KR101923235B1 - 클로로톡신 폴리펩티드 및 그의 접합체 및 용도 - Google Patents

클로로톡신 폴리펩티드 및 그의 접합체 및 용도 Download PDF

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에이자이 아이엔씨.
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Abstract

본 발명은 클로로톡신의 단일 종 접합체를 생성하는 데 사용될 수 있는 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 클로로톡신 폴리펩티드를 포함하는 접합체 및 그의 제약 조성물에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 그러한 조성물 및/또는 접합체의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

클로로톡신 폴리펩티드 및 그의 접합체 및 용도 {CHLOROTOXIN POLYPEPTIDES AND CONJUGATES AND USES THEREOF}
클로로톡신은, 종양 세포에 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀진 스콜피온 레이우리우스 퀸퀘스트리아투스 (Leiurius quinquestriatus)로부터의 독의 펩티드 성분이다. 클로로톡신은 전이성 종양 및 뇌 종양, 예컨대 악성 신경교종을 비롯한 각종 종양에 세포독성제 및/또는 영상화제를 전달하기 위한 표적화제로서 사용되어 왔다. 예를 들어, 클로로톡신은 방사성 동위원소 요오드-131에 접합되었으며, 이러한 클로로톡신 접합체는 효과적인 항-종양 치료제인 것으로 입증되었다. 또한, 사포린에 부착된 클로로톡신-GST 융합 단백질과 같은 단백질 융합체를 비롯한 여타 클로로톡신 접합체도 유의하고 선택적으로 종양 세포를 사멸시키는 결과를 나타내었다.
<발명의 개요>
클로로톡신은 세포독성제 및/또는 영상화제를 비롯한 광범위한 각종 작용제 중 어느 하나에 잠재적으로 접합될 수 있다. 현재 이용가능한 클로로톡신 접합체가 항-종양 특성이 입증되기는 했지만, 본 발명은 더 많은 레파토리의 클로로톡신 접합체가 많은 장점을 제공할 수 있다는 인식을 포함한다. 일례로서, 상이한 클로로톡신 접합체는 자기 자신만의 약동학적 특성을 나타내어, 주어진 종양 유형 및/또는 환자에게 특히 바람직할 수 있다. 추가로, 본 발명은 야생형 클로로톡신 폴리펩티드 (및 상기 폴리펩티드의 많은 변이체)가 접합이 발생할 수 있는 부위를 1개 초과로 함유한다는 사실로부터 기인한, 클로로톡신 접합체의 특정 유형과 관련된 잠재적 문제점에 대해 이전에 입증되지 않은 근원을 확인한다. 따라서, 본 발명은 클로로톡신과의 접합체를 생겅하는 화학 반응이 종종 접합체 종의 혼합물을 야기한다는 통찰을 제공한다. 적어도 몇몇의 실시양태에서, 이와 같이 상이한 종은 상이한 문제점을 나타낼 수 있다. 더욱이, 그러한 클로로톡신 접합체로 만들어진 결과물을 재현하려는 노력은, 표본 내에서 상이한 종들의 분포를 다시 파악해야 하는 도전과제로 인해 방해를 받을 수 있다. 품질 제어, 및 심지어 분석조차도 어렵거나 불가능할 수 있다.
본 발명은 신규 유형의 클로로톡신 접합체를 제공하며, 여타 클로로톡신 접합체로 나타날 수 있는 문제의 근원을 확인한다. 즉, 본 발명은 많은 선행기술의 클로로톡신 접합체가 관심 잔기 또는 물질을 클로로톡신 폴리펩티드에 화학적으로 접합시킴으로써 제조된다는 것을 인식한다. 본 발명에 따르면, 적어도 몇몇 경우에 그러한 접근법이, 관심 잔기 또는 물질이 상이한 지점 또는 위치에서 클로로톡신에 접합되어 있는 혼합된 집단의 접합체를 생성한다는 것을 인지한다. 본 발명은, 이러한 혼합된 집단이 특성화 및/또는 재현이 어려울 수 있으며, 상이한 특성 (예를 들어, 약동학적 특성)을 나타내고, 이러한 차이는 예측이 불가능할 수 있다는 인식을 포함한다. 본 발명은, 단일 종의 클로로톡신 접합체만을 함유하는 표본이, 예를 들어 치료적 및/또는 진단적 적용에 있어 접합체의 혼합물을 함유하는 표본에 비해 더 바람직할 수 있다는 인식을 포함한다.
또한, 본 발명은 이러한 확인된 문제의 근원에 대한 해결책을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 단일 종의 접합체를 생성할 수 있는 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드가 제공된다. 다양한 측면에서, 접합을 위한 부위로서 가용한 리신을 1개 이하로 갖는 클로로톡신 폴리펩티드를 포함하는 클로로톡신 접합체 ("모노리신 클로로톡신 접합체"), 이러한 접합체를 포함하는 제약 조성물, 및 이러한 접합체의 사용 방법이 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 제공되는 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 리신 잔기가 없다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드 및 그의 접합체를 제조 및 사용하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 제공되는 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드 및/또는 그의 접합체는 의약에 사용될 수 있다 (예를 들어, 다양한 치료적 및/또는 진단적 맥락에서).
정의
숫자와 관련하여 본원에 사용된 용어 "약" 및 "대략"은, 달리 언급되거나 문맥상 달리 명백한 경우를 제외하고 (숫자가 가능한 값의 100％를 초과할 수 있는 경우를 제외), 해당 숫자의 어느 한 방향 (초과 또는 미만)으로 20％, 10％, 5％ 또는 1％의 범위 내에 속하는 숫자들을 포함하도록 본원에서 사용된다.
본원에 사용된 용어 "특징적인 서열 요소" 또는 "서열 요소"는, 또다른 폴리펩티드와 적어도 약 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％의 동일성을 나타내는 인접 아미노산, 전형적으로 적어도 5개의 아미노산, 예를 들어, 적어도 5-50개, 5-25개, 5-15개 또는 5-10개의 아미노산의 스트레치 (stretch)를 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, 특징적인 서열 요소는 폴리펩티드 상에서의 기능에 관여하거나 기능을 부여한다. 몇몇 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 특징적인 서열 요소를 포함한다. 이러한 몇몇 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드 TTDHQMAR (서열 번호 29)인 특징적인 서열 요소를 포함한다.
용어 "화학요법제", "항암제" 및 "항암 약물"은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 이들은 암 또는 암성 병태를 치료하기 위해 사용되는 의약품을 지칭한다. 항암 약물은 방사성동위원소 (예를 들어, 요오드-131, 루테튬-177, 레늄-188, 이트륨-90), 톡신 (예를 들어, 디프테리아, 슈도모나스, 리신, 겔로닌), 효소, 전구약물 활성화 효소, 방사성-감작성 약물, 간섭 RNA, 슈퍼항원, 항-맥관형성 작용제, 알킬화제, 퓨린 길항제, 피리미딘 길항제, 식물 알칼로이드, 개재 항생제, 아로마타제 억제제, 항-대사물질, 유사분열 억제제, 성장 인자 억제제, 세포 주기 억제제, 효소, 토포이소머라제 억제제, 생물학적 반응 변형제, 항-호르몬 및 항-안드로겐의 군 중 하나로 통상적으로 분류된다. 이러한 항암제의 예에는 BCNU, 시스플라틴, 겜시타빈, 히드록시우레아, 파클리탁셀, 테모졸로미드, 토포테칸, 플루오로우라실, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 프로카르바진, 데카르바진, 알트레타민, 메토트렉세이트, 머캅토퓨린, 티오구아닌, 플루다라빈 포스페이트, 클라드리빈, 펜토스타틴, 시타라빈, 아자시티딘, 에토포시드, 테니포시드, 이리노테칸, 도세탁셀, 독소루비신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 이다루비신, 플리카마이신, 미토마이신, 블레오마이신, 타목시펜, 플루타미드, 류프롤리드, 고세렐린, 아미노글루티미드, 아나스트로졸, 암사크린, 아스파라기나제, 미톡산트론, 미토탄 및 아미포스틴이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "클로로톡신"은 소정 아미노산 서열 (서열 번호 1)을 갖는 36개 아미노산 길이의 펩티드를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "클로로톡신"은 스콜피온 레이우리우스 퀸퀘스트리아투스 또는 클로로톡신이 발견될 수 있는 여타 유기체의 독으로부터 단리된 클로로톡신 뿐만 아니라 재조합 및 합성 클로로톡신도 포함한다.
본원에 사용된 어구 "클로로톡신 접합체"는 하나 이상의 관심 물질/물질들 또는 잔기/잔기들과 공유적으로 회합된 클로로톡신 폴리펩티드를 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, 관심 물질은 폴리펩티드가 아니고/거나 폴리펩티드 쇄 내에 연결되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 관심 물질은 아미노산 측쇄에 연결된다. 몇몇 실시양태에서, 관심 물질은 리신 잔기를 통해 클로로톡신 폴리펩티드에 연결된다.
본원에 사용된 어구 "클로로톡신 폴리펩티드"는 클로로톡신 (서열 번호 1)과 적어도 45％ 전체 서열 동일성을 나타내고, 24개 내지 40개 (경계 포함)의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, 클로로톡신 폴리펩티드는 서열 번호 1과 적어도 50％, 적어도 55％, 적어도 60％, 적어도 65％, 적어도 70％, 적어도 75％, 적어도 80％, 적어도 85％, 적어도 86％, 적어도 87％, 적어도 88％, 적어도 89％, 적어도 90％, 적어도 91％, 적어도 92％, 적어도 93％, 적어도 94％, 적어도 95％, 적어도 96％, 적어도 97％, 적어도 98％ 또는 적어도 99％의 전체 서열 동일성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 클로로톡신 폴리펩티드는 서열 번호 1과 적어도 65％의 전체 서열 동일성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 클로로톡신 폴리펩티드는 서열 번호 1과 적어도 91％의 전체 서열 동일성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 클로로톡신 폴리펩티드는 서열 번호 1과 적어도 94％의 전체 서열 동일성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 클로로톡신 폴리펩티드는 서열 번호 1과 적어도 97％의 전체 서열 동일성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 클로로톡신 폴리펩티드는 서열 번호 1과 적어도 하나의 특징적인 서열 요소를 추가로 공유한다. 몇몇 실시양태에서, 특징적인 서열 요소는 TTDHQMAR (서열 번호 29)이다. 몇몇 실시양태에서, 클로로톡신 폴리펩티드는 24개 내지 40개 (경계 포함)의 아미노산으로 이루어진 길이를 갖는다. 몇몇 실시양태에서, "클로로톡신 폴리펩티드"는 전형적으로 C- 및/또는 N-말단에, 및/또는 서열 내에 삽입된 분리된 블록으로서 하나 이상의 추가의 아미노산 스트레치(들)을 포함한다. 전형적으로, 이러한 추가의 스트레치는 길이가 약 3 내지 약 1000개의 아미노산이다. 몇몇 실시양태에서, 추가의 스트레치는 길이가 약 3-100개, 3-90개, 3-80개, 3-70개, 3-60개, 3-50개, 3-40개, 3-30개 또는 3-20개의 아미노산이다. 몇몇 실시양태에서, 추가의 스트레치는 길이가 약 20개 이하의 아미노산이거나, 약 15개 이하의 아미노산이거나, 또는 약 10개 이하의 아미노산이다. 몇몇 실시양태에서, 추가의 스트레치는 하나 이상의 공지된 태그 (tag)를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 추가의 스트레치는 세포독성제를 포함한다.
본원에 사용된 어구 "조합 요법"은, 대상체가 2가지 작용제 모두에 동시에 노출되도록 2가지 이상의 활성 작용제를 투여하는 것을 지칭한다. 당업자는 임의의 개별 작용제가 단일 용량으로, 또는 다수의 용량으로, 예를 들어 예정된 간격에 걸쳐 서로 떨어져서, 또는 예정된 패턴으로 바람직하게 투여될 수 있음을 알 것이다. 조합 요법은 2가지 이상의 활성 작용제의 용량이 동시에 투여되어야만 하는 것은 아니며, 상기 용량을 투여받는 대상체가 2가지 작용제 모두에 동시에 노출되기만 하면 된다. 또한, 조합 요법은 2가지 이상의 활성 작용제가 동일한 경로로 투여되어야만 하는 것도 아니다. 몇몇 실시양태에서, 조합 요법으로 투여되는 적어도 2가지의 활성 작용제 중 하나 또는 둘 모두는, 단독으로 투여되는 경우의 용량 또는 빈도에 비해 감소된 용량 및/또는 빈도로 투여된다.
아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 내의 위치 또는 부위를 설명하기 위해 사용되는 어구 "상응하는"은 당업계에서 이해되는 그대로 본원에서 사용된다. 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 2개 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 블라스트 (BLAST), 클러스탈엑스 (ClustalX), 시퀀처 (Sequencher) 등과 같은 프로그램을 비롯한 표준 생물정보학 도구를 이용하여 정렬될 수 있다. 상기 2개 이상의 서열이 정확히 매치되지 않고/거나 동일한 길이를 갖지 않을 수 있지만, 서열의 정렬은 여전히 수행될 수 있고, 필요한 경우에 "컨센서스 (consensus)" 서열이 생성된다. 실제로, 정렬을 위해 이용되는 프로그램 및 알고리즘은 전형적으로, 삽입, 결실, 전위, 다형성, 점 돌연변이 등을 비롯한 규정가능한 수준의 차이를 허용한다. 이러한 정렬은 한 뉴클레오티드 서열 중의 위치가 다른 뉴클레오티드 서열의 위치에 상응하는지 결정하는 것을 도울 수 있다.
본원에 사용된 어구 "투여 섭생"은 소정 시간의 기간만큼 분리되어 개별적으로 투여되는 소정 세트의 단위 용량 (전형적으로 1개 초과)을 지칭한다. 특정 제약 작용제 또는 조성물에 대해 권장되는 세트의 용량 (즉, 양, 시점, 투여 경로 등)이 투여 섭생을 구성한다.
본원에 사용된 용어 "유효량" 및 "유효 용량"은 의도된 목적(들), 즉 허용가능한 이익/위험 비율로 조직 또는 대상체에서 요망되는 생물학적 또는 의학적 반응을 수행하기에 충분한 화합물 또는 조성물의 임의의 양 또는 용량을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 특정 실시양태에서, 상기 목적(들)은 맥관형성을 억제하는 것, 신생혈관의 퇴화를 유발하는 것, 또다른 생체활성 분자의 활성을 방해하는 것, 종양의 퇴화를 유발하는 것, 전이를 억제하는 것, 전이의 정도를 감소시키는 것 등일 수 있다. 의도된 해당 목적은 객관적인 것 (즉, 일부 시험 또는 마커에 의해 측정가능한 것) 또는 주관적인 것 (즉, 대상체가 효과의 지표를 나타내거나 효과를 느끼는 것)일 수 있다. 치료 유효량은 통상적으로 다수의 단위 용량을 포함할 수 있는 투여 섭생으로 투여된다. 임의의 특정 제약 작용제에 대해, 치료 유효량 (및/또는 효과적인 투여 섭생 내의 적절한 단위 용량)은, 예를 들어 투여 경로, 다른 제약 작용제와의 조합 여부에 따라 달라질 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 임의의 특정 환자에 대한 구체적인 치료 유효량 (및/또는 단위 용량)은, 치료 대상 장애 및 장애의 중증도; 사용되는 특정 제약 작용제의 활성; 사용되는 특정 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강상태, 성별 및 식이요법; 투여 시간, 투여 경로, 및/또는 사용되는 특정 제약 작용제의 분비 또는 대사 속도; 치료의 지속기간; 및 의약 분야에 널리 공지된 기타 요인을 비롯한 각종 요인에 의존적일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "형광발색단", "형광 잔기", "형광 표지", "형광 염료" 및 "형광 표지 잔기"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 이들은, 용액 상태에서, 그리고 적절한 파장의 빛으로 여기시에, 다시 빛을 방출하는 분자를 지칭한다. 각종 구조 및 특성의 무수한 형광 염료가 본 발명의 실시에 사용하기 적합하다. 유사하게, 핵산을 형광 표지하는 방법 및 재료가 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [R.P. Haugland, "Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 1992-1994", 5 th Ed., a 1994, Molecular Probes, Inc.] 참조). 형광발색단을 선택함에 있어서, 형광 분자가 높은 효율 (즉, 높은 분자 흡수 계수 및 형광 양자 수율)로 빛을 흡수하여 형광을 방출하고, 광안정적인 것 (즉, 분석 수행에 필수적인 시간 내에 빛 여기시 유의하게 분해되지 않음)이 대체로 바람직하다.
본원에 사용된 용어 "억제하다"는 어떤 일이 일어나는 것을 방지하고/거나, 어떤 일이 일어나는 것을 지연시키고/거나, 어떤 일이 일어나는 정도 또는 가능성을 감소시키는 것을 의미한다. 따라서, "맥관형성을 억제하다" 및 "신생혈관의 형성을 억제하다"는 맥관형성을 방지하고/거나, 지연시키고/거나, 그 가능성을 감소시키는 것 뿐만 아니라, 신생혈관의 수, 성장 속도, 크기 등을 감소시키는 것을 포함하고자 하는 의도이다.
용어 "표지된" 및 "검출가능한 작용제 또는 잔기로 표지된"은, 소정의 물질 (예를 들어, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드 또는 클로로톡신 접합체)이 예컨대 또다른 물질 (예를 들어, 신생물성 종양 조직)에 결합된 후에 가시화될 수 있음을 특정하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 검출가능한 작용제 또는 잔기는, 그 강도가 결합된 물질의 양과 상관되게 (예를 들어, 비례하게) 하고 측정될 수 있는 신호를 생성하게 하도록 선택될 수 있다. 단백질 및 펩티드를 표지하고/거나 검출하기 위한 각종 시스템이 당업계에 공지되어 있다. 표지된 단백질 및 펩티드는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적, 화학적 또는 여타 수단에 의해 검출가능한 표지를 혼입시키거나 또는 이것에 접합시킴으로써 제조될 수 있다. 표지 또는 표지 잔기는 직접적으로 검출가능할 수도 있고 (즉, 검출가능하도록 하기 위한 추가의 반응 또는 조작이 전혀 필요하지 않음, 예를 들어 형광발색단이 직접 검출가능함), 또는 간접적으로 검출가능할 수도 있다 (즉, 검출가능한 또다른 물질과의 반응 또는 결합을 통해 검출가능해 짐, 예를 들어 합텐 (hapten)이 형광발색단과 같은 수용체를 포함하는 적절한 항체와의 반응 후에 면역염색법으로 검출가능해 짐). 적합한 검출가능한 작용제에는 방사핵종, 형광발색단, 화학발광 작용제, 미세입자, 효소, 발색성 표지, 자성 표지, 합텐, 분자 비컨 (beacon), 압타머 (aptamer) 비컨 등이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "황반 변성"은 망막의 손상으로 인해 시야의 중추 (황반)에서 시력 상실을 초래하는 의학적 상태를 지칭한다. 여러 형태의 황반 변성이 존재하는 것으로 공지되어 있고, 달리 특정되지 않으면, 용어 "황반 변성"은 모든 형태를 포함한다. "습식 황반 변성" (또한 신생혈관성 또는 삼출성 형태로도 공지됨)은 망막 뒤의 맥락막으로부터의 혈관 성장을 수반하는 황반 변성을 지칭한다. 습식 황반 변성에서는 때때로 망막이 떨어질 수 있다. "건식 황반 변성" (또한 비-삼출성 형태로도 공지됨)에서는, 드루젠 (drusen)이라 불리우는 세포 찌꺼기가 망막과 맥락막 사이에 축적되지만, 혈관의 형성은 일어나지 않는다. "노화-관련 황반 변성" (ARMD)은 황반에 특징적인 황색 침착물이 생기는, 전형적으로 일생의 후반기에 시작되는 가장 흔한 형태의 황반 변성을 지칭한다. ARMD는 습식 또는 건식 형태의 황반 변성 중 하나로 나타날 수 있다.
본원에 사용된 용어 "전이" (때때로 "mets"로 약칭됨; 복수 "전이들")는 종양 세포가 한 기관 또는 조직으로부터 또다른 위치로 퍼지는 것을 지칭한다. 또한, 이 용어는 전이의 결과로서 새로운 위치에 형성되는 종양 조직을 지칭한다. "전이성 암"은 그의 원래 (즉, 원발성) 위치로부터 퍼지는 암이며, 또한 "속발성 암" 또는 "속발성 종양"으로도 지칭될 수 있다. 일반적으로, 전이성 종양은 이것이 기원하는 원발성 종양의 조직에 대해 명명된다. 따라서, 폐로 전이된 유방암은, 몇몇 암 세포가 폐에 위치해 있다고 하더라도 "전이성 유방암"으로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 어구 "모노리신 클로로톡신 폴리펩티드"는 접합을 위한 부위로서 가용한 리신 잔기를 1개만 갖는 클로로톡신 폴리펩티드를 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, 모노리신 클로로톡신 폴리펩티드는 1개의 리신 잔기만을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 모노리신 클로로톡신 폴리펩티드는 1개 초과의 리신 잔기를 갖지만, 리신 잔기 중 단 1개만이 접합을 위한 부위로서 가용하다. 이러한 몇몇 실시양태에서, 몇몇 리신 상의 하나 이상의 차단 기가 이들을 접합을 위한 부위로서 가용하지 않도록 만든다.
본원에 사용된 용어 "신생혈관"은 아직 완전히 성숙하지 않은, 즉 긴밀한 세포 연결부 또는 평활근 세포를 둘러싸는 완전한 층을 갖는 내피 라이닝이 완전히 형성되지 않은, 새로이 형성된 혈관을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "신혈관"은 신생혈관의 혈관을 지칭하기 위해 사용된다.
용어 "제약 작용제", "치료제" 및 "약물"은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 이들은 질환, 장애 또는 임상적 병태의 치료, 억제 및/또는 검출에 효과적인 물질, 분자, 화합물, 작용제, 인자 또는 조성물을 지칭한다.
"제약 조성물"은 본원에서, 유효량의 적어도 하나의 활성 성분 (예를 들어, 표지되거나 표지되지 않을 수 있는, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드 또는 클로로톡신 접합체), 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물로서 정의된다.
본원에 사용된 용어 "예방하는"은, 소정의 과정 (예를 들어, 맥관형성, 전이, 암 진행 등)에 대한 작용제의 활동을 지칭하기 위해 사용될 때, 작용제 (예를 들어, 치료제, 예컨대 클로로톡신 접합체)가 상기 과정과 관련된 하나 이상의 징후 또는 속성의 발달 전에 투여되는 경우에 그러한 과정의 정도를 감소시키고/거나 그의 발명을 지연시키는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "원발성 종양"은 종양이 처음으로 발생한 원래의 부위에 있는 종양 (즉, 거기로 퍼진 종양에 대한 반대말)을 지칭한다.
용어 "전구약물"은 생체내 투여 후에 생물학적, 제약적 또는 치료적 활성 형태의 화합물로 대사되거나 달리 전환되는 화합물을 지칭한다. 전구약물은 화합물의 대사 안정성 또는 수송 특성을 변경시키고/거나, 부작용 또는 독성을 차단하고/거나, 화합물의 향을 개선시키고/거나, 화합물의 특성 또는 특징을 변경시키기 위해 고안될 수 있다. 생체내 약물동력학적 과정 및 약물 대사의 지식에 의해, 일단 제약 활성 화합물이 확인되면, 제약 분야의 당업자는 일반적으로 그 화합물의 전구약물을 고안할 수 있다 (문헌 [Nogrady, "Medicinal Chemistry A Biochemical Approach", 1985, Oxford University Press: N.Y., pages 388-392]). 또한, 적합한 전구약물의 선별 및 제조를 위한 절차도 당업계에 공지되어 있다. 몇몇 실시양태에서, 전구약물은 그의 활성 형태 (생체내 투여 후)로의 전환이 효소적 촉매작용과 관련된 화합물이다.
용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 각종 길이의, 그의 중성 (비하전) 형태이거나 염으로서의, 글리코실화, 측쇄 산화 또는 인산화에 의해 변형되거나 변형되지 않은 아미노산 서열을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 아미노산 서열은 전장 천연 단백질이다. 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 전장 단백질의 더 작은 단편이다. 또다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 아미노산 측쇄에 부착된 추가의 치환기, 예컨대 글리코실 단위, 지질 또는 무기 이온 (예컨대, 포스페이트), 및 또한 쇄의 화학적 전환과 관련된 변형 (예컨대, 술프히드릴기의 산화)에 의해 변형된다. 따라서, 용어 "단백질" (또는 그의 등가 용어)은 그의 특이적 성질을 변화시키지 않는 상기 변형으로 처리된, 전장 천연 단백질의 아미노산 서열을 포함하고자 하는 의도이다. 특히, 용어 "단백질"은 단백질 이소형, 즉 동일한 유전자에 의해 코딩되지만 pI 또는 MW, 또는 둘 모두가 상이한 변이체를 포함한다. 이러한 이소형은 아미노산 서열이 상이할 수 있거나 (예를 들어, 대안적인 슬라이싱 (slicing) 또는 제한된 단백질분해의 결과로), 또는 별법으로 차등적인 번역-후 변형 (예를 들어, 글리코실화, 아실화 또는 인산화)으로부터 기인할 수 있다.
본원에 사용된 어구 "감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드"는 클로로톡신 (서열 번호 1)이 가지고 있는 것보다 더 적은 리신 잔기를 갖고/거나 클로로톡신이 가지고 있는 것보다 접합을 위한 부위로서 가용한 리신 잔기가 더 적은 클로로톡신 폴리펩티드를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 1개 이하의 리신 잔기를 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 단 1개의 리신 잔기를 갖는다. 특정 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 접합을 위한 부위로서 가용한 리신 잔기가 1개 이하이다. 몇몇 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드 중 1개를 제외한 모든 리신 잔기가 접합을 위한 부위로서 가용하지 않도록 변형되었다. 몇몇 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드의 모든 리신 잔기가 접합을 위한 부위로서 가용하지 않도록 변형되었다. 몇몇 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 접합을 위해 가용한 단일 부위를 함유한다.
용어 "퇴화시키다"는, 혈관 및/또는 맥관구조 (신생혈관 및/또는 신혈관 포함)를 지칭하기 위해 사용될 때, 본원에서 수축, 줄어듬 등을 의미하기 위해 사용된다.
용어 "대상체" 및 "개체"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 이들은 질환 또는 장애 (예를 들어, 암, 황반 변성 등)에 걸리거나 걸리기 쉬울 수 있는 (질환 또는 장애를 가질 수도, 또는 가지지 않을 수도 있음) 인간 또는 또다른 포유동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)을 지칭한다. 많은 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 많은 실시양태에서, 대상체는 환자이다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 "개체" 및 "대상체"는 특정 연령을 의미하지 않으며, 따라서 성인, 어린이 및 신생아를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "걸리기 쉬운"은, 일반적인 집단에서 관찰되는 것보다 어떤 것, 즉 질환, 장애 또는 병태 (예를 들어, 암, 전이성 암, 황반 변성, 류머티스성 관절염 등)에 대해 증가된 위험성 및/또는 성향을 가짐 (전형적으로 유전자 소인, 환경적 요인, 개인 이력 또는 이들의 조합에 기초함)을 의미한다. 상기 용어는 병태에 "걸리기 쉬운" 개체가 그러한 병태로 결코 진단받지 않을 수 있는 경우도 고려한다.
본원에 사용된 용어 "전신 투여"는 작용제가 체내에 유의한 양으로 널리 분포하여 혈관에서 생물학적 효과 (예를 들어, 그의 요망되는 효과)를 나타내고/거나 혈관계를 통해 원하는 작용 부위에 도달하도록 작용제를 투여하는 것을 지칭한다. 전형적인 전신 투여 경로에는 (1) 작용제를 혈관계에 직접 도입하는 것, 또는 (2) 경구, 폐 또는 근육내 투여 (작용제가 혈관계에 흡수되어 혈관계로 들어가, 혈관을 통해 하나 이상의 원하는 작용 부위(들)로 전달됨)에 의해 투여되는 것이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "치료하는"은 특정 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징의 부분적 또는 완전한 완화, 개선, 경감, 개시 지연, 진행 억제, 중증도 감소 및/또는 발생 감소를 지칭한다. 예를 들어, 암을 "치료하는"은 종양 세포가 생존, 성장 및/또는 퍼지는 것을 억제하는 것; 전이 및/또는 재발의 발생 가능성을 예방, 지연 및/또는 감소시키는 것; 및/또는 전이의 횟수, 성장 속도, 크기 등을 감소시키는 것을 지칭할 수 있다. 치료는 질환, 장애 및/또는 병태의 징후를 나타내지 않는 대상체 및/또는 질환, 장애 및/또는 병태의 초기 징후만을 나타내는 대상체에게, 질환, 장애 및/또는 병태와 관련된 병리상태 발병의 위험성을 감소시킬 목적으로 투여될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 치료는 제약 조성물을 대상체에게 전달하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 어구 "단위 용량"은 예정된 양의 활성 성분 (예를 들어, 치료제)을 포함하는 제약 조성물의 개별 양을 지칭한다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에게 투여될 활성 성분의 투여량 및/또는 그러한 투여량의 편리한 분율, 예컨대 그러한 투여량의 1/2 또는 1/3과 동일하다.
<본 발명의 특정 실시양태에 대한 상세한 설명>
I. 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드
표 1에 나타나고 서열 번호 1에 나열된 바와 같이, 클로로톡신은 서열 번호 1의 위치 15, 23 및 27에 3개의 리신 잔기를 갖는 36개 아미노산의 펩티드이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 감소된 수의 리신 잔기를 갖는 클로로톡신 폴리펩티드 ("감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드")를 제공한다. 특정 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드가 서열 번호 1과 적어도 45％의 전체 서열 동일성을 갖고 24 내지 40개 (경계 포함)의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다는 점에서 서열 번호 1에 상응하는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 서열 번호 1과 적어도 50％, 적어도 55％, 적어도 60％, 적어도 65％, 적어도 70％, 적어도 75％, 적어도 80％, 적어도 85％, 적어도 86％, 적어도 87％, 적어도 88％, 적어도 89％, 적어도 90％, 적어도 91％, 적어도 92％, 적어도 93％, 적어도 94％, 적어도 95％, 적어도 96％, 적어도 97％, 적어도 98％ 또는 적어도 99％의 전체 서열 동일성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 서열 번호 1과 적어도 65％의 전체 서열 동일성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 클로로톡신 폴리펩티드는 서열 번호 1과 적어도 91％의 전체 서열 동일성을 갖는다. 예를 들어, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 36개의 아미노산 잔기 중 33개에서 아미노산 서열이 클로로톡신과 동일할 수 있다 (즉, 약 91.7％의 서열 동일성). 몇몇 실시양태에서, 클로로톡신 폴리펩티드는 서열 번호 1과 적어도 94％의 전체 서열 동일성을 갖는다. 예를 들어, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 36개의 아미노산 잔기 중 34개에서 아미노산 서열이 클로로톡신과 동일할 수 있다 (즉, 약 94.4％의 서열 동일성). 몇몇 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 서열 번호 1과 적어도 97％의 전체 서열 동일성을 갖는다. 예를 들어, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 36개의 아미노산 잔기 중 35개에서 아미노산 서열이 클로로톡신과 동일할 수 있다 (즉, 약 97.2％의 서열 동일성). 몇몇 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 33, 34, 35, 36, 37 또는 38개의 아미노산로 이루어진 스트레치이고/거나 이를 함유할 수 있고, 그 서열은 클로로톡신 서열에 상응하거나, 또는 적어도 45％, 적어도 50％, 적어도 55％, 적어도 60％, 적어도 65％, 적어도 70％, 적어도 75％, 적어도 80％, 적어도 85％, 적어도 86％, 적어도 87％, 적어도 88％, 적어도 89％, 적어도 90％, 적어도 91％, 적어도 92％, 적어도 93％, 적어도 94％, 적어도 95％, 적어도 96％, 적어도 97％, 적어도 98％ 또는 적어도 99％의 전체 서열 동일성을 나타낸다.
표 1은 클로로톡신의 서열 및 예시적인 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드를 나타낸다. 표 1은 본 발명을 제한하려는 의도가 아니라, 본 발명에 의해 제공되는 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드의 특정 예를 설명하기 위한 것이다.
<표 1>
Figure 112012070761705-pct00001
Figure 112012070761705-pct00002
Figure 112012070761705-pct00003
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특정 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 접합을 위한 부위로서 가용한 리신을 1개 이하로 갖는다. 이러한 몇몇 실시양태에서, 1개의 리신이 가용하고, 이는 클로로톡신 폴리펩티드 내에서 리신이 클로로톡신에 존재하는 위치 (즉, 서열 번호 1의 위치 15, 23 또는 27)에 상응하는 위치에 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 가용한 단일 리신은 서열 번호 1의 위치 15에 있다. 몇몇 실시양태에서, 가용한 단일 리신은 서열 번호 1의 위치 23에 있다. 몇몇 실시양태에서, 가용한 단일 리신은 서열 번호 1의 위치 27에 있다. 몇몇 실시양태에서, 단일 리신은 본 발명의 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드에서 리신 잔기를 함유하지 않는 클로로톡신의 부위 (즉, 서열 번호 1의 위치 15, 23 또는 27 중 어느 하나에 상응하는 위치가 아님)에 상응하는 위치에 존재한다.
특정 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 서열 번호 1의 위치 15, 23 또는 27에 상응하는 적어도 하나의 아미노산 잔기가 결여되어 있다.
특정 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 리신 잔기가 전적으로 결여되어 있다 (예를 들어, 서열 번호 2, 5, 6, 24, 25 및 26 참조). 몇몇 실시양태에서, 클로로톡신에서 정상적으로 발견되는 위치의 아미노산이 결실되어 있다. 몇몇 실시양태에서, 클로로톡신에서 정상적으로 발견되는 하나 이상의 리신 잔기가 또다른 아미노산 잔기 및/또는 아미노산 유도체로 대체되어 있다. 즉, 서열 번호 1의 위치 15, 23 또는 27에 상응하는 폴리펩티드의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 리신이 아니다. 폴리펩티드를 전형적으로 구성하는 다른 19개의 자연 발생 아미노산 (알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 아스파라긴, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 티로신, 트립토판 및 발린)에 더하여, 각종 치환기가 사용될 수 있다. 치환기의 비제한적인 예에는 여타 자연 발생 아미노산, 비-자연 발생 아미노산 (예컨대, D-아미노산) 및 아미노산 유도체가 포함된다. 여타 자연 발생 아미노산의 비제한적인 예에는 베타-알라닌, 카르니틴, 시트룰린, 시스틴, 감마-아미노부티르산, 히드록시프롤린, 오르니틴 및 타우린이 포함된다 (자연 발생 아미노산 및 아미노산 유도체의 추가 예에 대해, 예를 들어 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Wagner and Musso (1983), "New Naturally Occuring Amino Acids," Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 22:816-828] 참조). 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 리신 잔기는 아르기닌 및/또는 알라닌으로 대체된다.
감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드에 전적으로 리신 잔기가 결여된 몇몇 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단 (즉, N- 및/또는 C-말단)은 화학적 접합을 위한 부위로서 작용할 수 있다. 말단 또는 말단들의 가용성은 이용되는 특정 접합 화학에 의존할 수 있다. 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드에 전적으로 리신 잔기가 결여된 몇몇 실시양태에서, N-말단의 알파 아미노기만이 접합을 위한 부위로서 가용하다.
1개 초과의 리신 잔기가 대체된 실시양태에서, 동일하거나 상이한 아미노산 잔기(들) 또는 아미노산 유도체(들)이 리신 잔기를 대체하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 동일한 아미노산 잔기가 리신 잔기를 대체하기 위해 사용된 비제한적인 예에 대해서는 서열 번호 17-22를 참조하고, 상이한 아미노산 잔기가 리신 잔기를 대체하기 위해 사용된 비제한적인 예에 대해서는 서열 번호 23을 참조한다.
몇몇 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 서열 내에 단 1개의 리신을 갖는다 ("모노리신 클로로톡신 폴리펩티드"). 몇몇 실시양태에서, 그러한 클로로톡신 폴리펩티드는, 리신 잔기가 클로로톡신에서 정상적으로 존재하는 위치, 예를 들어 서열 번호 1의 위치 15, 23 또는 27에 상응하는 위치에 리신 잔기를 갖는다 (예를 들어, 비제한적인 예에 대해서는 서열 번호 14-23 참조). 몇몇 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는, 리신 잔기가 클로로톡신에서 정상적으로 존재하는 위치 (즉, 서열 번호 1의 위치 15, 23 및 27)에 리신 잔기를 전혀 갖지 않지만, 서열 번호 1의 위치 15, 23 및 27 중 어느 하나와 상응하지 않는 위치에 리신 잔기를 갖는다. 클로로톡신 폴리펩티드가 리신을 전혀 갖지 않는 것과 마찬가지로, 모노리신 클로로톡신 폴리펩티드는 서열 번호 1의 위치 15, 23 및 27에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산이 결실될 수 있고/거나 서열 번호 1의 위치 15, 23 및 27에 상응하는 하나 이상의 위치에 아미노산 또는 아미노산 유도체 치환을 가질 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 제공되는 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 하나 또는 하나 이상의 리신 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 갖지만, 그럼에도 불구하고 클로로톡신과 비교시 접합을 위해 가용한 리신의 수가 감소되어 있다. 몇몇 실시양태에서, 본원에서 제공된 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드에서의 하나 이상의 리신 잔기는, 클로로톡신 폴리펩티드에 존재하기는 하지만 접합을 위한 부위로서 가용하지 않도록 되어 있다. 예를 들어, 하나 이상의 리신 잔기(들)은 하나 이상의 리신 잔기(들)의 화학적 접합 반응에의 참여가 차단되도록 공유적으로 또는 비-공유적으로 변형되어, 접합을 위한 부위로서 가용한 리신 잔기(들)을 3, 2 또는 1개 보다 적게 (즉, "감소된" 리신) 남길 수 있다. 이러한 방식으로 사용될 수 있는 리신 잔기에 대한 공유 변형의 비제한적인 예에는 PEG화 (즉, 폴리에틸렌 글리콜 중합체의 부착에 의한 변형), 메틸화 (디- 및 트리- 메틸화 포함) 및 여타 알킬기(들)의 부착이 포함된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 리신 잔기는 엡실론 NH2 기에서 변형된다. 예를 들어, 주어진 R기 (예를 들어, 부틸, 프로필 또는 에틸 기)가 리신 잔기를 공유적으로 변형시키기 위해 사용되는 경우, 엡실론 NH2 기는 NR2 또는 NR3 기로 변형될 수 있다.
표 2는 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드를 생성하기 위해 사용될 수 있는 변형 도식의 몇몇 비제한적인 예를 제시한다.
<표 2>
Figure 112012070761705-pct00005
특정 실시양태에서, 특정 리신 잔기의 차단은 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드의 합성 도중 적절한 단계 동안 변형된 리신 (접합에 가용한 부위가 이미 차단됨)을 혼입시킴으로써 달성된다. 변형된 리신은 상업적으로 쉽게 입수할 수 있으며, 당업계에 공지된 일상적인 방법으로 합성될 수 있다. 이러한 방식으로 사용될 수 있는 변형된 리신의 비제한적인 예에는 이치환된 리신 또는 삼치환된 리신 (예를 들어, N,N-R2-리신 또는 N,N,N-R3-리신, 여기서 R은 차단기임) 및 짧은 PEG 분자가 부착된 리신이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다. R은, 리신에 공유적으로 부착되는 경우에 리신 잔기가 화학적 접합 반응에 참여하는 것을 차단하는 작용을 하는 임의의 기일 수 있다. 예를 들어, 알킬기 (예를 들어, 부틸, 메틸 및 에틸)가 차단기로서 작용할 수 있다. 예를 들어, N,N-디메틸-리신 및/또는 N,N,N-트리메틸-리신이 합성 도중에 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단 (즉, N- 및/또는 C-말단)이 차단되어, 말단/말단들이 화학적 접합 반응에 참여하는 것을 방지한다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 적어도 하나의 말단이 차단되지 않은 경우에 접합 반응에 참여하는 접합 화학이 이용된다. 아민에서의 알킬기 부가 (예를 들어, 메틸화)에 의한 공유 변형이 포함되나 이에 한정되지는 않는, 폴리펩티드의 N- 및/또는 C-말단을 차단하는 각종 방법이 당업계에 공지되어 있다.
본원에 기재된 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드를 합성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 몇몇 펩티드 합성 방법에서, 한 아미노산 (또는 아미노산 유도체)의 아미노기는 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC)와 같은 시약과의 반응에 의해 활성화된 또다른 아미노산 (또는 아미노산 유도체)의 카르복실기에 연결된다. 유리 아미노기가 활성화된 카르복실기를 공격할 때, 펩티드 결합이 형성되고 디시클로헥실우레아가 방출된다. 이러한 방법에서, 잠재적으로 반응성인 여타 기 (예컨대, N-말단 아미노산 또는 아미노산 유도체의 α-아미노기 및 C-말단 아미노산 또는 아미노산 유도체의 카르복실기)는 화학 반응에 참여하는 것으로부터 차단 ("보호")될 수 있다. 따라서, 특정 활성 기만이 반응하여, 원하는 생성물이 형성된다. 이러한 목적에 유용한 차단기에는 아민기를 보호하기 위한 tert-부톡시카르보닐기 (t-Boc) 및 벤조일옥시카르보닐기; 및 카르복실기를 보호하기 위한 단순 에스테르 (예컨데, 메틸 및 에틸 기) 및 벤질 에스테르가 제한없이 포함된다. 전형적으로, 차단기는 펩티드 결합을 무손상 상태로 남기는 처리 (예를 들어, 묽은 산으로의 처리)에 의해 후속적으로 제거될 수 있다. 반응하지 않아야 하는 반응기의 보호 공정, 커플링에 의한 펩티드 결합 형성 공정, 및 반응기의 탈보호 공정이 반복될 수 있다. 펩티드는 아미노산을 순차적으로 부가하여 펩티드 쇄를 성장시킴으로써 합성될 수 있다. 액상 및 고상 펩티드 합성 방법 둘 다 본 발명에 따라 이용하기에 적합하다. 고상 펩티드 합성 방법에서, 성장하는 펩티드 쇄는 전형적으로 불용성 매트릭스 (예컨대, 폴리스티렌 비드)에, 카르복시말단 아미노산을 매트릭스에 연결시킴으로써 연결된다. 합성의 말미에, 펩티드는 펩티드 결합을 파괴하지 않는 절단 시약, 예컨대 히드로플루오르산 (HF)을 사용하여 매트릭스로부터 방출될 수 있다. 또한, 보호기는 전형적으로 이 시간에 제거된다. 또한, 자동화, 고처리량 및/또는 병렬 펩티드 합성 방법이 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 펩티드 합성 방법에 대한 추가의 정보는, 예를 들어 각각의 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Merrifield (1969) "Solid-phase peptide synthesis," Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol., 32:221-96]; [Fridkin et al. (1974) Annu Rev Biochem., 43 (0):419-43]; [Merrifield (1997) "Concept and Early Development of Solid Phase Peptide Synthesis," Methods in Enzymology, 289:3-13]; [Sabatino et al. (2009) "Advances in automatic, manual and microwave-assisted solid-phase peptide synthesis," Curr Opin Drug Discov Devel., 11(6):762-70]을 참조한다.
몇몇 실시양태에서, 리신 잔기에 대한 변형은 본원에 기재된 여타 수단 (예를 들어, 리신 잔기의 또다른 아미노산 또는 아미노산 유도체로의 대체, 및/또는 클로로톡신에서 정상적으로 발견되는 리신 잔기의 결여)과 조합하여 사용된다.
몇몇 실시양태에서, N-말단의 보호기는 합성의 말미에 제거되지 않는다. 이 보호기를 남겨놓는 것은, 예를 들어 차단된 N-말단을 갖는 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드를 생성하는 작용을 할 수 있으며, 이에 따라 특정 화학적 접합 설계에서 접합에 가용한 부위를 제한할 수 있다.
II. 클로로톡신 접합체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 물질 또는 잔기와 회합된 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드를 포함하는 클로로톡신 접합체가 제공된다. 본 발명의 클로로톡신 접합체는 본원에 기재된 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드를 포함하는 임의 길이의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
A. 접합
몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 물질 또는 잔기는 리신 잔기 및/또는 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드의 말단을 통해 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드와 회합된다. 이러한 몇몇 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드에 물질 또는 잔기가 부착될 수 있는 위치(들)은 접합을 위한 부위로서 가용한 리신 잔기의 수에 의해 제한된다. 예를 들어, 물질 또는 잔기는 모노리신 클로로톡신 폴리펩티드에서 가용한 단일 리신 잔기에 부착될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 물질 또는 잔기는 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에서 회합될 수 있다. 이러한 몇몇 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 클로로톡신 내의 "천연" 위치 (예를 들어, 위치 15, 23 및 27에 상응하는 위치) 중 어디에도 접합을 위해 가용한 리신 잔기를 갖지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 하나 이상의 물질/물질들 또는 잔기/잔기들에 공유적으로 회합된다. 당업자가 인식할 수 있는 바와 같이, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드 및 하나 이상의 물질/물질들 및/또는 잔기/잔기들은 직접적으로 또는 간접적으로 (예를 들어, 링커를 통해) 부착될 수 있다.
각종 접합 화학이 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 물질/물질들 또는 잔기/잔기들은 리신 잔기의 엡실론 아미노기에 부착된다. 몇몇 실시양태에서, 접합 화학은 NHS (N-히드록시숙신이미드)/EDC (1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드) 화학에 기초한다. 몇몇 실시양태에서, 접합 화학은 티올화 화학 (즉, 트라우트 시약 (Traut's reagent) 및/또는 2-이미노티올란과 같은 티올화제를 사용하는 것)에 기초한다.
특정 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드 및 하나 이상의 물질/물질들 또는 잔기/잔기들은 직접적으로, 공유적으로 서로 연결된다. 이러한 직접 공유 결합은, 예를 들어 아미드, 에스테르, 탄소-탄소, 디설파이드, 카르바메이트, 에테르, 티오에테르, 우레아, 아민 또는 카르보네이트 결합을 통한 각종 방식 중 어느 하나로 달성될 수 있다. 그러한 공유 결합은, 예를 들어 물질/물질들 또는 잔기/잔기들 및/또는 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드에 존재하는 관능기를 활용하여 달성될 수 있다. 사용될 수 있는 적합한 관능기에는 아민, 무수물, 히드록실기, 카르복실기, 티올 등이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 미래의 접합체의 한 부분의 관능기는 미래의 접합체의 다른 부분에의 커플링을 위해 활성화된다. 예를 들어, 활성화제, 예컨대 카르보디이미드가 그러한 커플링을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 각종 활성화제가 당업계에 공지되어 있고, 제공된 접합체를 형성하기에 적합하다.
몇몇 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드 및 하나 이상의 물질/물질들 또는 잔기/잔기들은 링커 기를 통해 서로 간접적으로 공유 연결된다. 그러한 간접적 공유 연결은 당업계에 널리 공지된 무수한 안정한 이관능성 작용제 (동질-관능성 및 이질-관능성 작용제 포함) 중 어느 것을 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 작용제의 비제한적인 예에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Pierce Catalog and Handbook]을 참조한다. 이관능성 작용제의 용도는, 이관능성 작용제가 생성된 접합체에 존재하는 연결 잔기를 형성하는 반면에 활성화제는 반응에 관여하는 2개의 잔기들 사이에 직접 커플링을 초래한다는 점에서, 활성화제의 용도와 상이하다. 이관능성 작용제의 역할은 달리 불활성인 2개의 잔기들 사이에 반응이 가능하도록 할 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 반응 생성물의 일부가 되는 이관능성 작용제는 접합체에 어느 정도의 형태적 가변성을 부여하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 이관능성 작용제는 여러 개의 원자, 예컨대 2 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 알킬을 포함할 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 이관능성 작용제는 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드와 하나 이상의 물질/물질들 또는 잔기/잔기들 사이에 형성된 연결이 절단가능하도록 (예를 들어, 가수분해가능하도록) 선택될 수 있다 (이러한 링커의 비제한적인 예에 대해서는, 예를 들어 각각의 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제5,773,001호; 제5,739,116호 및 제5,877,296호 참조). 이러한 링커는, 예를 들어 감소된 리신의 폴리펩티드에 접합된 물질 또는 잔기가 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드로부터의 가수분해 후에 더 높은 활성을 갖는 것으로 관찰되는 치료적 잔기인 경우에 사용될 수 있다. 절단을 달성하는 예시적인 메커니즘에는 리소좀의 산성 pH에서의 가수분해 (히드라존, 아세탈 및 시스-아코니테이트-유사 아미드), 리소좀성 효소 (예를 들어, 카텝신 및 여타 리소좀성 효소)에 의한 펩티드 절단, 및 디설파이드의 환원이 포함된다. 부가적인 절단 메커니즘에는 세포외 또는 세포내 생리적 pH에서의 가수분해가 포함된다. 이러한 메커니즘은 하나 이상의 물질/물질들 또는 잔기/잔기들을 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드에 커플링시키기 위해 사용되는 가교제가 생분해성/생부식성 물질, 예컨대 폴리덱스트란 등인 경우에 적용될 수 있다.
예를 들어, 하나 이상의 치료적 잔기를 포함하는 접합체에 대해, 히드라존-함유 접합체가 원하는 약물-방출 특성을 제공하는 카르보닐기의 도입으로 제조될 수 있다. 또한, 접합체는 한쪽 말단에 디설파이드기를 갖고 다른쪽 말단에 히드라진 유도체를 갖는 알쿨 (alkul) 쇄를 포함하는 링커로 제조될 수 있다.
또한, 히드라존 이외의 관능기를 함유하는 링커도 리소좀의 산성 환경에서 절단될 잠재성을 갖는다. 예를 들어, 접합체는 세포내에서 절단가능한 히드라존 이외의 기, 예컨대 에스테르, 아미드 및 아세탈/케탈을 함유하는 티올-반응성 링커로부터 제조될 수 있다. 또한, 산소 원자들 중 하나는 물질 또는 잔기에 부착되고 다른 하나는 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드에의 부착을 위한 링커에 부착된, 5 내지 7원 고리 케톤으로부터의 케탈도 사용될 수 있다.
pH-민감성 링커 부류의 추가 예로는 시스-아코니테이트가 있는데, 이는 아미드기에 병치된 카르복실산기를 갖는다. 상기 카르복실산은 산성 리소좀에서 아미드 가수분해를 가속화시킨다. 또한, 여러가지 다른 유형의 구조를 갖는 유사한 유형의 가수분해 속도 가속화 링커도 사용될 수 있다.
또한, 리소좀성 효소에 의한 펩티드의 효소적 가수분해가 접합체로부터 물질 또는 잔기를 방출시키는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 아미드 결합을 통해 파라-아미노벤질 알코올에 부착될 수 있고, 이어서 카르바메이트 또는 카르보네이트가 벤질 알코올과 물질 또는 잔기 사이에서 만들어질 수 있다. 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드의 절단은 아미노 벤질 카르바메이트 또는 카르보네이트의 붕괴를 초래하고, 물질 또는 잔기의 방출을 초래한다. 추가의 예로서, 페놀은 카르바메이트 대신에 링커의 붕괴에 의해 절단될 수 있다. 다른 추가 예로서, 디설파이드 반응을 이용하여 파라-머캅토벤질 카르바메이트 또는 카르보네이트의 붕괴를 개시한다.
많은 치료적 잔기, 특히 항암제는 수용해도가 있다손 치더라도 거의 없으며, 이는 치료적 잔기의 응집으로 인한 접합체 상의 약물 로딩을 제한한다. 이를 극복하는 한가지 접근법은 링커에 가용화 기를 부가하는 것이다. PEG (폴리에틸렌 글리콜) 및 디펩티드로 이루어진 링커로 제조된 접합체 (예를 들어, 감소된 리신의 클로로톡신 접합체에 부착된 PEG 이-산 티올-산 또는 말레이미드-산, 디펩티드 스페이서, 및 물질 또는 잔기에 결합된 아미드를 갖는 것 포함)가 사용될 수 있다. PEG 기를 혼입시키는 접근법이 응집 및 약물 로딩 한계를 극복하는 데 유익할 수 있다.
클로로톡신 접합체 내의 물질 또는 잔기가 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드인 실시양태에서, 클로로톡신 접합체는 융합 단백질일 수 있다. 융합 단백질은, 개별 펩티드 주쇄를 통해 공유 결합에 의해 연결된 2개 이상의 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함하는 분자이다. 본 발명의 방법에서 사용되는 융합 단백질은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 이는 폴리펩티드 합성기를 이용한 직접 단백질 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 별법으로, 앵커 (anchor) 프라이머를 사용한 유전자 단편의 PCR 증폭을 수행할 수 있는데, 상기 프라이머는 후속적으로 어닐링 및 재-증폭되어 키메라 유전자 서열을 생성하는 2개의 연속적인 유전자 단편들 사이에 상보성 돌출부 (overhang)를 생성시킨다. 융합 단백질은 표준 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다 (예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Maniatis et al. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 2nd Ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, N.Y.] 참조). 이들 방법은 일반적으로 (1) 원하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 작제; (2) 상기 핵산 분자의 재조합 발현 벡터로의 삽입; (3) 발현 벡터를 사용한 적합한 숙주 세포의 형질전환; 및 (4) 숙주 세포에서의 융합 단백질 발현을 포함한다. 이러한 방법에 의해 생산된 융합 단백질은, 당업계에 공지된 바와 같이 배양 배지로부터 직접, 또는 세포의 용해에 의해 회수 및 단리될 수 있다. 형질전환된 숙주 세포에 의해 생산된 단백질을 정제하는 많은 방법이 당업계에 널리 공지되어 있다. 이런 방법에는 침전, 원심분리, 겔 여과 및 컬럼 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 역상 및 친화성 크로마토그래피)가 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다. 여타 정제 방법도 기재된 바 있다 (예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Deutscher et al. "Guide to Protein Purification" in Methods in Enzymology, 1990, vol. 192, Academic Press] 참조).
특정 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 하나 이상의 물질/물질들 또는 잔기/잔기들에 비공유적으로 회합된다. 비-공유 회합의 예에는 소수성 상호작용, 정전기 상호작용, 이극성 상호작용, 반데르발스 상호작용 및 수소 결합이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
톡신 잔기와 치료제 사이의 회합의 성질과 무관하게, 회합은 전형적으로 접합체가 세포로 또는 세포 내로의 수송 전 또는 도중에 해리되지 않을 정도로 선택적이고 특이적이며 강력해야 한다. 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드와 하나 이상의 물질/물질들 또는 잔기/잔기들 사이의 회합은 당업자에게 공지된 임의의 화학적, 생화학적, 효소적 또는 유전자적 커플링을 이용하여 달성될 수 있다.
당업자가 쉽게 인식할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 접합체는 임의 수의 상이한 방식으로 서로 회합된, 임의 수의 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드 및 임의 수의 물질 또는 잔기를 포함할 수 있다. 접합체의 고안은 그의 의도된 목적(들) 및 그의 용도의 특정한 맥락에서 요망되는 특성에 의해 영향을 받을 것이다. 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드를 물질 또는 잔기에 회합 또는 결합시켜 접합체를 형성하는 방법의 선택은 당업자의 지식 범위 내에 있고, 일반적으로 요망되는 회합의 성질 (즉, 공유 대 비공유 및/또는 절단가능 대 절단불가능), 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드 및 물질/잔기의 성질, 화학적 관능기의 존재 및 성질 등에 의존할 것이다.
B. 물질들/잔기들
상기 언급한 바와 같이, 특정 실시양태에서, 클로로톡신 접합체는 하나 이상의 비-클로로톡신 물질을 포함한다. 그러한 각종 물질 또는 잔기 중 임의의 것이 사용될 수 있다.
1. 치료적 물질들/잔기들
특정 실시양태에서, 제공되는 접합체는 하기 기재되고 국제 특허 공보 WO 2009/021136 Al호 (전체 내용이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 하나 이상의 치료적 물질 또는 잔기를 포함한다.
a. 항암제
몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 치료적 물질 또는 잔기는 항암제를 포함한다. 적합한 항암제에는, 예를 들어 세포독성제를 비롯하여 암 세포에 직접 또는 간접적으로 독성 또는 유해성인 매우 다양한 물질, 분자, 화합물, 작용제 또는 요인이 포함된다. 본 발명의 실시에 적합한 항암제는 합성 물질 또는 천연 물질일 수 있다. 항암제는 단일 분자 또는 상이한 분자의 복합체를 포함할 수 있다.
적합한 항암제는, 소분자, 펩티드, 당류, 스테로이드, 항체, 융합 단백질, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 리보자임(ribozyme), 작은 간섭 RNA, 펩티드모방체 등이 포함되나 이에 한정되지는 않는 다양한 부류의 화합물 중 어느 하나에 속할 수 있다. 유사하게, 적합한 항암제는 알킬화제, 항-대사물질 약물, 항-유사분열 항생제, 알칼로이드성 항-종양제, 호르몬 및 항-호르몬, 인터페론, 비-스테로이드성 소염 약물, 및 여타 다양한 항-종양제가 포함되나 이에 한정되지는 않는 다양한 부류의 항암제 중 어느 하나에서 찾아볼 수 있다.
특히 적합한 항암제로는 암 세포에 대한 불량한 선택성/특이성으로 인한 원치않는 부작용을 일으키는 작용제; 세포성 흡수 및/또는 체류가 전혀 없거나 불량한 작용제; 세포성 약물 내성과 관련된 작용제; 및 불량한 수용해도, 응집 등으로 인해 암 환자에게 투여용으로 쉽게 제제화될 수 없는 작용제가 있다.
본 발명의 접합체에 사용될 수 있는 적합한 항암제의 예는 하기에 보다 상세히 기재된다.
불량한 수용성의 항암 약물
특정 실시양태에서, 본 발명의 접합체 내의 항암제 불량한 수용성의 화합물이다. 당업자가 인식할 수 있는 바와 같이, 매우 다양한 불량한 수용성의 항암제가 본 발명에서 사용하기에 적합하다.
예를 들어, 항암제는 여타 항-신생물성 작용제에 대해 불응성인 많은 고형 종양의 치료에서 효과적인 작용제로 인지되는 탁산으로부터 선택될 수 있다. 현재 승인된 2가지 탁산이 파클리탁셀 (탁솔 (TAXOLTM)) 및 도세탁셀 (탁소테레 (TAXOTERETM))이다. 파클리탁셀, 도세탁셀 및 여타 탁산은 방추체 미세소관의 형성에 있어 필수 단백질인 튜불린 (tubulin)의 중합을 증진시킴으로써 작용한다. 튜불린의 중합은, 세포 복제를 억제하여 세포 사멸을 초래하는, 매우 안정한 비-기능성 튜불 (tubule)이 형성되도록 한다.
파클리탁셀은 수용성이 매우 불량하고, 따라서 사실상 정맥내 투여를 위해 물로 제제화할 수 없다. 주사 또는 정맥내 주입용의 몇몇 탁솔 (TAXOLTM)은 약물 담체로서 크레모포어 EL (CREMOPHOR ELTM; 폴리옥시에틸화 피마자유)을 사용하여 개발되었다. 그러나, 크레모포어 EL (CREMOPHORTM EL)은 그 자체로 독성이고, 적어도 부분적으로는 그러한 제제의 투여와 관련된 과민 반응 (중증 피부 발진, 두드러기, 홍조, 호흡곤란, 심계항진 등)을 일으키는 것으로 고려된다. 이러한 부작용을 피하기 위해, 크레모포어 (CREMOPHORTM)를 함유하는 파클리탁셀 제제와 함께 사전 투약이 종종 처방된다. 파클리탁셀의 유사체인 도세탁셀도 파클리탁셀과 유사하게 수용성이 불량하다. 제약 용도를 위해 도세탁셀을 용해시키기는 데 현재 사용되는 가장 바람직한 용매는 폴리소르베이트 80 (트윈 (TWEEN) 80)이다. 환자에서 과민 반응을 유발하는 것에 더하여, 트윈 80은 매우 독성인 디에틸헥실 프탈레이트를 침출시키는 경향 때문에 PVC 전달 장치와 함께 사용될 수 없다.
탁산 및 클로로톡신 폴리펩티드를 포함하는 본 발명에 따른 접합체는 환자에서 유해한 반응을 유도하는 용매 및 담체의 사용을 피하는 개선된 전달 방법으로 사용될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 클로로톡신 접합체 내의 항암제는 엔디인 부류의 항생제에 속할 수 있다. 소정의 부류로서, 엔디인 항생제는 특히 강력한 항-종양제이다. 몇몇 구성원은, 임상적으로 사용되는 가장 효과적인 항-종양 항생제 중 하나인 아드리아마이신보다 1000배 더 강력하다 (문헌 [Y.S. Zhen et al., J. Antibiot., 1989, 42: 1294-1298]). 예를 들어, 본 발명의 접합체 내의 항암제는 엔디인 부류의 칼리케아미신 (calicheamicin)의 구성원일 수 있다. 토양 미생물인 마이크로모노스포라 에키노스포라 종 칼리켄시스 (Micromonospora echinospora ssp . calichensis)의 브로쓰 추출물로터 원래 단리된 칼리케아미신은 강력한 DNA 손상 작용제를 위한 스크리닝에서 검출되었다 (문헌 [M.D. Lee et al., J. Am. Chem. Soc., 1987, 109: 3464-3466]; [M.D. Lee et al., J. Am. Chem. Soc., 1987, 109: 3466-3468]; [W.M. Maiese et al., J. Antibiot., 1989, 42: 558-563]; [M.D. Lee et al., J. Antibiot., 1989, 42: 1070-1087]).
칼리케아미신은, 올리고사카라이드 쇄에 글리코실 결합을 통해 연결된 복잡하고 강직한 비시클릭 엔디인 알릴계 트리설파이드 코어 구조를 특징으로 한다. 올리고사카라이드 부분은 무수한 치환된 당 유도체 및 치환된 테트라히드로피란 고리를 함유한다. 칼리케아미신의 엔디인 함유 코어 (또는 아글리콘 (aglycone)) 및 탄수화물 부분은 상기 분자의 생물학적 활성에 있어 상이한 작용을 수행하는 것으로 보고된 바 있다. 코어 부분은 DNA를 절단하는 반면, 칼리케아미신의 올리고사카라이드 부분은 인지 및 전달 시스템으로 작용하여 약물을 이중-가닥 DNA 마이너 그루브 (minor groove; 약물이 자체로 정착함)로 안내한다 (문헌 ["Enediyne Antibiotics as Antitumor Agents", Doyle and Borders, 1995, Marcel-Dekker: New York]). 이중-가닥 DNA 절단은 세포에 대해 대체로 복구가 불가능하거나 쉽게 복구할 수 없는 유형의 손상이며, 대부분 치사에 이른다.
칼리케아미신의 여러 유사체는 그의 화학적 및 생물학적 특성으로 인해 잠재적 항-종양제로서 전-임상 모델에서 시험되어 왔다. 단일 작용제 요법으로서의 이들의 개발은, 치료를 위한 치료 용량 범위를 제한하는 장기간의 독성 때문에 추구되지 않았다. 그러나, 이들의 효능은 이들을 표적화된 화학요법에 특히 유용하게 한다.
불량한 수용성의 항암제로 적합한 다른 예에는 타목시펜 및 BCNU가 포함된다. 타목시펜은 각종 에스트로겐 수용체 양성 암종, 예컨대 유방암, 자궁내막 암종, 전립선 암종, 난소 암종, 신장 암종, 흑색종, 결장직장 종양, 섬유상 종양, 췌장 암종 및 뇌하수체 종양을 치료하는 데 가변적인 정도의 성공률로 사용되어 왔다. 불량한 수용해도에 의해 제한되는 것에 더하여, 타목시펜을 사용하는 화학요법은 세포성 약물 내성과 같은 부작용을 유발할 수 있다. BCNU (1,3-비스(2-클로로에틸)-1-니트로소우레아)는 그의 항-종양 특성에 대해 널리 공지되어 있고, 1972년 이래로 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)에서 뇌 종양, 결장암, 호지킨 (Hodgkin's) 질환, 폐암 및 다발성 골수종에 대해 차트에 기록되어 왔다. 그러나, 이 항암 약물의 효율적인 사용은 또한 그의 낮은 용해도 때문에 절충되어야 한다.
약물 내성과 관련된 항암제
본 발명의 특정 실시양태에서, 클로로톡신 접합체는 약물 내성과 관련된 항암제를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "약물 내성과 관련된 항암제"는 암 세포가 내성이 되거나 내성이 될 수 있는 임의의 화학요법제를 지칭한다. 이미 상기 언급한 바와 같이, 항암제에 대한 내성은 많은 요인으로 인한 것일 수 있고, 상이한 메커니즘에 의해 작동될 수 있다. 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드 및 약물 내성과 관련된 항암제를 포함하는 본 발명의 접합체를 투여하면, 항암제의 세포성 흡수를 증진시킬 수 있고, 이를 종양 세포, 예를 들어, 내성 종양 세포로 전달할 수 있다.
매우 다양한 약물 내성과 관련된 항암제 중 임의의 것이 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 약물 내성과 관련된 항암제는 메토트렉세이트일 수 있다. 널리 사용되는 암 약물인 메토트렉세이트는 폴산 (folic acid)의 유사체이며, 그 자체로 티미딜레이트 (DNA 합성에 특이적이고, 따라서 특히 중요한 구성요소)의 합성에 이용되는 화합물의 중요한 공급원인 테트라히드로폴산의 합성에서 중요한 단계를 차단한다. 메토트렉세이트-유도 약물 내성은 상기 약물의 세포성 흡수의 결여와 연관된다.
적합한 항암제의 다른 예에는, 효소적 활성의 상실을 통한 약물의 부적절한 세포내 활성화 때문에 생기는 약물 내성과 관련된 퓨린 및 피리미딘 유사체가 포함된다. 그러한 퓨린 유사체의 예로는 6-머캅토퓨린 (6-MP)이 있다. 6-MP에 대한 종양 세포 내성의 공통적인 원인은, 6-MP를 그의 상응하는 뉴클레오티드인 6-머캅토포스포리보실퓨린 (6-MPRP; 약물의 치사성 형태)으로 활성화시키는 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT) 효소의 상실이다. 특정 이론에 얽매이지 않고, 6-MPRP 그 자체가 세포 내로 도입되면 내성이 극복될 수 있을 것으로 여겨진다. 상기 화합물이 상업적으로 입수가능하기는 하지만, 이것이 암 치료에서 아직 치료적으로 사용되지는 않았는데, 이는 살아있는 세포로 적절하게 수송되지 않기 때문이다. 본 발명에 따른 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드에 6-MPRP가 회합하는 것은 세포 막을 가로지르는 능력을 극적으로 증가시킬 것이다. 티오구아닌은 효소 HGPRT의 결여로 인한 약물 내성과 관련된 항암제의 또다른 예이다.
부적절한 세포내 활성화로 인한 약물 내성과 관련된 피리미딘 유사체의 예에는 효소 데옥시시티딘 키나아제 (DOCK)에 의해 각각 치사성 형태인 시토신 디포스페이트 및 아데노신 디포스페이트로 활성화되는 시토신 아라비노시드 및 아데노신 아라비노시드가 포함된다. 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 그러한 피리미딘 유사체의 활성화된 형태와 커플링되어, 그들의 세포성 흡수를 증진시키고 세포성 약물 내성을 극복할 수 있다.
약물 내성과 관련된 항암제의 다른 예에는 5-플루오로우라실, 플루오로데옥시우리딘, 시토신, 아라비노시드, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 다우노루비신, 독소루비신, 악티노마이신 및 블레오마이신이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
여타 항암제
몇몇 실시양태에서, 항암제는 알킬화 약물 (예를 들어, 메클로레타민, 클로람부실, 시클로포스파미드, 멜팔란, 이포스파미드), 항대사물질 (예를 들어, 메토트렉세이트), 퓨린 길항제 및 피리미딘 길항제 (예를 들어, 6-머캅토퓨린, 5-플루오로우라실, 시타라빈, 겜시타빈), 방추체 독 (예를 들어, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 파클리탁셀), 포도필로톡신 (예를 들어, 에토포시드, 이리노테칸, 토포테칸), 항생제 (예를 들어, 독소루비신, 블레오마이신, 미토마이신), 니트로소우레아 (예를 들어, 카르무스틴, 로무스틴), 무기 이온 (예를 들어, 시스플라틴, 카르보플라틴), 효소 (예를 들어, 아스파라기나제) 및 호르몬 (예를 들어, 타목시펜, 류프롤리드, 플루타미드 및 메게스트롤) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 업데이트된 암 요법에 대한 보다 폭넓은 논의에 대해서는 웹사이트 (주소: "http://" 바로 뒤에 "www.cancer.gov/"), 웹사이트 (주소: : "http://" 바로 뒤에 "www.fda.gov/cder/cancer/druglistframe.htm"; FDA 승인된 종양학 약물의 목록), 및 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [The Merck Manual, Seventeenth Ed. 1999]을 참조한다.
핵산 작용제
특정 실시양태에서, 클로로톡신 접합체는 핵산 작용제를 포함한다.
무수한 암 및 종양이 가변적인 정도의 유전자 손상, 예컨대 점 돌연변이, 유전자 결실 또는 복제와 관련된 것으로 입증되었다. 암을 치료하기 위한 많은 새로운 전략, 예컨대 "안티센스", "안티진 (antigene)" 및 "RNA 간섭"이라 명명된 것들이 유전자의 발현을 조절하기 위해 개발되었다 (문헌 [A. Kalota et al., Cancer Biol. Ther., 2004, 3: 4-12]; [Y. Nakata et al., Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr., 2005, 15: 163-182]; [V. Wacheck and U. Zangmeister-Wittke, Crit. Rev. Oncol. Hematol., 2006, 59: 65-73]; [A. Kolata et al ., Handb. Exp. Pharmacol., 2006, 173: 173-196]). 이들 접근법은, 예를 들어 안티센스 핵산, 리보자임, 삼중 작용제, 또는 짧은 간섭 RNA (siRNA)를 이용하여, mRNA를 안티센스 핵산으로 차폐하거나 DNA를 삼중 작용제로 차폐함으로써, 뉴클레오티드 서열을 리보자임으로 절단함으로써, 또는 mRNA를 파괴시킴으로써 (RNA-간섭에 관여하는 복합한 메커니즘을 통함) 표적 유전자의 특정 mRNA 또는 DNA의 전사 또는 번역을 차단한다. 이들 전략 중 많은 것에서, 소분자 및 여타 구조체도 적용되기는 했지만, 주로 올리고뉴클레오티드가 활성 작용제로서 사용된다. 유전자 발현을 조절하기 위한 올리고뉴클레오티드-기반의 전략이 몇몇 암의 치료를 위한 방대한 잠재력을 갖기는 하지만, 올리고뉴클레오티드의 약리학적 적용은 상기 화합물의 암 세포 내의 작용 부위로의 비효과적인 전달로 인해 주로 방해되어 왔다 (문헌 [P. Herdewijn et al., Antisense Nucleic Acids Drug Dev., 2000, 10: 297-310]; [Y. Shoji and H. Nakashima, Curr. Charm. Des., 2004, 10: 785-796]; [A.W Tong et al., Curr. Opin. Mol. Ther., 2005, 7: 114-124]).
특정 실시양태에서, 제공되는 클로로톡신 접합체는 치료적 (예를 들어, 항암) 작용제로서 유용한 핵산 분자 및 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드를 포함한다. 다양한 화학적 유형 및 구조 형태의 핵산이 그러한 전략에 적합할 수 있다. 여기에는, 비제한적인 예로서 단일-가닥 (ssDNA) 및 이중-가닥 (dsDNA)를 비롯한 DNA; ssRNA, dsRNA, tRNA, mRNA, rRNA, 효소적 RNA가 포함되나 이들로 한정되지는 않는 RNA; RNA:DNA 하이브리드, 삼중화 DNA (예를 들어, 짧은 올리고뉴클레오티드와 회합된 dsDNA) 등이 포함된다.
몇몇 실시양태에서, 핵산 작용제는 길이가 약 5 내지 2000개의 뉴클레오티드이다. 몇몇 실시양태에서, 핵산 작용제는 길이가 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 또는 그 초과의 뉴클레오티드이다. 몇몇 실시양태에서, 핵산 작용제는 길이가 약 2000, 1900, 1800, 1700, 1600, 1500, 1400, 1300, 1200, 1100, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20개 미만, 또는 그보다 작은 뉴클레오티드이다.
몇몇 실시양태에서, 핵산 작용제는 프로모터 및/또는 전사를 조절하는 여타 서열을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 핵산 작용제는 복제 기점 및/또는 복제를 조절하는 여타 서열을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 핵산 작용제는 프로모터 및/또는 복제 기점을 포함하지 않는다.
본 발명의 실시에 적합한 핵산 항암제에는 종양발생 및 세포 성장 또는 세포 형질전환과 관련된 유전자 (예를 들어, 세포 분열을 자극하는 단백질을 코딩하는 원시-종양유전자), 맥관형성/항-맥관형성 유전자, 종양 억제 유전자 (세포 분열을 억제하는 단백질을 코딩함), 종양 증식 및/또는 종양 이동과 관련된 단백질을 코딩하는 유전자, 및 자살 (suicide) 유전자 (아팝토시스 (apoptosis) 또는 여타 형태의 세포 사멸을 유도함, 특히 신속하게 분열하는 세포에서 가장 활성이 높은 자살 유전자)를 표적으로 하는 작용제가 포함된다.
종양발생 및/또는 세포 형질전환과 관련된 유전자의 예에는 MLL 융합 유전자, BCR-ABL, TEL-AML1, EWS-FLI1, TLS-FUS, PAX3- FKHR, Bc1-2, AML1-ETO, AML1-MTG8, Ras, Fos PDGF, RET, APC, NF-1, Rb, p53, MDM2 등; 과다발현된 유전자, 예컨대 다중약물 내성 유전자; 시클린; 베타-카로틴; 텔로머라제 유전자; c-myc, n-myc, Bc1-2, Erb-B1 및 Erb-B2; 및 돌연변이된 유전자, 예컨대 Ras, Mos, Raf 및 Met가 포함된다. 종양 억제 유전자의 예에는 p53, p21, RB1, WT1, NF1, VHL, APC, DAP 키나아제, p16, ARF, 뉴로피브로민 (Neurofibromin) 및 PTEN이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다. 항암 요법에 유용한 핵산 작용제에 의해 표적화될 수 있는 유전자의 예에는 인테그린, 셀렉틴 및 메탈로프로테이나제와 같은 종양 이동과 관련된 단백질을 코딩하는 유전자; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 또는 VEGFr과 같은 새로운 혈관의 형성을 촉진하는 항-맥관형성 단백질을 코딩하는 유전자; 엔도스타틴, 안지오스타틴 및 VEGF-R2와 같은 신생혈관형성을 억제하는 항-맥관형성 단백질을 코딩하는 유전자; 및 인터류킨, 인터페론, 섬유모세포 성장 인자 (α-FGF 및 β-FGF), 인슐린-유사 성장 인자 (예를 들어, IGF-1 및 IGF-2), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 종양 괴사 인자 (TNF), 형질전환 성장 인자 (예를 들어, TGF-α 및 TGF-β), 상피 성장 인자 (EGF), 각질세포 성장 인자 (KGF), 줄기 세포 인자 및 그의 수용체 c-Kit (SCF/c-Kit) 리간드, CD40L/CD40, VLA-4 VCAM-1, ICAM-1/LFA-1, 히알루린/CD44 등과 같은 단백질을 코딩하는 유전자가 포함된다. 당업자가 인지할 수 있는 바와 같이, 상기 예들은 배타적인 것이 아니다.
본 발명에 사용하기 적합한 핵산 작용제는, 예를 들어 항암 또는 여타 치료제, 프로브, 프라이머 등으로서의 용도를 비롯한 각종 용도 중 어느 하나를 가질 수 있다. 핵산 작용제는 효소 활성 (예를 들어, 리보자임 활성), 유전자 발현 억제 활성 (예를 들어, 안티센스 또는 siRNA 작용제 등으로서) 및/또는 여타 활성을 가질 수 있다. 핵산 작용제는 그 자체로 활성을 나타낼 수도, 또는 활성 핵산 작용제를 전달하는 벡터 (예를 들어, 전달된 핵산의 복제 및/또는 전사를 통함)일 수도 있다. 본 명세서의 목적상, 그러한 벡터 핵산은, 이들이 그 자체로 치료적 활성을 갖지 않더라도 치료적 활성 작용제를 코딩하거나 달리 전달한다면, "치료제"로 간주된다.
특정 실시양태에서, 클로로톡신 접합체는 안티센스 화합물을 포함하거나 코딩하는 핵산 치료제를 포함한다. 용어 "안티센스 화합물 또는 작용제", "안티센스 올리고머", "안티센스 올리고뉴클레오티드" 및 "안티센스 올리고뉴클레오티드 유사체"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 안티센스 화합물이 왓슨-크릭 (Watson-Crick) 염기 쌍형성에 의해 RNA에서 표적 서열에 혼성화되어 표적 서열 내에 RNA 올리고머 이질이중나선 (heteroduplex)이 형성되도록 하는 뉴클레오티드 염기 및 서브유닛-투-서브유닛 (subunit-to-subunit) 주쇄의 서열을 지칭한다. 이 올리고머는 표적 서열 내에서 정확한 서열 상보성을 갖거나 근접한 상보성을 가질 수 있다. 그러한 안티센스 올리고머는 표적 서열을 함유하는 mRNA의 번역을 차단 또는 억제하거나, 또는 유전자 전사를 억제할 수 있다. 안티센스 올리고머는 이중-가닥 또는 단일-가닥 서열에 결합할 수 있다.
본 발명의 실시에 사용하기 적합한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 예에는, 예를 들어 고찰 문헌 [R.A Stahel et al., Lung Cancer, 2003, 41: S81-S88]; [K.F. Pirollo et al., Pharmacol. Ther., 2003, 99: 55-77]; [A.C. Stephens and R.P. Rivers, Curr. Opin. Mol. Ther., 2003, 5: 118- 122]; [N.M. Dean and C.F. Bennett, Oncogene, 2003, 22: 9087-9096]; [N. Schiavone et al., Curr. Pharm. Des., 2004, 10: 769-784]; [L. Vidal et al., Eur. J. Cancer, 2005, 41: 2812- 2818]; [T. Aboul-Fadl, Curr. Med. Chem., 2005, 12: 2193-2214]; [M.E. Gleave and B.P. Monia, Nat. Rev. Cancer, 2005, 5: 468-479]; [Y.S. Cho-Chung, Curr. Pharm. Des., 2005, 11: 2811-2823]; [E. Rayburn et al., Lett. Drug Design & Discov., 2005, 2: 1-18]; [E.R. Rayburn et al., Expert Opin. Emerg. Drugs, 2006, 11: 337-352]; [I. Tamm and M. Wagner, Mol. Biotechnol., 2006, 33: 221-238] (이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 언급된 것들이 포함된다.
적합한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 예에는, 예를 들어 bc1-2 mRNA의 개시 코돈 영역에 표적화된 포스포로티오에이트 올리고머인 오블리머센 (oblimersen) 나트륨 (또한 게나센스 (GenasenseTM) 또는 G31239로도 공지됨; 젠타 인크. (Genta, Inc.; 미국 뉴저지주 버클리 하이츠 소재)에 의해 개발됨)이 포함된다. Bc1-2는 강력한 아팝토시스 억제제이며, 여포성 림프종, 유방암, 결장암, 전립선암 및 중간/고-등급 림프종 (문헌 [C.A. Stein et al., Semin. Oncol., 2005, 32: 563-573]; [S.R. Frankel, Semin. Oncol., 2003, 30: 300-304])을 비롯한 많은 암에서 과다발현된다. 다른 적합한 안티센스 올리고뉴클레오티드에는 cAMP-의존성 단백질 키나아제 A (PKA)에 대한 혼합 주쇄 올리고뉴클레오티드인 GEM-231 (HYB0165, 하이브리돈 인크. (Hybridon, Inc.; 미국 메사추세츠주 캠브리지 소재)) (문헌 [S. Goel et al., Clin. Cancer Res., 203, 9: 4069-4076]); PKC알파의 안티센스 억제제인 어피니택 (Affinitak) (ISIS 3521 또는 아프리노카르센 (aprinocarsen); 아이시스 파미슈티컬스 인크. (ISIS pharmaceuticals, Inc.; 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)); 클러스터린 (clusterin; 세포 주기, 조직 리모델링, 지질 수송 및 세포 사멸의 조절에 관여하며, 유방, 전립선 및 결장의 암에서 과다발현되는 당단백질)에 대한 2'-메톡시에틸 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드인 OGX-011 (Isis 112989, 아이시스 파미슈티컬스 인크.); c-raf-1 mRNA의 3'-비번역 영역 서열에 상보적인 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드인 ISIS 5132 (Isis 112989, 아이시스 파미슈티컬스 인크.) (문헌 [S.P. Henry et al., Anticancer Drug Des., 1997, 12: 409-420]; [B.P. Monia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93: 15481- 15484]; [C.M. Rudin et al., Clin. Cancer Res., 2001, 7: 1214-1220]); 인간 H-ras mRNA 발현의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 안티센스 억제제인 ISIS 2503 (아이시스 파미슈티컬스 인크.) (문헌 [J. Kurreck, Eur. J. Biochem., 2003, 270: 1628-1644]); GEM 640 (AEG 35156, 애게라 테라퓨틱스 인크. (Aegera Therapeutics Inc.) 및 하이브리돈 인크.)와 같이 아팝토시스 단백질의 X-연관 억제제 (XIAP; 아팝토시스 경로의 실질적인 부분을 차단함)를 표적화하거나 ISIS 23722 (아이시스 파미슈티컬스 인크.), 2'-O-메톡시에틸 키메라 올리고뉴클레오티드와 같이 아팝토시스 단백질의 억제제 (IAP)인 서바이빈 (survivin)을 표적화하는 올리고뉴클레오티드; DNA 메틸 트랜스퍼라제를 표적화하는 MG98; 및 인간 리보 뉴클레오티드 리덕타제의 R2 소 서브유닛 성분 mRNA에서의 코딩 영역에 상보적인 20-머 올리고뉴클레오티드인 GTI-2040 (로러스 테라퓨틱스 인크. (Lorus Therapeutics, Inc. Toronto, Canada))이 포함된다.
다른 적합한 안티센스 올리고뉴클레오티드에는 Her-2/neu, c-Myb, c-Myc 및 c-Raf에 대해 개발된 안티센스 올리고뉴클레오티드가 포함된다 (예를 들어, 문헌 [A. Biroccio et al., Oncogene, 2003, 22: 6579-6588]; [Y. Lee et al., Cancer Res., 2003, 63: 2802-2811]; [B. Lu et al., Cancer Res., 2004, 64: 2840-2845]; [K.F. Pirollo et al., Pharmacol. Ther., 2003, 99: 55-77]; 및 [A. Rait et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 2003, 1002: 78-89] 참조).
특정 실시양태에서, 본 발명의 클로로톡신 접합체는 간섭 RNA 분자를 포함하거나 이를 코딩하는 핵산 항암제를 포함한다. 용어 "간섭 RNA" 및 "간섭 RNA 분자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 예를 들어 RNA 간섭 (RNAi)을 매개함으로써 유전자 발현을 억제 또는 하향조절하거나 서열-특이적 방식으로 유전자를 사일런싱시킬 수 있는 RNA 분자를 지칭한다. RNA 간섭 (RNAi)은 상보성 표적 단일-가닥 mRNA의 분해 및 상응하는 번역된 서열의 "사일런싱"을 유도하는 이중-가닥 RNA (dsRNA)에 의해 촉발되는, 진화적으로 보존되고 서열-특이적인 메커니즘이다 (문헌 [McManus and Sharp, 2002, Nature Rev. Genet., 2002, 3: 737]). RNAi는 더 긴 dsRNA 가닥을 약 21-23개 뉴클레오티드 길이의 생물학적으로 활성인 "짧은-간섭 RNA" (siRNA) 서열로 효소적으로 절단함으로써 기능한다 (문헌 [Elbashir et al., Genes Dev., 2001, 15: 188]). RNA 간섭은 암 요법에 대한 전도유망한 접근법으로서 출현하였다.
본 발명의 실시에 사용하기 적합한 간섭 RNA는 임의의 여러 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 간섭 RNA는 단리된 짧은 간섭 RNA (siRNA), 이중-가닥 RNA (dsRNA), 마이크로-RNA (miRNA) 또는 짧은 헤어핀 (hairpin) RNA (shRNA) 중 하나 이상으로서 제공될 수 있다.
본 발명에 사용하기 적합한 간섭 RNA 분자의 예에는, 예를 들어 고찰 문헌 [O. Milhavet et al., Pharmacol. Rev., 2003, 55: 629-648]; [F. Bi et al., Curr. Gene. Ther., 2003, 3: 411- 417]; [P.Y. Lu et al., Curr. Opin. Mol. Ther., 2003, 5: 225-234]; [I. Friedrich et al., Semin. Cancer Biol., 2004, 14: 223-230]; [M. Izquierdo, Cancer Gene Ther., 2005, 12: 217-227]; [P.Y. Lu et al., Adv. Genet., 2005, 54: 117-142]; [G.R. Devi, Cancer Gene Ther., 2006, 13: 819-829]; [M.A. Behlke, Mol. Ther., 2006, 13: 644-670]; 및 [L.N. Putral et al ., Drug News Perspect., 2006, 19: 317-324] (각각의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에서 인용된 iRNA가 포함된다.
적합한 간섭 RNA 분자의 다른 예에는 p53 간섭 RNA (예를 들어, 문헌 [T.R. Brummelkamp et al., Science, 2002, 296: 550-553]; [M.T. Hemman et al., Nat. Genet., 2003, 33: 396-400]); 만성 골수성 백혈병 및 급성 림프모구성 백혈병의 발병과 관련된 bcr-abl 융합을 표적으로 하는 간섭 RNA (예를 들어, 문헌 [M. Scherr et al ., Blood, 2003, 101: 1566-1569]; [M.J. Li et al ., Oligonucleotides, 2003, 13: 401-409]), 역형성 대세포 림프종의 75％에서 발견되며 종양 형성과 관련된 구성적 활성 키나아제의 발현을 초래하는 단백질인 NPM-ALK의 발현을 억제하는 간섭 (문헌 [U. Ritter et al., Oligonucleotides, 2003, 13: 365-373]); Raf-1 (문헌 [T.F. Lou et al., Oligonucleotides, 2003, 13: 313- 324]), K-Ras (문헌 [T.R. Brummelkamp et al., Cancer Cell, 2002, 2: 243-247]), erbB-2 (문헌 [G. Yang et al., J. Biol. Chem., 2004, 279: 4339-4345])와 같은 종양유전자를 표적으로 하는 간섭; 과다발현이 결장직장암에서의 주요 형질전환 사건인 것으로 생각되는 T-세포 인자 표적 유전자의 트랜스활성화 (transactivation)를 초래하는 b-카테닌 (b-catenin) 단백질을 표적으로 하는 간섭 RNA (문헌 [M. van de Wetering et al., EMBO Rep., 2003, 4: 609-615])가 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다
특정 실시양태에서, 클로로톡신 접합체는 리보자임인 핵산 치료제를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "리보자임"은 다른 RNA 분자를 표적-특이적 방식으로 절단할 수 있는 촉매적 RNA 분자를 지칭한다. 리보자임은 관심있는 유전자의 임의의 원치않는 생성물의 발현을 하향조절하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 리보자임의 예에는 안지오자임 (ANGIOZYMETM ; RPI.4610, 시마 테라퓨틱스 (Sima Therapeutics; 미국 콜로라도주 볼더 소재)), 인간, 마우스 및 래트 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR)-1 mRNA의 보존된 영역을 표적으로 하는 리보자임, 및 헤르자임 (Herzyme) (시마 테라퓨틱스)이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
광감작제
특정 실시양태에서, 클로로톡신 접합체 내의 물질 또는 잔기는 광역학 요법 (PDT)에서 사용되는 광감작제를 포함한다. PDT에서, 환자에 대한 광감작제의 국부 또는 전신 투여 이후에 치료 대상 조직 또는 기관에서 광감작제에 의해 흡수될 수 있는 빛의 조사가 뒤따른다. 광감작제에 의한 빛의 흡수는 세포에 유해한 반응성 종 (예를 들어, 라디칼)을 생성시킨다. 최대 효능을 위해, 광감작제는 전형적으로 투여에 적합한 형태이고, 또한 표적 부위에서 쉽게 세포로 내부화될 수 있는 형태 (종종 정상 조직에 비해 어느 정도의 선택성을 가짐)이다.
몇몇 광감작제 (예를 들어, 포토프린 (Photofrin®), 큐엘티 인크. (QLT, Inc.; 캐나다 브리티시컬럼비아주 밴쿠버 소재))가 간단한 수용액의 일부로서 성공적으로 전달되기는 하지만, 이러한 수용액은 테트라- 또는 폴리-피롤계 구조를 가진 약물과 같은 소수성 광감작제 약물에 적합하지 않을 수 있다. 이들 약물은 본래 분자 축적 (광감작 과정의 효능을 유의하게 감소시킴)에 의해 응집되는 경향이 있다 (문헌 [Siggel et al., J. Phys. Chem., 1996, 100: 2070-2075]). 응집을 최소화시키는 접근법에는 리포좀 제제화 (예를 들어, 벤조포르피린 유도체 모노산 (monoacid) A, BPDMA에 대해, 베르테포르핀 (Verteporfin®), 큐티엘 인크. (캐나다 밴쿠버 소재); 및 아연 프탈로시아닌, 시바-가이기 리미티드 (CIBA-Geigy, Ltd.; 스위스 바젤 소재)), 및 광감작제의 생체적합성 블록 공중합체 (문헌 [Peterson et al ., Cancer Res., 1996, 56: 3980-3985]) 및/또는 항체 (문헌 [Omelyanenko et al ., Int. J. Cancer, 1998, 75: 600-608])에의 접합이 포함된다.
광감작제와 회합된 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드를 포함하는 클로로톡신 접합체는 PDT에서의 신규 전달 시스템으로서 이용될 수 있다. 광감작제 응집을 감소시키는 것에 더하여, 본 발명에 따른 광감작제의 전달은 표적 조직/기관에 대한 증가된 특이성 및 광감작제의 세포 내부화와 같은 여타 장점을 나타낸다.
본 발명에 사용하기 적합한 광감작제에는 PDT에 유용한 광감작 특성을 갖는 임의의 각종 합성 및 자연 발생 분자가 포함된다. 특정 실시양태에서, 광감작제의 흡수 스펙트럼은 가시 범위 내, 전형적으로 350 nm 내지 1200 nm, 바람직하게는 400 nm 내지 900 nm, 예를 들어 600 nm 내지 900 nm이다. 본 발명에 따른 톡신에 커플링될 수 있는 적합한 광감작제에는 포르피린 및 포르피린 유도체 (예를 들어, 클로린, 박테리오클로린, 이소박테리오클로린, 프탈로시아닌 및 나프탈로시아닌); 메탈로포르피린, 메탈로프탈로시아닌, 안젤리신, 칼코게나피릴륨 염료, 클로로필, 쿠마린, 플리빈 및 관련 화합물, 예컨대 알록사진 및 리보플라빈, 풀러렌, 페오포르비드, 피로페오포르비드, 시아닌 (예를 들어, 메로시아닌 540), 페오피틴, 사피린, 텍사피린, 퓨르퓨린, 포르피센, 페노티아지늄, 메틸렌 블루 유도체, 나프탈이미드, 나일 블루 유도체, 퀴논, 페릴렌퀴논 (예를 들어, 하이페리신, 하이포크렐린 및 세르코스포린), 소랄렌, 퀴논, 레티노이드, 로다민, 티오펜, 베르딘, 크산텐 염료 (예를 들어, 에오신, 에리트로신, 로즈 벵갈), 다이머 및 올리고머 형태의 포르피린, 및 전구약물, 예컨대 5-아미노레불린산 (R.W. Redmond and J.N. Gamlin, Photochem. Photobiol., 1999, 70: 391-475)이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
본 발명에 사용하기 적합한 예시적인 광감작제에는 미국 특허 제5,171,741호; 제5,171,749호; 제5,173,504호; 제5,308,608호; 제5,405,957호; 제5,512,675호; 제5,726,304호; 제5,831,088호; 제5,929,105호 및 제5,880,145호 (각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것들이 포함된다.
방사성 감작제
특정 실시양태에서, 클로로톡신 접합체는 방사성 감작제를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "방사성 감작제"는 종양 세포를 방사선 요법에 더욱 민감하게 만드는 분자, 화합물 또는 작용제를 지칭한다. 방사선 요법을 받는 환자에게 방사성 감작제를 투여하는 것은, 일반적으로 방사선 요법의 효과를 증진시킨다. 이상적으로, 방사성 감작제는 표적 세포에서만 그의 기능을 발휘한다. 사용 편의를 위해, 방사성 감작제는 또한 전신 투여되는 경우에도 표적 세포를 찾아낼 수 있어야 한다. 그러나, 현재 입수가능한 방사성 감작제는 전형적으로 종양에 대한 선택성이 없으며, 이들은 포유동물 체내에서 확산에 의해 분포된다. 본 발명의 클로로톡신 접합체는 방사성 감작제를 위한 신규 전달 시스템으로서 이용될 수 있다.
각종 방사성 감작제가 당업계에 공지되어 있다. 본 발명에 사용하기 적합한 방사성 감작제의 예에는 파클리탁셀 (탁솔 (TAXOL®)), 카르보플라틴, 시스플라틴 및 옥살리플라틴 (문헌 [Amorino et al, Radiat. Oncol. Investig. 1999; 7: 343-352]; [Choy, Oncology, 1999, 13: 22-38]; [Safran et al., Cancer Invest., 2001, 19: 1-7]; [Dionet et al., Anticancer Res., 2002, 22: 721-725]; [Cividalli et al., Radiat. Oncol. Biol. Phys., 2002, 52: 1092-1098]); 겜시타빈 (겜자르 (Gemzar®)) (문헌 [Choy, Oncology, 2000, 14: 7-14]; [Mornex and Girard, Annals of Oncology, 2006, 17: 1743- 1747]); 에타니다졸 (니트롤미다졸 (Nitrolmidazole®)) (문헌 [Inanami et al., Int. J. Radiat. Biol., 2002, 78: 267- 274]); 미소니다졸 (문헌 [Tamulevicius et al., Br. J. Radiology, 1981, 54: 318-324]; [Palcic et al., Radiat. Res., 1984, 100: 340-347]), 티라파자민 (문헌 [Masunaga et al., Br. J. Radiol., 2006, 79: 991-998]; [Rischin et al., J. Clin. Oncol., 2001, 19: 535-542]; [Shulman et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 1999, 44: 349-353]); 및 핵산 염기 유도체, 예를 들어, 할로겐화 퓨린 또는 피리미딘, 예컨대 5-플루오로데옥시우리딘 (문헌 [Buchholz et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 1995, 32: 1053-1058])이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
방사성동위원소
특정 실시양태에서, 클로로톡신 접합체는 방사성동위원소를 포함한다. 적합한 방사성동위원소의 예에는, 종양 부위에 위치하는 경우에 세포 파괴를 초래하는 임의의 α-, β- 또는 γ-방사체가 포함된다 (문헌 [S.E. Order, "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, R.W. Baldwin et al. (Eds.), Academic Press, 1985]). 그러한 방사성동위원소의 예에는 요오드-131 (131I), 요오드-125 (125I), 비스무트-212 (212Bi), 비스무트-213 (213Bi), 아스타틴-211 (211At), 레늄-186 (186Re), 레늄-188 (188Re), 인-32 (32P), 이트륨-90 (90yY), 사마륨-153 (153Sm) 및 루테튬-177 (177Lu)이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
슈퍼항원
특정 실시양태에서, 클로로톡신 접합체는 슈퍼항원 또는 그의 생물학적 활성 부분을 포함한다. 슈퍼항원은, T-세포 집단의 많은 분율을 활성화시키는 데 극히 효율적인 일군의 박테리아성 및 바이러스성 단백질을 구성한다. 슈퍼항원은 가공없이 주요 조직적합성 복합체 (MHC)에 직접 결합한다. 사실상, 슈퍼항원은 MHC 클래스 II 분자 상의 항원 결합 그루브 외부에 가공되지 않고 결합하고, 이에 의해 종래의 펩티드-결합 부위에서 나타나는 대부분의 다형성을 피할 수 있다.
슈퍼항원-기반의 종양 치료 접근법이 고형 종양의 치료를 위해 개발되었다. 이 접근법에서, 표적화 잔기, 예를 들어 항체 또는 항체 단편은 슈퍼항원에 접합되어 표적화된 슈퍼항원을 제공한다. 상기 항체 또는 항체 단편이 종양-관련 항원을 인식하는 경우, 종양 세포에 결합된 표적화된 슈퍼항원은 슈퍼항원-활성화 세포독성 T-세포가 슈퍼항원-의존성 세포 매개 세포독성에 의해 직접 종양 세포를 사멸시키는 것을 촉발할 수 있다 (예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Sogaard et al. (1996) "Antibody-targeted superantigens in cancer immunotherapy," Immunotechnology, 2(3): 151-162] 참조).
슈퍼항원-기반의 종양 요법은 일부 성공을 거두었다. 예를 들어, 스타필로코커스의 야생형 엔테로톡신 A (SEA)와의 융합 단백질이 결장직장암 및 췌장암의 임상 시험에서 조사되었고 (전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Giantonio et al., J. Clin. Oncol., 1997, 15: 1994-2007]; [Alpaugh et aL, Clin. Cancer Res., 1998, 4: 1903-1914]; [Cheng et aL, J. Clin. Oncol., 2004, 22: 602-609]), 엔테로톡신 유전자 클러스터 (egc)의 스타필로코커스 슈퍼항원이 비-소세포 폐암의 치료에 대해 연구되었으며 (전문이 본원에 포함되는 문헌 [Terman et al., Clin. Chest Med., 2006, 27: 321-324]), 스타필로코커스의 엔테로톡신 B가 외견상 방광암의 소낭내 (intravesical) 면역요법에 대해 평가되었다 (전문이 본원에 포함되는 문헌 [Perabo et al ., Int. J. Cancer, 2005, 115: 591-598]).
슈퍼항원 또는 그의 생물학적 활성 부분은 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드와 회합하여 본 발명에 따른 클로로톡신 접합체를 형성할 수 있고, 본원에 기재된 바와 같은 요법, 예를 들어 항암 요법에 사용될 수 있다.
본 발명에 사용하기 적합한 슈퍼항원의 예에는 스타필로코커스의 엔테로톡신 (SE) (예를 들어, 스타필로코커스의 엔테로톡신 A (SEA) 또는 스타필로코커스의 엔테로톡신 E (SEE)), 스트렙토코커스 파이로젠스 (Streptococcus pyogenes) 엑소톡신 (SPE), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 독성 쇼크-증후군 톡신 (TSST-1), 스트렙토코커스의 유사분열 엑소톡신 (SME), 스트렙토코커스의 슈퍼항원 (SSA) 및 스타필로코커스의 엔테로톡신 유전자 클러스터의 슈퍼항원이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 상기 나열된 슈퍼항원의 3차원 구조는 단백질 데이터 은행으로부터 얻을 수 있다. 유사하게, 상기 언급된 슈퍼항원 및 여타 슈퍼항원의 핵산 서열 및 아미노산 서열은 진뱅크 (GenBank)로부터 얻을 수 있다.
전구약물 활성화 효소
특정 실시양태에서, 본 발명의 클로로톡신 접합체는 지정된 효소 전구약물 요법에 사용될 수 있다. 지정된 효소 전구약물 요법 접근법에서, 지정된/표적화된 효소 및 전구약물이 대상체에 투여되고, 여기서 표적화된 효소는 전구약물을 활성 약물로 전환시키는 대상체의 신체 부분에 특이적으로 위치하게 된다. 전구약물은 1단계로 (표적화된 효소에 의해) 또는 1개 초과의 단계로 활성 약물로 전환될 수 있다. 예를 들어, 전구약물은 표적화된 효소에 의해 활성 약물의 전구체로 전환될 수 있다. 이어서, 이 전구체는, 예를 들어 대상체에 투여된 하나 이상의 추가의 표적화된 효소, 하나 이상의 비-표적화된 효소, 대상체에 또는 대상체의 표적 부위에 자연적으로 존재하는 하나 이상의 효소 (예를 들어, 프로테아제, 포스파타제, 키나아제 또는 폴리머라제)의 촉매 활성에 의해, 대상체에 투여된 작용제에 의해, 및/또는 효소적으로 촉매화되지 않는 화학적 공정 (예를 들어, 산화, 가수분해, 이성질화, 에피머화 등)에 의해 활성 약물로 전환될 수 있다.
효소를 관심있는 부위에 지정/표적화하기 위해 다양한 접근법이 이용되어 왔다. 예를 들어, ADEPT (항체-지정된 효소 전구약물 요법)에서, 종양 항원에 대해 지정/개발된 항체가 효소에 연결되어 대상체에 주사되고, 이로써 효소의 종양에 대한 선택적 결합이 초래된다. 종양과 정상 조직 사이의 효소 수준 차등이 충분할 때, 전구약물이 대상체에 투여된다. 전구약물은 종양 내에서만 효소에 의해 그의 활성 형태로 전환된다. 항체의 종양 특이성에 의해, 그리고 종양과 정상 조직 사이의 효소 수준에 큰 차등이 있을 때까지 전구약물 투여를 지연시킴으로써, 선택성이 달성된다. 초기 임상 시험은 전도유망하고, ADEPT가 종양-관련 또는 종양-특이적 항체가 공지되어 있는 모든 고형 암에 대해 효과적인 치료법이 될 수 있음을 나타낸다. 또한, 종양은 전구약물 활성화 효소를 코딩하는 유전자로 표적화되었다. 이 접근법은 바이러스-지정된 효소 전구약물 요법 (VDEPT), 또는 보다 일반적으로 GDEPT (유전자-지정된 효소 전구약물 요법이라 불리어 왔으며, 실험실 시스템에서 양호한 결과를 나타내었다. 다른 형태의 지정된 효소 전구약물 요법에는 PDEPT (중합체-지정된 효소 전구약물 요법), LEAPT 렉틴-지정된 효소-활성화 전구약물 요법) 및 CDEPT (클로스트리듐-지정된 효소 전구약물 요법)가 포함된다. 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드와 회합된 전구약물 활성화 효소를 포함하는 본 발명에 따른 접합체도 유사한 방식으로 사용될 수 있다.
본 발명에 사용하기 적합한 효소/전구약물/활성 약물 조합의 비제한적인 예는, 예를 들어 문헌 [Bagshawe et al., Current Opinions in Immunology, 1999, 11: 579-583]; [Wilman, "Prodrugs in Cancer Therapy", Biochemical Society Transactions, 14: 375-382, 615th Meeting, Belfast, 1986]; [Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach To Targeted Drug Delivery", in "Directed Drug Delivery", Borchardt et al., (Eds), pp. 247-267 (Humana Press, 1985)]에 기재되어 있다. 효소/전구약물/활성 항암 약물 조합의 비제한적인 예는, 예를 들어 문헌 [Rooseboom et al., Pharmacol. Reviews, 2004, 56: 53-102]에 기재되어 있다.
전구약물 활성화 효소의 예에는 니트로리덕타제, 시토크롬 P450, 퓨린-뉴클레오시드 포스포릴라제, 티미딘 키나아제, 알칼리성 포스파타제, β-글루쿠로니다제, 카르복시펩티다제, 페니실린 아미다제, β-락타마제, 시토신 데아미나제 및 메티오닌 γ-리아제가 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
전구약물 활성화 효소에 의해 생체내에서 전구약물을 활성화시킴으로써 형성될 수 있는 항암 약물의 예에는 5-(아지리딘-1-일)- 4-히드록실-아미노-2-니트로-벤즈아미드, 이소포스포르아미드 머스타드, 포스포르아미드 머스타드, 2-플루오로아데닌, 6-메틸퓨린, 간시클로비르 (ganciclovir)-트리포스페이트 뉴클레오티드, 에토포시드, 미토마이신 C, p-[N,N-비스(2-클로로에틸)아미노]페놀 (POM), 독소루비신, 옥사졸리디논, 9-아미노캄토테신, 머스타드, 메토트렉세이트, 벤조산 머스타드, 독소루비신, 아드리아마이신, 다우노마이신, 카르미노마이신, 블레오마이신, 에스페라미신, 멜팔란, 팔리톡신, 4-데스아세틸빈블라스틴-3-카르복실산 히드라지드, 페닐렌디아민 머스타드, 4'-카르복시프탈레이토(1,2-시클로헥산-디아민) 백금, 탁솔, 5-플루오로우라실, 메틸셀레놀 및 카르보노티온산 디플루오라이드가 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
b. 항-맥관형성 작용제
특정 실시양태에서, 본 발명의 클로로톡신 접합체 내의 치료적 (예를 들어, 항암) 작용제는 항-맥관형성 작용제를 포함한다. 본 발명에 사용하기 적합한 항-맥관형성 작용제에는 맥관형성의 과정 또는 기존의 혈관으로부터 신규 혈관이 발생하게 하는 과정을 차단하거나, 억제하거나, 늦추거나, 또는 감소시키는 임의의 분자, 화합물 또는 인자가 포함된다. 이러한 분자, 화합물 또는 인자는 (1) 기원 혈관의 막을 용해시키는 단계, (2) 내피 세포의 이동 및 증식 단계, 및 (3) 세포의 이동에 의한 신규 맥관구조의 형성 단계를 비롯한 (이에 한정되지는 않음), 맥관형성에 관여하는 단계들 중 임의의 것을 차단하거나, 억제하거나, 늦주거나, 또는 감소시킴으로써 맥관형성을 차단할 수 있다.
항-맥관형성 작용제의 예에는 베바시주맙 (아바스틴 (AVASTIN®)), 셀레콕시브 (셀레브렉스 (CELEBREX®)), 엔도스타틴, 탈리도마이드, EMD121974 (실렌기티드 (Cilengitide)), TNP-470, 스쿠알아민, 콤브레타스타틴 A4, 인터페론-α, 항-VEGF 항체, SU5416, SU6668, PTK787/2K 22584, 마리미스탈 (Marimistal), AG3340, COL-3, 네오바스타트 (Neovastat) 및 BMS-275291이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
항-맥관형성 작용제는 항암 요법 및 황반 변성에 대한 요법이 포함되나 이에 한정되지는 않는 각종 치료적 맥락으로 사용될 수 있다.
당업자에게 인식될 수 있는 바와 같이, 본원에서 인용된 치료제의 구체적인 예는 본 발명의 실시에 사용하기 적합한 치료제 중 극히 적은 수만을 나타낸다.
2. 검출가능한 물질들/잔기들
특정 실시양태에서, 제공되는 접합체는 하나 이상의 검출가능한 물질 또는 잔기를 포함하는데, 즉 접합체는 그러한 물질 또는 잔기로 "표지"된다. 이러한 몇몇 실시양태에서, 상기 접합체는 진단적 적용에 유용하다.
임의의 각종 검출가능한 작용제가 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 적합한 검출가능한 작용제에는 다양한 리간드, 방사핵종; 형광 염료; 화학발광 작용제 (예컨대, 아크리디늄 에스테르, 안정화된 디옥세탄 등); 생체발광 작용제; 스펙트럼적으로 분해가능한 무기 형광 반도체 나노결정 (즉, 양자점); 미세입자; 금속 나노입자 (예를 들어, 금, 은, 구리, 백금); 나노클러스터 (nanocluster); 상자성 금속 이온; 효소; 발색성 표지 (예컨대, 염료, 콜로이드성 금 등); 바이오틴; 디옥시게닌; 합텐; 및 항혈청 또는 모노클로날 항체가 입수가능한 단백질이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
a. 방사활성 및/또는 상자성 동위원소 또는 이온
특정 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 방사활성 및/또는 상자성 동위원소 또는 이온으로 표지된다. 예를 들어, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 동위원소로 표지될 수 있거나 (즉, 자연에서 통상적으로 발견되는 원자 질량 또는 질량 수와 상이한 원자 질량 또는 질량 수를 갖는 원자로 대체된 하나 이상의 원자를 함유할 수 있음), 또는 동위원소가 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드에 부착될 수 있다. 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드에 혼입될 수 있는 동위원소의 비제한적인 예에는 수소, 탄소, 불소, 인, 구리, 갈륨, 이트륨, 테크네튬, 인듐, 요오드, 레늄, 탈륨, 비스무트, 아스타틴, 사마륨 및 루테튬의 동위원소 (즉, 3H, 13C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 67Ga, 90Y, 99MTc, 111In, 125I, 123I, 129I, 131I, 135I, 186Re, 187Re, 201Tl, 212Bi, 211At, 153Sm, 177Lu)가 포함된다.
특정 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영술 (SPECT) 또는 양전자 방출 단층촬영술 (PET)에 의해 검출가능한 방사성동위원소를 포함한다. 그러한 방사핵종의 예에는 요오드-131 (131I), 요오드 125 (125I), 비스무트-212 (212Bi), 비스무트-213 (213Bi), 아스타틴-221 (221At), 구리-67 (67Cu), 구리-64 (64Cu), 레늄-186 (186Re), 레늄-188 (188Re), 인-32 (32P), 사마륨-153 (153Sm), 루테튬-177 (177Lu), 테크네튬-99m (99mTc), 갈륨-67 (67Ga), 인듐-111 ( 11lIn) 및 탈륨-201 (201Tl)이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 감마 카메라에 의해 검출가능한 방사성동위원소로 표지된다. 그러한 방사성동위원소의 예에는 요오드-131 (131I) 및 테크네튬-99m (99mTc)이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 자기 공명 영상화 (MRI)에서의 양호한 콘트라스트 증진제인 상자성 금속 이온으로 표지된다. 그러한 상자성 금속 이온의 예에는 가돌리늄 III (Gd3+), 크롬 III (Cr3+), 디스프로슘 III (Dy3+), 철 III (Fe3+), 망간 II (Mn2+) 및 이테르븀 III (Yb3+)이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 표지 잔기는 가돌리늄 III (Gd3+)을 포함한다. 가돌리늄은 비정상 조직에 축적되어 상기 비정상 구역이 자기 공명 영상에서 매우 밝게 (증진됨) 되도록 하는 FDA-승인된 MRI용 콘트라스트 작용제이다. 가돌리늄은, 신체의 상이한 구역에서, 특히 뇌에서, 정상 조직과 비정상 조직 사이에 큰 콘트라스트를 제공하는 것으로 공지되어 있다.
특정 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 핵 자기 공명 분광법 (MRS)에 의해 검출가능한 안정한 상자성 동위원소로 표지된다. 적합한 상자성 동위원소의 예에는 탄소-13 (13C) 및 불소-19 (19F)가 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
몇몇 실시양태에서, 금속 동위원소는 킬레이션에 의해 감소된 리신의 클로로톡신 접합체에 비공유적으로 부착된다. 킬레이션의 예에는 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드에 융합된 폴리-His 영역에 금속 동위원소를 킬레이션시키는 것이 포함된다.
몇몇 실시양태에서, 가돌리늄 (Gd)과 같은 금속이, 상기 기재된 바와 같이 공유 결합 또는 킬레이션을 통해 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드에 혼입된다.
b. 형광 염료
특정 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 형광 염료로 표지된다. 각종 화학 구조 및 물리적 특성을 지닌 무수한 공지의 형광 염료가 본 발명의 실시에 사용하기 적합하다. 적합한 형광 염료에는 플루오레세인 및 플루오레세인 염료 (예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아닌 또는 FITC, 나프토플루오레세인, 4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인, 6-카르복시플루오레세인 또는 FAM 등), 카르보시아닌, 메로시아닌, 스티릴 염료, 옥소놀 염료, 피코에리트린, 에리트로신, 에오신, 로다민 염료 (예를 들어, 카르복시테트라메틸-로다민 또는 TAMRA, 카르복시로다민 6G, 카르복시-X-로다민 (ROX), 리사민 로다민 B, 로다민 6G, 로다민 그린, 로다민 레드, 테트라메틸로다민 (TMR) 등), 쿠마린 및 쿠마린 염료 (예를 들어, 메톡시쿠마린, 디알킬아미노쿠마린, 히드록시쿠마린, 아미노메틸쿠마린 (AMCA) 등), 오레곤 그린 (Oregon Green) 염료 (예를 들어, 오레곤 그린 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514 등), 텍사스 레드 (Texas Red), 텍사스 레드-X, 스펙트럼 레드 (SPECTRUM REDTm), 스펙트럼 그린 (SPECTRUM GREENTm), 시아닌 염료 (예를 들어, CY-3TM, CY-5TM, CY-3.5Tm, CY-5.5TM 등), 알렉사 플루오르 (ALEXA FLUORTm) 염료 (예를 들어, 알렉사 플루오르 350, 알렉사 플루오르 488, 알렉사 플루오르 532, 알렉사 플루오르 546, 알렉사 플루오르 568, 알렉사 플루오르 594, 알렉사 플루오르 633, 알렉사 플루오르 660, 알렉사 플루오르 680 등), 보디피 (BODIPYTm) 염료 (예를 들어, 보디피 FL, 보디피 R6G, 보디피 TMR, 보디피 TR, 보디피 530/550, 보디피 558/568, 보디피 564/570, 보디피 576/589, 보디피 581/591, 보디피 630/650, 보디피 650/665 등), IR염료 (예를 들어, IRD40, IRD 700, IRD 800 등) 등이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다. 적합한 형광 염료, 및 형광 염료를 단백질 및 펩티드와 같은 여타 화학 물질에 커플링시키는 방법의 추가 예에 대해서는, 예를 들어 문헌 ["The Handbook of Fluorescent Probes and Research Products", 9th Ed., Molecular Probes, Inc., Eugene, OR]을 참조한다. 형광 표지 작용제의 우호적인 특성에는 높은 몰농도 흡수 계수, 높은 형광 양자 수율 및 광안정성이 포함된다. 몇몇 실시양태에서, 형광발색단의 표지는 자외선 범위의 스펙트럼 (즉, 400 nm 미만)보다는 가시광선 스펙트럼 (즉, 400 내지 750 nm)에서 흡수 및 방출 파장을 나타낸다.
c. 효소
특정 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 효소로 표지된다. 적합한 효소의 예에는 ELISA에 사용되는 효소, 예를 들어 홀스래디쉬 퍼옥시다제, 베타-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제 등이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다. 다른 예에는 베타-글루쿠로니다제, 베타-D-글루코시다제, 우레아제, 글루코스 옥시다제 등이 포함된다. 효소는 카르보디이미드, 디이소시아네이트, 글루타르알데히드 등과 같은 링커 기를 사용하여 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드에 접합될 수 있다.
당업자는, 몇몇 실시양태에서 특정 비-클로로톡신 물질 또는 잔기가 하나 초과의 목적으로 작용할 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 소정의 잔기는 치료적 목적과 진단적 목적 둘 다를 가질 수 있다. 한 예를 제시하면, 131I와 같은 방사활성 요오드는 악성 신경교종을 비롯한 각종 종양의 치료에 있어 클로로톡신 접합체와의 세포독성 치료제와 방사성표지 둘 다로서 사용되었다.
III. 제약 조성물
본원에 기재된 클로로톡신 접합체는 그 자체로 및/또는 제약 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 유효량의 적어도 하나의 클로로톡신 접합체 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
적어도 하나의 원하는 결과를 달성하기 위해 필요하거나 충분한 만큼의 양으로 및 시간 동안, 클로로톡신 접합체, 또는 그의 제약 조성물은 본 발명에 따라 투여될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 제약 조성물은 암 세포를 죽이고/거나, 종양 크기를 감소시키고/거나, 종양 증식 또는 전이를 억제하고/거나, 다양한 백혈병을 치료하고/거나, 상기 질환을 갖는 포유동물 (인간을 포함함)의 생존기간을 연장시키거나, 또는 달리 임상적 이점을 제공하는 양으로 및 시간 동안 투여될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 원하는 치료적 효과를 달성하기 위해 효과적인 임의의 양 및 임의의 투여 경로를 사용하여 투여될 수 있다.
투여되는 제약 조성물의 정확한 양은 대상체의 종, 나이 및 일반적인 상태, 병태의 중증도 등에 따라 대상체마다 달라질 것이다 (하기 참조).
최적의 제약 제제는 투여 경로 및 원하는 투여량에 따라 달라질 수 있다. 이러한 제제는 투여된 화합물의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 제거 속도에 영향을 줄 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 단위 투여 형태로 제제화될 수 있다. 본원에서 사용되는 표현 "단위 투여 형태"는 치료되어야 할 환자를 위한 클로로톡신 접합체 (하나 이상의 부가 작용제가 있거나 없음)의 물리적으로 분리된 단위를 의미한다. 그러나, 본 발명의 조성물의 일일 총 사용량은 전문의에 의해 철저한 의학적 판단의 범위 내에서 결정될 것으로 이해될 것이다.
원하는 투여량에서의 하나 이상의 적절한 생리학상 허용되는 담체(들) 또는 부형제(들)와 함께 제제한 후에, 본 발명의 제약 조성물은 인간 또는 다른 포유동물에게 임의의 적합한 경로로 투여될 수 있다. 정제, 캡슐, 주사가능한 용액 등을 비롯한 다양한 전달 시스템이 공지되어 있고, 이는 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있다. 투여 방법에는 피부, 피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하, 비강내, 폐, 경막외, 안구 및 경구 경로가 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다. 조성물은 임의의 편리하거나 달리 적절한 경로, 예컨대 주입 또는 볼루스 주사, 상피 또는 점막피부 라이닝 (예를 들어, 경구, 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 및/또는 국부적일 수 있다.
주사가능한 제제 (예컨대, 멸균 주사가능한 수성 또는 유성 현탁액)는 적합한 분산제 또는 습윤제, 및 현탁화제를 사용하는 공지된 기술에 따라 제제화될 수 있다. 또한, 멸균 주사가능한 제제는 비경구적으로 허용되는 비독성 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사가능한 용액, 현탁액 또는 에멀젼 (예컨대, 2,3-부탄디올 중의 용액과 같은) 일 수 있다. 사용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액, U.S.P. 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 고정유는 통상적으로 용액 또는 현탁 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노글리세리드 또는 디글리세리드를 비롯한 임의의 배합 고정유가 사용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산이 주사가능한 제제에 사용될 수 있다. 멸균 액체 담체가 비경구 투여를 위한 멸균 액체 형태의 조성물에 유용하다.
주사가능한 제제는 예를 들어 박테리아-보유 필터를 통한 여과에 의해, 또는 사용 전에 멸균수 또는 기타 멸균 주사가능한 매질 중에 용해 또는 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물 형태로 멸균제를 혼입시킴으로써 멸균될 수 있다. 멸균 용액 또는 현탁액인 액체 제약 조성물은 예를 들어 정맥내, 근육내, 복막내 또는 피하 주사에 의해서 투여될 수 있다. 주사는 단일 푸시 (push)를 통해, 또는 점진적 주입 (예를 들어, 30분간 정맥내 주입)에 의해 할 수 있다. 필요한 경우, 조성물에는 주사 부위에서의 통증을 완화시키기 위해 국부 마취제가 포함될 수 있다.
약물의 효과를 연장시키기 위해서, 피하 또는 근육내 주사로부터 약물의 흡수를 저속화하는 것이 종종 바람직하다. 이것은 수용해도가 불량한 결정질 또는 무정형 물질의 액체 현탁액을 사용하여 달성될 수 있다. 이후, 약물의 흡수 속도는 용해 속도에 따라 달라지고, 이것은 다시 결정 크기 및 결정질 형태에 따라 달라질 수 있다. 대안적으로, 비경구 투여된 약물 형태의 지연된 흡수는 약물을 오일 비히클 중에 용해 또는 현탁시켜 달성된다. 주사가능한 데포 형태는 생분해성 중합체, 예컨대 폴리락티드-폴리글리콜리드 중에 약물의 마이크로캡슐 매트릭스를 형성하여 제조된다. 약물 대 중합체의 비율, 및 사용되는 특정 중합체의 성질에 따라 약물 방출 속도가 제어될 수 있다. 다른 생분해성 중합체의 예에는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)이 포함된다. 또한, 주사가능한 데포 제제는 리포좀 (또한, 지질 소포로도 공지됨) 또는 신체 조직에 적합한 마이크로에멀젼 중에 약물을 포획하여 제조될 수 있다.
경구 투여를 위한 액체 투여 형태에는 제약상 허용되는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르 및 압축된 조성물이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 활성 성분 (즉, 접합체) 이외에, 액체 투여 형태는 당업계에서 일반적으로 사용되는 불활성 희석제, 예를 들어 물 또는 기타 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일 (특히, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참깨유), 글리세롤, 테트라히드로푸르푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다. 불활성 희석제 이외에도, 경구 조성물에는 또한 보조제, 예컨대 습윤제, 현탁화제, 보존제, 감미제, 향미제 및 방향제, 증점제, 착색제, 점도 조절제, 안정화제 또는 삼투 조절제가 포함될 수 있다. 경구 투여를 위한 액체 담체의 적합한 예에는 물 (상기와 같은 첨가제, 예컨대 셀룰로스 유도체, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스 용액을 부분적으로 함유함), 알콜 (1가 알콜 및 다가 알콜 (예컨대, 글리콜)을 포함함) 및 그의 유도체, 및 오일 (예컨대, 분별 코코넛유 및 낙화생유)이 포함된다.
경구 투여를 위한 고체 투여 형태에는, 예컨대 캡슐, 정제, 환제, 분말 및 과립이 포함된다. 이러한 고체 투여 형태에서, 활성 성분은 적어도 1종의 불활성 생리학상 허용되는 부형제 또는 담체, 예컨대 나트륨 시트레이트 또는 이칼슘 포스페이트 및 하나 이상의 (a) 충전제 또는 증량제, 예컨대 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨 및 규산, (b) 결합제, 예를 들어 카르복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 수크로스 및 아카시아, (c) 보습제, 예컨대 글리세롤, (d) 붕해제, 예컨대 한천-한천, 칼슘 카르보네이트, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트 및 나트륨 카르보네이트, (e) 용해 지연제, 예컨대 파라핀, (f) 흡수 가속화제, 예컨대 4차 암모늄 화합물, (g) 습윤제, 예를 들어 세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트, (h) 흡수제, 예컨대 카올린 및 벤토나이트 점토, 및 (i) 윤활제, 예컨대 활석, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 술페이트, 및 이들의 혼합물과 혼합된다. 고형 제제에 적합한 추가적인 또는 대안적인 부형제에는 표면 개질제, 예컨대 비이온성 및 음이온성 표면 개질제가 포함된다. 표면 개질제의 대표적인 예에는 폴록사머 188, 벤즈알코니움 클로라이드, 칼슘 스테아레이트, 세토스테아릴 알콜, 세토마크로골 유화 왁스, 소르비탄 에스테르, 콜로이드성 규소 디옥시드, 포스페이트, 나트륨 도데실술페이트, 마그네슘 알루미늄 실리케이트 및 트리에탄올아민이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다. 캡슐, 정제 및 환제의 경우, 투여 형태는 또한 완충제를 포함할 수 있다. 고체 투여 형태당 고형 담체의 양은 매우 다양할 것이다. 몇몇 실시양태에서, 고체 투여 형태당 고형 담체의 양은 약 25 mg 내지 약 1 g이다.
또한, 유사한 유형의 고체 조성물이 부형제, 예컨대 락토스 또는 유당뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등을 사용하여 연질 및 경질-충전 젤라틴 캡슐 중의 충전제로 사용될 수 있다. 정제, 당의정, 캡슐, 환제 및 과립의 고체 투여 형태는 제약 제제화 분야에 널리 공지된 코팅제 및 쉘, 예컨대 장용 코팅제, 방출 제어 코팅제 및 기타 코팅제를 사용하여 제조될 수 있다. 상기 고체 투여 형태는 임의로 유백화제를 함유할 수 있고, 또한 임의로 지연된 방식으로 장관의 특정 부위에서 활성 성분(들)만을 방출하거나 활성 성분(들)을 우선적으로 방출하도록 하는 조성물의 형태일 수도 있다. 사용될 수 있는 포매 조성물의 예에는 중합체 물질 및 왁스가 포함된다.
특정 실시양태에서, 치료가 필요한 영역에 본 발명의 조성물을 국부적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 다른 방법들 중에서, 예컨대 수술 동안의 국부 주입, 국부 적용, 주사, 카테터의 수단, 좌약의 수단, 또는 피부 패치 또는 스텐트 또는 다른 이식의 수단에 의해 달성될 수 있다.
국부 투여를 위한 몇몇 조성물은 물, 글리세롤, 알콜, 프로필렌 글리콜, 지방 알콜, 트리글리세리드, 지방산 에스테르 또는 미네랄 오일과 같은 담체를 포함할 수 있는 젤, 연고, 로션 또는 크림으로 제제화될 수 있다. 다른 국부용 담체에는 액체 석유, 이소프로필 팔미테이트, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올 (95%), 물 중의 폴리옥시에틸렌모노라우레이트 (5%), 또는 물 중의 나트륨 라우릴 술페이트 (5%)가 포함된다. 항산화제, 보습제, 점도 안정화제 및 유사한 작용제와 같은 다른 물질은 필요에 따라 첨가될 수 있다. 또한, 피부 침투 증진제 (예컨대, 아존 (Azone))도 포함될 수 있다.
추가로 특정 경우에는, 조성물은 피부 위, 안, 아래에 있는 경피 장치 내에 배치될 수 있다. 이러한 장치에는 수동 또는 능동적인 방출 메카니즘에 의해 화합물을 피부 위로 방출하는 패치, 이식 및 주사가 포함된다. 경피 투여에는 신체의 표면, 및 상피 및 점막 조직을 비롯한 신체 통로의 내벽을 가로지르는 모든 투여가 포함된다. 이러한 투여는 로션, 크림, 발포제, 패치, 현탁액, 용액 및 좌약 (직장 및 질)으로 본 발명의 조성물을 사용하여 수행될 수 있다.
경피 투여는, 예컨대 피부에 대해 비독성인 활성 성분(들) 및 담체를 함유하는 경피 패치의 사용을 통해 달성될 수 있고, 이는 피부를 통한 혈류로의 전신 흡수를 위해 적어도 일부의 활성 성분(들)의 전달을 가능하게 한다. 상기 담체는 임의의 수많은 형태, 예컨대 크림 및 연고, 페이스트, 겔 및 폐쇄성 장치일 수 있다. 크림 및 연고는 다양한 액체, 또는 수중유 또는 유중수 유형의 반고체 에멀젼일 수 있다. 또한, 활성 성분(들)을 함유하는 석유 또는 친수성 석유에 분산된 흡수성 분말로 이루어진 페이스트가 적합할 수 있다. 다양한 폐쇄성 장치, 예컨대 활성 성분(들)을 담체와 함께 또는 담체 없이 함유하는 저장소, 또는 활성 성분을 함유하는 매트릭스를 커버하는 반투과성 막를 이용하여 활성 성분(들)을 혈류로 방출시킬 수 있다.
좌약 제제는 통상적인 물질, 예컨대 좌약의 융점을 변경시키기 위해 왁스를 첨가하거나 첨가하지 않은 코코아 버터, 및 글리세린으로부터 제조될 수 있다. 수가용성 좌약 베이스, 예컨대 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜 또한 사용될 수 있다.
다양한 제제를 생산하기 위한 물질 및 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 본 발명을 실시하기 위해 적용될 수 있다.
캡슐화제
몇몇 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공된 조성물에는 하나 이상의 캡슐화제가 포함된다. 일반적으로, 캡슐화제는 접합체 또는 잔기와 같은 독립체를 포획하기 위해 사용될 수 있는 임의의 생리학상 허용되는 작용제일 수 있다. "포획된"은 캡슐화제가 독립체를 둘러싸거나 밀폐할 수 있다는 것을 의미하고, 또는 "포획된" 독립체는 캡슐화제를 포함하는 물질 내에 부분적으로 또는 완전히 포매될 수 있다는 것을 의미한다.
몇몇 실시양태에서, 캡슐화제는 잔기 (예컨대, 치료적 잔기)의 부분이고, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 캡슐화제에 접합된다. 이러한 몇몇 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 캡슐화제의 바깥 표면에 접합된다. 이러한 몇몇 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 외부 환경 상에서 캡슐화제로 노출된다. 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 직접적인 상호작용 (이는 비공유 또는 공유일 수 있음)에 의해서 캡슐화제에 접합될 수 있거나, 링커를 통해 캡슐화제에 접합될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드 및 잔기 (예를 들어, 치료적 잔기)를 포함하는 접합체는 캡슐화제에 의해서 밀폐된다. 접합체는 캡슐화제에 의해 한정되고/거나 만들어진 공간 또는 환경 (예컨대, 수성의 환경) 내에 부분적으로 또는 완전히 밀폐될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 접합체는 캡슐화제 내에 적어도 부분적으로 포매된다. 예컨대, 캡슐화제가 지질 막을 포함하는 경우, 접합체는 막 중에서 지질 분자 내에 또는 사이에 적어도 부분적으로 포매될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 접합체는 캡슐화제 내에 완전히 포매된다.
약물, 생분자 등을 포획하기 위해 캡슐화제를 사용하는 방법으로, 캡슐화제의 다양한 유형이 당업계에 공지되어 있다. 특정 실시양태에서, 캡슐화제는 코어 및 표면을 갖는 소입자를 포함한다. 이러한 캡슐화제에는 리포좀, 마이셀, 미세입자, 나노입자 등이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다
리포좀은 전형적으로 대략적인 구형으로 성형된 이중층 구조 또는 소포이고, 천연 또는 합성 인지질 막으로 구성된다. 리포좀은 콜레스테롤 및 단백질과 같은 다른 막 성분을 추가로 포함할 수 있다. 리포좀의 내부 코어는 전형적으로 수용액을 함유한다. 치료제 및/또는 접합체는 수용액에 용해될 수 있다. 이전에 언급한 바와 같이, 치료제 및 접합체는 리포좀의 막 내에 포매될 수 있다. 리포좀은 억제 RNA (예컨대, siRNA)를 비롯한 핵산 작용제와 같은 작용제 (예컨대, 상기 기재된 작용제)를 전달하는 데에 특히 유용할 수 있다.
마이셀은 일반적으로 인지질의 단일 층으로부터 형성되고 내부 수용액이 부족한 것을 제외하고는 리포좀과 유사하다. 또한, 내부 수용액을 포함하기 위해 제조된 역 마이셀은 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 입자는 적어도 하나의 치수가 약 1 μm보다 더 작은 것을 평균으로 하는 미세입자이다. 예컨대, 입자의 가장 작은 치수는 약 100 nm, 약 120 nm, 약 140 nm, 약 160 nm, 약 180 nm, 약 200 nm, 약 220 nm, 약 240 nm, 약 260 nm, 약 280 nm, 약 300 nm, 약 320 nm, 약 340 nm, 약 360 nm, 약 380 nm, 약 400 nm, 약 420 nm, 약 440 nm, 약 460 nm, 약 480 nm, 약 500 nm, 약 550 nm, 약 600 nm, 약 650 nm, 약 700 nm, 약 750 nm, 약 800 nm, 약 850 nm, 약 900 nm 또는 약 950 nm를 평균으로 할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 입자는 적어도 하나의 치수가 약 100 μm보다 더 작은 것을 평균으로 하는 나노입자이다. 예컨대, 입자의 가장 작은 치수는 약 1 nm, 약 2 nm, 약 3 nm, 약 4 nm, 약 5 nm, 약 6 nm, 약 7 nm, 약 8 nm, 약 9 nm, 약 10 nm, 약 11 nm, 약 12 nm, 약 13nm, 약 14 nm, 약 15 nm, 약 16 nm, 약 17 nm, 약 18 nm, 약 19 nm, 약 20 nm, 약 22 nm, 약 24 nm, 약 26 nm, 약 28 nm, 약 30 nm, 약 32 nm, 약 34 nm, 약 36 nm, 약 38 nm, 약 40 nm, 약 42 nm, 약 44 nm, 약 46 nm, 약 48 nm, 약 50 nm, 약 55 nm, 약 60 nm, 약 65 nm, 약 70 nm, 약 75 nm, 약 80 nm, 약 85 nm, 약 90 nm, 약 95 nm 또는 약 99 nm를 평균으로 할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 입자의 코어는 진단 및/또는 치료 적용에 유리할 수 있는 자기 공명 활성을 갖는 물질을 포함한다. 자기 공명 활성을 갖는 물질에는 금속 및 금속을 함유하는 그의 산화물, 예컨대 알루미늄-, 코발트-, 인듐-, 철-, 구리-, 게르마늄-, 마그네슘-, 니켈-, 주석-, 티타늄-, 팔라듐-, 백금-, 셀레늄-, 규소-, 은-, 아연- 등이 포함된다.
몇몇 실시양태에서, 치료제는 핵산을 포함한다. 핵산은 캡슐화제 내에 완전히 밀폐될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 핵산 작용제는 캡슐화제 내에 포매된다. 예를 들어, 캡슐화제는 리포좀일 수 있고, 핵산 작용제는 리포좀 내에 밀폐될 수 있다. 핵산 작용제는 리포좀의 지질 분자 내에 적어도 부분적으로 포매될 수 있다.
제약 팩 또는 키트
또다른 측면에서, 본 발명은 본원에서 기재된 바와 같은 제약 조성물의 하나 이상의 성분을 함유하는 하나 이상의 용기 (예를 들어, 바이알, 앰플, 시험 튜브, 플라스크 또는 병)를 포함하고, 본 발명의 클로로톡신 접합체의 투여를 가능하게 하는 제약 팩 또는 키트를 제공한다.
IV . 클로로톡신 접합체의 사용 방법
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 클로로톡신 접합체를 포함하는 조성물을, 종양을 갖거나 종양을 가질 것으로 의심되는 개체에게 상기 접합체가 종양에 특이적으로 결합하도록 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 이러한 방법은 암의 치료 및/또는 진단에 유용하다. 몇몇 실시양태에서, 이러한 방법은 개체에 종양이 발병하고/거나, 개체에서의 하나 이상의 종양의 크기가 증가하고/거나, 개체에서의 하나 이상의 종양이 전이하고/거나, 암이 임의의 다른 측정 (예컨대, 임상 단계)에 의해 진행할 가능성을 감소시키는 데에 유용하다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 클로로톡신 접합체를 포함하는 조성물을, 비정상적 맥관형성을 특징으로 하는 질환 또는 병태를 갖거나 상기 질환 또는 병태를 가질 것으로 의심되는 개체에게 상기 클로로톡신 접합체가 맥관형성의 정도를 감소시키도록 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 클로로톡신 접합체는 신생혈관의 형성을 예방한다. 몇몇 실시양태에서, 클로로톡신 접합체는 기존 신생혈관의 퇴화를 유발한다.
A. 투여량 및 투여
본 발명에 따른 조성물은 소정 시간의 기간에 걸쳐 단일 용량 또는 복수 용량으로 이루어진 섭생에 따라 투여될 수 있다.
클로로톡신 접합체, 또는 그의 제약 조성물은 원하는 효과 (예를 들어, 치료, 진단 등)를 달성하기 위해 효과적인 임의의 투여 경로를 사용하여 투여될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 클로로톡신 접합체 (또는 그의 제약 조성물)는 전신적으로 전달된다. 전형적인 전신 투여 경로에는 근육내, 정맥내, 폐 및 경구 경로가 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다. 또한, 전신 투여는, 예컨대 주입 또는 볼루스 주사, 또는 상피 또는 점막피부 라이닝 (예를 들어, 경구, 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 클로로톡신 접합체는 정맥내로 투여된다.
별법으로 또는 부가적으로, 다른 투여 경로 또한 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 클로로톡신 접합체는 정맥내, 두개강내 (강내 포함), 근육내, 종양내, 피하, 안내 (intraocular), 안구주위, 국부 적용으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경로 또는 그의 조합에 의해서 투여된다.
하기 논의된 바와 같이, 안구 신생혈관 형성 질환에서의 맥관형성의 정도를 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 클로로톡신 접합체는 눈으로 전달될 수 있다. 눈으로의 전달은, 예를 들어 안내 및/또는 안구주위 경로 (예컨대, 유리질내 주사, 결막하 (subjunctival) 주사 등)를 이용하여 달성될 수 있다. 또한, 클로로톡신 작용제의 눈으로의 국부 적용은, 예를 들어 안약을 사용하여 달성될 수 있다.
특히, 안구 경로 투여는 안구 신생혈관 형성 질환, 예컨대 황반 변성의 치료에 유용할 수 있다.
투여는 매일, 매주 (또는 몇몇 다른 수일 간격에서) 1회 또는 수회, 또는 간헐적 스케줄 상으로 할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 수주 (예를 들어, 4-10주)의 기간 동안 매주 기준으로 1일 1회 이상 투여될 수 있다. 별법으로, 조성물은 수일 (예를 들어, 1-10일)의 기간 동안 매일 투여된 후에 수일 (예를 들어, 1-30일)의 기간까지 투여되지 않을 수 있고, 상기 주기는 주어진 횟수 (예를 들어, 2-10주기)로 반복된다. 몇몇 실시양태에서, 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회 또는 적어도 6회의 용량이 투여된다. 몇몇 실시양태에서, 조성물은 적어도 2주, 3주, 4주, 5주 또는 6주 동안 매주 투여된다.
투여는 임의의 편리한 방식, 또는 임의의 방식의 조합으로, 예컨대 주사 (피하, 정맥내, 근육내, 복막내 등), 경구 투여 및/또는 강내 투여에 의해 수행될 수 있다.
투여 경로에 따라, 유효량은 치료되어야 할 대상체의 장기 기능, 체중 또는 신체 표면적에 따라 산출될 수 있다. 적절한 투여량은 인간 임상 시험에서 관찰된 약동학적 데이터를 고려하여 당업자에 의해 쉽게 최적화될 수 있다. 최종 투여량 섭생은 약물의 작용 (예를 들어, 약물의 특이적 활성)을 변형하는 다양한 인자, 손상의 중증도 및 환자의 민감성, 환자의 나이, 상태, 체중, 성별 및 식이요법, 임의의 존재하는 감염의 중증도, 투여 시간, 동시 요법의 사용 (또는 미사용), 및 다른 임상 인자를 고려하여, 전문의에 의해 결정될 수 있다.
전형적인 투여량은 체중 1 kg 당 약 1.0 pg 내지 약 100 mg의 범위이다. (투여량은 본원에서 접합체의 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드 부분의 중량을 기준으로 나타냄).
예컨대, 전신 투여를 위해서, 전형적인 투여량은 체중 1 kg 당 약 100.0 ng 내지 약 10.0 mg의 범위이다. 예컨대, 클로로톡신 접합체가 정맥내로 투여되는 특정 실시양태에서, 작용제의 투여는 약 0.001 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 예를 들어, 약 0.001 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 4 mg/kg, 약 0.02 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 약 0.03 mg/kg 내지 약 2 mg/kg, 또는 약 0.03 mg/kg 내지 약 1.5 mg/kg을 포함하는 하나 이상의 용량의 클로로톡신의 투여를 포함할 수 있다. 예컨대, 몇몇 실시양태에서, 약 0.002 mg/kg, 약 0.004 mg/kg, 약 0.006 mg/kg, 약 0.008 mg/kg, 약 0.009 mg/kg, 약 0.01 mg/kg, 약 0.02 mg/kg, 또는 약 0.02 mg/kg 초과의 클로로톡신을 함유하는 각각 하나 이상의 용량의 클로로톡신 접합체가 투여될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 약 0.03 mg/kg, 약 0.04 mg/kg, 약 0.05 mg/kg, 약 0.06 mg/kg, 약 0.07 mg/kg, 약 0.09 mg/kg, 약 1.0 mg/kg, 또는 약 1.0 mg/kg 초과의 클로로톡신을 함유하는 각각 하나 이상의 용량의 클로로톡신 접합체가 투여될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 약 0.05 mg/kg, 약 0.10 mg/kg, 약 0.15 mg/kg, 약 0.20 mg/kg, 약 0.25 mg/kg, 약 0.30 mg/kg, 약 0.35 mg/kg, 약 0.40 mg/kg, 약 0.45 mg/kg, 약 0.50 mg/kg, 약 0.55 mg/kg, 약 0.60 mg/kg, 약 0.65 mg/kg, 약 0.70 mg/kg, 약 0.75 mg/kg, 약 0.80 mg/kg, 약 0.85 mg/kg, 약 0.90 mg/kg, 약 0.95 mg/kg, 약 1.0 mg/kg 또는 약 1 mg/kg 초과의 클로로톡신을 함유하는 각각 하나 이상의 용량의 클로로톡신 접합체가 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 약 1.0 mg/kg, 약 1.05 mg/kg, 약 1.10 mg/kg, 약 1.15 mg/kg, 약 1.20 mg/kg, 약 1.25 mg/kg, 약 1.3 mg/kg, 약 1.35 mg/kg, 약 1.40 mg/kg, 약 1.45 mg/kg, 약 1.50 mg/kg 또는 약 1.50 mg/kg 초과의 클로로톡신을 함유하는 각각 하나 이상의 용량의 클로로톡신 접합체가 투여될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 치료는 클로로톡신 접합체의 단일 용량의 투여, 또는 2 용량, 3 용량, 4 용량, 5 용량, 6 용량 또는 6 용량 초과의 투여를 포함할 수 있다. 2회의 연속적인 용량은 1일 간격, 2일 간격, 3일 간격, 4일 간격, 5일 간격, 6일 간격, 7일 간격 또는 7일 초과의 간격 (예를 들어, 10일, 2주 또는 2주 초과)에서 투여될 수 있다.
미세주입을 통해 부위에 직접 투여하기 위해, 전형적인 투여량은 체중 1 kg 당 약 1 ng 내지 약 1 mg의 범위이다.
클로로톡신 접합체가 국부적으로 투여되는 특정 실시양태에서, 특히 뇌로 강내 투여하는 경우에, 접합체의 투여는 약 0.01 mg 내지 약 100 mg, 예를 들어 약 0.05 내지 약 50 mg, 약 0.1 mg 내지 약 25 mg, 약 0.1 mg 내지 약 10 mg, 약 0.1 mg 내지 약 5 mg 또는 약 0.1 mg 내지 약 1.0 mg을 포함하는 하나 이상의 용량의 클로로톡신 폴리펩티드의 투여를 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 약 1 mg, 약 1.5 mg, 약 2 mg, 약 2.5 mg, 약 3 mg, 약 3.5 mg, 약 4 mg, 약 4.5 mg 또는 약 5 mg의 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드를 함유하는 각각 하나 이상의 용량의 클로로톡신 접합체가 투여될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 약 0.1 mg, 약 0.15 mg, 약 0.2 mg, 약 0.25 mg, 약 0.3 mg, 약 0.35 mg, 약 0.4 mg, 약 0.45 mg, 약 0.5 mg, 약 0.55 mg, 약 0.6 mg, 약 0.65 mg, 약 0.7 mg, 약 0.75 mg, 약 0.8 mg, 약 0.85 mg, 약 0.9 mg, 약 0.95 mg 또는 약 1 mg의 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드를 함유하는 각각 하나 이상의 용량의 클로로톡신 접합체가 투여될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 치료는 클로로톡신 접합체의 단일 용량의 투여, 또는 2 용량, 3 용량, 4 용량, 5 용량, 6 용량 또는 6 용량 초과의 투여를 포함할 수 있다. 2회의 연속적인 용량은 1일 간격, 2일 간격, 3일 간격, 4일 간격, 5일 간격, 6일 간격, 7일 간격 또는 7일 초과의 간격 (예를 들어, 10일, 2주 또는 2주 초과)에서 투여될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 다수의 용량이 투여되고, 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드의 투여된 양은 모든 용량에 대해 동일하지 않다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 용량은 임상의의 결정에 따라 1회 용량 내지 또다른 용량으로 조정 (예를 들어, 증가 또는 감소됨)될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물이 추가 요법 (즉, 본 발명에 따른 치료는 하나 이상의 바람직한 치료법 또는 의료 절차와 동시에, 이전에, 또는 이후에 투여될 수 있음)과 조합하여 사용될 수 있다는 것이 인지될 것이다. 이러한 조합 섭생에서 사용하기 위한 요법 (치료법 및/또는 절차)의 특정 조합은 바람직한 치료법 및/또는 절차의 생적합성 및 달성되어야 할 원하는 치료 효과를 고려할 것이다.
예를 들어, 본 발명의 방법 및 조성물은 수술, 방사선 치료 (예를 들어, 감마-방사선, 양성자 빔 방사선 치료, 전자 빔 방사선 치료, 양성자 치료, 근접치료 및 전신 방사성 동위원소), 내분비 치료, 고온온열치료 및 냉동치료를 비롯한 다른 절차와 함께 사용될 수 있다.
별법으로 또는 부가적으로, 본 발명의 방법 및 조성물은 임의의 유해한 효과를 약화시키는 여타 작용제 (예를 들어, 항구토제)와 함께, 및/또는 알킬화 약물 (메클로레타민, 클로람부실, 시클로포스파미드, 멜팔란, 이포스파미드), 항대사물질 (메토트렉세이트), 퓨린 길항제 및 피리미딘 길항제 (6-머캅토퓨린, 5-플루오로우라실, 시타라빈, 겜시타빈), 방추체 독 (빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 파클리탁셀), 포도필로톡신 (에토포시드, 이리노테칸, 토포테칸), 항생제 (독소루비신, 블레오마이신, 미토마이신), 니트로소우레아 (카르무스틴, 로무스틴), 무기 이온 (시스플라틴, 카르보플라틴), 효소 (아스파라기나제) 및 호르몬 (타목시펜, 류프롤리드, 플루타미드 및 메게스트롤)이 포함되나 이에 한정되지는 않는 여타 승인된 화학요법제 약물과 함께 사용될 수 있다. 업데이트된 암 요법에 대한 보다 폭넓은 논의에 대해서는, http://www.cancer.gov/, http://www.fda.gov/cder/cancer/druglistframe.htm (FDA 승인된 종양학 약물의 목록), 및 전문이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [The Merck Manual, Seventeenth Ed. 1999]을 참조한다.
또한, 본 발명의 방법 및 조성물은 치료 섭생의 일부로서의 세포독성제로 이루어진 하나 이상의 부가 조합물과 함께 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 세포독성제의 부가 조합물은 CHOPP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카르바진); CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손); COP (시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손); CAP-BOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 프로카르바진, 블레오마이신, 빈크리스틴 및 프레드니손); m-BACOD (메토트렉세이트, 블레오마이신, 독소루비신, 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 덱사메타손 및 류코보린); ProMACE-MOPP (프레드니손, 메토트렉세이트, 독소루비신, 시클로포스파미드, 에토포시드, 류코보린, 메클로에타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카르바진); ProMACE-CytaBOM (프레드니손, 메토트렉세이트, 독소루비신, 시클로포스파미드, 에토포시드, 류코보린, 시타라빈, 블레오마이신 및 빈크리스틴); MACOP-B (메토트렉세이트, 독소루비신, 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손, 블레오마이신 및 류코보린); MOPP (메클로에타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카르바진); ABVD (아드리아마이신/독소루비신, 블레오마이신, 빈블라스틴 및 다카르바진); ABV (아드리아마이신/독소루비신, 블레오마이신 및 빈블라스틴)와 교대로 투여되는 MOPP (메클로에타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카르바진); ABVD (아드리아마이신/독소루비신, 블레오마이신, 빈블라스틴 및 다카르바진)와 교대로 투여되는 MOPP (메클로에타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카르바진); Ch1VPP (클로람부실, 빈블라스틴, 프로카르바진 및 프레드니손); IMVP-16 (이포스파미드, 메토트렉세이트 및 에토포시드); MIME (메틸-개그(gag), 이포스파미드, 메토트렉세이트 및 에토포시드); DHAP (덱사메타손, 고용량 시타리빈 및 시스플라틴); ESHAP (에토포시드, 메틸프레디솔론, 고용량 시타라빈 및 시스플라틴); CEPP(B) (시클로포스파미드, 에토포시드, 프로카르바진, 프레드니손 및 블레오마이신); CAMP (로무스틴, 미톡산트론, 시타라빈 및 프레드니손); CVP-1 (시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손), ESHOP (에토포시드, 메틸프레디솔론, 고용량 시타라빈, 빈크리스틴 및 시스플라틴); EPOCH [에토포시드, 빈크리스틴 및 독소루비신 (시클로포스파미드 및 경구 프레드니손의 볼루스 용량과 함께 96시간 동안)], ICE (이포스파미드, 시클로포스파미드 및 에토포시드), CEPP(B) (시클로포스파미드, 에토포시드, 프로카르바진, 프레드니손 및 블레오마이신), CHOP-B (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 프레드니손 및 블레오마이신), CEPP-B (시클로포스파미드, 에토포시드, 프로카르바진 및 블레오마이신) 및 P/DOCE (에피루비신 또는 독소루비신, 빈크리스틴, 시클로포스파미드 및 프레드니손)로부터 선택된다.
B. 징후
본 발명의 조성물 및 방법은 질환 또는 병태를 치료 및/또는 진단하기 위해 각종 항-증식성 및/또는 항-맥관형성의 맥락에서 사용될 수 있다.
1. 항-증식성 맥락
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 비조절성 세포 증식, 예컨대, 1차 및/또는 전이성 암, 및 기타 암성 병태를 포함하는 병태를 치료 및/또는 진단하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 및 방법은 고형 종양 크기의 감소, 종양 증식 또는 전이의 억제, 각종 림프종의 치료 및/또는 상기 질환을 앓고 있는 포유동물 (인간 포함)의 생존 기간의 연장에 유용해야 한다.
본 발명에 따라 치료 및/또는 진단될 수 있는 암 및 암성 병태의 예에는 뇌 종양 및 중추 신경계 종양 (예를 들어, 수막, 뇌, 척수, 뇌신경 및 CNS의 다른 부분의 종양, 예를 들어 교아세포종 또는 수모세포종); 두경부암, 유방 종양, 순환기관 종양 (예를 들어, 심장, 종격 및 가슴막, 및 기타 흉내 장기, 혈관 종양 및 혈관 조직 관련 종양); 혈액 및 림프계 종양 (예를 들어, 호지킨 질환, 비-호지킨 질환 림프종, 버키트 림프종, AIDS-관련 림프종, 악성 면역증식성 질환, 다발성 골수종, 및 악성 형질세포 신생물, 림프성 백혈병, 골수성 백혈병, 급성 또는 만성 림프구성 백혈병, 단핵구 백혈병, 특정 세포 유형의 기타 백혈병, 특정되지 않은 세포 유형의 백혈병, 특정되지 않은 림프, 조혈, 관련조직의 악성 신생물, 예컨대 미만성 대형 세포 림프종, T-세포 림프종 또는 피부 T-세포 림프종); 배설계 종양 (예를 들어, 콩팥, 신장 깔때기, 요관, 방광, 및 기타 비뇨기); 위창자관 종양 (예를 들어, 식도, 위, 소장, 결장, 결장직장, 직장구불결장 이행부, 직장, 항문 및 항문관); 간 및 간내 쓸개관, 쓸개, 및 기타 담도 부분, 췌장, 및 기타 소화 기관을 포함하는 종양; 구강 종양 (예를 들어, 입술, 혀, 잇몸, 입바닥, 입천장, 귀밑샘, 침샘, 편도, 입인두, 코인두, 조롱박굴, 하인두, 및 기타 구강 부분); 생식계 종양 (예를 들어, 외음, 질, 자궁목, 자궁, 난소, 및 여성 생식기관과 연관된 기타 부위, 태반, 음경, 전립선, 고환, 및 남성 생식기관과 연관된 기타 부위); 기관지 종양 (예를 들어, 비강, 중이, 부비동, 후두, 기관, 기관지 및 폐, 예컨대 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암); 골격계 종양 (예를 들어, 사지의 뼈 및 관절연골, 뼈관절연골 및 기타 부위); 피부 종양 (예를 들어, 피부의 악성 흑색종, 비-흑색종 피부 암, 피부의 기저 세포 암종, 피부의 편평 세포 암종, 중피종, 카포시 육종); 및 말초 신경계 및 자율 신경계, 결합 및 연 조직, 후복막 및 복막, 눈 및 눈 부속기, 갑상선, 부신, 및 기타 내분비샘 및 관련 구조물, 림프절의 속발성 및 상세불명의 악성 신생물, 호흡계 및 소화계의 속발성 악성 신생물 및 기타 부위의 속발성 악성 신생물을 비롯한 기타 조직을 포함하는 종양이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
몇몇 실시양태에서, 종양은 피부 흑색종 또는 안내 흑색종이다. 몇몇 실시양태에서, 종양은 전이성 흑색종이다. 몇몇 실시양태에서, 종양은 비-소세포 폐암이다. 몇몇 실시양태에서, 종양은 결장암 또는 결장직장암이다.
몇몇 실시양태에서, 조성물 및 방법은 신경외배엽 종양의 치료 및/또는 진단에 유용하다. (예를 들어, 미국 특허 제6,667,156호 참조; 전문이 본원에 참조로 포함됨). 몇몇 실시양태에서, 신경외배엽 종양은 신경교종이다. (예를 들어, 미국 특허 제5,905,027호, 제6,028,174호, 제6,319,891호, 제6,429,187호 및 제6,870,029호, 및 국제 특허 출원 공보 WO03/101475A2, WO09/021136A1 및 WO 2009/140599 참조; 각 전문이 본원에 참조로 포함됨). 본 발명의 조성물 및 방법이 유용한 신경교종의 유형에는 다형성 교모세포종 (WHO 등급 IV), 역형성 성상세포종 (WHO 등급 III), 저등급 신경교종 (WHO 등급 II), 털모양 성상세포종 (WHO 등급 I), 희소돌기아교세포종, 신경절종, 수막종 및 뇌실막세포종이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다. 몇몇 실시양태에서, 신경외배엽 종양은 수모세포종, 신경모세포종, 크롬친화세포종, 흑색종, 말초 원시 신경외배엽 종양, 폐의 소세포 암종, 유잉 육종 (Ewing's sarcoma), 및 뇌에서의 전이성 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 조성물 및 방법은 육종의 치료 및/또는 진단에 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 방광 암, 유방암, 만성 림프종 백혈병, 두경부암, 자궁내막 암, 비-호지킨 림프종, 비-소세포 폐암, 난소 암, 췌장암 및 전립선암의 치료 및/또는 진단에 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 육종은 전립선암 또는 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. (예를 들어, 국제 특허 출원 공보 W003/101474A1, W003/10475A2 및 WO 2009/140599 참조; 각 전문이 본원에 참조로 포함됨). 몇몇 실시양태에서, 육종은 췌장암이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 조성물 및 방법은 골수증식성 장애 (예를 들어, 골수계 기원 종양) 및/또는 림프증식성 장애 (예를 들어, 림프계 기원 종양)의 치료 및/또는 진단에 유용하다. (예를 들어, 국제 특허 출원 공보 W005/099774 참조; 전문이 본원에 참조로 포함됨).
본 발명의 조성물 및 방법이 유용한 골수증식성 장애의 유형에는 진성 적혈구 증가증 (PV), 본태성 혈소판증가증 (ET), 특발성 골수양 이형성 (AMM) (또한, 특발성 골수섬유증 (IMF)으로도 지칭함), 및 만성 골수원성 백혈병 (CML)이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 림프증식성 장애를 치료 및/또는 진단하기 위해 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 림프증식성 장애는 비-호지킨 림프종이다. 몇몇 실시양태에서, 림프증식성 장애는 B 세포 신생물, 예를 들어 전구체 B-세포 림프모구성 백혈병/림프종 또는 말초 B 세포 신생물이다. 말초 B 세포 신생물의 비제한적인 유형에는 B 세포 만성 림프구성 백혈병/소 림프구성 림프종, B 세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포 림프종, 비장변연 B 세포 림프종, 모발성 세포 백혈병, 림프절외변연 B 세포 림프종, 맨틀 세포 림프종, 여포성 림프종, 림프절변연 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 버키트 림프종, 형질세포종 및 형질 세포 골수종이 포함된다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 T 세포 신생물을 치료하기 위해 사용된다. T 세포 신생물의 비제한적인 유형에는 T 세포 전림프구성 백혈병, T 세포 거대 과립 림프구성 백혈병, NK 세포 백혈병, 림프절외 NK/T 세포 림프종, 균상식육종, 원발성 피부 역형성 거대 세포 림프종, 피하 지방층염-유사 T 세포 림프종, 장병증-형태 장관 T 세포 림프종, 간비 감마-델타 T 세포 림프종, 혈관면역모세포형 T 세포 림프종, 말초 T 세포 림프종, 역형성 거대 세포 림프종 및 성인 T 세포 림프종이 포함된다.
본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 치료될 수 있는 종양은 다른 화학요법제를 사용한 치료에 불응성일 수 있다. 본원에서 종양의 지칭에 사용되는 경우에 용어 "불응성"은, 본 발명의 조성물 이외에 적어도 하나의 화학요법제를 사용한 치료시, 이러한 화학치료제의 치료 후에 종양 (및/또는 그의 전이)이 항-증식성 반응을 나타내지 않거나 단지 약한 항-증식성 반응을 나타내는 것 (즉, 종양 증식의 억제가 없거나 단지 약함)을 의미한다; 즉, 다른 (바람직하게는 표준) 화학요법제로 전혀 치료될 수 없거나 또는 단지 불만족한 결과로 치료될 수 없는 종양. 언급된 불응성 종양 등의 치료에서, 본 발명은 (i) 환자의 치료 중에 하나 이상의 화학요법제가 이미 실패하였던 종양뿐만 아니라 (ii) 다른 방법 (예를 들어, 화학요법제의 존재하의 생검 및 배양)에 의해 불응성을 나타낼 수 있는 종양도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
2. 항-맥관형성 문맥
클로로톡신은 항-맥관형성 특성을 가하는 것으로 제시되어 왔다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공보 W02009/117018 (전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 암 (상기 기재된 바와 같은 전이성 암을 포함함), 안구 신생혈관 형성 (예컨대, 황반 변성), 염증성 질환 (예컨대, 관절염) 등과 같은 질환 또는 병태를 치료, 진단 및/또는 개선시키기 위해 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 병태 또는 질환은 맥락막 신생혈관 형성을 특징으로 한다. 이러한 병태 또는 질환의 예에는 황반 변성 (습식 황반 변성, 노화-관련 황반 변성 등을 포함함), 근시, 안구 외상, 탄력섬유성위황색종, 및 그의 조합이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
황반 변성은 65세 이상의 미국인에서 시력 상실 및 실명을 초래하는 원인이다. 청소년 황반 변성 또한 발병하지만, 황반 변성은 노화-관련 형태 (종종, AMD 또는 ARMD로 명명됨)에서 전형적으로 발병한다. AMD/ARMD에서, 황반 (선명한 중심 시력을 담당하는 망막의 부분)이 퇴화된다. 황반 변성은 전형적으로 건식 (비-신생혈관) 또는 습식 (신생혈관)으로 진단된다.
건식 황반 변성에서, 주로 황반 주위의 열화되고 있는 조직으로부터의 침착물 또는 잔해물로부터 드루젠으로 알려진 황색을 띠는 얼룩이 축적되기 시작한다. 일반적으로, 중심 시력 상실이 점진적으로 일어나고, 이는 습식 황반 변성에서의 시력 상실만큼 심각하지는 않다.
"신생혈관" 명칭이 시사하는 바와 같이, 습식 황반 변성은, 예를 들어 황반에서 비정상적으로 성장하는 새로운 혈관을 특징으로 한다. 이러한 새로운 혈관은 혈액을 누출하며 망막 밑에서 성장할 수 있다. 이러한 누출은 중심 시력에서 맹점을 죽이고 만들어내는 빛-민감성 망막 세포에 영구한 손상을 야기한다. 습식 황반 변성은 2개의 카테고리로 추가로 분류될 수 있다. 습식 황반 변성의 잠재 형태에서, 망막 밑에서의 새로운 혈관 성장이 표명한 바와 같지 않고, 누출이 보다 적게 나타나고, 따라서 전형적으로 보다 덜 심각한 시력 상실을 초래한다. 습식 황반 변성의 전형적 형태에서, 혈관 성장 및 흉터는 망막 밑에서 관찰할 수 있는 매우 명백하게 기술된 윤곽을 갖는다. 전형적 습식 황반 변성은 또한 전형적 맥락막 신생혈관 형성으로도 알려져 있고, 일반적으로 보다 심각한 시력 상실을 초래한다.
많은 AMD/ARMD 경우를 포함하는 습식 황반 변성에서의 맥관형성의 역할을 고려하면, 본 발명의 조성물 및 방법은 이러한 장애를 치료, 진단 및/또는 개선시키는 데에 유용할 수 있다. 습식 황반 변성을 위한 본 요법은 맥관형성 억제제, 예컨대 루센티스(LucentisTM), 마쿠젠(MacugenTM) 및/또는 비수딘(VisudyneTM)을 포함하고, 이는 약물을 특정 세포에 표적시키기 위해 광역학 요법 (PDT)과 임의로 조합된다. 또한, 비정상적 혈관으로 망막의 영역에서 작은 화상을 만들어내기 위해 고에너지 레이저 빔이 사용되는 광응고법은 습식 황반 변성을 치료하기 위해 사용된다.
몇몇 실시양태에서, 클로로톡신 접합체 (또는 그의 제약 조성물)는 습식 황반 변성 및/또는 노화-관련 황반 변성을 앓고 있는 대상체에게 투여된다. 습식 황반 변성을 앓고 있는 대상체 중에서, 대상체는 잠재 또는 전형적 형태를 앓을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 클로로톡신 접합체는 기존 신생혈관의 퇴화를 일으킨다. 몇몇 실시양태에서, 클로로톡신 접합체는 새로운 관의 발아를 예방한다. 특정 실시양태에서, 클로로톡신 접합체는 습식 황반 변성을 위한 다른 치료, 예컨대 광응고법, 다른 맥관형성 억제제를 사용한 치료, 광역학 요법 등과 조합된다.
몇몇 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 클로로톡신 작용제는 맥관형성과 관련된 질환, 장애 또는 병태의 치료에 권장된 하나 이상의 치료 섭생과 함께 조합하여 또는 치료 섭생의 부분으로서 투여된다. 몇몇 예를 제공하기 위해, 암의 치료를 위해 권장된 섭생은 국립 암 연구소의 웹사이트인 www.cancer.gov의 URL을 갖는 웹사이트에서 확인할 수 있다. 황반 변성의 치료에 권장된 섭생은 www.mayoclinic org/macular-degeneration/treatment.html의 URL을 갖는 웹사이트에서 확인할 수 있다. 치료 섭생에는 화학요법, 수술, 및/또는 방사선 치료가 포함될 수 있다.
실시예
실시예 1: 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드의 합성
표 1 및 표 2에 나타낸 바와 같이 서열 번호 1-28의 아미노산 서열을 갖는 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드는 고상 펩티드 합성 (SPPS)을 이용하여 합성될 수 있다. 작은 고체 다공성 비드를 링커 (합성 도중에 합성된 폴리펩티드가 이것을 통해 비드에 공유적으로 부착됨)로 처리하였다. 이후, 초기의 폴리펩티드를 고상에 고정시켜 세척 단계 동안에 보유되도록 하였다.
커플링 및 탈보호의 반복된 주기를 이용하여, 서열 번호 1-28의 서열을 갖는 폴리펩티드를 생성하였다. 커플링 및 탈보호의 각 주기에서, 고상에 부착된 펩티드 또는 폴리펩티드의 유리 N-말단 아민을, Fmoc (9H-플루오렌-9-일메톡시카르보닐) 보호기에 의해 N-말단에서 보호된 단일 아미노산 단위에 커플링시켰다. 이어서, 성장하는 펩티드/폴리펩티드 쇄 상의 상기 단위를 디메틸포름아미드 중 20％ 피페리딘과 같은 염기성 조건에서 탈보호하여, 다음 회차의 커플링-탈보호에서 추가의 아미노산에 부착될 수 있는 새로운 N-말단 아민을 생성하였다.
모든 주기를 기재된 바와 같이 완료한 후, 트리플루오로아세트산을 사용하여 폴리펩티드를 비드로부터 절단하였다.
추가적인 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드를 생성하기 위해, 서열 번호 1, 11, 12 및 13의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 표2에 따라 리신에서 PEG화하여 변형시켰다.
실시예 2: 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드의 결합 활성 분석
클로로톡신은 U251 신경교종 세포 및 PC3 전립선암 세포를 비롯한 많은 상이한 종양 유형에 선택적으로 결합하는 것으로 입증된 바 있다. 본 실시예에서, 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성된 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드를 바이오틴으로 표지하고, 결합 활성에 대해 분석하였다. 각각의 바이오티닐화된 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드를 U251 신경교종 세포, 및 별도로 전면배양 미만 상태 (subconfluent)의 세포 배양물로부터 얻은 PC3 전립선암 세포와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 제조자의 지시에 따라 시판 키트를 이용하여 세포를 아비딘-HRP (홀스-래디쉬 퍼옥시다제)로 염색하였다. 클로로톡신을 양성 염색 대조군으로 이용하였고, 폴리펩티드가 없는 인큐베이션 반응을 음성 염색 대조군으로 이용하였다. 또한, 클로로톡신에 비해 산만해진 (scrambled) 아미노산 서열을 갖는 펩티드도 음성 염색 대조군으로 사용될 수 있다. HRP의 착색된 반응 생성물의 존재에 의해 증명되는 양성 염색이, 바이오티닐화된 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드에 의한 결합의 지표로서 사용되었다.
이어서, U251 또는 PC3 세포에 대한 결합을 나타내는 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드를, 비-표지 클로로톡신이 경쟁자로서 이용되는 경쟁 결합 분석에서 (표지된 형태로) 시험하였다. 증가량의 클로로톡신의 존재 하에 결합 수준의 감소를 나타내는 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드가 확인되었다.
결합된 세포의 백분율을 정량하기 위해, 형광 염료 (예컨대, FITC 또는 텍사스 레드)에 커플링된 아비딘을 바이오티닐화된 폴리펩티드와의 안큐베이션 후에 아비딘-HRP 대신 사용하였고, 세포를 FACS (형광-활성화 세포 분류)에 의해 분석하였다.
실시예 3: 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드의 결합 활성에 대한 추가 분석
실시예 2에서 U251 및/또는 PC3에 대해 클로로톡신과 경쟁적으로 결합하는 것으로 확인된 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드에 대해, 보다 포괄적인 결합 프로파일을 얻기 위해 더 넓은 범위의 세포 유형에 대한 결합 활성에 대해 세포를 추가로 분석하였다.
표 3은 세포주의 목록을 나열하고, 1차 배양된 세포 중 어느 하나 또는 그의 임의 조합이 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드로의 결합 분석에서 시험될 수 있다. 표 3에 나열될 세포주 및 1차 배양된 세포는 인간, 래트 및 마우스로부터의 신경교종 세포주와 비-신경교종 세포주 둘 모두를 포함하였다.
<표 3>
Figure 112012070761705-pct00006
Figure 112012070761705-pct00007
실시예 4: 모노리신 클로로톡신 폴리펩티드의 파클리탁셀에의 접합
실시예 1에서 합성되고 실시예 2 및/또는 3에서 결합에 대해 임의로 분석된 하나 이상의 모노리신 클로로톡신 폴리펩티드를, 그 자체로 수불용성 항암 치료제인 파클리탁셀에 접합시켰다. 파클리탁셀은 유사분열 억제제이다.
감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드를 PBS 중에서 파클리탁셀-에스테르-링커 카르복시 물질 (예를 들어, NHS/EEDQ)과 반응시키고, 인큐베이션하였다. 정제된 최종 생성물로부터의 샘플을 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 질량 분광법 (MS)에 의해 분석하여, 단일 종 접합체가 생성되었음을 확인하였다. 생성된 접합체를, 포화 농도 및 용해 속도를 측정함으로써 수용해도에 대해 시험하였다. 수용성인 접합체는 약물 후보로서의 추가 분석을 위해 식별하였다.
실시예 5: 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드의 겜시타빈에의 접합
리신 잔기를 전혀 갖지 않는 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드 (예를 들어, 서열 번호 2, 5 및 6 참조)를 실시예 1에 기재된 바와 같이 합성하고, 임의로 실시예 2 및/또는 3에서 결합에 대해 분석하였다. 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드를 뉴클레오시드 유사체인 겜시타빈 (겜자르 (GemzarTM))에 N-말단을 통해 접합시켰다.
실시예 6: 클로로톡신 접합체의 시험관내 결합 분석
실시예 4 및 5로부터의 클로로톡신 접합체를, 실시예 2 및 3에 기재된 바와 같이 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드에 대해 기재된 종양 세포주에 대한 결합에 대해 개별적으로 시험할 수 있었다.
실시예 7: 클로로톡신 접합체의 시험관내 세포독성 분석
실시예 4 및 5로부터 얻고 임의로 실시예 6에 기재된 바와 같이 결합에 대해 시험된 클로로톡신 접합체를 표 3에 나열된 하나 이상의 세포주에서 세포독성에 대해 시험하였다. 배양물 내의 세포를, 가변 농도의 클로로톡신 접합체 중에서 인큐베이션함으로써 클로로톡신 접합체에 노출시켰다. 노출 1.5시간 후, 세포 생존율을 측정하고, 클로로톡신 접합체의 몰 농도에 대한 생존 세포의 백분율의 플롯을 계산하였다. 비교를 위해, 세포를 개별적으로 세포독성제 단독과 함께 인큐베이션하고 (예를 들어, 실시예 4로부터의 파클리탁셀 또는 실시예 5로부터의 테모졸로미드), 생존율에 대해 유사한 용량-반응 곡선을 계산하였다.
실시예 8: 클로로톡신 접합체의 생체내 흡수
본 발명의 클로로톡신 접합체의 생체내 흡수는 제자리 (in situ) 방사성표지된 펩티드 (13C, 2H 또는 15N 등으로 표지) 및/또는 방사성표지된 물질/잔기; 나노입자 및 자기 공명 영상화; 및/또는 근적외선 염료 및 광생체공학 영상화를 이용한 영상화에 의해 평가할 수 있었다. 또한, 항-클로로톡신 폴리펩티드 항체를 조직에서의 흡수의 검출을 위해 사용할 수 있었다.
실시예 9: 세포 침윤을 억제하는 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드의 생물학적 활성
감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드 (또는 그의 접합체)를, 트랜스-웰 (Trans-well) 이동 분석을 이용하여 종양 세포의 침윤을 억제하는 능력에 대해 시험하였다. 이 분석에서, 종양 세포를 감소된 리신의 클로로톡신 폴리펩티드 (또는 그의 접합체)의 존재 또는 부재 하에 트랜스-웰의 상부 챔버에 플레이팅하고, VEGF 또는 PDGF와 같은 성장 인자로 세포의 이동을 자극하였다. 세포 배양 배지에서의 인큐베이션 대략 24시간 후, 트랜스-웰 필터의 위쪽에 남아있는 비-이동 세포를 제거하고, 아래쪽의 이동된 세포를 가시화를 위해 염색하였다. 이동된 세포를 침윤의 지표로서 계수하였다. 클로로톡신과 유사한 생물학적 활성을 가진 변형된 클로로톡신 변이체는 기능적 활성을 보유하는 것으로 간주되었다.
실시예 10: 생체내 유방암 종양 모델에서의 클로로톡신 접합체
클로로톡신 접합체의 치료적 활성을 생체내 유방암 모델에서 시험하였다. 이 실시예에서, MDA-MB-468 유방암 세포를 수용자 마우스에 이종이식함으로써 생성된 마우스 종양 모델을 이용하여, 실시예 4에서 생성된 파클리탁셀-클로로톡신 접합체의 종양 증식에 대한 효과를 시험하였다.
옆구리에 종양을 가진 마우스에게, 총 8개의 용량으로 1주당 3회 3.7 mg/kg의 파클리탁셀 용량을 정맥내 주사하였다. 이 실험에서 사용된 접합체의 농도는, 비-접합된 파클리탁셀을 이용한 동일한 투여 섭생이 치료적 효과를 갖기에는 불충분하다는 점에서 "치료 농도 미만 (sub-therapeutic)"이었다. 1군의 마우스에게 대조군으로서 염수를 단독으로 주사하였다. 또다른 군의 마우스에게 파클리탁셀을 3.7 mg/kg의 용량으로 주사하였다. 치료 간격 동안 및 그 후에 캘리퍼스를 이용하여 종양의 길이 및 폭을 측정함으로써 종양 증식을 모니터링하였다. 시간 경과에 따른 종양 증식을 시간에 대한 원래 종양 크기의 퍼센트로서 플로팅하였다.
여타 실시양태
본 명세서를 고려하거나 본원에 기재된 본 발명을 실시하는 것으로부터 본 발명의 여타 실시양태가 당업자에게 명백할 것이다. 본 명세서 및 실시예는 단지 예시적인 것으로 고려되어야 하며, 본 발명의 진정한 범위는 하기 청구항에 의해 나타내고자 의도한 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> TransMolecular Inc. 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Claims (71)

  1. 접합을 위한 부위로서 가용한 리신을 1 개 이하로 포함하고,
    서열 번호 1과 적어도 90 % 동일한 아미노산 서열을 포함하는 클로로톡신 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 1과 적어도 95 % 동일한 아미노산 서열을 포함하는 클로로톡신 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 17과 적어도 90 % 동일한 아미노산 서열을 포함하는 클로로톡신 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 서열번호 17과 적어도 95 % 동일한 아미노산 서열을 포함하는 클로로톡신 폴리펩티드.
  5. 제1항에 있어서, 서열 번호 1에 리신이 존재하는 위치에 상응하는 위치에 리신을 포함하는 클로로톡신 폴리펩티드.
  6. 제5항에 있어서, 리신이 서열 번호 1의 위치 15, 서열 번호 1의 위치 23 및 서열 번호 1의 위치 27로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 상응하는 위치에 있는 것인 클로로톡신 폴리펩티드.
  7. 제5항에 있어서, 리신이 서열 번호 1의 위치 27에 상응하는 위치에 있는 것인 클로로톡신 폴리펩티드.
  8. 제1항에 있어서, 서열 번호 1의 위치 15, 23 및 27에 상응하는 아미노산 잔기 중 적어도 하나가 리신이 아닌 것인 클로로톡신 폴리펩티드.
  9. 제8항에 있어서, 서열 번호 1의 위치 15, 23 및 27에 상응하는 적어도 하나의 아미노산 잔기가 알라닌인 클로로톡신 폴리펩티드.
  10. 제8항에 있어서, 서열 번호 1의 위치 15, 23 및 27에 상응하는 적어도 하나의 아미노산 잔기가 아르기닌인 클로로톡신 폴리펩티드.
  11. 제1항에 있어서, 서열 번호 1의 위치 15, 23 또는 27에 상응하는 적어도 하나의 아미노산이 결여되어 있는 클로로톡신 폴리펩티드.
  12. 제1항에 있어서, 리신 잔기를 갖지 않는 클로로톡신 폴리펩티드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 공유 변형(covalent modification)을 포함하는 클로로톡신 폴리펩티드.
  14. 제13항에 있어서, 상기 공유 변형은 다음 중 적어도 하나를 포함하는 것인 클로로톡신 폴리펩티드:
    PEG(폴리에틸렌 글리콜); PEG 이-산 티올-산; 말레이미드-산; 디펩티드 스페이서; 아미드; 디-메틸기; 트리-메틸기; 알킬기; 부틸기; 프로필기; 및 에틸기.
  15. 적어도 하나의 치료적 잔기와 회합된 적어도 하나의 클로로톡신 폴리펩티드를 포함하고,
    여기서 클로로톡신 폴리펩티드는 1 개 이하의 리신을 포함하며 서열 번호 1과 적어도 90 % 동일한 아미노산 서열을 포함하고,
    치료적 잔기는 단일 리신을 통해 또는 클로로톡신 폴리펩티드의 N-말단을 통해 클로로톡신 폴리펩티드에 공유적으로 회합된 것인,
    접합체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 클로로톡신 폴리펩티드는 서열번호 1과 적어도 95 % 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 접합체.
  17. 제15항에 있어서, 상기 클로로톡신 폴리펩티드는 서열번호 17과 적어도 90 % 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 접합체.
  18. 제15항에 있어서, 상기 클로로톡신 폴리펩티드는 서열번호 17과 적어도 95 % 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 접합체.
  19. 제15항에 있어서, 클로로톡신 폴리펩티드 및 치료적 잔기가 공유적으로 직접 회합된 것인 접합체.
  20. 제15항에 있어서, 클로로톡신 폴리펩티드 및 치료적 잔기가 링커를 통해 공유적으로 회합된 것인 접합체.
  21. 제15항에 있어서, 치료적 잔기가 항암제를 포함하는 것인 접합체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 항암제가
    BCNU, 시스플라틴, 겜시타빈, 히드록시우레아, 파클리탁셀, 테모졸로미드, 토포테칸, 플루오로우라실, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 프로카르바진, 데카르바진, 알트레타민, 메토트렉세이트, 머캅토퓨린, 티오구아닌, 플루다라빈 포스페이트, 클라드리빈, 펜토스타틴, 시타라빈, 아자시티딘, 에토포시드, 테니포시드, 이리노테칸, 도세탁셀, 독소루비신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 이다루비신, 플리카마이신, 미토마이신, 블레오마이신, 타목시펜, 플루타미드, 류프롤리드, 고세렐린, 아미노글루티미드, 아나스트로졸, 암사크린, 아스파라기나제, 미톡산트론, 미토탄 및 아미포스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 접합체.
  23. 제21항에 있어서, 항암제가 탁산인 접합체.
  24. 제23항에 있어서, 탁산이 파클리탁셀, 도세탁셀 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 접합체.
  25. 제15항에 있어서, 치료적 잔기가 방사성동위원소, 효소, 전구약물 활성화 효소, 방사성 감작제, 핵산 분자, 간섭 RNA, 슈퍼항원, 항-맥관형성 작용제, 알킬화제, 퓨린 길항제, 피리미딘 길항제, 식물 알칼로이드, 개재 항생제, 아로마타제 억제제, 항-대사물질, 유사분열 억제제, 성장 인자 억제제, 세포 주기 억제제, 효소, 토포이소머라제 억제제, 생물학적 반응 변형제, 항-호르몬 및 항-안드로겐으로 이루어진 군의 구성원인 접합체.
  26. 제25항에 있어서, 상기 핵산 분자가 DNA, 효소적 RNA, RNA:DNA 하이브리드, 삼중화 DNA, ssRNA, dsRNA, tRNA, mRNA, rRNA, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 접합체.
  27. 제15항에 있어서, 클로로톡신 폴리펩티드가 서열 번호 1에 리신이 존재하는 위치에 상응하는 위치에 리신을 포함하는 것인 접합체.
  28. 제27항에 있어서, 클로로톡신 폴리펩티드가 서열 번호 1의 위치 15, 서열 번호 1의 위치 23 및 서열 번호 1의 위치 27로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에 상응하는 위치에 리신을 포함하는 것인 접합체.
  29. 제28항에 있어서, 클로로톡신 폴리펩티드가 서열 번호 1의 위치 27에 상응하는 위치에 리신을 포함하는 것인 접합체.
  30. 제15항에 있어서, 서열 번호 1의 위치 15, 23 및 27에 상응하는 클로로톡신 폴리펩티드의 아미노산 중 적어도 하나가 리신 이외의 아미노산인 접합체.
  31. 제30항에 있어서, 서열 번호 1의 위치 15, 23 또는 27에 상응하는 클로로톡신 폴리펩티드에서 적어도 하나의 아미노산이 알라닌인 접합체.
  32. 제30항에 있어서, 서열 번호 1의 위치 15, 23 또는 27에 상응하는 클로로톡신 폴리펩티드에서 적어도 하나의 아미노산이 아르기닌인 접합체.
  33. 제15항에 있어서, 클로로톡신 폴리펩티드가 서열 번호 1의 위치 15, 23 또는 27에 상응하는 적어도 하나의 아미노산이 결여되어 있는 것인 접합체.
  34. 제15항에 있어서, 클로로톡신 폴리펩티드가, 중합체를 포함하는 잔기에 공유적으로 부착되어 있는 것인 접합체.
  35. 제34항에 있어서, 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인 접합체.
  36. 제35항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜이 클로로톡신 폴리펩티드의 아미노 말단을 통해 부착되어 있는 것인 접합체.
  37. 제15항 내지 제36항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 접합체, 또는 그의 생리학상 허용되는 염을 포함하고,
    상기 접합체가 종양에 특이적으로 결합하는 것인,
    종양을 갖거나 종양을 가질 것으로 의심되는 개체를 치료하기 위한 제약 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 종양이 신경외배엽 종양인 제약 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 신경외배엽 종양이 신경교종인 제약 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 신경교종이 다형성 교모세포종 (WHO 등급 IV), 역형성 성상세포종 (WHO 등급 III), 저등급 신경교종 (WHO 등급 II), 털모양 성상세포종 (WHO 등급 I), 희소돌기아교세포종, 신경절종, 수막종 및 뇌실막세포종으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
  41. 제38항에 있어서, 신경외배엽 종양이 수모세포종, 신경모세포종, 크롬친화세포종, 흑색종, 말초 원시 신경외배엽 종양, 폐의 소세포 암종, 유잉 육종 (Ewing's sarcoma), 및 뇌의 전이성 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
  42. 제37항에 있어서, 종양이 전립선암 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
  43. 제37항에 있어서, 종양이 피부 흑색종 또는 안내 (intraocular) 흑색종인 제약 조성물.
  44. 제37항에 있어서, 종양이 전이성 종양인 제약 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 종양이 전이성 흑색종인 제약 조성물.
  46. 제37항에 있어서, 종양이 비-소세포 폐암인 제약 조성물.
  47. 제37항에 있어서, 종양이 결장암 또는 결장직장암인 제약 조성물.
  48. 제37항에 있어서, 종양이 췌장암인 제약 조성물.
  49. 제15항의 접합체를 포함하고,
    황반 변성 또는 염증성 질환을 가지거나 이들을 가질 것으로 의심되는 개체를 치료하기 위한 제약 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 상기 개체는 황반 변성을 가지거나 황반 변성을 가질 것으로 의심되는 것인 제약 조성물.
  51. 제49항에 있어서, 상기 개체는 염증성 질환을 가지거나 염증성 질환을 가질 것으로 의심되는 것인 제약 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 상기 개체는 류머티스성 관절염을 가지거나 류머티스성 관절염을 가질 것으로 의심되는 것인 제약 조성물.
  53. 제15항의 접합체를 포함하는 조성물이며, 비정상적 맥관형성을 특징으로 하는 질환 또는 병태를 갖거나 상기 질환 또는 병태를 가질 것으로 의심되는 개체에서 상기 접합체가 맥관형성의 정도를 감소시키는 것인 제약 조성물.
  54. 제53항에 있어서, 접합체가 신생혈관의 형성을 예방하는 것인 제약 조성물.
  55. 제53항에 있어서, 접합체가 기존 신생혈관의 퇴화를 유발하는 것인 제약 조성물.
  56. 제53항에 있어서, 질환 또는 병태가 황반 변성, 염증성 질환, 또는 류머티스성 관절염인 제약 조성물.
  57. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 클로로톡신 폴리펩티드를 포함하고,
    여기서 클로로톡신 폴리펩티드는 적어도 하나의 검출가능한 잔기 또는 표적화 잔기와 회합되고,
    상기 검출가능한 잔기 또는 표적화 잔기는 존재하는 가용한 단일 리신을 통해 또는 클로로톡신 폴리펩티드의 N-말단을 통해 클로로톡신 폴리펩티드에 공유적으로 회합된 것인,
    접합체.
  58. 제57항에 있어서, 클로로톡신 폴리펩티드와 검출가능한 잔기 또는 표적화 잔기가 직접 또는 링커를 통해 공유적으로 회합된 것인 접합체.
  59. 제57항에 있어서, 상기 검출가능한 잔기가
    리간드, 방사핵종, 형광 염료, 화학발광 작용제, 생체발광 작용제, 양자점, 미세입자, 금속 나노입자, 나노클러스터, 상자성 금속 이온, 효소, 발색성 표지, 바이오틴, 디옥시게닌 및 합텐으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 접합체.
  60. 제59항에 있어서, 상기 방사핵종이
    요오드-131 (131I), 요오드 125 (125I), 비스무트-212 (212Bi), 비스무트-213 (213Bi), 아스타틴-221 (221At), 구리-67 (67Cu), 구리-64 (64Cu), 레늄-186 (186Re), 레늄-188 (188Re), 인-32 (32P), 사마륨-153 (153Sm), 루테튬-177 (177Lu), 테크네튬-99m (99mTc), 갈륨-67 (67Ga), 인듐-111 ( 11lIn) 및 탈륨-201 (201Tl)으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 접합체.
  61. 제59항에 있어서, 상기 상자성 금속이
    가돌리늄 III (Gd3+), 크롬 III (Cr3+), 디스프로슘 III (Dy3+), 철 III (Fe3+), 망간 II (Mn2+) 및 이테르븀 III (Yb3+)으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 접합체.
  62. 제57항에 있어서, 상기 표적화 잔기가 항체 또는 항체 단편을 포함하는 것인 접합체.
  63. 제57항에 있어서, 조직을 영상화하기 위한 접합체.
  64. 제57항에 있어서, 개체에서 암을 검출하기 위한 접합체.
  65. 제64항에 있어서, 수술 동안 종양을 검출하기 위한 접합체.
  66. 단일 리신 잔기를 가지고,
    하나 이상의 치료적 작용제, 진단적 작용제, 영상화 작용제, 또는 표적화 작용제와 공유적으로 커플링된, 제1항의 클로로톡신 폴리펩티드
    를 포함하는 접합체.
  67. 제66항에 있어서, 치료적 작용제, 진단적 작용제, 영상화 작용제, 또는 표적화 작용제는 리신 잔기를 통해 클로로톡신 폴리펩티드와 공유적으로 커플링된 것인 접합체.
  68. 제66항 또는 제67항에 있어서, 진단적 작용제 또는 영상화 작용제는 형광 표지, 방사성표지, 및 자기 공명 영상화 표지로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 접합체.
  69. 제66항 또는 제67항에 있어서, 진단적 작용제 또는 영상화 작용제는 금속 나노입자, 나노클러스터, 상자성 금속 이온, 또는 가돌리늄을 포함하는 표지 잔기로 구성된 군으로부터 선택된 것인 접합체.
  70. 제66항 또는 제67항에 있어서, 표적화 작용제는 항체, 폴리펩티드, 당류, 및 핵산으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 접합체.
  71. 제66항 또는 제67항에 있어서, 치료적 작용제는 화학치료제인 접합체.
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