Vynález se týká sloučenin, užitečných ve fotodynamické terapii (PDT) a souvisících aplikacích. Zvláště se týká ethylenglykolových esterů monohydrobronzoporfyrinů.

Dosavadní stav techniky

Fotodynamická terapie (PDT) zahrnuje všeobecně podávání sloučenin, které jsou způsobilé absorbovat světlo, typicky ve viditelné oblasti, ale také v blízké ultrafialové oblasti, jako následek ozáření míst subjektu, pro která se žádá toxický nebo inhibiční účinek. PDT byla zpočátku vyvinuta za použití hepatoporfyrinu a týkala se sloučenin při léčení tumorů, jak se to zjistilo, když tyto sloučeniny „zdomácněly“ na místech, která obsahovala rychle se dělící buňky. Tumor by mohl být tedy ozařován světlem, absorbovaným hematoporfyrinem a výsledkem byla užitečná pro léčení aterosklerotických skvrn, restenózy, infekcí krevního oběhu, revmatoidní artritidy, psoriázy a při léčení očních stavů, neomezujících se bezpodmínečně na tumory.

Patent US 5 171 749 a patenty, vydané na související přihlášky, patenty US 5 283 255, US 5 399 583, US 4 883 790, US 4 920 143 a US 5 095 030, na všechny se zde odkazuje, popisují a nárokují třídu fotoaktivních sloučenin, užitečný v PDT, jmenují monohydrobenzoporfyriny nebo „BPDs“. Tato třída sloučenin se získává Diels-Alderovou reakcí mono- nebo disubstituovaného alkinu s protoporfyrinem-IX a výsledné sloučeniny se mohou dále izomerizovat, redukovat a/nebo z nich vytvořit deriváty, aby se získala velká třída BPDs. V těchto patentech se objevuje zvlášť užitečná podtřída z této skupiny, rezultující z hydrolýzy nebo částečné hydrolýzy esterových skupin 2-karboxyethylových postranních řetězců na kruzích C a D. Esterifikace jako ochrana těchto skupin během Diels-Alderovy reakce rezultuje v počáteční produkty, které obsahují 2-karbalkoxyethylové skupiny. Bylo zjištěno, že je možno snadno provést hydrolýzu těchto esterů, přičemž všechny karbalkoxy skupiny, spojné s Diels-Alderovým produktem, získaným z dikarbalkoxy-alkinu, zůstanou prakticky zcela nehydrolyžované. Z toho vyplývají čtyři druhy sloučenin, BPD-Ma, BPD-MB, BPD-DA a BPD-DB, jak je zobrazeno na obr. 1; tento obrázek byl převzat z patentu US 5 171 749. V tomto vyobrazení jsou R¹ a R² karbalkoxy skupiny, typicky karbomethoxy- nebo karboethoxy- skupina a R je alkyl (1 až 6 C).

Bylo zjištěno, že BPD-MA má zvlášť užitečné vlastnosti pro PDT a je v současné době v klinickém zkoušení. Zůstává však požadavek na další specifické formy fotoaktivních činidel, které rozšíří repertoár fotoaktivních sloučenin pro různé indikace, na něž se PDT aplikuje, jak je shora poznamenáno. Tento vynález poskytuje sloučeniny, v nichž kruhy C a D obsahují estery ethylen- glukolu karboxy- alkylových substituentů. Tyto sloučeniny mají farmakokinetické vlastnosti, které jsou výhodné v určitých případech, kde se používá PDT.

Podstata vynálezu

Sloučeniny podle vynálezu jsou užitečné jako nově příspěvky k repertoáru fotoaktivních sloučenin, které nalézají použití ve fotodynamické terapii a týkají se metodologií, které využívají fotoaktivních činidel. Přítomnost esterů ethylenglykolu v těchto molekulách jim dává vlastnosti, které dovolují rozšířit rozsah podmínek, za kterých se takové fotoaktivní sloučeniny používají a jemně modifikují postup léčení.

-1 CZ 294715 B6

Předmětem vynálezu je sloučenina vzorce 1,2, 3,4

COOR¹

COOR¹

nebo ioOCi^CHjOH toOCHjCHzOH

(3)

popřípadě vázaná na kovový ion, zejména radioizotop, a/nebo s kovalentně napojeným chromoforem nebo fluorescenční značkou a/nebo v konjugované formě pro cílení na požadovanou tkáň 5 nebo orgán, kde každé R¹ je nezávisle alkyl (1 až 6 C);

každé n je nezávisle celé číslo 0 až 6 a

R² je vinyl, -CHOŘ', -CHO, -COOR', -CH(OR')CH₃, -CH(OR')CH₂OR', -CH(SR')CH₃, -CH(NR')₂CH₃, -CH(CN)CH₃, -CH(COOR')CH₃, -CH(OOCR')CH₃, -CH(NR'COR')CH₃, -CH(COOR'₂)CH₃, CH(halo)CH₃ nebo -CH(halo)CH₂(halo), kde R' je H nebo nasycený nebo nenasycený přímý, rozvětvený nebo cyklický uhlovodíkový radikál s až 6 uhlíkovými atomy, 15 popřípadě substituovaný heteroatomovým substituentem s 1 až 7 uhlíkovými atomy, obsahujícím jako heteroatom kyslík, dusík nebo síru, nebo

R² je skupina, obsahující 1 až 3 jádra tetrapyrrolového typu.

-2CZ 294715 B6

Výhodně R¹ představuje methyl, n je výhodně 2 a R² je výhodně vinyl. Výhodná sloučenina podle vynálezu má vzorec A-EAG, B-EAG,

nebo

Tato analoga jsou odvozena od protoporfyrinu III a popřípadě protoporfyrinu XIII způsobem podobným tomu, kterým jsou odvozeny sloučeniny vzorců 1 a 2 od protoporfyrinu IX. Vynález zahrnuje také izomery od různých forem vzorců 1 až 4, které rezultují z produktů kondenzace Diels-Alderovy reakce s nezměněným uspořádáním (tj. 1,4-dien), jak je popsáno v patentu US 4 883 790, na nějž se zde odkazuje.

Předmětem vynálezu je dále farmaceutická kompozice, která obsahuje sloučeninu podle některého z nároků 1 až 8 ve směsi alespoň s jedním farmaceuticky přijatelným excipientem.

Předmětem vynálezu je rovněž použití sloučeniny některého z uvedených vzorců jako fotoaktivního činidla pro výrobu léčiva pro provádění fotodynamické terapie nebo diagnózy.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 představuje sloučeniny známé ze stavu techniky, BPD-MA, BPD-MB, BPD-DA a PBD-DB.

Obr. 2 znázorňuje kinetiku absorpce B-EA6 buňkami L 1210.

Obr. 3 znázorňuje kinetiku uvolňování B-EA6 buňkami L 1210.

Obr. 4 ukazuje grafické zobrazení farmakokinetiky B-EA6 in vivo.

Obr. 5 ukazuje srovnání kinetiky absorpce B-EA6 normálními solenocyty a buňkami L 1210.

Obr. 6 ukazuje časový průběh PDT za použití B-EA6 v myši ve srovnání s myší, na kterou se působilo BPD-MA a BPD-MB.

Obr. 7 ukazuje účinek B-EA6 na mikrovaskulaturu myši.

Obr. 8 ukazuje srovnání spekter v plazmě BPD-MA a B-EA6.

Obr. 9A a 9B ukazuje cytotoxický účinek fotodynamického působení při použití A-EA6 ve srovnání s BPD-MA v buňkách L 1210 a v dendritických buňkách.

Obr. 10 ukazuje porovnání účinků PDT při použití A-EA6 a BPD-MA, vyjádřené zmenšujícím se povrchem MHC I receptorů.

Obr. 11 ukazuje účinek fotodynamické terapie při použití A-EA6 a BPD-MA na tlak a kinetiku cestu nepřímého dělení buněk HL 60.

Obr. 12 ukazuje porovnání účinků PDT při použití A-EA6 a BPD-MA na aktivaci kaspázy v buňkách HL 60.

Obr. 13 ukazuje porovnání účinků PDT při použití A-EA6 a BPD-MA na fragmentaci v buňkách HL 60.

Příklady provedení vynálezu

Sloučeniny podle vynálezu se týkají těch, jež jsou popsány ve shora citovaných patentech BPD, ale liší se v tom, že obsahují estery ethylenglykolu v substituentech na kruzích C a D. Tyto sloučeniny se mohou připravit jednoduchou hydrolýzou karbalkoxyalkylových nebo karbalkoxylových substituentů a reesterifíkací vzniklých karboxylových skupin v řetězcích C a D benzoporfyrinů, nebo se mohou získat přímou transesterifikací.

Budiž poznamenáno, že sloučeniny 1 a 2 jsou představitelé sloučenin, popsaných ve shora uvedených US patentech, získaných způsobem, který zahrnuje Diels-Alderovu reakci s protoporfyrinem IX. Sloučeniny 3 a 4 byly připraveny zcela analogickým způsobem při užití protoporfyrinu III nebo protoporfyrinu XIII jako substrátů pro Diels-Alderovu reakci. Protože protoporfyrin IX je vzhledem k A a B kruhům nesymetrický, vznikají dva možné produkty, závislé na tom, zda se Diels-Alderova adice objevuje v kruhu A nebo B. Z druhé stany jsou protoporfyriny III a XIII vzhledem k těmto kruhům symetrické a proto vzniká v každém případě pouze jeden produkt bez ohledu na polohu adice.

Ve sloučeninách podle vynálezu je R² výhodně vinyl, ale může to být také jeho derivát. Vinylová skupina v kruhu A nebo B se snadno derivatizuje na jiné formace R² adicí nebo oxidací. Adiční nebo oxidační produkty mohou být dále substituovány, jestliže adované substituenty jsou funkční jako odstupující skupiny, např. -Br může být substituován -OH, -OR, -NH₂, -NHR nebo -NR₂ atd., kde R je uhlovodíkový radikál. Například jedním z adovaných substituentů může být vodík a jiným může být halogen, hydroxyl, nižší alkoxylová skupina, amino- skupina nebo amid, sulfhydryl nebo organosulfíd nebo další vodík. Sloučeniny podle vynálezu zahrnují různé skupiny jako R² včetně substituentů, které poskytují další porfyrin nebo porfyrinu příbuzný kruh.

Tedy, R² může být vinyl, -CHOŘ', -CHO, COOR', -CH(OR')CH₃, -CH(OR')CH₂OR', -CH(SR')CH₃, -CH(NR')₂CH₃, -CH(CN)CH₃, -CH(COOR')CH₃, -CH(OOCR')CH₃, -CH(NR'COR')CH₃, -CH(CONR'₂)CH₃, -CH(hal)CH₃, nebo CH(hal)CH₂(hal), kde R' je H nebo uhlovodíkový radikál (1 až 6 C), případně substituovaný heteroatomovým substituentem, nebo kde R² je organická skupina o nižším počtu C než 12, vznikající přímou nebo nepřímou derivatizací vinylové skupiny, nebo kde R² je skupina, obsahující 1 až 3 jádra typu tetrapyrrolu.

Zde užívaným termínem „alkyl“ se míní nasycený rovný nebo rozvětvený uhlovodíkový řetězec, který může, má-li dostatečný počet atomů uhlíku, být cyklický nebo obsahovat cyklickou část. Typické příklady jsou methyl, ethyl, t-butyl, cyklohexyl a pod.

„Uhlovodíkový radikál“ znamená monovalentní substituent, obsahující jen uhlík a vodík, které mohou tvořit rovný nebo rozvětvený řetězec, nasycený nebo nenasycený, aromatický nebo nearomatický nebo obojí a cyklický nebo necyklický.

-4CZ 294715 B6

Tedy uhlovodíkový radikál o 1 až 10 C může zahrnovat cyklopentylethyl, 2-pentenyl, 3-butynyl, 2,4-dimethylhexyl a pod.

V některých provedeních vynálezu může být uhlovodíkový radikál substituován substituentem, obsahujícím heteroatom. Takové substituenty zahrnují -OR, -NR₂, -SR, -COOR, -CONR₂, -OOCR, NRCOR, -SOR, -SO₂R, halogen, -CN a pod. kde R je H nebo alkyl (1 až 6 C). Cyklické aminy zahrnují pyridyl, pyrimidyl, thiazoyl, chinolyl a také dále. Tedy mohou zahrnovat jednoduché kruhy, systémy kondenzovaných kruhů a mohou obsahovat přídavné heteroatomy.

Budiž poznamenáno, že sloučeniny podle vynálezu obsahují alespoň jedno chirální centrum a tedy mohou existovat v různých stereoizomerických formách. Pokud je to požadováno, takové stereoizomery včetně enantiomerů mohou být separovány za použití standardních dosavadních technik, avšak může být použito racemických směsí nebo směsí, obsahujících více než jeden diastereomer. Sloučeniny, vyjádřené vzorci, označenými 1 až 4, jsou proto reprezentanty individuálních optických izomerů, enantiomerů nebo diastereomerů, což mohou v tomto případě být podle okolností také směsi těchto individuálních chirálních izomerů.

Pokud je to požadováno, mohou se sloučeniny podle vynálezu připravit ve formách obsahujících kov zpracováním jádra tetrapyrolového typu s vhodným iontem, jako hořečnatým iontem, zinečnatým iontem, získaným iontem a pod., aby se získal kovový komplex. Kovový ion může také být radiačně značený. Všeobecně se kovový ion vřadí užitím vhodných solí za podmínek, standardních v dosavadní praxi. Například, zinečnatý ion se může zavést zpracováním sloučeniny octanem zinečnatým, obsaženým ve směsi methylenchloridu s methanolem v poměru 1:1.

Sloučeniny tedy mohou obsahovat značkovací látku, včetně radioizotopů, chromofory a fluorescenční značkovací látky. Značení radioizotopy je všeobecně užitečné, když sloučeniny mají být sledovány in vivo nebo má být ke značení použito specifických prostředků. Užitečnými kationtovými prostředky jsou radioizotopy, zahrnující technecium, gallium a indium. Kromě toho se ke značení molekuly může použít radioizotopů heteroatomů, jako ¹³¹I nebo ³²P v samotné molekule, nebo lze použít ¹⁴C.

Jak bylo popsáno ve výše uvedených BPD patentech, sloučeniny podle vynálezu mohou být spojeny, pokud je to žádoucí, s terčovým činidlem, který nasměruje molekulu do specifické tkáně nebo orgánu. Taková terčová činidla zahrnují protilátky, receptory, receptorové ligandy a podobně. Vazba terčového činidla ke sloučenině je prováděna za použití standardních technik. „Konjugovanou formou“ je míněna sloučenina vzorců 1 až 4, spojená do terčového činidla, jak je popsáno shora.

Výhodná provedení sloučenin vzorců 1 až 4 zahrnují ty, kde obě n jsou rovna 2, nebo ty, kde obě R' jsou ethyly nebo methyly, výhodně methyly, a ty, kde R² je vinyl. Zvláště výhodné jsou sloučeniny vzorce A-EAG, B-EAG

-5CZ 294715 B6

Obě sloučeniny A-EA6 a B-EA6 byly připraveny. Obě jsou efektivní fotosenzitiva, A-EA6 se jeví jako snáze připravitelné.

V technikách fotodynamické terapie, všeobecně známých v dosavadním stavu techniky, mohou být užity různé formy sloučenin podle vynálezu. Jak je vysvětleno v popisu dosavadního stavu techniky, může být fotodynamická terapie prováděna v mnoha případech a pro rozmanité indikace. Kromě toho, v některých případech, projevují sloučeniny tohoto typu farmakologické aktivity v nepřítomnosti světla.

Standardní farmaceutické kompozice, včetně výhodných liposomálních kompozic, jsou žádoucí pro užívání v takových aplikacích.

Dále uvedené příklady mají vynález ilustrovat, ale nikoli omezovat. Ačkoli příklady ilustrují a demonstrují překvapující vlastnosti dvou členů z látek podle vynálezu A-EA6 a B-EA6, je očekáváno, že zbývající sloučeniny, mající vzorec 1 až 4, budou mít podobné varianty těchto vlastností. Proto malá třída sloučenin, obsažená v tomto vynálezu, nabízí hodnotné přírůstky do repertoáru fotodynamických činidel, užitečných v léčení při různých podmínkách, při kterých byla tato terapie nařízena.

Příklad 1

Příprava dvou forem EA6

A. K přípravě B-EA6 je výchozím materiálem BPD-DB jako dimethylester - tj. BPD-DB, jak je vidět na obr. 1, kde R¹ a R² jsou v obou případech COOMe a R je vinyl.

Ke 2,0 g (2,7 mM) BPD-DB v 50 ml ethylenglykolu a 100 ml dichlormethanu byl přidán 1 ml kyseliny sírové. Reakční směs byla míchána po dobu 18 hod. při pokojové teplotě. Pak byla reakční směs přidána k míchané směsi 100 ml 5% vodného roztoku octanu amonného a 100 ml dichlormethanu. Organická vrstva byla izolována a pak dvakrát promyta 50 ml vody. Rozpouštědlo bylo odstraněno odpařením za rotace. Tmavě zelený zbytek byl pak chromatografován na 75 g oxidu hlinitého (dezaktivovaného 5 % vody) a eluován s gradientem 0,5% až 5,0% methanolu v dichlormethanu. Z frakcí, obsahujících produkt, bylo potom odstraněno rozpouštědlo odpařením za rotace. Zbytek byl sušen ve vakuu přes noc a získalo se 2,02 g (89 %) analyticky čisté zelené tuhé sloučeniny, uvedené v nadpisu.

B. Podobným způsobem, jak je uvedeno v odstavci A, ale nahrazením BPD-DA za BPD-DB, byla připravena izomerická forma, A-EA6.

-6CZ 294715 B6

Příklad 2

Srovnání absorpce a uvolňování B-EA6 a BDP-MA buňkami L 1210

BPD-MA nebo B-EA6 byly inkubovány v koncentraci 3 ^Lg/ml v přítomnosti 10% fetálního bovinního séra s 10⁷/ml buněk L 1210 myších leukemických buněk. Obsah fotosenzitivních látek v mezibuněčném prostoru byl měřen fluorescencí buněčných lyzátů v různých dobách. Dosažené maximum koncentrace bylo 145,9 ng/10⁶ buněk pro B-EA6 a 149,5 ng/10⁶ buněk pro BPD-MA. Časový průběh absorpce je vidět na obr. 2 jako procentní podíl obsahu buněk za 60 min, ve kteréžto době dosáhla absorpce v obou případech maxima. Jak je vidět, u B-EA6 probíhala absorpce rychleji a dosáhla 80 % své maximální koncentrace již po 5 min a dosáhla svého maxima absorpce v 15 min.

Kinetika uvolňování těchto léčiv z buněk L1210 byla měřena předběžným zatížením buněk při pg/ml po dobu 1 hod. a pak umístěním buněk do média bez léčiv, obsahujícího 10 % fetálního bovinního séra. Zbývající mezibuněčný obsah léčiv byl měřen v různých časových bodech lýzou buněk a měřením fluorescence. Jak je zřejmé z obr. 3, (zase jako procento z počátečního mezibuněčného obsahu), BPD-MA a B-EA6 projevují rozdílnou kinetiku uvolňování. Počáteční uvolňování B-EA6 bylo mnohem rychlejší, ale uvolňování bylo úplnější v případě BPD-MA.

Bylo neočekávané, že farmakokinetika B-EA6 byla in vitro rychlejší než farmakokinetika BPD-MA. Zatímco větší retence B-EA6 by mohla být připisována jejímu vzrůstajícímu rozměru ve srovnání s BPD-MA, byl rychlejší transfer membránou buňky neočekávaný.

Příklad 3

Srovnání farmakokinetik in vivo

Intravenózní injekcí byly podávány buď BPD-MA nebo B-EA6 do DBA/2 myší v dávce mg/kg při aplikaci 3 myším za časový bod. Obsah léčiva v plazmě, kůži, játrech a ledvině byl určen v extraktech tkáně fluorescencí. Obr. 4 ukazuje výsledky, zanesené do diagramu jako procentní podíl koncentrace v příslušné tkáni 15 min po injekci. Jak je vidět na obr. 4, ani BPD-MA ani B-EA6 se neakumuluje v plazmě, játrech nebo ledvinách, jakkoli BPD-MA se během prvních 3 hod. akumuluje v kůži, B-EA6 ne.

Rychlejší akumulace B-EA6 ve srovnání s BPD-MA, jak se zde potvrzuje in vivo, tvoří výhodu, spočívající v rychlejším odstranění ze všech tkání. Léčení světlem se může provádět brzy po injekci fotosenzitivní látky a díky rychlému odstranění se neočekává prodloužení fotosenzitivity kůže nebo oka. Tudíž léčené subjekty mohou pokračovat v normálním životě bez speciálních předběžných opatření, jako vyloučení ostře zářivého světla a nošení tmavých brýlí.

Poloviční doba života B-E6 a BPD-MA v různých tkáních byla pak vypočítávána v časovém úseku 15 min až 3 hod. a výsledky jsou uvedeny v tabulce 1:

-7CZ 294715 B6

Tabulka 1: Poloviční doby života B-EA6 a BPD-MA

Tkáň	T1// (15 min až 3 hod.)
B-EA6	BPD-MA
játra	0,6	2,4
slezina	0,8	10,9
ledvina	0,8	5,6
kůže	1,9	θ* **
sval	H,1	ND+
plazma	0,6	2,0

* uvedeno v hod., ** koncentrace BPD-MA v kůži vzrůstá postupně do 3 hod., ⁺ ND = nebylo stanoveno.

Poloviční doba života BPD-MA v kůži nemohla být v tomto časovém úseku vypočtena, protože koncentrace BPD-MA během tříhodinové doby vzrůstala. Jak ukazuje tabulka 1, všeobecně má B-EA6 ve většině tkání mnohem kratší poloviční dobu života než BPD-MA. Nedostatek akumulace nebyl ve srovnání s BPD-MA u B-EA6 v normální kůži očekáván a dochází k jeho rychlejšímu odstraňování, než je tomu u BPD-MA. Jak bylo shora uvedeno, je to výhodné, když fotosenzitivita kůže je jediný vedlejší účinek fotodynamické terapie, využívající fotosenzitivních látek.

Farmakokinetika byla také stanovena in vivo, při užití modelu tumoru myši. Skupinám 10 DBA/2 myší, obsahujícím Ml rhabdomyosarkomové tumory, byly intravenózně injektovány BPD-MA s liposomálním složením při různém dávkování 0,75 až 1,5 mg/kg. Tumory byly ozařovány laserovým světlem vlnové délky 690 nm při 50 nebo 150 J/cm² při různých dobách po injekci. Výsledky jsou uvedeny na obr. 2, byly stanoveny jako procentní podíly myší v každé skupině, které byly 7 dní po injekci bez tumorů.

Tabulka 2: Biologická zkouška

Podmínky PTD	Procenta bez tumorů za 7 dní
Dávka léčiva** (mg/kg)	Doba po IV (min)	Dávka světla*** (J/cm2)	BPD-MA	B-EA6
0,75	15	50	(4/5)	50%
	30	50	70%	0%
1,0	15	50	100%	90%
	30	50	90%	0%
1,5	180	150	70%	0%

* tumorový model = MI tumor v DBA/2 myši - každá PDT podmínka byla testována na 10 zvířatech, ** léčiva měla liposomální složení a byla injektována intravenózně, *** 690 nm laserové světlo.

Jak je ukázáno v tabulce 2, pomocí BPD-MA léčená myš projevovala značný přírůstek, když se doba po injekci pohybovala od 15 do 180 min. Na druhé straně pomocí B-EA6 léčená myš neprojevovala odezvu po 30 min nebo 180 min, jakkoli byly získány signifikantní odezvy, když byla dodávána energie ozařováním teprve po 15 min.

- 8 CZ 294715 B6

Tato data demonstrují, že PDT při užití B-EA6 bude účinné při včasném léčení světlem. Nedostatek účinku po delší době po injekci zase ukazuje rychlé odstraňování B-EA6, které je výhodné ze shora uvedených důvodů.

Příklad 4

Stanovení LD₅₀ se sérem a bez něho

Buď BPD-MA nebo B-EA6 bylo inkubováno po dobu 1 hod. s buňkami L1210 v rozsahu koncentrace a exponováno 9 J/cm² širokým spektrem světla. Toto stanovení bylo provedeno v nepřítomnosti séra a v přítomnosti 10 % séra. Výsledky ukazuje tabulka 3.

Tabulka 3: Hodnoty LD₅₀

	Bez séra	10 % séra
BPD-MA	3,7 ng/ml	54,0 ng/ml
B-EA6	4,7 ng/ml	19,7 ng/ml

Jak je vidět, mají BPD-MA a B-EA6 bez přítomnosti séra srovnatelné hodnoty LD₅₀, v přítomnosti séra vykazuje však B-EA6 podstatně lepší výdrž účinnosti.

Přítomnost séra ve většině případů velmi snižuje fotoaktivitu činidel, používaných v PDT, jako třeba BPD-MA. Překvapivě jeví B-EA6 více afinity k buněčným membránám než ke složkám plazmy a je tedy velmi nepatrně ovlivněn přítomností séra v okolí buněk. Tedy jeho aktivitu in vivo by měla být větší než aktivita BPD-MA a ostatních sloučenin této skupiny.

Příklad 5

Účinnost B-EA6 in vitro

Způsobilost B-EA6 využít cytotoxický účinek na buňkách L1210 in vitro byla dále testována inkubací buněk s B-EA6 v různých koncentracích po dobu 1 hod. v nepřítomnosti séra. Po odstranění přebytku léčiva byly buňky exponovány 9 J/cm² světlem (380 až 750 nm) a přeživší buňky byly stanoveny zkouškou MTT (Mosmann, T. et al. JImmunol Meth (1983) 65: 55 až 63). Procentní podíl usmrcených buněk byl vypočítán ve vztahu k přeživším buňkám, exponovaným jen světlem. Při koncentraci přibližně 7 ng/ml bylo usmrceno 80 % buněk, při 15 ng/ml nedokázalo přežít skoro 100 % buněk. Jak stanoveno shora, je LD₅₀ pro B-EA6 přibližně 4,7 ng/ml. Poněkud nižší účinek B-EA6 ve srovnání s BPD-MA in vitro vyváří rovněž neočekávanější srovnatelně vyšší aktivitu B-EA6 ve srovnání s BPD-MA in vivo v přítomnosti séra, jak ukázáno v příkladu 4.

Příklad 6

Selektivita B-EA6 pro buňky tumoru

Způsobilost buněk L1210 akumulovat B-EA6 byla srovnávána se způsobilostí solenocytů v obdobném případě. B-EA6 při 3pg bylo inkubováno s každým typem buňky a obsah B-EA6 v buňkách byl stanoven v lyzátech z buněk fluorescencí. Obr. 5 ukazuje srovnání absorpce pro dva typy buněk v ng/10⁶ buněk. Jak ukázáno, buňky L1210 byly způsobilé dosáhnout hodnoty

-9CZ 294715 B6 absorpce přibližně 140 ng/10⁶ buněk po 20 min. Solenocyty, na druhé straně, akumulují méně než 20 ng/10⁶ buněk po jedné hodině inkubace.

DBA/2 myš, mající tumor Ml (rhabdomyosarkom), rostoucí podkožně v jejím boku, byl použit jako model na ukázku toho, že B-EA6 vykazuje selektivitu pro tumory. Myši bylo podáváno 0,75 mg/kg B-EA6 v liposomálním složení intravenózně. Po 15 min, 1 cm² plochy, která zahrnuje tumor o průměru 5 mm, byl exponován 50 J/cm² světlem o 70 mW vlnové délky 690 nm žargonového barevného laseru. Expozice eliminuje efektivně tumor, ale nezasáhne okolní normální kůži. Tedy, B-EA6 vykazuje specifičnost pro tumor.

Příklad 7

Modulace imunity pomocí B-EA6

Balb/C myši (5 až 8 myší na skupinu) byly testovány za použití zkoušky zpožděné citlivosti kůže, nazývané také zkouška kontaktní hypersenzitivity (CHS). Myš byla natřena na boku senzibilačním činidlem dinitrofluorbenzenem (DNFB) a o 5 dní později bylo jedno ucho podrobeno imunologickému testu pomocí DNFB, zatímco druhé slouží jako kontrola. Indikátor imunitní odezvy je otok. Myším byly intravenózně injektovány liposomální B-EA6 v množství 1 mg/kg a buď ozařovány 15 J/cm² světlem na celém těle, nebo exponovány okolním světlem. Byla demonstrována způsobilost tohoto působení zachránit imunitní odezvě, jak ukázáno na inhibici otoku ucha. Výsledky ukazují, že podávání B-EA6, kombinované s ozařováním buď 15 J/cm² světla na celém těle, nebo okolním světlem, snižují otékání při ušním testu ve srovnání s neléčenou myší. Otékání bylo v obou případech přibližně jen 60 % onoho, které bylo pozorováno na myši bez léčení.

V další zkoušce na stanovení imunomodulace byly myši peritoneální makrofágy izolovány, čištěny a aktivovány rekombinovaným y-interferonem (100 U/ml). Aktivované buňky byly inkubovány po dobu 1 hod. při 37 °C s B-EA6 v rozmezí koncentrací a pak exponovány LED světlem o vlnové délce 690 nm při 5 J/cm². Úroveň exprese MHC I, MHC II, CD54, CD80 a CD86 byla stanovena o 24 hod. později za použití FITC konjugovaných protilátek a třídiče buněk. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4 pro B-EA6 při 0,5 ng/ml ve srovnání s podobnými experimenty s užitím BPD-MA při 2,5 ng/ml.

Tabulka 4

Účinek nízké dávky PDT s B-EA6 na úroveň exprese antigenů povrchu buňky u myšího peritoneálního makrofágu

Sloučenina	MHC Třída I	MHC Třída II	CD54 (ICAM-1)	CD80 (B7-1)	CD86 (B7-2)
BPD-MA	99,1	79,3	105,4	93,5 %	99,2 %
(2,5 ng/ml)	± 4,3 %	+ 10,1 %	± 3,0 %
BPD-B-EA6	100,4 %	71,8%	106,9 %	102,3 %	92,2 %
(0,5 ng/ml)

Výsledky v tabulce jsou vyjádřeny jako procenta exprese ve srovnání s buňkami, na něž se působilo pouze světlem. Jak je vidět, BPD-MA a B-EA6 byly obě způsobilé snížit expresi MHC II, ale ne zbývající povrchové znaky. Tedy i když má B-EA6 výhodnou farmakokinetiku, zachovat si imunomodulační aktivitu BPD-MA a ostatních sloučenin této skupiny.

-10CZ 294715 B6

Příklad 8

Účinek B-EA6 na modelovou artritidu

Samovolně rozvinutá artritida myši MRL-Ipr byly zesílena intradermální injekcí Freudova adjuvans. Na různé počty myší MRL-Ipr bylo působeno PDT ve dnech 0, 10 a 20 po injekci adjuvans. PDT, o složení 0,5 mg/kg liposomálního B-EA6 bylo injektováno intravenózně s následnou expozicí ventrální části myši červeným (560 až 900 nm) světlem při 80 J/cm² 1 hod. po injekci B-EA6. Myš byla pozorována a symptomy byly připočítávány každých 5 dní po dobu 30 dní. Výsledky jsou uvedeny na obr. 6 ve srovnání s myší podobně léčenou BPD-MA a PBD-MB. Jak ukazuje obr. 6, bylo-li měřeno při výskytu klinických symptomů (tj. procentový podíl myší, vykazující tyto symptomy) nebo při změn v šířce bimaleolámího kotníku v mililitrech, B-EA6 (znázorněno jako plné kružnice) bylo účinné v zabránění následků adjuvanční injekce.

Opět byla prokázána retence imunomodulační aktivity B-EA6.

Příklad 9

Účinek B-EA6 na mikrovaskulaturu

Bylo užito modelu myšího svalu kremasteru. Bylo podáváno B-EA6 intravenózně v dávce 2 mg/kg a započato 5 a 15 min po injekci s ozařováním chirurgicky exponovaný cév a žil světlem při intenzitě 25 J/cm² po dobu 5 min, a to 5 a 15 min po injekci B-EA6. Cévám byl měřen průměr krevního sloupce jako procentní podíl kontrol.

Výsledky jsou uvedeny na obr. 7. Zatím co přechodné uzavření cévy se mohlo získat, když ozařování bylo započato za 5 min, permanentní uzavření bylo získáno, když bylo ozařování započato po 15 min.

Zvýšená kapacita B-EA6 k zúžení nebo k okluzi (uzavření) vaskulatury, jak bylo demonstrováno v tomto příkladu, v kombinaci s rychlejší farmakokinetikou činí B-EA6 zvláště výhodným v léčení neovaskulárních chorob oka.

Příklad 10

Absorpční spektrum B-EA6

BPD-MA a B-EA6 mají podobná absorpční spektra v plazmě před a po 4 hodinové expozici fluorescenčního (380 až 750 nm) světla. Porovnání těchto spekter ukazuje obr. 8. Podobnost spektra B-EA6 spektru BPD-MA je výhodné, protože užití BPD-MA jako terapeutického činidla, užitečného v PDT, je dobře prozkoumáno. Podobnost jejich spekter ukazuje, že mohou být používány tytéž světelné zdroje pro B-EA6, jako jsou úspěšně používány v léčení s BPDMA.

Příklad 11

Cytotoxicita A-EA6 in vitro

Způsobem, podobným jak je uveden v příkladu 5, byla testována cytotoxicita A-EA6 in vitro na dvou různých liniích buněk a porovnávána s BPD-MA. Buď buňky L1210 nebo linie dendritických buněk D2SC/1 byly inkubovány po dobu jedné hodiny při 37 °C buď s látkou A-EA6 nebo

- 11 CZ 294715 B6 sBPD-MA. Po odstranění přebytku léčiva byly buňky exponovány světlem o vlnové délce 690 nm při 5 J/cm² pro dendritické buňky a při 9 J/cm² pro buňky L1210. Přežívání buněk bylo stanoveno o 18 až 24 hod. později s použitím kolorimetrické zkoušky MTT, popsané v příkladu

5. Procento usmrcených buněk bylo počítáno ve vztahu k buňkám, exponovaným pouze světlem. Jak ukazuje obr. 9A, projevuje A-EA6 srovnatelnou cytotoxicitu sBPD-MA ve vztahu k buňkám L1210 v nepřítomnosti séra, ale v přítomnosti séra bylo výrazně toxičtější než BPDMA. Prázdné kroužky přestavují A-EA6 plus sérum, plné kroužky představují BPD-MA plus sérum; prázdné čtverce představují A-EA6 v nepřítomnosti séra a plné čtverce představují BPDMA v nepřítomnosti séra.

Jak je vidět na obr. 9B, v dendritických buňkách, kde BPD-MA mělo LD₅₀ 6 ng/ml a A-EA6 mělo LD₅o 2,7 ng/ml, bylo A-EA6 toxické při nižších koncentracích než BPD-MA v přítomnosti 5 % fetálního telecího séra. Na obr. 9B představují plné kroužky BPD-MA a prázdné čtverce představují A-EA6.

V podobném stanovení, ale s měřením MHC I receptorů bylo A-EA6 účinné spíše ve snížení exprese těchto receptorů při nižších koncentracích, než ve snížení cytotoxicity. V tomto stanovení byly dendritické buňky inkubovány po do 1 hod. při koncentraci léčiva nižší než její LD₅₀; 2,5 ng/ml a 5 ng/ml u BPD-MA a 1 ng/ml a 2,5 ng/ml u A-AE6. Na buňky bylo působeno světlem o vlnové délce 690 nm při 5 J/cm² a potom označeny vhodnou protilátkou 3 hodiny po působení a pak stanoveny průtočnou cytometrií. Výsledky byly měřeny jako procenta z intenzity fluorescence prostředního kanálu světlem ošetřených kontrolních buněk. Tyto výsledky ukazuje obr. 10; BPD-MA vykazovalo 18% a 20% redukci, při 2,5 ng/ml a 5 ng/ml; A-EA6 snížilo kanálovou fluorescenci o přibližně 25 % o obou koncentrací 1 ng/ml a 12,54 ng/ml.

Příklad 12

Účinek A-EA6 na vnitrobuněčnou signalizaci

Podmínky studie, uvedené vpředu v příkladu 11, byly opakovány s použitím buněk HL-60 jako terče a porovnávány účinky A-EA6 a BPD-MA na cytotoxicitu, na mitogenické dráhy kinázy p70 S6K, a na stresové dráhy kinázy c-jun a HSP27. Výsledky ukazuje obr. 11. Při subletálních koncentracích jevilo A-EA6 silnější aktivaci stresové dráhy kinázy a silnější inhibici mitogenické dráhy kinázy.

Účinek na aktivaci kaspáz v buňkách HL-60 byl také měřen. A-EA6 ukázal silnější aktivaci kaspáz než BPD-MA. Tento účinek je žádoucí, je-li spojen s apoptózí. Užití apoptózy k odstranění nežádoucích buněk působí nejmenším účinkem na okolní normální buňky a tkáně. Porovnání A-EA6 s BPD-MA ukazuje obr. 12.

Obr. 13 ukazuje podobné porovnání, když byla procentní fragmentace DNA měřena v buňkách HL-60. Opět bylo A-EA6 při nižších koncentracích účinnější než BPD-MA.

Příklad 13

Fotodynamická terapie s užitím A-EA6 in vivo

V protokolu, podobném vpředu uvedenému v příkladu 3, bylo intravenózně injektováno buď A-EA6 nebo BPD-MA myši, mající Ml tumor, v dávce 1 mg/kg. Potom následovalo ozáření celého těla 50 J/cm² laserovým světlem vlnové délce 690 nm po různých dobách po podání drogy. Po 7 dnech byl zjištěn počet zvířat bez tumoru a výsledky ukazuje obr. 5.

- 12CZ 294715 B6

Tabulka 5

Fotosenzibilátor	Ozařovací doba (po i.v.)	Zvířat bez tumoru po 7 dnech
BPDA-MA	15 min	10/10
	30 min	9/10
A-EA6	15 min	2/2
	30 min	6/6

Tyto výsledky ukazují, že A-EA6 je v této zkoušce alespoň tak účinné jako BPD-MA.

Příklad 14

Aktivita modulace imunity

Boky kontrolní a testovací myši byly natřeny antigenem DMFB a jejich uši byly o 5 dní později podrobeny imunologickému testu potřením toutéž sloučeninou. Testem na zvířatech bylo působení PDT na celé tělo při použití látky BPD-MA nebo A-EA6 intravenózní injekcí fotosenzibilátoru a poté expozicí zvířat červeným LED světlem při 15 J/cm². Procentní potlačení otoků uší bylo počítáno ve srovnání s kontrolami. Výsledky jsou vidět v tabulce 6 a ukazují, že A-EA6 bylo v této zkoušce silnější imunomolární účinek než BPD-MA.

Tabulka 6

Fotosenzibilátor	Dávka (mg/kg)	Procento potlačení
BPD-MA	1,0	49%
A-EA6	1,0	68%
A-EA6	0,3	59%

- 13 CZ 294715 B6