示物，这表现为远端肺原位标记的绝对要求。目前，NBD-UBI树突和NBD-PMX都对洗脱耐受，而大多数其他结构变体不耐受洗脱。因此，用NBD-UBI树突和NBD-PMX标记的细菌在远端肺中发生的探针耗散时保持足够的荧光强度(图15)。
其次，我们通过傅立叶变换质谱(FTMS)和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析评估了来自急性肺损伤(ALI)患者的支气管肺泡灌洗液(BALF)中探针的稳定性。将NBD-UBINle、NBD-UBI树突和NBD-PMX与BALF孵育30分钟(图16)。NBD-UBI树突和NBD-PMX表现出稳定性，其峰值准确地对应于在生理盐水和BALF孵育的样品中容易地鉴定的完整探针的预测的理论光谱。也未观察到分解产物的预测光谱。相比之下，观察到NBD-UBINle的分解产物，表明在灌洗液中的不稳定性。因此，在“发炎”的高酶活性的远端肺环境的背景下探针稳定性和功能保留是体内效用的关键决定因素。这通过在羊灌洗液的存在下成像证实，其显示NBD-UBI树突比线性化合物的更高的荧光强度，并且当在羊灌洗液中成像时NBD-PMX的强度没有降低(图17)。
使用肺表面活性剂成分进行体外实验，以研究在大量表面活性剂存在下探针优先检测细菌的能力。掺入到NBD-UBI树突和NBD-PMX的荧光报告子(NBD)的性质表明在疏水性“丰富”表面活性剂环境中荧光激活的可能性。制备表面活性剂成分于缓冲盐水中的悬液(20mg/ml，65％二棕榈酰磷脂酰胆碱、30％磷脂酰甘油、5％棕榈酸和1mg/ml泰洛沙泊(tyloxapol)作为扩散剂)，并与或不与A549上皮细胞单层孵育。被观察到包被上皮细胞表面的表面活性剂成分的颗粒是荧光的，表明在此疏水溶液中NBD荧光增加。我们清楚地证明了，NBD-UBI树突和NBD-PMX都相对于肺表面活性成分对细菌标记具有选择性。在相等的摩尔浓度下，在表面活性剂成分的存在下，NBD-UBI树突具有比线性NBD-UBINle显著提高的细菌选择性(图18)。尽管依赖于NBD在疏水环境中的荧光增加的机制，NBD-UBI树突和NBD-PMX相对于纯化的表面活性剂成分优先增加细菌上的荧光，保持它们对远端肺部中的细菌成像的能力。尽管肺中表面活性剂成分的比较分布和相对丰度是未知的，但完全可能的是，这有助于在探针注入时观察到的背景荧光，并且需要在表面活性剂的存在下保持体外标记用于探针成功地成像，条件是它对降解充分耐受并在洗脱时保持标记。
我们已经开始开发定制的图像分析/处理策略，以对由探针/FCFM平台生成的大型数据集进行快速实时的客观分析。通过使用这些实时图像处理算法将实现对细菌的明确检测及其革兰氏状态的描绘。基于单帧分析的处理算法已经应用于整个视频序列(最高达3500帧)，并且即使在此早期阶段，我们能够明确地描绘细菌的存在和革兰氏状态。这些信号和图像处理算法将在准备临床应用中迅速迭代，并且我们期望将机器学习的重要组件纳入到NBD-UBI树突和NBD-PMX数据集的进一步优化中。
图19示出了基于通常用于以目标计算方式在荧光显微镜图像中检测亮点的两个图像处理算法(高斯拉普拉斯(LoG)和高斯差分(DoG))的，最初被选择来开发模型的单个阳性和阴性帧的分步处理。通过用LoG或DoG滤波进行卷积增强图像中的斑点。需要进行预处理以通过消除图像中的噪声的影响以提高精度。首先，通过将图像划分成小窗口(每帧100个)，然后计算像素强度的标准差来估计背景噪声。高通滤波用于降低低频噪声。以3倍标准差对生成的图片进行的阈值分割(thresholding)去除了背景噪声并且仅保留更高像素强度值。最后，用LoG或DoG检测到点。
我们已经采用上述方法分析整个FCFM图像视频(最多达3500帧)。采用每帧80个点的初始阈值限制来指示阳性帧，我们确定了每个视频的阳性帧数百分比，并将任意“截止”为20％作为是/否的二进制结果的阈值。这显示了分别使用NBD-UBI树突和NBD-PMX的细菌和革兰氏状态的明确检测(图20)。
为了确保化合物可以在正常人肺自体荧光以上标记细菌，将细菌与人肺组织一起孵育并使用FCFM和台式共聚焦成像(图21)，证明了一旦被高于自体荧光的水平标记则可以检测细菌。
我们已经用探针鉴定了远端肺原位标记的一些决定因素。这些解释了为什么线性NBD-UBINle探针的有希望的体外数据没有转化为在羊肺中可重现的原位标记。合成和评估结构变体，探索结构-活性关系。最初的目标是提高对降解的耐受力和改善信噪比。极大改善单个功能方面诸如稳定性(诸如插入d-氨基酸/正-甲基或仅包括d-氨基酸变体的变体)或标记强度(化合物的环化)的某些修饰不允许远端肺中细菌的可重现的可视化。使用37℃下实时台式共聚焦成像的体外细菌标记和羊肺中的原位标记，我们综合评估了UBI类似物在ALI BALF中的稳定性。
已经进行了一些结构修饰，这些结构修饰大致分为两组：
(a)通过检查不同的环境敏感性荧光团或增加NBD-UBINle载量来提高信噪比。
我们还评估了对于每个UBI片段包括两个NBD荧光团的效用，并且还用被设计为增强稳定性的N-甲基化氨基酸变体进行了评估。我们已经评估了一系列可选择的环境敏感性荧光团，包括孔雀绿和苯乙烯基染料，目的是产生更高的信噪比，这可以使得能够检测较低水平的细菌或在更低的有效探针浓度下进行检测。
(b)提高对蛋白水解降解的抗性。
我们已经评估了许多化合物，包括由母体NBD-UBI化合物的MALDI分析被鉴定为易于蛋白水解降解的位点的选定位置处掺入D-氨基酸和N-甲基化氨基酸的变体。为了降低降解而不改变氨基酸组成，我们合成了变体，所述变体在氨基和/或羧基末端包括PEG单元以阻断从肽序列的末端开始的降解。我们还合成并评估完全由D-氨基酸组成和具有或不具有封闭PEG单元的顺序反转的D-氨基酸组成的变体。此外，还评估了NBD-UBINle的环状变体以及此化合物在通过对NBD-UBINle的环状变体的MALDI分析鉴定为保持对蛋白水解裂解敏感的选定位置处掺入N-甲基化氨基酸的其它变体。
Figure BDA0001347198310000321
NBD-UBINle的环状变体
所有化合物均经过生物学评估。对于稳定性，我们在0.9％NaCl(生理盐水)或来自急性肺损伤患者的合并灌洗液的存在下评估每种化合物并通过基质辅助激光解吸/电离(MALDI)或傅里叶变换质谱(FTMS)进行分析。在具有细菌的化合物存在下，在台式共聚焦上评估体外标记，并将标记与充当细菌标记的参考对照的NBD-UBINle进行比较。在适当时，我们还评估了分离的人中性粒细胞和原代人细胞系(A549人肺腺癌细胞系)上化合物的标记。对于离体和体内羊肺实验，在对照肺段(注入2ml PBS)或细菌段(注入2ml的2光密度的细菌)中评估每种化合物。细菌注入后，将化合物施用于感兴趣的段并通过基于探针的共聚焦激光显微术(FCFM)成像。
不同NBD-UBINle变体的评估使我们更清楚地了解影响探针在肺环境中的功能的不同机制因素，并明确说明了为什么在所有UBI变体中只有NBD-UBI树突能够对肺中的细菌成像，尽管本领域的教导表明NBD-UBI树突将自体猝灭。
对于本申请而言，可选择的荧光团比不上NBD。孔雀绿变体给出了低得多的细菌上的标记强度，并且尽管苯乙烯-染料化合物表现出细菌上的标记强度增加，但这些化合物对哺乳动物细胞的选择性降低，最有可能是由于染料本身进入亲脂性膜的倾向克服了ubiquicidin部分的靶向。因此，苯乙烯-染料变体在离体肺中表现出大大增加的脱靶标记并且没有观察到细菌信号。
D-氨基酸变体以及在肽序列末端具有PEG封闭基团的变体在体外表现出降低的标记而在离体无标记。尽管在体外保留功能的线性UBI变体具体改善的稳定性，这些都不能在肺中对细菌成像。我们已经获得了证据，最有可能与亲和力和/或随后插入细菌膜的性质有关的探针的洗脱性质影响它们是否可以被用于在肺内成功成像。通过共聚焦在体外研究移除探针溶液时的标记保留。所有线性UBI变体标记在洗脱时完全失去。这表明，在肺中，一旦细菌周围的探针浓度由于流体耗散而降低，标记就会迅速消失。用这些线性NBD-UBINle化合物预先标记细菌，并通过对预注入的细菌悬液成像确认成功的标记。将这些悬液注入离体肺中，当随后使用FCFM使段成像时，未检测到细菌信号(从注入导管转变为通过FCFM纤维进入相同段存在固有的时间延迟)。然而，当注入通过体外共聚焦评价在洗脱时不失去标记的用多粘菌素-NBD(NBD-PMX)预先标记的细菌时，检测到细菌信号。NBD-UBI树突构建体以及以等摩尔浓度提供的增加的细菌信号在洗脱时保留标记。如预测的，当向离体肺注入用这些化合物预先标记的细菌时，细菌成功地成像。
如前所述，我们在合成的表面活性剂中评估了NBD-UBINle的环状变体，并且在表面活性剂标记的背景上可鉴定荧光细菌(如对于NBD-UBI树突和NBD-PMX所观察到的)。因此，在表面活性剂成分的存在下，NBD-UBINle的环状变体和NBD-UBI树突具有相似的洗脱行为、标记强度和标签保留，但只有NBD-UBI树突能够在肺中使细菌成像。因此，假设降解可能是该化合物的限制因素。MALDI分析鉴定了环状NBD-UBINle在与线性NBD-UBINle化合物不同的位置选择性降解。因此在这些位点掺入N-甲基氨基酸。然而，这些变体不再表现对于NBD-UBINle的环状变体观察到的增加的标记强度，并且在洗脱时不再保持标记。在被假设为降解的主要位点的位置处插入单个N-甲基精氨酸的变体示出了与NBD-UBINle的原始环状变体相比的降低的标记，但仍具有比线性NBD-UBINle高的强度。此变体具有在洗脱时改善的标记保留但保留的标记低于NBD-UBINle的环状变体的保留标记，并且此化合物在离体肺中不使细菌成像。
通过溶血测定评估NBD-PMX和NBD-UBI树突的直接红细胞毒性，并显示在高达100μM无红细胞溶血(图22)。在啮齿动物单剂量、气管内毒性评估中评估化合物的毒性。小鼠接受100μg/25g小鼠(3000倍人剂量，假设向75kg人递送100μg)的NBD-UBI树突或NBD-PMX或PBS对照的单次气管内施用。在48小时和14天使小鼠安乐死(每组n＝3)。数据显示NBD-PMX(表1和图23)或NBD-UBI树突无毒性(表2和图23)。
Figure BDA0001347198310000341
表1
Figure BDA0001347198310000351
表2
探针的合成方法
基于ubiquicidin的弹性蛋白酶探针的合成(“甲基红(MR)-AAPV-NBD-UBI29-41”和 “TAMRA-AAPV-NBD-UBI29-41”)
用标准氨基酸偶联循环(在室温下2×30分钟)，用～0.1mM试剂浓度的肽级DMF中的DIC和oxyma、使用Fmoc-策略在固相上合成MR-AAPV-K(NBD)-PEG-OH(AL3-74)片段。在于DMF的20％哌啶中进行Fmoc脱保护步骤(2×30分钟)。在每个步骤之间，用DMF、DCM和MeOH洗涤树脂。
用于无水DCM(2mL)中的Fmoc-PEG-OH(3当量)和DIPEA(6当量)处理2g氯三苯甲基聚苯乙烯树脂(载量～0.3mmol/g)持续3小时。洗涤和Fmoc脱保护后，使用Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Pro-OH和Fmoc-Ala-OH如上所述地合成Fmoc-AAPVK(Dde)序列。序列完成后，用一半的树脂(0.3mmol规模)继续合成，并使用于NMP/DCM中的NH2OH/咪唑(2×90分钟)正交地除去Dde保护基团。使用于DMF中的NDB-Cl(3当量)和DIPEA(6当量)处理树脂(2×45分钟)。在Fmoc脱保护后，以0.15mmol规模继续合成，并如上所述地将甲基红偶联至N-末端。洗涤后，用TFA-TIS-H2O(95:2.5:2.5)从树脂上裂解片段(30分钟)并用冷乙醚沉淀以得到AL3-74(ESI-MS 1044.4和1066.4)。
Figure BDA0001347198310000361
方案1甲基红-AAPV-NBD-UBI29-41的合成
使用上述Fmoc策略，在Rink-酰胺ChemMatrix树脂(载量1mmol/g)上合成Ubi29-41序列。接下来，将于无水DMF(0.6mL)的AL3-74(0.055mmol)加至ChemMatrix树脂AL3-68上的UBI29-41(0.03mmol)，随后加入HBTU(0.055mmol)和DIPEA(0.22mmol)。将反应混合物避光振荡过夜。过滤后，用DMF、DCM和MeOH洗涤树脂。将树脂用DCM溶胀、使探针脱保护并用TFA/茴香硫醚/EDT/茴香醚(90:5:3:2)从树脂上裂解(3小时)。将粗品用冷乙醚沉淀并通过离心收集。通过制备型HPLC纯化产物AL3-79，在490nm检测并用H2O-含0.1％甲酸的ACN的梯度作为洗脱剂。MALDI-TOF MS 2719.4，＞95％HPLC纯度。
以相似的方式合成TAMRA-AAPV-NBD-UBI29–41AL3-88(Maldi-TOF MS 2881.5，＞95％HPLC纯度)，除了将片段TAMRA-AAPV-K(NBD)-PEG-OH(AL3-75)偶联至在树脂AL3-68上的UBI基的肽的N-末端。
Figure BDA0001347198310000371
方案2TAMRA-AAPV-NBD-UBI29-41的合成
基于多粘菌素的NeBac-探针的合成(AL3-124)
Figure BDA0001347198310000381
方案3TAMRA-AAPV-NBD-PMX的合成
用标准氨基酸偶联循环(室温下2×30分钟)用～0.1mM试剂浓度的于肽级DMF中的DIC和肟基氰乙酸乙酯、使用Fmoc-策略在固相上合成Tamra-AAPV-K(MR)-PEG-OH 3A片段。在于DMF中的20％哌啶中进行Fmoc脱保护步骤(2×30分钟)。在每个步骤之间，用DMF、DCM和MeOH洗涤树脂。
使用于无水DCM(2mL)中的Fmoc-PEG-OH(3当量)和DIPEA(6当量)处理500mg氯三苯甲基聚苯乙烯树脂(载量～0.3mmol/g)持续3小时。洗涤和Fmoc脱保护后，使用Fmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Pro-OH和Fmoc-Ala-OH如上所述地合成Fmoc-AAPVK(Dde)序列。序列完成后，用于NMP/DCM中的NH2OH/咪唑(2×90分钟)正交地除去Dde保护基团。用于DMF中的NDB-Cl(3当量)和DIPEA(6当量)处理树脂(2×45分钟)。如上所述，在Fmoc脱保护后，将5个(6)-羧基Tamra偶联至N末端。洗涤后，用TFA-TIS-H2O(95:2.5:2.5)(30分钟)将该片段从树脂上裂解并用乙醚沉淀。3A ESI-MS 1044.4和1066.4。
接着，向于无水DMF(0.5mL)中的3A(0.011mmol)加入HSPyU(0.011mmol)和DIPEA(0.033mmol)，并在室温搅拌反应1小时。加入截短的且选择性地被Boc-保护的多粘菌素(四-Boc多粘菌素化合物C-见下文)(15mg，0.012mmol，于0.5mL DMF中)和DIPEA(0.033mmol)，并将反应混合物避光搅拌过夜。将DMF蒸发，将粗品溶解于1mL TFA-DCM(1:1)中并搅拌90分钟。蒸发TFA-DCM，将粗品用冷乙醚沉淀并通过离心收集。通过制备型HPLC纯化产物，在490nm检测并用H2O-含0.1％甲酸的ACN的梯度作为洗脱剂。
MALDI-TOF MS 2151.6和2173.6，100％HPLC纯度。
NBD-UBI树突的合成
单体(5)的合成
如方案1所示以六个步骤1合成单体(5)。通过将1,1,1-三(羟基甲基)氨基甲烷的羟基基团1,4-加成到丙烯腈上，然后进行氨基保护(Boc)制备单体(5)。用PtO2/H2使氰基氢解得到(3)，将其用DdeOH处理得到三-Dde保护的胺(4)。除去Boc保护基后，按照
Figure BDA0001347198310000391
的方法制备异氰酸酯(5)。2
Figure BDA0001347198310000392
方案4单体(5)的合成
Fmoc-Rink酰胺ChemMatrix树脂(6)
将4-[(2,4-二甲氧基苯基)-(Fmoc-氨基)甲基]苯氧基乙酸(Rink酰胺接头)附接到ChemMatrix树脂(LV＝1mmol/g)。因此，将Fmoc-Rink-酰胺接头(0.2mmol，1当量)溶于DMF(4mL)并加入肟基氰乙酸乙酯(Oxyma)(0.2mmol，1当量)，并将混合物搅拌5分钟。然后加入N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)(0.2mmol，1当量)并将所得混合物再搅拌2分钟。将溶液加至ChemMatrix树脂(0.1mmol，1.0mmol/g，1当量)并振荡0.5小时。所得树脂用DMF(3×5mL)、DCM(3×5mL)和MeOH(3×5mL)洗涤。通过定量茚三酮测试3监测偶联反应。
Figure BDA0001347198310000401
方案5NBD-UBI树突的合成
在用Fmoc-Rink酰胺型接头衍生的ChemMatrix树脂上合成探针(方案2)。用单体(5)装载接头(6)，得到三分支的支架(7)。除去Dde基团(于DMF中的2％肼)后，依序偶联合适的Fmoc-氨基酸，然后附接4-PEG-7-硝基苯并呋咱N-羟基琥珀酰亚胺酯(NBD-PEG-NHS)，并使用TFA/TIS/DCM(90/5/5)从树脂裂解。
Fmoc脱保护的一般程序
向树脂(在DCM中预溶胀)中加入于DMF中的20％哌啶(5mL)并将反应混合物振荡10分钟。将溶液排干并用DMF(3×10mL)、DCM(3×10mL)和MeOH(3×10mL)洗涤树脂。重复此程序两次。通过定量茚三酮测试3监测偶联反应。
异氰酸酯偶联以得到(7)
向在DCM(10mL)中预溶胀的树脂(0.30mmol)中加入异氰酸酯(6)(920g，0.93mmol)、DIPEA(0.2mL，0.93mmol)和DMAP(22mg，0.17mmol)于DCM/DMF的混合物(1:1，5mL)中的溶液并将混合物振荡过夜，并通过定量茚三酮测试监测反应。将溶液排干并用DMF(3×20mL)、DCM(3×20mL)和MeOH(3×20mL)和乙醚(3×20mL)洗涤树脂。(3×20mL).通过定量茚三酮测试3监测偶联反应。
PEG偶联-8-(9-芴基甲氧基羰基-氨基)-3,6-二氧杂辛酸(Fmoc-PEG-OH)偶联
加入Fmoc-PEG-OH(3.0mmol，10当量)于DMF(3mL)中的溶液和Oxyma(3.0mmol，10当量)并将混合物搅拌5分钟。然后加入DIC(3.0mmol，10当量)并将所得混合物再搅拌2分钟。将溶液加至在DCM中预溶胀的树脂(7)中并将反应混合物振荡0.5小时。将溶液排干并用DMF(3×10mL)、DCM(3×10mL)和MeOH(3×10mL)洗涤树脂。通过定量茚三酮测试3监测偶联反应。
肽合成
肽序列：Thr-Gly-Arg-Ala-Lys-Arg-Arg-Nle-Gln-Tyr-Asn-Arg-Arg
加入适当的Fmoc-氨基酸(3.0mmol，10当量)(Fmoc-Arg(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH)和Oxyma(3.0mmol，10当量)的溶液并将混合物搅拌5分钟。然后加入DIC(3.0mmol，10当量)并将所得混合物再搅拌2分钟。将溶液加至在DCM中预溶胀的树脂并将反应混合物振荡0.5小时。将溶液排干，用DMF(3×20mL)、DCM(3×20mL)和MeOH(3×20mL)洗涤树脂。通过定量茚三酮测试3监测偶联反应。
7-硝基苯并呋咱(NBD)偶联
向NBD-PEG-NHS(3.0mmol，10当量)于DMF(3mL)中的溶液中加入DIPEA(3.0mmol，10当量)。将所得溶液加至在DCM中预溶胀的树脂(1当量)中，并将反应混合物振荡0.5小时。将溶液排干并用DMF(×3)、DCM(×3)和MeOH(×3)洗涤树脂。通过定量茚三酮测试3监测偶联反应。
TFA裂解和报告子NBD-UBI树突的纯化
用TFA/TIS/DCM(90/5/5，300μL)的裂解混合物处理在DCM中预溶胀的树脂(45mg)2.5小时。将溶液排干并用裂解混合物洗涤树脂，并将溶液在真空下除去。将粗制材料溶解于最小量的裂解混合物(50μL)并加至冰冷的乙醚(7.5mL)中。通过离心收集沉淀的固体(22mg)并通过倾析除去溶剂，用冷乙醚(3×5mL)洗涤沉淀。然后通过制备型反相HPLC纯化沉淀物并将所需级分合并并冻干，以得到NBD-UBI树突。
Figure BDA0001347198310000421
NBD-PMX的合成
NBD-PMX探针由其前体多粘菌素B硫酸酯以四步合成(方案6)。探针是新颖的且其中间体是用适度修改的报道方法1合成的。荧光团以NBD-peg的NHS酯和四-boc多粘菌素化合物C之间的酰胺偶联并入。在TFA裂解和HPLC纯化后获得NBD-PMX。
Figure BDA0001347198310000431
方案6NBD-PMX探针的合成路线。
化合物B的制备
将多粘菌素B硫酸酯(10g，7.7mmol，1当量)溶解于pH 6.5的去离子水(200mL)(使用HCl水溶液调节pH)。将木瓜蛋白酶(1.5g)溶解于水(25mL)(相同pH)。合并溶液并加入甲苯(0.5mL)并将混合物在65℃下缓慢搅拌过夜。然后将混合物在沸水中搅拌5分钟，通过离心和过滤除去形成的沉淀物(变性的木瓜蛋白酶)。将滤液在真空下浓缩并冷冻干燥，以定量产率得到粗产物B。该步骤不需进一步纯化直接进行下一步骤。MS m/z 963.2(100％，[M+H]+)。
化合物C的制备：
将粗品B(5.5g，5.7mmol，1当量)溶解于H2O:二氧杂环已烷:Et3N(150mL，1:1:1)的混合物中并加入Boc-ON(4.52g，17.1mmol，3当量)。在室温下将溶液搅拌20分钟，然后用甲醇氨(20mL，MeOH中2M氨)淬灭。反应后，进行ELSD。蒸发溶剂并将所得混合物进行硅胶色谱柱(MeOH:DCM，15:85)以得到白色固体B(1.7g，22％)。MS m/z 1363.7(100％，[M+H]+)。
N-(4-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-7-基)氨基-3,6-二氧杂辛酸(NBD-PEG2-OH)：2
在0℃，在1小时内，将DIEA(850μl，5.00mmol)和固体8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(NH2-PEG2-OH)(392mg，2.40mmol，1当量)缓慢加入到NBD-Cl(401mg，2.01mmol)于甲醇(20mL)中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌过夜。蒸发溶剂且剩余的物质通过硅胶上的色谱法纯化，用DCM/MeOH(8:2)作为洗脱剂，得到NBD-PEG2-OH(400mg，1.23mmol，51％)的深红色油状物。1H NMR(500MHz,DMSO):δ10.9(s,1H；COOH),8.49(d,J＝8.5Hz,1H；CH NBD),7.1(s,1H,NH),6.23(d,J＝8.5Hz,1H；CH NBD),4.25(s,2H),3.93(t,J＝5.3Hz,2H；CH2),3.80(s,4H),3.72(t,J＝6.8Hz,2H；CH2)ppm；MS(ESI-)：对于C12H14N4O7[M-H]计算的m/z：325.1；实测：325.2。
N-(4-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-7-基)氨基-3,6-二氧杂辛酸，琥珀酰亚胺酯(NBD-PEG2-OH)：
向NBD-PEG-OH(2.4g，7.4mmol，1当量)于无水DCM(500mL)的溶液中加入EDC.HCl(1.56g,8.18mmol,1.1当量)和DIPEA(1.36mL,10mmol)。搅拌混合物10分钟后，加入N-羟基琥珀酰亚胺(0.94g，8.18mmol)并允许搅拌16小时。将反应混合物用DCM(250mL)稀释并用5％含水柠檬酸(2×200mL)、饱和的含水NaHCO3和盐水处理。将有机层用Na2SO4干燥、过滤并在真空下浓缩以获得为暗棕色固体产物(1.0g，定量)。该粗品不经进一步纯化被用于下一步骤。
化合物F的制备：
将NBD-PEG-NHS(466mg，1.1mmol，1当量)、DIPEA(384μL，2.2mmol，2当量)和胺C(1.5g，1.1mmol，1当量)于DMF(150mL)中的溶液在室温下避光搅拌1小时。反应完成后(TLC)，在真空下除去挥发物。将粗混合物通过快速色谱法纯化(DCM:MeOH，90:10)以得到深橙色/棕色固体(1.2g，65％)。HPLC(254nm&495nm)Rt＝7.80min；m/z 1671.7(25％,[M+H]+)；1693.9(65％,[M+Na]+)。
NBD-PMX探针的制备：
将Boc-保护的多粘菌素F(150mg，0.09mmol)于含20％TFA的DCM(2mL)的溶液在室温下避光剧烈搅拌45分钟。将反应混合物在真空下蒸发并将所得物溶于乙醚。离心后将乙醚层倾析(3×2mL)。将所得黄色/棕色固体(40mg，定量)在真空下干燥。通过制备型HPLC纯化粗制产物，以MeOH/H2O作为梯度溶剂系统，以0.1％甲酸作为添加剂。将从制备型HPLC收集的级分冷冻干燥，得到红/橙色固体(30mg，从HPLC中回收26％)。
表征：对于分析型HPLC，使用Poroshell 120SB-C18，2.7μm，4.6×50mm柱与二极管阵列检测器。对于制备型HPLC方法：Discovery C18反相柱(5cm×4.6mm，5μm)，流速为1mL/min，用H2O/MeOH/HCOOH(95/5/0.05)至H2O/MeOH/HCOOH(5/95/0.05)在6分钟内洗脱，在95％MeOH保持4分钟，检测通过ELSD在254nm和495nm进行。HPLC(495nm)：Rt＝4.1分钟；MS m/z1271.7(95％，[M+H]+)；1293.7(100％，[M+Na]+)；FTMS计算值636.3282([M+2H]/2)+，实测值636.3344。
吸收/发射：467nm/539nm。
溶解性：完全溶于水。
稳定性：在室温下稳定持续＞1周。
存储：在惰性气氛下储存于-20℃。避光。
生物学方法
细菌生长：测定中使用的细菌包括铜绿假单胞菌(PA01参考菌株和来自VAP患者的J3284临床分离株)、鲍曼不动杆菌、嗜麦糖寡养食单胞菌、金黄色葡萄球菌(包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA))、克氏肺炎杆菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌。
Figure BDA0001347198310000461
在琼脂肉汤、巧克力琼脂或血琼脂板上培养所有细菌，储存在4℃。对于测定，使用接种环采集单菌落的细菌，并加至于50ml Falcon管中的10ml液体肉汤中。将其转移到37℃的培养箱中，持续16小时(对于肺炎链球菌补充5％CO2)。将培养物用作过夜培养物(稳定期)或从这些培养物中进行亚培养(1:100)，并培养样品直到它们进入中对数期(在分光光度计上在595nm的读数为0.5-0.6光密度(OD))。然后将培养物在4000rpm离心5分钟并将沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。洗涤三次后，将其重构为0.5OD595nm用于共聚焦测定、0.1OD595nm用于流式细胞术或2OD595nm用于羊离体肺实验(除非另有说明)。
细菌计数：将样品(制备的细菌或来自羊肺段的灌洗液)短暂涡旋，然后进行连续稀释(1:10)稀释至第8稀释。将肉汤/血琼脂板分成象限，每象限5×20ul滴。将它们在37℃下培养16小时(对于肺炎链球菌，补充5％CO2)，并且计数板，以菌落形成单位/毫升(CFU/ml)报告数据。
表面活性剂组分合成：将表面活性剂5μg 1,2-二棕榈酰-sn-甘油酰-3-磷酸胆碱(DPPC)和2.5μg L-α-磷脂酰基-L-甘油钠盐(来自蛋黄卵磷脂；PG)溶于500μl氯仿中，并在圆底烧瓶中在氮气下蒸发至薄脂质膜。将脂质膜在48℃用PBS边搅拌(750rpm)边再水合1小时以产生多层囊泡(multilammelar vesicles,MLV)。将它们1:4稀释用于共聚焦实验。
琼脂糖细菌珠：将细菌在400ml TSB中培养至中对数期，通过离心沉淀并重悬于2ml PBS中。将其与18ml熔融的胰蛋白酶-大豆琼脂(50℃)混合并快速注入预温至50℃的涡旋的矿物油+0.01％Span 80。然后将其快速冷却至4℃同时继续涡旋以允许珠凝固(set)。通过离心(20分钟，3000g)将细菌琼脂珠沉淀并用PBS中的0.5％脱氧胆酸钠(SDC)洗涤(20分钟，3000g)，然后用PBS中的0.25％SDC(20分钟，3000g)洗涤、在PBS 10分钟，3000g)和3XPBS(5分钟，200g)中洗涤。将珠以50％v/v重悬于PBS用于注入。
中性粒细胞提取：从健康人志愿者葡聚糖沉淀然后通过不连续血浆-Percoll梯度离心的外周血中分离中性粒细胞。
A549培养物：将A549细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、100单位/mL青霉素G和100μg/mL链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中生长至80％融合。用胰蛋白酶-EDTA分散细胞并将其接种到玻璃盖玻片或8孔共聚焦成像室上，并在DMEM存在下培养至融合。
共聚焦分析：制备细菌并使用Syto82核酸染料剂(Invitrogen，CA，USA)在37℃和350rpm振荡加热块中复染20分钟。将它们与所需浓度的探针在密封的POC微室或8孔共聚焦室中共孵育。当需要时，将用于POC室的玻璃盖玻片在纤连蛋白(用于中性粒细胞实验)或聚-D-赖氨酸(用于细菌和细胞系)中包被，并在37℃与细胞孵育1小时以允许在细菌接种之前进行粘附。用ImageJ分析。简而言之，Syto通道被自动阈值分割(Huang)，并从其产生一个ROI。量化该ROI内探针通道的平均荧光强度。提供的数据代表三个独立视野的平均值。
流式细胞术：制备细菌并使用Syto82核酸染料剂(Invitrogen，CA，USA)在37℃和350rpm振荡加热块中复染20分钟。用PBS×3洗涤细菌并将探针(50μl)加入到50ul OD5951od细菌中。将其稀释至500uL，并使用FL-1和FL-2通道用BD FACS Calibur分析10,000次事件。在FL-2通道上门控后，使用FlowJo软件分析。
肺收集和pCLE程序：从注定被屠宰的剩余库存母羊的群组中，一只母羊被确定并最终用过量的麻醉剂安乐死。确认死亡，确定气管并将其原位夹住。然后进入胸腔，将肺从周围组织和器官中释放并整个取出心脏/肺。确定右肺动脉、插管并灌注1000ml 0.9％NaCl。一旦确认了左心室被填充就进行切口以允许自由引流，并继续灌注直到来自左心房的引流澄清。然后将肺转移到皇后医学研究所(Queen’s Medical Research Institute)，释放夹子后立即将8.0气管内导管插入气管。将肺置于新生儿培养箱中，环境温度为37℃，湿度为65％，并使用压力控制呼吸机(Breas Vivo PV 403)通气。调整呼吸机设置以帮助最大实质细胞(parenchymal)招募，并旨在实现＞1升的潮气容量。1小时的最佳通气后，进行支气管镜检查并鉴定各段，并注入2ml细菌或PBS对照。注入后，引入单独的鞘(ERBE)并注入探针。然后使pCLE纤维向下通过工作通道，并将该段成像。对于BALF，将支气管镜楔入并注入20ml 0.9％NaCl、小心地取出，灌洗收率为40-50％。对照段在解剖学上不同和/或在对侧肺。在每个段成像之间对支气管镜进行消毒。
溶血测定：从新鲜采集的抗凝血的人血液分离红细胞并在PBS(pH 7.4)中重悬至20体积％。在阴性对照的情况下，在96孔微量滴定板中，将100μl红细胞悬液加至100μl于PBS中的NLLP溶液(由1:2系列稀释制备)或100μl PBS中。百分之一百的溶血孔含有100μl的红细胞悬液和100μl的0.2体积％Triton X-100。将板在37℃下孵育1小时，然后用150μlPBS稀释各孔。然后将板在1,200g下离心15分钟，将每孔的100μl上清液转移到新鲜的微量滴定板中，测量A350。溶血百分比被确定为(A-A0)/(A总计-A0)X100，其中A为测试孔的吸光度，A0为阴性对照的吸光度，A总计为100％溶血孔的吸光度，全部在Biotek读板器上以350nm进行。
MALDI-TOF：将探针加至用ALI孵育30分钟的生理盐水或来自患者的合并的BALF。用5μL MeCN(0.1％TFA作为添加剂)然后用20μL H2O洗涤ZipTip(C-18，0.2μL)。用样品装载ZipTip，洗涤并洗脱至5μL的80％MeCN水溶液中(0.1％TFA作为添加剂)。用MALDI-TOF(PerSeptive Biosystems Voyager DETMSTR MALDI-TOF质谱仪(Applied Biosystems，Foster City，CA))分析样品。
统计学分析：除非另有说明，所有实验进行至少三次且结果表示为平均值±SEM。通过非配对t检验或ANOVA分析数据，显著性被确定为p＜0.05(GraphPad Prism)。
参考文献
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2.H.J.
Figure BDA0001347198310000491
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3.E.Kaiser,R.L.Colescott,C.D.Bossinger and P.I.Cook,AnalyticalBiochemistry,1970,34,595-598.
相关序列的列表
SEQ ID NO.1
ubiquicidin(全长)
KVHGSLARAG KVRGQTPKVA KQEKKKKKTG RAKRRMQYNR
RFVNVVPTFG KKKGPNANS
SEQ ID NO.2
ubiquicidin(UBI29-41)
TGRAKRRMQY NRR
SEQ ID NO.3
ubiquicidin(UBINle)
TGRAKRRNleQY NRR
SEQ ID NO.4
多粘菌素
Figure BDA0001347198310000501
Dab＝L-α-γ-二氨基丁酸
SEQ ID NO.5
多粘菌素B1
Figure BDA0001347198310000502
SEQ ID NO.6
多粘菌素B2
Figure BDA0001347198310000511
序列表
<110> 爱丁堡大学董事会
<120> 分子探针及其使用方法
<130> P220284WO
<140>
<141>
<150> GB 1420222.0
<151> 2014-11-13
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 59
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Lys Val His Gly Ser Leu Ala Arg Ala Gly Lys Val Arg Gly Gln Thr
1 5 10 15
Pro Lys Val Ala Lys Gln Glu Lys Lys Lys Lys Lys Thr Gly Arg Ala
20 25 30
Lys Arg Arg Met Gln Tyr Asn Arg Arg Phe Val Asn Val Val Pro Thr
35 40 45
Phe Gly Lys Lys Lys Gly Pro Asn Ala Asn Ser
50 55
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Ubiquicidin片段
<400> 2
Thr Gly Arg Ala Lys Arg Arg Met Gln Tyr Asn Arg Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有甲硫氨酸到正亮氨酸取代的Ubiquicidin片段
<400> 3
Thr Gly Arg Ala Lys Arg Arg Nle Gln Tyr Asn Arg Arg
1 5 10
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Phe经历翻译后异构化成为D-Phe
<220>
<221> misc_binding
<222> (10)..(10)
<223> 通过Thr与第四氨基酸残基（Dbu）的结合形成的环
<400> 4
Dbu Thr Dbu Dbu Dbu Phe Leu Dbu Dbu Thr
1 5 10
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 多粘芽孢杆菌
<220>
<221> misc_binding
<222> (1)..(1)
<223> 结合6-甲基辛酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Phe经历翻译后异构化成为D-Phe
<220>
<221> misc_binding
<222> (10)..(10)
<223> 通过Thr与第四氨基酸残基（Dbu）的结合形成的环
<400> 5
Dbu Thr Dbu Dbu Dbu Phe Leu Dbu Dbu Thr
1 5 10
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 多粘芽孢杆菌
<220>
<221> misc_binding
<222> (1)..(1)
<223> 结合6-甲基庚酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Phe经历翻译后异构化成为D-Phe
<220>
<221> misc_binding
<222> (10)..(10)
<223> 通过Thr与第四氨基酸残基（Dbu）的结合形成的环
<400> 6
Dbu Thr Dbu Dbu Dbu Phe Leu Dbu Dbu Thr
1 5 10

Claims (24)

1.一种探针，所述探针包含标签和结合部分，其中所述结合部分是截短的多粘菌素部分，其中多粘菌素的至少一部分烃尾已经被除去，其中所述标签是7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑，所述探针为：
Figure FDA0002993071400000011
。
2.一种探针，所述探针的结构式为：
Figure FDA0002993071400000012
3.第一探针和第二探针在制备用于在靶区域中检测细菌和/或真菌的试剂盒中的用途，其中所述第一探针适于标记细菌和/或真菌并且包含至少一个第一结合部分和至少一个第一荧光团，所述至少一个第一结合部分包含ubiquicidin部分，其中所述ubiquicidin部分是SEQ ID NO:1的全长ubiquicidin或其片段或变体，所述变体与所述全长ubiquicidin或所述片段相比包含氨基酸取代，并且所述片段是包含所述全长ubiquicidin的至少12个连续氨基酸的ubiquicidin片段，并且所述第二探针适于仅标记革兰氏阴性细菌并且包含第二结合部分和第二荧光团，其中所述第二结合部分是截短的多粘菌素部分，其中多粘菌素的至少一部分烃尾已经被除去，其中所述第二荧光团是7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑，所述第二探针为：
Figure FDA0002993071400000021
当所述试剂盒被使用时，包括以下步骤：
(1)提供所述第一探针；
(2)将所述第一探针递送到所述靶区域；
(3)用适当波长的光照射所述靶区域以激发所述第一探针；
(4)确定所述靶区域中的细菌和/或真菌是否已被所述第一探针标记；
其中如果确定所述靶区域中的细菌已经被所述第一探针标记，则
(5)提供所述第二探针；
(6)将所述第二探针递送到所述靶区域；
(7)用适当波长的光照射所述靶区域以激发所述第二探针；
(8)确定所述第二探针是否已经标记了所述靶区域中的细菌；
其中在所述靶区域中被所述第二探针标记的细菌被鉴定为革兰氏阴性细菌，并且其中所述第一探针和所述第二探针不与动物细胞结合。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述靶区域是肺的一部分、在患者的皮肤上、关节中、循环系统中、上皮膜。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述上皮膜是消化系统或生殖系统的一部分。
6.根据权利要求3所述的用途，其中所述靶区域是细胞培养物的一部分、组织样品、液体样品、或医疗装置的一部分，并且所述用途可以在体外进行。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的用途，其中所述检测由临床医师在原位、护理现场进行，并确定细菌和/或真菌是否存在于所述靶区域中，以及任何细菌是革兰阴性的或革兰氏阳性的。
8.根据权利要求3至6中任一项所述的用途，其中如果在所述靶区域中检测到细菌并向患者给予适当的抗生素，则所述试剂盒用于确定所述抗生素的功效。
9.根据权利要求7所述的用途，其中如果在所述靶区域中检测到细菌并向患者给予适当的抗生素，则所述试剂盒用于确定所述抗生素的功效。
10.根据权利要求3-6和9中任一项所述的用途，其中如果在所述靶区域中检测到细菌并向患者给予适当的外科手术程序，则所述试剂盒用于确定所述程序的功效。
11.根据权利要求7所述的用途，其中如果在所述靶区域中检测到细菌并向患者给予适当的外科手术程序，则所述试剂盒用于确定所述程序的功效。
12.根据权利要求8所述的用途，其中如果在所述靶区域中检测到细菌并向患者给予适当的外科手术程序，则所述试剂盒用于确定所述程序的功效。
13.根据权利要求3至6中任一项所述的用途，其中如果在所述靶区域中检测到真菌并向患者给予适当的抗真菌剂，则所述试剂盒用于确定所述抗真菌剂的功效。
14.根据权利要求7所述的用途，其中如果在所述靶区域中检测到真菌并向患者给予适当的抗真菌剂，则所述试剂盒用于确定所述抗真菌剂的功效。
15.根据权利要求3至6、9、11-12和14中任一项所述的用途，其中当所述试剂盒被使用时，包括在荧光下观察所述靶区域以确定在所述靶区域中鉴定的任何细菌或真菌的形态的步骤。
16.根据权利要求7所述的用途，其中当所述试剂盒被使用时，包括在荧光下观察所述靶区域以确定在所述靶区域中鉴定的任何细菌或真菌的形态的步骤。
17.根据权利要求8所述的用途，其中当所述试剂盒被使用时，包括在荧光下观察所述靶区域以确定在所述靶区域中鉴定的任何细菌或真菌的形态的步骤。
18.根据权利要求10所述的用途，其中当所述试剂盒被使用时，包括在荧光下观察所述靶区域以确定在所述靶区域中鉴定的任何细菌或真菌的形态的步骤。
19.根据权利要求13所述的用途，其中当所述试剂盒被使用时，包括在荧光下观察所述靶区域以确定在所述靶区域中鉴定的任何细菌或真菌的形态的步骤。
20.根据权利要求15所述的用途，其中当所述试剂盒被使用时，包括在荧光下观察所述靶区域以鉴定所述靶区域内的微生物，并使用所述第一探针和所述第二探针来确定那些微生物的身份的步骤。
21.根据权利要求16-19中任一项所述的用途，其中当所述试剂盒被使用时，包括在荧光下观察所述靶区域以鉴定所述靶区域内的微生物，并使用所述第一探针和所述第二探针来确定那些微生物的身份的步骤。
22.根据权利要求3所述的用途，其中所述第一结合部分是氨基酸29至41的ubiquicidin片段，所述ubiquicidin片段的序列为SEQ ID NO.2。
23.根据权利要求3所述的用途，其中所述第一结合部分是包含正亮氨酸氨基酸取代原始的甲硫氨酸氨基酸的氨基酸29至41的ubiquicidin片段，所述包含正亮氨酸氨基酸取代原始的甲硫氨酸氨基酸的UBI29-41的序列为SEQ ID NO.3。
24.根据权利要求3所述的用途，其中所述第一探针为：
Figure FDA0002993071400000051
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