CN115819502A - 一种edb-fn靶向多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种EDB‑FN靶向多肽及其应用，其基序为AVRTSAD，命名为EDBp，所述多肽具有更强的亲和力，平衡解离常数KD达到nM级别，亲和力获得极大提升，对EDB‑FN具有很强的亲和力，特异性强，无生物毒性，其在体内较为稳定且分布合理，可以作为靶向载体，EDB‑FN靶向多肽可应用于多种EDB‑FN高表达肿瘤的分子成像和治疗中，在肿瘤分子成像和靶向治疗中具有重要应用价值。

Description

一种EDB-FN靶向多肽及其应用

技术领域

本发明属于靶向肽技术领域，具体涉及一种EDB-FN靶向多肽及其应用。

背景技术

Fibronectin(FN)编码于染色体2q35上，通常由成纤维细胞产生，是肿瘤细胞产生的肿瘤微环境(TME)中细胞外基质的高分子量糖蛋白成分。肿瘤间质中最丰富的细胞是成纤维细胞，其收缩间质和诱导肿瘤细胞侵袭的能力已被证实。FN是一种广泛表达的高分子量细胞外基质糖蛋白，有多种亚型。序列分析显示，FN由3个不同的同源序列组成，分别是I型、II型和III型。在FN分子的III型重复序列中已经确定了三个备选的剪接位点：ED-A，ED-B和IIICS。由于体外转化细胞优先表达ED-B结构域，EDB-FN被命名为癌胚纤维连接蛋白或胚胎纤维连接蛋白，主要在胎儿组织和实体肿瘤中表达。目前，研究人员成功研发了多种EDB-FN相关抗体及多肽相关放射性核素分子探针、磁共振分子探针和光学分子探针。这些EDB-FN相关抗体及多肽分子探针有相当一部分进入临床实验，并在肿瘤病人中取得了良好的成像和治疗效果。

EDB-FN在多种肿瘤中过表达，其中包括胸腺瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤、胰腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、胆管癌、头颈部鳞癌、皮肤黑色素瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、胃癌、肉瘤、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、肝癌、肾透明细胞癌、胶质瘤、食管癌、肾上腺皮质癌。EDB-FN在肿瘤细胞的迁移、侵袭和增殖中发挥重要的作用。同时，GEPIA数据库显示，FN表达水平越高的肿瘤患者，总体生存率和无病生存率大部分较差。因此，EDB-FN是肿瘤诊断和预后评价的重要标记物，开发以EDB-FN为靶点的多肽诊断试剂，对肿瘤的诊断有着重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的EDB-FN靶向多肽及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面，提供一种EDB-FN靶向多肽，其基序如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8任一项所示。

在本发明的一些实施方式中，所述氨基酸包括L型氨基酸和D型氨基酸。

本发明的第二方面，提供一种缀合物，包含本发明第一方面所述的靶向多肽和功能性部分。

在本发明的一些实施方式中，所述缀合物中含有至少一个拷贝的靶向多肽。

在本发明的一些实施方式中，所述功能性部分包含显像剂和/或治疗剂。

在本发明的一些实施方式中，显像剂包含FB基团、诊断用放射性核素、生物素、荧光团、荧光蛋白、抗体、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述治疗剂包含治疗用放射性核素、促凋亡肽、纳米颗粒、化学治疗剂、纳米微滴、脂质体药物和细胞因子中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述放射性核素通过螯合剂标记所述靶向多肽。

在本发明的一些实施方式中，所述诊断用放射性核素包含⁹⁹Tc、⁶⁸Ga、¹⁸F、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹In、⁶⁷Ga、⁶⁴Cu、⁸⁹Zr、¹¹C、¹⁷⁷Lu和¹⁸⁸Re中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述治疗用放射性核素包含¹⁷⁷Lu、⁹⁰Y、²²⁵Ac、²¹¹As、²¹²Bi、²¹³Bi、¹³⁷Cs、⁵¹Cr、⁶⁰Co、¹⁶⁵Dy、¹⁶⁹Er、²⁵⁵Fm、¹⁹⁸Au、¹⁶⁶Ho、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁹²Ir、⁵⁹Fe、²¹²Pb、⁹⁹Mo、¹⁰³Pd、³²P、⁴²K、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²²³Ra、¹⁰⁶Ru、²⁴Na、⁸⁹Sr、¹⁴⁹Tb、²²⁷Th、¹³³Xe、¹⁶⁹Yb和¹⁷⁷Yb中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述螯合剂包含HYNIC、DOTA、NOTA、DTPA中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述的缀合物中的各部分直接连接和/或通过连接剂连接。

在本发明的一些优选实施方式中，所述连接剂为以下(I)～(II)中至少一种：

(I)多元醇；

(II)氨基酸。

在本发明的一些实施方式中，所述多元醇为甘油、季戊四醇、木糖醇、山梨醇、聚乙二醇中的至少一种。

在本发明的一些优选实施方式中，所述多元醇为聚乙二醇。

在本发明的一些更优选实施方式中，所述多元醇为聚合度为3～12的聚乙二醇。

在本发明的一些实施方式中，所述氨基酸的数量为3～8个。

在本发明的一些实施方式中，所述氨基酸为任意氨基酸。

在本发明的一些优选实施方式中，所述氨基酸为赖氨酸。

在本发明的一些实施方式中，所述连接剂连接于多肽的C端。

本发明的第三方面，提供本发明第一方面所述的靶向多肽或本发明第二方面所述的缀合物的相关生物材料，所述相关生物材料为下述(A1)～(A8)中的任一种：

(A1)编码本发明第一方面所述的靶向多肽或本发明第二方面所述的缀合物的核酸分子；

(A2)含有(A1)所述核酸分子的表达盒；

(A3)含有(A1)所述核酸分子的重组载体；

(A4)含有(A2)所述表达盒的重组载体；

(A5)含有(A1)所述核酸分子的重组细胞；

(A6)含有(A2)所述表达盒的重组细胞；

(A7)含有(A3)所述重组载体的重组细胞；

(A8)含有(A4)所述重组载体的重组细胞。

本发明的第四方面，提供本发明第一方面所述靶向多肽或本发明第二方面所述的缀合物或本发明第三方面所述的相关生物材料在制备疾病中的靶向筛查、诊断、治疗或预后评估产品中的应用；所述疾病优选为EDB-FN异常表达的疾病。

在本发明的一些实施方式中，所述EDB-FN异常表达的疾病优选为胸腺瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤、胰腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、胆管癌、头颈部鳞癌、皮肤黑色素瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、胃癌、肉瘤、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、肝癌、肾透明细胞癌、胶质瘤、食管癌、肾上腺皮质癌。

本发明的第四方面，提供一种产品，所述产品中包含本发明第一方面所述的靶向多肽或本发明第二方面所述的缀合物或本发明第三方面所述的相关生物材料。

在本发明的一些实施方式中，所述产品为：探针、试剂盒、诊断试剂、药物。

在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型为注射液、颗粒剂、口服液剂、气雾剂、胶囊剂或喷雾剂。

在本发明的一些实施方式中，所述药物的给药途径为静脉、动脉、腔内、皮下或鞘内注射。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种突变体EDBp(AVRTSAD)，其对EDB-FN具有更强的亲和力，平衡解离常数KD达到nM级别，亲和力获得极大提升，对EDB-FN具有很强的亲和力，特异性强，无生物毒性，其在体内较为稳定且分布合理，可以作为靶向载体，EDB-FN靶向多肽可以作为分子探针应用于多种EDB-FN高表达肿瘤的分子成像中，如临床术中导航NIRF区光学成像、磁共振成像MRI，正电子发射成像PET和单光子发射成像SPECT等，在肿瘤分子成像和治疗中具有重要应用价值。

基于EDBp(AVRTSAD)，本发明还提供了一种靶向试剂，包含EDBp(AVRTSAD)，还包显像剂和/或治疗剂，起到更好的肿瘤诊断与治疗的作用，显像剂标记相应的多肽，具有更好的稳定性，达到了更好的诊断和治疗效果。

附图说明

图1为利用微尺度热泳动技术(MST)检测ZD2、丙氨酸扫描肽A1-A7与EDB-FN蛋白的亲和力。图1A为ZD2与EDB-FN蛋白的亲和力；图1B-图1H分别为A1-A7与EDB-FN蛋白的亲和力。

图2为NZD2的结构及相关探针。图2A为EDBp的结构式；图2B为Cy5-EDBp的结构公式；图2C为¹⁸F-EDBp的结构式；图2D为¹⁷⁷Lu-EDBp的结构式。

图3为Cy5-EDBp在荧光引导手术中的评价。图3A为流式细胞术检测Cy5-EDBp与BHT-101细胞系的结合以及EDBp对Cy5-EDBp的阻断作用(黄色：对照组；蓝色：阻断组0.1uMCy5-EDBp+20uM EDBp；红色；非阻断组0.1μM Cy5-EDBp)；图3B为共聚焦激光扫描检测BC-1抗体与Cy5-EDBp在BHT-101细胞系中的共定位，蓝色：DAPI；绿色：BC-1抗体；红色：Cy5-EDBp；图3C为未阻断组和阻断组ATC原位荷瘤小鼠荧光显像：未阻断组肿瘤组织有较强的荧光信号，阻断组无荧光信号，切除原位肿瘤后，行荧光成像检查切除边缘是否干净，绿色圆圈表示肿瘤；图3D为体外荧光成像显示，未阻断组有较强的荧光信号，阻断组无荧光信号，采集的其他器官仅肾有较强的荧光信号。

图4为¹⁸F-EDBp在ATC原位荷瘤小鼠体内的生物分布。图4A为¹⁸F-NOTA-NZD2静脉注射1小时和2小时后在小鼠主要组织和肿瘤中的生物分布；图4B为1小时和2小时肿瘤与器官的比例；图4C为¹⁸F-EDBp在未阻断组和阻断组的主要组织和肿瘤组织中的生物分布。

图5为ATC原位荷瘤小鼠¹⁸F-EDBp PET/CT成像。图5A为¹⁸F-EDBp在ATC原位荷瘤小鼠体内的PET/CT成像(非阻断组及阻断组1小时显像，其中阻断组¹⁸F-EDBp：EDBp＝1:1000)；MIP图显示，非阻断组ATC原位荷瘤小鼠颈部肿瘤组织核素富集，阻断组小鼠颈部未见明显核素富集；图5B为注射¹⁸F-EDBp的1小时后，非阻断组肿瘤组织核素摄取明显高于阻断组；图5C为ATC原位荷瘤小鼠颈部肿瘤组织HE染色及BC-1抗体免疫组化结果。

图6为¹⁷⁷Lu-EDBp在ATC原位荷瘤小鼠体内核素靶向治疗优势。图6A为生理盐水治疗组每只小鼠肿瘤体积随时间变化趋势；图6B为EDBp治疗组每只小鼠肿瘤体积随时间变化趋势；图6C为白蛋白紫杉醇治疗组每只小鼠肿瘤体积随时间变化趋势；图6D为¹⁷⁷Lu-EDBp治疗组每只小鼠肿瘤体积随时间变化趋势；图6E为不同治疗组在第1天到第7天的肿瘤体积变化；图6F为不同治疗组第1天到第15天的肿瘤体积变化；图6G为不同治疗组小鼠在治疗第1天至第15天体重变化；图6H图为不同治疗组生存分析。

图7为通过放射自显影技术检测¹⁸F-EDBp与不同病理类型甲状腺癌组织切片结合情况。图7A为不同病理类型人甲状腺癌石蜡切片；图7B为不同病理类型人甲状腺癌组织切片¹⁸F-EDBp放射自显影；图7C为不同病理类型人甲状腺癌组织HE染色；图7D为FN在人不同病理类型甲状腺癌中的免疫组化结果；图7E为箭头指向位置免疫组化结果(×400)。

图8为甲状腺癌患者原发病灶和转移灶的PET/CT成像。图8A为颈部甲状腺病灶在静脉注射¹⁸F-EDBp 5min和45min后的PET和PET/CT成像，显示双侧甲状腺癌组织中¹⁸F-EDBp浓聚，SUVmax值分别为3.9(5min)和2.4(min)；图8B为静脉注射¹⁸F-EDBp后60min时躯干最大强度投影(MIP)图像，显示¹⁸F-EDBp在肾脏、尿管和膀胱积聚；PET和PET/CT成像显示T11和双侧髂骨转移灶中¹⁸F-EDBp浓聚，SUVmax值为3.4。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1多肽突变体与EDB-FN的亲和力检测

作为EDB-FN靶向多肽的进一步改进，氨基酸基序选自丙氨酸扫描结果：AVRTSAD、TARTSAD、TVATSAD、TVRASAD、TVRTAAD、TVRTSAD、TVRTSAA。

通过微量热泳动(microscale thermophoresis，MST)法，检测这7条多肽和既往报道EDB-FN相关靶向多肽ZD2(CTVRTSADC)与EDB-FN(G12524-1，赛索飞)蛋白的亲和力，具体操作如下：

方法：

1)配制0.05％的PBST：将25μl的吐温20加入到50ml的PBS中，过0.22μm的滤嘴。

2)将多肽溶解成1mM/mL，即储存液浓度：取20μl多肽(20μM)与80μl的PBST混合，稀释成200nM/μL。

3)EDB-FN蛋白稀释：加100μl水到2μl的EDB-FN蛋白中(约稀释51倍)，此时的浓度为2.4μM。

4)取2μlRED-tris-NTA二代染料(5μM)与98μl的PBST混匀，得到100μl染料(100nM)。

5)取30μl染料，加入30μl的PBST混匀，得到50nM的染料。

6)取6μl的3)蛋白于PCR管中，用PBST以1：1稀释蛋白，稀释16个管。

7)分别向16个管中加入3μl的50nM的染料，加入3μl稀释好的蛋白，混匀，室温孵育30min。

8)用毛吸管吸取样品后上机检测，仪器设置为80％LED/excitation power及medium MST power。

9)使用MO.Control或MO.Affinity Analysis软件，通过Kd拟合模式计算Kd。

10)如果染料与蛋白的亲和力强于10nM(Kd≤10nM)，选择合适的蛋白溶度继续下面的步骤。本次实验中，选用100nM的初始蛋白浓度做后续的实验。

11)取50μl蛋白PBST稀释成400nM与50μL染料(100nM)，混匀，室温孵育30min。

12)取10μl的多肽(100μM)到PCR管中(第1管)，每次取用5μl用PBST以1：1稀释多肽，依次按此比例稀释到15个管(共16管)。

13)取3μl的蛋白/染料混合液于PCR管中，加入3μl的16种不同浓度的多肽，混匀。此时蛋白浓度为100nM/μl；第1管多肽浓度为10μM/μl。

14)用毛吸管吸取样品后上机检测，仪器设置为80％ LED/excitation power及medium MST power。

15)使用MO.Control或MO.Affinity Analysis软件，通过Kd拟合模式计算Kd。

结果表明见表1和图1，其中A5(TVRTAAD)无法拟合。

表1EDB-FN相关多肽与EDB-FN蛋白的亲和力

可以看出，线性多肽EDBp(AVRTSAD)与EDB-FN的亲和力最强且远高于其他7条多肽，其Kd值为14.4±1.4nM，也远高于ZD2(CTVRTSADC)(Kd值为4839.7±361.7nM)；除了A1，与ZD2相比，3个肽段(A2、A4和A7)与EDB-FN的亲和力高于ZD2，3个肽段(A3、A5和A6)与EDB-FN的亲和力低于ZD2。

实施例2

1、通过流式细胞术检测人源性甲状腺未分化癌细胞株BHT-101与EDBp多肽的结合力，具体操作如下：

1)将肿瘤细胞种植到12孔板中，9个复孔，加入培养液在细胞培养箱中放置24小时，使细胞贴壁生长。

2)其中3个复孔(阻断组0.1uM Cy5-EDBp(其结构式见图2B)+20uM EDBp(其结构式见图2A))加入20uM的EDBp多肽到细胞中，混匀，放入37℃培养箱中孵育1小时。

3)吸走含多肽的培养基，用PBS洗涤细胞3次，500μl/次。

4)细胞用胰酶消化，培养基重悬，300g离心5分钟。

5)其中2)的3个复孔(阻断组)及另外3个复孔(非阻断组0.1uM Cy5-EDBp)加入0.1uM的Cy5-EDBp(其结构式见图2B)到细胞中，混匀，放入37℃培养箱中孵育1小时。

6)最后3个复孔(对照组)不做处理。

7)用PBS洗涤细胞3次，500μl/次；1000g离心5分钟/次。

8)弃上清留细胞沉淀，500μl生理盐水重悬细胞，放入流式管中。

9)流式机选择Cy5通道，FlowJo V10分析结果。

结果表明，Cy5-EDBp能成功的特异性结合到肿瘤细胞中，同时能被EDBp多肽部分特异性阻断(图3A)。

2、共聚焦细胞免疫荧光研究EDB-FN在肿瘤细胞定位情况，具体操作如下：

用10％多聚甲醛固定细胞，用BC-1抗体(Abcam,ab154210/1:200)和Cy5-EDBp(1μM)孵育切片，检测EDB-FN表达和EDBp的结合能力。加二抗(GB25301 1:400)。洗涤后，切片用DAPI(Servicebio,G1012)染色。所有荧光图像均使用尼康荧光显微镜(Nikon ECLIPSE C1)获得，使用尼康成像系统(Nikon DS-U3)采集图像(图3B)。可以看到Cy5-EDBp可以定位肿瘤细胞内的EDB-FN。

实施例3EDBp与高表达EDB-FN肿瘤的体内靶向性检测

通过近红外荧光成像，检测EDBp在ATC原位荷瘤小鼠中的肿瘤靶向性，具体操作如下：

1)在小动物近红外荧光成像中，将100μl含1000mM的EDBp多肽尾静脉注射到ATC原位荷瘤小鼠(阻断组)体内循环1小时后；

2)将2μl浓度为1mM荧光探针Cy5-EDBp(其结构式见图2B)尾静脉注射到步骤1)中的小鼠(阻断组)和新的ATC原位荷瘤小鼠体内(非阻断组)，体内循环1小时后，观察在原位荷瘤小鼠的体内分布。

3)使用IVIS 200 Imaging System荧光成像。

结果显示，Cy5-EDBp在ATC原位荷瘤小鼠肿瘤组织中高摄取，而在阻断组肿瘤中则未见明显摄取(图3C)。体外荧光成像显示，未阻断组有较强的荧光信号，阻断组无荧光信号，采集的其他器官仅肾有较强的荧光信号(图3D)。

通过小动物PET/CT，检测EDBp在ATC原位荷瘤小鼠中的肿瘤靶向性，具体操作如下：

1)将100μg的Lys(NOTA)-PEG4-EDBp(后续简称EDBp)，6.275μg的AlCl₃.6H₂O，330μl的无水乙醇或乙腈，5μl的冰醋酸，65μl活度约3mCi的¹⁸F离子水，混匀，使pH约为4，置于10ml真空玻璃瓶中。

2)100℃金属浴中加热10min，后室温放置5分钟。

3)Waters Sep Pak C18柱子活化，用10ml无水乙醇洗涤，后用20ml灭菌水洗涤。

4)往玻璃瓶中加入10ml灭菌水，混匀，转移至活化后的C18柱子中，20ml灭菌水洗涤。

5)400μl无水乙醇洗脱，氮吹仪将无水乙醇蒸发，加300μl生理盐水溶解。

6)取10μCi¹⁸F-EDBp进行HPLC检查，进行质控。

7)取约100μCi¹⁸F-EDBp分别尾静脉注射到每只小鼠体内(n＝10)，6只小鼠循环1小时处死解剖，4只小鼠循环2小时处死解剖，伽马计数仪检测不同器官计数情况(图4)。

8)阻断组荷瘤小鼠(n＝6)EDBp多肽约1000倍阻断(将100μl含8000mM的EDBp多肽尾静脉注射到ATC原位荷瘤小鼠体内循环1小时后)，取约100μCi18F-EDBp分别尾静脉注射到每只小鼠体内；非阻断组荷瘤小鼠(n＝6)不做处理，取约100μCi¹⁸F-EDBp分别尾静脉注射到每只小鼠体内，1小时处死解剖两组小鼠，伽马计数仪检测不同器官计数情况。

图4A为¹⁸F-EDBp静脉注射1小时和2小时后在小鼠主要组织和肿瘤中的生物分布；图4B为1小时和2小时肿瘤与器官的比例；图4C为¹⁸F-EDBp在未阻断组和阻断组的主要组织和肿瘤组织中的生物分布。

结果说明：¹⁸F-EDBp对移植瘤具有很强的敏感性和特异性，途径肝肠代谢，主要经过泌尿系统排泄。

9)阻断组荷瘤小鼠EDBp多肽约1000倍阻断(将100μl含8000mM的EDBp尾静脉注射到ATC原位荷瘤小鼠体内循环1小时后)，非阻断组荷瘤小鼠不做处理，取约100μCi¹⁸F-EDBp分别尾静脉注射到每只小鼠体内；1小时后，异氟烷麻醉小鼠，放入检测舱，进行PET/CT成像。

结果显示，¹⁸F-EDBp在肿瘤组织分布具有明显优势，¹⁸F标记的EDBp的肿瘤摄取清晰可见，对照组(阻断组)未见摄取(图5A、图5B)。小动物近红外成像和PET/CT的结果均在体内证明了EDBp在小鼠体内的靶向性和特异性。图5C为ATC原位荷瘤小鼠颈部肿瘤组织HE染色及BC-1抗体免疫组化结果。

实施例4通过肿瘤变化情况和生存分析，评价¹⁷⁷Lu标记的Lys(DOTA)-PEG4-EDBp(后续简称为EDBp)在BHT-101原位荷瘤小鼠中的抑制肿瘤作用

具体操作如下：

将人源性甲状腺未分化癌原位荷瘤小鼠分成四个治疗组：

A组：生理盐水组(治疗第1天150μl生理盐水尾静脉注射体内)；

B组：EDBp组(治疗第1天150μl/10μg EDBp尾静脉注射体内)；

C组：白蛋白紫杉醇组(ABRAXANE)(治疗时每周3次腹腔注射白蛋白紫杉醇，连续2周，剂量为15mg/Kg)；

D组：¹⁷⁷Lu-EDBp组(治疗第1天150μl/200μCi¹⁷⁷Lu-EDBp尾静脉注射体内)。

¹⁷⁷Lu-EDBp获得方法如下：

1)将1.35mCi¹⁷⁷LuCl₃加入到100μL含有100μM EDBp的溶液中，用0.1M醋酸钠将溶液pH调节成5，95℃反应10min。

2)95℃金属浴中加热10min，后室温放置5分钟。

3)Waters Sep Pak C18柱子活化，用10ml无水乙醇洗涤，后用20ml灭菌水洗涤。

4)往玻璃瓶中加入10ml灭菌水，混匀，转移至活化后的C18柱子中，20ml灭菌水洗涤。

5)400μl无水乙醇洗脱，氮吹仪将无水乙醇蒸发，加300μl生理盐水溶解。

6)取10μCi¹⁷⁷Lu-EDBp进行HPLC检查，进行质量监控。

7)取约200μCi¹⁷⁷Lu-EDBp，尾静脉注射到小鼠体内。

8)每隔2天用游标卡尺测量肿瘤大小及小鼠体重，将D组¹⁷⁷Lu-EDBp治疗组和A组(生理盐水组)；B组(EDBp组)；C组(ABRAXANE)作对比。

10)小鼠死亡或者肿瘤长径1.5cm时终止实验，进行生存分析。

结果见图6，图6A为生理盐水治疗组每只小鼠肿瘤体积随时间变化趋势；图6B为EDBp治疗组每只小鼠肿瘤体积随时间变化趋势；图6C为ABRAXANE治疗组每只小鼠肿瘤体积随时间变化趋势；图6D为¹⁷⁷Lu-EDBp治疗组每只小鼠肿瘤体积随时间变化趋势；图6E为不同治疗组在第1天到第7天的肿瘤体积变化；图6F为不同治疗组第1天到第15天的肿瘤体积变化；图6G为不同治疗组小鼠在治疗第1天至第15天体重变化；图6H图为不同治疗组生存分析。

结果显示，¹⁷⁷Lu-EDBp组小鼠肿瘤生长缓慢，生存期最长。除了证明了EDBp在小鼠体内的靶向性和特异性外，还证明了¹⁷⁷Lu-EDBp治疗的靶向性。

实施例5通过放射自显影技术检测¹⁸F-EDBp与不同病理类型甲状腺癌组织切片结合情况，后期实现EDBp靶点应用的临床转化

1)放射性药物的准备：同上

2)取放射性标记并质控合格的药物¹⁸F-EDBp，加入到1％BSA+Tris-HCl缓冲液(170nmol/L；pH8.2)中配制成可供孵育的溶液(¹⁸F-EDBp按20μCi/mL浓度进行配制)。

3)上述溶液配制体积按每切片0.4mL进行配制。

4)取出已水化后的切片放置在一张A4纸上，并做好标记。

5)用1mL移液枪移取约0.3-0.4mL的核素溶液，缓慢滴加在切片组织上，并使得液体覆盖住全部切片组织，同时避免液体沾污到非切片组织区域，室温下孵育1h。

6)孵育完成后，镊子夹持切片上端(切片编号端)，切片组织面朝上倾斜切片至45度角，使得液体沿下端流走，然后用1mL移液枪每次移取1mL超纯水，轻轻冲洗切片组织(重复6次)，然后再用同样的方法移取1％BSA+Tris-HCl缓冲液(170nmol/L；pH8.2)轻轻冲洗切片组织(重复2次)，清洗完成后用纸巾轻轻擦干组织周围的液体。

7)60℃烤箱切片烘烤至白色状态，磷屏压屏2小时，用Typhoon FLA7000IP(GE)扫描，像素尺寸为100μm,PMT为1000。数据采用ImageQuant TL8.1软件进行处理分析。

结果见图7，图7A为不同病理类型人甲状腺癌石蜡切片；图7B为不同病理类型人甲状腺癌组织切片¹⁸F-EDBp放射自显影；图7C为不同病理类型人甲状腺癌组织HE染色；图7D为EDB-FN在人不同病理类型甲状腺癌中的免疫组化结果；图7E为箭头指向位置免疫组化结果(×400)。

结果说明¹⁸F-EDBp可以与人不同病理类型甲状腺癌组织特异性结合，为EDBp在人甲状腺癌显像和治疗中的应用提供理论基础。

实施例6¹⁸F-EDBp在甲状腺癌患者中人体显像初步了解及该探针临床转化情况

1)¹⁸F-EDBp PET扫描不需要特殊患者准备。

2)1号患者静脉注射(剂量为4.07±0.1MBq/kg，共296MBq)后5min和45min，2号患者静脉注射(剂量为3.7±0.1MBq/kg，共281.2MBq)后1h，在Biograph 64PET/CT扫描仪(西门子)上进行扫描。

3)在3D模式下获得全身(头顶到大腿)PET/CT图像(每个床位2分钟)。在螺旋模式下进行连续低剂量CT扫描，设置条件为120kV,170mAs，切片厚度2mm，螺距0.8。

4)通过多模态工作站(Syngo.via；西门子医疗系统)进行图像分析并测量ROIs。

图8为甲状腺癌患者原发病灶和转移灶的PET/CT成像。图8A为颈部甲状腺病灶在静脉注射¹⁸F-EDBp 5min和45min后的PET和PET/CT成像，显示双侧甲状腺癌组织中¹⁸F-EDBp浓聚，SUVmax值分别为3.9(5min)和2.4(min)；图8B为静脉注射¹⁸F-EDBp后60min时躯干最大强度投影(MIP)图像，显示¹⁸F-EDBp在肾脏、尿管和膀胱积聚；PET和PET/CT成像显示T11和双侧髂骨转移灶中¹⁸F-EDBp浓聚，SUVmax值为3.4。

上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种EDB-FN靶向多肽，其基序如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQIDNO.8任一项所示。

2.一种缀合物，包含权利要求1所述的靶向多肽和功能性部分。

3.根据权利要求2所述的缀合物，其特征在于，所述缀合物中含有至少一个拷贝的靶向多肽。

4.根据权利要求2所述的缀合物，其特征在于，所述功能性部分包含显像剂和/或治疗剂。

5.根据权利要求4所述的缀合物，其特征在于，显像剂包含FB基团、诊断用放射性核素、生物素、荧光团、荧光蛋白、抗体、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶中的至少一种；优选地，所述治疗剂包含治疗用放射性核素、促凋亡肽、纳米颗粒、化学治疗剂、纳米微滴、脂质体药物和细胞因子中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的缀合物，其特征在于，所述放射性核素通过螯合剂标记所述靶向多肽，所述诊断用放射性核素包含⁹⁹Tc、⁶⁸Ga、¹⁸F、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹In、⁶⁷Ga、⁶⁴Cu、⁸⁹Zr、¹¹C、¹⁷⁷Lu和¹⁸⁸Re中的至少一种；优选地，所述治疗用放射性核素包含¹⁷⁷Lu、⁹⁰Y、²²⁵Ac、²¹¹As、²¹²Bi、²¹³Bi、¹³⁷Cs、⁵¹Cr、⁶⁰Co、¹⁶⁵Dy、¹⁶⁹Er、²⁵⁵Fm、¹⁹⁸Au、¹⁶⁶Ho、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁹²Ir、⁵⁹Fe、²¹²Pb、⁹⁹Mo、¹⁰³Pd、³²P、⁴²K、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²²³Ra、¹⁰⁶Ru、²⁴Na、⁸⁹Sr、¹⁴⁹Tb、²²⁷Th、¹³³Xe、¹⁶⁹Yb和¹⁷⁷Yb中的至少一种；优选地，所述螯合剂包含HYNIC、DOTA、NOTA、DTPA中的至少一种。

7.根据权利要求2所述的缀合物，其特征在于，所述缀合物中的各部分直接连接和/或通过连接头连接。

8.权利要求1所述的靶向多肽或权利要求2～7任一项所述的缀合物的相关生物材料：所述相关生物材料为下述(A1)～(A8)中的任一种：

(A1)编码权利要求1所述的靶向多肽或权利要求2～7任一项所述的缀合物的核酸分子；

(A2)含有(A1)所述核酸分子的表达盒；

(A3)含有(A1)所述核酸分子的重组载体；

(A4)含有(A2)所述表达盒的重组载体；

(A5)含有(A1)所述核酸分子的重组细胞；

(A6)含有(A2)所述表达盒的重组细胞；

(A7)含有(A3)所述重组载体的重组细胞；

(A8)含有(A4)所述重组载体的重组细胞。

9.权利要求1所述的靶向多肽或权利要求2～7任一项所述的缀合物或权利要求8所述的相关生物材料在制备疾病的靶向筛查、诊断、治疗或预后评估产品中的应用，优选的，所述疾病为EDB-FN异常表达的疾病，更优选为胸腺瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤、胰腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、胆管癌、头颈部鳞癌、皮肤黑色素瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、胃癌、肉瘤、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、肝癌、肾透明细胞癌、胶质瘤、食管癌、肾上腺皮质癌。

10.一种产品，其特征在于，所述产品中包含权利要求1所述的靶向多肽或权利要求2～7任一项所述的缀合物或权利要求8所述的相关生物材料。

Images