PT1346059E - Internalização fotoquímica para distribuição de moléculas no citosol - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"INTERNALIZAÇÃO FOTOQUÍMICA PARA DISTRIBUIÇÃO DE MOLÉCULAS NO CITOSOL" Método A presente invenção refere-se a um método melhorado para introdução de moléculas no citosol de células utilizando um agente fotossensibilizador e irradiação das células com luz de um comprimento de onda eficaz para activar o agente fotossensibilizador. A maioria das moléculas não penetra facilmente nas membranas celulares. Os métodos para introduzir moléculas no citosol de células vivas são instrumentos úteis para manipular e estudar processos biológicos. De entre os métodos mais normalmente mais utilizados actualmente encontram-se microinjecção, fusão mediada por glóbulos vermelhos sanguíneos fantasma e fusão de lipossomas, lise osmótica de pinossomas, carregamento por raspagem, electroporação, transfecção mediada por fosfato de cálcio e por vírus. Estas técnicas são úteis para investigar células em cultura, embora em muitos casos possam ser impraticáveis, morosas, ineficientes ou estas podem induzir uma morte celular significativa. Deste modo essas técnicas não são óptimas para utilização em investigação biológica ou médica ou em terapia em que é necessário que as células devam permanecer viáveis e/ou funcionais. 1 É bem conhecido que as porfirinas e muitos outros compostos fotossensibilizadores podem induzir efeitos citotóxicos em células e tecidos. Estes efeitos são baseados no facto de após exposição à luz o composto fotossensibilizador poder tornar-se tóxico ou libertar substâncias tóxicas tais como oxigénio singuleto ou outros radicais de oxidação que estão a danificar o material celular ou biomoléculas, incluindo as membranas celulares e estruturas celulares e esses danos celulares ou membranares podem consequentemente matar as células. Estes efeitos têm sido utilizados no tratamento de várias anomalias ou distúrbios, incluindo especialmente doenças neoplásicas. 0 tratamento é denominado terapia fotodinâmica (PDT) e envolve a administração de agentes fotossensibilizadores (fotoquimioterapêuticos) à área afectada do organismo, seguida por exposição à luz activante para activar os agentes fotossensibilizadores e convertê-los na forma citotóxica, pelo que as células afectadas são mortas ou o seu potencial proliferativo diminuído. São conhecidos agentes fotossensibilizadores que se irão localizar de um modo preferido ou selectivo no local alvo pretendido e. g., num tumor ou em outra lesão. São conhecidos vários agentes fotossensibilizadores, incluindo notavelmente psoralenos, porfirinas, clorinas e ftalocianinas. Esses fármacos tornam-se tóxicos quando expostos à luz .

Os fármacos fotossensibilizadores podem exercer os seus efeitos através de vários mecanismos, directamente ou indirectamente. Deste modo por exemplo, determinados fotossensibilizadores tornam-se directamente tóxicos quando activados pela luz, enquanto outros actuam para produzir 2 espécies tóxicas, e. g., agentes oxidantes, tais como oxigénio singuleto ou outros radicais livres derivados do oxigénio, que são extremamente destrutivos para o material celular e biomoléculas tais como lípidos, proteínas e ácidos nucleicos.

Os fotossensibilizadores porfirínicos actuam indirectamente pela produção de espécies de oxigénio tóxicas e são considerados como candidatos particularmente favoráveis para a PDT. As porfirinas são precursores de ocorrência natural na síntese de heme. Em particular o heme é produzido quando o ferro (Fe3+) é incorporado na protoporfirina IX (PpIX) por acção da enzima ferroquelatase. A PpIX é um fotossensibilizador extremamente potente, enquanto o heme não tem qualquer efeito fotossensibilizador. São conhecidos na técnica e descritos na literatura vários fotossensibilizadores baseados em porfirinas ou relacionados com porfirinas. 0 efeito citotóxico da maioria dos sensibilizadores utilizado em PDT é mediado principalmente através da formação de oxigénio singuleto formado após a exposição dos fotossensibilizadores à luz. Este intermediário reactivo tem uma vida muito curta em células (<0,04 ps) . Deste modo, o efeito citotóxico primário da PDT é realizado durante a exposição à luz e muito próximo dos locais de formação de 102. O 302 reage com proteínas (histidina, triptofano, metionina, cisteína, tirosina), ADN (guanina), ácidos gordos insaturados e colesterol e oxida-os. Uma das vantagens da PDT é que os tecidos não expostos à luz podem ser mantidos não afectados i. e. que pode ser obtido um efeito da PDT selectivo. Existe vária documentação no que se refere à utilização da PDT para destruir populações de células não pretendidas, por exemplo células 3 neoplásicas. A literatura de patentes descreve vários compostos fotodinâmicos, isolados ou conjugados com agentes de direccionamento, e. g., imunoglobulinas dirigidas para determinantes de receptor de célula neoplásicas, tornando o complexo mais especifico para uma célula. Alguns compostos fotoquimicos, tal como derivados da hematoporfirina, têm para além disso uma capacidade inerente para se localizarem em células malignas. Esse métodos e compostos, são descritos na patente Norueguesa N°. 173319 e nos pedidos de patente norueguesas N° . 900731, 176645, 176947, 180742, 176786, 301981, 300499 e 891491.

No documento W093/14142 é descrito um sistema de distribuição de fármaco compreendendo um agente anti-cancerigeno e um agente fotoactivável (i. e. um fotossensibilizador) ligado a veículos copoliméricos. Após administração este complexo entra no interior da célula por pinocitose ou fagocitose e localiza-se no interior dos endossomas e lisosomas. Nos lisosomas, a ligação entre o agente antineoplásico e o polímero é hidrolizada e o primeiro pode difundir passivamente para o citosol através da membrana lisossómica. A utilidade deste método está deste modo limitado a pequenos compostos moleculares que sejam capazes de se difundir através das membranas lisossómicas. Após se permitir um período de tempo para difusão, é aplicada uma fonte de luz de comprimento de onda e energia adequados para activar o composto fotoactivável. 0 efeito combinado do agente anti-cancerígeno e do agente fotoactivável destrói a célula. Esses métodos de PDT como descritos acima são deste modo dirigidos à destruição de estruturas celulares originando a morte celular.

Os documentos WO 96/07432 e WO 00/54802 por outro lado, referem-se a métodos que utilizam o efeito fotodinâmico como um 4 mecanismo para introduzir moléculas, de outra forma impermeáveis à membrana, no citosol de uma célula de uma forma que não resulta necessariamente na destruição celular ou na morte celular generalizada. Neste método, são aplicados a molécula a ser internalizada e um composto fotossensibilizador simultânea ou sequencialmente às células, após o que o composto fotossensibilizador e a molécula são endocitados ou de outra forma translocados para o interior de endossomas, lisosomas ou outros compartimentos intracelulares delimitado por uma membrana. A molécula a ser translocada para compartimentos intracelulares das células e o composto fotossensibilizador são aplicados às células em conjunto ou sequencialmente e incorporados pela célula em conjunto nos mesmos compartimentos intracelulares (i. e. são co-translocados). A molécula a ser internalizada dentro da célula é então libertada por exposição das células a luz de comprimentos de onda adequados para activar o composto fotossensibilizador que por sua vez leva à destabilização das membranas do compartimento intracelular e à libertação subsequente da molécula, que está localizada no mesmo compartimento que o agente fotossensibilizador, no citosol. Este método foi denominado "internalisação fotoquímica" ou PCI. Deste modo, nestes métodos o passo final de expor as células à luz resulta na molécula em questão ser libertada a partir do mesmo compartimento intracelular que o agente fotossensibilizador e ficar presente no citosol.

Foi considerado que para que este método fosse eficaz era essencial que o composto fotossensibilizador e a molécula a ser libertada no citosol estivessem presentes nos mesmos compartimentos intracelulares quando era realizada irradiação. 5

Foi agora surpreendentemente verificado que podem ser introduzidas moléculas no citosol de células por métodos de PCI semelhantes mas em que a exposição das células à luz não é necessariamente o passo final e os métodos não são dependentes da molécula e estando o agente fotossensibilizador localizado nos mesmos compartimentos intracelulares no momento da exposição à luz. Nesses métodos, o agente fotossensibilizador pode ser feito contactar com as células e activado por irradiação antes que a molécula a ser internalizada e deste modo distribuída no citosol seja levada ao contacto com as células. Deste modo, apesar do facto da molécula a ser internalizada e o agente fotossensibilizador não estarem necessariamente localizados nos mesmos compartimentos intracelulares no momento da exposição à luz, a molécula ainda entra na célula e é distribuída no citosol. Estes resultados são extremamente surpreendentes e esses métodos apresentam vantagens significativas em relação aos métodos em que a irradiação com luz é o passo final.

Consequentemente na sua generalidade, a presente invenção proporciona um método in vitro ou ex vivo para introduzir uma molécula no citosol de uma célula, compreendendo o referido método fazer contactar a referida célula com um agente fotossensibilizador e fazendo contactar a referida célula com a molécula a ser introduzida (molécula de transferência) e irradiando a referida célula com luz de um comprimento de onda eficaz para activar o agente fotossensibilizador, em que referida irradiação é realizada no momento antes ou simultaneamente ao contacto da referida célula com a molécula de transferência, em que a molécula de transferência não penetra facilmente as membranas celulares e/ou em que um ou ambos o agente fotossensibilizador e molécula de transferência estão 6 ligados, associados ou conjugados com uma ou mais moléculas transportadoras, moléculas direccionadoras ou vectores. A irradiação é realizada antes da incorporação celular da molécula a ser incorporada. "Internalização" como aqui utilizado, refere-se à distribuição citosólica de moléculas. No presente caso "internalização" inclui deste modo o passo de libertação de moléculas a partir de compartimentos intracelulares/ligados a membranas no citosol das células.

Como aqui utilizado, "incorporação celular" ou "translocação" refere-se a um dos passos de internalização em que as moléculas externas à membrana celular são incorporadas pela célula de forma a que estas sejam encontradas internamente à membrana celular envolvente, e. g., por endocitose ou outros mecanismos de incorporação adequados, por exemplo no interior ou associadas a um compartimento intracelular delimitado por uma membrana, por exemplo o retículo endoplasmático, complexo de Golgi, lisossomas, endossomas, etc.

Deste modo a presente invenção proporciona um método in vitro ou ex vivo para introduzir uma molécula no citosol de uma célula, como descrito acima em que referida célula é feita contactar com a molécula de transferência simultaneamente ou após a irradiação.

Como discutido abaixo, o método pode ser utilizado in vivo e neste aspecto a presente invenção proporciona a utilização de uma molécula de transferência e de um agente fotossensibilizador em que o agente fotossensibilizador e a molécula de 7 transferência são como aqui definidos para a preparação de um medicamento para a utilização no tratamento ou na prevenção de uma doença, distúrbio ou infecção, de um modo preferido para terapia génica, estimulando uma resposta imunitária ou tratando ou prevenindo o cancro, em que o referido agente fotossensibilizador e separadamente a referida molécula de transferência se destina a ser feita contactar com células ou tecidos de um doente e as referidas células se destinam a ser irradiadas com a luz de um comprimento de onda eficaz para activar o agente fotossensibilizador e a irradiação se destina a ser realizada um momento antes ou ao mesmo tempo em que é feita contactar a referida célula com a molécula de transferência, em que a referida molécula de transferência é uma molécula terapêutica. A invenção proporciona ainda a utilização de uma molécula de transferência como aqui definida para a preparação de um medicamento para a utilização no tratamento ou na prevenção de uma doença, distúrbio ou infecção, de um modo preferido para a terapia génica, estimulando uma resposta imunitária ou para tratar ou prevenir o cancro, em que a referida doença, distúrbio ou infecção se destinam a ser tratados fazendo contactar com células ou tecidos de um doente com o referido medicamento e é feito contactar separadamente um agente fotossensibilizador como aqui definido com as referidas células ou tecidos dos referidos doentes e as referidas células se destinam a ser irradiadas com luz de um comprimento de onda eficaz para activar o agente fotossensibilizador e a irradiação destina-se a ser realizada um momento antes ou ao mesmo tempo em que é feita contactar a referida célula com a molécula de transferência , em que a referida molécula de transferência é uma molécula terapêutica. A presente invenção proporciona ainda uma composição que se refere a uma molécula de transferência e separadamente a um agente fotossensibilizador como aqui definido como uma composição combinada para a utilização separada ou sequencial como aqui descrito acima. Num aspecto adicional a invenção proporciona uma molécula de transferência como aqui definida para uma utilização como aqui descrito acima.

De um modo preferido as células são feitas contactar com as moléculas a serem introduzidas ou internalizadas (seguidamente designadas como as moléculas de transferência) num momento após ter ocorrido a irradiação ou por outras palavras, o tratamento fotoquímico das células, fazendo-as contactar com um agente fotossensibilizador e depois irradiação, é realizado antes das moléculas serem adicionadas às células. Nesta forma de realização as moléculas a serem introduzidas no citosol podem ser levadas ao contacto com as células que foram submetidas a tratamento fotoquímico em qualquer momento após ter ocorrido o tratamento desde que as moléculas de transferência estejam ainda capazes de serem incorporadas nas células. A janela temporal em que as moléculas podem ser levadas ao contacto com as células e ainda sejam incorporadas pode depender de vários factores tais como por exemplo o tipo celular, a molécula em questão em particular, o agente fotossensibilizador utilizado em particular e a duração do tratamento com luz. Se necessário esta janela temporal pode ser determinada para um conjunto particular de condições. No entanto, de um modo preferido a molécula a ser transferida para o citosol é exposta às células relativamente precocemente após tratamento fotoquímico, por exemplo dentro de 24 horas após tratamento fotoquímico e de um modo mais preferido dentro das 10 primeiras horas após tratamento fotoquímico e. g., dentro das 5 primeiras horas ou de um modo mais preferido na 9 primeira hora. Por exemplo a molécula de transferência pode ser administrada in vitro ou ex vivo durante um determinado período de tempo, e. g., 30 minutos a 24 horas, de um modo preferido 1 a 2 horas, iniciando-se a administração imediatamente após ou brevemente após a irradiação, e. g., se o final da irradiação for considerado como o ponto de partida, a molécula de transferência pode ser aplicada em 0 minutos a 24 horas, e. g., 0 a 4 horas.

Foi observado que mesmo se a molécula de transferência for feita contactar com a célula durante um tempo considerável após a irradiação, é ainda possível a internalização na célula. Deste modo, por exemplo, a molécula de transferência pode ser aplicada mais de uma hora após a irradiação, e. g., mais de 2, 4, 8, 10 ou até 12 horas após a irradiação.

Deste modo, numa forma de realização preferida a referida célula é feita contactar com a referida molécula de transferência 0 a 4 horas após a irradiação durante um período de 1 a 2 ou 3 horas ou mais longo, e. g., pelo menos 0,5 a 3 horas. O tempo em que a molécula de transferência é administrado irá variar dependendo dos métodos estarem a ser realizados in vitro ou in vivo. Para métodos in vitro as moléculas de transferência podem ser geralmente levadas ao contacto com todas as células alvo simultaneamente, e. g., se as células estiverem em crescimento numa cultura in vitro e deste modo for relativamente fácil levar as moléculas ao contacto com as células num momento adequado. No entanto in vivo, o passo de fazer contactar as células alvo com as moléculas de transferência é obviamente mais complicado e irá depender do modo de administração e da posição das células alvo. Por exemplo, quando a molécula de transferência pode ser 10 administrada directamente às células alvo, e. g., por injecção local, então a molécula de transferência irá entrar em contacto com as células alvo (ou pelo menos uma sua proporção) relativamente rapidamente, e. g.f numa questão de minutos ou de horas após a administração. Se por outro lado as moléculas de transferência forem administradas por injecção intravenosa para um alvo distante então estas moléculas podem levar muito mais tempo para entrarem em contacto com as células alvo. Por exemplo estas podem levar 24 a 96 horas após a administração para atingirem as células alvo. Este "tempo de viagem" terá que ser considerado na decisão do tempo adequado para administrar as moléculas de transferência em relação à administração do agente fotossensibilizador e ao tempo de irradiação.

Numa forma de realização alternativa da invenção em lugar da molécula de transferência ser levada ao contacto com as células após ter ocorrido irradiação esta pode ser levada ao contacto com as células simultaneamente à irradiação.

Como referido acima, o momento preciso da adição da molécula de transferência e do agente fotossensibilizador e o momento da irradiação para obter os efeitos descritos acima tem que ter em consideração vários factores incluindo as células a serem tratadas, agentes e moléculas em utilização e o ambiente das células, particularmente no que respeita a estar em questão um sistema in vitro ou in vivo. Os momentos adequados podem ser facilmente determinados tendo em conta estas considerações.

Os métodos de internalização fotoquímica divulgados anteriormente em que a molécula de transferência e o agente fotossensibilizador foram adicionados às células antes da irradiação dependiam das moléculas em questão estarem 11 localizadas nos mesmos compartimentos intracelulares antes da exposição à luz para que a lise destes compartimentos pela activação pela luz do agente fotossensibilizador resultasse na libertação tanto da molécula como do agente fotossensibilizador no citosol. Na Figura 7 é mostrado um desenho esquemático mostrando isto.

Nos presentes métodos o agente fotossensibilizador e a molécula de transferência a serem introduzidos no citosol não estão claramente nos mesmos compartimentos intracelulares no momento da exposição à luz uma vez que a irradiação é realizada antes da incorporação celular da molécula de transferência. 0 mecanismo de acção dos presentes métodos é ainda desconhecido e na realidade é surpreendente o facto deste método funcionar em absoluto. Não se pretendendo estão limitado pela teoria, a razão para estas verificações surpreendentes e que pode ocorrer fusão de vesículas danificadas fotoquimicamente com vesículas endocitóticas formadas de novo que é então é seguida pela libertação de moléculas endocitadas de novo no citosol. Na Figura 7 é mostrado um diagrama esquemático ilustrando isto. Alternativamente, os danos fotoquímicos em enzimas lisossómicas ou vesículas contendo enzimas lisossómicas, tal como endossomas tardios, pode reduzir a velocidade de degradação intracelular das moléculas a serem internalizadas. Isto pode ser devido ao transporte reduzido para vesículas contendo enzimas lisossómicas ou ao transporte para vesículas endocíticas contendo actividade hidrolítica mais baixa. Deste modo estas moléculas irão ter mais tempo para evitar a compartimentação endocitica do que quando a via de degradação lisossómica está activa. Uma explicação alternativa adicional pode ser o tratamento fotoquímico das células originar a danos menores à membrana plasmática das 12 células originando penetração aumentada de macromoléculas através da membrana celular. No entanto as experiências realizadas (ver o Exemplo 7) sugerem que isto não seja provavelmente o motivo. A presente invenção refere-se deste modo a métodos para transportar ou transfectar quaisquer moléculas para o citosol de células vivas in vitro (i. e. em cultura) ou in vivo, após o que as moléculas irão estar disponíveis no citosol.

Esses métodos podem ser utilizados não apenas para transferir moléculas (ou as suas partes ou os seus fragmentos) para o interior de uma célula mas também, em algumas circunstâncias, apresentá-las ou expressá-las na superfície celular. Deste modo, após transporte e libertação de uma molécula de transferência no citosol celular de acordo com os métodos da presente invenção, se a(s) célula(s) em questão é(são) célula(s) especializada(s), tal como por exemplo uma célula apresentadora de antigénio, a molécula ou o fragmento, pode ser transportado até à superfície celular onde este pode ser apresentado no exterior da célula i. e. na superfície celular. Esses métodos têm utilidade particular no campo da vacinação, em que podem ser introduzidos componentes de vacina, i. e., antigénios ou imunogénios, numa célula para apresentação na superfície dessa célula, de forma a induzir, facilitar ou aumentar uma resposta imunitária, no documento WO 00/54802 são descritos detalhes adicionais no que respeita à utilidade da capacidade de expressar moléculas na superfície celular.

As moléculas de transferência que podem ser introduzidas no citosol de células utilizando os métodos da presente invenção incluem moléculas que não penetram facilmente membranas 13 celulares. Adicionalmente, a presente invenção pode aumentar a distribuição citosólica e a actividade de moléculas que são apenas em parte capazes de penetrar a membrana celular ou as membranas de vesículas intracelulares. As moléculas de transferência podem ser compostos orgânicos, proteínas ou fragmentos de proteínas tais como por exemplo péptidos, anticorpos ou antigénios ou os seus fragmentos. Outra classe de moléculas de transferência para utilização de acordo com a invenção são fármacos citotóxicos, tais como toxinas de proteína ou compostos orgânicos citotóxicos, e. g., bleomicina. Ainda uma outra classe de moléculas de transferência adequadas são ácidos nucleicos.

Podem ser utilizados ácidos nucleicos na forma de genes codificando por exemplo proteínas terapêuticas, moléculas de ARN anti-sentido, ribozimas, aptâmeros de ARN ou oligonucleótidos formadores de triplexes. Alternativamente podem ser utilizados ácidos nucleicos na forma de moléculas não-codificantes tais como por exemplo ADN sintético ou moléculas de ARN anti-sentido, ribozimas, aptâmeros, oligonucleótidos formadores de triplexes, ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ADN factor de transcrição "chamariz" ou oligonucleótidos quiméricos para reparação de mutações específicas no doente. Quando adequado as moléculas de ácido nucleico podem estar sob a forma de genes inteiros ou de fragmentos de ácidos nucleicos opcionalmente incorporados numa molécula ou entidade vector e. g., um vector plasmídico ou uma partícula virai ou bacteriófago. A última forma tem uma aplicabilidade particular quando a molécula de transferência se destina a ser utilizada em métodos de terapia génica. 0 agente fotossensibilizador a ser utilizado de acordo com a presente invenção é convenientemente qualquer dos agente que 14 se localiza em compartimentos intracelulares, particularmente endossomas ou lisossomas. São conhecidos na técnica e descritos na literatura vários desses agentes fotossensibilizadores, incluindo no documento WO96/07432. No que a isto respeita pode ser feita referência a aluminoftalocianina di e tetrassulfonada (e. g., AlPcS2a) , tetrafenilporfinas sulfonadas (TPPSn) , azul do Nilo, derivados e6 de clorina, uroporfirina, filoeritrina, hematoporfirina e azul de metileno que revelaram localizar-se em endossomas e lisossomas de células em cultura. Na maioria dos casos isto é devido à incorporação endociticas do fotossensibilizador. Deste modo, o agente fotossensibilizador é de um modo preferido um agente que é incorporado nos compartimentos internos de lisossomas ou endossomas. No entanto, podem ser também utilizados outros agentes fotossensibilizadores que se localizam em outros compartimentos intracelulares por exemplo no retículo endoplasmático ou no aparelho Golgi. É também concebível que possam ocorrer mecanismos em que os efeitos do tratamento fotoquímico estão em outros componentes da célula (i. e. outros componentes além dos compartimentos delimitados por uma membrana). Deste modo, por exemplo uma possibilidade pode ser o que o tratamento fotoquímico destrói moléculas importantes para o transporte intracelular ou a fusão de vesículas. Essas moléculas podem não estar necessariamente localizadas em compartimentos delimitados por uma membrana, mas os danos fotoquímicos dessas moléculas pode originar no entanto a internalização fotoquímica das moléculas de transferência, por exemplo: através de um mecanismo em que os efeitos fotoquímicos sobre essas moléculas originam transporte reduzido da molécula a ser internalizada (i. e.. a molécula de transferência) para vesículas degradativas tal como lisossomas, para a molécula a ser internalizada possa sair para o citosol antes de ser degradada. Os exemplos dessas moléculas não necessariamente 15 localizadas em compartimentos delimitados por membranas são várias moléculas do sistema de transporte microtubular como dineina e componentes da dinactina; e por exemplo rab5, rab7, factor sensível N-etilmaleimda (NSF), proteína solúvel de ligação a NSF (SNAP) e semelhantes.

As classes de agentes fotossensibilizadores adequados que podem ser referidas incluem deste modo porfirinas, ftalocianinas, purpurinas, clorinas, benzoporfirinas naftalocianinas, corantes catiónicos, tetraciclinas e bases fracas lisomotrópicas ou os seus derivados (Berg et al., J. Photochemistry and Photobiology, 1997, 65, 403409). Outros agentes fotossensibilizadores adequados incluem texafirinas, feoforbidos, porficenos, bacterioclorinas, cetoclorinas, derivados de hematoporfirina e os seus derivados, fotossensibilizadores endógenos induzidos pelo ácido S-aminolevulínico e os seus derivados, dímeros ou outros conjugados entre fotossensibilizadores.

De um modo preferido o fotossensibilizador está na forma livre,, i. e., não conjugada com qualquer outra macromolécula. No entanto o fotossensibilizador pode alternativamente ser associado, ligado ou conjugado com um veículo ou outra molécula como aqui descrita abaixo, e. g., ligado a um anticorpo direccionador ou ligado a um veículo tal como polilisina.

Os agentes fotossensibilizadores preferidos incluem TPPS4, TPPS2ar AlPcS2a e outros fotossensibilizadores anfifílicos.

Num aspecto preferido, a presente invenção proporciona métodos em que os agentes fotossensibilizadores que podem ser utilizados são compostos sendo ácido S-aminolevulínico ou 16 ésteres do ácido 5-aminolevulínico ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Nesses ésteres o grupo 5-amino pode ser substituido ou não substituído, sendo o último caso os ésteres ALA.

Mais particularmente, os ésteres ALA para utilização de acordo com a invenção são ésteres de ácidos 5-aminolevulínicos com alcanóis opcionalmente substituídos, i. e. ésteres alquílicos ou ésteres alquílicos substituídos.

Convenientemente, os ésteres ALA que podem ser utilizados são compostos da fórmula I, r|n - CH2COCH2 - CH2CO - OR1 (I) (em que R1 pode representar alquilo opcionalmente substituído com grupos hidroxilo, alcoxilo, aciloxilo, alcoxicarboniloxilo, amino, arilo, oxo ou fluoro e opcionalmente interrompidos por átomos de oxigénio, azoto, enxofre ou fósforo; e R2, cada um dos quais podendo ser igual ou diferente, representa um átomo de hidrogénio ou um grupo R1) e os seus sais.

Os grupos alquilo R1 substituídos podem ser mono ou polissubstituídos. Deste modo os grupos R1 adequados incluem por exemplo alquilo não substituído, alcoxialquilo, hidroxialcoxialquilo, poli-hidroxialquilo, hidroxipolialquilenooxialquilo e semelhantes. 0 termo "acilo" como aqui utilizado inclui tanto os grupos carboxilato como os carbonato, deste modo, grupos alquilo substituídos com aciloxilo incluem por exemplo alquilcarboniloxilalquilo. Nesses grupos 17 qualquer parte alquileno tem de um modo preferido conteúdos em átomos de carbono definidos para grupos alquilo abaixo. Os grupos arilo preferidos incluem fenilo e heteroaromáticos monocíclicos com 5-7 membros, especialmente fenilo e esses grupos podem eles próprios opcionalmente substituídos.

Os grupos alquilo substituidos R1 representativos incluem grupos alcoximetilo, alcoxietilo e alcoxipropilo ou grupos aciloximetilo, aciloxietilo e aciloxipropilo e. g. pivaloiloximetilo.

Os ésteres ALA preferidos para utilização como agentes fotossensibilizadores de acordo com a invenção, incluem aqueles em que R1 representa um grupo alquilo não substituído e/ou cada R2 representa um átomo de hidrogénio.

Como aqui utilizado, o termo "alquilo" inclui qualquer grupo hidrocarboneto alifático saturado ou não saturado de cadeia longa ou curta, cadeia linear ou ramificada. Os grupos alquilo não saturados podem ser mono ou poliinsaturados e incluir grupos alcenilo e alcinilo. Esses grupos podem conter até 40 átomos de carbono. No entanto, são preferidos os grupos alquilo contendo até 10 e. g., 8, de um modo mais preferido até 6 e especialmente de um modo preferido até 4 átomos de carbono.

Pode ser feita uma referência particular a éster ALA-metílico, éster ALA-etílico, éster ALA-propílico, éster ALA-hexílico, éster ALA-heptílico e éster ALA-octílico e os seus sais, que representam agentes fotossensibilizadores preferidos para utilização de acordo com a invenção. 18

Necessariamente, o agente fotossensibilizador é feito contactar com uma célula antes da irradiação. No entanto, ao contrário da molécula de transferência, este agente deve ser administrado suficientemente antes da irradiação de forma a que na irradiação o referido agente seja incorporado num compartimento intracelular. Deste modo o referido agente é convenientemente aplicado 1 a 72 horas antes da irradiação, e. g., 4 a 48, e. g., 4 a 24 horas antes da irradiação. Novamente, como discutido acima em relação ao passo de levar a molécula de transferência ao contacto com as células, o momento da administração do agente fotossensibilizador para se obter contacto com a célula alvo em relação ao momento da irradiação irá depender do tempo que este irá levar para um agente fotossensibilizador atingir as células alvo e ser incorporado por estas. Este tempo pode variar dependendo de se os métodos estão a ser realizados in vitro ou in vivo e se a administração é directa ao tecido alvo ou se está numa localização distai. Em todos os casos, é importante que o agente fotossensibilizador tenha sido incorporado pelas células alvo antes da ocorrência da irradiação. 0 referido agente pode ser mantido em contacto com as referidas células imediatamente até à irradiação, e. g., durante 1 ou 4 a 72 horas, de um modo preferido 4 a 24 horas, e. g., 12 a 20 horas ou pode ser removido do contacto imediatamente antes da irradiação, e. g., durante mais de 5 minutos, e. g., durante 10 minutos a 8 horas, e. g., 1 hora a 4 horas em meio isento de agente.

Opcionalmente, um ou outro ou ambos o agente fotossensibilizador e a molécula de transferência a ser introduzida em células podem ser ligados ou associados ou conjugados com uma ou mais moléculas transportadoras, moléculas direccionadoras ou vectores que podem actuar para facilitar ou 19 aumentar a incorporação do agente fotossensibilizador ou da molécula de transferência ou actuar para visar ou distribuir estas entidades a um tipo celular, tecido ou compartimento intracelular particular.

Os exemplos de sistemas veiculo incluem polilisina ou outros policatiões, sulfato de dextrano, lípidos catiónicos diferentes, lipossomas, partículas LDL reconstituídas, lipossomas estabilizados estericamente ou partículas de adenovírus. Estes sistemas veículo podem melhorar geralmente o farmacocinética e aumentar a incorporação celular da molécula de transferência e/ou do agente fotossensibilizador e podem também direccionar a molécula de transferência e/ou o agente fotossensibilizador para compartimentos intracelulares que são especialmente benéficos para obter internalização fotoquímica, mas estes não têm geralmente a capacidade de direccionar a molécula de transferência e/ou o agente fotossensibilizador para células (e. g., células de cancro) ou tecidos específicos. No entanto, para obter esse direccionamento específico ou selectivo as moléculas transportadoras, a molécula de transferência e/ou o fotossensibilizador podem ser associadas ou conjugadas com moléculas direccionadoras específicas que irão promover a incorporação celular específica da molécula de transferência para o interior de células pretendidas ou derivados. Essas moléculas direccionadoras podem também direccionar a molécula de transferência para compartimentos intracelulares que são especialmente benéficos para obter internalização fotoquímica.

Podem ser utilizadas muitas moléculas direccionadoras diferentes, e. g., como descrito em Curiel, D.T. (1999), Ann. New York Acad. Sei. 886, 158-171; Bilbao, G. et al. (1998), em Gene Therapy of Câncer (Walden et al., ed., Plenum Press, Nova 20

Iorque), Peng K.W. e Russell S.J. (1999), Curr. Opin. Biotechnol. 10, 454-457, Wickham T.J. (2000), Gene Ther. 7, 110-114. A molécula veículo e/ou a molécula direccionadora podem ser associadas, ligadas ou conjugadas com a molécula de transferência, com o agente fotossensibilizador ou com ambos e pode ser utilizado o mesmo veículo ou moléculas direccionadoras ou diferente. Se por exemplo forem utilizadas partículas de adenovírus como transportadores então as moléculas de transferência podem ser incorporadas dentro das partículas de adenovírus. Por exemplo se a molécula de transferência em questão for uma molécula de ADN codificando uma proteína ou uma molécula de ARN, então o ADN é incorporado no vector virai e após internalização fotoquímica a molécula de ADN irá estar presente na localização intracelular correcta de forma a que possa ocorrer a expressão da molécula codificada. A expressão dessas moléculas pode ser controlada pela concepção do vector através de métodos bem conhecidos e documentados na técnica. Por exemplo, podem ser utilizados elementos reguladores tais como por exemplo promotores específicos ou reguláveis para um tecido para obter expressão específica ou regulável para um tecido ou uma doença. Por exemplo pode ser utilizado o promotor específico para um tecido promotor tirosinase específico para o melanoma. São bem conhecidos promotores reguláveis tal como os promotores regulados pela tetracilina. Mais exemplos de promotores específicos ou regulados que podem ser utilizados na presente invenção podem ser encontrados em Hart, I.R., 1996, Semin. Oncol. 23, 154-158; Hallahan, D.E. et al., 1995, Nature Med. 1, 786-791; Luna, M.C. et al. 2000, Câncer Res. 60, 1637-1644; 21

Moleiro, N. e Whelan, J., 1997, Hum. Gene Ther Wickham, T.J, 2000, Gene Ther. 7, 110-114; Nettelbeck D. M. e Muller; J.V., 2000, Trends Genet. 16, 174-181; Clackson, T., 2000, Gene Ther. 7, 120-125; Freundlieb, S, et al., 1999, J. Gene Med. 1, 4-12; Spear M.A., 1998, Anticancer Res. 18, 3223-31, Harvey, D.M. e Caskey C.T., 1998, Curr. Opin. Chem. Biol. 2, 512-518; Clary, B.M. e Lyerly, H.K., 1998, Surg. Oncol. Clin. North Am. 7, 565-574. Luna, MC et al. Câncer Res. 60, 1637-1644; e as referências aí contidas.

Como referido acima, podem ser utilizados simultaneamente mais que um veículo e/ou molécula direccionadora ou vector. Por exemplo os vectores podem ser proporcionados num veículo, e. g., vectores virais, tal como adenovírus, podem ser transportados, e. g. num lipossoma ou numa estrutura policatiónica.

Os veículos e vectores preferidos para utilização na presente invenção, particularmente para a utilização em conjunto com a molécula de transferência, incluem adenovírus, policatiões tais como polilisina (e. g., poli-L-lisina ou poli-D-lisina) , polietilenoimina ou dendrímeros (e. g., dendrímeros catiónicos tal como SuperFect®) ; lípidos catiónicos tais como DOTAP ou Lipofectin; péptidos e vectores direccionados tais como e. g., transferrina polilisina ou vectores adenovirais direccionados. Numa forma de realização particularmente preferida da invenção o veículo é um adenovírus.

Essas moléculas ou veículos direccionadores como descritos acima podem ser também utilizados para direccionar a molécula de transferência para compartimentos intracelulares particulares especialmente benéficos para a utilização de PCI, por exemplo lisossomas ou endossomas. 22 0 compartimento delimitado por uma membrana intracelular pode ser qualquer dos compartimento que esteja presente numa célula. De um modo preferido o compartimento irá ser uma vesícula membranar, especialmente um endossoma ou um lisossoma. No entanto, o compartimento intracelular pode também incluir o aparelho Golgi ou o retículo endoplasmático. 0 passo de irradiação com luz para activar o agente fotossensibilizador pode realizar-se de acordo com as técnicas e os processos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, o comprimento de onda e a intensidade da luz pode ser seleccionada de acordo com o agente fotossensibilizador utilizado. As fontes de luz adequadas são bem conhecidas na técnica. 0 tempo durante o qual as células estão expostas à luz nos métodos da presente invenção pode variar. A eficiência da internalização da molécula de transferência no citosol parece aumentar com a exposição aumentada à luz. Uma duração preferida do passo de irradiação depende do fotossensibilizador, da quantidade de fotossensibilizador acumulado nas células ou tecido alvo e da sobreposição entre o espectro de absorção do fotossensibilizador e o espectro de emissão da fonte de luz. Geralmente, a duração do passo de irradiação está na ordem dos minutos a várias horas, e. g., de um modo preferido até 60 minutos, e. g., de 0,5 ou 1 a 30 minutos, e. g., desde 0,5 a 3 minutos ou desde 1 a 5 minutos ou desde 1 a 10 minutos, e. g., de 3 a 7 minutos e de um modo preferido aproximadamente 3 minutos, e. g., 2,5 a 3,5 minutos. As doses de luz adequadas podem ser seleccionadas por um especialista na técnica e irão novamente depender do fotossensibilizador e da quantidade de fotossensibilizador acumulado nas células ou tecidos alvo. Por exemplo, as doses de luz tipicamente utilizadas para o tratamento fotodinâmico de cancros com o fotossensibilizador Fotofrin e o precursor da 23 protoporfirina ácido S-aminolevulínico estão na gama 50-150 J/cm2 numa gama de fluxo de menos de 200 mW/cm2 de forma a evitar hipertermia. As doses de luz são normalmente mais baixas quando são utilizados fotossensibilizadores com coeficientes de extinção mais elevados na área do vermelho do espectro visível. No entanto, para o tratamento de tecidos não-cancerosos com menos fotossensibilizador acumulado a quantidade total de luz necessária pode ser substancialmente mais elevada do que para o tratamento de cancros. A determinação das doses adequadas de moléculas alvo para utilização nos métodos da presente invenção será prática de rotina para um especialista na técnica. Quando a molécula de transferência é uma proteína ou um péptido, as moléculas de transferência irão ser geralmente utilizadas para aplicações in vitro em doses de menos de 5 mg/mL (por exemplo 0,1-5 mg/mL) e as moléculas de transferência irão ser geralmente utilizadas para aplicações in vivo em doses de menos de 5 mg/kg (e. g., 0,l-5mg/kg). Quando a molécula de transferência é um ácido nucleico, uma dose característica das moléculas de transferência para aplicações in vitro irá ser aproximadamente 0,1-50 pg de ácido nucleico por 104 células e para aplicações in vivo aproximadamente 10“6 - 1 g de ácido nucleico por injecção em humanos. Quando a molécula de transferência está associada com um veículo adenoviral, uma dose característica para aplicações in vitro irá situar-se entre 1 - 1 x 105 partículas físicas de vírus, e. g., 1 x 103 - 1 x 105 partículas por célula e a molécula a ser introduzida em associação com o veículo adenoviral pode estar presente para aplicações in vivo numa concentração de 1 x 10-9 a 50% tal como 3 x 10~6 a 50%, e. g., 0, 003 a 30%, e. g., 0,2 a 10% (p/p) de partículas de vírus na composição final para utilização in vivo em que p/p se refere ao peso do veículo virai 24 para além da molécula a ser introduzida em relação ao peso da composição final. Se for utilizado em injecções de 1 mL, isto irá corresponder a uma dose aproximadamente 105 a 1015 partículas virais físicas.

Os métodos da invenção irão inevitavelmente originar alguma morte celular devido ao tratamento fotoquímico, i. e., através da acção do agente fotossensibilizador. No entanto, esta morte celular será importante e pode, de facto, ser vantajosa para muitas das aplicações (e. g., tratamento do cancro) e os métodos da invenção podem ser modificados de forma a que a fracção ou a proporção das células sobreviventes seja regulada por selecção da dose de luz em relação à concentração do agente fotossensibilizador. Novamente, essas técnicas são conhecidas na técnica. Independentemente da quantidade de morte celular induzida pelo tratamento fotoquímico puro, é importante que a dose de luz seja regulada de forma a que algumas células individuais em que o efeito da PCI se manifeste não sejam mortas pelo tratamento fotoquímico puro (embora estas possam ser subsequentemente mortas devido ao efeito da PCI).

Em algumas aplicações pode ser adequado conservar um maior número de células viáveis após tratamento por PCI. Por exemplo em vacinação e em alguns métodos de terapia génica são importantes as células viáveis que permitem por exemplo a apresentação de antigénio ou a expressão proteica. Nessas aplicações é adequado que uma população ou a pluralidade das células, substancialmente todas as células ou uma maioria significativa (e. g., pelo menos 50%, de um modo mais preferido pelo menos 60, 70, 80 ou 90% das células) não são mortas. Isto obviamente nem sempre é desejável sobretudo quando a PCI é utilizada para introduzir moléculas de transferência citotóxicas 25 e a morte celular adicional não é desvantajosa. Os efeitos citotóxicos podem também no entanto serem obtidos utilizando por exemplo terapia génica em que um gene terapêutico é internalizado em células tumorais pelo método da invenção e. g., de forma a que estas células produzam substâncias imunologicamente activas que irão induzir a morte imunológica local de células das restantes do cancro ou irão induzir uma resposta imunitária sistémica às células tumorais. Nesse casos, claramente após tratamento por PCI é necessária uma proporção de células viáveis.

As vantagens dos presentes métodos e a sequência de passos de tratamento, especialmente as formas de realização em que a molécula de transferência é adicionada às células após o passo de irradiação com luz, em comparação com os métodos anteriormente descritos são a) os danos fotoquímicos à molécula de transferência são diminuídos; b) simplificação do tratamento por PCI de lesões internas na combinação com cirurgia uma vez o tratamento fotoquímico pode ser realizado após a exposição cirúrgica da lesão seguida por e. g. injecção intra tumoral ou outra administração local da molécula de transferência; c) os métodos são mais independentes do momento exacto do tratamento,, i. e., o momento da adição da molécula a ser incorporada pelas células em relação ao momento da iluminação. Isto significa que existe uma maior "janela temporal" para o tratamento. Isto é importante uma vez que a incorporação de uma molécula terapêutica pode variar amplamente em situações 26 clínicas diferentes e além disso, a incorporação é difícil de estimar para lesões individuais numa situação clínica, consequentemente tornando uma maior janela temporal extremamente vantajosa; d) ocorre uma translocação rápida da molécula de transferência para o citosol reduzindo substancialmente deste modo as possibilidades de degradação lisossómica da molécula de transferência.

Estas vantagens são adicionais às vantagens associadas aos métodos de internalização de moléculas PCI per se ,, i. e., 1) não existe qualuer restrição ao tamanho da molécula a ser internalizada e distribuída ao citosol desde que a molécula possa ser endocitada pela célula alvo 2) os métodos não são dependentes da proliferação celular; 3) os métodos são específicos para um local por apenas as áreas expostas à luz serem afectadas; 4) não são oncogénicos.

Os passos de "fazer contactar" as células com um agente fotossensibilizante e com a molécula de transferência podem ser realizados de qualquer forma conveniente ou pretendida. Deste modo, se o passo de contacto se destinar a ser realizado in vitro as células podem ser convenientemente mantidas num meio aquoso tal como por exemplo meio de cultura celular adequado e no momento adequado podem ser simplesmente adicionados agente fotossensibilizador ou molécula de transferência ao meio sob condições adequadas, por exemplo numa concentração adequada e durante um período de tempo adequado. 27 0 agente fotossensibilizador é levado ao contacto com as células numa concentração adequada e durante um período de tempo adequado que pode ser facilmente determinado por um especialista na técnica utilizando técnicas de rotina e irá depender do agente fotossensibilizador particular utilizado e do tipo celular. A concentração do agente fotossensibilizador deve ser de forma a que uma vez incorporado na célula, e. g., no interior ou associado com um ou mais dos seus compartimentos intracelulares e activado pela irradiação, são destabilizadas uma ou mais estruturas celulares e. g., um ou mais compartimentos intracelulares são lisados ou destabilizados. Por exemplo os agentes fotossensibilizantes aqui utilizados nos Exemplos podem ser utilizados numa concentração de por exemplo 10 a 50 pg/mL. Para utilização in vitro a gama pode ser muito mais ampla, e. g.f 0,05-500 pg/mL. Para tratamentos in vivo em humanos o agente fotossensibilizador pode ser utilizado na gama 0,05-20 mg/kg de peso corporal quando administrado sistemicamente ou 0,1-20% num solvente para aplicação tópica. Em animais mais pequenos a gama de concentração pode ser diferente e pode ser ajustada consequentemente. 0 tempo de incubação das células com o agente fotossensibilizador (i. e. o tempo de "contacto") pode variar desde alguns minutos a várias horas, e. g., mesmo até 48 horas ou mais tempo. O tempo de incubação deve ser de forma a que o agente fotossensibilizador seja incorporado pelas células adequadas. A incubação das células com o agente fotossensibilizador pode ser opcionalmente seguida a um período de incubação com meio isento de fotossensibilizador antes das células serem expostas à luz ou a molécula de transferência ser adicionada. 28 A molécula de transferência pode ser qualquer molécula como discutido acima e é levada ao contacto com as células numa concentração adequada e durante um intervalo de tempo adequado. Surpreendentemente foi verificado que o contacto pode ser iniciado até várias horas após a irradiação. Pode ser determinada uma concentração adequada dependendo da eficiência da incorporação da molécula em questão nas células em questão e da concentração final que se pretende obter nas células. Deste modo "tempo de transfecção" ou "tempo de incorporação celular", i. e., o tempo em que as moléculas estão em contacto com as células pode ser de alguns minutos ou até algumas horas, pode ser utilizado por exemplo um tempo de transfecção de 10 minutos até 24 horas, por exemplo de 30 minutos até 10 horas ou por exemplo de 3 0 minutos até 2 horas ou 6 horas. Um tempo de transfecção aumentado resulta normalmente numa incorporação aumentada da molécula em questão. No entanto, os tempos de incubação mais curtos, por exemplo 30 minutos a 1 hora, parecem resultar numa especificidade melhorada da incorporação da molécula. Deste modo, na selecção de um tempo de transfecção para qualquer método, deve ser atingido um equilíbrio adequado entre a obtenção de uma incorporação suficiente da molécula mantendo simultaneamente uma especificidade suficiente de incorporação.

Um método adequado e um tempo de incubação in vivo em que as moléculas de transferência e os agentes fotossensibilizadores sejam levados ao contacto com as células alvo irá ser dependente do modo de administração e do tipo de molécula de transferência e dos agentes fotossensibilizadores. Por exemplo, se a molécula de transferência for injectada num tumor que se destine a ser tratado, as células próximas do ponto de injecção irão entrar em contacto com esta e deste modo irão tendencialmente incorporar a 29 molécula de transferência mais rapidamente do que as células localizadas a uma maior distância do ponto de injecção, que irão provavelmente entrar em contacto com a molécula de transferência num momento ulterior e a uma concentração mais baixa. Além disso, uma molécula de transferência administrada por injecção intravenosa pode demorar algum tempo a chegar às células alvo e esta pode originar deste modo uma pós-administração mais demorada e. g., vários dias, de forma a que se acumule uma quantidade suficiente ou óptima da molécula de transferência numa célula ou tecido alvo. Aplicam-se obviamente as mesmas considerações ao tempo de administração necessário para a incorporação do agente fotossensibilizador no interior das células. 0 tempo de administração necessário para células individuais in vivo é deste modo susceptivel de variar dependendo destes e de outros parâmetros.

No entanto, embora a situação in vivo seja mais complicada do que in vitro, o conceito subjacente da presente invenção é ainda o mesmo,, i. e., o tempo em que as moléculas entram em contacto com as células alvo deve ser de forma a que seja incorporada uma quantidade adequada do agente fotossensibilizador pelas células alvo antes de ocorrer a irradiação e também: (i) durante a irradiação a molécula de transferência esteja a ser incorporada ou (ii) após a irradiação a molécula de transferência está em contacto com as células durante um periodo do tempo suficiente para permitir a sua incorporação nas células. 0 termo "célula" é aqui utilizado para incluir todas as células eucariotas (incluindo células de insecto e células fúngicas). As "células" representativas incluem deste modo todos os tipos de células de animais mamíferos e não-mamíferos, 30 células vegetais, células de insecto, células fúngicas e protozoários.

Os métodos da presente invenção podem ser utilizados in vitro ou in vivo, por tratamento in situ (por exemplo utilizando partes direccionadoras) ou por tratamento ex vivo seguido por administração das células tratadas ao organismo.

Os métodos da presente invenção podem ser utilizados por exemplo no tratamento do cancro. Vários fotossensibilizadores acumulam-se de um modo preferido em tecidos neoplásicos, sendo a selectividade para um tumor em relação ao tecido circundante normalmente um factor de 2-3, mas este factor pode em alguns casos, tal como para tecidos cerebrais, ser mais elevado,, i. e., até 30. Alternativamente, um agente fotossensibilizador particular pode ser direccionado para um tumor particular pelos métodos descritos acima. Além disso, as moléculas que possam ter interesse clínico para o tratamento do cancro, mas que estejam restringidas por uma incorporação baixa ou nula no citosol podem ser introduzidas no citosol e direccionadas para células específicas através da presente invenção. A gelonina, como exemplificado abaixo, é um exemplo de uma dessas moléculas. Podem ser utilizadas outras moléculas, isoladas ou ligadas a outras moléculas que direccionam a molécula a ser internalizada para uma célula particular (e. g., anticorpos, transferrina, fotossensibilizadores, apoB em partículas LDL reconstituídas). A vantagem desse tratamento de combinação irá ser 1) efeito citotóxico intensificado em camadas mais profundas dos tecidos tumorais uma vez que são suficientes doses baixas e subtóxicas de luz para a destabilização de lisossomas e endossomas; 2) especificidade intensificada do tratamento uma vez que a PCI é apenas administrada à área tumoral. 31

Os métodos da invenção podem ser também utilizados para o tratamento de vários outros distúrbios, como ditado pela selecção da molécula a ser introduzida na célula, tais como artrite reumatóide, arterosclerose e outras doenças cardiovasculares, vírus e outras infecções, psoríase, queratose solar, cicatrização de feridas, consolidação de fracturas, verrugas e distúrbios genéticos hereditários tais como fibrose quística, síndroma de Gorlin e ataxia telangiectasia.

Os métodos da invenção podem ser também utilizados em terapia génica,, i. e., na transferência terapêutica de genes para células de um doente. A terapia génica é promissora como um método para tratar muitas doenças tais como cancro, doenças cardiovasculares, infecções virais, distúrbios monogénicos tais como fibrose quística e muitas outras patologias tais como as descritas acima. Um problema significativo em terapia génica actualmente consiste na elevada eficiência e especificidade de transferência génica que deve ocorrer in vivo. Nos métodos actuais são utilizados muitos veículos ou vectores diferentes para realizar a transferência génica em terapia génica. Podem ser referidos compostos policatiónicos, lípidos catiónicos e sistemas virais como exemplos, mas até ao momento a terapia génica in vivo revelou-se com pouco sucesso. Entre as muitas desvantagens conhecidas dos métodos actuais encontram-se a baixa estabilidade do vector no soro, especificidade limitada na distribuição génica, eficiência baixa na distribuição génica etc. Os métodos de PCI da presente invenção proporcionam um meio para melhorar substancialmente a eficiência e a especificidade de muitos dos métodos de distribuição génica presentemente utilizados em terapia génica, melhorando o passo do libertação endossómica que pode ser limitativo da eficiência para muitos vectores de distribuição génica sintéticos e para vários 32 sistemas virais. 0 tratamento com luz inerente ao método PCI permite também definir precisamente onde irá ocorrer no organismo a transferência génica intensificada, uma vez que o aumento da eficiência de transferência génica irá apenas ocorrer em áreas iluminadas. A transfecção pode ser realizada, in vitro, in vivo ou ex vivo (com células ou tecidos que são administrados ao doente como adequado) . De um modo preferido os veículos adequados e os vectores para transfecção incluem adenovírus, policatiões tais como polilisina (e. g., poli-D-lisina ou poli-L-lisina), SuperFect®, polietilenoimina ou dendrímeros; lípidos catiónicos tais como DOTAP ou Lipofectin ou lípidos catiónicos formulados com um "lípido auxiliador" tal como DOPE; péptidos e vectores direccionados tais como e. g., transferrina polilisina ou vectores adenovirais direccionados. Numa forma de realização preferida da invenção o veículo utilizado para o gene terapêutico é um adenovírus.

Um outro aspecto preferido da presente invenção consiste em utilizar sistemas veículo não-virais tais como por exemplo polímeros catiónicos incluindo péptidos e lípidos catiónicos. Os polímeros típicos incluem por exemplo poliamina, poliaminoácidos incluindo poliaminoácidos básicos, polímeros de açúcares catiónicos sintéticos e naturais, polímeros de metacrilato, dendrímeros, polialquilenaminas e outros polímeros conhecidos na técnica como sendo úteis na distribuição de fármacos especialmente polímeros úteis na distribuição génica. Os compostos típicos úteis de acordo com a presente invenção incluem polilisina, poliarginina, ácido poli-L-glutâmico, polivinilpiridina, quitosano, polietilenemina, poli(2-dimetilamino)metacrilato de etilo, histonas, protamina, poli(L-ornitina) , avideno, espermina, espermidina e quaisquer seus derivados. Num aspecto preferido da presente invenção o 33 polímero aqui descrito pode ser combinado com outros polímero ou combinado com outros sistemas de distribuição de genes. 0 sistema de distribuição génica não-viral útil de acordo com a presente invenção, por exemplo, é descrito em R.I. Mahato et al. em Advances in Genetics (Ed J.C. Hall et al.) (1999) 41 95-156. São ainda descritos polímeros catiónicos em M.C. Garnett em Criticai Reviews in Therapeutical Drug Carrier Systems (1999), 16, 147-207, K.A. Howard et al. em Biochimica et Biophysica Acta (2000), 1475, 245-255, H.K. Nguyen et al. em Gene Therapy (2000), 7, 126-138, A. Bragonzi et al. em J. Controlled Release (2000), 65, 187-202, S.C. DeSmedt et al. em Pharmaceutical Reseach (2000), 17, 113-126 e R.I. Mahoto em J. Drug Targeting (1999), 7, 249-268.

Um outro aspecto da presente invenção envolve a utilização de lipossomas ou de outras construções baseadas em lípidos como sistemas veículo não-virais. Os lipossomas podem ser lipossomas sensíveis a pH ou lipossomas não sensíveis a pH. Os lipossomas sensíveis a pH são pelo menos um componente sensível ao pH na membrana do lipossoma. Os compostos típicos incluem ácidos gordos tais como ácido oleico, palmitoil-homocisteína, colesterol, hemissuccinato sal de morfolina e dieloilsuccinilglicerol. Além dos componentes sensíveis ao pH, os lipossomas podem consistir em dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) e/ou outros fosfolípidos semelhantes.

Os lipossomas ou outros sistemas de distribuição baseados em lípidos contêm de um modo preferido pelo menos um lípido catiónico. O sistema de distribuição à base de lípidos pode estar presente em vários tipos de formulação aquosa. São utilizados na 34 literatura vários termos para estas formulações: lipossomas multilamelares, lipossomas unilamelares, lipossomas sensíveis ao pH, nanoemulsões, nanopartículas, proteolipossomas, virossomas, quimeroassomas, coquelatos, lipofectin® e lipoplex. As referências à utilização de lípidos catiónicos na transferência qénica incluem P.L. Felgner et al. em Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1987), 84, 7413-7417, D.D. Lasic et al. em Adv. Drug Del Rev (1996), 20, 221266. L.G. Barron et al. em Gene Therapy (1999), 6 1179-1183, S. Kawakami et al. em Pharmaceutical Research (2000), 17, 306-313. N.S. Templeton et al. em Molecular Biotechnology (1999) , 11, 175-180, Y. Zou et al. em Câncer Gene Therapy (2000) , 7, 683-696, D.D. Stuart et al. em Biochemistry et Biophysica Acta (2000), 1463, 219229, R.I. Mahato et al. em Drug Deliv (1997) 4 151 e R.J. Lee et al. em Crit Rev Drug Carrier Syst (1997), 14, 173.

Nos documentos US 6120751, US 6056938, US 6093 816 us 6039936, US 6034137, US 603413 5, US 6020526, us 5980 935 us 5958935, US 5935936, US 587722 o, US 5830430, us 5777 153 us 5705693, US 5459127, US 5334761, US 526 4618 e referê ncia; s a contidas são, por exemplo descritos lipidos úteis de acordo com a presente invenção.

Os exemplos típicos de lípidos catiónicos incluem cloreto de N [1-(2,3-dioleiloxi)propil-N,N,N-trimetil-amónio (DOTMA), brometo de 1,2-dimiristil-oxipropil-3-dimetil-hidroxietilamónio (DMRIE), 1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamino)propano (DOTAP), 3β (N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil-colesterol (DCChol), trifluoracetato de 2,3-dioleil-oxi-N [2-esperminacarboxiil- amido]etil-N,N-dimetil-l-propanamínio (DOS PA), 3-β (N4-espermina carbamoil)-colesterol, 3-β (N4-espermidina carbamoil)-colesterol e dio-octadecilamidoglilespermina (DOGS). 35

Como descrito acima, numa das formas de realização preferidas da invenção o veiculo são lipidos catiónicos. Foi descrito anteriormente que o tratamento fotoquimico tem um efeito de inibidor sobre a transfecção mediada por lipidos catiónicos quando a luz é proporcionada após a molécula de transferência (Prasmickaite et ai. (2000), J. Gene Med. 6, em publicação). No entanto, foi aqora muito surpreendentemente demonstrado que quando a luz é proporcionada antes da molécula de transferência a PCI pode ter um efeito estimulante na transfecção por lipidos catiónicos (ver o Exemplo 9).

Deste modo, um aspecto adicional da invenção proporciona uma composição contendo uma molécula de transferência como aqui definida e separadamente um agente fotossensibilizador como aqui definido como uma composição combinada para utilização separada ou sequencial no tratamento ou na prevenção de uma doença, distúrbio ou infecção, em que o referido agente fotossensibilizador e separadamente a referida molécula de transferência se destina a ser feita contactar com células ou tecidos de um doente e as referidas células se destinam a ser irradiadas com luz de um comprimento de onda eficaz para activar o agente fotossensibilizador e a irradiação deve ser realizada um momento antes ou ao mesmo tempo em que é feita contactar a referida célula com a molécula de transferência, em que a referida molécula de transferência é uma molécula terapêutica. Opcionalmente a molécula de transferência e/ou o agente fotossensibilizador nas composições podem ser associadas com moléculas transportadoras tais como as descritas acima. De um modo preferido as composições são utilizadas para terapia do cancro ou terapia génica. Uma molécula veiculo para terapia génica preferida é um adenovirus. Os lipidos catiónicos são outros veículos preferidos. 36

Num aspecto adicional consequentemente a presente invenção proporciona a utilização de uma molécula de transferência e de um agente fotossensibilizador em que o agente fotossensibilizador e a molécula de transferência são como aqui definidos para a preparação de um medicamento para a utilização no tratamento ou na prevenção de uma doença, distúrbio ou infecção, de um modo preferido para terapia génica, estimulando uma resposta imunitária ou para tratar ou prevenir o cancro, em que o referido agente fotossensibilizador e separadamente a referida molécula de transferência se destina a ser feita contactar com células ou tecidos de um doente e as referidas células se destinam a ser irradiadas com luz de um comprimento de onda eficaz para activar o agente fotossensibilizador e a irradiação se destina a ser realizada um momento antes ou ao mesmo tempo em que é feita contactar a referida célula com a molécula de transferência, em que a referida molécula de transferência é uma molécula terapêutica.

Como aqui definido "tratamento" refere-se a redução, alivio ou eliminação de um ou mais sintomas da doença, distúrbio ou infecção que está a ser tratado, em relação aos sintomas antes do tratamento. "Prevenção" refere-se ao atraso ou à prevenção do estabelecimento dos sintomas da doença, distúrbio ou infecção.

Como referido anteriormente, esses métodos têm também aplicação em métodos da vacinação. Consequentemente, um aspecto adicional da invenção proporciona um método de expressão ou de apresentação in vitro de uma molécula antigénica (a molécula de transferência) ou de uma sua parte na superfície de uma célula, de um modo preferido uma célula apresentadora de antigénio, em que o referido método compreende os passos como aqui definidos 37 acima. A segunda utilização médica correspondente é um aspecto adicional desta invenção.

Como aqui utilizado "expressão" ou "apresentação" referem-se à presença da molécula ou de uma sua parte na superfície da referida célula de forma a que pelo menos uma porção dessa molécula esteja exposta e acessível ao ambiente que rodeia essa célula. Pode ser obtida expressão na "superfície" em que a molécula a ser expressa está em contacto com a membrana celular e/ou componentes que possam estar presentes ou sejam tornados presentes nessa membrana.

De um modo preferido, essa apresentação antigénica pode resultar vantajosamente no estímulo de uma resposta imunitária, de um modo preferido uma resposta imunitária que confere protecção contra o desafio subsequente por uma entidade compreendendo ou contendo a referida molécula de antigénio ou sua parte e consequentemente a invenção encontra utilidade particular como uma utilização para vacinação. De um modo preferido consequentemente a presente invenção proporciona uma utilização para vacinação compreendendo a utilização aqui acima descrita.

Neste aspecto da invenção, a molécula de transferência como aqui definida é designada como uma "molécula antigénica". A molécula antigénica pode ser qualquer molécula em que essa molécula ou uma sua parte sejam capazes de estimular uma resposta imunitária, quando apresentadas ao sistema imunitário de uma forma adequada. De um modo vantajoso, consequentemente a molécula antigénica irá ser um antigénio de vacina ou um componente de vacina, tal como uma entidade contendo um polipéptido. 38

Muitos desses antigénios ou componentes de vacina antigénicos são conhecidos na técnica e incluem todas as formas de antigénios bacterianos ou virais ou de facto antigénios ou componentes antigénicos de qualquer espécie patogénica incluindo protozoários ou organismos superiores. Embora tradicionalmente os componentes antigénicos de vacinas tenham compreendido organismos inteiros (vivos, mortos ou atenuados), i. e., vacinas de células inteiras, têm sido adicionalmente amplamente investigadas e descritas na literatura vacinas de sub-unidade,, i. e., vacinas baseadas em componentes antigénicos particulares de organismos e. g., proteínas ou péptidos ou mesmo hidratos de carbono. Algum desses componentes de vacina baseados em "sub-unidades" podem ser utilizados como a molécula antigénica da presente invenção. No entanto, a invenção encontra utilidade particular no campo das vacinas peptídicas. Deste modo, uma molécula antigénica preferida de acordo com a invenção é um péptido (que é aqui definido como incluindo péptidos com comprimentos mais curtos e mais longos, i. e., péptidos, oligopéptidos ou polipéptidos e também moléculas proteicas ou os seus fragmentos e. g., péptidos com 5-500 e. g., 10 a 250 tais como 15 a 75 ou 8 a 25 aminoácidos) . As partes de moléculas antigénicas que são apresentadas ou expressas compreendem de um modo preferido partes que são produzidas pela maquinaria de processamento de antigénios no interior da célula. As partes podem no entanto ser produzidas por outros meios que pode ser obtidos através da concepção adequada de antigénios (e. g., bandas sensíveis a pH) ou através de outros meios de processamento de células. Convenientemente essas partes têm tamanho suficiente para produzir uma resposta imunitária, e. g., no caso de péptidos de tamanho superior a 5, e. g., superior a 10 ou 20 aminoácidos. 39

Tem sido proposto na literatura um número vasto de candidatos de vacinas peptídicas, por exemplo no tratamento de doenças virais e infecções tais como SIDA/infecção com HIV ou influenza, parvovírus canino, vírus da leucemia bovina, hepatite, etc. (ver e. g., Phanuphak et al., Asian Pac. J.

Alergy. Immunol. 1997, 15 (1), 41-8; Naruse, Hokkaido Igaku

Zasshi 1994, 69(4), 811-20; Casal et al., J. Virol., 1995, 69(11), 7274-7; Belyakov et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1998, 95(4), 1709-14; Naruse et al., Proc. Natl. Sei. USA, 1994 91(20), 958892; Kabeya et al., Vaccine 1996, 14(12), 1118-22;

Itoh et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1986, 83(23) 9174-8.

Podem ser utilizados péptidos bacterianos do mesmo modo, como de facto podem ser antigénios de péptidos derivados de outros organismos ou espécies.

Além de antigénios derivados de organismos patogénicos, foram também propostos péptidos para a utilização como vacinas contra o cancro ou outras doenças tal como esclerose múltipla. Por exemplo, péptidos de oncogenes mutantes constituem uma grande esperança como vacinas contra cancro actuando em antigénios na simulação de linfócitos T citotóxicos. (Schirrmacher, Jornal of Câncer Research and Clinicai Oncology 1995, 121, 443-451; Curtis Câncer Chemotherapy and Biological

Response Modifiers. 1997, 17, 316-327) . Foi também avaliada uma vacina peptídica sintética para o tratamento do melanoma metastático (Rosenberg et al., Nat. Med. 1998, 4 (3), 321-7). Em

Wilson et al., J. Neuroimmunol. 1997, 76 (1-2), 15-28 é descrita

uma vacina peptídica de receptor de células T para o tratamento da esclerose múltipla. Pode ser utilizado qualquer desses componentes de vacina peptídica como a molécula antigénica da invenção, assim como pode de facto qualquer dos péptidos descritos ou propostos na literatura como vacinas peptídicas. O 40 péptido pode ser deste modo sintético ou isolado ou de outra forma derivado de um organismo. A célula que é submetida aos métodos, utilizações etc. deste aspecto da invenção pode ser qualquer célula que seja capaz de expressar ou apresentar na sua superfície uma molécula que é administrada ou transportada para o seu citosol.

Uma vez que a utilidade principal deste aspecto da invenção reside na apresentação de antigénio ou vacinação, a célula é convenientemente uma célula efectora imunitária, i. e., uma célula envolvida na resposta imunitária. No entanto, outras células podem também apresentar o antigénio ao sistema imunitário e estas situam-se também no âmbito deste aspecto da invenção. As células de acordo com este aspecto são deste modo vantajosamente células apresentadoras de antigénio. A célula apresentadora de antigénio pode estar envolvida em qualquer aspecto ou "ramificação" da resposta imunitária, incluindo imunidade humoral e mediada por células, por exemplo o estímulo da produção de anticorpos ou o estímulo de células citotóxicas ou assassinas, que podem reconhecer e destruir (ou de outra forma eliminar) as células expressando antigénios "exógenos" na sua superfície. 0 termo "estímulo de uma resposta imunitária" inclui deste modo todos os tipos de respostas imunitárias e mecanismos para os estimular. 0 estímulo de células citotóxicas ou de células produtoras de anticorpos, requer que antigénios sejam apresentados à célula a ser estimulada de uma forma particular pelas células apresentadoras do antigénio, por exemplo apresentação do MHC da Classe I (e. g., a activação de células T citotóxicas CD8+ requer a apresentação de antigénio MHC-1). 41

As células apresentadoras de antigénio são conhecidas na técnica e descritas na literatura e incluem por exemplo, linfócitos (células T e B), células dendriticas, macrófagos etc. Outras incluem por exemplo células de cancro e. g. células de melanoma.

Para a apresentação de um antigénio por uma célula apresentadora de antigénio a uma célula T citotóxica (CTL) a molécula antigénica tem de entrar no citosol da célula apresentadora de antigénio (Germain, Cell, 1994, 76, 287-299). A presente invenção proporciona um meio eficiente de distribuição da molécula antigénica no citosol.

Uma vez libertado na citosol celular pelo processo de internalização fotoquímica, a molécula antigénica pode ser processada pela maquinaria de processamento do antigénio da célula e ser apresentada na superfície celular de uma forma adequada e. g., pela MHC da Classe I. Este processamento pode envolver a degradação do antigénio, e. g., a degradação de uma proteína ou polipéptido antigénico em péptidos, em que os péptidos são então complexados com moléculas do MHC para apresentação. Deste modo, a molécula antigénica expressa ou apresentada na superfície celular de acordo com a presente invenção pode ser uma parte ou um fragmento da molécula antigénica que é incorporado na célula.

Os antigénios podem ser incorporados por células apresentadoras de antigénios por endocitose e serem degradados em péptidos nas vesículas endocíticas. Estes péptidos podem ligar-se a moléculas da classe II do MHC nos endossomas e serem transportados até à superfície celular onde o complexo péptido -classe II do MHC pode ser reconhecido por células T CD4+ 42 auxiliadoras e induzir uma resposta imunitária. Alternativamente, as proteínas no citosol podem ser degradadas nas suas parte, e. g., por proteassomas e transportadas para o retículo endoplasmático através de TAP (transportador associado com a apresentação do antigénio) onde os péptidos se podem ligar a moléculas da classe I do MHC e serem transportadas até à superfície celular como ilustrado na figura 1 (Yewdell e Bennink, 1992, Adv. Inununol. 52: 1-123). Se o péptido for de

origem antigénica exógena, o complexo péptido-classe I do MHC irá ser reconhecido por células T citotóxicas CD8+ (CTL). As CTL irão ligar-se ao complexo péptido - classe I do MHC (HLA) e deste modo irão ser activadas, iniciar a proliferação e formar um clone de CTL. A célula alvo e outras células alvo com o mesmo complexo péptido - classe I do MHC na superfície das células podem ser mortas pelo clone de CTL. Pode ser estabelecida imunidade contra o antigénio exógeno se puder ser introduzida uma quantidade suficiente do antigénio no citosol (Yewdell e Bennink, 1992, supra; Rock, 1996, Immunology Today 17: 131-137). Isto é a base para o desenvolvimento inter alia de vacinas contra o cancro. Um dos maiores problemas práticos é introduzir quantidades suficientes de antigénios (ou partes de antigénios) no citosol. Isto pode ser resolvido de acordo com a presente invenção por PCI.

As composições podem também compreender uma célula contendo uma molécula de transferência que tenha sido internalizada no citosol da referida célula por um método da invenção, para a utilização em terapia, particularmente terapia do cancro, terapia génica e vacinação.

Deste modo, é descrita uma célula ou uma população de células contendo uma molécula de transferência que foi 43 internalizada no citosol da referida célula, em que a célula é obtenível por um método da presente invenção. É descrita a utilização de uma dessas células ou população de células para a preparação de uma composição ou um medicamento para utilização em terapia, de um modo preferido terapia do cancro, terapia génica ou vacinação. É descrito um método de tratamento de um doente compreendendo a administração ao referido doente células ou composições da presente invenção,, i. e., um método compreendendo os passos de introdução de uma molécula numa célula como aqui descrita acima e administrar a referida célula preparada deste modo ao referido doente. Os referidos métodos podem ser utilizados para tratar o cancro, em terapia génica ou para vacinação.

Pode ser utilizado in vivo, qualquer modo de administração normal ou convencional na técnica, e. g., injecção, infusão, administração tópica, a superfícies corporais internas e externas, etc. Para utilização in vivo, a invenção pode ser utilizada em relação a qualquer tecido que contenha células nas quais o agente fotossensibilizador e a molécula de transferência estejam localizados, incluindo localizações em fluido corporal, assim como em tecidos sólidos. Todos os tecidos podem ser tratados desde que o fotossensibilizador seja incorporado pelas células alvo e a luz possa ser adequadamente distribuída.

Deste modo, as composições e os medicamentos da invenção podem ser formulados em qualquer forma conveniente de acordo com as técnicas e os processos conhecidos na técnica farmacêutica, e. g., utilizando um ou mais veículos ou excipientes 44 farmaceuticamente aceitáveis. "Farmaceuticamente aceitável" como aqui referido refere-se a ingredientes que são compatíveis com outros ingredientes da composição ou medicamento assim como fisiologicamente aceitáveis para o receptor. A natureza da composição ou medicamento e dos veículos ou materiais excipientes, dosagens etc. pode ser seleccionada de uma forma rotineira de acordo com a preferência e a via de administração pretendida, o objectivo do tratamento etc. As dosagens podem ser do mesmo modo determinadas de uma forma rotineira e podem depender da natureza da molécula, objectivo do tratamento, idade do doente, modo de administração etc. No que respeita ao agente fotossensibilizador deve ser também tida em consideração a potência/capacidade de destabilização de membranas na irradiação. A invenção irá ser agora descrita mais detalhadamente nos seguintes Exemplos não limitativos com referência aos desenhos seguintes em que: A figura 1 mostra a transfecção induzida pela luz de células THX com um complexo pEGFP-Nl polilisina, em que as células são feitas contactar com complexo pEGFP-Nl polilisina antes ou após as células serem expostas à luz como indicado na Figura. A figura 2 mostra a transfecção induzida pela luz de células HCT116 com um complexo pEGFP-Nl polilisina, em que as células são feitas contactar com o complexo pEGFP-Nl polilisina antes ou após as células serem expostas à luz como indicado na Figura. 45 A figura 3 mostra o tratamento induzido por luz de células THX com gelonina e deste modo uma redução da síntese proteica, em que as células são feitas contactar com a molécula de gelonina antes ou após as células serem expostas à luz como indicado na Figura. A figura 4 mostra o efeito sobre a eficiência da transfecção induzida pela luz de células THX de contactar as células com o complexo pEGFP-Nl polilisina imediatamente após a exposição à luz e em momentos ulteriores após a exposição à luz. A figura 5 mostra o efeito na eficiência da transfecção induzida pela luz de células THX quando as células são feitas contactar com o complexo pEGFP-Nl polilisina em momentos variáveis antes e após a exposição à luz. A figura 6 mostra o efeito na transfecção induzida pela luz de células THX quando as células são feitas contactar com o complexo pEGFP-Nl polilisina durante vários períodos de tempo após a exposição à luz. A figura 7 mostra uma representação esquemática de um modelo potencial através do qual a presente invenção pode funcionar. A. I. 0 fotossensibilizador S é endocitado (I) e termina nas vesículas intracelulares (II). Estas vesículas rompem-se após exposição à luz (III) . B. Após o tratamento fotoquímico como descrito em A as células são tratadas com uma molécula M que é endocitada e termina nas vesículas intracelulares. Estas vesículas vão se 46 fundir com vesículas fotoquimicamente danificadas e a molécula M irá ser libertada no citosol. A figura 8 mostra o efeito sobre a transfecção do tratamento das células em 0 °C com o complexo pEGFP-Nl polilisina. A figura 9 mostra transfecção induzida pela luz do complexo pEGFP-Nl polilisina quando é utilizado 3-THPP, que não está maioritariamente localizado em vesículas endocitóxicas, como um agente fotossensibilizador. A figura 10 mostra o efeito de uma combinação de fotossensibilizador e pré-tratamento com luz na transfecção de células com lípidos catiónicos. A figura 11 mostra o efeito do tratamento fotoquimico na transdução com adenovírus de células THX. A figura 12 mostra o efeito do tratamento fotoquimico na localização intracelular do FITC-dextrano. Foram incubadas células THX com AlPcS2a 20 pg/mL durante 18 h seguidas por 4 h de incubação em meio isento de AlPcS2a· Depois as células foram quer expostas à luz durante 4 min (B, D) ou mantidas no escuro (A, C) antes de uma incubação durante 3 h com FITC-dextrano 5 mg/mL. Micrografias de fluorescência (A, B) e contraste de fase (C, D). A figura 13 mostra o efeito do tratamento fotoquimico na toxicidade da gelonina em células THX e HCT 116. Para a estratégia "luz antes", as células foram inicialmente incubadas com AlPcS2a 20 pg/mL durante 18 h, depois durante mais 4 h em meio isento de AlPcS2a antes da exposição à luz como indicado na 47 figura. Após a iluminação foi adicionada gelonina 1 pg/mL e as células foram incubadas durante 18 h. Para a estratégia "luz após" as células foram co-incubadas com AlPcS2a 20 pg/mL e gelonina 1 pg/mL durante 18 h antes da exposição à luz como indicado na figura. As células de controlo foram tratadas apenas com gelonina 1 pg/mL durante 18 h e expostas à luz; ou apenas com AlPcS2a 20 pg/mL durante 18 h, seguidas durante 4 h em meio isento de AlPcS2a e expostas à luz. Foi medida a incorporação de [3H]-leucina nas proteínas no dia seguinte após tratamento com luz e foi expressa como síntese proteica relativa. Os pontos de dados representam médio ± erro padrão (S. E.) de triplicados. A figura 14 mostra o efeito do tratamento fotoquímico na expressão da β-galactosidase em células THX infectadas com AdHCMV-lacZ. Para a estratégia "luz antes" foram incubadas células pré-tratadas com AlPcS2a durante mais 4 h em meio isento de AlPcS2a antes da exposição à luz durante 3 min. Após iluminação as células foram infectada com AdHCMV-lacZ (a MOI 1) durante 30 min a 37 °C. Depois foram adicionados 2 mL de meio e as células foram incubadas durante dois dias antes da análise da expressão da β-galactosidase. Para a estratégia "luz após" as células tratadas com AlPcS2a foram incubadas em meio isento de AlPcS2a durante 3 h antes de uma infecção de 30 min com AdHCMV-lacZ. Após a adição de 2 mL do meio de cultura as células foram incubadas durante mais 30 min antes da iluminação durante 3 min e dois dias depois foram analisadas para a expressão da β-galactosidase. A figura 15 mostra o efeito do tempo de incubação sobre a eficiência da transfecção induzida por luz com pEGFP/polilisina em células THX e HCT 116. As células pré-tratadas com AlPcS2a foram lavadas e incubadas em meio isento de AlPcS2a durante 4 h 48 antes da exposição à luz durante 3 min (células THX) ou 7 min células (HCT). Após iluminação foi adicionado o complexo pEGFP-Nl/polilisina (plasmideo 5 pg/mL) e as células foram incubadas durante períodos de tempo diferentes indicados na figura. Após a remoção do complexo foi adicionado meio fresco isento de complexo e as células foram incubadas durante dois dias antes da análise da expressão de EGFP. figura 16 mostra o efeito da estratégia de PCI luz ) sobre a transfecção de células THX mediada por poli-L- lisina utilizando TPPS2a como o fotossensibilizador em comparação com a estratégia luz após, utilizando vários tempos de irradiação. PLL-L: Irradiação após o complexo pEGFP-Nl/PLL. L-PLL: Irradiação antes do complexo diopEGFP-Nl/PLL. Barras não sombreadas - sem luz, barras sombreadas - irradiação de 70 segundos, barras a cheio - irradiação de 100 segundos. A figura 17 mostra o efeito da estratégia de PCI luz primeiro sobre a transfecção de células THX mediada por poli-L-lisina utilizando TPPS4 como o fotossensibilizador em comparação com a estratégia luz após, utilizando vários tempos de irradiação. PLL-L:. Irradiação após o complexo pEGFP-Nl/PLL. L-PLL: Irradiação antes do complexo pEGFP-Nl/PLL. Barras não sombreadas - sem luz, barras sombreadas horizontalmente irradiação de 50 segundos, barras sombreadas verticalmente irradiação de 70 segundos, barras a cheio - irradiação de 100 segundos. A figura 18 mostra o efeito da estratégia de PCI luz primeiro sobre a transfecção de células HCT 116 mediada por poli-L-lisina, utilizando TPPS2a como o fotossensibilizador em comparação com a estratégia luz após, utilizando vários tempos 49 de irradiação. PLL-L: Irradiação após complexo pEGFPNl/PLL. L-PLL: Irradiação antes do complexo pEGFPNl/PLL. Barras não sombreadas - sem luz, barras sombreadas irradiação de 70 segundos, barras a cheio - irradiação de 100 segundos. A figura 19 mostra o efeito da estratégia de PCI luz primeiro sobre a transfecção de células HCT 116 mediada por poli-L-lisina, utilizando TPPS4 como o fotossensibilizador. PLLL: Irradiação após do complexo pEGFP-Nl/PLL. L-PLL: Irradiação antes do complexo pEGFP-Nl/PLL. Barras não sombreadas - sem luz, barras sombreadas horizontalmente - irradiação de 1,5 minutos, barras sombreadas verticalmente - irradiação de 2 minutos, barras a cheio - irradiação de 3 minutos. A figura 20 mostra o efeito da estratégia de PCI luz primeiro sobre a transfecção mediada por DOTAP utilizando TPPS4 como o fotossensibilizador em comparação com a estratégia luz após, utilizando vários tempos de irradiação. DOTAP-L: Irradiação após o complexo pEGFP-Nl/DOTAP. L-DOTAP: Irradiação antes do complexo pEGFP-Nl/DOTAP. Barras não sombreadas - sem luz, barras sombreadas - irradiação de 70 segundos, barras a cheio - irradiação de 100 segundos. A figura 21 mostra o efeito da estratégia de PCI luz primeiro sobre a transfecção mediada por SuperFect® utilizando TPPS2a como o fotossensibilizador, em que são utilizados vários tempos de iluminação e de transfecção e a quantidade de ADN para a transfecção variou. - transfecção durante 1 hora com 0,75 pg de ADN; Á - transfecção durante 4 horas com 0,75 pg de ADN; o - transfecção durante 1 hora com 1,5 pg de ADN. 50 A figura 22 mostra o efeito da estratégia de PCI luz primeiro na transdução génica de células HCT 116 mediada por adenovírus utilizando AlPcS2a como o fotossensibilizador, em que 0 vírus é adicionado em tempos diferentes. Foi analisada a percentagem de células transduzidas quando foi adicionado vírus em momentos diferentes por citometria de fluxo como descrito no Exemplo. Estão indicados na figura os momentos da adição dos complexos de vírus. Tempos à esquerda do eixo do Y representam vírus adicionado antes da irradiação, tempos à direita representam adição do vírus após a irradiação. - irradiação de 1 min; □ - sem irradiação. A figura 23 mostra o efeito da estratégia de PCI luz primeiro sobre a transfecção de células HCT 116 mediada por Poli-D-lisina utilizando AlPcS2a como o fotossensibilizador, com tempos de irradiação variáveis. A figura 24 mostra o efeito da estratégia de PCI luz primeiro em morte celular pelo agente citostático bleomicina utilizando TPPS2a como o fotossensibilizador, com quantidades variáveis de bleomicina, tempos de irradiação e tempos de transfecção. 0-5 TPPS-, 1 h = bleomicina 5 μΜ, sem TPPS2a, incubação durante 1 h; ♦ - 5 TPPS +, 1 h = bleomicina 5 μΜ, com TPPS2a, incubação durante 1 h; Δ - 25 TPPS-, 1 h = bleomicina 25 μΜ, sem TPPS2a, incubação durante 1 h; A - 25 TPPS + , 1 h = bleomicina 25 μΜ, com TPPS2a, incubação durante 1 h; □ - 100 TPPS-, lh = bleomicina 100 μΜ, sem TPPS2a, incubação durante 1 h; - 100 TPPS+, 1 h = bleomicina 100 μΜ, com TPPS2a, incubação durante 1 h; o - 100 TPPS-, 4 h = bleomicina 100 μΜ, sem TPPS2a, incubação durante 4 h; · - 100 TPPS + , 4 h = bleomicina 100 μΜ, com TPPS2a, incubação durante 4 h. 51 A figura 25 mostra o efeito da PCI com gelonina para o tratamento de tumores num modelo de murganho in vivo. Os grupos de tratamento foram como se segue: (Δ)apenas gelonina; () tratamento de placebo de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) injecção combinada com a iluminação; (0) apenas tratamento fotoquimico (i. e.. AlPcS2a + luz), mas sem gelonina; (·) tratamento de PCI com gelonina completo (i. e.. AlPcS2a + gelonina + luz) .

EXEMPLOS

Materiais e Métodos

Linhas Celulares A linha de célula de melanoma humana THX foi estabelecida a partir de tecido tumoral obtido a partir de um doente tratado para melanoma maligno metastático no Norwegian Radium Hospital (Aamdal et al.r 1986., Int. J. Câncer, 37, 579) e foi cultivada em RMPI 1640 (Gibco-BRL) suplementado com FCS a 10% (Gibco-BRL) e glutamina 2 mM (Gibco-BRL). A linha celular de carcinoma do cólon humano HCT 116 foi obtida da American Type Culture Collection (ATCC n. CCL-247) e foi cultivada em meio RPMI 1640 suplementado com soro de vitelo fetal a 10%, penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 mg/mL e glutamina 2 mM (tudo de Gibco BRL, Paisley, UK). 52

Irradiaçao

Foram utilizadas duas fontes de luz diferentes para o tratamento das células, consistindo ambas numa armação de 4 lâmpadas fluorescentes tubulares. As células tratadas com TPPS4, TPPS2a e 3-THPP (Porphyrin Products, Logan, UT) foram expostas a luz azul (modelo 3026; Appl. Photophysics, Londres, UK) com uma intensidade luminosa a atingir as células de 1,5 mW/cm2 enquanto as células tratadas com AlPcS2a (Porphyrin Products, Logan, UT) foram expostas a luz vermelha (Philips TL 20W/09) filtrada através de um filtro Cinemoid 35 com uma intensidade luminosa a atingir as células de 1,35 mW/cm2.

Microscopia de fluorescência

As células foram analisadas por microscopia de fluorescência como descrito em Berg. K., et al., Biochem. Biophys. Acta., 1370: 317-324, 1998. Para análise de moléculas marcadas com fluoresceina o microscópio foi equipado com um filtro de excitação 450-490 nm, um divisor de feixe dicróico de 510 nm e um filtro de emissão com banda de passagem a 510-540 nm.

Preparação de Complexos Plasmídeo-pLys e Tratamento de células

Foram preparados complexos plasmídeo-pLys (proporção de carga, 1,7 como descrito em Berg et al. (1999) Câncer Res. 59: 1180-83) por mistura suave de 5 pg de plasmídeo (pEGFP-Nl; Clontech Laboratories, Inc., Paio Alto, CA) em 75 pL de HBB com 5,3 pg pLys (MW 20700; Sigma, St. Louis, MO) em 75 pL de HBS. As 53 soluções foram incubadas durante 30 min à temperatura ambiente, diluídas com meio de cultura e foram adicionadas às células.

Foram incubadas células THX com AlPcS2a 20 pg/mL durante 18 horas a 37 °C, lavadas e incubadas em meio isento de sensibilizador durante 3 horas antes da incubação com complexos plasmídeo-pLys durante 1 hora seguida por exposição à luz. Alternativamente, após a incubação com AlPcS2a as células foram lavadas e incubadas em meio isento de sensibilizador durante 4 horas antes da exposição à luz seguida por uma incubação durante 1 hora com os complexos plasmídeo-pLys. As células foram incubadas a 37 °C durante 2 dias, antes de ser realizada a análise da expressão GFP por citometria de fluxo.

Foram incubadas células HCT-116 com AlPcS2a 20 pg/mL durante 18 horas, lavadas incubadas durante 4 horas na ausência de AlPcS2a antes da exposição à luz. As células foram tratadas com complexo pEGFP-Nl polilisina durante 4 horas imediatamente antes ou após a exposição à luz. A expressão GFP foi estudada por citometria de fluxo após incubação durante 2 dias a 37 °C.

Análise de citometria de fluxo

As células foram tratadas com tripsina, centrifugadas, ressuspensas em 400 pL de meio de cultura e filtradas através de um filtro de nylon com uma malha de 50 pm. Depois as células foram analisadas por um citómetro de fluxo FACS-Calibur (Becton Dickinson). Para cada amostra foram recolhidos 10000 eventos. A fluorescência da fluoresceína (proteína verde Fluorescente por exemplo (GFP)) foi medida através de um filtro de 510-530 nm após excitação com um laser de árgon (200 mW) sintonizado a 54 488 nm. 0 AlPcS2a foi medido através de um filtro de passagem longa de 670 nm após a excitação com um laser de díodo (50 mW) sintonizado a 635 nm. Os dupletos celulares e as células mortas foram discriminados das células viáveis isoladas pela passagem. Os dados foram analisados com o software CELLQuest (Becton Dickinson).

Exemplo 1 A transfecção induzida pela luz como uma função da dose de luz

Foram tratadas células THX com AlPcS2a 20 pg/mL durante 18 horas, lavadas e incubadas em meio isento de sensibilizador durante 3 horas seguido por incubação durante 1 hora com 5 pg de complexo pEGFP-Nl/polilisina antes da exposição à luz durante 1, 2, 3 ou 4 minutos. Alternativamente, após a incubação com AlPcS2a as células foram lavadas e incubadas durante 4 horas em meio isento de sensibilizador antes do tratamento com luz durante 1, 2, 3 ou 4 minutos seguidos por 1 hora com complexo pEGFPNl/polilisina como indicado na Figura 1. A expressão da GFP foi analisada por citometria de fluxo 48 horas após a exposição à luz. A proporção de carga para o complexo pEGFP-Nl/polilisina foi de 1.7.

Os resultados são mostrados na Figura 1 e pode ser verificado que a transfecção da GFP é igualmente tão eficaz quando é adicionado o complexo plasmídeo-pLys (i. e. pEGFP-Nl/pLys) às células após e não antes da exposição à luz. Pode também ser verificado que com ambos os tratamentos a percentagem de células transfectada depende da quantidade de 55 tempo a que as células estão expostas à luz com a percentagem a atingir um nível máximo em redor dos 2 minutos e mantendo-se depois.

Exemplo 2

Expressão de GFP em células HCT-116

Foram incubadas células HCT-116 com AlPcS2a 20 pg/mL durante 18 horas seguidas por 4 horas na ausência de AlPcS2a antes da exposição à luz. As células foram tratadas com o complexo pEGFP-Nl/polilisina durante 4 horas imediatamente antes ou após a exposição à luz como indicado na Figura 2. Foi medida a expressão da GFP por citometria de fluxo 2 dias após a exposição à luz .

Os resultados são mostrados na Figura 2 e pode ser verificado que, de um modo semelhante à transfecção das células THX no Exemplo 1, a transfecção da GFP é igualmente tão eficaz quando o complexo plasmídeo-pLys (i. e. pEGFPNl/pLys) é adicionado às células após e não antes da exposição à luz. Novamente, a percentagem de células transfectadas varia dependendo da quantidade de tempo que as células estão expostas à luz . 56

Exemplo 3

Efeitos sinérgicos da adiçao de gelonina antes e após tratamento fotoquímico A gelonina é uma toxina vegetal que inibe eficazmente a síntese proteica quando está presente no citosol de células. Foram incubadas células THX com AlPcS2a 20 pg/mL durante 18 horas seguidas de 4 horas em meio isento de sensibilizador antes da exposição à luz. As células foram co-tratadas com AlPcS2a e gelonina 1 pg/mL ou foi adicionada gelonina (1 pg/mL) ao meio imediatamente após a exposição à luz durante 18 horas após o que foi removida do meio como indicado na Figura 3. A síntese proteica foi medida 24 horas após a exposição à luz.

Os resultados são mostrados na Figura 3 e pode ser verificado que embora o próprio tratamento fotoquímico na ausência de gelonina origine alguma redução da síntese proteica, a presença de gelonina antes ou após o tratamento fotoquímico induz uma inibição significativamente maior da síntese proteica. Estes dados mostram que gelonina é internalizada nas células se a gelonina for feita contactar com as células antes ou após o tratamento fotoquímico.

Exemplo 4

Efeito do tempo de seguimento sobre a transfecção induzida pela luz

Foram tratadas células THX com AlPcS2a 20 pg/mL durante 18 horas, lavadas e incubadas em meio isento de sensibilizador 57 durante 4 horas antes de 3 minutos de tratamento com luz. As células foram incubadas no meio de crescimento durante os tempos indicados na Figura 4 antes do tratamento com complexo pEGFP-Nl/polilisina (proporção de carga 1,7) durante 1 hora. A expressão da GFP foi analisada por citometria de fluxo 48 horas após a exposição à luz.

Os resultados são mostrados na Figura 4 e pode ser verificado que para melhores resultados a molécula a ser internalizada deve ser exposta às células relativamente cedo após o tratamento fotoquímico, uma vez que a transfecção com pEGFP-Nl declina com uma meia vida de cerca de 5 horas após a exposição à luz.

Exemplo 5

Eficiência da transfecção como uma função de um pulso de transfecção relativo à iluminação

Foram tratadas células THX com AlPcS2a 20 pg/mL durante 18 horas, lavadas e incubadas em meio isento de sensibilizador. Foi proporcionado às células um pulso (0,5 ou 1 hora, a largura da barra na Figura 5 reflecte o inicio e o final do tratamento) de tratamento com complexo pEGFP-Nl/polilisina antes (valores de abcissa negativos) ou após (valores de abcissa positivos) 3 minutos de exposição à luz. Foi analisada a expressão da GFP por citometria de fluxo 48 horas após a exposição à luz. Foram normalizados dados de várias experiências considerando a eficiência da transfecção como 100% quando a transfecção é realizada imediatamente antes ou imediatamente após a exposição à luz . 58

Os resultados são mostrados na Figura 5 e pode ser verificado que para a melhor eficiência de transfecção as células devem ser expostas às moléculas a serem internalizadas imediatamente antes ou após a exposição à luz.

Exemplo 6

Transfecção induzida pela luz - Dependência do tempo de incubação com o complexo pEFGP-Nl/polilisina

Foram tratadas células THX com AlPcS2a 20 pg/mL durante 18 horas, lavadas e incubadas em meio isento de sensibilizador durante 4 horas antes da exposição à luz, seguida por incubação com o complexo pEGFP-Nl/polilisina (proporção de carga 1,7) durante até 6 horas como ilustrado na Figura 6A. A expressão da GFP foi analisada por citometria de fluxo 48 horas após a exposição à luz. O número de células expressando GFP após esses tratamentos é apresentado na Figura 6B e a especificidade dos tratamentos diferentes é apresentada na Figura 6C.

Os resultados são mostrados na Figura 6 e pode ser verificado que embora o número de células transfectadas aumente com o tempo de incubação crescente com complexo pEGFP-Nl/polilisina (fig. 6B) , a especificidade de transfecção mais elevada ocorre após os tempos de incubação mais curtos (fig. 6C) . 59

Exemplo 7

Tratamento com complexo pEGFP-Nl/polilisina a 0 °C

Esta experiência foi concebida para testar se o tratamento fotoquimico originou menores danos às membranas celulares, significando deste modo que o plasmideo levado ao contacto com as células após tratamento com luz pode passar através da membrana plasmática.

Foram tratadas células THX com AlPcS2a 20 pg/mL durante 18 horas, lavadas e incubadas em meio isento de sensibilizador durante 4 horas antes da exposição à luz seguida depois imediatamente por incubação durante 45 minutos a 0 °C com complexo pEGFP-Nl/polilisina (proporção de carga 1,7). As células foram então A) tratadas com tripsina e inoculadas antes de serem transferidas para 37 °C ou B) transferidas para 37 °C sem tratamento com tripsina. As células foram expostas à luz como indicado na Figura 8. A expressão da GFP foi analisada por citometria de fluxo 48 horas após a exposição à luz.

Após a incubação das células durante 45 minutos a 0 °C com complexo pEGFP-Nl/polilisina o complexo irá aderir à superfície celular mas não irá ser endocitado. As células THX foram então incubadas em meio isento de plasmideo a 37 °C (fig. 8B) ou tratadas com tripsina (fig. SA) para remover o plasmideo da superfície e inoculadas em novas placas a 37 °C. Estas experiências indicam que o complexo plasmídeo/polilisina não passa através da membrana plasmática após tratamento fotoquimico. 60

Exemplo 8

Combinação de 3-THPP e luz com tratamento com complexo pEGFP-Nl/polilisina

Foram tratadas células THX com 3THPP 0,25 pg/mL durante 18 horas, lavadas e incubadas em meio isento de sensibilizador durante 4 horas antes da exposição à luz, seguida imediatamente depois por incubação durante 1 hora com complexo pEGFP-Nl/polilisina (proporção de carga 1,7). As células foram expostas à luz como indicado na Figura 9 e analisadas para a expressão de GFP por citometria de fluxo 48 horas após a exposição à luz. O 3-THPP é um fotossensibilizador cuja localização principal não é nos endossomas ou nos lisossomas. Os resultados mostrados na Figura 9 indicam que o tratamento de células com 3-THPP antes da irradiação induz apenas um aumento menor na expressão da GFP em comparação com os resultados mostrados em exemplos anteriores em que é utilizado o agente fotossensibilizador AlPcS2a· Isto indica que pode ser vantajoso um agente fotossensibilizador que esteja localizado nos endossomas e lisossomas.

Exemplo 9

Combinação de pré-tratamento com fotossensibilizador e luz permite a transfecçao de células utilizando lípidos catiónicos Foram inoculadas células HCT 116 numa densidade de 75000 células/poço numa placa de 12 poços um dia antes da 61 experiência. As células foram incubadas com o fotossensibilizador AlPcS2a (20 ug/mL) durante 18 horas seguidas por um seguimento de 7 h em meio isento de fotossensibilizador e expostas a luz vermelha durante 7 min. Depois as células foram incubadas com um complexo de DOTAP (DOTAP foi adquirido de Boehringer) com o plasmídeo pEGFP-Nl (5:1 DOTAP/plasmídeo, 1 ug/mL pEGFP-Nl) durante 3 h, lavadas com meio de crescimento e incubadas a 37 °C durante 21 h antes de ter sido medida a expressão de EGFP por citometria de fluxo como descrito sob Materiais e Métodos. As células de controlo não foram expostas à luz, de outra forma o tratamento foi idêntico.

Os resultados são mostrados na Fig. 10 e pode ser verificado que o tratamento por PCI aumenta a eficiência da transfecção com o complexo DOTAP/plasmídeo cerca de 4 vezes.

Exemplo 10

Efeito da PCI na transdução com adenovírus de células THX

Material

Foi adquirido di-p-D-galactopiranósido de fluoresceína (FDG) de Molecular Probes (F-1179). Foi preparada uma solução de armazenamento 20 mM dissolvendo o pó numa mistura 1:1 de DMSO/etanol. A mistura foi gradualmente adicionada a um volume adequado de água gelada para preparar uma solução 8:1:1 de H20/DMS0/etano1.

Foi formado o vírus recombinante AdCA171acZ e propagado na linha 293 de células humana, uma linha celular embrionárias de 62 rim transformadas com AD EI mantida em meio MEM F-ll suplementado com FCS a 10%, penicilina 100 U/mL (Gibco-BRL) , estreptomicina 0,1 mg/mL (GibcoBRL) e glutamina 2 mM.

Construção de vírus recombinante 0 adenovírus recombinante AdCA171acZ codificando o gene lacZ E. coli sob o controlo do promotor CMV humano foi obtido por recombinação homóloga utilizando o sistema pJM17 em células 293 (Addison et al. , 1997, J. Gen. Virol., 78, 1653-1661). Os vectores recombinantes foram purificados em placa, cultivados num título elevado em células 293 e purificados por gradiente de cloreto de césio como descrito anteriormente (Hitt et al., 1995, Methods in Mol. Genetics., 7, 15-30) .

Sensibilização de células

Foram inoculadas células THX (4 x 105 células) em placas de 6 cm e foi permitido crescimento de um dia para o outro. O meio de crescimento foi permutado por 2 mL meio de crescimento suplementado com AlPcS2a 20 pg/mL numa confluência aproximadamente 60% e as placas foram colocadas novamente na incubadora durante 16-18 horas. O meio contendo sensibilizador foi então aspirado e as células foram incubadas no meio de crescimento normal durante pelo menos 4 horas antes de tratamento com luz e infecção com vírus. 63

Infecçao de células

Foi utilizada tripsina-EDTA para libertar a células de três placas e foi calculado o número de células médio nas placas por contagem em câmara de Burcher. Foram preparadas diluições de adenovirus em PBS com CaC12 0,68 mM e MgCl2 0,5 mM de acordo com o número de células a infectar. Normalmente as células foram infectadas numa m.o.i. (multiplicidade de infecção) de 1 e 10.

As células foram expostas a luz vermelha (Philips TL 20W/09, filtradas por um filtro Cinemoid 35 com uma intensidade luminosa a atingir as células de 1,35 mW/cm2) durante 3 minutos, antes do vírus ser adicionado. Subsequentemente o meio foi aspirado e foram adicionados 200 pL de suspensão de vírus (ou PBS com CaC12 0,68 mM e MgCl2 0,5 mM nos casos de controlos não tratados com o vírus) a cada placa. Após incubação durante 30 minutos a 37 °C, foram adicionados 5 mL de meio de crescimento normal e foi permitido o crescimento das células durante 48 horas.

Ensaio da β-galactosidase

As células foram libertadas com Tripsina-EDTA e ressuspensas em 5 mL de meios de crescimento. Após centrifugação durante 5 minutos a 1000 rpm, o meio foi aspirado, os sedimentos celulares ressuspensos em 50 pL de meio de crescimento e os tubos colocados a 37 °C banho de água durante 5 minutos. Subsequentemente, foram adicionados 50 pL de solução FDG 2 mM pré-aquecida a 37 °C e os tubos foram colocados novamente no banho de água durante 1 min. Finalmente, foram adicionados 900 pL de meio de crescimento e os tubos foram incubados em gelo 64 durante 30-60 minutos antes das amostras serem analisadas por citometria de fluxo como descrito acima.

Foram tratadas células THX com AlPcS2a (designado como PS na Figura 11) e adenovirus (designado como "vírus" na Figura 11) e expostas a 3 ou 4 minutos de luz como descrito em Material e Métodos e foram medidas para a actividade da β-galactosidase (β-gal) por citometria de fluxo. A actividade β-gal total foi quantificada por integração das células positivas para β-gal e pela sua actividade β-gal. O número de células positivas para β-gal e a actividade β-gal média foi aumentado pelo tratamento por PCI.

Os resultados mostram que ocorre infecção mínima de células THX quando as células são incubadas com vírus apenas ou vírus e agente fotossensibilizador mas que o tratamento fotoquímico, i. e. adição de luz ao agente fotossensibilizador potência significativamente a transdução de células (como mostrado pelo aumento da actividade β-gal).

Exemplo 11

Efeito do tratamento fotoquímico na_localização intracelular de uma molécula de marcadora de endocitose.

Foram inoculadas células THX em placas Falcon 3001 (2,5 x 104 células por placa) e no dia seguinte foram tratadas com AlPcS2a 20 pg/mL durante 18 h, lavadas de AlPcS2a e incubadas em meio isento de AlPcS2a durante 4 h. Depois as células foram expostas à luz durante 4 min antes de uma incubação de 3 h com marcador endocítico FITC-dextrano 5 mg/mL. As células 65 não-iluminadas foram tratadas de uma forma semelhante excepto a iluminação. Foi observada a localização intracelular de FITC-dextrano em células não-fixadas com um microscópio de fluorescência Zeiss Axioplan (Oberkochen, Alemanha) utilizando uma objectiva com uma ampliação de 63 x, um filtro de excitação com banda de passagem de 450-490 nm e um filtro de emissão com banda de passagem de 510-540. Foram registadas micrografias de fluorescência através de um câmara de dispositivo de acoplamento de carga (CCD) arrefecida (Photometrics Inc., Tucson, AZ).

Os resultados mostram (Fig. 12) que a PCI com luz proporcionada antes do marcador endocitico fluorescente FITC-dextrano desloca a localização deste marcador das vesículas endocíticas (os locais observados no painel A para células não-iluminadas) para o citosol (a fluorescência difusa observada no painel B para células iluminadas). Deste modo quando o tratamento com luz é administrado antes da macromolécula a ser internalizada a macromolécula é muito rapidamente deslocada para o citosol, reduzindo substancialmente as possibilidades de degradação lisossómicas da macromolécula.

Exemplo 12

Efeitos de tratamentos fotoquímicos sobre a toxicidade da qelonina em células THX e HCT 116 A gelonina é uma toxina vegetal que inibe eficazmente a síntese proteica quando está presente no citosol celular, mas que não é capaz de alcançar o citosol por si só e por isso é significativamente não-tóxica para células intactas. Para o tratamento com gelonina foram inoculadas 25 x 103 células por 66 poço em placas de 24 poços (Nunc, Dinamarca) . No dia seguinte foi adicionado AlPcS2a 20 pg/mL e as células foram incubadas durante 18 h a 37 °C. Todos os processos após a adição de AlPcS2a foram realizados sob luz suavizada. Para a estratégia "luz antes", as células foram lavadas com AlPcS2a e incubadas em meio isento de AlPcS2a durante 4 h. Depois as células foram expostas à luz (como indicado nas figuras) antes do tratamento com gelonina 1 pg/mL durante 18 h. Para estratégia a "luz após" as células foram co-incubadas com AlPcS2a 20 pg/mL e gelonina 1 pg/mL durante 18 h e lavadas antes da exposição à luz como indicado na figura.

As células não-iluminadas foram tratadas de um modo semelhante excepto a iluminação. As células tratadas foram lavadas uma vez com meio de cultura e após a adição de meio fresco foram incubadas a 37 °C antes de análise adicional. A inibição da síntese proteica foi ensaiada por incorporação de [3H]-leucina na proteína 24 h após exposição à luz. A iluminação foi realizada a partir de uma armadura com quatro lâmpadas (Philips TL 20W/09) e um filtro de passagem longa com um corte a 550-600 nm. A intensidade luminosa a atingir as células foi 13,5 W/m2. O exemplo mostra que tanto nas células THX (Fig. 13A) como nas HCT 116 (Fig. 13B) a estratégia "luz antes" funciona melhor do que o método "luz após". Deste modo, para células THX na dose de luz mais elevada a inibição da síntese proteica foi cerca de 3 vezes mais potente com "luz antes" do que com "luz após". Pode ser também verificado que em ambas as linhas celulares a gelonina por si só não teve qualquer efeito tóxico sem o tratamento por PCI, revelando a potência e a especificidade na 67 indução dos efeitos de toxina que podem ser obtidas pelo tratamento fotoquímico.

Exemplo 13

Estímulo fotoquímico da transdução génica mediada por adenovírus

Foram inoculadas 5 X 104 células THX por poço em placas de 6 poços. No dia seguinte foi adicionado AlPcS2a 20 pg/mL e as células foram incubadas durante 18 h a 37 °C. Todos os processos após a adição de AlPcS2a foram seguidos na sob luz suavizada. Para a estratégia "luz antes", as células foram lavadas de

AlPCS2a e incubadas no meio isento de AlPCS2a durante 4 h. Depois as células foram expostas à luz durante 3 min antes do tratamento com o vector adenoviral AdHCMV-lacZ (também designado no Exemplo 10 como AdCA171acZ) numa multiplicidade de infecção (MOI) de 1 durante 30 min. Este vector contém um gene de repórter da β-galactosidase cuja expressão pode ser analisada por citometria de fluxo (ver abaixo).

Para a estratégia "luz após" foram inicialmente tratadas células AlPcS2a, tratadas e lavadas, com o adenovírus na mesma concentração e durante o mesmo tempo como indicado acima, lavadas e após a adição do meio de cultura fresco foram expostas à luz. As células não-iluminadas foram tratadas de um modo semelhante excepto a iluminação.

As células tratadas foram lavadas uma vez com meio de

cultura e após a adição de meio fresco foram incubadas a 37 °C antes de análise adicional. A expressão da β-galactosidase foi 68 analisada por citometria de fluxo dois dias após a exposição à luz. Sob o Exemplo 10 estão descritos métodos detalhados para a construção do vírus (que é designado como AdHCMV-lacZ ou como AdCA171acZ), tratamento das células, iluminação e análise da expressão da β-galactosidase.

Os resultados (Fig. 14) mostram que o tratamento fotoquímico utilizando o processo "luz antes" (mostrado pelas barras do lado direito da Figura 14) aumenta cerca de 6 vezes a percentagem de células expressando a β-galactosidase; de 2,5% para 15% nestas condições experimentais. Pode também ser verificado que o efeito com o processo "luz antes" foi quase igual ao que foi obtido com o método "luz após" (mostrado pelas barras no lado esquerdo da Figura 14).

Exemplo 14

Efeito do tempo de incubação na eficiência dz transfecção induzida pela luz

Foram inoculadas 5 X 104 células THX ou 7,5 x 104 células HCT 116 por poço respect ivamente em placas de 6 poços e de 12 poços. No dia seguinte foi adicionado AlPcS2a 20 pg/mL e as células foram incubadas durante 18 h a 37 °C. Todos os processos após a adição de AlPcS2a foram seguidos sob luz suavizada. As células foram lavadas de AlPcS2a e incubadas em meio isento de AlPcS2a durante 4 h. Depois as células foram expostas à luz (3 min para as células THX ou 7 min para as células HCT 116) antes do tratamento com complexo pEGFP-Nl/polilisina (pEGFP-Nl 5 pg/mL) durante os tempos indicados na Fig. 15. As células não-iluminadas foram tratadas de um modo semelhante excepto a 69 iluminação. As células tratadas foram lavadas uma vez com meio de cultura e após a adição do meio fresco foram incubadas a 37 °C durante 2 dias antes da análise da expressão EGFP por citometria de fluxo (ver Materiais e Métodos). A iluminação foi realizada com uma armadura com quatro lâmpadas tubulares (Philips TL 20W/09) e um filtro de passagem longa com um corte a 550-600 nm. A intensidade luminosa a atingir as células foi 13,5 W/m2. 0 complexo pEGFP-Nl/polilisina (proporção de carga 1,7) foi preparado por mistura suave de soluções de plasmídeo e polilisina preparadas separadamente: foram diluídas 5 pg de plasmídeo pEGFP-Nl em 75 pL e água e 5,3 pg polilisina diluídas em 75 pL de água. As soluções foram misturadas e incubadas durante 30 min à temperatura ambiente, diluídas com meio de cultura até 1 mL e adicionadas às células.

Os resultados (fig. 15) mostram que em células THX e em HCT 116 a transfecção por complexos DNA/polilisina pode ser fortemente induzida por tratamento fotoquímico "luz antes". Pode ser verificado que o estímulo da transfecção é eficaz logo após tempos de incubação curtos com ADN, pelo menos até a 30 min de tempo de incubação. A transfecção induzida pela luz aumenta com o tempo de incubação, no entanto, estabilizando aparentemente após cerca de 2 h de incubação com ADN. 70

Exemplo 15

Efeito da estratégia PCI luz primeiro sobre a transfecção de células THX mediada por poli-L-lisina utilizando TPPS2a como o fotossensibilizador 0 dissulfonato de tetrafenilporfina (TPPS2a) , lote #04197, foi produzido por Phorphyrin Products (UT, EUA) . O TPPS2a foi dissolvido em DMSO. 0 plasmideo pEGFP-Nl foi adquirido de Clontech Laboratories Inc. (CA, EUA; n° . de cat. 6085-1) . O lote utilizado (lote N° EGFP-NI-I002) foi produzido por ELIM Biopharmaceuticals, Inc. (CA, EUA) e distribuído numa concentração de 5 mg/mL em água estéril. Foi preparada uma solução de armazenamento 0,5 mg/mL em tampão TE estéril pH 7,4 (Tris-HCl 1 mM, EDTA 1 mM) e mantida a -20 °c.

Foram cultivadas células de melanoma humanas THX em meio RPMI 1640 suplementado com FCS a 10% (soro de vitelo fetal), Penicilina/Estreptomicina e L-glutamina. O meio foi removido e foi adicionado meio contendo TPPS2a 2 ng/mL sob luz suavizada. As células (protegidas da luz) foram incubadas a 37 °C durante 18 h. As células foram lavadas três vezes com meio e para as amostras PLL-L ("luz após") foi adicionado 1 mL de meio contendo um complexo pEGFP-Nl/Poli-L-Lisina. O complexo continha 5 pg de pEGFP-Nl e tinha uma proporção de carga entre a poli-L-lisina (PLL) e o ADN de 1,7. Após 4 h de incubação adicional a 37 °C no escuro o meio foi removido e as células foram lavadas uma vez com meio. Foi adicionado 1 mL de meio e as células foram expostas a luz azul como indicado na Figura 16 e descrito sob Materiais e Métodos. Para as amostras L-PLL ("luz antes") as 71 primeiras 4 h de incubação foram em meio sem complexo pEGFP-Nl/PLL, sendo o complexo adicionado imediatamente após a iluminação e removido após uma incubação adicional de 4 h.

As células foram incubadas durante 2 dias (ainda protegidas da luz) antes da análise da expressão de EGFP por citometria de fluxo. Para esta análise as células foram tratadas com tripsina (Tripsina-EDTA, Sigma, MO, EUA), ressuspensas em 400 pL de meio RPMI e filtradas através de um filtro de nylon com uma malha de 50 pm antes da análise num citómetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, CA, EUA) . A EGFP foi medida através de um filtro de 510-540 nm após excitação a 488 nm. Foi utilizado iodeto de propídio (1 pg/mL) para discriminar as células mortas das células viáveis e foi realizado processamento com pulsos para discriminar os dupletos de células das células isoladas. Foram recolhidos 10000 eventos para cada amostra e os dados foram analisados com o software CELLQuest (Becton Dickinson, CA, EUA) .

Resultados

Como pode ser verificado na Figura 16 para a transfecção de células THX mediada por poli-L-lisina a abordagem "luz antes" da adição da molécula de transferência funciona assim como abordagem "luz após" quando se utiliza o fotossensibilizador TPPS2a. 72

Exemplo 16

Efeito da estratégia de PCI luz primeiro sobre a transfecção de células THX mediada por poli-L-lisina utilizando TPPS4 como o fotossensibilizador

Foram cultivadas e tratadas células THX como descrito sob o Exemplo 15, excepto por ter sido utilizado o fotossensibilizador TPPS4 (75 pg/mL) em vez de TPPS2a·

Resultados É evidente a partir da Figura 17 que para a transfecção de células THX mediada por poli-L-lisina a abordagem "luz antes" funcionou ligeiramente melhor que a abordagem "luz após" utilizando o fotossensibilizador TPPS4, mas ambos os métodos originaram ainda transfecção.

Exemplo 17

Efeito da estratégia PCI luz primeiro sobre a transfecção de células HCT 116 mediada por poli-L-lisina, utilizando TPPS2a como o fotossensibilizador

Foram cultivadas e tratadas células HCT 116 como descrito sob o Exemplo 15. 73

Resultados

Pode ser verificado a partir da Figura 18 que para a transfecção de células HCT 116 mediada por poli-L-lisina a abordagem "luz antes" funciona assim como a abordagem "luz após" utilizando o fotossensibilizador TPPS2a.

Exemplo 18

Efeito da estratégia de PCI luz primeiro sobre a transfecção de células HCT 116 mediada por poli-L-lisina. utilizando TPPS4 como o fotossensibilizador

Foram cultivadas e tratadas células THX como descrito sob o Exemplo 15, excepto por ter sido utilizado o fotossensibilizador TPPS4 (75 pg/mL) em vez de TPPS2a.

Resultados A figura 19 mostra que para a transfecção de células THX mediada por poli-L-lisina a abordagem "luz antes" funciona assim como a abordagem "luz após" quando se utiliza o fotossensibilizador TPPS4. 74

Exemplo 19

Efeito da estratégia PCI luz primeiro sobre a transfecçao mediada por DOTAP utilizando TPPS4 como o fotossensibilizador

Foram cultivadas células HCT 116 em meio RPMI 1640 suplementado com FCS a 10% (soro de vitelo fetal), Penicilina/Estreptomicina e L-glutamina. O meio foi removido e foi adicionado meio contendo TPPS4 75 pg/mL, sob luz suavizada. As células (protegidas da luz) foram incubadas a 37 °C durante 18 h. As células foram lavadas três vezes com meio e para as amostras DOTAP-L ("luz após") foi adicionado 1 mL de meio contendo um complexo de 1 pg de pEGFP-Nl e 5 pg de DOTAP. O meio foi removido após 4 h de incubação adicional a 37 °C no escuro e as células foram lavadas uma vez com meio. Foi adicionado 1 mL de meio e as células foram expostas a luz azul como indicado na Figura 20 e descrito sob "Materiais e Métodos". Para as amostras L—DOTAP ("luz antes") as primeiras 4 h de incubação foram em meio sem complexo pEGFPNl/DOTAP, sendo o complexo adicionado imediatamente após a iluminação e removido após 4 h de incubação adicionais. As células foram incubadas durante 1 dia (ainda protegidas da luz) antes da análise da expressão da EGFP por citometria de fluxo como descrito sob o Exemplo 15.

Resultados

Pode ser observado a partir da Figura 20 que para a transfecção de células HCT 116 mediada pelo lípido catiónico DOTAP a abordagem "luz antes" funciona substancialmente melhor do que a abordagem "luz após" utilizando o fotossensibilizador 75 TPPS4. A abordagem "luz antes" parece ser especialmente vantajosa para a transfecção mediada por lípidos catiónicos.

Exemplo 20

Efeito da estratégia de PCI luz primeiro sobre a transfecção mediada por SuperFect® utilizando TPPS2a como o fotossensibilizador

SuperFect® foi adquirido de QIAGEN AG.

Preparação de complexos plasmídeo/SuperFect®

Foram preparados complexos plasmídeo/SuperFect® como se segue: (i) foi diluída pEGFP-Nl com meio RPMI 1640 (sem soro, proteínas e antibióticos). (ii) foi adicionado SuperFect® (2 pL por pg de ADN) à solução de plasmídeo e os conteúdos foram misturados sob vórtice durante 10 s. (iii) a solução foi incubada durante 10-20 min à temperatura ambiente para permitir a formação de complexos, (iv) Foram adicionados 400 pL de meio de crescimento celular (com soro e antibióticos) aos tubos contendo os complexos de transfecção e os conteúdos foram misturados por pipetagem para cima e para baixo duas vezes e o volume total foi transferido imediatamente para as células.

Tratamento das células

Foram inoculadas células HCT 116 (75000 células/poço, 1 mL/poço) em placas de 12 poços (Costar Corning, NI, EUA) e foi permitida a ligação durante seis horas. Foi adicionado 1 mL de 76 meio com TPPS2a 0,7 pg/mL e as células foram incubadas durante 18 h (5% v/v C02, 37 °C). As células foram lavadas três vezes com meio e incubadas durante 4 h (37 °C, 5% V/V C02) em meio contendo soro . As células foram iluminadas por exposição a uma armadura com quatro lâmpadas fluorescentes tubulares (Osram 18W/67) com o fluxo mais elevado a cerca de 420 nm. Foram adicionados complexos plasmídeo/SuperFect® imediatamente após a exposição à luz e as células foram incubadas com os complexos durante 1 ou 4 h. As células foram então lavadas 4 vezes em meio RPMI e após a adição de 1 mL meio estas foram incubadas adicionalmente durante dois dias. Depois a expressão da EGFP foi analisada por citometria de fluxo como descrito sob o Exemplo 15.

Resultados

Pode ser verificado (Figura 21) que a PCI melhora substancialmente a transfecção com SuperFect® em todas as condições testadas. E. g.r para 0,75 pg de ADN e um tempo de transfecção de 1 h foi verificada uma melhoria de 9 vezes, enquanto para 0,75 pg de ADN e um tempo de transfecção de 4 h foi observado um aumento de 10 vezes.

Exemplo 21

Efeito da estratégia PCI luz primeiro na transdução génica de células HCT 116 mediada por adenovírus utilizando TPPS2a como o fotossensibilizador em meio RPMI 16 40 de vitelo fetal),

Foram cultivadas células HCT 116 suplementado com FCS a 10% (soro 77

Penicilina/Estreptomicina e L-glutamina. 0 meio foi removido e foi adicionado meio contendo TPPS2a 1 pg/mL a cada poço, sob luz suavizada. As células (protegidas da luz) foram incubadas a 37 °C durante 18 h. As células foram lavadas três vezes com meio. As células foram então infectadas com o adenovirus Ad-HCMV-LacZ em momentos diferentes antes ou após a iluminação (que foi sempre 4 h após a remoção do fotossensibilizador) . As células foram ainda incubadas durante 2 dias (ainda protegidas da luz) antes da análise da actividade β-galactosidase por citometria de fluxo como descrito sob o Exemplo 10 (Materiais e Métodos).

Resultados A Figura 22 mostra o efeito do momento do tratamento com luz em relação à distribuição do vírus sobre o efeito de PCI na transdução génica mediada por adenovirus. Pode ser verificado que para a abordagem "luz antes" (o lado direito do eixo do Y) a iluminação PCI é eficaz durante pelo menos 13 h, para que o vírus possa ser administrado até pelo menos 13 h após a iluminação, mantendo ainda os efeitos positivos da PCI sobre a transdução. Isto é muito importante do ponto de vista clínico, porque isto permite ao médico uma grande flexibilidade na concepção do tratamento e na sua coordenação com outros tratamentos que o doente possa receber, e. g., processos cirúrgicos. 78

Exemplo 22

Efeito da estratégia de PCI luz primeiro sobre a transfecção de células HCT 116 mediada por Poli-D-lisina utilizando AlPcS2a como o fotossensibilizador

Foram cultivadas, tratadas e analisadas células HCT 116 como descrito sob o Exemplo 15 excepto por ter sido utilizada poli-D-lisina em vez de poli-L-lisina na criação do complexo com pEGFP-Nl.

Resultados A partir da Figura 23 pode ser observado que PCI com o protocolo "luz antes" também funciona bem quando é utilizado o policatião poli-D-lisina como o agente de transfecção.

Exemplo 23

Efeito da estratégia de PCI luz primeiro sobre a morte celular pelo agente citostático bleomicina utilizando TPPS2a como o fotossensibilizador 0 dissulfonato de tetrafenilporfina (TPPS2a)/ lote N° 04197, foi produzido por Phorphyrin Products (UT, EUA) . O TPPS2a foi dissolvido em DMSO.

Neste estudo foi utilizada a linha celular de fibroblastos de pulmão de hamster chinês V-79. 79 Ο ΜΤΤ (brometo de 3-[4,5-Dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio) foi de Sigma (MO, EUA; n°. de cat. M 2128), dissolvido em PBS a uma concentração de 5 mg/mL, filtrado em esterilidade e armazenado a 4 °C. A Bleomicina (ASTA Medica) 15000 IE/KY foi obtida da farmácia do Norwegian Radium Hospital. 1 IE corresponde a 1 mg de Bleomicina. O pó de bleomicina foi dissolvido numa solução estéril de NaCl a 0,9% para uma concentração final de 2 mM.

Cultura celular

As células V-79 foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco) suplementado com soro de vitelo fetal a 10%, penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 pg/mL e glutamina 2 mM (tudo de Gibco BRL, Paisley, Escócia) a 37 °C e C02 a 5% num ambiente húmido.

Tratamento das células

As células (75000 células/poço, 1 mL/poço) foram inoculadas em placas de 12 poços (Costar Corning, NI, EUA) e foi permitida a ligação durante 6 h. Foi adicionado 1 mL de meio com TPPS2a 0,7 pg/mL a alguns poços (ver a Tabela 1) e as células foram incubadas durante 18 h (5% v/v C02, 37 °C) . As células foram lavadas três vezes com meio. As células foram então incubadas em meio contendo soro durante 4 h. O meio foi removido, foi adicionado meio novo e as células foram iluminadas por exposição à luz de uma caixa contendo uma armadura de quatro lâmpadas fluorescentes tubulares (Osram 18W/67) com o fluxo mais elevado a cerca de 420 nm. 80

Foram imediatamente adicionadas diferentes doses de bleomicina. Após 1 ou 4 h de incubação com bleomicina as células foram lavadas uma vez com meio RPMI, foi adicionado 1 mL de meio e a sobrevivência celular foi medida pelo ensaio de MTT 3 dias após a incubação. Este método é baseado na redução de um sal de tetrazólio solúvel em água (MTT) num produto formazano púrpura, insolúvel por desidrogenases mitocondriais presentes nas células vivas, metabolicamente activas. É adicionado um mL de meio contendo 0,25 pg de MTT às células, seguido por incubação durante 4 h (37 °C, 5% v/v CO2) . Os cristais de formazano resultantes são dissolvidos adicionando 200 pL de isopropanol (Sigma, MO, EUA) por poço. A solução é transferida para uma placa de 96 poços que é lida por um leitor de microplacas Multiskan EX (Labsystems, Finlândia) com um filtro com banda de passagem de 570 nm. A sobrevivência celular é calculada como a percentagem de células de controlo que não recebem tratamento com luz.

Resultados A figura 24 mostra que a PCI com a abordagem "luz antes" pode também aumentar o efeito biológico de um agente quimioterapêutico de baixo peso molecular, aprovado clinicamente (bleomicina). Deste modo, pode ser verificado que para a dose de bleomicina 100 pM pode ser observado um aumento substancial da citotoxicidade da bleomicina induzida pela luz ( e · na Figura 24) . A ausência de efeito na dose mais baixa de bleomicina (♦ na Figura 24) mostra que esta citotoxicidade aumentada não é um resultado do tratamento fotoquímico per se, uma vez que esta série de amostras recebeu o mesmo tratamento fotoquímico que a 81 série de bleomicina a 100 μΜ sem efeitos observáveis sobre sobrevivência celular induzidos pela luz.

Exemplo 24 PCI com gelonina para o tratamento de tumores num modelo de murganho in vivo

Animais

Foram reproduzidos murganhos Balb/c (nu/nu) nus do sexo feminino no Animal Department of the Institute for Câncer Research. Os murganhos foram mantidos sob condições específicas isentas de agentes patogénicos. Foram proporcionados água e alimento ad libitum. Todos os processos envolvendo murganhos foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo comité de cuidados animais do Norwegian Radium Hospital, sob controlo pelas orientações do National Ethical Committee sobre bem-estar animal. Os murganhos tinham em média 20-25 g (5-8 semanas) no início das experiências e os requerentes utilizaram pelo menos 5 murganhos por grupo experimental. O adenocarcinoma humano WiDr utilizado no presente estudo, foi propagado por transplante em série em murganhos Balb/c (nu/nu). Os tumores foram triturados até à homogeneidade com um bisturi e foram injectados subcutaneamente 20 pL da solução no quadril direito de cada murganho. O tamanho do tumor foi medido duas ou três vezes por semana medindo dois diâmetros perpendiculares. O volume do tumor foi calculado utilizando a fórmula seguinte: V = (W2 x L)/2 82

Em que W é a largura e L os diâmetros de comprimento dos tumores medidos.

Tratamento

Os murganhos foram distribuídos aleatoriamente pelos diferentes grupos mostrados na Tabela 1 e na Figura 25. Foi diluída uma solução de armazenamento de AlPcS2a para 1,25 mg/mL em PBS e foi injectada intraperitonealmente numa concentração final de 10 mg/kg quando os tumores tinham atingido um volume aproximadamente 100 mm3. Os tumores foram expostos a luz vermelha durante 16 min 48 h após a injecção de AlPcS2a (ver abaixo). Foi injectada gelonina intratumoralmente (quantidade total de 50 pg numa solução 2 mg/mL,, i. e., 25 pL) imediatamente após a exposição à luz. Os murganhos foram mantidos no escuro durante 1 semana após injecção de AlPcS2a.

Tratamento com luz

Os tumores foram iluminados com uma lâmpada de halogéneo de 150 W (Xenophot HLX64640) filtrada com um filtro de passagem longa de 580 nm e um de passagem curta da 700 nm emitindo 150 mW/cm2. os animais foram cobertos com folha de alumínio excepto sobre a área do tumor em que tinha sido realizado um orifício na folha metálica com um diâmetro 2 mm maior do que o diâmetro do tumor. Os tumores foram expostos a 145 J/cm2 de luz. Os volumes dos tumores foram medidos duas ou três vezes por semana como descrito acima. Os murganhos foram mortos quando os tumores atingiram um diâmetro aproximadamente 20 mm. Foi contabilizada a fracção de murganhos isenta de tumores 30 dias 83 após a iluminação (Tabela 1) e foi registado o volume tumoral médio em cada grupo de tratamento (Figura 25).

Resultados

Tabela 1. Os murganhos foram tratados como descrito acima e foi registada a ocorrência de tumores 30 dias após a iluminação. N. a DE GRUPO TRATAMENTO FRACÇÁO DE MURGANHOS ISENTOS DE TUMOR 30 DIAS APÓS ILUMINAÇÃO % DE MURGANHOS ISENTOS DE TUMOR 30 DIAS APÓS ILUMINAÇÃO 1 Não tratado 1/8 13 2 PBS + luz 0/7 0 3 Gelonina 0/8 0 4 Gelonina +"luz antes" 0/5 0 5 AlPcS2a 0/10 0 6 AlPcS2a + gelonina 0/7 0 7 AlPcS2a + luz 2/11 18 8 AlPcS2a + gelonina+ "luz antes" 4/5 80

Pode ser verificado a partir da Tabela 1 que a PCI com gelonina utilizando a abordagem "luz antes" (grupo 8) curou 80% (4 de 5) dos murganhos dos seus tumores. Pelo contrário, a gelonina apenas não apresentou qualquer efeito, com (grupo 4) ou sem (grupo 3) tratamento com luz adicional (sem AlPcS2a) . Também a gelonina em combinação com AlPcS2a sem tratamento com luz (grupo 6) não apresentou qualquer efeito. Foi observada uma baixa proporção de cura em animais não tratados (grupo 1) provavelmente devido a um tumor que desapareceu espontaneamente. Pode também ser observada uma baixa proporção de cura para 84 animais e recebendo AlPcS2a e tratamento com luz (grupo 7), devido a um efeito de terapia fotodinâmica (PDT) que era independente da presença de gelonina. No entanto, este efeito de PDT (cura de 18%) foi significativamente inferior ao que foi encontrado para o tratamento por PCI com gelonina (80%, grupo 8). Uma vez que a gelonina por si só não teve qualquer tipo de efeito, a elevada proporção de cura no grupo PCI não pode ser explicada por um efeito aditivo de PDT e gelonina, mas deve ser devida a um efeito sinérgico em que o tratamento por PCI origina o potencial tóxico da gelonina. A figura 25 mostra o efeito do tratamento por PCI no volume tumoral médio em alguns grupos de tratamento. Pode ser verificado que no grupo recebendo apenas gelonina (A) os tumores cresceram tão rapidamente como em animais a que foi administrado um tratamento placebo de uma injecção de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) combinada com iluminação () . Em animais que recebendo apenas o tratamento fotoquímico, mas sem gelonina (0) o crescimento tumoral foi atrasado, mas os tumores iniciaram novamente o crescimento aproximadamente 15 dias após a iluminação. Pelo contrário para os animais recebendo tratamento por PCI com gelonina completo (·) não pôde ser observado qualquer aumento no volume tumoral médio até 33 dias após a iluminação.

Lisboa, 24 de Maio de 2011 85

Claims (31)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método in vitro ou ex vivo para introduzir uma molécula no citosol de uma célula, compreendendo o referido método fazer contactar a referida célula com um agente fotossensibilizador que se localiza para endossomas, lisossomas, retículo endoplasmático ou aparelho Golgi, fazendo contactar a referida célula com a molécula a ser introduzida (molécula de transferência) e irradiando a referida célula com luz de um comprimento de onda eficaz para activar o agente fotossensibilizador, em que a referida irradiação é realizada um momento antes ou ao mesmo tempo em que é feita contactar a referida célula com a molécula de transferência, em que (i) a molécula de transferência não penetra facilmente membranas celulares e/ou (ii) um ou ambos do agente f otossensibili zador e da molécula de transferência estão ligados, associados ou conjugados, com uma ou mais moléculas transportadoras, moléculas direccionadoras ou vectores.
2. 2. Método como reivindicado na reivindicação 1, em que a célula é feita contactar com a molécula de transferência num momento após a irradiação se ter realizado.
3. 3. Método como reivindicado na reivindicação 2, em que a célula é feita contactar com a referida molécula de transferência 0 a 4 horas após a irradiação se ter realizado. 1
4. 4. Método como reivindicado na reivindicação 1, em que a célula é feita contactar com a molécula de transferência simultaneamente à irradiação.
5. 5. Método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a molécula de transferência é feita contactar com a referida célula durante 30 minutos a 6 horas.
6. 6. Método como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 5, em que a referida molécula de transferência é uma proteína, péptido, anticorpo ou antigénio ou um seu fragmento.
7. 7. Método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 em que a referida molécula de transferência ou uma sua parte ou um seu fragmento, é apresentada ou expressa na superfície celular.
8. 8. Método como reivindicado na reivindicação 8 em que a referida célula é uma célula apresentadora de antigénio.
9. 9. Método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 em que a referida molécula de transferência é um fármaco citotóxico.
10. 10. Método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 em que a referida molécula de transferência é uma molécula de ácido nucleico.
11. 11. Método como reivindicado na reivindicação 10 em que a referida molécula de ácido nucleico é incorporada numa molécula vector. 2
12. 12. Método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o agente fotossensibilizador é seleccionado do grupo consistindo em TPPS4, TPPS2a, AlPcS2a e outro fotossensibilizadores anfifilicos.
13. 13. Método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que os referidos agentes fotossensibilizadores são compostos sendo ácido 5-aminolevulínico ou ésteres do ácido aminolevulinico ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
14. 14. Método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 em que o referido agente fotossensibilizante é feito contactar com as referidas células durante 4 a 24 horas antes da irradiação.
15. 15. Método como reivindicado na reivindicação 14, em que o referido agente fotossensibilizante é feito contactar com as referidas células durante 4 a 24 horas imediatamente antes da irradiação.
16. 16. Método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 15 em que o referido agente fotossensibilizante é removido após contacto com a referida célula durante 1 a 4 horas antes da irradiação.
17. 17. Método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em que o transportador, molécula direccionadora ou vector ao qual ou com o qual, a molécula de transferência se liga, associa ou conjuga, é um adenovirus, um policatião, um lipido catiónico ou um péptido ou vector direccionado. 3
18. 18. Método como reivindicado na reivindicação 17, em que a referida molécula de transferência está ligada, associada ou conjugada com um vector e o referido vector está ligado, associado ou conjugado, com uma molécula transportadora, molécula direccionadora ou vector.
19. 19. Método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 11 a 18 em que o referido vector é um adenovirus.
20. 20. Método como reivindicado na reivindicação 17, em que o referido policatião é poli-L-lisina, poli-D-lisina ou SuperFect®.
21. 21. Método como reivindicado na reivindicação 17 ou 18, em que 0 referido lipido catiónico é DOTAP.
22. 22. Método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 19, em que a referida molécula veículo é um lipossoma ou uma construção baseada em lípidos, de um modo preferido contendo pelo menos um lipido catiónico.
23. 23. Método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou 10 a 22, em que pelo menos 50% de referidas células nas quais é introduzida a referida molécula não estão mortas.
24. 24. Método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 23 em que o passo de irradiação é 1 a 10 minutos.
25. 25. Utilização de uma molécula de transferência e um agente fotossensibilizador em que o agente fotossensibilizador e a molécula de transferência são como definidos em qualquer 4 reivindicação anterior para a preparação de um medicamento para a utilização no tratamento ou na prevenção de uma doença, distúrbio ou infecção, em que o referido agente fotossensibilizador e separadamente a referida molécula de transferência se destina a ser feita contactar com células ou tecidos de um doente e as referidas células se destinam a ser irradiadas com luz de um comprimento de onda eficaz para activar o agente fotossensibilizador e a irradiação se destina a ser realizada um momento antes ou ao mesmo tempo em que é feita contactar a referida célula com a molécula de transferência, em que a referida molécula de transferência é uma molécula terapêutica.
26. 26. Utilização de uma molécula de transferência como definido em qualquer reivindicação anterior para a preparação de um medicamento para a utilização no tratamento ou na prevenção de uma doença, distúrbio ou infecção, em que a referida doença, distúrbio ou infecção se destina a ser tratada fazendo contactar células ou tecidos de um doente com o referido medicamento e separadamente um agente fotossensibilizador como definido em qualquer reivindicação anterior se destina a ser feito contactar com as referidas células ou tecidos do referido doente e as referidas células se destinam a ser irradiadas com luz de um comprimento de onda eficaz para activar o agente fotossensibilizador e a irradiação se destina a ser realizada um momento antes ou ao mesmo tempo em que é feita contactar a referida célula com a molécula de transferência, em que a referida molécula de transferência é uma molécula terapêutica. 5
27. 27. Composição contendo uma molécula de transferência e separadamente um agente fotossensibilizador, em que o agente fotossensibilizador e a molécula de transferência são como definidos em qualquer reivindicação anterior, como uma composição combinada para utilização separada ou sequencial no tratamento ou na prevenção de uma doença, distúrbio ou infecção, em que o referido agente fotossensibilizador e separadamente a referida molécula de transferência se destinam a ser feitos contactar com células ou os tecidos de um doente e as referidas células se destinam a ser irradiadas com a luz de um comprimento de onda eficaz para activar o agente fotossensibilizador e a irradiação se destina a ser realizada um momento antes ou ao mesmo tempo em que é feita contactar a referida célula com a molécula de transferência, em que a referida molécula de transferência é uma molécula terapêutica.
28. 28. Molécula de transferência como definida em qualquer reivindicação anterior para a utilização no tratamento ou na prevenção de uma doença, distúrbio ou infecção, em que a referida doença, distúrbio ou infecção se destina a ser tratada fazendo contactar células ou tecidos de um doente com a referida molécula de transferência e separadamente um agente fotossensibilizador como definido em qualquer reivindicação anterior se destina a ser feito contactar com as referidas células ou tecidos do referido doentes e as referidas células se destinam a ser irradiadas com luz de um comprimento de onda eficaz para activar o agente fotossensibilizador e a irradiação se destina a ser realizada um momento antes ou ao mesmo tempo em que é feita contactar a referida célula com a molécula de 6 transferência, em que a referida molécula de transferência é uma molécula terapêutica.
29. 29. Utilização, composição ou molécula de transferência como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 25 a 28, em que o referido método da incorporação celular se destina a ser realizado como descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, 14, 15, 16, 23 ou 24.
30. 30. Utilização, composição ou molécula de transferência como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 25 a 29 para vacinação, em que a referida molécula de transferência é uma molécula antigénica e a referida molécula de transferência ou uma sua parte ou fragmento, destinam-se a ser apresentadas ou expressas na superfície celular.
31. 31. Utilização, composição ou molécula de transferência como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 25 a 29 para terapia génica estimulando uma resposta imunitária ou para tratar ou prevenir cancro Lisboa, 24 de Maio de 2012 7