DE69803376T2

DE69803376T2 - Äthylenglykolester von monohydrobenzoporphyrinderivaten als photoaktive mittel

Info

Publication number: DE69803376T2
Application number: DE69803376T
Authority: DE
Inventors: David Dolphin; W. Hunt; Ashok Jain; G. Levy; M. Richter; Ethan Sternberg; Elizabeth M. Waterfield
Original assignee: University of British Columbia; QLT Inc; Quadra Logic Technologies Inc
Current assignee: University of British Columbia; Novelion Therapeutics Inc
Priority date: 1997-05-07
Filing date: 1998-05-06
Publication date: 2002-08-14
Anticipated expiration: 2018-05-07
Also published as: JP2001507369A; EP0983273B8; CN1113882C; US6153639A; EP1177795A3; AU741070B2; NZ338031A; DK0983273T3; ES2171022T3; US5929105A; HU221754B1; WO1998050387A1; CZ294715B6; NO995436L; ATE211473T1; DE69803376D1; PL336790A1; IL132066A0; CN1254339A; CA2284879C

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft bei der fotodynamischen Therapie (PDT) und verwandte Anwendungen nützliche Verbindungen. Insbesondere betrifft sie Ethylenglycolester von Monohydrobenzoporphyrinen.

Hinterrund des Fachgebiets

Fotodynamische Therapie (PDT) umfaßt im allgemeinen die Verabreichung von Verbindungen, die Licht, üblicherweise im sichtbaren Bereich, jedoch auch im nahen Ultraviolettbereich absorbieren können, gefolgt von Bestrahlung von Stellen beim Patienten, für welche eine toxische oder hemmende Wirkung erwünscht ist. PDT wurde anfänglich unter Verwendung von Hämatoporphyrin und verwandten Verbindungen zur Behandlung von Tumoren entwickelt, da es schien, dass diese Verbindungen sich an schnell teilende Zellen enthaltenden Stellen "einfinden". Der Tumor konnte dann mit durch das Hämatoporphyrin absorbiertem Licht bestrahlt werden, was die Zerstörung des umgebenden Gewebes zur Folge hatte. PDT zeigte sich seither bei der Behandlung von artheriosklerotischen Ablagerungen, Restenose, Infektionen im Blutstrom, rheumatoider Arthritis, Psoriasis und bei der Behandlung von nicht unbedingt auf Tumore begrenzten Augenerkrankungen nützlich.
Das US Patent Nr. 5,171,749 und auf verwandte Anmeldungen erteilte Patente, die US Patente Nr. 5,283,255, 5,399,583, 4,883,790, 4,920,143 und 5,095,030, die alle hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind, beschreiben und beanspruchen eine Klasse photoaktiver Verbindungen, welche bei der PDT nützlich sind und als Monohydrobenzoporphyrine oder "BPDs" bezeichnet werden. Diese Klasse wird durch Diels-Adler-Reaktion eines mono- oder disubstituierten Alkyns mit Protoporphyrin-IX erhalten, und die erhaltenen Verbindungen können weiter isomerisiert, reduziert und/oder derivatisiert werden, um eine große Klasse an BPDs zu erhalten. Wie in diesen Patenten offenbart, wird eine besonders nützliche Unterklasse dieser Gruppe aus der Hydrolyse oder teilweisen Hydrolyse der Estergruppen der 2-Carboxyethylseitenketten an den Ringen C und D erhalten. Veresterung als Schutz dieser Gruppen während der Diels-Adler-Reaktion führt zu 2-Carbalkoxyethylgruppen enthaltenden Anfangsprodukten. Es wurde gefunden, dass leichte Hydrolyse dieser Ester ohne weitere3s durchgeführt werden konnte, wobei irgendwelche Carbalkoxygruppen, die mit dem aus einem Dicarbalkoxyalkyn erhaltenen Diels-Adler-Produkt in Zusammenhang stehen, nahezu vollständig unhydrolysiert gelassen werden. Dies führte zu vier Arten von Verbindungen: BPD-MA, BPD-MB, BPD-DA und BPD-DB, wie in Fig. 1 veranschaulicht; diese Figur stammt aus dem US Patent Nr. 5,171,749. In dieser Veranschaulichung sind R¹ und R² Carbalkoxygruppen, üblicherweise Carbomethoxy- oder Carboethoxygruppen und ist R ein (C&sub1;&submin;&sub6;)-Alkylrest.
Für BPD-MA wurde gefunden, dass es besonders nützliche Eigenschaften für PDT aufweist, und es ist gegenwärtig in klinischer Entwicklung. Jedoch bleibt eine Notwendigkeit für zusätzliche spezifische Formen von photoaktiven Mitteln bestehen, die das Repertoire an photoaktiven Verbindungen für eine Reihe von Indikationen erweitern, für welche, wie vorstehend beschrieben, PDT angewandt wird. Die vorliegende Erfindung stellt Verbindungen bereit, bei welchen die Ringe C und D Ethylenglycolester der Carboxyalkylsubstituenten enthalten. Diese Verbindungen weisen pharmakokinetische Eigenschaften auf, die in bestimmten, PDT einsetzenden Fällen vorteilhaft sind.

Offenbarung der Erfindung

Die Verbindungen dieser Erfindung sind nützliche, neue Ergänzungen zu dem Repertoire an Verbindungen, die bei der fotodynamischen Therapie und verwandten, Verbindungen einsetzenden Methodologien Anwendung finden. Die Gegenwart von Ethylenglycolestern in diesen Molekülen stellt sie mit Merkmalen bereit, die die Erweiterung des Umfangs an Bedingungen, unter welchen solche photoaktiven Verbindungen eingesetzt werden, und Feinabstimmung der Behandlung erlauben.
Somit ist ein Gesichtspunkt der Erfindung auf Verbindungen der Formel
und die metallierten und/oder markierten und/oder konjugierten Formen davon gerichtet, wobei R¹ ein (C&sub1;&submin;&sub6;)-Alkylrest, vorzugsweise eine Methylgruppe ist, n eine ganze Zahl von 0-6, vorzugsweise 2 ist und R² eine Vinylgruppe oder ein durch Addition oder Oxidation der Vinylgruppe erhältliches Derivat davon, vorzugsweise eine Vinylgruppe, ist.
Die Erfindung ist auch auf Verbindungen der Formel
und die metallierten und/oder markierten und/oder konjugierten Formen davon gerichtet, wobei R¹, n und R² wie vorstehend beschrieben definiert sind. Diese Analoge werden aus Protoporphyrin-III bzw. Protoporphyrin-XIII in einer Weise erhalten, die derjenigen, bei welcher die Verbindungen der Formeln 1 und 2 aus Protoporphyrin-IX erhalten werden, ähnlich ist. Die Erfindung schließt auch Isomere der verschiedenen Formen der Formeln 1-4 ein, die aus den nicht umgelagerten Diels-Adler-Reaktionsprodukten (d. h. das 1,4-Dien) wie in dem hier durch Bezugnahme eingeschlossenen US Patent 4,883,790 beschrieben erhalten werden.
In anderen Gesichtspunkten betrifft die Erfindung Diagnose- und Behandlungsverfahren unter Verwendung der Verbindungen der Formel 1,2,3 oder 4 oder deren 1,4-Dienisomere oder Gemische davon.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die Verbindungen des Standes der Technik, BPD-MA, BPD-MB, BPD-DA und BPD-DB.
Fig. 2 zeigt die Kinetik der Aufnahme von B-EA6 durch L1210-Zellen.
Fig. 3 zeigt die Kinetik der Freisetzung von B-EA6 durch L1210-Zellen.
Fig. 4 zeigt eine grafische Darstellung der Pharmakokinetik von B-EA6 in vivo.
Fig. 5 zeigt einen Vergleich der Kinetik der Aufnahme von B-EA6 durch normale Splenozyten und L1210-Zellen.
Fig. 6 zeigt den Zeitverlauf von PDT unter Verwendung von B-EA6 bei Mäusen im Vergleich zu mit PBD-MA und PBD-MB behandelten Mäusen.
Fig. 7 zeigt die Wirkung von B-EA6 auf das Mikrogefäßsystem bei Mäusen.
Fig. 8 zeigt einen Vergleich der Spektren in Plasma von PBD-MA und B-EA6.
Fig. 9A und 9B zeigen die zytotoxische Wirkung von fotodynamischer Behandlung unter Verwendung von A-EA6 im Vergleich zu PBD-MA in L1210-Zellen und in dendritischen Zellen.
Fig. 10 zeigt die vergleichenden Wirkungen von A-EA6 und BPD-MA bei der Verminderung der Oberflächenexpression von MHC1-Rezeptoren.
Fig. 11 zeigt die Wirkung von fotodynamischer Therapie unter Verwendung von A- EA6 und BPD-MA auf Stress- und Mitogenbandkinasen in HL60-Zellen.
Fig. 12 zeigt die vergleichende Wirkung von PDT unter Verwendung von A-EA6 und BPD-MA auf Caspase-Aktivierung in HL60-Zellen.
Fig. 13 zeigt die vergleichende Wirkung von PDT unter Verwendung von A-EA6 und BPD-MA auf DNA-Fragmentierung in HL60-Zellen.

Ausführungsformen der Erfindung

Die Verbindungen der Erfindung sind verwandt mit denjenigen, welche in den vorstehend zitierten BPD-Patenten offenbart sind, unterscheiden sich jedoch dadurch, dass sie Ester von Ethylenglycol in den Substituenten an den Ringen C und D enthalten. Diese Verbindungen können durch einfache Hydrolyse der Carbalkoxyalkyl- oder Carbalkoxylsubstituenten und Umesterung der erhaltenen Carboxylgruppen in den C- und D- Ringen des Benzoporphyrins oder direkt durch Umesterung erhalten werden.
Es wird angemerkt, dass die Verbindungen 1 und 2 individuelle Arten der in den vorstehend erwähnten US Patenten beschriebenen Gattung sind, welche durch ein eine Diels- Adler-Reaktion mit Protoporphyrin-IX umfassendes Verfahren erhalten werden. Die Verbindungen 3 und 4 werden in einer vollständig analogen Weise, jedoch unter Verwendung von Protoporphyrin-III oder Protoporphyrin-XITI als Substrate für die Diels-Adler-Reaktion hergestellt. Da Protoporphyrin-IX in Bezug auf die A- und B-Ringe nicht symmetrisch ist, werden, abhängig davon, ob die Diels-Adler-Addition im A- oder B-Ring auftritt, zwei mögliche Produkte erhalten. Andererseits sind Protoporphyrin-III und -XIII in Bezug auf diese Ringe symmetrisch, weshalb nur ein Produkt in jedem Fall ungeachtet der Additionsstelle erhalten wird.
In den Verbindungen der Erfindung ist R² vorzugsweise eine Vinylgruppe, kann jedoch auch ein Derivat davon sein. Die Vinylgruppe in Ring A oder B wird leicht zu anderen Ausführungsformen von R² durch Addition oder Oxidation derivatisiert. Die Additions- oder Oxidationsprodukte können weiter substituiert werden, wenn die angehängten Substituenten als austretende Gruppen wirken, z. B. kann -Br durch -OH, -OR", -NH&sub2;, -NHR" oder -NR&sub2;" usw., wobei R" ein Kohlenwasserstoffrest ist, substituiert werden. Zum Beispiel kann einer der angehängten Substituenten ein Wasserstoffatom und der andere ein Halogenatom, eine Hydroxygruppe, ein Niederalkoxyrest, eine Aminogruppe oder eine Amid-, Sulfhydryl- oder eine Organosulfidgruppe oder ein zusätzliches Wasserstoffatom sein. Die Verbindungen der Erfindung schließen verschiedene Gruppen als R², einschließlich zusätzliche Porphyrin- oder Porphyrin-bezogene Ringsysteme bereitstellende Substituenten ein.
Somit kann R² eine Vinylgruppe, die Gruppe -CHOR', -CHO, -COOR', -CH(OR')CH&sub3;, -CH(OR')CH&sub2;OR', -CH(SR')CH&sub3;, -CH(NR')&sub2;CH&sub3;, -CH(CN)CH&sub3;, -CH(COOR')CH&sub3;, -CH(OOCR')CH&sub3;, -CH(NR'COR')CH&sub3;, -CH(CONR'&sub2;,)CH&sub3;, -CH(Halogen)CH&sub3; oder CH(Halogen)CH&sub2;(Halogen) sein, wobei R' für H oder einen (C&sub1;&submin;&sub6;)- Kohlenwasserstoffrest, gegebenenfalls substituiert mit einem Heteroatomsubstituenten, steht oder wobei R² ein organischer Rest mit weniger als 12 Kohlenstoffatomen ist, der durch direkte oder indirekte Derivatisierung der Vinylgruppe erhalten wird, oder wobei R² ein 1-3 Kerne vom Tetrapyrrol-Typ enthaltender Rest ist.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "Alkylrest" eine gesättigte, geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe, die, wenn sie eine ausreichende Anzahl an Kohlenstoffatomen enthält, cyclisch sein oder einen cyclischen Teil enthalten kann. Typische Beispiele sind eine Methyl-, Ethyl-, t-Butyl-, Cyclohexylgruppe und ähnliches.
Ein "Kohlenwasserstoffrest" bedeutet einen einwertigen, nur Kohlenstoff und Wasserstoff enthaltenden Substituenten, der geradkettig oder verzweigt, gesättigt oder ungesättigt, aromatisch oder nicht aromatisch oder beides, und cyclisch oder nicht cyclisch sein kann. Somit könnte ein Kohlenwasserstoffrest mit 1-10 Kohlenstoffatomen eine Cyclopentylethyl-, 2-Pentenyl-, 3-Butynyl-, 2,4-Dimethylhexylgruppe und ähnliches einschließen.
In einigen Ausführungsformen der Erfindung kann der Kohlenwasserstoffrest mit einem Heteroatom-haltigen Substituenten substituiert sein. Solche Substituenten schließen die Gruppe -OR, -NR&sub2;, -SR, -COOR, -CONR&sub2;, -OOCR, -NRCOR, -SOR, -SO&sub2;R, -SO&sub3;R, ein Halogenatom, -CN und ähnliches, wobei R für H oder einen (C&sub1;&submin;&sub6;)-Alkylrest steht, ein. Cyclische Amine schließen eine Pyridyl-, Pyrimidyl-, Thiazolyl-, Chinolylgruppe und so weiter ein. Somit kann sie Einzelring- oder fusionierte Ringsysteme einschließen und zusätzliche Heteroatome enthalten.
Es wird angemerkt, dass die Verbindungen der Erfindung mindestens ein chirales Zentrum enthalten und somit in verschiedenen stereoisomeren Formen vorliegen können. Falls gewünscht, können solche Stereoisomere, einschließlich Enantiomere, unter Verwendung von auf dem Fachgebiet standardmäßigen Techniken getrennt werden, jedoch können auch racämische Gemische oder mehr als ein Diastereomer enthaltende Gemische verwendet werden. Die wie in den Formeln 1-4 gezeigten Verbindungen sind deshalb für die individuellen optischen Isomere, Enantiomere oder Diastereomere, wie es der Fall sein kann, sowie als Gemische von diesen individuellen chiralen Isomeren repräsentativ.
Falls gewünscht, können die Verbindungen der Erfindung in metallierten Formen durch Behandeln des Kerns vom Tetrapyrrol-Typ mit einem entsprechenden Ion, wie einem Magnesiumion, Zinkion, Zinnion und ähnliches hergestellt werden, um einen Metallkomplex zu erhalten. Das Metallion kann auch ein Radiomarker sein. Im allgemeinen wird das Metallion unter Verwendung der entsprechenden Salze unter auf dem Fachgebiet standardmäßigen Bedingungen eingefügt. Zum Beispiel kann das Zinkion durch Behandeln der Verbindung mit Zinkacetat in 1 : 1 Methylenchlorid : Methanol eingebracht werden.
Die Verbindungen können auch Marker, einschließlich Radioisotope, Chromophore und Fluoreszenzmarkierungen enthalten. Radioisotopmarkieren ist im allgemeinen nützlich, wenn die Verbindungen in vivo verfolgt oder zum Markieren für bestimmte Einheiten verwendet werden müssen. Nützliche kationische Einheiten, die Radioisotope sind, schließen Technetium, Gallium und Indium ein. Zusätzlich können Radioisotope von Heteroatomen, wie ¹³¹I oder ³²P, im Molekül selbst oder der Einschluss von ¹&sup4;C kann zum Markieren des Moleküls verwendet werden.
Wie weiter in den vorstehend dargelegten, BPD-bezogenen Patenten beschrieben, können die Verbindungen der Erfindung, falls gewünscht, an ein Zielmittel, das das Molekül zu dem bestimmten Gewebe oder Organ lenkt, gekuppelt werden. Solche Zielmittel schließen Antikörper, Rezeptoren, Rezeptorliganden und ähnliches ein. Die Bindung des Zielmittels an die Verbindung wird unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt. Eine "konjugierte Form" bedeutet eine Verbindung der Formeln 1-4, welche an das Zielmittel wie vorstehend beschrieben gekuppelt ist.
Bevorzugte Ausführungsformen der Verbindungen der Formeln 1-4 schließen diejenigen, bei welchen beide n-Werte gleich 2 sind oder diejenigen, bei welchen beide Reste R¹ eine Ethyl- oder Methylgruppe, vorzugsweise eine Methylgruppe ist, und diejenigen, bei welchen R² eine Vinylgruppe ist, ein. Besonders bevorzugt werden Verbindungen der Formel
Sowohl A-EA6 als auch B-EA6 wurden hergestellt. Beide sind wirksame Lichtsensibilisierungsmittel, wobei es scheint, dass A-EA6 leichter zuzubereiten ist.
Die verschiedenen Formen der Verbindungen der Erfindung können bei den auf dem Fachgebiet allgemein bekannten, fotodynamischen Therapietechniken verwendet werden. Wie im Hintergrundteil dargelegt, kann die fotodynamische Therapie unter Verwendung einer Fülle von Protokollen und für eine Reihe von Indikationen verwendet werden. Zusätzlich zeigen Verbindungen dieses Typs in manchen Fällen pharmakologische Aktivität in Abwesenheit von Licht. Standardarzneimittel, einschließlich bevorzugte Liposomalmittel werden, wenn gewünscht, in solchen Anwendungen verwendet.
Die folgenden Beispiele beabsichtigen, die Erfindung zu veranschaulichen, jedoch nicht zu begrenzen. Während die Beispiele die überraschenden pharmakokinetischen Eigenschaften von zwei Vertretern der Art der Erfindung, A-EA6 und B-EA6, veranschaulichen und demonstrieren, wird erwartet, dass die übrigen durch die Formeln 1-4 beschriebenen Verbindungen ähnliche Eigenschaftsvielfältigkeiten zeigen. Damit bietet die kleine Klasse von in der vorliegenden Erfindung enthaltenen Verbindungen wertvolle Ergänzungen zu dem Repertoire an fotodynamischen Wirkstoffen, die bei der Behandlung von verschiedenen Zuständen, auf welche die Therapie gerichtet ist, nützlich sind.

Beispiel 1

Herstellung von zwei Formen von EA6

A. Zur Herstellung von B-EA6 ist das Ausgangsmaterial BPD-DB als Dimethylester, d. h. BPD, wie in Abb. 1 gezeigt, wobei sowohl R¹ als auch R² COOMe sind und R" eine Vinylgruppe ist.
Zu 2,0 g (2,7 mM) BPD-DB in 50 ml Ethylenglycol und 100 ml Dichlormethan wurde 1,0 ml Schwefelsäure zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 18 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch einem rührenden Gemisch aus 100 ml 5%igem, wässrigem Ammoniumacetat und 100 ml Dichlormethan zugesetzt. Die organische Schicht wurde abgetrennt und dann zwei mal mit 50 ml Wasser gewaschen. Das Lösungsmittel wurde im Rotationsverdampfer entfernt. Der dunkelgrüne Rückstand wurde dann über 75 g Aluminiumoxid (deaktiviert mit 5% Wasser) chromatografiert und mit einem Gradienten von 0,5%-5,0% Methanol in Dichlormethan eluiert. Das Lösungsmittel von diesen produkthaltigen Fraktionen wurde dann im Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wurde im Vakuum über Nacht getrocknet, um 2,02 g (89%) der analytisch reinen, grünen, festen Titelverbindung zu erhalten.
8. In einer zu der in Absatz A dargelegten ähnlichen Weise, jedoch durch Ersetzen von BPD-DB durch PBD-DA wurde die isomere Form A-EA6 hergestellt.

Beispiel 2

Vergleich von Aufnahme und Freisetzung von B-EA6 und BPD-MA durch L1210-Zellen

BPD-MA oder B-EA6 wurden mit 3 ug/ml in Gegenwart von 10%igem fötalem Rinderserum mit 10 ml L1210-Zellen, einer Mäuseleukämiezellreihe, inkubiert. Der intrazelluläre Gehalt des Lichtsensibilisierungsmittels wurde durch Fluoreszenz von Zelllysaten zu verschiedenen Zeiten gemessen. Die erreichte maximale Konzentration betrug 145,9 ng/10&sup6; Zellen für B-EA6 und 149,5 ng/10&sup6; Zellen für BPD-MA. Der Zeitverlauf der Aufnahme ist in Abb. 2 als Prozentualität des Zellgehalts bei 60 Min. erzeugt, bei welchem die zeitliche Aufnahme bei beiden Fällen ein Maximum erreichte. Wie gezeigt, wird B-LEA6 schneller aufgenommen und erreicht 80% seiner maximalen Konzentration nach nur 5 Min. und seine maximale Aufnahme innerhalb 15 Min.
Die Kinetik der Freisetzung dieser Arzneien von L1210-Zellen wurde durch 1- stündiges vorheriges Belasten der Zellen mit 3 ug/ml und dann Setzen der Zellen in Arzneifreies, 10%iges fötales Rinderserum enthaltendes Medium gemessen. Der restliche intrazelluläre Arzneigehalt wurde zu verschiedenen Zeitpunkten durch Lysieren der Zellen und Messen der Fluoreszenz gemessen. Wie in Fig. 3 gezeigt (wieder als intrazeullärer Ausgangsprozentgehalt) zeigten BPD-MA und B-EA6 verschiedene Kinetik der Freisetzung. Die anfängliche Freisetzung von B-EA6 war viel schneller, jedoch war die Freisetzung im Fall von BPD-MA vollständiger.
Es war unerwartet, dass die Pharmakokinetiken von B-EA6 in vitro schneller als diejenigen von BPD-MA waren. Da die höhere Retention von B-EA6 seiner erhöhten Größe verglichen mit BPD-MA zugeschrieben werden kann, war die schnellere Übertragung durch die Zellmembran unerwartet.

Beispiel 3

Vergleich von Pharmakokinetiken in vivo

Entweder BPD-MA oder B-EA6 wurde durch intravenöse Injektion an DBA/2-Mäuse mit einer Dosis von 4 mg/kg unter Verwendung von 3 Mäusen pro Zeitpunkt verabreicht. Der Arzneigehalt von Plasma, Haut, Leber und Niere wurde durch Fluoreszenz in den Gewebeextrakten bestimmt. Fig. 4 zeigt die als Prozentualität der Konzentration im relevanten Gewebe 15 Min. nach der Injektion aufgezeichneten Ergebnisse. Wie in Fig. 4 gezeigt, sammelte sich weder BPD-MA noch B-EA6 in Plasma, Leber oder Niere, jedoch sammelte sich BPD-MA innerhalb der ersten 3 Std. in der Haut, während B-EA6 dies nicht tat.
Die schnellere Ansammlung von B-EA6 verglichen mit BPD-MA, wie hier in vivo durch schnellere Beseitigung von allen Geweben festgestellt, bildet einen Vorteil. Die Behandlung mit Licht kann bald nach der Injektion des Lichtsensibilisierungsmittels durchgeführt werden, und wegen der schnellen Beseitigung zeigt sich keine verlängerte Haut- oder Augenlichtempfindlichkeit. Somit können die zu behandelnden Patienten ein normales Leben ohne spezielle Vorsichtsmaßnahmen, wie Vermeiden von grellem Licht und Tragen von dunklen Brillen wieder aufnehmen.
Die Halbwertszeit von B-EA6 und BPD-MA in verschiedenen Geweben wurde dann im Zeitrahmen von 15 Min.-3 Std. berechnet und die Ergebnisse in Tabelle 1 dargestellt:
* gezeigt in Stunden
** BPD-MA-Konzentration in der Haut stieg bis zu 3 Std. an
V NB = nicht bestimmt
Die Halbwertszeit von BPD-MA in diesem Zeitrahmen konnte nicht in der Haut berechnet werden, da seine Konzentration während der 3-stündigen Dauer anstieg. Wie in Tabelle 1 gezeigt, weist B-EA6 im allgemeinen in den meisten Geweben eine viel kürzere Halbwertszeit als BPD-MA auf. Das Fehlen von Ansammlung von B-EA6 in normaler Haut, verglichen mit BPD-MA war unerwartet und zeigt schnellere Beseitigung als diejenige von BPD-MA. Wie vorstehend dargelegt, ist dies vorteilhaft, da Hautlichtempfindlichkeit die einzige festgestellte Nebenwirkung der fotodynamischen Therapie unter Verwendung von Lichtsensibilisierungsmitteln ist.
Die Pharmakokinetiken wurden auch unter Verwendung eines Mäusetumormodells in vivo bestimmt. Gruppen von 10 DBA/2-Mäusen mit M1-Rhabdomyosarkomtumore wurde intravenös eine Liposomzubereitung von BPD-MA mit verschiedenen Dosierungen von 0,75- 1,5 mg/kg injiziert. Die Tumore wurden mit Laser-Licht mit 690 nm bei 50 oder 150 J/cm² zu verschiedenen Zeiten nach der Injektion bestrahlt. Die Ergebnisse wurden, wie in Tabelle 2 gezeigt, in Bezug auf die Prozentualität der Mäuse in jeder Gruppe, die am 7. Tag nach der Injektion tumorfrei waren, bestimmt
* Tumormodell = M1-Tumor bei DBA/2-Mäusen - jede PDT-Bedingung wurde bei 10 Tieren getestet
** Die Arzneien wurden liposomal zubereitet und intravenös injiziert
*** Laserlicht mit 690 nm
Wie in Tabelle 2 gezeigt, zeigten BPD-MA-behandelte Mäuse wesentliche Überlebensraten, als die Zeiten nach der Injektion im Bereich von 15-180 Min. lagen. Andererseits zeigten B-EA6-behandelte Mäuse keine Reaktion bei 30 Min. oder 180 Min., jedoch wurden bedeutende Reaktionen erhalten, als die Bestrahlung nach nur 15 Min. angewandt wurde.
Diese Daten zeigen, dass PDT unter Verwendung von B-EA6 bei früher Behandlung mit Licht wirksam ist. Das Fehlen einer Wirkung zu späteren Zeiten nach der Injektion zeigt wieder die aus den vorstehend dargelegten Gründen vorteilhafte, schnelle Beseitigung von B- EA6.

Beispiel 4

Bestimmung von LD&sub5;&sub0; mit und ohne Serum

Entweder B-EA6 oder BPD-MA wurde 1 Std. mit L1210-Zellen mit einem Konzentrationsbereich inkubiert und mit 9 J/cm² Breitspektrumslicht belichtet. Diese Bestimmung wurde in Abwesenheit von Serum und in Gegenwart von 10%igem Serum durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.
Wie gezeigt, weisen BPD-MA und B-EA6 vergleichbare LD&sub5;&sub0;-Werte in Abwesenheit von Serum auf, jedoch zeigt B-EA6 in Gegenwart von Serum eine wesentlich bessere Retentionswirksamkeit.
In den meisten Fällen reduziert die Gegenwart von Serum die Lichtempfindlichkeit von bei der PDT verwendeten Mitteln, wie BPD-MA, stark. Überraschend zeigt B-EA6 stärkere Affinität für Zellmembrane als für Plasmabestandteile und wird somit sehr leicht durch die Gegenwart von Serum in der Zellumgebung beeinflusst. Somit kann seine Wirksamkeit in vivo höher sein als diejenige von BPD-MA und anderen Verbindungen dieser Familie.

Beispiel 5

Wirksamkeit von B-EA6 in vitro

Die Fähigkeit von B-EA6 zum Ausüben einer zytotoxischen Wirkung auf L1210- Zellen in vitro wurde weiter durch 1-stündiges Inkubieren der Zellen mit B-EA6 mit verschiedenen Konzentrationen in Abwesenheit von Serum getestet. Nachdem überschüssige Arznei entfernt war, wurden die Zellen mit 9 J/cm² Breitspektrumslicht (380-750 nm) bestrahlt und die Zellüberlebensrate durch den MTT-Versuch (Mosmann, T. et al., J. Immunol. Meth (1983) 65: 55-63) bestimmt. Die Prozentualität von getöteten Zellen wurde mit Bezug auf die Überlebensrate von nur mit Licht belichteten Zellen berechnet. Bei einer Konzentration von etwa 7 ng/ml wurden 80% der Zellen getötet, bei 15 ng/ml überlebten fast 100% der Zellen nicht. Wie vorstehend angegeben, beträgt der LD&sub5;&sub0; für B-EA6 etwa 4,7 ng/ml.
Die etwas geringere Wirkung von B-EA6 verglichen mit BPD-MA in vitro lässt sogar die vergleichsmäßig höhere Aktivität von B-EA6 verglichen mit BPD-MA in vivo in Gegenwart von Serum wie in Beispiel 4 gezeigt nicht erwarten.

Beispiel 6

Selektivität von B-EA6 für Tumorzellen

Die Fähigkeit von L1210-Zellen zum Ansammeln von B-EA6 wurde mit der diesbezüglich gleichen Fähigkeit von Splenozyten verglichen. B-EA6 mit 3 ug/ml wurde mit dem jeweiligen Zelltyp inkubiert und der Zellgehalt von B-EA6 durch Fluoreszenz in Zelllysaten bestimmt. Fig. 5 zeigt einen Vergleich der Aufnahme für die zwei Zelltypen in ng/106 Zellen. Wie gezeigt, konnten L1210-Zellen etwa 140 ng/106 Zellen aufnehmen, wobei dieser Wert nach etwa 20 Min. erreicht wurde. Splenozyten sammelten andererseits weniger als 20 ng/10&sup6; Zellen nach einstündiger Inkubation an.
DBA/2-Mäuse mit subkutan in ihren Lenden wachsendem M1 (Rhabdomyosarkom)- Tumor wurden als Modell verwendet, um zu zeigen, dass B-EA6 selektiv auf Tumore wirkt. Mäusen wurden 0,75 mg/kg B-EA6 in einer Liposomzubereitung intravenös verabreicht. Nach 15 Min. wurde eine 1 cm große Fläche, die einen Tumor mit einem Durchmesser von 5 mm einschloss, mit 50 J/cm² Licht mit 70 mW und einer Wellenlänge von 690 nm von einem Argonpumpenfarblaser bestrahlt. Die Bestrahlung entfernte wirksam den Tumor, beeinflusste die umgebende normale Haut jedoch nicht. Somit zeigt B-EA6 Tumorspezifität.

Beispiel 7

Immunmodulation durch B-EA6

Balb/-C-Mäuse (5-8 Mäuse pro Gruppe) wurden unter Verwendung des Versuchs der verzögerten Hautlichtempindlichkeit, auch Kontakthyperempfindlichkeitsversuch (KHE) getestet. Die Mäuse wurden an den Lenden mit dem Sensibilisierungsmittel Dinitrofluorbenzol (DNFB) bestrichen, und 5 Tage später wurde ein Ohr mit DNFB erregt, während das andere als Kontrolle diente. Das Anschwellen ist ein Indikator von Immunreaktion. Mäusen wurden intravenös 1 mg/kg liposomales B-EA6 injiziert und entweder mit 15 J/cm² Licht über den ganzen Körper oder mit Umgebungslicht bestrahlt. Die Fähigkeit dieser Behandlung zur Verhütung der Immunreaktion, wie durch die Hemmung von Ohrschwellung gezeigt, wurde bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Verabreichung von B-EA6, kombiniert mit entweder Nachbestrahlung mit 15 J/cm² Licht des ganzen Körpers oder mit Umgebungslicht, die Schwellung am Testohr verglichen mit den unbehandelten Mäusen verminderte. Die Schwellung betrug in beiden Fällen nur etwa 60% von derjenigen die sich bei Mäusen ohne Behandlung zeigte.
In einem zusätzlichen Versuch zur Bestimmung von Immunmodulation wurden Mäuseperitonealmakrophagen isoliert, gereinigt und durch rekombinantes Interferon-γ (100 U/ml) aktiviert. Die aktivierten Zellen wurden 1 Std. bei 37ºC mit B-EA6 mit einem Konzentrationsbereich inkubiert und dann mit LED-Licht mit 690 nm bei 5 J/cm² bestrahlt. Expressionsgrade von MHC I, MHC II, CD54, CD80 und CD86 wurden 24 Std. später unter Verwendung von FITC-konjugierten Antikörpern und eines Zellensortierers bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 für B-EA6 mit 0,5 ng/ml verglichen mit ähnlichen Experimenten unter Verwendung von BPD-MA mit 2,5 ng/ml dargestellt.
Die Ergebnisse in der Tabelle werden als Prozentualität der Expression verglichen mit nur mit Licht behandelten Zellen angegeben. Wie gezeigt konnten sowohl BPD-MA als auch B-EA6 die Expression von MHC II, jedoch nicht die restlichen Oberflächenmarkierungsmittel unterdrücken. Somit behält B-EA6, obwohl es vorteilhafte Pharmakokinetiken aufweist, die Immunmodulationsaktivität von BPD-MA und anderen Verbindungen dieser Gruppe bei.

Beispiel 8

Wirkung von B-EA6 in einem Arthitis-Modell

MRL-Ipr-Mäuse entwickeln spontan Arthritis, wobei dies durch intradermale Injektion von Freund's Zusatz gesteigert wurde. Verschiedene Anzahlen von MRL-Ipr-Mäusen wurden mit PDT am Tag 0, 10 und 20 nach Injektion des Zusatzes behandelt. PDT bestand aus 0,5 mg/kg liposomalem B-EA6, das intravenös injiziert wurde, gefolgt von Bestrahlung des Vorderteils der Maus mit rotem (560-900 nm) Licht bei 80 J/cm² 1 Std. nach der B-EA6- Injektion. Die Mäuse wurden beobachtet und die Symptome 30 Tage lang jeden 5. Tag bewertet. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 verglichen mit den in ähnlicher Weise mit BPD-MA und BPD-MB behandelten Mäusen dargestellt. Wie in Fig. 6 gezeigt, war B-EA6 (dargestellt als gefüllte Kreise) entweder durch die Messung von dem Eintritt von klinischen Symptomen (d. h. Prozentualität von Mäusen, welche diese Symptome zeigen) oder durch die Veränderung in der bimalleolären Knöchelbreite in Millimeter bei der Verhütung der Folgen der Zusatzinjektion wirksam.
Wieder wird die Retention von Immunmodulationsaktivität von B-EA6 gezeigt.

Beispiel 9

Wirkung von B-EA6 auf das Mikrogefäßsystem

Das Maus-Kremastermodell wurde verwendet. B-EA6 wurde intravenös mit 2 mg/kg verabreicht und beginnend 5 und 15 Min. nach der Injektion wurden die operativ freigelegten Arteriole und Venole mit Licht mit einer Intensität von 25 J/cm² pro 5 Min. bestrahlt. Die Gefäße wurden als Säulendurchmesser der roten Blutkörperchen als Kontrollprozentualität gemessen.
Die Ergebnisse sind in Fig. 7 dargestellt. Während transienter Gefäßverschluss erhalten wurde, als mit der Bestrahlung 5 Min. nach der Injektion begonnen wurde, wurde dauerhafter Verschluss erhalten, als mit der Bestrahlung nach 15 Min. begonnen wurde.
Die verbesserte Kapazität von B-EA6 zum Verengen oder Verschließen von Gefäßen wie in diesem Beispiel gezeigt in Kombination mit schnelleren Pharmakokinetiken, macht B- EA6 bei der Behandlung von neovaskulären Augenerkrankungen besonders vorteilhaft.

Beispiel 10

Absorptionsspektrum von B-EA6

BPD-MA und B-EA6 weisen ähnliche Absorptionsspektren im Plasma vor und nach 4-stündiger Belichtung mit fluoreszentem (380-750 nm) Licht auf. Ein Vergleich dieser Spektren ist in Fig. 8 dargestellt. Die Ähnlichkeit des Spektrums von B-EA6 zu dem Spektrum von BPD-MA ist vorteilhaft, da die Verwendung von BPD-MA als bei der PDT nützliches therapeutisches Mittel gut entwickelt ist. Die Ähnlichkeit in deren Spektren zeigt, dass die gleichen Lichtquellen für B-EA6 verwendet werden können, die bei der Behandlung mit BPD-MA nützlich sind.

Beispiel 11

Zytotoxizität in vitro von A-EA6

In einer zu derjenigen in Beispiel 5 dargelegten ähnlichen Weise wurde die Zytotoxizität von A-EA6 in vitro bei zwei verschiedenen Zellreihen getestet und mit BPD- MA verglichen. Entweder L1210-Zellen oder die dendritischen Zellreihe D2SC/1 wurden 1 Stunde bei 37ºC mit entweder A-EA6 oder BPD-MA inkubiert. Nach Entfernen von überschüssiger Arznei wurden die Zellen mit Licht mit 690 nm bei 5 J/cm² für dendritische Zellen und 9 J/cm² für L1210-Zellen bestrahlt. Die Zellüberlebensrate wurde 18-24 Stunden später unter Verwendung des in Beispiel 5 beschriebenen kalorimetrischen MTT-Versuchs bestimmt. Die Prozentualität an getöteten Zellen wurde mit Bezug auf die nur mit Licht bestrahlten Zellen berechnet. Wie in Fig. 9A gezeigt, zeigte A-EA6 vergleichbare Toxizität mit BPD-MA in Bezug auf L1210-Zellen in Abwesenheit von Serum, jedoch war es deutlich toxischer in Gegenwart von Serum als BPD-MA. Die leeren Kreise stellen A-EA6 plus Serum, die gefüllten Kreise BPD-MA plus Serum, die leeren Quadrate A-EA6 in Abwesenheit von Serum und die gefüllten Quadrate BPD-MA in Abwesenheit von Serum dar.
Wie in Fig. 9B gezeigt, war A-EA6 in dendritischen Zellen, wobei BPD-MA einen LD&sub5;&sub0; von 6 ng/ml und A-EA6 einen LD&sub5;&sub0; von 2,7 ng/ml aufweist, bei niederen Konzentrationen toxischer als BPD-MA in Gegenwart von S%igem fötalem Kalbserum. In Fig. 9B stellen gefüllte Kreise BPD-MA und leere Quadrate A-EA6 dar.
In einer ähnlichen Bestimmung, jedoch durch Messen von MHC I-Rezeptoren statt von Zytotoxizität, war A-EA6 beim Vermindern der Expression dieser Rezeptoren bei niederen Konzentrationen wirksam. In dieser Bestimmung wurden dendritische Zellen 1 Stunde mit einer Arzneikonzentration niedriger als ihr LD&sub5;&sub0;, d. h. 2,5 ng/ml und 5 ng/ml für BPD-MA und 1 ng/ml und 2,5 ng/ml für A-EA6 inkubiert. Die Zellen wurden mit Licht mit 690 nm bei 5 J/cm² behandelt und dann mit entsprechendem Antikörper 3 Stunden nach der Behandlung markiert und durch Fließzytometrie untersucht. Die Ergebnisse wurden als Prozentualität der mittleren Kanalfluoreszenzintensität für lichtbehandelte Kontrollzellen gemessen. Diese Ergebnisse sind in Fig. 10 dargestellt, wobei BPD-MA eine 18%ige bzw. eine 29%ige Reduktion bei 2,5 ng/ml und 5 ng/ml bereitstellte und A-EA6 die Kanalfluoreszenz um etwa 25% sowohl bei 1 ng/ml als auch bei 2,5 ng/ml minderte.

Beispiel 12

Wirkung von A-EA6 auf intrazelluläre Signalgebung

Die Bedingungen der in Beispiel 11 dargelegten Untersuchung wurde unter Verwendung von HL-60-Zellen als Ziel und unter Vergleich der Wirkungen von A-EA6 und BPD-MA auf Zytotoxizität auf die Mitogenbahnkinase p70 S6K und auf die Stressbahnkinasen c-jun und HSp27 wiederholt. Die Ergebnisse sind in Fig. 11 dargestellt. Bei nicht tödlichen Konzentrationen zeigte A-EA6 stärkere Aktivierung der Stressbahnkinasen und stärkere Hemmung der Mitogenbahnkinasen.
Die Wirkung auf Caspase-Aktivierung in HL-60-Zellen wurde ebenso gemessen. A- EA6 zeigte eine stärkere Aktivierung von Caspasen als BPD-MA. Diese Wirkung ist erwünscht, da sie mit Apoptosis in Verbindung steht. Die Verwendung von Apoptosis zur Entfernung unerwünschter Zellen verursacht die geringste Wirkung auf umgebene Normalzellen und Gewebe. Der Vergleich von A-EA6 mit BPD-MA ist in Fig. 12 dargestellt.
Fig. 13 zeigt einen ähnlichen Vergleich beim Messen von prozentualer DNA- Fragmentierung in HI-60-Zellen. Wieder war A-EA6 bei niederen Konzentrationen wirksamer als BPD-MA.

Beispiel 13

Fotodynamische Therapie unter Verwendung von A-EA6 in vivo

In einem zu demjenigen in Beispiel 3 dargelegten ähnlichen Protokoll wurde entweder A-EA6 oder BPD-MA intravenös Mäusen mit M1-Tumoren mit einer Dosis von 1 mg/kg injiziert. Diesem folgte Ganzkörperbestrahlung mit 50 J/cm² Laserlicht mit 690 nm zu verschiedenen Zeiten nach Verabreichung der Arznei. Die Anzahl der tumorfreien Tiere am 7. Tag wurde bestimmt und die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass A-EA6 in diesem Versuch mindestens so wirksam ist wie BPD-MA.

Beispiel 14

Immunmodulationsaktivität

Die Lenden von Kontroll- und Testmäusen wurden mit dem Antigen DMFB bestrichen und ihre Ohren 5 Tage später durch Einpinseln mit derselben Verbindung erregt. Die Tiere wurden mit Ganzkörper-PDT unter Verwendung von BPD-MA oder A-EA6 durch intravenöses Injizieren des Lichtsensibilisierungsmittels und dann Bestrahlen der Tiere mit rotem LED-Licht bei 15 J/cm² behandelt. Die prozentuale Unterdrückung von Ohrschwellung wurde verglichen mit den Kontrollen berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt und zeigen, dass A-EA6 eine stärkere Immunmodulationswirkung in diesem Versuch als BPD-MA hatte.

Claims

1. Verbindung der Formel

und die metallierten und/oder markierten und/oder konjugierten Formen davon, wobei jeder Rest R¹ unabhängig ein (C&sub1;&submin;&sub6;)-Alkylrest ist;

jedes n unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist; und

der Rest R² eine Vinylgruppe oder ein Derivat davon, erhältlich durch Addition oder Oxidation der Vinylgruppe, ist.

2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei der Rest R² eine Vinylgruppe, ein Rest -CHOR', -CHO, -COOR', -CH(OR')CH&sub3;, -CH(OR')CH&sub2;OR', -CH(SR')CH&sub3;, -CH(NR')&sub2;CH&sub3;, -CH(CN)CH&sub3;, -CH(COOR')CH&sub3;, -CH(OOCR')CH&sub3;, -CH(NR'COR')CH&sub3;,

-CH(CONR'&sub2;)CH&sub3;, -CH(Halogen)CH&sub3; oder -CH(Halogen)CH&sub2;(Halogen) ist, wobei der Rest R' für H oder einen (C&sub1;&submin;&sub6;)-Kohlenwasserstoff-Rest, gegebenenfalls substituiert durch einen Heteroatom-Substituenten, steht, oder

wobei der Rest R² ein organischer Rest mit weniger als 12 Kohlenstoffatomen ist, der aus der direkten oder indirekten Derivatisierung eines Vinyl-Substituenten resultiert, oder

wobei der Rest R² ein Rest ist, der 1-3 Kerne vom Tetrapyrrol-Typ enthält.

3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, welche in einer metallierten Form und/oder in konjugierter Form vorliegt und/oder markiert ist.

4. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, welche kein Metallion enthält.

5. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Rest R² eine Vinylgruppe ist und/oder wobei jeder Rest R¹ eine Methylgruppe ist und/oder wobei beide n den Wert 2 haben.

6. Verbindung nach Anspruch 5, wobei der Rest R² eine Vinylgruppe ist und beide Reste R¹ eine Methylgruppe sind.

7. Verbindung nach Anspruch 6 der Formel

und die metallierten und/oder markierten und/oder konjugierten Formen davon.

8. Verbindung nach Anspruch 7, welche in einer metallierten Form und/oder in konjugierter Form vorliegt und/oder markiert ist.

9. Verbindung nach Anspruch 7, welche kein Metallion enthält.

10. Arzneimittel, umfassend die Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in Gemisch mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Exzipienten.

11. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 bei der Herstellung einer lichtempfindlichen Verbindung zur Verwendung bei der photodynamischen Therapie oder Diagnose.