CN113817021A - 一种整合素α6靶向多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种整合素α6靶向多肽及其应用，其基序为RWYD，所述多肽具有更强的亲和力，平衡解离常数KD达到nM级别，亲和力获得极大提升，对整合素α6具有很强的亲和力，特异性强，无生物毒性，其在体内较为稳定且分布合理，可以作为靶向载体，整合素α6靶向多肽也可以作为分子探针应用于多种整合素α6高表达肿瘤的分子成像中。还提供了其二聚体，具有更显著的靶向作用，无生物毒性。整合素α6靶向多肽可应用于多种整合素α6高表达肿瘤的分子成像中在肿瘤分子成像中具有重要应用价值。
Description
技术领域
本发明属于靶向肽技术领域，具体涉及一种整合素α6靶向多肽及其应用。
背景技术
整合素是一种膜蛋白，胞膜外区域较大，有利于分子探针的接近和结合，因此是肿瘤分子成像以及肿瘤靶向性治疗的理想靶点。整合素由18种α亚基和8种β亚基组合形成24种异源二聚体。在肿瘤中过表达的整合素，主要包括αvβ3，αvβ5，α5β1，α4β1，α2β1，α3β1，αvβ6，α6β4和α6β1。其中以整合素αvβ3为靶点的RGD多肽分子探针以及肿瘤靶向治疗药物研究最为广泛。整合素αvβ3在肿瘤新生血管中过表达而在正常组织血管中低表达，因此RGD多肽分子探针可以判断肿瘤血管新生的情况。目前，研究人员成功研发了多种RGD多肽放射性核素分子探针、磁共振分子探针、超声分子探针和光学分子探针。这些RGD多肽分子探针有相当一部分进入临床实验，并在肿瘤病人中取得了良好的成像效果。
整合素α6在体内以α6β4和α6β1二聚体形式存在，整合素α6亚基在多种肿瘤中过表达，其中包括乳腺癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、食管癌、胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌、头颈部肿瘤、鼻咽癌、宫颈癌、胃癌、肾癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤。整合素α6在肿瘤细胞的迁移、侵袭和增值中发挥重要的作用。同时，GEPIA数据库显示，整合素α6表达水平越高的肿瘤患者，总体生存率和无病生存率均较差。因此，整合素α6是肿瘤诊断和预后评价的重要标记物，开发以整合素α6为靶点的多肽诊断试剂，对肿瘤的诊断有着重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的整合素α6靶向多肽及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种整合素α6靶向多肽，其基序为RWYD(SEQ IN NO：1)。
在本发明的一些实施方式中，所述氨基酸包括L型氨基酸和D型氨基酸。
本发明的第二个方面，提供一种整合素α6靶向多肽多聚体，由本发明第一方面所述多肽单体聚合而成。
在本发明的一些实施方式中，所述多肽连接有连接剂。
在本发明的一些优选实施方式中，所述连接剂为以下(I)～(II)中至少一种：
(I)多元醇；
(II)氨基酸。
在本发明的一些实施方式中，所述多元醇为甘油、季戊四醇、木糖醇、山梨醇、聚乙二醇。
在本发明的一些优选实施方式中，所述多元醇为聚乙二醇。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述多元醇为聚合度为3～12的聚乙二醇。
在本发明的一些实施方式中，所述氨基酸的数量为3～8个。
在本发明的一些实施方式中，所述氨基酸为任意氨基酸，优选为赖氨酸。
在本发明的一些实施方式中，所述连接剂连接于多肽的C端。
在本发明的一些优选实施方式中，所述多聚体为二聚体。
本发明的第三方面，提供本发明第一方面所述多肽或本发明第二方面所述多聚体在靶向筛查、诊断、治疗或预后评估试剂中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述靶向试剂为肿瘤靶向试剂。
在本发明的一些优选实施方式中，所述肿瘤为整合素α6高表达的肿瘤。
在本发明的一些优选实施方式中，所述肿瘤优选为肝癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、食管癌、胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌、头颈部肿瘤、鼻咽癌、宫颈癌、胃癌、肾癌、嗜铬细胞瘤或副神经节瘤。
在本发明的一些实施方式中，所述应用还可以为适用于临床术中导航NIRF区光学成像、磁共振成像(MRI)，正电子发射成像(PET)或单光子发射成像(SPET)。
本发明的第四个方面，提供一种靶向试剂，包含本发明第一方面所述多肽或本发明第二方面所述多聚体。
在本发明的一些实施方式中，所述靶向试剂还包含显像剂和/或治疗剂。
在本发明的一些优选实施方式中，所述显像剂为FB基团、放射性核素、生物素、荧光团、荧光蛋白、抗体、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶中的至少一种。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述显像剂为放射性核素。
在本发明的一些实施方式中，所述核素通过螯合剂标记本发明第一方面所述多肽或本发明第二方面所述多聚体。
在本发明的一些优选实施中，所述放射性核素为18F、99Tc、68Ga、64Cu、111In或177Lu。
在本发明的一些实施方式中，所述螯合剂为HYNIC、DOTA、NOTA或DTPA。
在本发明的一些实施方式中，述治疗剂为放射性核素、促凋亡肽、纳米颗粒、化学治疗剂、纳米微滴、脂质体药物和细胞因子的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述靶向制剂为药物。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型为注射液、颗粒剂、口服液剂、气雾剂、胶囊剂或喷雾剂。
在本发明的一些实施方式中，所述药物的给药途径为静脉、动脉、腔内、皮下或鞘内注射。
在本发明的一些实施方式中，所述靶向试剂为肿瘤靶向试剂。
在本发明的一些优选实施方式中，所述肿瘤为整合素α6高表达的肿瘤。
在本发明的一写更优选实施方式中，所述肿瘤为肝癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、食管癌、胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌、头颈部肿瘤、鼻咽癌、宫颈癌、胃癌、肾癌、嗜铬细胞瘤或副神经节瘤。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种突变体RWYD，其对整合素α6具有更强的亲和力，平衡解离常数KD达到nM级别，亲和力获得极大提升，对整合素α6具有很强的亲和力，特异性强，无生物毒性，其在体内较为稳定且分布合理，可以作为靶向载体，整合素α6靶向多肽可以作为分子探针应用于多种整合素α6高表达肿瘤的分子成像中，如临床术中导航NIRF区光学成像、磁共振成像MRI，正电子发射成像PET和单光子发射成像SPET等，在肿瘤分子成像中具有重要应用价值。
本发明还提供了其二聚体RD2，并且通过细胞流式结合实验、小鼠体内的近红外成像和PET/CT，也充分地验证了二聚体RD2对高表达整合素α6的肿瘤具有更显著的靶向作用。基于REWD和RD2，本发明还提供了一种靶向试剂，包含RWYD或RD2，还包显像剂和/或治疗剂，起到更好的肿瘤诊断与治疗的作用，显像剂标记相应的多肽，具有更好的稳定性，达到了更好的诊断效果。
附图说明
图1为RWYD及其分子成像剂的结构式。A图为RWYD的结构式；B图为RWYD-PEG4-K-FITC的结构式；C图为RWYD-PEG4-K(ICG)-K(NOTA)的结构式；D图为RWYD-PEG4-K-NOTA的结构式；E图为(RWYD-PEG4)2-K-K-FITC的结构式；F图为(RWYD-PEG4)2-K-K-NOTA的结构式。
图2为RWYD与整合素α6β4或α6β1的强亲和力。A图为RWYD与整合素α6β4的亲和力；B图为RWYD与α6β1的亲和力。
图3为RWYD与高表达整合素α6肿瘤细胞的强亲和力。A图为整合素α6在HCCLM3细胞中的表达情况；B图为整合素α6在Huh-7细胞中的表达情况；C图为整合素α6在Hep3B细胞中的表达情况；D图为整合素α6在S18细胞中的表达情况；E图为整合素α6在MDA-MB-231细胞中的表达情况；F图为整合素β4在HCCLM3细胞中的表达情况；G图为整合素β4在Huh-7细胞中的表达情况；H图为整合素β4在Hep3B细胞中的表达情况；I图为整合素β4在S18细胞中的表达情况；J图为整合素β4在MDA-MB-231细胞中的表达情况；K图为RWY、RD与高表达整合素α6的HCCLM3细胞的亲和力；L图为RWY、RD与高表达整合素α6的Huh7细胞的亲和力；M图为RWY、RD与Hep3B细胞的亲和力；N图为RWY、RD与高表达整合素α6的S18细胞的亲和力；O图为RWY、RD与高表达整合素α6的MDA-MB-231细胞的亲和力。
图4为RWYD对高表达整合素α6肿瘤的体内靶向性。A图为RWYD-PEG4-ICG在高表达整合素α6的HCCLM3皮下肿瘤中高摄取；B图为RWYD-PEG4-ICG在不表达整合素α6的Hep3B的皮下肿瘤中则不高摄取；C图为18F-RWY标记的肿瘤摄取情况；D图为18F-RD标记的肿瘤摄取情况。
图5为RD、RD2与高表达整合素α6肿瘤细胞的强亲和力。A图为RD、RD2与HCCLM3细胞的亲和力；B图为RD、RD2与S18细胞的亲和力；C图为RD、RD2与HT29细胞的亲和力；D图为RD、RD2与Huh7细胞的亲和力；E图为RD、RD2与MDA-MB-231细胞的亲和力；F图为RD、RD2与KYSE30细胞的亲和力；G图为RD、RD2与Hep3B细胞的亲和力；H图为RD、RD2与SW620细胞的亲和力；I图为RD、RD2与SW1990细胞的亲和力。
图6为RD2对高表达整合素α6肿瘤的体内靶向性。A图为RD与整合素α6β4的亲和力；B图为RD2与整合素α6β4的亲和力；C图为HCCLM3皮下肝癌小鼠中，18F-RD2在肿瘤处摄取情况；D图为在HCCLM3原位肝癌小鼠模型中，18F-RD在肿瘤处摄取情况；E图为在HCCLM3原位肝癌小鼠模型中，18F-RD2在肿瘤处摄取情况。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1多肽突变体与整合素α6的亲和力检测
作为整合素α6靶向多肽的进一步改进，氨基酸基序选自：CRWYDENAC、CAWYDENAC、CRAYDENAC、CRWADENAC、CRWYAENAC、CRWYDANAC、CRWYDEAAC、RWYDENA、RWYDEN、RWYDANA、RWYDAN、RWYDEA、RWYDE、RWYDA、RWYD、RWYAEN、RWYAE和RWY。其中CRWYDENAC、CAWYDENAC、CRAYDENAC、CRWADENAC、CRWYAENAC、CRWYDANAC、CRWYDEAAC是通过两端半胱氨酸C形成的环肽，RWYDENA、RWYDEN、RWYDANA、RWYDAN、RWYDEA、RWYDE、RWYDA、RWYD、RWYAEN、RWYAE和RWY为直链肽。
通过微量热泳动(microscale thermophoresis，MST)法，检测这18条多肽与整合素α6β4的亲和力，具体操作如下：
1)整合素α6β4蛋白溶解成800nM，多肽溶解成100μM。
2)使用MO系列RED-tris-NTA蛋白标记试剂盒，将RED-tris-NTA二代染料稀释成100nM。
3)取100μlα6β4蛋白与50μl染料混匀，室温孵育30min，使α6β4蛋白与染料结合。
4)取10μl的多肽到PCR管中，用PBST(含0.05％吐温20)以1：1稀释多肽，稀释成16个浓度梯度。
5)取3μl的蛋白/染料混合液于PCR管中，分别加入3μl的16种不同浓度的多肽，混匀。
6)用毛细管吸取混合液上机检测(仪器型号Monolith NT.115)，参数设置为80％LED/excitation power及medium MST power。
7)使用MO.Affinity Analysis软件，通过KD拟合模式计算α6β4蛋白与多肽平衡解离常数KD。
结果表明，线性4元多肽RWYD(其结构式见图1A)与整合素α6β4的亲和力最强且远高于其他17条多肽，其KD为21.82±3.86nM(图2A)，远大于CRWYDENAC的6.97±1.44μM，亲和力相对于CRWYDENAC(简称RWY)增加了327倍(表1)。进一步的，RWYD与整合素α6β1也具有很强的亲和力，KD为53.14±28.69nM(图2B)。
表1多肽突变体与整合素α6β4的亲和力检测
实施例2突变体RWYD(简称RD)与高表达整合素α6肿瘤细胞的亲和力检测
通过流式术检测人源性肝癌细胞HCCLM3、人源性肝癌细胞Huh-7、人源性肝癌细胞Hep3B、人源性鼻咽癌细胞S18和人源性乳腺癌细胞MDA-MB-231的整合素α6和β4的表达情况。结果表明，整合素α6表达于HCCLM3、Huh-7、S18和MDA-MB-231细胞(图3A、图3B、图3D、图3E)；整合素β4表达于HCCLM3、S18和MDA-MB-231细胞(图3F、图3G、图3I、图3J)；而Hep3B不表达α6和β4(图3C、图3H)。通过流式细胞术检测肿瘤细胞与突变体RWYD的亲和力，具体操作如下：
1)将肿瘤细胞种植到12孔板中，加入培养液在细胞培养箱中放置24小时，使细胞贴壁生长，每种细胞3个复孔。
2)加入2μl浓度为1mM的RWYD-PEG4-K-FITC(其结构式见图1B，简称RD)或CRWYDENAC-PEG4-K-FITC(简称RWY)到细胞中，混匀，放入37℃培养箱中孵育2小时。
3)吸走含多肽的培养基，用PBS洗涤细胞3次，500μl/次。
4)细胞用胰酶消化，培养基重悬，300g离心5分钟。
5)弃上清留细胞沉淀，500μl生理盐水重悬细胞，放入流式管中。
6)流式机检测FITC通道，CytExpert分析结果。
结果表明，RD相比于RWY，与高表达整合素α6的肿瘤细胞具有更强的亲和力(图3K、图3L、图3N、图3O)；而RD或RWY与不表达整合素α6的Hep3B细胞的亲和力一致(图3M)。
实施例3RD与高表达整合素α6肿瘤的体内靶向性检测
在小动物近红外成像中，将2μl浓度为1mM荧光探针RWYD-PEG4-K(ICG)-K(NOTA)(其结构式见图1C)尾静脉注射到HCCLM3皮下荷瘤小鼠体内，体内循环24小时后，观察在皮下荷瘤小鼠的体内分布。结果显示，RWYD-PEG4-K(ICG)-K(NOTA)在高表达整合素α6的HCCLM3皮下肿瘤中高摄取(图4A)，而在不表达整合素α6的Hep3B的皮下肿瘤中则不高摄取(图4B)。
通过小动物PET/CT，检测RD在HCCLM3原位肝癌小鼠中的肿瘤靶向性，具体操作如下：
1)将100μg的RWYD-PEG4-K-NOTA(其结构式见图1D)，6.275μg的AlCl3·6H20，330μl的无水乙醇或乙腈，5μl的冰醋酸，65μl活度约3mCi的18F离子水，混匀，使pH约为4，置于10ml真空玻璃瓶中。
2)100℃金属浴中加热10min，后室温放置5分钟。
3)Waters Sep-Pak C18柱子活化，用10ml无水乙醇洗涤，后用20ml灭菌水洗涤。
4)往玻璃瓶中加入10ml灭菌水，混匀，转移至活化后的C18柱子中，20ml灭菌水洗涤。
5)400μl无水乙醇洗脱，氮吹仪将无水乙醇蒸发，加300μl生理盐水溶解。
6)取10μCi进行HPLC检查，进行质量监控。
7)取约100μCi，尾静脉注射到小鼠体内。
8)1小时后，异氟烷麻醉小鼠，放入检测舱，进行PET/CT成像。
结果显示，18F标记的RWYD-PEG4-K-NOTA(简称18F-RD)的肿瘤摄取清晰可见，明显好于18F标记的CRWYDENAC-PEG4-K-NOTA(简称18F-RWY)，除了肾脏和膀胱有少量摄取，其它脏器的背景较低(图4C、图4D)。小动物近红外成像和PET/CT的结果均在体内证明了突变体RD相比于RWY具有更强的整合素α6靶向性和特异性。
实施例4二聚体RWYD(简称RD2)与高表达整合素α6肿瘤细胞的亲和力检测
RWYD-PEG4通过赖氨酸(K)连接形成二聚体或多倍体。通过流式细胞术，检测了肿瘤细胞整合素α6的表达情况，结果显示，HCCLM3、Huh-7、S18、MDA-MB-231、人源性结直肠腺癌细胞SW620、人源性结肠腺癌细胞HT29、人源性食管鳞癌细胞KYSE30和人源性胰腺癌细胞SW1990都高表达整合素α6，而Hep3B不表达整合素α6。流式细胞术检测肿瘤细胞与RD2的亲和力，其具体操作与“流式细胞术检测肿瘤细胞与RD的亲和力”相似。结果显示，(RWYD-PEG4)2-K-K-FITC(其结构式见图1E)相比于RWYD-PEG4-K-FITC，与高表达整合素α6的肿瘤细胞具有更强的亲和力(图5A-图5F、图5H-图5I)；而RD2或RD与不表达整合素α6的Hep3B细胞的亲和力相近(图5G)。此结果在细胞水平上证明了RD可以通过构建二聚体RD2或多倍体，增加其与整合素α6的亲和力。
实施例5二聚体RD2与高表达整合素α6肿瘤的体内靶向性检测
通过MST法，测得(RWYD-PEG4)2-K-K-NOTA(其结构式见图1F)与整合素α6β4具有更强的亲和力，其KD为64.83±28.16nM(图6B)，远大于RWYD-PEG4-K-NOTA的642.38±260.52nM(图6A)，亲和力增加了约10倍。通过小动物PET/CT，检测RD2在HCCLM3皮下肝癌小鼠和原位肝癌小鼠的肿瘤靶向性，其具体操作与“检测RD在HCCLM3原位肝癌小鼠中的肿瘤靶向性”相似。在HCCLM3皮下肝癌小鼠中，18F标记的(RWYD-PEG4)2-K-K-NOTA(简称18F-RD2)在肿瘤处摄取清晰可见(图6C)。在HCCLM3原位肝癌小鼠模型中，18F-RD2在肿瘤处的摄取效果明显好于18F-RD，除了肾脏和膀胱有少量摄取，其它脏器的背景更低(图6D、图6E)。此结果在荷瘤小鼠模型中证明了二聚体RD2与整合素α6具有很强的亲和力，在高表达整合素α6的肿瘤中具有很强的分子靶向效果。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学、中山大学肿瘤防治中心(中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所)
<120> 一种整合素α6靶向多肽及其应用
<130>
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
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1
Claims (10)
1.一种整合素α6靶向多肽，其基序为RWYD。
2.一种整合素α6靶向多肽多聚体，由权利要求1所述多肽单体聚合而成。
3.根据权利要求2所述的多聚体，其特征在于，所述多肽连接有连接剂，所述连接剂优选为以下(I)～(II)中至少一种：
(I)多元醇；
优选地，所述多元醇为甘油、季戊四醇、木糖醇、山梨醇、聚乙二醇；
更优选地，所述聚乙二醇为聚合度为3～12的聚乙二醇；
(II)氨基酸；
优选地，所述氨基酸的数量为3～8个；
更优选地，所述氨基酸为赖氨酸。
4.根据权利要求2～3任一项所述的多聚体，其特征在于，所述多聚体为二聚体。
5.权利要求1所述靶向多肽或权利要求2～4任一项所述多聚体在制备以下靶向筛查、诊断、治疗或预后评估试剂中的应用。
6.一种靶向试剂，包含权利要求1所述多肽或权利要求2～4任一项所述多聚体。
7.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包含显像剂和/或治疗剂。
8.根据权利要求7所述的试剂，其特征在于，所述显像剂为FB基团、放射性核素、生物素、荧光团、荧光蛋白、抗体、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶中的至少一种；优选地，所述治疗剂为放射性核素、促凋亡肽、纳米颗粒、化学治疗剂、纳米微滴、脂质体药物和细胞因子的至少一种。
9.根据权利要求8所述的试剂，其特征在于，所述核素通过螯合剂标记权利要求1所述多肽或权利要求2～4任一项所述多聚体，所述放射性核素优选为18F、99Tc、68Ga、64Cu、111In或177Lu；优选地，所述螯合剂为HYNIC、DOTA、NOTA或DTPA。
10.根据权利要求6～9任一项所述试剂，其特征在于，所述靶向试剂为肿瘤靶向试剂，所述肿瘤为整合素α6高表达的肿瘤，所述肿瘤优选为肝癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、食管癌、胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌、头颈部肿瘤、鼻咽癌、宫颈癌、胃癌、肾癌、嗜铬细胞瘤或副神经节瘤。
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