CZ301427B6

CZ301427B6 - Zpusob zavedení molekuly do cytosolu bunky

Info

Publication number: CZ301427B6
Application number: CZ20031791A
Authority: CZ
Inventors: Berg@Kristian; Prasmickaite@Lina; Hogset@Anders; Kristian Selbo@Pal
Original assignee: Pci Biotech As
Priority date: 2000-11-29
Filing date: 2001-11-29
Publication date: 2010-02-24
Also published as: WO2002044396A1; US20050075268A1; CA2430087C; JP2004520021A; US7223600B2; PT1346059E; ES2383516T3; HUP0402260A2; HU229805B1; PL365006A1; HK1056573A1; KR20030074632A; AU2002220853B2; BR0115795A; KR20080080685A; EP1346059A1; KR100980153B1; CZ20031791A3; AU2085302A; US8008077B2

Abstract

Zpusob zavedení molekuly do cytosolu bunky in vitro nebo ex vivo tak, že tento zpusob zahrnuje kroky, v nichž se zmínená bunka uvede do styku s fotosenzitizujícím cinidlem, bunka se uvede do styku s molekulou jež má být zavedena, tedy s prenášenou molekulou a bunka se ozárí svetlem o vlnové délce úcinné pro aktivaci fotosenzitizujícího cinidla, uvedené ozárení se provádí pred bunecným pohlcením zmínené molekuly do kteréhokoliv intracelulárního oddílu, pricemž prenášená molekula není snadno uvolnena z oddílu, vymezeného intracelulární membránou, do cytosolu, a/nebo se jedna složka nebo obe složky, sestávající z fotosenzitizacního cinidla a prenášené molekuly, spojí s nebo pripojí na jednu nebo více z nosicových molekul, zacílujících molekul nebo vektoru.

Description

Způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká zlepšeného způsobu zavádění molekul do cytosolu buněk, při němž se používá fotosenzitizační činidlo a ozáření buněk světlem o takové vlnové délce, která je účinná pro aktivaci fotosenzitizační ho činidla.

Dosavadní stav techniky

Většina buněk neproniká buněčnou membránou snadno. Způsoby zavedení molekul do cytosolu živých buněk jsou vhodnými nástroji pro manipulační a studijní biologické postupy. Mezi nej15 běžněji používané současné způsoby patří mikroínjekce, permeabilizovanými červenými krvinkami zprostředkovaná fúze (red blood cell ghost-mediated fusion) a fúze liposomů, osmotická lyže pinosomů, vnášení poškrábáním (scrape loading), elektroporace, fosforečnanem vápenatým a virem zprostředkovaná transfekce. Tyto techniky jsou vhodné pro zkoumání buněk v kultuře, i když v mnoha případech mohou být nepraktické, časově náročné, neúčinné nebo mohou induko20 vat významné usmrcení buněk. Takové techniky tedy nejsou optimální pro použití v biologickém nebo lékařském výzkumu, nebo při léčbách, vyžadujících, aby buňky zůstaly živé a/nebo funkční.

Je dobře známo, že porfyriny a mnoho dalších fotosenzitizuj ících sloučenin může indukovat cytotoxické účinky na buňky a tkáně. Tyto účinky se zakládají na skutečnosti, že během vystave25 ní světlu se může fotosenzitizuj ící sloučenina stát toxickou nebo může uvolnit toxické látky, jako je singletní kyslík nebo jiné oxidační radikály, které poškozují buněčný materiál či biomolekuly, včetně buněčných membrán a buněčných struktur a takové buněčné nebo membránové poškození může nakonec buňky usmrtit.

Tyto účinky již byly používány pri léčbě různých abnormalit nebo poruch, včetně zejména nádorových onemocnění. Tato léčba se nazývá fotodynamická léčba (PDT, photodynamic terapy) a zahrnuje podání fotosenzitizuj ících (fotochemoterapeutických) činidel do zasažené oblasti těla, následné vystavení aktivačnímu světlu k aktivaci fotosenzitizuj ících Činidel ajejich přeměně na cytotoxické formy tak, aby zasažené buňky byly usmrceny, nebo byla oslabena jejich prolife35 rativní schopnost. Jsou známa taková fotosenzitizuj ící činidla, která budou přednostně nebo výběrově lokalizovat požadované cílové místo, například nádor nebo jinou lezi,

Známa je Široká škála fotosenzitizuj ících činidel, kam patří zejména psoraleny, porfyriny, chloriny a ftalocyaniny. Taková léčiva se po vystavení světlu stávají toxickými.

Tato senzitizující léčiva mohou uplatňovat své účinky mnoha různými mechanismy, přímo nebo nepřímo. Některé fotosenzitizery se tedy například stávají toxickými po aktivaci světlem, zatímco jiné vyvolávají tvorbu toxických látek, například oxidačních činidel jako je singletní kyslík a jiné volné radikály odvozené od kyslíku, které jsou extrémně destruktivní vůči buněčnému materiálu a vůči biomolekulám, jako jsou lipidy, proteiny a nukleové kyseliny.

Porfyrinové fotosenzitizery působí nepřímo, prostřednictvím tvorby toxických kyslíkových látek a jsou považovány za zvláště výhodné kandidáty k PDT. Porfyriny jsou přírodně se vyskytujícími prekurzory pri syntéze hernu. Konkrétně je hem produkován tak, že se železo (Fe³*) začlení do ?o protoporfyrinu (Pp IX) účinkem enzymu ferrochelatázy. Protoporfyrin IX je extrémně účinným fotosenzitizerem, zatímco hem nemá žádný fotosenzitizační účinek. V oboru je známo velké množství senzitizerú na bázi porfyrinu nebo odvozených od porfyrinu, které jsou rovněž popsány v literatuře.

Cytotoxický účinek většiny senzitizerů užitých v PDT je zprostředkován zejména vytvářením singletního kyslíku, 'O?, který vzniká během vystavení fotosenzitizerů světlu. Tento reaktivní meziprodukt má v buňkách velmi krátký poločas rozpadu (< 0,04 μβ). Primární cytotoxický účinek PDT je tedy vytvářen během vystavení světlu a v místech velmi blízkých oblastem vytvá5 ření ^lO₂. 'θ₂ reaguje s proteiny (aminokyseliny histidin, tryptofan, methíonin, cystein, tyrosin) DNA (guanin), nenasycenými mastnými kyselinami a cholesterolem, přičemž je oxiduje. Jednou z výhod PDT je to, že tkáně nevystavené světlu zůstanou neovlivněné, což znamená, že lze získat selektivní účinek PDT. Pokud se týká použití PDT ke zničení nežádoucích buněčných populací, například nádorových buněk, existuje k tomu rozsáhlá dokumentace. Patentová literatura popisui() je množství fotodynamických sloučenin, ať už samotných nebo spojených s činidly umožňujícími jejich zacílení, například s imunoglobuliny namířenými vůči receptorovým determinantám nádorových buněk, které činí komplex buněčně specifičtějším. Určité fotochemické sloučeniny, jako jsou hematoporfyrinové deriváty, mají nadto vrozenou schopnost koncentrovat se v maligních buňkách. Takové způsoby a sloučeniny jsou popsány v norském patentu 173 319 a v norských patentových přihláškách 900 731, 176 645, 176 947, 180 742, 176 786, 301 981, 300 499 a 891 491.

Ve WO 93/14142 je popsán systém k uvolňování léčiv, který obsahuje protirakovinné činidlo a fotoaktivační činidlo (tj, fotosenzitizér) připojené na kopolymemí nosiče. Během podávání vstupuje tento komplex do nitra buňky pinocytózou nebo fagocytózou a objevuje se uvnitř endozomů a lysozomů. V lysozomech se vazba mezi proti nádorovým činidlem a polymerem hydrolyzuje, první jmenované pak může pasivně difundovat lysozomální membránou do cytosolu. Použitelnost tohoto způsobuje tedy omezena na malé molekulární sloučeniny, které jsou schopné difundovat přes lysozomální membrány. Po určité časové prodlevě pro difúzi se použije zdroj světla o příhodné vlnové délce a energii k aktivaci fotoaktivovatelné sloučeniny. Spojený účinek protinádorového činidla a fotoaktivovatelného činidla ničí buňku. Takové metody PDT, jaké byly popsány výše, jsou tedy zacíleny k destrukci buněčných struktur, vedoucí až k odumření buňky.

WO 96/074 32 a WO 00/54 802 se na druhé straně týkají způsobů, které používají fotodynamický účinek jako mechanismus k zavedení membránou jinak neprostupných molekul do cytosolu buňky takovým způsobem, který nemá nezbytně za důsledek široké buněčné poškození nebo odumření buňky. Při tomto způsobu se molekula, která má být intemalizována a fotosenzitizující sloučenina aplikují souběžně nebo následně do buněk tak, že jsou jak molekula, tak fotosenzitizující sloučenina endocytovány nebo přeneseny jinými způsoby do endosomů, lysozomů nebo do jiných, intracelulární membránou vymezených oddílů.

Molekula, která má být přenesena do intracelulárních oddílů buňky a fotosenzitizující sloučenina jsou do buňky aplikovány společně nebo následně ajsou buňkou zachyceny, pohlceny společně, do stejných intracelulárních (nitrobuněčných) oddílů (tj. jsou společně translokovány). Molekula, ío která má být intemalizována do buňky, je potom uvolněna vystavením buňky světlu o vhodných vlnových délkách k aktivaci fotosenzitizující sloučeniny, což obratem vede k protržení membrán intracelulární ho oddílu a následnému uvolnění molekuly, která se nachází ve stejném oddílu jako fotosenzitizující činidlo, do cytosolu. Tato metoda byla nazvána „fotochemická intemalizace“,

PCI. V těchto metodách je tedy výsledkem konečného kroku vystavení buněk světlu uvolnění pří45 slušné molekuly ze stejného intracelulámího oddílu jako fotosenzitizující činidlo a její další přítomnost v cytosolu.

Předpokládalo se, že pro účinnost takové metody je nezbytné, aby jak fotosenzitizující sloučenina, tak i molekula, jež má být uvolněna do cytosolu, byly během ozáření světlem přítomné ve stejných intracelulárních oddílech.

Nyní bylo překvapivě zjištěno, že molekuly mohou být zavedeny do cytosolu buněk podobnými metodami PCI, u nichž však vystavení světlu není nezbytně konečným krokem a tyto metody nejsou závislé na tom, aby molekula a fotosenzitizující činidlo byly v době vystavení světlu přítomné ve stejných intracelulárních oddílech. V takových metodách může být fotosenzitizující

Cl 301427 B6 činidlo uvedeno do styku s buňkami, a aktivováno ozářením před tím, než je molekula, která má být intemalízována a tedy uvolněna do cytosolu, uvedena do styku s buňkami. Navzdory skutečností, že molekula k intemalizaci a fotosenzitizující činidlo nejsou nezbytně umístěny ve stejných intracelulámích oddílech v době vystavení světlu, molekula stále vstupuje do buňky a je uvolňo5 vána do cytosolu. Tyto výsledky jsou extrémně překvapující a takové metody vykazují významné výhody oproti metodám, v nichž je ozáření světlem konečným krokem.

Podstata vynálezu io

Předkládaný vynález tedy nej obecněji poskytuje způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky, přičemž tento způsob zahrnuje kroky, v nichž se zmíněná buňka uvede do styku s fotosenzitizuj ícím činidlem, zmíněná buňka se uvede do styku s molekulou jež má být zavedena a zmíněná buňka se ozáří světlem o vlnové délce účinné pro aktivaci fotosenzitizujícího činidla, přičemž i5 uvedené ozáření se provádí před buněčným pohlcením zmíněné molekuly do intracelulámího oddílu obsahujícího uvedené fotosenzitizující činidlo, s výhodou před buněčným pohlcením zmíněné molekuly do kteréhokoliv intracelulámího oddílu.

Podstatu vynálezu tvoří způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky in vitro nebo ex vivo, tento způsob zahrnuje kroky, v nichž se zmíněná buňka uvede do styku s fotosenzitizuj ícím Činidlem, buňka se uvede do styku s molekulou jež má být zavedena, tedy s přenášenou molekulou a buňka se ozáří světlem o vlnové délce účinné pro aktivaci fotosenzitizuj ícího činidla, uvedené ozáření se provádí před buněčným pohlcením zmíněné molekuly do kteréhokoliv intracelulámího oddílu, přičemž přenášená molekula není snadno uvolněna z oddílu, vymezeného intracelulámí membrá25 nou, do cytosolu, a/nebo se jedna složka nebo obě složky, sestávající z fotosenzitizujícího činidla a přenášené molekuly, spojí s nebo připojí na jednu nebo více z nosičových molekul, zacílujících molekul nebo vektorů.

Tak, jak je zde použit, týká se výraz „buněčné pohlcení“ nebo „translokace“ jednoho z kroků intemalizace, při níž jsou molekuly vně buněčné membrány přijmuty do buňky tak, že se ocitnou na vnitrní straně vnější buněčné membrány, například v oddílech vymezených intracelulámí membránou nebo ve spojení s těmito oddíly, například v endoplasmatickém retikulu, Golgiho aparátu, lysosomech, endosomech a podobně, k čemuž dochází například endocytózou nebo jiným vhodným pohlcovacím mechanismem.

Konkrétně jako upřednostňovaný aspekt poskytuje předkládaný vynález způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky, přičemž zmíněný způsob zahrnuje kroky, v nichž se uvedená buňka uvede do styku s fotosenzitizuj ícím činidlem, poté se tato buňka ozáří světlem o vlnové délce účinné pro aktivaci fotosenzitizujícího činidla a v podstatě ve stejný časový okamžik nebo v době po ozáření se zmíněná buňka uvede do styku s molekulou, jež má být zaváděna.

S výhodou se buňky do styku s molekulami, jež mají být zaváděny nebo intemalizovány (zde dále označovanými jako přenášené molekuly), uvádějí v době po ozáření, nebo jinými slovy, fotochemické ovlivnění buněk jejich stykem s fotosenzitizuj ícím činidlem a poté ozářením se provádí předtím, než jsou molekuly přidány k buňkám. V tomto ztělesnění mohou být molekuly, jež mají být zaváděny do cytosolu, uvedeny do styku s buňkami, které již byly podrobeny fotochemickému ovlivnění, v jakémkoliv časovém období po takovém ovlivněná za předpokladu, že přenášené molekuly jsou stále schopné být přijmuty do buněk. Časové okno, v němž mohou být molekuly uvedeny do styku s buňkami a stále být do nich přijaty, může záviset na množství faktorů jako například na buněčném typu, konkrétní přijímané molekule, na konkrétním použitém fotosenzitizuj ícím činidle a na délce trvání světelného ovlivnění. V případě potřeby může být takové časové okno stanoveno pro konkrétní sadu podmínek. Ovšem s výhodou je molekula, jež má být převedena do cytosolu, vystavena buňkám poměrně brzo po fotochemickém ovlivnění, například během 24 hodin po fotochemickém ovlivnění a ještě lépe během prvních 10 hodin po fotochemickém ovlivnění, například během prvních 5 hodin nebo ještě lépe během první hodiny.

Například molekula přenášená in vitro nebo ex vivo může být podávána po určité časové období, například od 30 minut do 24 hodin lépe od 1 do 2 hodin, přičemž podávání začíná bezprostředně po ozáření nebo krátce po něm, tedy pokud je konec ozařování považován za výchozí bod, může být přenášená molekula aplikována od doby nulté minuty do 24 hodin, například od 0 do 4 hodin.

Bylo zjištěno, že dokonce i pokud je přenášená molekula uvedena do styku s buňkou značnou dobu po ozáření, je internalizace do této buňky stále možná. Přenášená molekula může být například aplikována více než 4 hodiny po ozáření, například více než 2, 4, 8, 10 nebo dokonce io 12 hodin po ozáření.

V upřednostňovaném ztělesnění tohoto vynálezu je tedy zmíněná buňka uvedena do styku se zmíněnou přenášenou molekulou 0 až 4 hodiny po ozáření na dobu 1 až 2 nebo 3 hodin či déle, například alespoň na dobu 0,5 až 3 hodin. Tato doba, po kterou je přenášená molekula podávána, se bude lišit v závislosti na tom, zda jsou způsoby prováděny in vitro nebo in vivo. Pro způsoby in vitro mohou být přenášené molekuly obecně uváděny do styku se všemi cílovými buňkami souběžně, například pokud jsou buňky pěstovány v kultuře in vitro a je tedy poměrně snadné přivést molekuly do styku s buňkami ve vhodný časový okamžik. Uspořádání in vivo je ovšem krok uvedení cílových buněk do styku s přenášenými molekulami jasně komplikovanější a bude záviset na způsobu podávání a na umístění cílových buněk.

Pokud například může být přenášená molekula podávána přímo do cílových buněk, například lokální injíkact, potom bude přenášená molekula do styku s cílovými buňkami (nebo alespoň s jejich částí) uvedena poměrně rychle, například během minut nebo hodin po podání. Na druhou stranu pokud jsou přenášené molekuly podávány intravenózní injikací pro dosažení vzdáleného cíle, pak může trvat déle než se dostanou do styku s cílovými buňkami. Například může trvat 24 až 96 hodin, než se po podání dostanou do cílových buněk. Tato „doba vyjádřená ve dnech“ musí být brána v úvahu při plánování vhodné doby, během níž mají být přenášené molekuly podávány vzhledem k aplikací fotosenzitizujícího činidla a doby ozáření.

V alternativním uspořádání předkládaného vynálezu mohou být přenášené molekuly spíše než po ozáření uvedeny do styku s buňkami v podstatě ve stejnou dobu, v jakou se ozáření provádí. Výraz „v podstatě ve stejnou dobu“, tak jak je zde použit, zahrnuje „přesně ve stejnou dobu“, tj. současně, ale rovněž zahrnuje přidání molekul k buňkám krátce před ozářením, například až do jedné nebo dvou hodin před ozářením, a to za předpokladu, že buněčné pohlcení přenášené molekuly nenastalo v době ozáření a může stále nastat, třeba po ozáření nebo za předpokladu, že pokud buněčné pohlcení přenášené molekuly již proběhlo, potom přenášená molekula afotosenzitizační činidlo nejsou v době vystavení světlu soustředěny ve stejných intracelulámích oddílech.

Jak bylo zmíněno výše, přesné načasování přídavku přenášené molekuly a fotosenzitizuj ícího činidla a načasování ozáření k dosažení výše popsaných účinků musí brát v potaz různé faktory, zahrnující ovlivňované buňky, používaná činidla a používané molekuly a prostředí, v němž se buňky nacházejí, zvláště sohledem na to, zdaje používán systém in vitro nebo in vivo. Pokud jsou tyto otázky zohledňovány mohou být příslušná načasování snadno určena.

Jako obecný princip jsou vhodné podmínky stanoveny tak, že krok ozáření by měl být prováděn buď před buněčným pohlcením přenášené molekuly (za předpokladu, že fotosenzitizuj ící činidlo bylo samo již přijmuto do intracelulámích oddílů), nebo po buněčném pohlcení přenášené mole50 kuly za předpokladu, že přenášená molekula a fotosenzitizuj ící činidlo nejsou v době vystavení světlu soustředěny ve stejných intracelulámích oddílech. Při této druhé možnosti bude přenášená molekula samozřejmě uvedena do styku s buňkami v časový okamžik před uskutečněním ozáření. To představuje jedno z upřednostňovaných ztělesnění tohoto vynálezu.

.1 .

CZ 301427 Bó

Dříve předkládané způsoby fotochemické internalizace, při nichž byly přenášené molekuly a fotosenzitizující činidlo přidávány k buňkám před ozářením, závisely na tom, zda příslušné molekuly byly soustředěny ve stejných intracelulámích oddílech před vystavením světlu tak, aby lyže těchto oddílů světelnou aktivací fotosenzitizujícího činidla vyvolala uvolnění jak molekuly, tak i fotosenzitizujícího činidla do cytosolu. Schématické vyjádření takového děje je na Obr. 7 A.

V předkládaných způsobech zjevně fotosenzitizující činidlo a přenášená molekula, jež má být zavedena do cytosolu, nejsou v době vystavení světlu ve stejných intracelulámích oddílech, neboť přenášená molekula se k buňkám přidává pouze krátce před vystavením buněk světlu nebo io po něm.

Mechanismus působení podle předkládaného způsobu je stále neznámý a skutečnost, že tento způsob vůbec funguje, je zjevně překvapující. Aniž by bylo žádoucí vázat se teorií, může být důvodem těchto překvapivých nálezů to, že dochází k fúzi fotochemicky poškozených měchýřků s nově vytvořenými endocytotoxickými měchýřky, po níž následuje uvolnění nově endocytovaných molekul do cytosolu. Schématický diagram ozřejmující tento děj je znázorněn na Obr. 7B.

Alternativně může fotochemické poškození lysosomálních enzymů nebo měchýřků obsahujících lysosomální enzymy, jako pozdních endosomů, snížit rychlost intracelulámí degradace molekul, jež mají být intemalizovány. To může být způsobeno sníženým transportem do měchýřků obsahujících lysosomální enzymy, nebo transportem do endocytálních měchýřků obsahujících menší hydrolytickou aktivitu, V takovém případě budou mít tyto molekuly více času uniknout endocytické kompartmentalizaci, než když je cesta lysosomální degradace aktivní. Dalším alternativním vysvětlením by mohlo být to, že fotochemické ovlivnění buněk vede k menšímu poškození plasmatické membrány buněk, vedoucímu ke zvýšenému pronikání makromolekul přes buněčnou membránu. Ovšem prováděné pokusy (viz Příklad 7) naznačují, že toto vysvětlení se pravděpodobně neuplatňuje.

Předkládaná vynález se tedy týká způsobu přenosu nebo transfekce jakýchkoliv molekul do cytosolu živých buněk buď in vitro (tj. v buněčné kultuře) nebo in vivo, po němž by molekuly měly být dostupné v cytosolu.

Takové způsoby mohou být použity nejen k přenosu molekul (nebo jejich částí či fragmentů) do nitra buňky, ale za určitých podmínek také k jejich předložení nebo expresi na buněčný povrch.

Tedy po přenesení a uvolnění přenášené molekuly do cytosolu způsobem podle předkládaného vynálezu, za předpokladu specializace příslušné buňky nebo buněk, jak je tomu například u buněk předkládající antigen, mohou být molekula nebo její fragment přeneseny na povrch buňky, kde mohou být předkládány, tedy prezentovány na vnější straně buňky, tj. na buněčném povrchu. Takové způsoby mají konkrétní využití v oblasti očkování, kde mohou být složky vakcíny, tj. antigeny nebo imunogeny, zavedeny do buňky k předložení na povrch takové buňky a to k indukování, usnadnění nebo zvýšení imunitní odpovědi. Další podrobnosti, týkající se využitelností takové schopnosti exprese molekuly na buněčném povrchu, jsou popsány ve WO 00/54 802.

Přenášené molekuly, které mohou být zavedeny do cytosolu buněk způsobem podle předkládaného vynálezu, zahrnují molekuly, které nesnadno procházejí buněčnými membránami. Nadto může předkládaný vynález zvýšit uvolnění do cytosolu a cytosolámí aktivitu molekul, které jsou pouze částečně schopné průstupu přes membránu buňky nebo membrány intracelulámích měchýřků. Přenášenými molekulami mohou být organické sloučeniny, proteiny nebo fragmenty proteinů, jako jsou například peptidy, protilátky či antigeny nebo jejich fragmenty. Jinou třídou přenášených molekul pro použiti podle tohoto vynálezu jsou cytotoxická léčiva jako proteinové toxiny, nebo cytotoxické organické sloučeniny, například bleomycin. Ještě další třídou vhodných přenášených molekul jsou nukleové kyseliny.

-5CZ 301427 B6

Nukieové kyseliny mohou být použity ve formě genů, kódujících například léčebné proteiny, antikódující, negativní (antisense) RNA molekuly, ribozymy, RNA aptamery nebo triplex vytvářející oligonukleotidy, Alternativně mohou být nukieové kyseliny použity ve formě nekódujících molekul, jako například syntetických DNA anebo RNA negativních molekul ribozymů, aptame5 rů, triplex vytvářejících oligonukleotidů, peptidových nukleových kyselin (PN As), transkripční ho faktoru „lákajícího“ DNA (transcription factor „deocy“ DNA) nebo chimérických oligonukleotidů k opravám specifických mutací u pacienta. Pokud je to příhodné, mohou být molekuly nukieové kyseliny ve formě celých genů nebo fragmentů nukleových kyselin, volitelně začleněných do vektorové molekuly nebo entity, například do plasmidového vektoru nebo virové částice io čí do bakteriofága. Posledně zmíněná forma je zvláště využitelná v případech, kdy má být přenášená molekula použita v metodách genové léčby.

Fotosenzitizujícím činidlem, které má být použito podle předkládaného vynálezu, je výhodně jakékoliv takové činidlo, soustřeďující se do intracelulámích oddílů a zvláště do endosomu nebo lysosomu. V oboru je známa celá škála takových fotosenzitizuj ících činidel a jsou také popsána v literatuře, včetně WO 96/07 432. V tomto ohleduje třeba zmínit di- a tetrasulfonovaný hlinitý ftalocyanin (například AlPcS_2a), sulfonované tetraphenylporfíny (TPPS_n), nilskou modř, deriváty chlorinu e₆, uroporíyrin I, fyloerythrin, hematoporfyrin a methylenovou modř, u nichž bylo prokázáno, že se soustřeďují v endosomech a lysosomech buněk v kultuře. Ve většině případů je to způsobeno endocytickým pohlcením fotosenzitizeru.

Fotosenzitizujícím činidlem je tedy s výhodou takové činidlo, které je přijímáno do vnitrních oddílů (kompartmentů) lysosomů nebo endosomů. Použita však mohou být i další fotosenzitizující činidla, která se soustřeďují do jiných intracelulámích oddílů, jako například do endoptasma25 tického retikula nebo do Golgiho aparátu. Je také možné, že se může uplatňovat takový mechanismus, při němž účinky fotochemického ovlivnění působí na další složky buňky (tj. na složky odlišné od membránou vymezených oddílů). Jednou z možností může tedy být například destrukce molekul důležitých pro intracelulámí transport nebo fúzi měchýřků fotochemickým ovlivněním. Takové molekuly nemusí být nezbytně soustředěny v membránou vymezených oddílech, ovšem fotochemické poškození takových molekul může přesto vést k fotochemické intemalizaci přenášených molekul. Uplatnit se může například mechanismus, při němž fotochemické účinky na takové molekuly vedou ke sníženému přenosu molekuly, jež má být intemalizována (tj. přenášené molekuly) do degradačních měchýřků, jako jsou lysosomy, takže molekula, jež má být intemalizována, může uniknout do cytosolu dříve, než je degradována. Příkla35 dům takových molekul, nikoliv nezbytně soustředěných do membránou vymezených oddílů, jsou některé molekuly mikrotubu lamího transportu jako dynein a složky dynactinu; a například rab5, rab7, vůči N-ethylmaleinimidu citlivý faktor (NSF), rozpustný protein zachycující NSF (soluble NSF attachment protein, SNAP) a podobně.

4o Třídy vhodných fotosenzitizuj ících činidel, které lze zmínit, tedy zahrnují porfyríny, ftalocyaniny, purpuriny, chloriny, benzoporfyriny, naftalocyaniny, kationtová barviva, tetracykliny a lysomotropní slabé báze nebo jejich deriváty (Berg se spoluautory, J. Photochemistry and Photobiology 65, 403·—109, 1997). Další vhodná fotosenzitizující činidla zahrnují texafyriny, theoforbidy, porfyceny, bakteriochloriny, ketochloriny, hematoporfyrinové deriváty a deriváty takových látek, endogenní fotosenzitizery indukované kyselinou 5-aminolevulinovou a jejich deriváty, dimery nebo jiné konjugáty fotosyntetizerů,

Fotosenzitizery jsou s výhodou ve volné formě, tj. nejsou konjugované s žádnou další makromolekulou. Ovšem fotosenzitizer může být alternativně spojen s nosičem či připojen nebo konju50 gován k nosiči nebo jiné molekule, jak bude popsáno dále, například může být připojen na zacílenou protilátku nebo být spojen s nosičem jako je polylysin.

Upřednostňovaná fotosenzitizující činidla zahrnují TPPS₄, TPPS_2a, AlPcS_2a a jiné amfifilní fotosenzitizery.

V upřednostňovaném aspektu poskytuje předkládaný vynález způsob, při němž jsou fotosenzitizujícími činidly, která lze použít, kyselina 5-aminoíevulinová, estery 5-aminolevulinové kyseliny nebo farmaceuticky přijatelné sole takových sloučenin.

U zmíněných esterů může být 5-aminová skupina substituovaná nebo nesubstituovaná, ve druhém případě se pak jedná o estery ALA, kyseliny 5-aminolevulinové.

ALA estery pro použití v předkládaném vynálezu jsou konkrétněji estery kyseliny 5-aminolevulinové s volitelně substituovanými alkanoly, tj. alkylové estery nebo substituované alkylové io estery.

Estery ALA, které mohou být použity, jsou výhodně sloučeniny o vzorci l, (R^N-C^COCHrC^CO-OR¹ (I) (kde R¹ může představovat alkyl volitelně substituovaný hydroxyiovými, alkoxylovými, aminovými, arylovými skupinami, acyloxyskupinami, alkoxykarbonyloxyskupinami, oxoskupinami nebo fluorovými skupinami a volitelně přerušený kyslíkovými, dusíkovými, sírovými nebo fosfonovými atomy; a skupina R², buď shodná nebo odlišná, představuje vodíkový atom nebo skupinu

M R'), nebo sole takových sloučenin.

Substituované alkylové R¹ skupiny mohou být mono- nebo polysubstituované. Vhodné R¹ skupi25 ny tedy zahrnují například nesubstituovaný alkyl, alkoxyalkyl, hydroxyalkoxyalkyl, polyhydroxyalkyl, hydroxypolyalkylenoxyalkyl a podobně. Výraz „acyl“, jak je zde používán, zahrnuje jak karboxy látové, tak karbonátové skupiny a tedy acyloxyskupinou substituované alkylové skupiny zahrnují například alkylkarbonyloxyalkyl. V takových skupinách mají kterékoliv alkylenové Částice s výhodou takový obsah uhlíkových atomů, jaký je definován níže pro alkylové sku30 piny. Upřednostňované arylové skupiny zahrnují fenyl a monocyklické, 5 až 7 členné heteroaromáty, zvláště pak fenyl a takové skupiny mohou být opět samy volitelně substituovány.

Reprezentativní substituované alkylové skupiny R¹ zahrnují alkoxymethylové, alkoxy ethylové a alkoxypropyiové skupiny nebo acyloxymethylové, acyloxyethylové a acyloxypropylové skupi35 ny, například p i valoy loxy methyl.

Upřednostňované estery ALA pro použití jako fotosenzítizující činidla podle tohoto vynálezu zahrnují takové estery ALA, kde R¹ představuje nesubstituovanou alkylovou skupinu a/nebo každá skupina R² představuje vodíkový atom.

Tak, jak je zde používán, zahrnuje výraz „alkyl“ jakoukoliv alifatickou nasycenou nebo nenasycenou uhlovodíkovou skupinu s krátkým nebo dlouhým řetězcem, rovným nebo rozvětveným. Nenasycené alkylové skupiny mohou být mono-nenasycené nebo poly-nenasycené a zahrnují jak alkenylové, tak alkynylové skupiny. Takové skupiny mohou obsahovat až 40 uhlíkových atomů.

Přednost se však dává alkylovým skupinám obsahujícím nejvýše 10, například 8, lépe nejvýše 6 a zvláště pak nejvýše 4 uhlíkové atomy.

Zejména je potřeba zmínit ALA-methylester, ALA-ethylester, ALA-propylester, ALA-hexylester, ALA-heptylester a ALA-oktylester ajejich sole, které představují upřednostňovaná foto50 senzitizující činidla pro použití podle předkládaného vynálezu.

Fotosenzítizující činidlo je do styku s buňkou nezbytně uvedeno před ozářením buňky. Na rozdíl od přenášené molekuly by však toto činidlo mělo být podáváno dostatečně před ozářením, tak, aby při ozáření bylo zmíněné činidlo přijmuto do intracelulámího oddílu. Zmíněné činidlo je proto výhodně aplikováno 1 až 72 hodin před ozářením, například 4 až 48 hodin, tedy například

-7CZ 301427 B6 až 24 hodin před ozářením. Opět, jak již bylo uvedeno výše ve spojení s krokem uvedení přenášené molekuly do styku s buňkami, načasování podávání fotosenzitizujícího činidla k dosažení styku s cílovou buňkou ve vztahu k okamžiku ozáření bude záviset na době, za kterou se fotosenzitizující činidlo dostane do cílových buněk a bude do nich přijato. Tato doba se může lišit v závislosti na tom, zdaje způsob prováděn in vitro nebo in vivo a na tom, zda jde o podávání přímé do cílové tkáně nebo nepřímé, na vzdáleném místě. Ve všech případech je důležité, aby ťotosenzitizující činidlo bylo přijato cílovými buňkami před prováděním ozáření. Zmíněné činidlo může být udržováno ve styku s uvedenými buňkami bezprostředně až do ozáření, například od 1 či 4 do 72 hodin, s výhodou od 4 do 24 hodin, například od 12 do 20 hodin, nebo může ío být od buněk odstraněno bezprostředně před ozářením, takže buňky jsou například více než minut, například 10 minut až 8 hodin, například 1 hodinu až 4 hodiny v médiu bez přítomnosti činidla.

Volitelně mohou být buď fotosenzitizující činidlo nebo přenášená molekula, nebo obě tyto i? složky, které mají být zavedeny do buněk, asociovány, spojeny či konjugovány s jednou nebo více molekulami nosiče, cílovými molekulami nebo vektory, které mohou usnadnit nebo zvýšit pohlcení fotosenzitizujícího činidla nebo přenášené molekuly, nebo mohou zacílit či uvolnit tyto entity do zvláštního buněčného typu, tkáně nebo intracelulámího oddílu. Příklady nosičových systémů zahrnují polylysin nebo jiné polykationty, dextransulfát, různé kationtové lipidy, liposo2o my, rekonstituované LDL-částice, stericky stabilizované liposomy nebo částice adenovirů.

Tyto nosičové systémy mohou obecně zlepšit farmakokinetiky a zvýšit buněčné pohlcování přenášené molekuly a/nebo fotosenzitizujícího činidla a mohou také nasměrovat přenášenou molekulu a/nebo fotosenzitizující činidlo do intracelulámích oddílů, které jsou zvláště výhodné pro dosažení fotochemické intemalizace, ale obecně nejsou schopné zacílit přenášenou molekulu a/nebo fotosenzitizující činidlo do specifických buněk (například rakovinných buněk) nebo tkání. Ovšem k získání takto specifických nebo selektivně směrujících nosičových molekul mohou být přenášená molekula nebo fotosenzitizující činidlo spojeny nebo konjugovány se specifickými směrovacími molekulami, které napomůžou specifickému buněčnému pohlcení přenášené mole30 kuly do požadovaných buněk nebo tkání. Takové směrovací molekuly mohou rovněž namířit přenášenou molekulu do intracelulámích oddílů, které jsou zvláště výhodné k dosažení fotochemické intemalizace.

Použito může být mnoho různých směrovacích molekul, například jak popisují D. T. Curiel v Ann. New York Acad. Sci. 886, 158-171, 1999; G. Bilbao se spoluautory v Gene Terapy of Cancer (vydavatelé Walden a spol,, Plenům Press, New York, 1998); K. W. Peng a S. J. Russell v Curr. Opin. Biotechnol. jO, 454-457, 1999; a T. J. Wickham v Gene Ther. 7, 110-114, 2000.

Nosičova molekula a/nebo směrovací molekula může být spojena, navázána nebo konjugována s přenášenou molekulou, s fotosenzitizujícím činidlem nebo s oběma a použity mohou být stejné nebo odlišné nosiče či směrovací molekuly. Pokud jsou například jako nosič použity částice adenovirů, pak mohou být přenášené molekuly začleněny do adenovirových Částic. Například pokud je přenášenou molekulou molekula DNA kódující protein nebo molekula RNA, potom je DNA začleněna do virového vektoru a po fotochemické intemalizaci bude molekula DNA přítomna na správném intrace tu lamím místě tak, aby mohla nastat exprese kódované molekuly.

Exprese takových molekul může být řízena vytvořením vektoru, způsoby dobře známými a popsanými v oboru. Například k získání tkáňové specifické nebo vzhledem k onemocnění specifické či regulovatelné exprese lze použít regulační prvky, jako jsou například tkáňové specific50 ké nebo regulovatelné promotory. Použít je možné například tkáňový specifický promotor, promotor vůči melanomu specifické tyrosinázy. Dobře známé jsou regulovatelné promotory, jako tetracyklinem regulované promotory. Více příkladů specifických nebo regulovatelných promotorů, které lze použít v předkládaném vynálezu, je možné najít v pracích I. R. Harta v Semin. Oncol. 23, 154—158, 1996; D. E. Hallahana a spoluautorů, Nátuře Med. I, 786-791, 1995; M. C.

Luny a spoluautorů, Cancer Res. 60, 1637-1644, 2000; N. Millera aJ. Whelana, Hum. Gene

Ther., 1997; T. J. Wickhama v Gene Ther. 7, 110-114, 2000; D. M. Nettelbecka a J. V. Mullera vTrends Genet. 16, 174-181, 2000; T. Clacksona v Gene Therp. 7, 120-125, 2000; S.

Freundlieba se spoluautory v J. Gene Med. 1, 4-12, 1999; M. A. Speara v Anticancer Res. 18,

3223-3231, 1998; D: M. Harveye a C. T. Caskeye v Cum Opin. Chem. Biol. 2, 512-518, 1998;

B. M. Claryho a Η. K, Lyerlyho v Surg. Oncol. Clin. North Am. 7, 565-574, 1998; M. C. Luny se spoluautory v Cancer Res. 60, 1637-1644, 2000 a ve zde uvedených odkazech.

Jak bylo uvedeno výše, je možné souběžně použít více než jeden nosič a/nebo vektor či směrovací molekulu. Vektory mohou být například poskytnut v nosiči, například virové vektory, jako io je adenovirus, mohou být neseny například v liposomu nebo v polykat iontové struktuře, Upřednostňované nosiče a vektory pro použití v předkládaném vynálezu, zvláště pro použití ve spojení s přenášenou molekulou, zahrnují adenoviry, polykationty jako póly lysin (například poly-Llysin nebo poly-D-lysín), polyethylen i min či dendrimery (například kationtové dendrimery jako

SuperFecť®); kationtové lipidy jako DOTAP nebo Lipofectin; peptidy a směrovací vektory jako například transferin polylysin nebo zacílené adenovirové vektory. V zvláště upřednostňovaném ztělesnění tohoto vynálezu je potom nosičem adenovirus.

Takové směrující molekuly nebo nosiče, jaké byly popsány výše, mohou být také použity k namíření přenášené molekuly do konkrétních intracelulámích oddílů, které jsou zvláště příhodné pro io využití PCI, například do tysosomů nebo endosomů.

Intracelulámím, membránou vymezeným oddílem může být kterýkoliv takový oddíl, který je přítomný v buňce. S výhodou bude takovým oddílem membránový měchýřek, zvláště endosom nebo lysosom, ovšem intracelulámí oddíl může také zahrnovat Golgiho aparát nebo endoplas25 matické retikulum.

Krok ozáření světlem pro aktivování fotosenzitizujícího činidla může být prováděn technikami a postupy dobře známými v oboru. Vlnová délka a intenzita světla mohou být například zvoleny podle použitého fotosenzitizujícího činidla. Vhodné světelné zdroje jsou v oboru dobře známé.

Doba, po kterou jsou buňky vystaveny světlu v metodách podle předkládaného vynálezu, se může lišit. Účinnost intemalizace přenášené molekuly do cytosolu se zdá zvyšovat s rostoucím vystavením světlu. Upřednostňovaná doba v kroku ozáření závisí na fotosenzitizeru, na množství fotosenzitizeru shromážděném v cílových buňkách nebo v tkáni a na překryvu mezi absorpčním spektrem fotosenzitizeru a emisním spektrem světelného zdroje.

Obecně bude trvání kroku ozáření v řádu od minut do několika hodin, například s výhodou do 60 minut, například od 0,5 nebo 1 minuty do 30 minut, například od 0,5 minuty do 3 minut nebo od 1 minuty do 5 minut nebo od 1 minuty do 10 minut, například od 3 do 7 minut a s výhodou přibližně 3 minuty, například od 2,5 do 3,5 minuty.

Vhodné dávky světla mohou být zvoleny odborníkem v oboru a opět budou záviset na typu fotosenzitizeru a na množství fotosenzitizeru nashromážděného v cílových buňkách nebo tkáních. Dávky světla, typicky používané k fotodynamické léčbě rakoviny za přítomnosti fotosenzitizeru Photofrinu a protoporťyrinového prekurzorů kyseliny 5-aminolevulinové jsou například v rozme45 zí od 50 do 150 J/cm² a v rozmezí světelného toku menším než 200 mW/cm² k zabránění hypertermie. Dávky světla jsou obvykle nižší, pokud jsou použity fotosenzitizery s vyššími extinkčními koeficienty v červené oblasti viditelného spektra. Ovšem k léčbě nerakovinných tkání, v nichž se shromažďuje menší množství fotosenzitizeru, musí být celkové množství světla podstatně vyšší než u léčby rakoviny.

Stanovení vhodných dávek zacílených molekul pro použití ve způsobech podle tohoto vynálezu by mělo být pro odborníka v oboru rutinní praxí. Pokud je přenášenou molekulou bílkovina nebo peptid, měly by být přenášené molekuly pro aplikaci in vitro obecně použity v dávkách menších než 5 mg/ml (například 0,1 až 5 mg/ml) a pro aplikace in vivo by přenášené molekuly měly být obecně používány v dávkách menších než 5 mg/kg (například 0,1 až 5 mg/kg). Pokud je premise-9CZ 301427 B6 nou molekulou nukleová kyselina, měla by příkladná dávka přenášených molekul pro aplikace in vitro být přibližně 0,1 až 50 pg nukleové kyseliny na 10⁴ buněk a pro aplikace in vivo přibližně ⁶ až 1 g nukleové kyseliny na 1 injikaci u člověka. Pokud je přenášená molekula spojena s adenovirovým nosičem, měla by příkladná dávka pro aplikace in vitro představovat 1 až lx 10⁵ fyzických virových částic, například 1 x 10³ až 1 x 10³ částic na buňku a pro aplikace invivo může být molekula, zaváděná ve spojená s adenovirovým nosičem, přítomna v koncentraci 1 x 10 ⁹ až 50%, jako 3 x 10“⁶ až 50%, například 0,003 až 30 %, například 0,2 až 10 % (hmotnost/hmotnost) virových částic v konečném prostředku pro použití in vivo, přičemž údaj hmotnost/hmotnost se týká hmotnosti virového nosiče přidávaného k molekule, jež má být io zaváděna, vzhledem k hmotnosti celkového prostředku. Pokud se používá injekce o objemu 1 ml, bude odpovídat dávce přibližně 10⁵ až 10¹⁵ fyzických virových částic.

Způsoby podle tohoto vynálezu budou nevyhnutelně vyvolávat určitou úmrtnost buněk vzhledem k fotochemické léčbě, tj. působení fotosenzítizujícího činidla. Tato smrt buněk nebude na závadu a dokonce může být výhodná u mnoha aplikací (například u léčby rakoviny) a způsoby podle tohoto vynálezu mohou být upraveny tak, že podíl přežívajících buněk je řízen volbou světelné dávky vzhledem ke koncentraci fotosenzitizačního činidla. Takové techniky jsou v oboru známé. Bez ohledu na množství buněk, usmrcených Čistým fotochemickým působením, je důležité, že světelná dávka je řízena tak, že některé z jednotlivých buněk u nichž se projeví PCI účinek, nejsou usmrceny pouhým fotochemickým ovlivněním (ačkoliv mohou být následně usmrceny působením PCI účinku).

U některých aplikací může být výhodné zachovat po působení PCI větší množství živých buněk. Například při vakcinaci a u některých způsobů genové léčby je důležité zachovat živé buňky, které umožní například prezentaci antigenu nebo expresi proteinu. U takových aplikací je výhodné, aby u celé populace nebo prosté většiny buněk, v podstatě u veškerých buněk nebo u jejich významné většiny (například alespoň u 50 %, lépe alespoň o 60, 70, 80 nebo 90 % buněk) nedošlo k usmrcení. To ovšem není vždycky žádoucí, zvláště pokud se PCI používá k zavedení cytotoxických přenášených molekul a následné buněčné usmrcení pak není nevýhodné. Cytotoxické účinky mohou ovšem být dosaženy také za použití například genové léčby, při níž je léčebný gen intemalizován do nádorových buněk způsobem podle tohoto vynálezu, například tak, že tyto buňky budou produkovat imunologicky aktivní sloučeniny, které budou indukovat místní imunologické zahubení zbývajících rakovinných buněk nebo budou indukovat systémovou imunitní odpověď vůči nádorovým buňkám. V takových případech je po PCI léčbě vyžadován pouze podíl živoucích buněk.

Výhodami předkládaných způsobů a sekvencí (posloupností) léčebných kroků a zvláště takových ztělesnění, v nichž se přenášená molekula přidává k buňkám po kroku ozáření světlem, je ve srovnání s dříve popsanými metodami to, že

a) se sníží fotochemické poškození přenášené molekuly;

b) se zjednoduší PCI působení na vnitřní leze v kombinaci s chirurgickým zákrokem, neboť po takovém zákroku může být uplatněno fotochemické působení, například nitronádorová injikace nebo jiné místní podání přenášené molekuly;

c) způsoby jsou více nezávislé na přesném načasování léčby, tj. na načasování přídavku molekuly, která má být pohlcena buňkami, vzhledem k okamžiku ozáření. To znamená, že zde existuje větší „časové okno pro léčbu. Je to důležité z toho důvodu, že pohlcení léčebné molekuly se může široce lišit za různých klinických situací a nadto je obtížné odhadnout pohlcení u jednotlivých leží v klinické situaci; z toho důvodu je větší časové okno extrémně výhodné;

d) dochází k rychlému přemístění přenášené molekuly do cytosolu, čímž se podstatně snižuje možnost lysosomální degradace přenášené molekuly.

Tyto výhody se uplatňují navíc, kromě výhod spojených se samotnými PCI metodami internalizace molekul, kterými je to, že

- 10CZ 301427 B6

1) neexistuje žádné omezení velikosti molekuly, která má být intemalizována a přenesena do cytosolu, pokud může být tato molekula endocytována cílovou buňkou;

2) uváděné způsoby nejsou závislé na buněčné proliferací;

3) uváděné způsoby jsou místně specifické v tom, že ovlivněny budou pouze plochy vystavené světlu;

4) metoda není onkogenní.

Kroky „uvádění do styku⁴* buněk s fotosenzitizuj ícím činidlem a s přenášenou molekulou mohou být prováděny jakýmkoliv běžným nebo požadovaným způsobem. Pokud má být krok uvádění do io styku prováděn in vitro, mohou být buňky výhodně udržovány ve vodném médiu, jako je například vhodné buněčné kultivační médium a fotosenzitizuj ící činidlo nebo přenášená molekula mohou být ve vhodném časovém okamžiku jednoduše přidány do média za vhodných podmínek, například ve vhodné koncentraci a na vhodné časové období.

Fotosenzitizující činidlo se uvádí do styku s buňkami ve vhodné koncentraci a po vhodné časové období, což může být snadno stanoveno odborníkem za použití rutinních postupů a bude záviset na konkrétním použitém fotosenzitizuj ícím činidle a na typu buněk. Koncentrace fotosenzitizuj ícího činidla musí být taková, že jakmile je toto činidlo jednou přijato do buněk, například do jednoho nebo více z intracel ulam ích oddílů těchto buněk neboje s takovými oddíly spojeno, a je aktivováno ozářením, jedna nebo více z buněčných struktur je rozrušena, například jeden nebo více z intracelulámích oddílů je lyžován nebo rozrušen. Například fotosenzitizující činidla, používaná ve zde uváděných příkladech, mohou být použita v koncentraci 10 až 50 pg/ml. Pro použití in vitro může být toto rozmezí ještě širší, například od 0,05 do 500 pg/ml. Pro humánní léčbu in vivo může být fotosenzitizující činidlo použito v rozmezí od 0,05 do 20 mg/kg tělesné hmotnosti při systematickém podávání, nebo v rozmezí od 0,1 do 20 % v rozpouštědle pro místní nanesení. U menších zvířat může být koncentrační rozmezí odlišné a může být odpovídajícím způsobem upraveno.

Doba inkubace buněk s fotosenzitizujícím činidlem (tj, doba „styku⁴*) se může lišit pohybovat od několika minut do několika hodin, například až do 48 hodin nebo déle. Doba inkubace by měla být taková, aby bylo fotosenzitizující činidlo přijato do vhodných buněk.

Po inkubaci buněk s fotosenzitizujícím činidlem může volitelně následovat období inkubace s médiem bez přítomnosti fotosenzitizeru ještě před tím, než jsou buňky vystaveny světlu nebo než je přidána přenášená molekula.

Přenášenou molekulou může být jakékoliv molekula, jak byla diskutována výše a taková molekula je uváděna do styku s buňkami ve vhodné koncentraci a na vhodné časové období. Překvapivě bylo zjištěno, že styk může být iniciován dokonce několik hodin po ozáření. Vhodná koncentrace může být stanovena v závislosti na účinnosti přijímání příslušné molekuly do buněk a na konečné koncentraci, jež má být v těchto buňkách dosažena. „Doba transfekce“ nebo „doba buněčného pohlcení“, tj. doba, po kterou jsou molekuly ve styku s buňkami, může být v rozmezí od několika minut až do několika hodin, Použita může být například doba transfekce od 10 minut až do 24hodin, například od 30 minut do 10 hodin, nebo například od 30 minut až do 2 hodin nebo

6 hodin. Prodloužená doba transfekce má obvykle za následek zvýšené pohlcení příslušné molekuly. Ovšem zkrácené doby inkubace, například od 30 minut do 1 hodiny, se zdají poskytovat zlepšenou specifičnost pohlcení molekuly. Při volbě doby transfekce pro jakoukoliv metodu je tedy nutné zvolit patřičnou rovnováhu mezi dosažením dostatečného pohlcování molekul pří zachování dostatečné specifičnosti takového pohlcování.

Za podmínek in vivo bude vhodný způsob a doba inkubace, při níž jsou přenášené molekuly a fotosenzitizující činidla uváděny do styku s cílovými buňkami, záviset na způsobu podávání a na typu přenášené molekuly a fotosenzitizuj ících činidel. Pokud se například přenášená molekula injikuje do nádoru jenž má být léčen, dostanou se buňky v blízkosti místa injikace do

- 11 CZ 301427 B6 styku s přenášenou molekulou a mají tedy sklon přijímat přenášenou molekulu rychleji než buňky, nacházející se ve větší vzdálenosti od místa injikace, která se pravděpodobně do styku s přenášenou molekulou dostanou později a v nižší koncentraci. Kromě toho může přenášené molekule, poskytované intravenózní injikací, trval určitou dobu, než se dostane k cílovým buňkám a proto může období po podání trvat déle, například několik dnů, než se dostatečné nebo optimální množství přenášené molekuly nahromadí v cílových buňkách nebo tkáních. Stejné úvahy samozřejmě platí i pro dobu podávání, stanovovanou pro pohlcení fotosenzitizuj ícího činidla do buněk. Doba podávání, která je vyžadována u jednotlivých buněk in vivo, se tedy pravděpodobně mění v závislosti na těchto a dalších parametrech.

io

Přesto, i když je situace in vivo komplikovanější než in vitro, je základní koncept předkládaného vynálezu stále stejný, tj, doba, ve které se molekuly dostanou do styku s cílovými buňkami musí být taková, aby před ozářením bylo cílovými buňkami přijato příslušné množství fotosenzitizujícího činidla a buď: (i) před ozářením nebo během ozáření byla přenášená molekula buď pohlcena i5 nebo po dostatečném styku s cílovými buňkami došlo k jejímu pohlcení do odlišných intracelulámích oddílů nebo (ii) po ozáření byla přenášená molekula ve styku s buňkami po dostatečné časové období k umožnění jejího pohlcení do buněk. Za předpokladu, že přenášená molekula je pohlcena do odlišných intracelulámích oddílů vzhledem k fotosenzitizujícímu činidlu, může být přenášená molekula pohlcena před ozářením nebo po něm.

Výraz „buňka“ se zde používá k zahrnutí všech eukaryotických buněk (včetně buněk hmyzu a hub). Reprezentativní „buňky“ tedy zahrnují všechny typy savčích a nesavčích živočišných buněk, rostlinných buněk, hmyzích buněk, buněk hub a prvoků.

Způsoby podle předkládaného vynálezu mohou být používány in vitro nebo in vivo, buď při léčbě in šitu (místně, například za použití zacílených částic) nebo pří léčbě ex vivo s následným podáním léčených buněk do těla.

Způsoby podle předkládaného vynálezu mohou být použity například k léčbě rakoviny. Některé fotosenzitizery se shromažďují přednostně v neoplastických tkáních, selektivnost vzhledem k nádoru ve srovnání s okolní tkání může mít obvykle faktor 2 až 3, ovšem tento faktor může být v některých případech, jako u mozkových tkání, vyšší tj. až do 30. Alternativně může být konkrétní fotosenzitizuj ící činidlo zacíleno na konkrétní nádor výše popsanými způsoby. Nadto molekuly, které mohou být klinicky zajímavé pro léčbu rakoviny, ale jsou omezeny malým nebo nulovým přijímáním do cytosolu, mohou být zavedeny do cytosolu a namířeny vůči specifickým buňkám prostřednictvím předkládaného vynálezu. Příkladem takové molekuly je gelonin, který bude uveden níže. Použity mohou být i jiné molekuly, buď samotné nebo navázané na další molekuly, které označují molekuly, jež mají být intemalízovány do konkrétní buňky (například protilátky, transferrin, fotosenzitizery, apoB na rekonstituovaných LDL částicích). Výhodou takové kombinační léčby by mělo být l) zvýšení cytotoxického účinku ve spodnějších vrstvách nádorových tkání, neboť k rozrušení lysosomů a endosomů dostačují nízké a subtoxické dávky světla; 2) zvýšení specifičnosti a léčby, neboť PCI se dává pouze do oblasti nádoru.

Způsoby podle předkládaného vynálezu mohou být rovněž použity k léčbě různých dalších poruch, vyžadujících výběr molekuly pro zavedení do buňky, jako jsou revmatoidní artritida, ateroskleróza a jiná kardiovaskulární onemocnění, virové a jiné infekce, lupénka, sluneční keratóza, léčba poranění, léčba zlomenin, bradavice a vrozené genetické poruchy jako cystická fibróza, Gorlinův syndrom a ataxie telangiectasía.

Způsoby podle tohoto vynálezu mohou být rovněž použity pří genové léčbě, tj. při léčebném přenosu genů do buněk pacienta. Genová léčba je nadějná jako způsob léčby mnoha onemocnění, jako jsou rakovina, kardiovaskulární onemocnění, virová onemocnění, monogenní poruchy jako cystická fibróza a mnoho dalších stavů jako jsou ty, popsané výše.

Významnou obtíží současné genové léčby je nutnost vysoké účinnosti a specifičnosti genového přenosu, který musí probíhat in vivo. V používaných způsobech se k dosažení genového přenosu v genové léčbě využívá mnoho různých nosičů nebo vektorů. Jako příklady lze zmínit polykationtové sloučeniny, kationtové lipidy a virové systémy, ovšem až dosud se genová léčba in vivo setkávala jen s malým úspěchem. Mezi mnohé známé výhody současných způsobů patří malá stálost vektoru v séru, omezená specifičnost při poskytnutí genu, malá účinnost poskytnutí genu a podobně. Způsoby PCI podle předkládaného vynálezu poskytují prostředky k podstatnému zlepšení jak účinnosti, tak i specifičnosti mnoha metod dodání genu, používaných v současnosti v genové léčbě, a to zlepšením kroku endosomálního uvolnění, který může být krokem io určujícím účinnost jak u mnoha syntetických vektorů poskytujících gen, tak u různých virových systémů. Také ovlivnění světlem, patřící do způsobu PCI, umožňuje přesnější stanovení toho, kde by mělo v těle dojít ke zvýšenému genovému přenosu, neboť zvýšení účinnosti genového přenosu nastane pouze v ozářených oblastech. Transfekce se může uskutečnit in vitro, in vivo nebo ex vivo (přičemž buňky nebo tkáně se příslušným způsobem podávají pacientovi). Vhodné nosiče a vektory pro transfekci s výhodou zahrnují adenoviry, polykationty jako polylysin (například poly-D-lysin nebo poly-L-lysin), SuperFect®, polyethylenimin nebo dendrimery; kationtové lipidy jako DOTAP (l,2-bis(oleoyloxy)-3-(trimethylamino)propan) nebo Lipofectin, nebo kationtové lipidy formulované s „pomocným lipidem“ jako DOPE (dioleoylfosfatidylethanolamin); peptidy a zacílené vektory jako například transferrin polylysin nebo zacílené adenovirové vektory. V upřednostňovaném ztělesnění tohoto vynálezu je nosičem použitým pro léčebný gen adenovírus.

Jiným upřednostňovaným aspektem předkládaného vynálezu je použití nevirových nosičových systémů, jakými jsou například kationtové polymery, obsahující peptidy a kationtové lipidy.

Typické polymery zahrnují například polyamin, polyaminokyseliny včetně bazických polyaminokyselin, syntetické a přírodní kationtové cukerné polymery, methakrylátové polymery, dendrimery, polyalkyleniminy a další polymery známé v oboru jako vhodné pro dodání léčiv; zvláště polymery vhodné pro dodání genu. Typickými sloučeninami, použitelnými podle předkládaného vynálezu, jsou polylysin, polarginin, poly-L-glutamová kyselina, polyvinylpyridin, chitosan, polyethylenimin, poly(2-dimethylamino)ethylmethakiylát, histony, protamin, poly(L-omitín), aviden, spermin, spermidin a jakýkoliv derivát uvedených látek. V upřednostňovaném aspektu předkládaného vynálezu mohou být zde popsané polymery kombinovány s jinými polymery nebo kombinovány s jinými systémy dodávajícími gen. Nevirový systém pro dodání genu, který je použitelný podle předkládaného vynálezu, je například popsán R. I. Mahatem a spoluautory v Advances in Genetics 41, 95-156, vyd. J. C. Halí a další, 1999. Kationtové polymery jsou dále popsány M. C. Gamettem v Cricital Reviews in Terapeutic Drug Carrier Systems 16, 147-207, 1999; K. A. Howardem se spoluautory v Biochemica et Biophysica Acta 1475, 245-255, 2000; Η. K. Nguyenem a spoluautory v Gene Terapy 7, 126-138, 2000; A. Bragonzim a spoluautory vJ. Controlled Relase 65, 187-202, 2000; S. C. DeSmedtem a spoluautory v Pharmaceutical Research 1_7, 113-126, 2000 a R. I. Mahotem v J. Drug Targeting 7, 249-268, 1999.

Jiný aspekt předkládaného vynálezu zahrnuje využití liposomů nebo jiných konstruktů na bázi lipidů jako nevirových nosičových systémů. Liposomy mohou být vůči pH-citlivé liposomy nebo vůči pH necitlivé liposomy. Vůči pH citlivé liposomy sestávají z alespoň jedné vůči pH citlivé složky liposomální membrány. Typické sloučeniny zahrnují mastné kyseliny jako je kyselina olejová, palmitoylhomocystein, cholesterol, hemisukcinátová morfolinová sůl a dieloylsukcinylglycerol. Kromě složek citlivých vůči pH mohou liposomy zahrnovat dioleoylfosfatidylethanolamin (DOPE) a/nebo jiné podobné fosfolipidy.

Liposomy nebo jiné přenášení systémy na bázi lipidů s výhodou obsahují alespoň jeden kationtový lipid.

Přenášecí (dodávací) systémy na bázi lipidů mohou být přítomné v různých typech vodných přípravků. V literatuře se pro takové přípravky používají různé názvy: multilamelámí liposomy,

- 13CZ 301427 B6 jednovrstvé (unilamelámí) liposomy, vůči pH citlivé liposomy, nanoemulze, nanočástice, proteoliposomy, virosomy, chimerasomy, kocheláty, lipofectin* a lípoplex. Odkazy na použití kationtových lipidů v genovém přenosu zahrnují práce: P. L. Felgner se spoluautory, Proč. Nati. Acad.

Sci. USA 84, 7413-7417, 1987; D. D. Lasic se spoluautory, Adv. Drug Del. Rev. 20, 221-266,

1996; L. G. Barron se spoluautory, Gene Terapy 6, 1179-1183, 1999; S. Kawakami se spoluautory. Pharmaceutical Research F7, 306-313, 2000; N. S. Templeton se spoluautory, Molecular Biotechnology JJ, 175-180, 1999; Y. Zou se spoluautory, Cancer Gene Terapy 7, 683-696, 2000; D. D. Stuart se spoluautory, Bíochemistry et Biophysica Acta 1463, 219-229, 2000; R. I. Mahato se spoluautory, Drug Deliv. 4, 151, 1997 a R. J. Lee se spoluautory, Crit. Rev. Drug io Carrier Syst. ]4, 173, 1997.

Tuky použitelné podle předkládaného vynálezu jsou popsány například v patentech US 6 120 751, US 6 056 938, US 6 093 816, US 6 039 936, US 6 034 137, US 6 034 135, US 6 020 526, US 5 980 935, US 5 958 935, US 5 935 936, US 5 877 220, US 5 830 430,

US 5 777 153, US 5 705 693, US 5 459 127, US 5 334 761, US 5 264 618 a v odkazech v nich uvedených.

Typické příklady kationtových lipidů zahrnují N[ 1-(2,3-dioleyloxy)propyl-N,N,N-trimethyIamoniumchlorid (DOTMA), 1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethylamoniumbromid (DMRIE), l,2-bis(oleoyloxy)-3“<trimethylamino)propan (DOTAP), 3p(N',N'-dimethylaminoethan)-karbamoylcholesterol (DC-Chol), 2,3-dioleyl-oxy-N[2-sperminkarboxy-yl-amido]ethyl-N,N-dimethy 1-1 -propanaminiumtrifluoracetát (DOS PA), 3-p(N⁴-sperminkarbamoyl)cholesterol, 3-P(N⁴-spermidinkarbamoyl)cholesterol a dioktadecylamidoglylspermin (DOGS),

Jak bylo popsáno výše, v jednom z upřednostňovaných ztělesnění předkládaného vynálezu je nosičem kationtový lipid. Již dříve bylo zjištěno, že fotochemické působení má inhíbující účinek na transfekci zprostředkovanou kationtovými lipidy, pokud je světlo poskytnuto až po přenášené molekule (Prasmickaite se spoluautory, J. Gene Med. 6, 2000). Ovšem nyní bylo velmi překvapivě prokázáno, že pokud se světlo uplatní před aplikací přenášené molekuly, má PCI stimulační účinek na transfekci prostřednictvím kationtových lipidů (viz Příklad 9).

Jako další aspekt tedy předkládaný vynález poskytuje prostředky, obsahující přenášenou molekulu a fotosenzitizující Činidlo pro použití k léčbě. Přenášená molekula a/nebo fotosenzitizující činidlo mohou být v prostředcích volitelně spojeny s nosičovými molekulami jako jsou ty, popsa35 né výše. Prostředky se s výhodou používají pro léčbu rakoviny nebo pro genovou léčbu. Upřednostňovanou nosičovou molekulou pro genovou léčbu je adenovirus. Jinými upřednostňovanými nosiči jsou kationtové lipidy.

V dalším aspektu tedy předkládaný vynález poskytuje použití přenášené molekuly a/nebo foto40 senzitizujícího činidla, jak byly popsány výše, k přípravě léčiva pro použití k léčbě, kde uvedené fotosenzitizující činidlo a odděleně i zmíněná přenášená molekula jsou uvedeny do styku s buňkami nebo tkáněmi pacienta a zmíněné buňky jsou ozářeny světlem o vlnové délce, která je účinná k aktivaci fotosenzitizujícího činidla, ozáření se provádí před buněčným pohlcením zmíněné přenášené molekuly do intracelulámí ho oddílu obsahujícího uvedené fotosenzitizující činid45 Io, s výhodou pak před buněčným pohlcením zmíněné přenášené molekuly do kteréhokoliv intracelulámího oddílu. Způsoby léčby, obsahující takové metody, vytvářejí alternativní aspekty předkládaného vynálezu.

Vynález tedy poskytuje způsob léčby nebo prevence onemocnění, poruchy, nebo infekce u pacienta, zahrnující uvedení přenášené molekuly do jedné nebo do více buněk in vitro, in vivo nebo ex vivo způsobem, jaký zde byl výše popsán a tam, kde je to nezbytné (tj. pokud se transfekce provádí in vitro nebo ex vivo), podávání uvedených buněk zmíněnému pacientovi.

Tak, jak je zde definován, týká se výraz „léčba“ snížení, zmírnění nebo odstranění jednoho nebo více z příznaků onemocnění, poruchy nebo infekce, které mají být léčeny a to vzhledem k příznáCZ 301427 B6 kům, pozorovaným před léčbou. „Prevence“ se týká opoždění nebo zabránění nástupu příznaků onemocnění, poruchy nebo infekce.

Jak bylo uvedeno dříve, mají takové způsoby, využití i při vakcinaci. Proto je dalším aspektem předkládaného vynálezu poskytnutí způsobu exprese nebo prezentace (předložení) antigenní molekuly (přenášené molekuly) nebo její části na povrchu buňky, s výhodou buňky předkládající antigen, přičemž zmíněný způsob zahrnuje kroky, jak zde byly dříve definovány.

Výrazy „exprese“ nebo „prezentace“, jak zde byly použity, se týkají přítomnosti molekuly nebo io její části na povrchu zmíněné buňky tak, že alespoň část této molekuly je vystavena a je dostupná pro okolní prostředí takové buňky. Na „povrchu“ může být dosaženo takové exprese, kdy molekula, která má být exprimována, je ve styku s buněčnou membránou a/nebo se složkami, které mají být přítomny na této membráně.

Tento způsob může být prováděn in vitro nebo in vivo. Ovšem s výhodou může taková antigenní prezentace výhodně vyvolat stimulaci imunitní odpovědi, lépe pak imunitní odpovědi, která poskytuje ochranu vůči následné provokaci entitou, obsahující nebo zahrnující zmíněnou antigenní molekulu nebo její část a v důsledku toho předkládaný vynález nachází zvláštní využití jako způsobu vakcinace. Předkládaný vynález tedy s výhodou poskytuje způsob vakcinace, zahr20 nující metodu, která zde byla výše popsána.

V tomto aspektu předkládaného vynálezu je přenášená molekula definována jako odpovídající „antigenní molekule“. Antigenní molekulou může být jakákoliv molekula, pokud je taková molekula nebo její část schopna stimulovat imunitní odpověď pokud je prezentována imunitnímu sys25 tému patřičným způsobem. Antigenní molekulou bude tedy s výhodou vakcínový antigen nebo složka vakcíny, jako je entita obsahující polypeptid.

V oboru je známo mnoho takových antigenů nebo složek antigenních vakcín a zahrnují veškeré typy bakteriálních nebo virových antigenů nebo skutečných antigenů či antigenních složek jakýchkoliv patogenních druhů, včetně prvoků či vyšších organismů. Zatímco tradičně antigenní složky vakcín obsahovaly celé organismy (ať už živé, mrtvé nebo oslabené) tj. jednalo se o vakcíny s celými buňkami, široce byly studovány a v literatuře byly popsány také subbuněčné vakcíny, tj. vakcíny, založené na konkrétních antigenních složkách organismů, například proteinech či peptidech nebo dokonce cukrech. Jakákoliv taková složka „subbuněčné“ vakcíny může být pou35 žita jako antigenní molekula v předkládaném vynálezu. Ovšem tento vynález nachází zvláštní využití v oblastí peptidových vakcín.

Upřednostňovanou antigenní molekulou podle tohoto vynálezu je tedy peptid, (který je zde definován jako zahrnující peptidy o kratších i delších délkách řetězce, tj. peptidy, oligopeptidy nebo polypeptidy a rovněž proteinové molekuly nebo jejich fragmenty, například peptidy o 5 až 500, například 10 až 250, jako 15 až 75 nebo 8 až 25 aminokyselinách). Části antigenních molekul, které jsou předkládány nebo exprimovány, s výhodou zahrnují takové části, které jsou vytvářeny mechanismem zpracování antigenů (antigen-processing machinery) v buňce. Takové části mohou být ovšem vytvářeny i jinými způsoby, jako vhodnou úpravou antigenů (například vůči pH citlivé proužky) nebo pomocí jiných prostředků ke zpracování buňky. Výhodně mají takové části dostatečnou velikost pro vyvolání imunitní odpovědi, například v případě peptidů je to velikost větší než 5, například větší než 10 nebo 20 aminokyselin.

V literatuře bylo navrženo velké množství kandidátů na peptidové vakcíny, například pro léčbu virových onemocnění a infekcí jako AIDS/HIV infekce nebo chřipky, psích parvovirů, virů hovězí leukémie, hepatitidy a podobně (viz například Phanuphak se spoluautory, Asian Pac.

J. Allergy, Immunol. 15 (1), 4M8, 1997; Naruse, Hokkaido Igaku Zasshi 69 (4), 811-820, 1994; Casal se spoluautory, J. Virol. 69 (11), 7274-7277, 1995; Belyakov se spoluautory, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 95 (4), 1709-1714, 1998; Naruse se spoluautory, Proč. Nati. Acad. Sci. USA

21 (20), 9588-9592, 1994; Kabeya se spoluautory, Vaccine H (12), 1118-1122, 1996; Itoh se

- 15CZ 301427 B6 spoluautory, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83 (23), 9174-9178, 1986). Podobně mohou být použity bakteriální peptidy, stejné jako peptidové antigeny, které byly získány zjiných organismů nebo druhů.

Kromě antigenů získaných z patogenních organismů bylo rovněž navrženo použití peptidu jako vakcín vůči rakovině nebo jiným onemocněním, jako roztroušené skleróze. Například mutantní onkogenní peptidy jsou velmi nadějné jako rakovinné vakcíny, představující antigeny při simulaci cytotoxických T lymfocytů. (Schirrmacher, Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 121, 443-451, 1995; Curtis, Cancer Chemoterapy and Biologieal Response Modiflers ío 17, 316-327, 1997). Syntetická peptidová vakcína byla také hodnocena vzhledem ke vhodnosti pro léčbu metastatického melanomu (Rosenberg se spoluautory Nat, Med. 4(3), 321-327, 1998). Vakcína na bázi T-buněčného receptorového peptidu k léčbě roztroušené sklerózy je popsána Wilsonem a spoluautory v J, Neuroimmunol, 76(1-2), 15-28, 1997. Jakákoliv taková složka peptidové vakcíny může být použita jako antigenní molekula podle tohoto vynálezu, stejně jako kterýkoliv z peptidu, popsaných nebo navržených v literatuře jako peptidové vakcíny. Takový peptid může být tedy syntetický nebo izolovaný, či jinak získaný z organismu.

Buňkami, které jsou používány v těchto způsobech, použitích a podobně podle předkládaného vynálezu, mohou být jakékoliv buňky, které jsou schopné exprimovat nebo prezentovat na svém povrchu molekulu, která je podávána nebo přenášena do jejich cytosolu.

Vzhledem k tomu, že prvotní využití tohoto aspektu předloženého vynálezu spočívá v antigenní prezentaci nebo vakcinaci, buňkami jsou výhodně imunitní efektorové buňky, tj. buňky účastnící se imunitní odpovědi. Předkládat antigen imunitnímu systému však mohou i jiné buňky a ty rov25 něž patří do rozsahu tohoto aspektu vynálezu. Buňkami podle tohoto aspektu jsou tedy výhodně buňky předkládající (prezentující) antigen. Buňky prezentující antigen mohou být začleněny v kterékoliv části nebo „rameni“ imunitní odpovědi, zahrnující jak humorální, tak i buněčně zprostředkovanou imunitu, například stimulaci tvorby protilátek nebo stimulaci cytotoxických či zabíječských buněk, které mohou rozpoznat a zničit (nebo jinak eliminovat) buňky, exprimující „cizí“ antigeny na svém povrchu. Výraz „stimulující imunitní odpověď“ tedy zahrnuje všechny typy imunitních odpovědí a mechanismy jejich stimulace.

Stimulace cytotoxických buněk nebo buněk vytvářejících protilátky vyžaduje, aby byly antigeny, které mají být prezentovány buňkám, stimulovány konkrétním způsobem buňkami prezentujícími (předkládajícími) antigen, například v prezentaci MHC (hlavního histokompatibilního komplexu) třídy I (například aktivace CD8⁺ cytotoxických T-buněk vyžaduje antigenní prezentaci MHC-1).

Buňky prezentující antigen jsou v oboru známé ajsou popsány v literatuře; zahrnují například lymfocyty (jak buňky T, tak i buňky B), dendritické buňky, makrofágy a podobně. Další zahrnují

4o například rakovinné buňky, například buňky melanomu.

Pro prezentaci antigenů buňkou prezentující antigen cytotoxické buňce T (CTL) musí antigenní molekula vstoupit do cytosolu buňky prezentující antigen (Germain, Cell 76, 287-299, 1994). Předkládaný vynález poskytuje účinné prostředky pro dodání antigenní molekuly do cytosolu.

Jakmile je uvolněna do buněčného cytosolu procesem fotochemické intemalizace, může být antigenní molekula zpracována mechanismem zpracování antigenů v buňce a předložena, prezentována na buněčném povrchu vhodným způsobem, například prostřednictvím MHC třídy I. Takové zpracování může zahrnovat degradaci (rozklad) antigenů, například degradaci bílkovinného nebo polypeptidového antigenů na peptidy a tyto peptidy jsou pro prezentaci poté komplexovány s molekulami MHC, Antigenní molekulou, exprimovanou nebo předkládanou na povrchu buňky podle tohoto vynálezu, může tedy být část nebo fragment antigenní molekuly, která je přijmuta do buňky.

A

Antigeny mohou být přijmuty, pohlceny do buněk předkládajících antigeny endocytózou a degradovány v endocytámích měchýrcích na peptidy. Tyto peptidy se mohou vázat na molekuly MHC třídy II v endosomech a mohou být přenášeny na buněčný povrch, kde je komplex peptid-MHC třídy II rozpoznáván pomocnými T buňkami typu CD4⁺ a indukuje imunitní odpověď. Altemativ5 ně mohou být bílkoviny v cytosolu degradovány na části, například působením proteasomů a transportovány do endoplasmatického retikula prostřednictvím TAP (transportéru spojeného s předkládáním antigenu), kde se peptidy mohou vázat na molekuly MHC třídy I a být přenášeny na buněčný povrch tak, jak je znázorněno na Obr. I (Yewdell and Bennink, Adv. Immunol. 52, 1-123, 1992). Pokud je peptid původem cizorodým antigenem, bude komplex peptid-MHC třídy ίο I rozpoznáván cytotoxickými T-buňkami typu CD8⁺ (CTL). Tyto CTL se budou vázat na komplex peptid-MHC (HLA) třídy 1, čímž se aktivují, začínají proliferovat a vytvářejí klon CTL. Cílové buňky a jiné cílové buňky se stejným komplexem peptid-MHC třídy I na buněčných površích mohou být tímto klonem CTL usmrceny. Imunita vůči cizímu antigenu může být vytvořena tehdy, pokud lze do cytosolu zavést dostatečné množství antigenu (Yewdell and Bennink,

1992 viz výše; Rock, Immunology Today 17, 131-137, 1996). To je základem pro vývoj kromě jiného i rakovinných vakcín. Jedním z největších praktických problémů je zavedení dostatečných množství antigenu (nebo Částí antigenu) do cytosolu. To může být vyřešeno podle předkládaného vynálezu prostřednictvím PCI.

Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou rovněž obsahovat buňky obsahující přenášenou molekulu, která byla intemalizována do cytosolu zmíněných buněk způsobem podle tohoto vynálezu, pro použití k léčbě a zvláště k léčbě rakoviny, ke genové léčbě a vakcinaci.

Ještě dalším aspektem předkládaného vynálezu je poskytnutí buněk nebo populace buněk obsahujících přenášenou molekulu, která byla intemalizována do cytosolu zmíněných buněk a tyto buňky jsou získatelné způsobem podle předkládaného vynálezu. Ještě další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje použití takových buněk nebo populace buněk pro přípravu prostředku nebo léčiva k použití při léčbě, zvláště léčby rakoviny, genové léčbě nebo vakcinaci.

Tento vynález dále poskytuje způsob léčby pacienta, který zahrnuje podávání buněk nebo prostředků podle předkládaného vynálezu zmíněnému pacientovi, tj, způsob, zahrnující kroky zavedení molekuly do buněk tak, jak zde bylo popsáno výše a podávání takto připravených buněk zmíněnému pacientovi. Uvedené způsoby se s výhodou používají k léčbě rakoviny, v genové léčbě nebo pro vakcinaci.

In vivo může být použit jakýkoliv způsob podávání, který je v oboru běžný nebo standardní, například injikace, infuze, místní podání jak na vnitřní, tak i na vnější tělesné povrchy a podobně. Za podmínek in vivo může být tento vynález použit ve vztahu k jakékoliv tkáni obsahující buňky, do nichž jsou soustředěny fotosenzitizující činidlo a přenášená molekula, včetně tělních tekutin, stejně jako pevných tkání. Pokud je fotosenzitizer přijímán cílovými buňkami a může být patřičně dodáváno světlo, mohou být léčeny veškeré tkáně.

Prostředky podle předkládaného vynálezu tedy mohou být formovány jakýmkoliv vhodným způsobem, technikami a postupy známými v oboru farmacie, například za použití jednoho nebo více z farmaceuticky přijatelných nosičů nebo pomocných látek. Výraz „farmaceuticky přijatelný“, jak je zde používán, se týká přísad, které jsou slučitelné s dalšími přísadami prostředků, a jsou také fyziologicky přijatelné pro příjemce. Povaha prostředků a nosičů nebo pomocných látek, dávkování a podobně mohou být zvoleny rutinním způsobem podle přání a požadovaného způsobu podávání, účelu léčby a podobně. Dávkování může být obdobně stanoveno rutinním způ50 sobem a může záviset na povaze molekul, cíli léčby, věku pacienta, způsobu podávání a podobně. Ve spojení s fotosenzitizujícím činidlem by měla být rovněž uvažována možnost/schopnost rozrušit membrány při ozáření.

Vynález bude nyní popsán podrobněji v následujících Příkladech na něž se neomezuje a ve vztahu k doprovázejícím obrázkům.

- 17CZ 301427 B6

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 znázorňuje světlem indukovanou transfekci buněk THX s komplexem plasmidu a polylysinu, tedy komplexem pEGFP-N 1/polylysin, kde jsou buňky uvedeny do styku s komplexem pEGFP-Nl /pólylysin před tím, nebo poté, co jsou buňky vystaveny světlu, jak je označeno na obrázku.

Obr.2 znázorňuje světlem indukovanou transfekci buněk HCT-116 s komplexem pEGFPN1 /potylysin, kde jsou buňky uvedeny do styku s komplexem pEGFP-N 1/polylysin před tím, io nebo poté, co jsou buňky vystaveny světlu, jak je označeno na obrázku.

Obr. 3 znázorňuje světlem indukovanou léčbu (ovlivnění) buněk THX geloninem a tedy snížení syntézy proteinů, přičemž buňky jsou uvedeny do styku s molekulou geloninu před nebo po vystavení světlu, jak je označeno na obrázku.

Obr. 4 znázorňuje ovlivnění účinnosti světlem indukované transfekce buněk THX při uvedení buněk do styku s komplexem pEGFP-N 1/polylysin bezprostředně po vystavení světlu a v dalších časových intervalech po vystavení světlu.

Obr. 5 znázorňuje ovlivnění účinnosti světlem indukované transfekce buněk THX při uvedení buněk do styku s komplexem pEGFP-Nl/polylysin v různých časových okamžicích před a po vystavení světlu.

Obr. 6 znázorňuje ovlivnění účinnosti světlem indukované transfekce buněk THX při uvedení buněk do styku s komplexem pEGFP-N 1/pólylysin pro různá časová období po vystavení světlu.

Obr. 7 znázorňuje schématické nákres možného modelu jakým může fungovat předkládaný vynález.

jo A. I. fotosenzitizer S je endocytován (I) a končí v intracelulámích váčcích, vesikulech (II). Tyto váčky praskají při vystavení světlu (III).

B. Po fotochemickém ovlivnění, jak bylo popsáno v bodě A, jsou buňky léčeny nebo ovlivňovány molekulou M, která je endocytována a končí v intracelulámích váčcích. Tyto váčky se budou spojovat s fotochemicky poškozenými váčky a molekula M bude uvolňována do cytosolu.

Obr. 8 znázorňuje účinek ovlivnění buněk komplexem pEGFP-N 1/polylysin při 0 °C na transfekcí.

Obr. 9 znázorňuje světlem indukovanou transfekci komplexu pEGFP-N 1/polylysin, pokud se

3-THPP, který není převážně lokalizován v endacytárních měchýřcích, použije jako fotosenzitizuj ící činidlo.

Obr. 10 znázorňuje účinek kombinace fotosenzitizéru a světelného ovlivnění na transfekci buněk s kationtovými lipidy.

Obr. 11 znázorňuje účinek fotochemického ovlivnění na transdukci buněk THX adenovirem.

Obr. 12 znázorňuje účinek fotochemického působení na nitrobuněčnou (intraceluiámí) lokalizaci FITC-dextranu. Buňky THX byly po dobu 18 hodin inkubovány s AlPcSi_a v koncen50 traci 20 pg/ml a následně 4 hodiny v médiu bez přítomnosti AIPcS?_a, Poté byly buď vystaveny ovlivnění světlem po dobu 4 minut (B, D) nebo ponechány ve tmě (A, C) a následně byly 3 hodiny inkubovány s FITCdextranem o koncentraci 5 mg/ml. Na mikrosnímcích je fluorescence (A, B) a fázový kontrast (C, D).

- 18CZ 301427 B6

Obr. 13 znázorňuje účinek fotochemického působení na toxicitu geloninu u buněk THX aHCTlló. Pri strategii „osvit předem“ byly buňky nejprve 18 hodin inkubovány s AlPcS_2av koncentraci 20 pg/ml a následně 4 hodiny v médiu bez přítomnosti AlPcS_2a před vystavením světlu, jak je vyznačené na obrázku. Po ozáření byl přidán gelonin v koncentraci 1 pg/ml a buňky byly inkubovány po dobu 18 hodin. Při strategii „osvit následně“ byly buňky před vystavení světlu, jak je vyznačené na obrázku, 18 hodin spoluinkubovány s AIPcS_2a v koncentraci 20 pg/ml a s geloninem v koncentraci 1 pg/ml. Kontrolní buňky byly ovlivněny pouze inkubací s geloninem v koncentraci l pg/ml po dobu 18 hodin a poté byly vystaveny světlu; nebo pouze 18 hodinovou inkubací s AIPcS_2a v koncentraci 20 pg/ml s následnou 4 hodinovou inkubací v médiu bez přítomnosti AIPcS_2a a poté byly vystaveny světlu. Inkorporace [³H]-leucinu do proteinů byla měřena další den po ovlivnění světlem a byla vyjádřena jako poměrná, relativní syntéza proteinů. Referenční body představují průměrné hodnoty ± střední chybu průměru tří souběžných měření.

Obr. 14 znázorňuje účinek fotochemického ovlivnění na expresi β-galaktosidázy v buňkách THX, infikovaných prostřednictvím AdHCMV-lacZ, Pri strategii „osvit předem“ byly buňky předem ovlivněné AIPcS?_a inkubovány po další 4 hodiny v médiu bez přítomnosti AIPcS_2a a poté vystaveny světlu na dobu 3 minut. Po ozáření byly buňky během 30 minut pri 37 °C infikovány AdHCMV-lacZ (pri MOI 1). Následně byly přidány 2 ml média a buňky byly dva dny inkubovány před analyzováním exprese β-galaktosidázy. Při strategii „osvit následně“ byly buňky předem ovlivněné AIPcS_2a inkubovány po další 3 hodiny v médiu bez přítomnosti AIPcS_2a a během 30 minut byly infikovány AdHCMV-lac. Následně byly přidány 2 ml média a buňky byly inkubovány dalších 30 minut a následně ozářeny v trvání 3 minut. O dva dny později byla analyzována exprese β-galaktosidázy.

Obr. 15 znázorňuje účinek doby inkubace na účinnost světlem indukované transfekce s pEGFP/polylysinem u buněk THX a HCT 116. Buňky předem ovlivněné AIPcS_2a byly promyty a inkubovány po další 4 hodiny v médiu bez přítomnosti AIPcS_2a a poté vystaveny světlu na dobu 3 minut (buňky THX) nebo 7 minut (buňky HCT). Po ozáření byl přidán komplex pEGFP/polylysin (plasmid v koncentraci 5 pg/ml) a buňky byly inkubovány po různé časové úseky, vyznačené na obrázku. Po odstranění komplexu bylo přidáno čerstvé médium bez obsahu komplexu a buňky byly před stanovením exprese EGFP inkubovány v tomto médiu další dva dny.

Obr. 16 znázorňuje účinek strategie PCI s osvitem předem na transfekci buněk THX, zprostředkovanou poly-L-lysinem, za použití TPPS_2a jako fotosenzitizeru, ve srovnání se strategií následovného osvitu, při použití různých dob ozáření (osvitu), PLL-L: ozáření po přídavku komplexu pEGFP-Nl/PLL. L-PLL: ozáření před přidáním komplexu pEGFP-Nl/PLL. Prázdné sloupce bez osvitu; šrafované sloupce - ozáření po dobu 70 sekund, plné sloupce - ozáření po dobu 100 sekund. PLL = póly lysin.

Obr. 17 znázorňuje účinek strategie PCI s osvitem předem na transfekci buněk THX, zprostředkovanou poly-L-lysinem, za použití TPPS₄ jako fotosenzitizeru, ve srovnání se strategií následovného osvitu, pri použití různých dob ozáření (osvitu). PLL-L: ozáření po přídavku komplexu pEGFP-Nl/PLL. L-PLL: ozáření před přidáním komplexu pEGFP-Nl/PLL. Prázdné sloupce bez osvitu; šrafované sloupce - ozáření po dobu 70 sekund, plné sloupce - ozáření po dobu 100 sekund.

Obr. 18 znázorňuje účinek strategie PCI s osvitem předem na transfekci buněk HCT 116, zprostředkovanou poly-L-lysinem, za použití TPPS_2a jako fotosenzitizeru, ve srovnání se strategií následovného osvitu, při použití různých dob ozáření (osvitu). PLL-L: ozáření po přídavku komplexu pEGFP-Nl/PLL. L-PLL: ozáření před přidáním komplexu pEGFP-Nl/PLL. Prázdné sloupce - bez osvitu; šrafované sloupce - ozáření po dobu 70 sekund, plné sloupce - ozáření po dobu 100 sekund.

- 19CZ 301427 B6

Obr. 19 znázorňuje účinek strategie PCI s osvitem předem na transfekci buněk HCT116, zprostředkovanou póly—L—lysinem, za použití TPPS₄ jako fotosenzitizeru, ve srovnání se strategií následovného osvitu, při použití různých dob ozáření (osvitu). PLL-L: ozáření po přídavku komplexu pEGFP-Nl/PLL. L-PLL: ozáření před přidáním komplexu pEGFP-Nl/PLL. Prázdné sloupce - bez osvitu; vodorovně šrafované sloupce - ozáření po dobu 1,5 minuty, svisle šrafované sloupce - ozáření po dobu 2 minut, plné sloupce - ozáření po dobu 3 minut.

Obr. 20 znázorňuje účinek strategie PCI s osvitem předem na transfekci zprostředkovanou DOTAP, za použití TPPS₄ jako fotosenzitizeru, ve srovnání se strategií následovného osvitu, při jo použití různých dob ozáření (osvitu). DOTAP-L: ozáření po přídavku komplexu pEGFP-Nl/DOTAP. L-DOTAP: ozáření před přidáním komplexu pEGFP-Nl/DOTAP, Prázdné sloupce

- bez osvitu; šrafované sloupce - ozáření po dobu 70 sekund, plné sloupce - ozáření po dobu

100 sekund.

Obr, 21 znázorňuje účinek strategie PCI s osvitem předem na transfekci zprostředkovanou

SuperFeet\ za použití TPPS_2a jako fotosenzitizeru, přičemž byly použity různé doby ozáření a transfekce a měnilo se i množství DNA pro transfekci. Plné čtverečky - transfekce po dobu 1 hodiny s 0,75 pg DNA; plné trojúhelníčky - transfekce po dobu 4 hodin s 0,75 ng DNA; prázdná kolečka - transfekce po dobu 1 hodiny s 1,55 pg DNA.

Obr. 22 znázorňuje účinek strategie PCI s osvitem předem na transfekci zprostředkovanou genovou transdukci buněk HCT 116 za použití AIPcS_2a jako fotosenzitizeru, přičemž virus byl přidáván v různých časech. Procentní množství transdukovaných buněk, vzniklých za přidání viru v různých časových bodech, bylo analyzováno průtokovou cytometrií, jak je popsáno v Pří25 kladech. Časové body přidání virových komplexů jsou vyznačeny na obrázku. Časové body na levé straně osy Y představují virus přidávaný před ozářením, časové body na pravé straně osy Y představují virus přidávaný po ozáření. Plné čtverečky - 1 minutové ozáření; prázdné čtverečky bez ozáření.

Obr. 23 znázorňuje účinek strategie PCI s osvitem předem na transfekci buněk HCT 116 zprostředkovanou poly-D-ly sinem, za použití AIPcS_2a jako fotosenzitizeru, přičemž se lišily doby ozáření.

Obr. 24 znázorňuje účinek strategie PCI s osvitem předem na usmrcení buněk cytostatickým činidlem bleomycinem, za použití TPPS_2a jako fotosenzitizeru, přičemž se množství bleomycinu, doby ozáření a doby transfekce lišily. Prázdné kosočtverce: 5 TPPS-, 1 h = 5 μπιοΙ.Γ¹ bleomycin, bez TPPS2a, inkubace 1 hodina; plné kosočtverce: 5 TPPS1, lh = 5 μπιοΐ.1 ¹ bleomycin, s TPPS2a, inkubace 1 hodina; prázdné trojúhelníčky: 25 TPPS-, 1 h - 25 μιηοΙ.Γ¹ bleomycin, bez TTPS2a, inkubace 1 hodina; plné trojúhelníčky: 25 TPPS+, lh = 25 μιηοΙ.Γ¹ bleomycin, sTPPS2a, inkubace 1 hodina; prázdné čtverečky: 100TPPS-, 1 h = ΙΟΟμιηοΙ.Ι ¹ bleomycin, bez TPPS2a, inkubace 1 hodina; plné čtverečky: 100 TPPS+, lh = 100 μπΊοΙ.Γ¹ bleomycin, s TPPS2a, inkubace 1 hodina; prázdná kolečka: 100 TPPS-, 4 h = 100 μιηοΙ.Γ¹ bleomycin, bez TPPS2a, inkubace 4 hodiny; plná kolečka: 100 TPPS+, 4h - 100 μιηοΙ.Γ¹ bleomycin, s TPPS2a, inkubace 4 hodiny.

Obr. 25 znázorňuje účinek PCI s geloninem na léčbu nádorů u myšího modelu in vivo. Léčené skupiny byly následující: prázdný trojúhelníček: pouze gelonin; plný čtvereček: placebová léčba injikací fosfátem pufrovaného solného roztoku (PBS) v kombinaci s ozářením; prázdné kosočtverce: pouze fotochemické ovlivnění (tj. AIPcS_2a + světlo), bez geloninu; plná kolečka: plná léčba PCI s geloninem (tj. AlPcS_2a + gelonin + světlo).

_ on _

Příklady provedení vynálezu

Materiály a metody

Buněčné linie

Buněčná linie lidského melanomu THX byla vytvořena z nádorové tkáně, získané od pacientů léčených na metastázující maligní melanom v zařízení „Norwegian Radium Hospital“ (Aamdal se spoluautory, Int. J. Cancer 37, 579, 1986) a pěstována v kultivačním médiu RPMI 1640 ío (Gibco-BRL), doplněném 10 % fetálním telecím sérem (FCS, Gibco-BRL) a 2 mmol.Γ¹glutaminem (Gibco-BRL). Buněčná linie lidského karcinomu tlustého střeva HCT116 byla získána z americké sbírky kultur (American Type Culture Collection, ATCC č. CCL-247) a byla pěstována v kultivačním médiu RPMI 1640, doplněném 10% fetálním telecím sérem, penicilinem v koncentraci 100 Lf/ml, streptomycinem v koncentraci 100 U/ml a 2 mmol.L¹ glutaminem (všechny reagencie Gibco-BRL, Paisley, Velká Británie).

Ozáření

K ovlivnění buněk byly použity dva odlišné světelné zdroje, přičemž oba sestávaly se série čtyř fluorescenčních trubic. Buňky ovlivňované (léčené) působením TPPS4, TPPS_2a a 3-THPP (Porphyrin Products, Logan, UT) byly vystaveny modrému světlu (model 3026; Appl. Photophysics, London, Velká Británie) se světelnou intenzitou působící na buňky 1,5 mW/cm²; zatímco buňky ovlivňované (léčené) prostřednictvím AIPcS2_a (Porphyrin Products, Logan, UT) byly vystaveny červenému světlu (Philips TL 20W/09), filtrovanému průchodem přes filtr Cinemoid

35, se světelnou intenzitou působící na buňky 1,35 mW/cm².

Fluorescenční mikroskopie

Buňky byly analyzovány fluorescenční mikroskopií tak, jak popisuje K. Berg se spoluautory v Biochem. Biophys. Acta 1370, 317-324, 1998. Pro analýzu fluoresceinem označených molekul byl mikroskop vybaven excitačním filtrem v rozsahu 450 až 490 nm, rozdělovačem dichroického paprsku (dichroic beam splitter) při vlnové délce 510 nm a emisním filtrem procházejícího pásu 510 az 540 nm,

Příprava komplexů plasmid-pLys a ovlivnění (léčba) buněk

Komplexy plasmid-pLys (poměr náboje 1,7; jak popisuje Berg se spoluautoiy v Cancer Res. 59, 1180-83, 1999) byly připraveny jemným smícháním 5 pg plasmidu (pEGFP-Nl; Clontech Laboratories, lne., Palo Alto, CA) v 75 pl HBS s 5,3 pg pLys (o molekulové hmotnosti 20 700;

Sigma, St Louis, MO) v 75 pl HBS. Roztoky byly inkubovány 30 minut při teplotě místnosti, naředěny kultivačním médiem a poté přidány k buňkám.

Buňky THX byly nejprve 18 hodin inkubovány při teplotě 37 °C sAIPcS_2a v koncentraci 20 pg/ml, poté byly promyty a inkubovány v médiu bez senzitizačního činidla další 3 hodiny, po nichž následovala inkubace s komplexy plasmid-pLys v trvání 1 hodiny a pak vystavení světlu. Alternativně byly buňky po inkubaci s AIPcS_2a promyty a inkubovány v médiu bez senzitizačního činidla další 4 hodiny, po nichž následovalo vystavení světlu a inkubace s komplexy plasmid-pLys v trvání 1 hodiny. Před analýzou exprese GFP, prováděnou průtokovou cytometrií, byly buňky inkubovány 2 dny při teplotě 37 °C.

Buňky HCT-116 byly 18 hodin inkubovány s AlPcS_2a v koncentraci 20 pg/ml, promyty a inkubovány 4 hodiny bez přítomnosti AlPcS_2a před vystavením světlu. Bezprostředně před nebo po vystavení světlu byly buňky 4 hodiny ovlivňovány (léčeny) komplexem pEGFP-NI. Po 2 dnech inkubace při 37 °C byla exprese GFP studována průtokovou cytometrií.

-21 CZ 301427 B6

Analýza průtokovou cytometrií

Buňky byly trypsinizovány, odstředěny, res uspěn dovány ve 400 μΐ kultivačního média azfiltrovány přes nylonový filtr o velikosti otvorů 50 pm. Poté byly buňky analyzovány za použití průto5 kového cytometru FACS-Calibur (Becton Dickinson), Pro každý vzorek bylo shromážděno 1000 výsledků. Flouresceinová fluorescence (například zelená fluorescentní bílkovina, GFP, green Fluorescent protein) byla měřena přes 510 až 530 nm filtr po excitaci argonovým laserem (200 mW), vyladěným na 488 nm, AlPcS_2a bylo měřeno přes podlouhlý průchozí filtr 670 nm po excitaci diodovým laserem (50 mW), vyladěným na 635 nm. Buněčné dublety a mrtvé buňky io byly od jednotlivých živých buněk odlišeny na základě průstupnosti (gating). Hodnoty byly analyzovány za použití programu CELL Quest Software (Becton Dickinson).

Příklad 1

Světlem indukovaná transfekce jako funkce světelné dávky

Buňky THX byly 18 hodin ovlivňovány AIPcSsa v koncentraci 20 pg/ml, poté byly promyty a inkubovány v médiu bez senzitizačního činidla další 3 hodiny, po nichž následovala inkubace

2o s 5 pg komplexu plasmid-pLys v trvání 1 hodiny a pak vystavení světlu na 1, 2, 3 nebo 4 minuty. Alternativně byly buňky po inkubaci s AlPcS_2a promyty a inkubovány 4 hodiny v médiu bez senzitizačního činidla před ovlivněním světlem po dobu 1,2, 3 nebo 4 minut a následnou inkubací s komplexem pEGFP-Nl/pólylysinu v trvání I hodiny, jak je znázorněno na Obr. 1. Poměr náboje pEGFP-Nl/polylysinového komplexu byl 1,7.

Výsledky jsou znázorněny na Obr. 1 a je zjevné, že transfekce GFP je stejně účinná, pokud se komplex plasmid-pLys (tj. pEGFP-Nl/polylysin) přidá k buňkám raději po vystavení světlu než před vystavením světlu. Rovněž je zřejmé, že při obou způsobech ovlivnění závisí procento transferovaných buněk na délce vystavení buněk světlu, přičemž maximální procentní úrovně je dosaženo kolem 2 minut a poté se snižuje.

Příklad 2

Exprese GFP u buněk HCT-116

Buňky HCT-116 byly před vystavením světlu inkubovány 18 hodin sAlPcS_2a v koncentrací 20 pg/ml a následně 4 hodiny bez přítomnosti AlPcS_2a. Bezprostředně před nebo po vystavení světlu byly buňky 4 hodiny ovlivňovány komplexem pEGFP-Nl/póly lysin, jak je znázorněno na

Obr. 2. Exprese GFP byla měřena průtokovou cytometrií 2 dny po vystavení světlu.

Výsledky jsou znázorněny na Obr. 2 a je zjevné, že podobně jako u transfekce buněk THX v Příkladu 1, je i transfekce GFP stejně účinná, pokud se komplex plasmid-pLys (tj. pEGFP-Nl/polylysin) přidá k buňkám raději po vystavení než před vystavením světlu. Procentní množství trans45 fektovaných buněk se opět liší v závislosti na délce vystavení buněk světlu.

Příklad 3

Syntetické účinky přidání geloninu před fotochemickým ovlivněním a po něm

Gelonin je rostlinný toxin, který, pokud je přítomný v cytosolu buněk, účinně inhibuje syntézu proteinů. Buňky THX byly před vystavením světlu inkubovány 18 hodin s AlPcS_2a v koncentraci 20 pg/ml a následně 4 hodiny bez přítomnosti senzitizačního činidla. Buňky byly buď ovlivňoCZ 301427 B6 vány současným působením AlPcS_2a a geloninu v koncentraci l pg/ml, nebo byl gelonin (1 pg/ml) bezprostředně po vystavení světlu přidán do média na dobu 18 hodin a poté byl z média odstraněn. Syntéza proteinů byla měřena 24 hodin po vystavení světlu.

Výsledky jsou znázorněny na Obr, 3 a je zřejmé, že ačkoli samotné fotochemické působení v nepřítomnosti geloninu vede k určitému snížení syntézy proteinů, přítomnost geloninu, ať už před nebo po fotochemickém působení, indukuje významně vyšší inhibicí syntézy proteinů. Tyto údaje ukazují, že gelonin je intemalizován do buněk, ať už je uveden do styku s buňkami před fotochemickým působením, nebo po něm.

io

Příklad 4

Účinek doby prodlevy na světlem indukovanou transfekci

Buňky THX byly inkubovány 18 hodin s AlPcS_2a v koncentraci 20 pg/ml, promyty a následně inkubovány 4 hodiny bez přítomnosti senzitizačního činidla; pak byly vystaveny světlu po dobu 3 minut. V růstovém médiu byly buňky inkubovány po doby, uvedené v Obr. 4 a následně byly ovlivněny komplexem pEGFP-Nl/polylysin (poměr náboje 1,7) v trvání 1 hodiny. Exprese GFP byla analyzována průtokovou cytometrií 48 hodin po vystavení světlu.

Výsledky jsou znázorněny na Obr. 4 a je zřejmé, že pro dosažení nejlepšího výsledku by molekuly, které mají být intemalizovány, měly být vystaveny buňkám brzo po fotochemickém působení, neboť transfekce účinkem pEGFP-Nl klesá s poločasem přibližně 5 hodin po vystavení světlu.

Příklad 5

Účinnost transfekce jako funkce transfekčního impulzu, vztahujícího se k ozáření

Buňky THX byly inkubovány 18 hodin s AlPcS_2a v koncentraci 20 pg/ml, promyty a následně inkubovány 4 hodiny bez přítomnosti senzitizačního činidla. Buňky obdržely impuls (v trvání 0,5 hodiny nebo 1 hodina, přičemž šířka sloupce na Obr. 5 odráží počátek a konec působení) ovlivnění prostřednictvím komplexu pEGFP-Nl/polylysin buď před tříminutovým vystavením světlu (záporné hodnoty na ose x) nebo po něm (kladné hodnoty na ose x). Exprese GFP byla analyzována průtokovou cytometrií 48 hodin po vystavení světlu. Údaje z několika pokusů byly normalizovány tak, že účinnost transfekce provedené právě před vystavením světlu nebo právě po něm byla považována za 100 %.

Výsledky jsou znázorněny na Obr. 5 a je zřejmé, že pro nej lepší účinnost transfekce by buňky měly být vystaveny molekulám, které mají být intemalizovány, buď krátce před vystavením světlu, nebo krátce po něm.

Příklad 6

Světlem indukovaná transfekce - závislost na době inkubace s komplexem pEGFP-Nl/polylysin

Buňky THX byly inkubovány 18 hodin s AlPcS_2a v koncentraci 20 pg/ml, promyty a následně 50 před vystavením světlu inkubovány 4 hodiny bez přítomnosti senzitizačního činidla. Pak byly inkubovány s komplexem pEGFP-Nl /polylysin (poměr náboje 1,7). v trvání až do 6 hodin, jak je znázorněno na Obr. 6A. Exprese GFP byla analyzována průtokovou cytometrií 48 hodin po vystavení světlu. Počet buněk exprimujících GFP po takovém ovlivnění je znázorněn na Obr. 6B a specifičnost různých ovlivnění je znázorněna na Obr. 6C.

-23CZ 301427 B6

Výsledky jsou znázorněny na Obr. 6 a je zřejmé, že ačkoli se počet transfektovaných buněk zvyšuje s rostoucí dobou inkubace s komplexem pEGFP-Nl/polylysin (Obr. 6B), nejvyšší specifičnost transfekce se uplatňuje po nejkratších dobách inkubace (Obr. 6C),

Příklad 7

Ovlivnění komplexem pEGFP-Nl/polylysin při 0 °C io Tento pokus byl navržen k testování toho, zda fotochemické ovlivnění může vést k menšímu poškození buněčných membrán, což by znamenalo, že plasmid přivedený do styku s buňkami po ovlivnění světlem by mohl proniknout plasmatickou membránou.

Buňky THX byly inkubovány 18 hodin s AIPcS_2a v koncentraci 20 pg/ml, promyty a následně is inkubovány 4 hodiny bez přítomnosti senzitizačního činidla před vystavením světlu. Následně byly okamžitě inkubovány s komplexem pEGFP-Nl/polylysin (poměr náboje 1,7) 45 minut při teplotě 0 °C. Pak byly buňky buď: A) trypsinizovány a zaočkovány aniž by byly převedeny na ⁹C; nebo B) převedeny na teplotu 37 °C bez trypsinizace. Buňky byly vystaveny světlu tak, jak je uvedeno na Obr. 8. Exprese GFP byla analyzována průtokovou cytometrií 48 hodin po vystavení buněk světlu.

Po 45 minutové inkubací buněk při 0 °C s komplexem pEGFP-Nl/polylysin bude komplex přilepen na jejich buněčný povrch, ale nebude endocytován. Při popisovaném pokusu byly buňky THX následně buď inkubovány při 37 °C v médiu bez přítomnosti plasmidu (Obr. 8B) nebo trypsinizovány (Obr. 8A) k odstranění plasmidu z povrchu a byly zaočkovány do nových misek při teplotě 37 °C. Výsledky ukazují, že komplex plasmid/polylysin po fotochemickém působení neproniká plasmatickou membránou.

Příklad 8

Kombinace 3-THPP a světla s ovlivněním komplexem pEGFP-Nl/polylysin

Buňky THX byly ovlivňovány 18 hodin působením 3-THPP v koncentraci 0,25 pg/ml, následně byly promyty a inkubovány před vystavením světlu 4 hodiny v médiu bez přítomností senzitizačního činidla. Bezprostředně poté byly inkubovány 1 hodinu s komplexem pEGFP-Nl/pólylysin (poměr náboje 1,7). Buňky byly vystaveny světlu tak, jak je uvedeno v Obr. 9 a exprese GFP byla analyzovány průtokovou cytometrií 48 hodin po vystavení buněk světlu.

3-THPP je fotosenzitizujícím činidlem, jehož hlavní lokalizace není v endosomech nebo v lysosomech. Výsledky znázornění na Obr. 9 ukazují, že ovlivnění buněk prostřednictvím 3-THPP před ozářením indukuje pouze menší zvýšení exprese GFP ve srovnání s výsledky, uvedenými v předchozích Příkladech, v nichž byl jako fotosenzitizuj ící činidlo použit AlPcS_2a (disulfonovaný hlinitý ftalocyanin). To ukazuje, že výhodné může být takové fotosenzitizuj ící činidlo, které je lokalizováno v endosomech a lysosomech.

Příklad 9

Kombinace fotosenzitizeru a předběžného ovlivnění světlem umožňuje transfekci buněk za použití kationtových lipidů

Buňky HCT 116 byly zaočkovány v hustotě 75 000 buněk na jamku do 12 jamkových destiček jeden den před prováděním pokusu. Buňky byly 18 hodin inkubovány s fotosenzitizerem AlPcS_2a (20 pg/ml), pak následovala prodleva v trvání 7 hodin v médiu bez přítomností fotosenzitizační. 74 .

ho činidla a poté byly buňky vystaveny na 7 minut červenému světlu. Pak byly tyto buňky ínkubovány s komplexem kationtového lipidu DOTAP (DOTAP byl získán od firmy Boehringer) splasmidem pEGFP-Nl (5:1 DOTAP/plasmid, 1 pg/ml pEGFP-Nl) po dobu 3 hodin, promyty růstovým médiem a ínkubovány 21 hodin při 37 °C před tím, než byla exprese EGFP měřena průtokovou cytometrií tak, jak je popsáno v Materiálech a metodách. Kontrolní buňky nebyly vystaveny světlu, ale jinak bylo jejich ovlivnění shodné.

Výsledky jsou znázorněné na Obr. 10 a je zřejmé, že působení PCI zvyšuje účinnost transfekce s komplexem DOTAP/plasmid přibližně čtyřnásobně.

io

Příklad 10

Účinek PCI na transdukci buněk THX adenovirem

Materiál

Di-p-D-galaktopyranosid fluoresceinu (FDG) byl získán od firmy Molecular Probes (F-l 179). Zásobní roztok v koncentraci 20mmol.r^l byl připraven rozpuštěním prášku v poměru 1:1 ve směsi DMSO (dimethylsulfoxid)/ethanol. Směs byla postupně přidávána do příslušného objemu ledově studené vody k vytvoření soustavy voda/DMSO/ethanol v poměru 8:1:1.

Rekombinantní virus AdCA171acZ byl vytvořen a propagován v lidské buněčné linii 293, tedy linii Ad El-transformovaných embryonálních ledvinných buněk, uchovávané v minimálním esenciálním médiu MEM F-l 1, doplněném 10% fetálním telecím sérem, penicilinem (100 U/ml, Gibco-BRL), streptomycinem (0,1 mg/ml, Gibco-BRL) a glutaminem (2 mmoLf¹).

Konstrukce rekombinantního viru

Rekombinantní adenovirus AdCA171acZ, kódující lacZ gen E. coli pod kontrolou lidského promotoru CMV, byl získán homologní rekombinací za použití systému pJMl7 v 293 buňkách (Addíson se spoluautory, J. Gen. Virol. 78, 1653-1661, 1997). Rekombinantní vektory byly plakově čištěny, pěstovány do vysokého titru v 293 buňkách a čištěny gradientem chloridu česného, jak bylo popsáno dříve (Hitt se spoluautory, Methods in Mol. Genetics 7,15-30, 1995).

Senzitizace buněk

Buňky THX (4 χ 10⁵ buněk) byly zaočkovány na misky o průměru 6 cm a ponechány růst přes noc. Při přibližně 60% konfluenci (souběžném růstu) bylo růstové médium nahrazeno 2 ml růsto40 vého média, doplněného AlPcS_2a v koncentraci 20 pg/ml a misky byly umístěny na 16 až 18 hodin zpátky do inkubátoru. Médium obsahující senzitizační činidlo pak bylo odsáto a buňky byly ínkubovány alespoň 4 hodiny v běžném růstovém médiu před ovlivněním světlem a infikací virem.

Infikace buněk

K uvolnění buněk ze tri misek byla použita soustava trypsin-EDTA a průměrný počet buněk v miskách byl vypočítán za použití Burcherovy komůrky. Naredění adenoviru bylo připraveno vPBS sCaCl₂ (0,68 mmol.Γ¹) a MgCl₂ (0,5 mmol.Γ¹) podle počtu buněk, které měly být infikovány. Buňky byly obvykle infikovány při m.o.i. (multiplicity of ínfection, násobnosti infekce) 1 a 10.

Před přidáním viru byly buňky vystaveny červenému světlu (Philips TL 20W/09, filtrovanému přes filtr Cinemoid 35, se světelnou intenzitou působící na buňky 1,35 mW/cmj po dobu

3 minut. Následně bylo médium odsáto a do každé misky bylo přidáno 200 μΙ virové suspenze

-25CZ 301427 B6 (nebo PBS s 0,68 mmol.l'¹ CaCl2 a 0,5 mmol.l ¹ MgCl2 v případě kontrol neovlivňovaných virem). Po inkubaci probíhající 30 minut při 37 °C bylo přidáno 5 ml obvyklého růstového média a buňky byly ponechány růst 48 hodin.

Stanovení β-galaktosídázy

Buňky byly uvolněny působením trypsinu/EDTA a resuspendovány v 5 ml růstového média. Po odstředění (5 minut, 1000 otáček za minutu) bylo médium odsáto, buněčný pelet byl resuspendován v 50 μί růstového média a zkumavky byly na 5 minut umístěny do vodní lázně o teplotě io 37 °C.

Následně bylo do zkumavek přidáno 50 μΐ 2 mmol.l·¹ roztoku FDG, předem zahřátého na teplotu 37 °C a zkumavky byly vráceny na 1 minutu do vodní lázně. Nakonec bylo přidáno 900 μΐ růstového média a zkumavky byly inkubovány 30 až 60 minut v ledu před analýzou vzorků průtokovou cytometrií, jak bylo popsáno výše.

Buňky THX byly ovlivněny AlPcS_2a (označeném na Obr. 11 jako PS) a adenovirem (označován na Obr. 11 jako „virus“) a na 3 až 4 minuty byly vystaveny světlu tak, jak bylo popsáno v odstavci Materiál a metody. Aktivita β-galaktosidázy (β—gal) byla měřena průtokovou cytometrií.

Celková aktivita β—gal byla kvantifikována sloučením (integrací) buněk, které jsou vzhledem k β—gal positivní a jejich β-galaktosidázové aktivity. Jak počet buněk, které jsou vzhledem k β—gal positivní, tak i průměrná β-galaktosidázová aktivita byly účinkem PCI zvýšeny.

Výsledky ukazují, že k minimální infikací buněk THX dochází při inkubaci buněk se samotným virem nebo s virem a s fotosenzitizujícím činidlem, a že fotochemické ovlivnění, tj. přídavek světla k fotosenzitizujícímu činidlu, významně zesiluje transdukci buněk (jak je prokázáno zvýšením (3-galaktosidázové aktivity).

Příklad 11

Účinek fotochemického ovlivnění na intracelulámí (nitrobuněčnou) lokalizaci molekuly označující endocytózu

Buňky THX byly zaočkovány na misky Falcon 3 001 (2,5 x 10⁴ buněk na misku) a další den byly hodin ovlivňovány působením AlPcS_2a v koncentraci 20 pg/ml, promyty k odstranění AlPcS_2aa inkubovány v médiu bez obsahu AIPcS_2a po dobu 4 hodin. Poté byly buňky na 4 minuty vystaveny světlu a následně inkubovány 3 hodiny sendocytámím markérem FITC-dextranem v koncentraci 5 mg/ml. Neozářené buňky byly ovlivňovány obdobně, s výjimkou ozáření. Intra40 celulámí lokalizace FITC-dextranu v uvolněných buňkách byla pozorována fluorescenčním mikroskopem Zeiss Axioplan (Oberkochen, Německo) za použití objektivu pro 63-násobné zvětšení, excitačního filtru pro oblast 540 až 490 nm a emisního filtru pro oblast 510 až 540 nm. Fluorescenční mikrosntrnky byly zaznamenávány pomocí chlazené CCD (charge-coupled device) kamery (Photometric lne., Tuscon, AZ).

Výsledky znázorněné na Obr. 12 ukazují, že PCI s vynaložením světla před inkubací s fluorescenčním endocytámím markérem FITC-dextranem posunuje lokalizaci tohoto markéru (označující sloučeniny) z endocytámích měchýřků (body viditelné v části 12A pro neozářené buňky) do cytosolu (difusní fluorescence, viditelná v části 12 B u ozářených buněk). Pokud je tedy ovliv50 není světlem provedeno před přídavkem makromolekuly, která má být interna! izována, je taková makromolekula velmi rychle převedena do cytosolu, což podstatně snižuje možnosti lysosomálního odbourání (degradace) takové molekuly.

-26CZ 301427 B6

Příklad 12

Účinky fotochemického ovlivnění na geloninovou toxicitu v buňkách THX a HCT-116

Gelonin je rostlinný toxin, který účinně inhibuje syntézu proteinů, pokud je přítomný v cytosolu buněk, ale který není schopen se do cytosolu sám o sobě dostat a proto je celkem netoxický pro nenarušené, intaktní buňky. Pro ovlivnění geloninem bylo 25 x IQ³ buněk na jamku zaočkováno na destičky o 24 jamkách (Nunc, Dánsko). Další den byl přidán AlPcS_2a a buňky byly 18 hodin inkubovány při 37 °C. Veškeré postupy po přidání AlPcS_2a byly prováděny při utlumeném světle. Při strategii „osvit předem“ byly buňky promyty k odstranění AlPcS_2a a inkubovány v médiu bez obsahu AlPcS_2a po dobu 4 hodin. Poté byly buňky vystaveny světlu (jak je označeno na obrázcích) a následně byly 18 hodin ovlivňovány geloninem v koncentraci 1 pg/ml. U strategie „osvit následně“ byly buňky 18 hodin inkubovány společně s AlPcS_2a v koncentraci 20 μg/ml i s geloninem v koncentraci 1 pg/ml a poté byly promyty a vystaveny světlu tak, jak je označeno na obrázku.

Neozářené buňky byly ovlivňovány obdobným způsobem s výjimkou ozáření. Ovlivňované buňky byly jednou promyty kultivačním médiem a po přidání Čerstvého média byly inkubovány při teplotě 37 °C až do další analýzy. Inhibice syntézy proteinů byla stanovována inkorporací [³H]leucinu do proteinu 24 hodin po vystavení světlu. Ozáření bylo provedeno ze světelné lavice se čtyřmi světelnými trubicemi (Philips TL 20W/09) a podlouhlým průchozím filtrem pro oblast 550 až 600 nm. Světelná intenzita působící na buňky byla 13,5 W/m².

Tento příklad ukazuje, že jak u buněk THX (Obr. 13A), tak i u buněk HCT-118 (Obr. 13B) funguje strategie „osvit předem“ lépe než postup „osvit následně“. U buněk THX při nejvyšší dávce světla byla tedy inhibice syntézy proteinů u postupu „osvit předem“ přibližně trojnásobná ve srovnání s postupem „osvit následně“. Rovněž je zřejmé, že u obou buněčných linií nemá gelonin sám o sobě, bez PCI-ovlivnění, žádný toxický účinek, což prokazuje účinnost a specifičnost při indukci účinků toxinu, kterých lze dosáhnout fotochemickým ovlivněním.

Příklad 13

Fotochemická stimulace adenovirem zprostředkované transdukce genu

Buňky THX byly v množství 5 x 10⁴ na jamku zaočkovány na destičky o 6 jamkách. Další den byl přidán AlPcS_2a a buňky byly 18 hodin inkubovány při 37 °C. Veškeré postupy po přidání AIPcS_2a byly prováděny při utlumeném světle. Při strategii „osvit předem“ byly buňky promyty k odstranění AlPcS_2a a inkubovány v médiu bez obsahu AIPcS_2a po dobu 4 hodin. Poté byly buňky po dobu 3 minut vystaveny světlu a následně byly ovlivňovány adenovirovýtn vektorem AdHCMV-lacZ (označovaným také vPříkladu 10 jako AdCAI71acZ) při násobnosti infekce (MOI) 1 po dobu 30 minut. Tento vektor obsahuje reportérový gen β-galaktosidázy, jehož expresi lze analyzovat průtokovou cytometrií (viz níže).

U strategie „osvit následně“ byly buňky ovlivněné AlPcS_2a a promyté nejprve ovlivňovány adenovirem ve stejné koncentrací a po stejnou dobu, jak bylo popsáno výše, následně byly promyty a po přídavku čerstvého kultivačního média byla vystaveny světlu. Neozařované buňky byly ovlivňovány stejným způsobem, s výjimkou ozáření.

Ovlivňované buňky byly jednou promyty kultivačním médiem a po přídavku čerstvého média byly inkubovány při 37 °C až do další analýzy. Exprese β-galaktosidázy byla analyzována průtokovou cytometrií dva dny po vystavení světlu. Podrobné postupy pro konstrukci viru (který je označován jako AdHCMV-lacZ, nebo jako AdCA171acZ), pro ovlivnění buněk, ozáření a analýzu exprese β-galaktosidázy jsou popsány v Příkladu 10,

-27CZ 301427 B6

Výsledky (Obr. 14) ukazují, že fotochemické ovlivnění, využívající postup „osvit předem (znázorněné sloupci na pravé straně Obr. 14), zvyšuje procento buněk exprimujících β-galaktosidázu přibližně šestinásobně; od 2,5 % do 15 % za těchto pokusných podmínek. Rovněž je zřejmé, že účinek postupu „osvit předem“ byl téměř shodný s účinkem, získanému za použití postupu „osvit následně“ (viz sloupce na levé straně Obr. 14),

Příklad 14 io

Účinek doby inkubace na účinnost světlem indukované transdukce

Buňky THX v množství 5 x 10⁴ na jamku a buňky HCT-116 v množství 7,5 x 10⁴ na jamku byly zaočkovány na destičky o 6, respektive 12 jamkách. Druhý den byl přidán AlPcS_2a v koncentraci

20 pg/ml a buňky byly 18 hodin inkubovány při 37 °C. Veškeré postupy po přidání AlPcS_2a byly prováděny při utlumeném světle. Buňky promyty k odstranění AlPcS_2a a inkubovány v médiu bez obsahu AlPcS_2a po dobu 4 hodin. Poté byly buňky vystaveny světlu (buňky THX po dobu 3 minut, buňky HCT-116 po dobu 7 minut) a následně byty ovlivňovány komplexem pEGFPNl/polylysin (5 pg/ml pEGFP-Nl) po doby, označené na Obr. 15. Neozářené buňky byly ovlivňovány stejným způsobem, s výjimkou ozáření. Ovlivňované buňky byly jednou promyty kultivačním médiem a po přidání čerstvého média byly inkubovány při teplotě 37 °C 2 dny do analýzy exprese EGFP průtokovou cytometrií (viz Materiály a metody).

Ozáření bylo provedeno ze světelné lavice se čtyřmi světelnými trubicemi (Philips TL 20W/09) a podlouhlým průchozím filtrem pro oblast 550 až 600 nm. Světelná intenzita působící na buňky byla 13,5 W/m².

Komplex pEGFP-Nt/polylysin (poměr náboje 1,7) byl připraven mírným smísením roztoků plasmidu a polylysinu, připravených odděleně: 5 pg plasmidů pEGFP-Nl bylo naředěno 75 μΐ vody a 5,3 μg polylysinu bylo rovněž naředěno 75 μΐ vody. Oba roztoky byly smíchány a inkubovány 30 minut při teplotě místnosti, naředěny kultivačním médiem na 1 ml a přidány k buňkám.

Výsledky (Obr. 15) ukazují, že transfekce jak buněk THX, tak i buněk HCT-116 komplexy DNA/polylysin může být silně indukovány fotochemickým ovlivněním typu „osvit předem“. Je zřejmé, že stimulace transfekce je účinná již po krátkých dobách inkubace s DNA, alespoň do 30 minut inkubační doby. Světlem indukovaná transfekce roste s dobou inkubace, ovšem po přibližně 2 hodinách inkubace s DNA se zdánlivě ustálí.

Příklad 15

Účinek strategie PCI „osvit předem“ na transfekci buněk THX, zprostředkovanou poly-L-lysinem za použití TPPS_2A jako fotosenzitizeru

Disulfonát tetrafenylporfínu (TPPS_2a), č. šarže 04197, byl vyroben firmou Porphyrin Products (UT, USA). TPPS_2a byl rozpuštěn v dimethylsulfoxidu (DMSO).

Plasmid pEGFP-Nl byl získán zClontech Laboratories lne. (CA, USA, katalogové číslo 6085-1). Použitá šarže (č. EGFP-N1-1002) byla vyrobena firmou EL1M Biopharmaceuticals, lne. (CA, USA) a dodávána) v koncentraci 5 mg/ml sterilní vody. Zásobní roztok 0,5 mg/ml byl připraven ve sterilním TE-pufru o pH 7,4 (1 mmol.l'¹ Tris-HCl, 1 mmol.l'¹ EDTA) a uchováván při -20 °C.

Buňky THX lidského melanomu byly kultivovány v médiu RPMI, doplněném 10% fetálním telecím sérem, penicilinem/streptomycinem a L-glutaminem. Při ztlumeném světle bylo médium odstraněno nahrazeno médiem obsahujícím TPPS_2a v koncentraci 2 pg/ml. Buňky (chráněné před světlem) byly inkubovány 18 hodin při 37 °C. Poté byly trojnásobně promyty médiem a do vzorků PLL-L („osvit následovně“) byl přidán 1 ml média, obsahujícího komplex pEGFP-Nl/poly-L-lysin. Komplex obsahoval 5 μg pEGFP-Nl a měl poměr náboje poly-L-lysinu (PLL) a DNA 1,7. Po 4 hodinách další inkubace pří 37 °C a ve tmě bylo médium odstraněno a buňky byly jednou promyty médiem. Následně byl přidán 1 ml média a buňky byly vystaveny modrému světlu Jak je znázorněno na Obr. 16 a popsáno v odstavci Materiál a metody.

Vzorky L-PPL („osvit následovně“) byly nejprve 4 hodiny inkubovány v médiu bez komplexu ío pEGFP-Nl/PLL, komplex byl přidán bezprostředně po ozáření a odstraněn po dalších hodinách inkubace. Buňky byly inkubovány 48 hodin (stále chráněny před světlem) a poté byly analyzovány vzhledem k expresi EGFP průtokovou eytometrií. Pro tuto analýzu byly buňky trypsinizovány (Trypsin-EDTA, Sigma, MO, USA), resuspendovány v 0,4 ml média RPMI a zfiltrovány přes nylonový filtr o velikosti otvorů 50 pm. Poté byly buňky analyzovány za použití průtokového cytometru FACSalibur (Becton Dickinson, CA, USA). Měření EGFP se provádělo přes filtr 510 až 540 nm po excitaci při 488 nm. Pro každý vzorek bylo shromážděno 1000 výsledků. K odlišení mrtvých a živých buněk byl použit propidiumiodid (1 pg/ml) a k odlišení buněčných dubletu od jednotlivých buněk bylo použito pulsního zpracování. Hodnoty byly analyzovány za použití programu CELLQuest Software (Becton Dickinson, CA, USA).

Výsledky

Jak je zřejmé z Obr. 16, za použití fotosenzitizerů TPPS, u poly-L-lysinem zprostředkované transfekce buněk THX funguje přidání přenášené molekuly postupem „osvit předem“ stejně, jako postupem „osvit následně“.

Příklad 16 jo Účinek strategie PCI „osvit předem“ na transfekcí buněk THX, zprostředkovanou poly-L-lysinem za použití TPPS₄ jako fotosenzitizerů

Buňky THX byly pěstovány a ovlivňovány tak, jak je popsáno v Příkladu 15, jen s tím rozdílem, že místo TPPS_2a byl použit fotosenzitizér TPPS₄ (75 pg/ml).

Výsledky

Z Obr. 17 je zřejmé, že za použití fotosenzitízéru TPPS₄ u poly-L-lysinem zprostředkované transfekce buněk THX funguje postup „osvit předem“ poněkud lépe než postup „osvit následně“, ale oběma postupy je stále dosaženo transfekce.

Příklad 17

Účinek strategie PCI „osvit předem“ na transfekcí buněk HCT-116, zprostředkovanou poly-Llysinem za použití TPPS_2a jako fotosenzitizerů

Buňky HCT-116 byly pěstovány a ovlivňovány stejně, jak bylo popsáno v Příkladu 15.

Výsledky

Z Obr. 18 je zřejmé, že za použití fotosenzitizerů TPPS_2a u poly-L-lysinem zprostředkované transfekce buněk HCT-116 funguje postup „osvit předem“ stejně jako postup „osvit následně“.

-29CZ 301427 B6

Příklad 18

Účinek strategie PCI „osvit předem“ na transfekci buněk HCT-116, zprostředkovanou poly-Llysinem za použití TPPS₄ jako fotosenzitízeru

Buňky HCT-l 16 byly pěstovány a ovlivňovány stejně, jak bylo popsáno v Příkladu 15, jen s tím rozdílem, že místo TPPS_2a byl použit fotosenzitizer TPPS₄ (75 pg/ml).

Výsledky io

Z Obr. 19 je zřejmé, že za použití fotosenzitízeru TPPS₄ u poly-L-lysinem zprostředkované transfekce buněk HCT-116 funguje postup „osvit předem“ stejně jako postup „osvit následně“.

Příklad 19

Účinek strategie PCI „osvit předem“ na transfekci, zprostředkovanou DOTAP, za použití TPPS₄jako fotosenzitízeru

2« Buňky HCT-t 16 byly pěstovány v médiu RPMI-1640, doplněném 10 % fetálním telecím sérem, penicilinem/streptomycinem a L-glutaminem. Při ztlumeném světle bylo médium odstraněno a nahrazeno médiem obsahujícím TPPS₄ v koncentraci 75 pg/ml, Buňky (chráněné před světlem) byly inkubovány 18 hodin při 37 °C. Poté byly trojnásobně promyty médiem a ke vzorkům DOTAP-L („osvit následovně“) byl přidán 1 ml média obsahujícího komplex 1 pg pEGFP-Nl a 5 pg DOTAP. Po 4 hodinách další inkubace ve tmě a při 37 °C bylo médium odstraněno a buňky byly vystaveny modrému světlu tak, jak je uvedeno na Obr. 20 a popsáno v odstavci Materiál a metody.

U vzorků L-DOTAP („osvit předem“) byly vzorky nejprve 4 hodiny inkubovány v médiu bez přítomnosti komplexu pEGFP-Nl/DOTAP, který byl přidán bezprostředně po ozáření a odstraněn po dalších 4 hodinách inkubace. Buňky pak byly inkubovány 1 den (stále chráněné před světlem) před analýzou exprese EGFP průtokovou cytometrií, jak bylo popsáno v Příkladu 15.

Výsledky

Z Obr. 20 je zřejmé, že pro transfekci buněk HCT-116, zprostředkovanou kationtovým lipidem DOTAP, slouží za použití TPPS₄ jako fotosenzitízeru postup „osvit předem“ podstatně lépe než postup „osvit následovně“. Postup „osvit předem“ se zdá být zvláště výhodný pro transfekci zprostředkovanou kationtovým i lipidy.

Příklad 20

Účinek strategie PCI „osvit předem“ na transfekci zprostředkovanou látkou SuperFect®, za pou45 žití TPPS_2a jako fotosenzitízeru

SuperFact® byl získán od firmy Q1AGEN AG.

Příprava komplexů plasmid/SuperFact^x

Komplexy plasmid/SuperFact® byly připraveny následovně: (i) pEGFP-Nl byl naředěn médiem RPMI 1640 (bez obsahu séra, proteinů a antibiotik), (ii) SuperFect® (2 μΐ na μg DNA) byl přidán k roztoku plasmidu a celý obsah byl vířivě míchán 10 sekund (iii), Roztok byl ínkubován 10 až 20 minut při teplotě místnosti k umožnění tvorby komplexu, (iv) 400 μΐ růstového buněčného

-30CZ 301427 B6 média (se sérem a antibiotiky) bylo přidáno do zkumavek, obsahujících transfekční komplexy, obsahy zkumavek byly promíchány dvojnásobným pipetováním tam a zpět a celkový objem byl okamžitě převeden k buňkám.

Ovlivnění buněk

Buňky HCT-116 (75 000 buněk na jamku; l ml na jamku) byly zaoěkovány na destičky o 12 jamkách (Costar Corning, NY, USA) a ponechány přichytit se po dobu 6 hodin. Poté byl přidán 1 ml média s TPPS_2a (0,7 pg/ml) a buňky byly inkubovány 18 hodin (5% CO₂ obj./obj., 37 °C). io Poté byly trojnásobně promyty médiem a inkubovány další 4 hodiny (5% CO₂ obj./obj., 37 °C) v médiu s obsahem séra. Buňky byly ozářeny vystavením lavici o čtyřech fluorescenčních trubicích (Osram 18W/67) snejvyšším působením v oblasti přibližně 420 nm. Komplexy plasmid/SuperFect® byly přidány bezprostředně po vystavení buněk světlu a buňky nimi byly inkubovány l hodinu nebo 4 hodiny. Následně byly čtyřnásobně promyty v médiu RPMI 1640 a po přidání is 1 ml média byly dále inkubovány po dobu 2 dní. Poté byla exprese EGFP analyzována průtokovou cytometrií, jak bylo popsáno v Příkladu 15.

Výsledky

Je zřejmé (z Obr. 21), že PCI podstatné zlepšuje transfekci zprostředkovanou látkou SuperFect® za všech testovaných podmínek. Například pro 0,75 pg DNA a l hodinu transfekce bylo pozorováno devítinásobného zlepšení, zatímco pro 0,75 pg DNA a 4 hodiny transfekce bylo pozorováno desetinásobné zlepšení.

Příklad 21

Účinek strategie PCI „osvit předem“ na adenovirem zprostředkovanou genovou transdukci buněk HCT-116, za použití TPPS_2a jako fotosenzitizeru

Buňky HCT-116 byly kultivovány v médiu RPMI 1640, doplněném 10% fetálním telecím sérem, pěnicilinem/streptomycinem a L-glutaminem. Za ztlumeného světla bylo médium odstraněno a do každé jamky bylo přidáno médium s obsahem l pg/ml TPPS_2a. Buňky (chráněné před světlem) byly inkubovány 18 hodin při 37 °C. Poté byly trojnásobně promyty médiem a následně byly infikovány Ad-HCMV-lacZ adenovirem v různých časových okamžicích před ozářením, nebo po něm (které bylo vždy provedeno 4 hodiny po odstranění fotosenzitizéru). Buňky pak byly inkubovány další 2 dny (stále chráněné před světlem) až do analýzy β-galaktosidázové aktivity průtokovou cytometrií, jak je popsáno v Příkladu 10 (a v Materiálech a metodách).

Výsledky

Obr. 22 znázorňuje účinek načasování světelného ovlivnění vzhledem k dodání viru na účinek PCI při adenovirem zprostředkované genové transdukci. Je zřejmé, že při postupu „osvit předem (pravá strana osy Y) je PCI ozáření účinné alespoň 13 hodin, takže virus může být podáván až do

13 hodin po ozáření za stálého udržení kladných účinků PCI na transdukci. Tato skutečnost je velmi důležitá z klinického hlediska, neboť to klinickému lékaři poskytuje větší pružnost pri plánování léčby a koordinaci s další léčbou, kterou může pacient podstupovat, například s chirurgickými zákroky,

Příklad 22

Účinek strategie PCI „osvit předem“ na transfekci buněk HCT-4 16 zprostředkovanou poly-Dlysinem, za použití TPPS_2a jako fotosenzitizeru

Buňky HCT-116 byly pěstovány, ovlivňovány a analyzovány tak, jak je popsáno v Příkladu 15 s tou výhradou, že místo polv-L-lysinu byl pro přípravu komplexu s pEGFP-N 1 použit poly-Dlysin.

Výsledky

Z Obr. 23 je zřejmé, že PCI s postupem „osvit předem“ funguje stejně dobře i za použití polykationtu poly-D-lysinu jako transfekčního činidla.

io

Příklad 23

Účinek strategie PCI „osvit předem” na zabíjení buněk cytostatickým činidlem bleomycinem, za použití TPPS₄ jako fotosenzitizeru

Disulfonát tetrafenylporfinu (TPPS_2a), šarže č. 04197, byl vyroben firmou Porfyrin Products (UT, USA). TPPS_2a byl rozpuštěn v dimethylsulfoxidu,

V této studii byla použita buněčná linie plieních fibroblastů V79 čínského křečka.

MTT (3-[4,5~dimethylthiazol-2-yl]-2,5~difenyltetrazoliumbromid) byl získán od firmy Sigma (MO, USA, katalogové číslo M 2128), rozpuštěn v PBS (fosfátem pufrovaném solném roztoku) v koncentraci 5 mg/ml, sterilně zfiltrován a uchováván při teplotě 4 °C

Bleomycin (ASTA Medica) 15 000 IE/KY byl získán z lékárny nemocnice „Norwegium Radium Hospital“. 1 IE odpovídá 1 mg bleomycinu. Bleomycinový prášek byl rozpuštěn ve sterilním 0,9% roztoku NaCI v konečné koncentraci 2 mmoLl'¹.

Kultivace buněk

Buňky V-79 byly kultivovány v médiu RPMI 1640 (Gibco), doplněném 10% fetálním telecím sérem, penicilinem m(100 U/ml), streptomycinem (100 pg/ml) a 2 mmol.!^-1 glutaminem (všechny reagencie od firmy Gibco BRL, Paisley, Skotsko), při 37 °C a ve vlhkém prostředí s 5% CO₂.

Ovlivnění buněk

Buňky (75 000 buněk na jamku; 1 ml na jamku) byly zaočkovány na destičky o 12 jamkách (Costar Corning, NY, USA) a ponechány přichytit se po dobu 6 hodin. Do některých jamek byl přidán 1 ml média s TPPS_2a (0,7 pg/ml) (viz Tabulka l) a buňky byly inkubovány 18 hodin (5% •to CO₃ obj./obj., 37 °C), Poté byly trojnásobně promyty médiem a inkubovány další 4 hodiny v médiu s obsahem séra. Následně bylo médium odstraněno, přidáno bylo nové médium a buňky byly ozářeny vystavením světlu z kazety, obsahující lavici o čtyřech fluorescenčních trubicích (Osram 18W/67) s nejvyšším působením v oblasti přibližně 420 nm.

Hned poté byly přidány různé dávky bleomycinu. Po 1 hodině nebo po 4 hodinách inkubace s bleomycinem byly buňky jednou promyty médiem RPMI, přidán byl 1 ml média a po 3 dnech inkubace bylo měřeno přežití buněk prostřednictvím stanovení MTT. Tato metoda je založena na redukci vodou rozpustné tetrazoliové sole (MTT) na purpurový, nerozpustný formazanový produkt mitochondriálními dehydrogenázami, přítomnými v živých, metabolicky aktivních buňkách.

K buňkám se přidá 1 ml média s obsahem 0,25 pg MTT a následuje inkubace (5% CO₂ obj./obj., 37°C) po dobu 4 hodin. Výsledné formazanové krystaly jsou rozpuštěny přídavkem 200 μΐ isopropanolu (Sigma, MO, USA) na jamku. Roztok se převede do mikrotitračních destiček o 96 jamkách, které jsou odečítány na odečítači mikrodestiček Multiskan EX (Labsystems, Finsko) • 32CZ 301427 B6 s filtrem pro průchozí pás o vlnové délce 570 nm. Přežití buněk se počítá jako procentní množství vzhledem ke kontrolním buňkám, které nebyly ovlivněny světlem.

Výsledky

Obr. 24 ukazuje, že PCI s postupem „osvit předem“ může také zvýšit biologický účinek klinicky schváleného chemoterapeutika o nízké molekulové hmotnosti, bleomycinu. Je tedy zřejmé, že pro dávku 100 pmol.L¹ bleomycinu lze pozorovat podstatné, světlem indukované zvýšení cytotoxicity bleomycinu (plné čtverečky a plná kolečka na Obr, 24). Nepřítomnost účinku u nejnižší dávky io bleomycinu (plné kosočtverečky na Obr, 24) ukazuje, že tato zvýšená cytotoxicita není výsledkem fotochemického ovlivnění samotného, neboť tato série vzorků podstoupila stejné fotochemické ovlivnění jako série se lOOmmoLf* bleomycinu, aniž by došlo k pozorovatelnému světlem indukovanému účinku na přežití buněk.

Příklad 24

PCI s geloninem pro léčbu tumorů u myšího modelu in vivo

Zvířata

Holé samice myší Balb/c (nu/nu) byly namnoženy v Department of the Institute for Cancer Research. Myši byly chovány ve speciálních podmínkách bez přítomnosti patogenů. Voda a strava byla poskytována ad libitum. Veškeré postupy, týkající se zvířat, byly prováděny v sou25 hlase s protokoly, schválenými komisí pro péči o zvířata (Animal care committee) v Norwegian Radium Hospital, pod kontrolou Směrnic Národního etického výboru pro blaho zvířat (National Ethical Committee's guidelines on animal welfare). Myši měly na počátku pokusů průměrnou hmotnost 20 až 25 g (stáří 5 až 8 týdnů) a v jedné pokusné skupině bylo alespoň 5 zvířat. Lidský adenokarcinom WiDr, používaný v této studii, byl rozšiřován (propagován) sériovou transplanta30 cí myším Balb/c (nu/nu). Nádory byly skalpelem rozsekány do homogenity a 20 μΐ roztoku bylo podkožně injikováno do pravého kyčle každé myši. Velikost nádoru byla měřena dvakrát nebo třikrát týdně přeměřením dvou na sebe kolmých průměrů. Obem nádoru byl počítán podle následujícího vzorce:

V = (W²xL)/2 kde W je šířka a L délka průměrů měřených nádorů.

Léčba

Myši byly náhodně rozděleny do různých skupin, uvedených v Tabulce 1 a na Obr. 25. Zásobní roztok AlPcS_2a byl naředěn na koncentraci 1,25 mg/ml v PBS a injikován intraperitoneálně (do dutiny břišní) v konečné koncentraci 10 mg/kg, jakmile nádory dosáhly objemu přibližně 100 mm³. Čtyřicetosm hodin po injikaci AlPcS₂₃ byly nádory po dobu 16 minut vystaveny červenému světlu (viz níže). Bezprostředně po vystavení světlu byl do nádoru gelonin injikován (50 pg celkového množství v roztoku o koncentraci 2 mg/ml, tj. 25 μΐ). Myši byly po injikaci

AlPcS_2a ponechány ve tmě po dobu 1 týdne.

Působení světlem

Nádory byly ozářeny halogenovou lampou (150 W, Xenophot HLX64640), filtrovanou dlouhovlnným filtrem 580 nm a krátkovlnným filtrem 700 nm, emitující 150 mW/cm². Zvířata byla pokryta hliníkovou fólií všude kromě oblasti nádoru, kde byl ve fólii vytvořen otvor s průměrem o 2 mm širším než průměr nádoru. Nádory byly vystaveny 145 J/cm² světla. Objemy nádorů byly měřeny dvakrát až třikrát týdně, jak bylo popsáno výše. Myši byly usmrceny, jakmile nádor

-33CZ 301427 B6 dosáhl průměru přibližně 20 mm. Hodnocen byl podíl myší bez nádoru 30 dní po ozáření a zaznamenána byla průměrná velikost nádoru u každé z léčených skupin (Obr. 25).

Výsledky

Tabulka 1

Myši byly léčeny takjak bylo popsáno výše a výskyt nádorů byl zaznamenán 30 dní po ozáření.

skupina č.	léčba	podíl myší bez nádoru 30 dní po ozáření	=—=——ni % myší bez nádoru 30 dní po ozáření
1	neléčené	1/8	¹³ !
2	PBS + světlo	0/7	0
3	gelonin	0/8	0
4	gelonin + osvit předem”	0/5	0
5	AlPcS_2a	0/10	0
6	AIPcS_2a + gelonin	0/7	0
7	AiPcS_2a + světlo	2/11	18
8	AIPcS_2a + gelonin + osvit předem”	4/5	80

Z Tabulky 1 je zřejmé, že fotochemická intemalizace (PCI) sgeloninem, využívající postup „osvit předem“ (skupina 8) vyléčila 80 % (4 z 5) myší z jejich nádorového bujení. Oproti tomu gelonin samotný nevykázal žádný účinek, ani s přídavným ovlivněním světlem (skupina 4), ani bez ovlivnění světlem (skupina 3), v obou případech bez přítomnosti AIPcS2_a. Gelonin nevykázal i? žádný účinek ani v kombinaci s AlPcSía bez ovlivnění světlem (skupina 6). Nízká míra vyléčení byla zaznamenána u neléčených myší (skupina 1), což bylo pravděpodobně způsobeno spontánním vymizením nádoru. Nízkou míru vyléčení je možné pozorovat také u zvířat, která obdržela

AlPcS_2a a podstoupila ovlivnění světlem (skupina 7), což bylo dáno účinkem fotodynamické léčby (PDT), nezávislým na přítomnosti geloninu. Ovšem tento účinek PDT (18% vyléčení) byl významně nižší než účinek nalezený u ovlivnění PCI společně sgeloninem (80%, skupina 8). I když gelonin sám o sobě nemá žádný účinek, jakkoliv vysoká míra vyléčení u skupiny PCI nemůže být vysvětlena pouze aditivním, součtovým účinkem PDT a geloninu, ale musí být vyvolána synergickým účinkem, při němž ovlivnění PCI uskutečňuje toxický potenciál geloninu.

Obr. 25 znázorňuje účinek ovlivnění prostřednictvím PCI na střední objem nádoru u některých z léčených skupin. Je zřejmé, že u skupiny, dostávající pouze gelonin (prázdné trojúhelníčky) rostou nádory stejně rychle jako u skupiny, která je také ozářena a dostává placebo v injekci PBS (plné čtverečky). U zvířat, ovlivňovaných pouze fotochemicky, ale nikoli geloninem (prázdné kosočtverečky) byl růst tumorů opožděn, ale nádory začaly zase růst přibližně 15 dní po ozáření.

Naproti tomu u zvířat, ovlivňovaná plnou geloninovou a PCI léčbou (plná kolečka), nebylo pozorováno žádné zvýšení středního objemu nádoru ani 33 dní po ozáření.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

5 1. Způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky ín vitro nebo ex vivo, vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje kroky, v nichž se zmíněná buňka uvede do styku s fotosenzitizujícím činidlem, buňka se uvede do styku s molekulou jež má být zavedena, tedy s přenášenou molekulou a buňka se ozáří světlem o vlnové délce účinné pro aktivaci fotosenzitizuj ícího činidla, přičemž uvedené ozáření se provádí před buněčným pohlcením zmíněné molekuly do kteréhoio koliv intracelulámího oddílu, přičemž přenášená molekula není snadno uvolněna z oddílu, vymezeného intracelulámí membránou, do cytosolu, a/nebo se jedna složka nebo obě složky, sestávající z fotosenzitizačního činidla a přenášené molekuly, spojí s nebo připojí na jednu nebo více z nosičových molekul, zacílujících molekul nebo vektorů.

15
2. Způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky in vitro nebo ex vivo, vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje kroky, v nichž se zmíněná buňka uvede do styku s fotosenzitizujícím činidlem, tato buňka se ozáří světlem o vlnové délce účinné pro aktivaci fotosenzitizuj ícího činidla a ve stejnou dobu nebo v době po ozáření se buňka uvede do styku s molekulou, jež má být zavedena, tedy s přenášenou molekulou, přičemž přenášená molekula není snadno uvolněna

20 z oddílu, vymezeného intracelulámí membránou, do cytosolu, a nebo se jedna složka nebo obě složky, sestávající z fotosenzitizačního činidla a přenášené molekuly, spojí s nebo připojí na jednu nebo více z nosičových molekul, zacílujících molekul nebo vektorů.
3. Způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky podle nároku 2, vyznačující se

25 t í m , že ozáření se provádí před buněčným příjmem přenášené molekuly.
4. Způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že buňka se uvede do styku s přenášenou molekulou v době následující po uskutečněném ozáření.
5. Způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky podle nároku 4, vyznačující se tím, že buňka se uvede do styku se zmíněnou přenášenou molekulou v rozmezí od 0 do 4 hodin poté, co se uskutečnilo ozáření.

35
6. Způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že buňka se uvede do styku se zmíněnou přenášenou molekulou ve stejné době, v jaké se provádí ozáření.
7. Způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6,

40 vyznačující se tím, že přenášená molekula se uvede do styku se zmíněnou buňkou na dobu 30 minut až 6 hodin.
8. Způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že jako přenášená molekula se používá protein, peptid, protilátka

45 nebo antigen, či jejich fragment.
9. Způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že přenášená molekula, nebo její část či fragment se prezentuje nebo exprimuje na buněčném povrchu.
10. Způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky podle nároku 9, vyznačující se tím, že jako zmíněná buňka se používá buňka prezentující antigen.

-35CZ 301427 B6
11. Způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že jako zmíněná přenášená molekula se používá cytotoxické léčivo.

5
12. Způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že jako zmíněná přenášená molekula se používá molekula nukleové kyseliny.
13. Způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky podle nároku 12, vyznačující se io tím, že zmíněná molekula nukleové kyseliny se začlení do vektorové molekuly, s výhodou adenoviru.
14. Způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že se fotosenzitizující činidlo zvolí ze skupiny, sestávající z tetra15 sulfonátu tetrafenylporfinu, disulfonátu tetrafenylporfinu, hlinitého disulfonátu ftalocyaninu a z dalších amfiftlních fotosenzitizérů.
15. Způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že jako zmíněná fotosenzitizující činidla se používají sloučeniny,

20 kterými jsou kyselina 5-aminolevulinová nebo estery kyseliny 5-aminolevulinové či farmaceuticky přijatelné sole takových sloučenin.
16. Způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že fotosenzitizující činidlo se uvede do styku s uvedenými buňka25 mí na dobu 4 až 24 hodin před ozářením, s výhodou po zmíněné časové rozmezí bezprostředně před ozářením.
17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že fotosenzitizující činidlo se uvede do styku s uvedenými buňkami na dobu 4 až 24 hodin bezprostředně před ozářením.
18. Způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16, vyznačující se tím, že zmíněné fotosenzitizující činidlo se odstraní po styku se zmíněnou buňkou na 1 hodinu až 4 hodiny před ozářením.

35
19. Způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 18, vyznačující se tím, že jako nosič, zacílující molekula nebo vektor, knimž je přenášená molekula připojena, nebo s nimiž je spojena, se používá adenovirus, polykationt, kationtový lipid či peptid, nebo zacílený vektor.

40
20. Způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky podle nároku 19, vyznačující se tím, že zmíněná přenášená molekula se připojí k vektoru, s výhodou adenoviru, nebo se s ním spojí a zmíněný vektor se připojí k nosičové molekule, zacílující molekule nebo vektoru, nebo se s nimi spojí.

45
21. Způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky podle nároku 19 nebo 20, vyznačující se tím, že jako zmíněný polykationt se použije poly-L-lysin, poly-D-lysin nebo kationtový dendrimer.
22. Způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky podle nároku 19 nebo 20, vyznačující

5o se tím, že jako zmíněný kationtový lipid se použije l,2-bis(oleoyloxy)-3-(trimethylamino)propan.
23. Způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 20, vyznačující se tím, že jako zmíněná nosičova molekula se použije liposom nebo

55 konstrukt na bázi lipidu, s výhodou obsahující alespoň jeden kationtový lipid.

- 36 CZ 301427 B6
24. Způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, nebo 12 až 23 vyznačující se tím, že alespoň 50 % zmíněných buněk, do nichž se uvedená molekula zavádí, není usmrceno.
25. Způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky podle kteréhokoliv z nároků l až 24, vyznačující se tím, že krok ozáření se provádí 1 až 10 minut.
26. Použití přenášené molekuly a fotosensitizujícího činidla, tak jak jsou definovány v kterémkoliv z předchozích nároků, pro výrobu léčiva, obsahujícího buňky připravené způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 25 pro použití při léčení nebo prevenci onemocnění, poruchy nebo infekce, s výhodou pro genovou terapii, stimulaci imunitní odpovědi nebo k prevenci nebo léčení zhoubného nádoru.
27. Použití přenášené molekuly a fotosensitizujícího činidla, tak jak jsou definovány v kterémkoliv z předchozích nároků, pro výrobu léčiva pro použití při léčení nebo prevenci onemocnění, poruchy nebo infekce, s výhodou pro genovou terapii, stimulaci imunitní odpovědi nebo k prevenci nebo léčení zhoubného nádoru, při němž jsou fotosenzitizační činidlo a odděleně přenášená molekula určeny pro styk s buňkami nebo tkáněmi nemocného a buňky mají být ozářeny světlem s vlnovou délkou, účinně aktivující fotosenzitizační činidlo před pohlcením přenášené molekuly do jakéhokoliv intracelulámího oddílu buňky.
28. Použití přenášené molekuly a fotosensitizujícího činidla, tak jak jsou definovány v kterémkoliv z předchozích nároků, pro výrobu léčiva pro použití při léčení nebo prevenci onemocnění, poruchy nebo infekce, s výhodou pro genovou terapii, stimulaci imunitní odpovědi nebo k prevenci nebo léčení zhoubného nádoru, přičemž toto onemocnění, porucha nebo infekce má být léčena tak, že se léčivo a oddělené fotosenzitizační činidlo, definované v předchozích nárocích mají uvést do styku s buňkami nebo tkáněmi nemocného a buňky mají být ozářeny světlem s vlnovou délkou, účinně aktivující fotosenzitizační Činidlo před pohlcením přenášené molekuly do jakéhokoliv intracelulámího oddílu buňky.
29. Použití přenášené molekuly a fotosensitizujícího činidla, tak jak jsou definovány v kterémkoliv z předchozích nároků, pro výrobu léčiva pro použití při léčení nebo prevenci onemocnění, poruchy nebo infekce, s výhodou pro genovou terapii, stimulaci imunitní odpovědi nebo k prevenci nebo léčení zhoubného nádoru, přičemž toto onemocnění, porucha nebo infekce má být léčeny tak, že se léčivo a odděleně přenášená molekula, definovaná v předchozích nárocích mají uvést do styku s buňkami nebo tkáněmi nemocného a buňky mají být ozářeny světlem s vlnovou délkou, účinně aktivující fotosenzitizační činidlo před pohlcením přenášené molekuly do jakéhokoliv intracelulámího oddílu buňky.
30. Použití podle kteréhokoliv z nároků 26 až 29, při němž pohlcení do buňky má být uskutečněno způsobem podle kteréhokoliv z nároků 2 až 7, 16 až 18, 24 nebo 25.
31. Použití podle kteréhokoliv z nároků 26 až 30, při vakcinaci, jako přenášená molekula se užije molekula antigenu nebo její část nebo fragment, který je prezentován nebo exprimován na buněčném povrchu.
32. Prostředek, obsahující přenášenou molekulu a odděleně fotosenzitizuj ící činidlo, tak jak byly definovány v kterémkoliv z předchozích nároků, jako kombinovaný prostředek pro oddělené nebo následné použití při léčení nebo prevenci onemocnění, poruchy nebo infekce, s výhodou pro genovou terapii, stimulaci imunitní odpovědi nebo k prevenci nebo léčení zhoubného nádoru, přičemž fotosenzitizační činidlo a odděleně přenášená molekula mají být uvedeny do styku s buňkami nebo tkáněmi nemocného a buňky mají být ozářeny světlem s vlnovou délkou, účinně aktivující fotosenzitizační činidlo před pohlcením přenášené molekuly do jakéhokoliv intracelulámího oddílu buňky.