CN103097403B - 氯毒素变体、缀合物及其使用方法 - Google Patents

氯毒素变体、缀合物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

氯毒素变体、氯毒素变体缀合物、包含氯毒素变体或缀合物的组合物和使用氯毒素变体、缀合物和组合物的方法。

Description

氯毒素变体、缀合物及其使用方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2010年5月11日提交的美国申请号US61/333,556的利益，将该文献的公开内容引入本文参考。
技术领域
本发明一般性涉及氯毒素，更具体地说，本发明涉及氯毒素变体、氯毒素变体缀合物、包含氯毒素变体或缀合物的组合物，以及使用氯毒素变体、缀合物和组合物的方法。
背景技术
神经外科医师长期寻找阐明脑癌细胞以鉴定癌症病灶并且在肿瘤切除操作过程中实时将癌症与正常组织区分的方法。由氯毒素(CTX)即从Leiurus quinquestriatus全蝎中发现的肽组成的生物缀合物和近红外荧光(NIRF)分子例如Cy5.5,("肿瘤涂料")以高灵敏度清楚地鉴定了肿瘤病灶(M.Veiseh等人,"Tumor Paint:A Chlorotoxin:Cy5.5Bioconjugate for Intra-Operative Visualization of Cancer Foci,"CancerResearch 67(14):6882-88,2007)。最初选择CTX用于这些研究，因为与正常脑组织相比它优先结合神经胶质瘤细胞(L.Soroceanu等人,"Use of Chlorotoxin for Targeting ofPrimary Brain Tumors,"Cancer Research 58:4871-4879,1998)。因为CTX靶标显示出为多种其他癌症类型共有，所以CTX:Cy5.5有效地指示出了前列腺、结肠、肉瘤、髓母细胞瘤和其他类型的实体瘤(M.Veiseh 2007)。
CTX是36个氨基酸的肽，它具有4个二硫键，这些二硫键赋予多肽高度三维结构。CTX在15、23和27位具有3个赖氨酸残基，它们用于缀合NHS-酯修饰的Cy5.5和其他荧光分子。得到的生物缀合物是典型地75-85%在27位单-标记的肽和少量与Lys 15和Lys 23缀合的二-和三-标记的肽的混合物。尽管能够具有Food and DrugAdministration(FDA)和另外类似管理部门批准的混合物，但是商业化可能受到阻碍，因为它昂贵且在未来难以匹配单-、二-和三-标记批量的比例。
对具有氯毒素优良特性并且具有用于缀合诊断剂或治疗剂的单一赖氨酸残基以提供单一均匀的新分子本体的多肽存在需求。本发明寻求满足这一需求并且还提供相关的优势。
发明内容
本发明提供了氯毒素变体、由氯毒素变体构成的缀合物、包含氯毒素变体或缀合物的组合物，以及使用氯毒素变体、缀合物和组合物的方法。
在一个方面中，本发明提供了具有单一赖氨酸残基(Lys 27)的修饰的氯毒素肽。在一个实施方案中，修饰的氯毒素肽具有被非赖氨酸的氨基酸取代的Lys 15和Lys 23的天然氯毒素。在一个实施方案中，修饰的氯毒素肽具有SEQ ID NO:2中给出的氨基酸序列。在一个实施方案中，修饰的氯毒素肽具有SEQ ID NO:3中给出的氨基酸序列。在一个实施方案中，修饰的氯毒素肽具有SEQ ID NO:4中给出的氨基酸序列。在一个实施方案中，修饰的氯毒素肽具有SEQ ID NO:5中给出的氨基酸序列。在一个实施方案中，修饰的氯毒素肽具有SEQID NO:6中给出的氨基酸序列。
还提供了包含本发明修饰的氯毒素肽的组合物。在一个实施方案中，该组合物包含药学可接受的载体。
在另一个方面中，本发明提供了可通过给予氯毒素治疗的疾病或病症的治疗方法，包括对有此需要的受试者给予有效量的本发明修饰的氯毒素肽。
在本发明的另一个方面中，提供了包含本发明修饰的氯毒素肽的氯毒素缀合物。在一个实施方案中，所述氯毒素缀合物包含与一种或多种治疗剂、诊断剂、成像剂或靶向剂或增加修饰的氯毒素肽的循环半衰期的基团共价偶合的修饰的氯毒素肽。在一个实施方案中，所述治疗剂、诊断剂、成像剂或靶向剂或增加修饰的氯毒素肽的循环半衰期的基团通过赖氨酸残基与修饰的氯毒素共价偶合。适合的诊断剂或成像剂包括荧光标记(例如量子点或聚合物点)、放射性标记和磁共振成像标记(例如硼纳米颗粒、硼和碳纳米颗粒、碳化硼纳米颗粒、含硼聚合物、含硼和碳的聚合物、碳化硼聚合物和还包含钆的任意的这些纳米颗粒或聚合物)。适合的靶向剂包括抗体、多肽、多糖和核酸。适合的治疗剂包括化疗剂(例如甲氨蝶呤、多西他赛、顺铂和依托泊苷)和生物治疗剂(例如cDNA、siRNA、shRNA,和RNAi)。适合的增加修饰的氯毒素肽的循环半衰期的基团包括聚乙二醇基团、糖基基团和糖基聚乙二醇基团。
在其他方面中，提供了使用氯毒素缀合物的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了使可通过氯毒素成像的组织成像的方法，包括使可通过氯毒素成像的组织接触本发明的氯毒素缀合物，以使可通过氯毒素成像的组织成像。
在一个实施方案中，本发明提供了检测可通过氯毒素检测的癌症的方法，包括使可通过修饰的氯毒素成像的组织接触本发明的修饰的氯毒素缀合物，以检测可通过氯毒素检测的癌症。
在一个实施方案中，本发明提供了检测和摘除可通过氯毒素检测的癌症的方法，包括使组织接触本发明的修饰的氯毒素缀合物，以检测癌组织，并且摘除通过修饰的氯毒素缀合物检测的癌组织。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗修饰的氯毒素缀合物靶向的癌症的方法，包括使结合修饰的氯毒素的组织接触本发明的修饰的氯毒素缀合物以治疗癌症。
附图说明
本发明的上述方面和许多附加优点易于理解，在参照如下详细描述并且结合附图考虑时其会得到更好的理解。
图1比较了天然氯毒素(线性CTX)与本发明有代表性的修饰的氯毒素肽(K15A_K23A CTX;K15R_K23R CTX)的序列。天然和具有4个二硫键的取代的CTX如黄线所示。
图2是本发明有代表性的修饰的氯毒素肽和天然氯毒素的二级αH化学位移的比较。通过从实验αH位移中扣除随机螺旋位移计算二级αH位移(D.S.Wishart等人,1H,13C和15NChemical ShiftReferencing in Biomolecular NMR,"Journal of Biomolecular NMR 6,135-140,1995)。天然CTX(深蓝色)、线性CTX(蓝色)、K15A_K23ACTX(红色)和K15R_K23R CTX(橙色)的棒形图。两个β-链如蓝色箭头所示，α–螺旋如红色所示。取代的残基和残基D18如绿色星号所示。
图3A和3B示例本发明有代表性的修饰的CTX:Cy5.5生物缀合物的功能图像(图3A，K15A_K23A CTX:Cy5.5；和图3B,K15R_K23RCTX:Cy5.5)。通过尾静脉给具有WT或ND2:SmoA1肿瘤的小鼠注射50μl 40μM修饰的生物缀合物。在注射后3天使用Xenogen光谱取生物光子图像。然后将脑冷冻在OCT中，切成12μm切片，用H&E染色以确定肿瘤负荷。
发明详述
本发明提供了氯毒素变体、由氯毒素变体构成的缀合物、包含氯毒素变体或缀合物的组合物、以及使用氯毒素变体、缀合物和组合物的方法。
在一个方面中，本发明提供了氯毒素变体。本文所用的术语"氯毒素变体"与术语"修饰的氯毒素肽"可互换使用且指具有至少一些有用的天然氯毒素活性的非天然多肽。氯毒素是天然存在的包含36个氨基酸并且具有SEQ ID NO:1中给出的氨基酸序列的多肽。
术语"修饰的氯毒素肽"是指具有氨基酸序列的多肽，其中天然氯毒素的一个或多个氨基酸残基被在该位置上非天然氯毒素的氨基酸残基取代(即替代)。例如，天然氯毒素的残基15和23是赖氨酸残基；在本发明的一些实施方案中，提供了在15和23位上具有丙氨酸或精氨酸残基的修饰的氯毒素肽。
在一个实施方案中，本发明提供了具有单一赖氨酸残基(Lys 27)的修饰的氯毒素肽。在该实施方案中，修饰的氯毒素肽具有被非赖氨酸的氨基酸取代的Lys 15和Lys 23天然氨基酸，得到了具有单一赖氨酸残基(Lys 27)的修饰的氯毒素。在该实施方案中，修饰的氯毒素肽具有SEQ ID NO:2中给出的氨基酸序列，其中Lys 15和Lys 23被独立地选自天然存在和非天然氨基酸、氨基酸类似物和氨基酸模拟物的氨基酸取代。
天然存在的氨基酸是通常在天然存在的蛋白质中发现的20种L-氨基酸(Ala或A、Cys或C、Asp或D,Glu或E、Phe或F,Gly或G、His或H、Ile或I、Lys或K、Leu或L、Met或M、Asn或N、Pro或P、Gln或Q、Arg或R、Ser或S、Thr或T,Val或V、Trp或W、Tyr或Y)。非天然氨基酸包括D-氨基酸。氨基酸类似物和氨基酸模拟物以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，仅作为实例，α-碳与氢、羧基、氨基和R基团键合。这种类似物可以具有修饰的R基团(作为实例正亮氨酸)或可以具有修饰的肽骨架，而仍然保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸类似物的非限制性实例包括高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。
在一个实施方案中，Lys 15和/或Lys 23独立地被碱性氨基酸(即His、Arg)、非天然氨基酸、氨基酸类似物或氨基酸模拟物替代。
在一个实施方案中，Lys 15和/或Lys 23独立地被非极性(疏水性)氨基酸(即Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Val、Trp)、相关的非天然氨基酸、氨基酸类似物或氨基酸模拟物替代。
在一个实施方案中，Lys 15和/或Lys 23独立地被极性(不带电荷的)氨基酸(即Cys、Gly、Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr)、非天然氨基酸、氨基酸类似物或氨基酸模拟物替代。
在一个实施方案中，Lys 15和/或Lys 23独立地被酸性氨基酸(即Glu、Asp)、非天然氨基酸、氨基酸类似物或氨基酸模拟物替代。
在一个实施方案中，修饰的氯毒素肽具有被丙氨酸取代的Lys 15和Lys 23(K15A_K23A CTX)。在该实施方案中，修饰的氯毒素肽具有SEQ ID NO:3中给出的氨基酸序列。
在一个实施方案中，修饰的氯毒素肽具有被精氨酸取代的Lys 15和Lys 23(K15R_K23R CTX)。在该实施方案中，修饰的氯毒素肽具有SEQ ID NO:4中给出的氨基酸序列。
在一个实施方案中，修饰的氯毒素肽具有被丙氨酸取代的Lys 15和被精氨酸取代的Lys 23(K15A_K23R CTX)。在该实施方案中，修饰的氯毒素肽具有SEQ ID NO:5中给出的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，修饰的氯毒素肽具有被精氨酸取代的Lys15和被丙氨酸取代的Lys 23(K15R_K23A CTX)。在该实施方案中，修饰的氯毒素肽具有SEQ ID NO:6中给出的氨基酸序列。
在本发明的另一个方面中，提供了包含修饰的氯毒素肽的组合物。该组合物可以包含用于递送修饰的氯毒素肽的药学可接受的载体或稀释剂。适合的药学可接受的载体或稀释剂包括注射用盐水或葡萄糖。
治疗方法.在另一个方面中，本发明提供了治疗可通过给予氯毒素治疗的疾病或病症的方法。在一个实施方案中，该方法包括对有此需要的受试者给予有效量的本发明修饰的氯毒素肽。
本文所用的术语"有效量"是指将所治疗的疾病或病症的一种或多种症状缓解至一定程度所给予的活性剂或化合物的足量。结果可以是疾病征兆、症状或原因减少和/或缓解，或生物系统的任意其他期望的改变。可以给予包含这种活性剂或化合物的组合物用于预防、增强和/或治疗。可以使用例如剂量递增研究这样的技术测定任何个体情况中的适合的"有效"量。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗患者中表达氯毒素结合位点的癌症的方法，包括对有此需要的患者给予有效量的本发明氯毒素变体。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗表达氯毒素结合位点的癌症的方法，包括对有此需要的患者给予有效量的药物组合物，该药物组合物包含本发明的氯毒素变体和药学可接受的载体。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗表达氯毒素结合位点的肿瘤的方法，包括对有此需要的患者给予有效量的本发明的氯毒素变体。
在一个实施方案中，本发明提供了用于抑制表达氯毒素结合位点的细胞侵害活性的方法，包括将有效量的氯毒素变体施用于表达氯毒素结合位点的细胞。
本发明的治疗方法可施用于有这种治疗需要的人和动物受试者。
实际上可以用本发明的氯毒素变体和缀合物治疗表达氯毒素结合位点的每种类型的恶性癌症。这些恶性癌症可以包括神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、脉络丛癌、室管膜瘤、脑膜瘤、胶质母细胞瘤、神经节瘤、嗜铬细胞瘤和转移脑瘤、其他脑瘤、神经母细胞瘤、头颈癌、小细胞肺癌、乳腺癌、肠癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、肾癌、皮肤癌、肉瘤(30个类型以上)、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤因肉瘤、癌、黑素瘤、卵巢癌、宫颈癌、淋巴瘤、甲状腺癌、直肠癌症、结直肠癌、子宫内膜癌症、生殖细胞肿瘤、喉癌、多发性骨髓瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、胃癌、睾丸癌和维尔姆斯瘤。
氯毒素缀合物.在另一个方面中，本发明提供了本发明修饰的氯毒素肽的缀合物。在一个实施方案中，该缀合物包含本发明修饰的氯毒素肽，其与增加修饰的氯毒素肽的循环半衰期的基团共价偶合。在另一个实施方案中，该缀合物包含与治疗剂、诊断剂、成像剂或靶向剂共价偶合的本发明修饰的氯毒素肽。在一些实施方案中，所述治疗剂、诊断剂、成像剂或靶向剂或增加修饰的氯毒素肽的循环半衰期的基团通过肽的赖氨酸残基共价偶合。
增加修饰的氯毒素肽的循环半衰期的适合的基团包括本领域公知用于增加多肽的循环半衰期的那些基团(例如聚乙二醇化、糖基化、聚乙二醇糖基化)。用于聚乙二醇化的有代表性的基团包括聚亚烷基氧化物(聚环氧化物，polyalkylene oxides)(聚氧化乙烯、聚氧化丙烯以及聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的共聚物)。用于糖基化的有代表性的基团包括寡糖类(例如碳水化合物，包括多唾液酸)。在一个实施方案中，所述缀合物是聚乙二醇化氯毒素且包含与一种或多种聚亚烷基氧化物(例如聚氧化乙烯)共价偶合的修饰的氯毒素肽。在一个实施方案中，所述缀合物是糖基化氯毒素且包含与一种或多种寡糖类共价偶合的修饰的氯毒素肽。在一个实施方案中，所述缀合物是聚乙二醇糖基化(glycopegylated)氯毒素且包含与一种或多种糖基化聚亚烷基氧化物(例如糖环氧乙烷)共价偶合的修饰的氯毒素肽。
适合的治疗剂包括细胞毒性剂。有代表性的治疗剂包括化疗剂，例如甲氨蝶呤、多西他赛、顺铂和依托泊苷等；生物治疗剂，例如核酸分子(例如DNA，例如cDNA；和RNA，例如siRNA、shRNA、RNAi)，包括转录和迁移抑制剂和信号转导调节剂。
适合的诊断剂包括提供通过荧光法和非荧光成像的方法检测的试剂。其他适合的诊断剂包括放射性标记(例如放射性同位素标记的化合物)，例如125I、14C和31P等和磁共振成像剂。
适合的靶向剂包括抗体、多肽、多糖和核酸。
在本发明的另一个方面中，提供了包含修饰的氯毒素肽缀合物的组合物。该组合物可以包括用于递送修饰的氯毒素肽缀合物的药学可接受的载体或稀释剂。适合的药学可接受的载体或稀释剂包括注射用盐水或葡萄糖。
成像方法.在本发明的另一个方面中，提供了使用修饰的氯毒素肽缀合物的方法。在一个实施方案中，本发明提供了使可用氯毒素成像的组织成像的方法。在该方法中，使可用氯毒素成像的组织接触氯毒素缀合物。
在一个实施方案中，成像方法是荧光成像法。用于制备和使用荧光氯毒素缀合物的有代表性的方法描述在美国专利申请公开号US20080279780A1中，发明名称为荧光氯毒素缀合物和用于癌症手术中显影的方法，特别将该文献完整地引入本文参考。
本发明提供了可通过荧光成像检测的氯毒素缀合物，它能够使癌组织手术中显影；包含氯毒素缀合物的组合物；和使用氯毒素缀合物的方法。
在一个方面中，本发明提供了可通过荧光成像检测的氯毒素缀合物，它能够使癌组织手术中显影。
氯毒素是使所述缀合物定向于所关注的组织的靶向剂。在一个实施方案中，本发明的氯毒素缀合物包括与氯毒素共价偶合的一种或多种荧光基团(例如红外或近红外发射荧光基团)。
本文所用的术语"红外或近红外发射荧光基团"是指具有大于约600nm的荧光发射最大值的荧光基团。具有较短波长(例如约500－约600nm)发射荧光基团的荧光氯毒素缀合物用于组织化学成像。这些缀合物可能会较少用于人和动物体内成像，其中优选较长波长(例如大于约600nm)发射荧光基团。
在氯毒素缀合物的一些实施方案中，荧光基团衍生自特征在于发射波长最大值大于约600nm以避免自体荧光的荧光化合物，自体荧光是通过几毫米－1厘米组织/血液/流体传播的发射、不被人或动物组织中的血红蛋白、其他血液成分或蛋白质吸收的发射。
所述荧光基团与氯毒素共价偶合，从而能够通过荧光成像使所述缀合物显影。所述荧光基团衍生自荧光化合物。适合的荧光化合物是那些可以与氯毒素共价偶合、而基本上对氯毒素缀合物的靶向和结合功能没有不良影响的化合物。类似地，适合的荧光化合物在与氯毒素缀合后保留其荧光特性。
在一个实施方案中，所述的荧光基团是酞菁基团。酞菁化合物的特征在于其相对高的消光系数和有利的荧光量子产量。酞菁化合物的荧光发射波长最大值作为酞菁结构的函数改变。根据具体酞菁化合物的不同，荧光发射波长最大值可以从绿色(约490nm)改变至近红(约740nm)。在本发明方法的实施过程中，优选具有远红外(约650nm)至近红外(约750nm)的荧光发射最大值的酞菁化合物。在这些发射波长下，来自局部环境的背景荧光是最小的且所关注的组织相对透明。由于在这些波长下所关注的组织的相对透明性，所以与使用在较短波长(小于600nm)具有发射的荧光化合物的其他缀合物相比，可以观察到本发明缀合物激发和荧光发射显影最大化且其靶向的组织的量相对更大。
适合的酞菁包括商购自GE Healthcare的CYDYE荧光素，命名为Cy2(506nm)、Cy2(506nm)、Cy3(570nm)、Cy3B(572nm)、Cy3.5(596nm)、Cy5(670nm)、Cy5.5(675nm)和Cy7(694nm)(括号内是发射最大值)。在一个实施方案中，酞菁化合物是Cy5.5。
在一个实施方案中，所述的荧光基团是磺化呫吨基团。适用于实施本发明的磺化呫吨化合物描述在美国专利US6,130,101中，特别将该文献完整地引入本文参考，且该化合物商购自Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR，命名为ALEXA FLUOR。ALEXA FLUOR是荧光团家族的名称，其特征在于其相对高的消光系数和有利的荧光量子产量。磺化呫吨化合物的荧光发射波长最大值作为该化合物的结构的函数改变。根据具体磺化呫吨化合物的不同，荧光发射波长最大值可以从绿色(约450nm)改变至近红(约780nm)。在本发明方法的实施过程中，优选具有远红外(约650nm)至近红外(约750nm)的荧光发射最大值的ALEXA FLUOR化合物。
适合的磺化呫吨化合物包括ALEXA FLUORS，例如ALEXAFLUOR 350(442nm)、ALEXAFLUOR 405(421nm)、ALEXAFLUOR 488(539nm)、ALEXA FLUOR 500(525nm)、ALEXAFLUOR 514(540nm)、ALEXA FLUOR 532(554nm)、ALEXAFLUOR 546(575nm),ALEXA FLUOR 555(565nm)、ALEXAFLUOR 568(603nm)、ALEXA FLUOR 594(617nm)、ALEXAFLUOR 610(628nm)、ALEXAFLUOR 633(647nm),ALEXAFLUOR 635(645nm)、ALEXA FLUOR 647(668nm)、ALEXAFLUOR 660(690nm)、ALEXA FLUOR 680(702nm)、ALEXAFLUOR 700(719nm)和ALEXA FLUOR 750(779nm)(括号内是发射最大值)。在一个实施方案中，磺化呫吨是ALEXA FLUOR 680。可以按照与TheHandbook-A Guide to Fluorescent Probes and LabelingTechnologies,RichardP.Haugland(Molecular Probes,Inc.,asubsidiary of Invitrogen Corp.)中所述类似的方式制备有代表性的磺化呫吨-氯毒素缀合物。
用于本发明的其他适合的NIR荧光团包括DyLight-680、DyLight-750、VivoTag-750、DyLight-800、IRDye-800、VivoTag-680和吲哚菁绿。
本发明修饰的氯毒素肽还可以与量子点和聚合物点偶合。
适合的荧光化合物包括赋予该化合物对于氯毒素的化学反应性的官能团。适合的官能团包括与胺基共价偶合的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基团、与巯基共价偶合的马来酰亚胺基团和与醛基共价偶合的酰肼基团。优选用于制备本发明缀合物的荧光化合物包括单一反应性官能团(例如一-NHS酯)。可以理解，其他缀合化学品适合于制备本发明的氯毒素缀合物。
本发明适合的缀合物包括约1－约3个荧光基团/氯毒素。在一个实施方案中，所述的缀合物包括约1个荧光基团。
在本发明的另一个方面中，提供了包含氯毒素缀合物的组合物。该组合物适合于对人和动物受试者给药并且包含药学可接受的载体。该组合物包含药理学有效量的修饰的氯毒素缀合物。通常可以通过建立的方法确定有效量。有效量是足以占据癌细胞中的氯毒素结合位点、但不足以将与非肿瘤组织的非特异性结合降至最低的用量。有效量优化了手术中成像的信噪比。
本发明提供了使用氯毒素缀合物检测组织的方法，本发明的氯毒素缀合物靶向氯毒素结合位点并且与之结合。可以理解，氯毒素结合位点可以采取两种形式：结合氯毒素的位点和结合本发明氯毒素缀合物的位点。可以理解氯毒素结合位点可以不同于氯毒素缀合物结合位点。
在一个实施方案中，提供了区分表达氯毒素结合位点的癌病灶的方法。该方法包括下列步骤：
(a)使所关注的组织接触对表达氯毒素结合位点的细胞具有亲和力和特异性的氯毒素缀合物，其中氯毒素缀合物包含一种或多种与氯毒素共价偶合的红外或近红外发射荧光基团；和
(b)测定氯毒素缀合物的结合水平，其中相对于正常组织，结合水平升高指示该组织是肿瘤。
在一个实施方案中，提供了检测表达氯毒素结合位点的癌症的方法。该方法包括下列步骤：
(a)使所关注的组织接触对表达氯毒素结合位点的细胞具有亲和力和特异性的氯毒素缀合物，其中氯毒素缀合物包含一种或多种与氯毒素共价偶合的红外或近红外发射荧光基团；和
(b)测定氯毒素缀合物的结合水平，其中相对于正常组织，结合水平升高指示该组织是肿瘤。
在一个实施方案中，提供了测定表达手术中患者氯毒素结合位点的癌细胞位置的方法。该方法包括下列步骤：
(a)对患者给予药物组合物，其中该药物组合物包含药学可接受的载体和足以使表达体内氯毒素结合位点的癌细胞成像的用量的氯毒素缀合物，其中氯毒素缀合物包含一种或多种与氯毒素共价偶合的红外或近红外发射荧光基团；
(b)通过荧光成像测定氯毒素缀合物的结合水平以确定表达氯毒素结合位点的癌细胞的位置，其中相对于正常组织，结合水平升高指示存在表达氯毒素结合位点的癌细胞；和
(c)从患者中手术取出至少一些表达通过荧光成像定位的氯毒素结合位点的细胞。
本发明用于检测癌症病灶的成像方法适用于小鼠和其他癌症动物模型和兽医实践。
本发明的荧光氯毒素缀合物可以包括其他有用的试剂。其他有用的试剂包括诊断剂和治疗剂。
在另一个实施方案中，成像方法是磁共振成像方法。磁共振成像中制备和使用氯毒素缀合物的有代表性的方法描述在美国专利申请公开号US 200701254965A1中，发明名称为氯毒素-标记的纳米颗粒组合物和靶向原发性脑肿瘤的方法，特别将该文献完整地引入本文参考。
本发明提供了能够靶向原发性脑肿瘤的氯毒素-标记的纳米颗粒、包括纳米颗粒的组合物、使用所述纳米颗粒使组织成像的方法和使用所述纳米颗粒处理表达氯毒素结合位点的细胞的方法。
在一个方面中，本发明提供了氯毒素-标记的颗粒，其包含：
(a)具有表面的芯，该芯包含具有磁共振成像活性的材料；
(b)修饰的氯毒素肽；和
(c)使修饰的氯毒素肽与表面共价偶合的连接基。
所述的芯包括具有磁共振成像活性的材料。具有磁共振成像活性的适合的材料包括金属氧化物，例如氧化亚铁、氧化铁、氧化硅、多晶硅氧化物、氧化铝、氧化锗、硒化锌、二氧化锡、二氧化钛、氧化铟锡和氧化钆。可以使用一种或多种金属氧化物的混合物。
除磁性材料外，所述的芯还可以包括无磁性材料，例如氮化硅、不锈钢、钛、硼、碳化硼、硼和碳混合物和镍钛。还可以使用一种或多种无磁性材料的混合物。
本发明的颗粒包括约1－约100个修饰的氯毒素/颗粒。在一个实施方案中，所述的颗粒包括约10－约50个修饰的氯毒素/颗粒。在一个实施方案中，所述的颗粒包括约10个修饰的氯毒素/颗粒。在一个实施方案中，所述的颗粒包括约50-约100个修饰的氯毒素/颗粒。
如上所述，本发明的磁性纳米颗粒包括用作靶向基团的氯毒素，所述的靶向基团有效地使所述纳米颗粒定向于表达氯毒素结合位点的细胞，在那里结合所述纳米颗粒。原发性脑瘤细胞(例如来源于神经外胚层的肿瘤细胞和神经胶质瘤细胞)包括氯毒素结合位点。
氯毒素-标记的纳米颗粒还可以包括其他有用的试剂。其他有用的试剂包括诊断剂。
适合的诊断剂包括通过非磁共振成像的方法检测纳米颗粒的试剂。适合的诊断剂包括发射光的化合物(例如荧光团、磷光体和发光体)。适合的荧光团包括如上所述的那些。
在一个实施方案中，氯毒素-标记的颗粒还包含荧光基团。本发明的颗粒包括约1－约10个荧光基团/颗粒。在一个实施方案中，所述颗粒包括约1－约2个荧光基团/颗粒。
在一个实施方案中，荧光基团选自红外和近红外发射荧光基团(即具有大于约600nm的发射最大值的荧光基团)。在一个实施方案中，荧光基团是酞菁基团。在一个实施方案中，荧光基团是Cy5.5基团。
其他适合的诊断剂包括放射性标记(例如放射性同位素标记的化合物)，例如125I、14C和31P等。
在本发明的另一个方面中，提供了包括本发明颗粒的组合物。在一个实施方案中，该组合物包含适合于对人或动物受试者给药的纳米颗粒。该组合物可以包含可接受的载体。在一个实施方案中，该组合物是药学可接受的组合物并且包含药学可接受的载体。本文所用的术语"载体"是指有利于递送颗粒的稀释剂(例如盐水)。
在其他方面中，本发明提供了使用纳米颗粒的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了使来源于神经外胚层的肿瘤细胞与无肿瘤脑组织相区分的方法。在该方法中，区分来源于神经外胚层的肿瘤细胞与无肿瘤脑组织的步骤在于：
(a)使所关注的组织接触对来源于神经外胚层的肿瘤细胞具有亲和力和特异性的氯毒素-标记的纳米颗粒；和
(b)测定氯毒素-标记的纳米颗粒的结合水平，其中相对于正常组织，结合水平升高指示该组织是肿瘤。
在一个实施方案中，本发明提供了检测来源于神经外胚层的肿瘤细胞的方法。在该方法中，通过下列步骤检测来源于神经外胚层的肿瘤细胞：
(a)使所关注的组织接触对来源于神经外胚层的肿瘤细胞具有亲和力和特异性的氯毒素-标记的纳米颗粒；和
(b)测定氯毒素-标记的纳米颗粒的结合水平，其中相对于正常组织，结合水平升高指示该组织是肿瘤。
上述方法用于区分和检测神经胶质瘤细胞。
在上述方法中，测定氯毒素-标记的纳米颗粒的结合水平包括磁共振成像。
在上述方法的一些实施方案中，氯毒素-标记的纳米颗粒还包含荧光基团。在这些实施方案中，测定氯毒素-标记的纳米颗粒的结合水平可以包括荧光成像。
在一个实施方案中，本发明提供了在术前、手术中和术后测定患者神经胶质瘤细胞位置的方法。该方法包括下列步骤：
(a)对患者给予药物组合物，其中该药物组合物包含药学可接受的载体和足以使体内神经胶质瘤细胞成像的用量的荧光团/氯毒素-标记的纳米颗粒；
(b)通过术前磁共振成像测定荧光团/氯毒素-标记的纳米颗粒的结合水平，以确定神经胶质瘤细胞的位置，其中相对于正常组织，结合水平升高指示存在神经胶质瘤细胞；
(c)从患者中手术取出至少一些通过磁共振成像定位的神经胶质瘤细胞；
(d)通过手术中荧光成像测定荧光团/氯毒素-标记的纳米颗粒的结合水平，以确定残留的神经胶质瘤细胞的位置，其中相对于正常组织，结合水平升高指示存在残留的神经胶质瘤细胞；
(e)从患者中手术取出至少一些通过荧光成像定位的残留神经胶质瘤细胞；和
(f)通过术后磁共振成像测定荧光团/氯毒素-标记的纳米颗粒的结合水平，以确定神经胶质瘤细胞的位置，其中相对于正常组织，结合水平升高指示存在神经胶质瘤细胞。
在该方法中，足以使体内神经胶质瘤细胞成像的荧光团/氯毒素-标记的纳米颗粒的用量约为1-20mg Fe/kg体重("Fe"是指存在于颗粒芯中的铁)。
在上述方法中，可以重复步骤(d)和(e)。
上述方法包括术前、手术中和术后成像。可以理解，上述方法的变化形式属于本发明的范围。该方法的其他变化形式包括，例如(1)仅术前成像；(2)仅手术中成像；(3)仅术后成像；(4)仅术前和手术中成像；(5)仅术前和术后成像；和(6)仅手术中和术后成像。
本发明提供了使用纳米颗粒处理组织的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗患者中的神经胶质瘤的方法，包括对有此需要的患者给予有效量的药物组合物，该药物组合物包含氯毒素-标记的纳米颗粒和药学可接受的载体。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗神经外胚叶瘤的方法，包括对有此需要的患者给予有效量的药物组合物，该药物组合物包含氯毒素-标记的纳米颗粒和药学可接受的载体。
在一个实施方案中，本发明提供了抑制肿瘤细胞的侵害活性的方法，包括对肿瘤细胞给予有效量的药物组合物，该药物组合物包含氯毒素-标记的纳米颗粒和药学可接受的载体。
下文描述了本发明有代表性的修饰的氯毒素肽及其特性、肽的缀合物及其特性和所述缀合物在成像中的应用。
修饰的氯毒素肽的制备.本发明的两种有代表性的修饰的氯毒素(CTX)肽(丙氨酸取代的氯毒素,K15A_K23A-CTX；精氨酸取代的氯毒素,K15R_K23R-CTX)序列如图1中所示。使用Boc(叔-丁氧羰基)/HBTU[2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐]进行原位中和化学反应合成肽。具有pH 7.8的0.1M Tris-HCl、0.2MNaCl、5mM还原型谷胱甘肽/0.5mM氧化谷胱甘肽的缓冲溶液用于在室温氧化取代的肽以及环化和氧化CTX过夜。RP-HPLC用于纯化肽且通过分析型RP-HPLC和ES-MS证实两种CTX类似物K15A_K23A-CTX和K15R_K23R-CTX的纯度和分子量。
NMR排布.将所述肽溶于90%H2O和10%D2O并且在600MHz在298°K记录一维和二维TOCSY和NOESY光谱。使用充分建立的技术指定NMR光谱(K.Wuthrich,"NMR of Proteinsand NucleicAcids",Wiley-Interscience,New York,1986)。酰胺区中的化学位移充分分散，证实所述肽正确折叠，且每种肽的NOESY光谱中的指纹区显示αH–NH依次连接性的完整循环，除两个脯氨酸残基(Pro4和Pro31)以外。然而，正如预计的，从脯氨酸残基及其在先残基的δ质子中观察到NOEs。天然CTX和合成类似物的二级αH化学位移比较如图2中所示。
取代的CTX生物缀合物的表征.使天然和修饰的肽与Cy5.5缀合并且如下文实施例中所述纯化。通过HPLC和质谱分析得到的生物缀合物。正如预计的，Ala和Arg取代仅产生单-标记的CTX:Cy5.5生物缀合物。
取代的CTX:Cy5.5的功能评价.取代的潜在有益性取决于肽的功能靶向活性是否与天然CTX生物缀合物可比拟。通过生物光子成像测定每种肽使Cy5.5信号优先于正常脑而靶向至髓母细胞瘤细胞的能力。在每种情况中，将50μL 40μM生物缀合物注入显示与晚期脑瘤具有一致性临床征兆的小鼠的尾静脉。3天后，处死小鼠，使用Caliper/Xenogen光谱生物光子成像系统使其脑成像。与正常脑相比，所有修饰的肽缀合物优先使髓母细胞瘤癌组织发光(图3A和3B)。在所有情况中将肿瘤中的信号与不具有髓母细胞瘤的注射的对照组动物的小脑中的信号比较。与正常信号比较的肿瘤中的信号为：天然CTX:Cy5.5，1.96+/-0.47(n=10)；Ala取代的，3.3+/-1.8(n=8)；和Arg取代的，2.6+/-0.85(n=5)。在统计学上，所有修饰的肽生物缀合物都与天然CTX:Cy5.5之间无显著差异，显示赖氨酸取代不会干扰CTX结合其靶标。
本发明的优点.当开发针对人临床试验的新治疗剂时，不仅要考虑到效力、药代动力学、药效学和毒理学，而且要考虑到实际问题，即可能损害管理许可或增加生产成本。肿瘤漆(Tumor Paint)，即安全和有效地使小鼠模型中的实体瘤发光的生物缀合物，提出了与如下事实相关的生产挑战：所述生物缀合物实际上是单-、二-和三-标记的CTX的混合物。本发明提供了三种新的有代表性的化学体，它们在功能上与使NIRF分子靶向至癌症的CTX等效，而仅与单一NIRF分子缀合。
使用精氨酸酶裂解偶合蛋白质组分析对CTX:Cy5.5中的CTX缀合位点作图，并且显示典型地>80%的产物在Lys 27上单标记，且少量还在Lys 15或Lys 23缀合。在与4种其他NIRF染料缀合的CTX的分析中，观察到具有少量二-和三标记的肽的单-标记的肽占优势的类似模式，除Dylight 750以外，即仅生成单-标记的种类的NIRF染料。Dylight 750以单体方式结合未修饰的CTX的事实启示其他两个赖氨酸的利用是有限的。
显然CTX中的赖氨酸残基无一涉及CTX与癌细胞上其靶标的主动结合。这一结论基于如下观察结果：尽管Lys 15或Lys 23被Ala或Arg取代，但是靶向结合得到保护，大量Cy5.5或其他NIRF染料添加到Lys 27上不会妨碍与活性位点结合。
实验方法
固相肽合成.采用手动固相肽合成(SPPS)合成具有标准保护基(例如Asn(Xan)、Asp(OcHex)、Arg(TOS)、Cys(MeBzl)、Lys(ClZ)、Ser(Bzl)、Thr(Bzl)和Tyr(BrZ))的肽。将Ala和Arg取代的线性CTX组装在不具有硫酯连接基的PAM-Arg树脂上。在-5－0°C通过使用氟化氢(HF)与对-甲酚和对-硫代甲酚作为清除剂(9:0.8:0.2(vol/vol)HF:对-甲酚:对-硫代甲酚)将肽从树脂上裂解，进行1.5h。使用C18柱反相-高效液相色谱法(RP-HPLC)、通过在215nm监测吸收度、使用0-80%溶液B(溶液A:H2O/0.05%三氟乙酸；溶液B:90%CH3CN/10%H2O/0.045%三氟乙酸)梯度纯化肽。电喷雾质谱(ES-MS)证实合成肽的纯度和分子量。
折叠.在室温用具有pH 7.8的0.1M Tris-HCl、0.2M NaCl、5mM还原型谷胱甘肽/0.5mM氧化谷胱甘肽组成的缓冲水溶液将Ala和Arg取代的类似物氧化过夜。RP-HPLC用于纯化肽，并且通过分析型RP-HPLC和ES-MS证实纯度和分子量。
NMR光谱法.600MHz 1H NMR光谱法用于监测肽类似物的三维结构。将肽样品溶于90%H2O和10%D2O(v/v)。D2O(99.99%)获自Cambridge Isotope Laboratories,Woburn,MA。二维NMR实验包括全相关光谱法(TOCSY)，并且在298°K记录核欧豪斯效应分光光度(NOESY)光谱。
血清稳定性测定.使用20μM最终肽浓度，在100%人男性血清(Sigma)中进行血清稳定性测定。以14000g将血清离心10min以除去脂质成分，并且将上清液在37°C温育15min，然后测定。在37°C在血清中温育每种肽，并且在0、1、3、6、10、16和24h取出40μL一式三份等分试样。用40μL 6M脲使每一血清等分试样猝灭，并且在4°C温育10min。然后用40μL 20%三氟乙酸使每一血清等分试样猝灭，并且在4°C再温育10min，以沉淀血清蛋白。以14000g将样品离心10min并且用RP-HPLC、使用溶液B线性梯度(0.3mL/min流速)分析100μL上清液。对照样品在进行相同处理过程的磷酸缓冲盐水中包含等量的肽。通过在215nm积分检测肽的回收百分比。
动物模型.严格根据用于试验室动物护理和应用的NationalInstitutes ofHealth Guide操作所有动物。全部动物研究根据FredHutchinson Cancer ResearchCenter's Institute of Animal Care andUse Committee批准的方案进行。使用C57b1/6作为背景的髓母细胞瘤ND2:SmoA1自体小鼠模型(A.R.Hallahan等人,"The SmoA1MouseModel Reveals That Notch Signaling is Critical for the Growthand Survival ofSonic Hedgehog-Induced Medulloblastomas,"CancerResearch 64:7794-7800,2004.B.A.Hatton等人"The Smo/SmoModel:Hedgehog-Induced Medulloblastoma With90% Incidence andLeptomeningeal Spread,"Cancer Research 68:1768-1776,2008)用于评价环化CTX:Cy5.5、K15A_K23A CTX:Cy5.5和K15R_K23RCTX:Cy5.5的特异性。选择具有症状性髓母细胞瘤的半合子或纯合(称作ND2:SmoA1)小鼠用于在这些研究中登记。使用开放场地笼评价检测症状。症状包括头倾斜、弓状姿势、共济失调、头盖骨突出和体重减轻。
离体成像.通过尾静脉给显示髓母细胞瘤症状的ND2:SmoA1动物注射50μL 40μMK15A_K23A CTX:Cy5.5或K15R_K23RCTX:Cy5.5。注射后3天使用CO2吸入对小鼠实施安乐死，并且使用Xenogen光谱成像系统(Caliper)得到其脑的离体生物光子图像。然后将脑冷冻在Tissue-Tek最适切割温度(OCT)化合物(Sakura)中，切成12μm切片，并且根据标准方案进行苏木精和伊红(H&E)染色。
尽管示例和描述了本发明的优选实施方案，但是可以理解，可以在不脱离本发明精神和范围的情况下进行各种改变。

Claims (17)

1.氯毒素缀合物，包含：
氯毒素变体多肽，所述氯毒素变体多肽由SEQ ID NO:2中给出的氨基酸序列所表示，其中天然氯毒素的Lys 15残基和Lys 23残基被碱性氨基酸或非极性氨基酸取代，这样氯毒素变体多肽具有一个单独的赖氨酸残基Lys 27；和
荧光标记，选自DyLight-680、DyLight-750、VivoTag-750、DyLight-800、VivoTag-680和吲哚菁绿；
并且其中氯毒素变体多肽通过单独的赖氨酸残基Lys 27与荧光标记共价偶合，并且氯毒素变体多肽与癌细胞表达的氯毒素结合位点结合。
2.权利要求1的氯毒素缀合物，其中Lys 15残基和Lys 23残基独立地被丙氨酸取代。
3.权利要求1的氯毒素缀合物，其中Lys 15残基和Lys 23残基独立地被精氨酸取代。
4.权利要求1的氯毒素缀合物，其中Lys 15残基被丙氨酸取代且Lys 23残基被精氨酸取代。
5.权利要求1的氯毒素缀合物，其中Lys 15残基被精氨酸取代且Lys 23残基被丙氨酸取代。
6.权利要求1的氯毒素缀合物，其由SEQ ID NO:3中给出的氨基酸序列所表示。
7.权利要求1的氯毒素缀合物，其由SEQ ID NO:4中给出的氨基酸序列所表示。
8.权利要求1的氯毒素缀合物，其由SEQ ID NO:5中给出的氨基酸序列所表示。
9.权利要求1的氯毒素缀合物，其由SEQ ID NO:6中给出的氨基酸序列所表示。
10.组合物，包含权利要求1－9任一项的氯毒素缀合物。
11.权利要求10的组合物，还包含药学可接受的载体。
12.权利要求1－9任一项的氯毒素缀合物在制备用于治疗可通过给予氯毒素治疗的疾病或病症的药物中的用途。
13.权利要求1-9任一项的氯毒素缀合物在制备用于使可通过氯毒素成像的组织成像的试剂中的用途。
14.权利要求1-9任一项的氯毒素缀合物在制备用于检测或成像可通过氯毒素检测或成像的癌细胞或者是癌或肿瘤组织的试剂中的用途，所述检测或成像包括使可通过氯毒素检测或成像的细胞或组织与之接触。
15.权利要求1-9任一项的氯毒素缀合物在制备用于治疗由氯毒素缀合物靶向的癌症的药物中的用途。
16.权利要求1-9任一项的氯毒素缀合物在制备用于使癌细胞或者是癌或肿瘤组织离体显影的试剂中的用途，所述显影包括使所述癌细胞或者组织与缀合物接触，并检测或成像氯毒素缀合物与手术过程中摘除的癌细胞或者癌或肿瘤组织的结合，从而使所述癌细胞或者癌或肿瘤组织显影。
17.权利要求1-9任一项的氯毒素缀合物在制备用于离体区分表达氯毒素结合位点的癌病灶与非肿瘤组织的试剂中的用途，所述区分包括使手术过程中摘除的组织与缀合物接触，并测定氯毒素缀合物的结合水平，其中相对于正常组织，结合水平升高指示该组织是肿瘤。
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