CN107987127A - 整合素α6靶向多肽及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了整合素α6靶向多肽及应用，多肽基序为RWYXXXA。本发明的整合素α6靶向多肽，对整合素α6具有很好的亲和力，其在体内较为稳定，可以作为靶向载体。整合素α6靶向多肽可以应用于多种整合素α6过表达肿瘤的分子成像，在肿瘤分子成像中具有重要应用价值。将本发明的多肽与分子成像探针偶联，可以对多种整合素α6过表达的肿瘤实现分子成像，可以很好应用于肿瘤诊断和筛选。
Description
技术领域
本发明涉及一类靶向肽及其应用，特别涉及整合素α6靶向多肽及应用。
背景技术
整合素是一种膜蛋白，胞膜外区域较大，有利于分子探针的接近和结合，因此是肿瘤分子成像以及肿瘤靶向性治疗的理想靶点。整合素由18种a亚基和8种β亚基组合形成24种异源二聚体。在肿瘤中过表达的整合素，主要包括αvβ3，αvβ5，α5β1，α4β1，α2β1，α3β1，αvβ6，α6β4和α6β1。其中以整合素αvβ3为靶点的RGD多肽分子探针以及肿瘤靶向治疗药物研究最为广泛。整合素αvβ3在肿瘤新生血管中过表达而在正常组织血管中低表达，因此RGD多肽分子探针可以判断肿瘤血管新生的情况。目前，研究人员成功研发了多种RGD多肽放射性核素分子探针、磁共振分子探针、超声分子探针和光学分子探针。这些RGD多肽分子探针有相当一部分进入临床实验，并在肿瘤病人中取得了良好的成像效果。
以α6β4和α6β1整合素为靶点的肿瘤分子成像以及肿瘤靶向性治疗的研究甚少。整合素α6亚基在多种肿瘤中过表达，其中包括乳腺癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、食管癌、胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌、头颈部肿瘤、鼻咽癌、宫颈癌、胃癌、肾癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤。因此，以整合素α6为靶点的多肽，可以应用于上述肿瘤的分子成像中。然而现有技术中，缺乏相应的靶向肽。开发相应的靶向肽，对肿瘤的诊断有着重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的整合素α6靶向多肽及应用。
本发明所采取的技术方案是：
整合素α6靶向多肽，其基序为RWYXXXA。
作为上述整合素α6靶向多肽的进一步改进，基序选自：RWYAENA、RWYDANA或RWYDEAA。
作为上述整合素α6靶向多肽的进一步改进，基序的C端和/或N端可选连接有1～3个氨基酸。
作为上述整合素α6靶向多肽的进一步改进，基序的两端分别连接有一个Cys。
作为上述整合素α6靶向多肽的进一步改进，多肽通过两端的Cys形成环肽。
一种靶向诊断或筛查试剂，包括显像剂，显像剂偶联有上述的整合素α6靶向多肽。
作为上述靶向诊断或筛查试剂的进一步改进，显像剂为分子成像剂。
作为上述靶向诊断或筛查试剂的进一步改进靶向诊断或筛查试剂为肿瘤靶向诊断或筛查试剂。
作为上述靶向诊断或筛查试剂的进一步改进，肿瘤为整合素α6过表达的肿瘤。
本发明的有益效果是：
本发明的整合素α6靶向多肽，对整合素α6具有很好的亲和力，其在体内较为稳定，可以作为靶向载体。整合素α6靶向多肽可以应用于多种整合素α6过表达肿瘤的分子成像中，在肿瘤分子成像中具有重要应用价值。
将本发明的多肽与分子成像探针偶联，可以对多种整合素α6过表达的肿瘤实现分子成像，可以很好应用于肿瘤诊断和筛选。
附图说明
图1是多肽与整合素α6β1的亲和力检测结果；
图2是多肽与整合素α6β4的亲和力检测结果；
图3是多肽与肿瘤细胞体外结合的实验结果；
图4是多肽在体内肿瘤富集情况的实验结果；
图5是多肽近红外线荧光成像结果；
图6是多肽正电子发射断层成像结果。
具体实施方式
整合素α6靶向多肽，其基序为RWYXXXA(SEQ ID NO：1)。
作为上述整合素α6靶向多肽的进一步改进，基序选自：RWYAENA(SEQ ID NO：2)、RWYDANA(SEQ ID NO：3)或RWYDEAA(SEQ ID NO：4)。
作为上述整合素α6靶向多肽的进一步改进，基序的C端和/或N端可选连接有1～3个氨基酸。
作为上述整合素α6靶向多肽的进一步改进，基序的两端分别连接有一个Cys。
作为上述整合素α6靶向多肽的进一步改进，多肽通过两端的Cys形成环肽。
上述多肽中的氨基酸，既可以是L型，也可以是D型的。
一种靶向诊断或筛查试剂，包括显像剂，显像剂偶联有上述的整合素α6靶向多肽。
作为上述靶向诊断或筛查试剂的进一步改进，显像剂为分子成像剂。分子成像剂包括但不限于99mTc，18F，Cy5和Gd。
作为上述靶向诊断或筛查试剂的进一步改进，靶向诊断或筛查试剂为肿瘤靶向诊断或筛查试剂，特别是整合素α6过表达的肿瘤。肿瘤包括但不限于乳腺癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、食管癌、胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌、头颈部肿瘤、鼻咽癌、宫颈癌、胃癌、肾癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤。
下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。下述实验中使用的多肽如下：
| 肽名称 | 多肽序列(斜体的两个C环化) | SEQ ID NO： |
| S1 | CAWYDENAC | 5 |
| S2 | CRAYDENAC | 6 |
| S3 | CRWADENAC | 7 |
| S4 | CRWYAENAC | 8 |
| S5 | CRWYDANAC | 9 |
| S6 | CRWYDEAAC | 10 |
| YDE | CRWYDENAC | 11 |
| C1 | CYWDANREC | 12 |
| Biotin-S1 | Biotin-CAWYDENAC | |
| Biotin-S2 | Biotin-CRAYDENAC | |
| Biotin-S3 | Biotin-CRWADENAC | |
| Biotin-S4 | Biotin-CRWYAENAC | |
| Biotin-S5 | Biotin-CRWYDANAC | |
| Biotin-S6 | Biotin-CRWYDEAAC | |
| Biotin-YDE | Biotin-CRWYDENAC | |
| Biotin-Scramble | Biotin-CYWDANREC | |
| Cy5-S5 | Cy5-CRWYDANAC |
数据分析：
数据相关结果应用统计软件SPSS16.0进行分析，(P<0.05时，有显著差异)。
多肽与整合素α6β1以及整合素α6β4的亲和力
采用表面等离子体共振技术分别检测多肽与整合素α6β1以及整合素α6β4的亲和力。发明人首先合成丙氨酸扫描点突变的整合素α6靶向多肽，然后应用SPR分别检测这些多肽与整合素α6β1以及整合素α6β4的亲和力。具体实验方法如下：
1)应用胺基偶联的方法，将整合素α6β1以及整合素α6β4分别固定于CM5芯片(GEHealthcare,BioSciences AB)上。首先将NHS和EDC按1：1体积比混合，上机10分钟，用于激活Biacore T100生物传感器葡聚糖表面，然后将10mM乙酸盐溶解的整合素α6β1以及整合素α6β4固定于激活的葡聚糖表面；
2)100μL乙醇胺封闭没有激活的葡聚糖表面；
3)应用含0.05％P20的PBS稀释丙氨酸扫描点突变的整合素α6靶向多肽，以每分钟30μL的速度注射于1分钟；
4)应用Biacore evaluation software version 2.0.3(Biacore T100)分析平衡解离常数(equilibrium dissociation constants，KD)。
实验结果如图1和图2所示。图1为多肽与整合素α6β1的亲和力，图2为多肽与整合素α6β4的亲和力。图1显示S1，S2和S3与整合素α6β1没有亲和力，S4与整合素α6β1结合的平衡解离常数为2.04x10-4，S5与整合素α6β1结合的平衡解离常数为2.27x10-5，S6与整合素α6β1结合的平衡解离常数为2.58x10-4，YDE与整合素α6β1结合的平衡解离常数为3.85x10-4；图2显示S1与整合素α6β4没有亲和力，S2与整合素α6β4结合的平衡解离常数为6.67x10-4，S3与整合素α6β4结合的平衡解离常数为7.77x10-4，S4与整合素α6β4结合的平衡解离常数为1.69x10-4，S5与整合素α6β4结合的平衡解离常数为1.80x10-4，S6与整合素α6β4结合的平衡解离常数为2.01x10-4，YDE与整合素α6β4结合的平衡解离常数为1.40×10-4。综合上述，与YDE多肽相比较，发明人发现S5多肽与整合素α6β1以及整合素α6β4亲和力更高。
多肽与肿瘤细胞体外结合能力
采用ELISA技术检测多肽与肿瘤细胞体外结合能力。发明人首先合成生物素标志的丙氨酸扫描点突变整合素α6靶向多肽，然后应用ELISA检测这些多肽与鼻咽癌细胞S18的结合能力。具体实验方法如下：
1)终浓度为10-4mol/L的生物素标志的丙氨酸扫描点突变整合素α6靶向多肽，加入生长于96孔板的鼻咽癌S18细胞中，37℃结合4小时；
2)使用含0.2％Tween-20的PBS冲洗96孔板6次，4％福尔马林固定15分钟，含0.2％Triton X-100的PBS破膜5分钟；
3)加入Streptavidin-HRP(1:3,000,Sigma)，室温孵育30分钟；
4)使用含0.2％Tween-20的PBS冲洗96孔板6次，加入100μL底物TMB，室温结合20-30分钟，加入100μL0.5M H2SO4终止反应；
5)吸收光波长为450nm检测OD值；
6)以不加多肽的孔作为空白对照(Blank)，按照下列公式计算相对结合能力：(突变多肽–空白对照)/(CRWYDENAC-空白对照)×100。
分别比较突变多肽S1，S2，S3，S4，S5以及S6与YDE多肽的细胞结合能力，实验结果如图3所示。发现S1，S2和S3的细胞结合能力明显降低，S4和S6的细胞结合能力变化不明显，S5的细胞结合能力明显增强。综合上述，发明人发现S5与肿瘤细胞结合的能力更强。
多肽在体内肿瘤富集情况
采用近红外线荧光成像技术检测多肽在体内肿瘤富集情况。发明人应用合成的丙氨酸扫描点突变的整合素α6靶向多肽，阻断近红外线荧光标志的整合素α6靶向多肽，间接检测它们体内肿瘤富集情况。具体实验方法如下：
1)将6μmol丙氨酸扫描点突变整合素α6靶向多肽与6nmol Cy5标志的整合素α6靶向多肽Cy5-YDE溶解于150μL生理盐水中，尾静脉注射于鼻咽癌S18荷瘤小鼠中，循环1小时后，进行近红外线荧光成像；
2)应用NightOWL II LB983系统(Berthold Technologies,Germany)进行近红外线荧光成像；
3)激发光波长为630nm，发射波长为680nm，样品大小为150nm，高度为15nm，曝光时间设为0.1s；
4)应用IndiGO软件进行检测，数据采集和分析。
实验结果如图4所示。分别比较突变多肽S1，S2，S3，S4，S5以及S6与YDE多肽的体内阻断能力，发现S1，S2和S3的体内阻断能力明显降低，S4，S5和S6的体内阻断能力无明显变化。
多肽近红外线荧光成像结果
采用近红外线荧光成像技术检测多肽在体内肿瘤富集情况。发明人合成Cy5-S5多肽,并将其通过尾静脉注射于荷瘤小鼠体内，通过近红外线荧光成像技术检测其在肿瘤中的富集情况。具体实验方法如下：
1)6nmol Cy5-S5多肽溶解于150μL生理盐水中，尾静脉注射于鼻咽癌S18荷瘤小鼠中，在不同时间点对小鼠进行近红外线荧光成像；
2)应用NightOWL II LB983系统(Berthold Technologies,Germany)进行近红外线荧光成像；
3)激发光波长为630nm，发射波长为680nm，样品大小为150nm，高度为15nm，曝光时间设为0.1s；
4)应用IndiGO软件进行检测，数据采集和分析。
实验结果如图5所示。Cy5-S5多肽在注射后6-24小时内，可以在肿瘤中明显富集。
多肽正电子发射断层成像结果
采用正电子发射断层成像(PET,Position Emission Tomography)检测多肽在体内肿瘤富集情况。发明人合成NOTA-S5多肽，并将其与18F离子螯合，形成适用于PET成像的分子探针18F-ALF-NOTA-S5。该分子通过尾静脉注射于肝癌小鼠模型中，通过PET成像技术检测其在肿瘤中的富集情况。具体实验方法如下：
1)1.5ml EP管分别加入如下液体，混匀，酸性pH试纸检测保证溶液在pH2-4，封口膜封闭；
2)100℃加热10分钟，冷却至室温；
3)C18柱子活化，加10ml乙醇活化，加20ml dH2O冲洗，20ml注射器吹干待用；
4)转移加热后液体至50ml EP管中，加入15ml dH2O，转移至活化后的C18柱子中；
5)20ml dH2O冲洗2次；；
6)1.5ml注射器400ul 10mM HCl乙醇洗脱；
7)取10μl应用HPLC检测，进行质量监控；
8)生理盐水稀释100uCi/只小鼠尾静脉进行注射；
8)注射后60分钟，进行PET成像；
实验结果如图6所示。18F-ALF-NOTA-S5在注射1小时内，可以在肿瘤中明显富集。
实验结果表明，本发明的整合素α6靶向多肽，对整合素α6具有很好的亲和力，其在体内较为稳定，可以作为靶向载体。整合素α6靶向多肽可以应用于多种整合素α6过表达肿瘤的分子成像中，在肿瘤分子成像中具有重要应用价值。
将本发明的多肽与分子成像探针偶联，可以对多种整合素α6过表达的肿瘤实现分子成像，可以很好应用于肿瘤诊断和筛选。
序列表
<110> 中山大学附属肿瘤医院
<120> 整合素α6靶向多肽及应用
<150> CN 2017104286834
<151> 2017-06-08
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Trp Tyr Xaa Xaa Xaa Ala
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Arg Trp Tyr Ala Glu Asn Ala
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Arg Trp Tyr Asp Ala Asn Ala
1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Arg Trp Tyr Asp Glu Ala Ala
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Cys Ala Trp Tyr Asp Glu Asn Ala Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Cys Arg Ala Tyr Asp Glu Asn Ala Cys
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Cys Arg Trp Ala Asp Glu Asn Ala Cys
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Cys Arg Trp Tyr Asp Glu Asn Ala Cys
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Cys Tyr Trp Asp Ala Asn Arg Glu Cys
1 5
Claims (9)
1.整合素α6靶向多肽，其基序为RWYXXXA。
2.根据权利要求1所述的整合素α6靶向多肽，其特征在于：基序选自：RWYAENA、RWYDANA或RWYDEAA。
3.根据权利要求1或2所述的整合素α6靶向多肽，其特征在于：基序的C端和/或N端可选连接有1～3个氨基酸。
4.根据权利要求1或2所述的整合素α6靶向多肽，其特征在于：基序的两端分别连接有一个Cys。
5.根据权利要求4所述的整合素α6靶向多肽，其特征在于：多肽通过两端的Cys形成环肽。
6.一种靶向诊断或筛查试剂，包括显像剂，其特征在于：显像剂偶联有权利要求1～5任一项所述的整合素α6靶向多肽。
7.根据权利要求6所述的靶向诊断或筛查试剂，其特征在于：显像剂为分子成像剂。
8.根据权利要求6或7所述的靶向诊断或筛查试剂，其特征在于：靶向诊断或筛查试剂为肿瘤靶向诊断或筛查试剂。
9.根据权利要求8所述的靶向诊断或筛查试剂，其特征在于：肿瘤为整合素α6过表达的肿瘤。
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