JP4922490B2

JP4922490B2 - 方法

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Publication number: JP4922490B2
Application number: JP2000604874A
Authority: JP
Inventors: クリスティンバーグ; トールンイー．テジェール; アンダースホッグセット; リーナプラスミケイト
Original assignee: フォトキュアエイエスエイ
Priority date: 1999-03-15
Filing date: 2000-03-10
Publication date: 2012-04-25
Anticipated expiration: 2020-03-10
Also published as: DE60041347D1; US8216587B1; CA2367357A1; ES2319255T3; US9737594B2; EP1223973A2; PL355015A1; CZ20013328A3; NO20014491L; JP2002541072A; DK1223973T3; CZ299370B6; WO2000054802A2; AU3177100A; HUP0202441A3; NO331101B1; CN100379450C; KR100769113B1; EP1223973B1; CA2367357C

Description

【０００１】
本発明は、光力学的治療（PDT）を利用してワクチン成分を細胞内に導入し、抗原提示を達成する段階を含むワクチン接種の方法およびこのような方法において有用なワクチン組成物に関する。
【０００２】
大半の分子は、細胞膜を容易に通過することができない。生きている細胞の細胞質ゾルに分子を導入する方法は、生物学的プロセスを扱い、研究するための有用な手段である。今日、最も一般に利用されている方法の中には、マイクロインジェクション、赤血球ゴースト媒介融合およびリポソーム融合、ピノソームの浸透溶解、スクレープ負荷（scrape loading）、エレクトロポレーション（電気穿孔法）、リン酸カルシウムおよびウイルス媒介トランスフェクションがある。これらの技術は、多くの場合、非実用的で、時間を浪費し、非効率的であるか、あるいは、重大な細胞死を引き起こすこともあるが、培養中の細胞を調べるのに有用である。したがって、細胞に生存能力があり、かつ／または機能的なままに維持することが要求されるところでは、このような技術は、生物学的または医学的研究、あるいは治療における使用には適していない。
【０００３】
ポルフィリンおよび他の多くの光増感化合物が、細胞および組織に対し、細胞毒性作用を引き起こすことがあることはよく知られている。これらの作用は、光増感化合物を光にさらすことにより、毒性となるか、または、細胞膜および細胞構造を含む細胞物質または生体分子にダメージを及ぼす一重項酸素（¹O）または他の酸化ラジカルのような毒性物質を放出するに違いない事実、ならびにこのような細胞または膜のダメージが最終的に細胞を殺すに違いない事実を根拠にしている。これらの作用は、特に腫瘍性疾患を含む、さまざまな異常または疾患の治療に利用されてきた。この治療は、光力学的治療（PDT）と名づけられており、身体の患部に光増感（光化学治療）剤を投与し、次いで、光増感剤を活性化し、これらを細胞毒性型に変換させるために、光活性化光線にさらす段階を含んでおり、このことにより、病変細胞が殺され、あるいはその増殖能力が低減される。光増感剤は、優先的に、あるいは選択的に、所望の標的部位、具体的には腫瘍または他の病変に局在化するであろうことが知られている。
【０００４】
光増感剤の範囲は知られており、たとえば、著名なソラーレン、ポルフィリン、クロリンおよびフタロシアニンが挙げられる。このような薬剤は、光に曝された時に毒性となる。
光増感剤は、直接的または間接的に様々なメカニズムによって、その効果を発揮するであろう。したがって、たとえば、ある光増感剤は、光により活性化されて直接毒性となるが、一方で、脂質、タンパク質、核酸のような、細胞物質および生体分子に対し非常に破壊的である、たとえば、一重項酸素または他の酸素由来のフリーラジカルのような酸化剤といった毒性種を発生するように作用するものもある。
【０００５】
ポルフィリン光増感剤は、毒性酸素種の発生により間接的に作用し、PDTのために特に好ましい候補として認識されている。ポルフィリンは、ヘム合成の際、自然界に生成する前駆体である。特に、ヘムは、酵素フェロケラターゼの作用により、プロトポルフィリンIX（Pp）に鉄（Fe³⁺）が組み込まれたときに造られる。Ppは、非常に強力な増感剤であるが、ヘムは、光増感作用を有しない。当該分野では、ポルフィリンを主体とした、またはポルフィリン関連のさまざまな光増感剤が知られており、文献に記載されている。
【０００６】
細胞毒性作用は、主に、一重項酸素の形成を通じて媒介される。この反応中間体は、細胞中では存在期間が非常に短い（＜0.04μs）。したがって、PDTの最初の細胞毒性作用は、光照射の間に、一重項酸素（¹O）の形成部位の極めて近傍で達成される。¹Oは、タンパク質（ヒスチジン、トリプトファン、メチオニン、システイン、チロシン）、DNA（グアニン）、不飽和脂肪酸およびコレステロールと反応し、酸化する。PDTの利点の一つとしては、光に曝されない組織は影響されないまま残ることができることである。すなわち、選択的なPDT効果を得ることができることである。たとえば腫瘍細胞などの望まない細胞集団を破壊するための、PDTの利用に関する多くの文献がある。特許文献には、多くの光力学的化合物が、単独に、あるいは、たとえば、より細胞特異的な複合体とすべく腫瘍細胞レセプター決定因子に向けられる免疫グロブリンなどの標的試薬との複合体形成も記載されている。ヘマトポルフィリン誘導体のような、ある種の光化学的化合物は、さらに、有害な細胞に局在化する固有の能力を有している。このような方法および化合物は、ノルウェー特許NO173319号、ノルウェー特許出願No.900731号、176645号、176947号、180742号、176786号、301981号、300499号、および891491号に記載されている。
【０００７】
WO93/14142では、抗ガン剤およびコポリマー担体に結合した光活性化剤（すなわち、光増感剤）を含む薬物送達システムが記載されている。投与の際、この複合体はピノサイトーシスまたはファゴサイトーシスにより細胞内に入り、エンドソーム（ピノソーム）およびリソソーム内部に局在化する。リソソームでは、抗腫瘍薬とポリマー間の結合が加水分解され、前者は、抵抗なくリソソーム膜を通過して、細胞質ゾルに拡散し得る。この方法の効用は、したがって、リソソーム膜を横切って拡散することができる小分子化合物に制限される。拡散のための時間のずれをみた後、適切な波長およびエネルギーの光源を光活性な化合物を活性化するのに適用される。抗がん剤および光活性化剤の共同作用により、細胞が破壊される。
【０００８】
したがって、上述したようなPDT法は、細胞構造の破壊に向けられ、細胞死に導かれる。
他方、WO96/07432は、広範な細胞破壊あるいは細胞死を招かない方式で細胞質ゾル中に他の方法では膜を透過しない分子を導入するためのメカニズムとして、光力学的作用を用いた方法に関する。この方法では、分子は、光増感剤とともに、細胞中の細胞内小胞（例：リソソームまたはエンドソーム）に共に内在化される（より具体的には、”細胞内取り込みされる”）。その後、細胞は、光活性化光線にさらされ、光増感剤を”活性化”させ、次に、小胞膜に破壊または破裂を引き起こし、分子を含む小胞内容物を細胞内部に、すなわち、細胞質ゾルに放出する。このような方法では、大多数の細胞の機能または生存能力が、有害な影響を受けていないことがわかった。したがって、”光化学的インターナリゼーション”と呼ばれる、このような方法の有用性が、治療薬を含むさまざまな異なる分子を細胞質ゾル、すなわち、細胞内部に移送するために提案されている。
【０００９】
今回、我々は、このような方法が、分子を細胞内部に移送するためだけではなく、細胞表面上に提示しあるいは発現させるためにも好適に使用し得ることを見出した。したがって、分子を細胞質ゾルに移送し、かつ放出した後に、該分子は、細胞表面に移送されてもよく、そこで、細胞の外側、すなわち、細胞の表面上に提示されてもよい。このような方法は、特にワクチン接種の分野で有用であり、その際、免疫応答を誘発させ、促進し、あるいは増大させるために、ワクチン成分、すなわち、抗原または免疫原は、細胞表面上に提示するために細胞に導入されてもよい。
【００１０】
したがって、最も一般的には、本発明は、光化学的インターナリゼーションにより、細胞質ゾルに分子を導入する段階を含み、続いて、前記分子またはその一部が前記細胞表面上に提示されていることを特徴とする、細胞、好ましくは抗原提示細胞の表面に抗原性分子またはその一部を発現させる方法を提供するものである。
【００１１】
本明細書で用いる、”発現する”または”提示する”とは、前記細胞の表面上に分子またはその一部が存在していることをいい、したがって、少なくともその分子の一部は、その細胞を取り囲む環境にさらされ、接触可能である。”表面”上での発現は、発現される分子が、細胞膜および／または膜内に存在してもよく、もしくは膜に存在することになる成分と接触する場合に達成されてもよい。
【００１２】
このような抗原提示は、好適には、免疫応答、好ましくは、前記抗原分子またはその一部からなるまたは含む存在物による後の攻撃に対し保護を与えるような免疫応答の刺激をもたらしてもよく、結果的に、本発明は、ワクチン接種の方法として、特に有用性を見出している。
さらに詳しくは、本発明の当該側面は、抗原分子またはその一部を細胞表面上に発現するための方法を提供するものであって、以下の段階を含んでいることを特徴としている：
前記細胞を前記抗原分子および光増感剤と接触させ、前記分子および前記増感剤をそれぞれ前記細胞の細胞内の膜で区切られたコンパートメントにそれぞれ取り込む段階、および
前記細胞を、光増感剤を活性化させるのに効果的な波長の光で照射し、当該細胞を殺すことなく、当該細胞内コンパートメントの膜を破壊し、前記分子を細胞質ゾル中に放出させ、
その後、当該放出された抗原分子またはその一部が該細胞の表面上に提示される段階。
【００１３】
本明細書で使用しているように、”破壊された”コンパートメントとは、中に含まれている抗原分子を放出させるのに充分なほど、永久的にまたは一時的にそのコンパートメントの膜の構築を破壊することをいう。
別の観点からみると、本発明の当該側面は、また、好ましくは免疫応答を刺激するために、細胞の表面に抗原分子またはその一部を発現させる際に使用する組成物であって、抗原分子および光増感剤を含む組成物を提供するものである。当該組成物は、医薬品基準に合っていることが好ましく、また、医薬品基準に合った賦形剤あるいは希釈液をも含んでいることが好ましい。
【００１４】
さらなる面では、本発明はまた、免疫応答を刺激するために、細胞表面に前記抗原分子またはその一部を発現させる際に使用する薬剤の調製における、抗原分子および光増感剤の用途を提供するものである。
本発明のよりさらなる面は、好ましくは免疫応答を刺激するために、細胞表面に、前記抗原またはその一部を発現させる際に、同時に、別々にまたは連続的に使用するための製剤の組み合わせとして、抗原分子および光増感剤を含む製品を提供するものである。
【００１５】
本発明のもう一つの面は、細胞の表面に抗原分子またはその一部を発現させる際に使用するためのキットであって、
前記抗原分子を含む第一の容器、および
光増感剤を含む第二の容器
を含むキットを提供するものである。
【００１６】
本発明においては、抗原分子は、適切な様式で免疫系に提示された時に、当該分子またはその一部が免疫応答を刺激し得るものであれば、どのような分子であってもよい。したがって、好適には、抗原分子は、たとえばポリペプチドを含む存在物などの、ワクチン抗原またはワクチン成分であろう。
多くのこのような抗原または抗原性ワクチン成分が、当該分野で知られており、たとえば、すべての種類の細菌性またはウイルス性抗原、あるいは、さらに、原生動物またはより高等な生物を含む任意の病原種の抗原または抗原成分が挙げられる。
【００１７】
一方、従来より、ワクチンの抗原成分は、生物全体（生きているか、死んでいるか、減毒されているかを問わない）からなり、すなわち、全細胞ワクチンであるが、さらには、サブユニットワクチン、すなわち、生物の特定抗原成分、具体的には、タンパク質またはペプチド、あるいは炭水化物でさえも主成分とするワクチンが、広く研究され、文献に報告されている。このような”サブユニット”系ワクチン成分のいずれかを、本発明の抗原分子として用いてもよい。しかしながら、本発明は、特にペプチドワクチンの分野に有用性を見出している。したがって、本発明によれば、抗原分子としては、ペプチドが好ましい（本明細書では、ペプチドとして、長さのより短いものとより長いものの両方、すなわち、ペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチド、並びに、タンパク質分子またはその断片であって、具体的には、5〜500、より具体的には、10〜250、たとえば、15〜75または8〜25のアミノ酸からなるペプチドなどを包含するように定義される）。提示されまたは発現されている抗原分子の一部は、好ましくは、細胞内の抗原処理機構によって発生する部分を含む。しかしながら、該部分は、適切な抗原設計（例：pH感受性バンド）または他の細胞処理手段を通じて達成されるような別の手段によって発生させられてもよい。一般に、そのような部分は、免疫応答を生じるのに充分な大きさである、例えば、5より大きいペプチドの場合、あるいは例えば、大きさが10または20のアミノ酸より大きい場合である。
【００１８】
たとえば、AIDS/HIV感染またはインフルエンザ、イヌ由来パルボウイルス、ウシ由来白血病ウイルス、肝炎などのようなウイルス性疾患および感染の処置では、多数のペプチドワクチン候補が、文献に提案されている（例：Phanuphakら、Asian Pac. J. Allergy. Immunol. 1997, 15(1), 41-8; Naruse, Hokkaido Igaku Zasshi 1994, 69(4), 811-20; Casalら、J. Virol., 1995, 69(11), 7274-7; Belyakovら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95(4), 1709-14; Naruseら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91(20), 9588-92; Kabeyaら、Vaccine 1996, 14(12), 1118-22; Itohら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83(23), 9174-8）。実際には、他の生物または種由来のペプチド抗原を用いてもいいように、同様に、細菌のペプチドを用いてもよい。
【００１９】
病原性生物に由来する抗原に加えて、ペプチドもまた、ガンまたは多発性硬化症のような他の疾患に対するワクチンとして使用することが提案されている。たとえば、突然変異性ガン遺伝子のペプチドは、細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激する際、抗原を演じるガンワクチンとして、多大な有望性を有している（Schirrmacher, Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 1995, 121, 443-451; Curtis Cancer Chemotherapy and Biological Response Modifiers, 1997, 17, 316-327）。合成ペプチドワクチンもまた、転移性黒色腫治療に評価されている（Rosenbergら、Nat. Med. 1998, 4(3), 321-7）。多発性硬化症の治療のためのＴ細胞受容体ペプチドワクチンが、Wilsonら、J. Neuroimmunol. 1997, 76(1-2), 15-28に記載されている。実際に、文献中にペプチドワクチンとして記載または提案されているペプチドのいずれも用いてもいいように、このようなペプチドワクチン成分のいずれかを、本発明の抗原分子として使用してもよい。したがって、ペプチドは、合成されたものでも、または単離されたものでも、あるいは生物由来の他の方法によるものであってもよい。
【００２０】
本発明の方法、使用などに用いられる細胞は、細胞質ゾルに投入され、移送された分子を細胞表面に発現し、あるいは提示し得る細胞であればいかなるものでもよい。
本発明の第一の有用性は、抗原提示またはワクチン接種にあるため、細胞は、免疫エフェクター細胞、すなわち、免疫応答に関与する細胞であることが好ましい。しかしながら、他の細胞もまた、免疫系に抗原を提示する場合もあり、これらも、本発明の範囲に含まれる。
【００２１】
したがって、本発明の細胞は、抗原提示細胞であることが好ましい。抗原提示細胞は、体液性および細胞媒介免疫の両方を含む免疫応答のいかなる局面、または“戦力（arm）”、具体的には、抗体産生の刺激、あるいは細胞毒性または傷害性細胞の刺激に関わっていてもよい。これにより、“外来”抗原を細胞表面に発現する細胞を認識しかつ破壊（または、その他の方法で排除）し得るであろう。したがって、“免疫応答を刺激する”という用語は、それらを刺激するためのあらゆる種類の免疫応答およびメカニズムを包含している。
【００２２】
細胞傷害性の細胞または抗体産生細胞の刺激は、抗原提示細胞により特定の方法で刺激される細胞に、抗原が提示されること、たとえば、MHCクラスIの提示を必要とする（例：CD8^-細胞傷害性T細胞の活性化は、MHC-I抗原提示を必要とする）。
抗原提示細胞は、当該分野で知られており、また、文献に記載されていて、たとえば、リンパ球（T細胞およびB細胞の両方）、樹状細胞、マクロファージなどが挙げられる。その他には、たとえば、黒色腫細胞などのガン細胞が挙げられる。
【００２３】
抗原提示細胞による細胞傷害性T細胞（CTL）への抗原提示のためには、抗原分子は、抗原提示細胞の細胞質ゾルに入ることを必要とする（Germain, Cell, 1994, 76, 287-299）。本発明は、抗原分子の細胞質ゾルへの効率的な送達方法を提供するものである。
抗原分子は、光化学的インターナリゼーション処理により細胞質ゾルに放出されると直ぐに、細胞の抗原処理機構により処理され、たとえば、MHCクラスIにより適当な方法で細胞表面に提示されるだろう。この処理は、抗原の分解、たとえば、タンパク質またはポリペプチド抗原のペプチドへの分解を含んでおり、そのペプチドは、提示のためにMHCの分子と複合体を形成する。したがって、本発明により細胞表面に発現されまたは提示される抗原分子は、内在化（エンドサイトーシス）される抗原分子の一部または断片であってもよい。
【００２４】
抗原は、抗原提示細胞によるエンドサイトーシスにより取り込まれ、エンドサイトーシス小胞（endocytic vesicles）中でペプチドに分解されてもよい。これらのペプチドは、エンドソーム中で、MHCクラスII分子に結合し、細胞表面に移送されるが、そこで、ペプチド−MHCクラスII複合体は、CD⁴⁺ヘルパーT細胞により認識され、免疫応答が誘発されるだろう。あるいは、細胞質ゾル中にあるタンパク質は、たとえばプロテアソームにより分解され、TAP（抗原提示に関係する輸送体）の手段によって、小胞体中に移送されてもよく、さらに、そこでペプチドはMHCクラスI分子に結合し、図１に図示したように細胞表面に移送されるに違いない（YewdellおよびBennink、1992, Adv. Immunol. 52: 1-123）。もし、ペプチドが外来抗原起源のものであるならば、ペプチド−MHCクラスI複合体はCD8+細胞傷害性T細胞（CTL）により認識されるであろう。CTLは、ペプチド−MHC（HLA）クラスI複合体に結合し、それによって活性化され、増殖を開始し、CTLのクローンを形成するであろう。標的細胞および細胞表面に同一のペプチド−MHCクラスI複合体を有する他の標的細胞は、CTLクローンにより殺される。もし、充分な量の抗原が細胞質ゾルに導入され得る場合は、外来性抗原に対する免疫が、確立されることになる（YewdellおよびBennink、1992, 上記；Rock, 1996, Immunology Today 17: 131-137）。これが、とりわけガンワクチンの開発の基礎となる。最も実際的な問題のうちの一つは、充分な量の抗原（または抗原の一部）を細胞質ゾルに導入することである。これは、本発明では、PCIにより解決することができる。この原理は、図１に図示されており、図１は、どのようにしてPCIが利用され、CTLを刺激するかを示している。ペプチドまたはタンパク質（P）は、抗原提示細胞へ細胞外より適用される。Pは、PCIによりエンドサイトーシスされ、細胞質ゾル中に放出される。その後、ペプチドまたはタンパク質は、プロテアソームにより、部分的に分解され、MHC（HLA）クラスIと複合体を形成したまま、細胞表面に移送されるであろう。そこで、複合体は、CTLにより認識され得る。
【００２５】
後述の実施例でより詳細に記載されているように、本発明によれは、光化学的インターナリゼーションは、ガン特異的ペプチドの細胞質ゾルへの送達のために効果的に使用され得ることが示されている。
抗原分子および／または光増感剤は、標的薬剤、具体的には標的に特異的な送達系または担体系、あるいは担体分子を使用することにより、特定の細胞または組織に向けることができる。したがって、たとえば、抗原分子および／または光増感剤をベクターまたは担体系、具体的には再構成されたLDL−粒子を用いて、細胞に送達することができる。担体分子は、抗原分子、光増感剤または両方に結合され、または複合化されてもよく、また、同一または異なる担体分子を用いてもよい。抗原分子および／または光増感剤もまた、部位を標的にするリガンド、たとえば、特定の細胞タイプまたは特定の細胞構造に特異的なリガンド、具体的にはある細胞タイプに発現される表面抗原、たとえば腫瘍に特異的な抗原を認識する抗体、に結合していてもよい。このようなメカニズムは、受容体に媒介されるエンドサイトーシスによる光増感剤および／または抗原分子の取り込みを増加させるように作用してもよい。抗原分子および／または光増感剤を細胞内コンパートメントに運ぶために、このような標的分子の担体またはベクターが用いられてもよい。
【００２６】
細胞内の膜により限定されたコンパートメントは、細胞内にあるコンパートメントであればいずれであってもよい。好ましくは、該コンパートメントは膜性の小胞、特にエンドソームもしくはリソソームであろう。しかし、該細胞内コンパートメントは、ゴルジ装置または小胞体を含むこともできる。要件とされることは、抗原分子と光増感剤が同一の細胞内コンパートメントを探し当てることである。
【００２７】
光化学的インターナリゼーション処理はWO96／07432（参照により本明細書の一部をなす内容）にさらに詳細に記載されている。PDTの方法もまた、今では文献に広く記載されている。
本発明によって使用される光増感剤は、細胞内コンパートメント、とりわけエンドソームもしくはリソソームに局在化するものであれば何でもよい。そのような光増感剤の範囲は当業界で知られており、WO96／07432を含む文献に記載されている。この点につき、培養細胞のエンドソームもしくはリソソームの位置を突き止めることが示されているジ‐およびテトラスルホン化アルミニウムフタロシアニン、スルホン化テトラフェニルポルフィリン（TPPS_n）、ナイルブルー、クロリンｅ₆誘導体、ウロポルフィリンI、フィロエリスリン、ヘマトポルフィリンおよびメチレンブルーを挙げることができる。これはほとんどの場合、エンドサイトーシス活性によるものである。
【００２８】
したがって言及すべき適切な光増感剤の種類は、ポルフィリン、フタロシアニン、プルプリン、クロリン、ベンゾポルフィリン、ナフタロシアニン、陽イオン性色素、テトラサイクリンおよびリソソーム向性の弱塩基またはそれらの誘導体を含むものである（Bergら、 Photochemistry and Photobiology, 1997, 65, 403-409）。
【００２９】
好ましい光増感剤はTPPS₄（Zabnerら、 J.Biol.Chem., 1995, 270, 18997- 19007）、ＴＰＰＳ_2aおよびAlPcS_2aを含むものである。
本発明による光化学的インターナリゼーション過程は、当業界ではよく知られ、標準的であるＰＤＴ法およびこの方法において有効である技術の適切な変法を使用して行なうことができる。かくしてPDTの技術分野で公知である手法および手段により、抗原分子および光増感剤を適用または投与することにより細胞に導入することができる。
【００３０】
本発明の方法は、同所発生部位での処置または生体外での処置のいずれかによりインビトロもしくはインビボで使用してもよく、続いて処理した細胞を投与される。
したがって、本発明のもうひとつの面は、表面で抗原分子またはその一部分を発現している抗原提示細胞を提供することであり、本明細書の先に定義した方法によりそのような細胞を得ることが可能である（得られる）。本発明の別の面は、そうした細胞の集団または培養株、特にそのような細胞の活きた機能的に完全である集団または培養株ならびに治療上、具体的には免疫応答を刺激するための、とりわけCTLを刺激するための、そうした細胞（または細胞の集団もしくは培養株）の使用を提供する。
【００３１】
免疫応答を刺激するための、特にCTL細胞を刺激するための治療薬（たとえばワクチン組成物）を調製するためにそうした細胞（または細胞の集団もしくは培養株）の利用もまた提供する。
インビボでは、当業界で通常のあるいは標準的である任意の投与方式を使用してもよく、たとえば注射、点滴、体内の表面または体外の表面へのいずれの局部投与などがある。インビボでの使用では、固形の組織のみならず体液中にあるものを含め、標的細胞を含むいずれの組織に関しても本発明を使用することができる。光増感剤が標的細胞により取り込まれかつ光が適切に届くかぎり、あらゆる組織を処置することができる。
【００３２】
したがって、本発明の組成物は製剤技術において知られた技法および操作に従い、たとえば製剤上許容される一以上の担体または賦形剤を使用して、任意の好都合な方式で処方することができる。組成物、担体もしくは賦形物質の特性、用量などは、投与の選択と所望する経路、ワクチン投与の目的などに応じて常法的に選択することができる。同様に用量は常法的に決定してもよく、抗原分子の特性、ワクチン投与の目的、患者の年齢、投与方法などに依存するであろう。その際、光増感剤に関連して、照射により細胞膜が破壊される潜在性／作用力もまた考慮に入れられるべきである。
【００３３】
光増感剤を活性化するための光照射段階もまた当業界でよく知られた技術および操作に従って行われるだろう。たとえば光の波長および強度は、使用する光増感剤によって選択されるであろう。適切な光源は当業界ではよく知られている。すでに述べたようにそしてWO96／０７４３２に記載されたように、このような方法において光化学的インターナリゼーションは、細胞の生存性および機能に対して有害に作用しないことが見出されている。特に本発明の方法に従って、複数の細胞または細胞の集団が処置されたとき、その処置で大多数の細胞は殺されることなく生き延び、実質的に機能が完全であることが見出されている。
【００３４】
本明細書では、「細胞を殺すことなく」なる用語は、そうした状況を定義することを意図するものである。換言すると複数の細胞または細胞の集団、あるいは実質上すべての細胞、あるいは著しく大多数（具体的には、細胞の少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０，８５，９０もしくは９５％）が殺されないですむことである。
【００３５】
明らかに複数の細胞または細胞の集団への光照射を取り扱う場合、細胞の特定グループまたは組織の特定部分が、細胞の他のグループまたは組織の他の部分よりも多い光を受けたり、あるいは何らかの方法で、より大きいPCI効果を受けたりすることはありうる。したがって、細胞の生存について与えられたパーセンテージの値は、照射された集団全体にわたって必ずしも一様である必要はなく、当該値は照射された集団に残り生存している細胞のパーセントを指すこととなる。その要件は、照射された細胞のうち充分な割合が生存することだけである。加えて、照射により誘導される細胞死はある時間を要し、たとえばそれが起こるのに長時間を要するなどである。この場合、最後は死ぬ細胞もまた本発明の方法に従ってその表面に抗原性の分子を発現することができることは認められ得ることであり、したがって本発明の方法、利用などが関わり得ることとなる。かくして「％細胞死」は、照射の数時間内（たとえば照射後、４時間まで）に生存したままの細胞のパーセントを意味するが、より好ましくは照射して４時間以上してからの「生存細胞％」を言及する。
【００３６】
本発明の方法は、光増感剤の濃度に関連して光量を選択することにより、生存する細胞の比率または割合を調整するように修飾することもできる。またそのような技法は、当業界では公知である。
本発明は、極めて多様な抗原分子を送達する効率的な手段を提供する。本発明は、該手段をワクチン送達の道具として特に好適なものとするいくつかの特徴を有する。1)送達する分子が、標的細胞によりエンドサイトーシスをされ得るかぎりそのサイズに制限を付さない。2)それは、細胞の増殖に依存しない。3)光に曝される部分のみが影響を受ける意味において部位特異的である。4)腫瘍形成性ではない。さらに、光化学的インターナリゼーションは、部位特異的または組織特異的な薬物作用を生じさせるための他の原理と組み合わされる可能性を有する。たとえば細胞表面の構造に対する特異的なリガンドを使用することによる標的化、組織特異性を付与する調節遺伝子エレメントを利用すること、疾患特異的な薬剤の使用などである。これにより標的細胞に対する薬物の特異性に実質的に相乗的効果を得る可能性を切り開くこととなる。
【００３７】
本発明を、添付した図の参照しつつ限定されない次の実施例においてさらに詳細に記載することとする。
【００３８】
【実施例】
材料および方法
照射
2つの異なる光源を細胞の処理のために用いた。いずれも４個の蛍光管列からなる。TPPS₄、TPPS_2a、および3-THPP（ポルフィリンプロダクツ、ローガン、UT）で処理された細胞を、1.5mW/cm²の細胞に到達する光強度で青色光（モデル3026；アップライドフォトフィジックス社、ロンドン、UK）に曝し、一方，AlPcS_2a（ポルフィリンプロダクツ、ローガン、UT）で処理された細胞は1.35mW/cm²の細胞に到達する光強度で、シネモイド（Cinemoid）35フィルターを通した赤色光（フィリップス社TL20W/09）に曝した。
蛍光顕微鏡
Berg.K.,ら Biochem. Biophys. Acta., 1370:317-324,1998に記載された蛍光顕微鏡により細胞を分析した。フルオレセイン標識分子の分析のため、顕微鏡に450-490nm励起フィルター、510nm二色光線スプリッターおよび510-540nmバンドパス発光フィルターを装備した。
プラスミド−ｐ Lys 複合体の調製および細胞の処理
プラスミド−ｐLys複合体（チャージ比1.7）は、HBS 75 μlにあるプラスミド（pEGFP-N1;クローンテックラボラトリーズ社、パロアルト、CA）5μgとHBS 75 μl中のｐLys（MW 20,700; シグマ社、セントルイス、MO）5.3μgとを温和に混ぜることにより調製した。溶液は室温で30分間インキュベートし、培養培地で希釈して細胞に加えた。
【００３９】
THX細胞は、37℃で18時間 AlPcS_2a 20μg/mlとインキュベートし、洗浄してさらに3時間、増感剤フリーの培地にインキュベートしてから2時間、プラスミド−pLys複合体とインキュベートした。
pEGFP-N1／ｐLys処理THX細胞は、一度洗浄してから光に照射する前に添加物のない培養培地で２時間インキュベートした。細胞は、フローサイトメトリーによるGFP発現の分析の前に、2日間３７℃でインキュベートして継代培養し、さらに５日間インキュベートした。
【００４０】
HCT-116細胞は、AlPcS_2a 20μg/mlで18時間インキュベートし洗浄して、次いで光照射前にプラスミドフリー培地でプラスミド-pLys複合体を用いて６時間トランスフェクションした。37℃における40時間のインキュベーション後、GFP発現を顕微鏡で調べた。
フローサイトメトリー分析
細胞は、トリプシン処理をして遠心分離後、400μlの培養培地に再懸濁して50μmメッシュのナイロンフィルターを通して濾過した。その後これらの細胞をFACStar付きフローサイトメーター（ベクトン・ディキンソン社）で分析した。488nmに調整したアルゴンレーザー（200mW）で励起後、510-530nmフィルターを通して、緑色蛍光タンパク質（GFP）を測定した。351-356nmに調整したクリプトンレーザー（50mW）で励起した後、650nmロングパス・フィルターを通して、AlPcS_2aを測定した。二組の細胞は、GFP蛍光シグナルのパルス幅をゲート調整することにより単一の細胞から区別された。データはPCライシス（Lysys）IIソフトウェア（ベクトン・ディキンソン社）で解析された。
フルオレセイン−ペプチドの調製および細胞の処理
フルオレセイン標識ペプチドVal¹²-p21^ras（残基5〜21）がAlan Cuthbertson（ニコムドアマーシャム社）により合成され、提供された。
【００４１】
BL2-G-E6細胞を、フルオレセイン標識p21^ras由来ペプチド、30μg／mlで18時間インキュベートし、次いで18時間、AlPcS_2a 20μg／mlにそして赤色光に曝す前に薬物フリーの培地中で１時間インキュベートした。
【００４２】
【実施例１】
光化学的インターナリゼーション（ PCI ）はペプチドが細胞の細胞質ゾルに入ることができるようにするために用いることができる
ガンに特異的なペプチドの細胞質ゾルへの送達についてPCIを評価するために、残基5〜21を包含しVal¹²変異（G12V）を含むフルオレセイン標識p21^rasペプチドが用いられた(Gjertsen,M.K.,ら Int. J. Cancer, 72:784-790,1997)。BL2-6-E6マウス線維芽細胞において、rasペプチドはAlPcS_2a と良好にともに局在化した。このことは該ペプチドのエンドサイトーシスを示している（図２）。光に4分曝した後、フルオレセイン標識rasペプチドおよびAlPcS_2a が細胞質内に拡散的に局在化していることがわかった。類似の効果はフルオレセイン標識rasペプチドおよび光にのみ曝された細胞では観察されなかった（データは示さず）。
【００４３】
【実施例２】
抗原提示ならびに CD8 ⁺ T リンパ球媒介の細胞殺生を誘導するための PCI の使用
10%牛胎児血清（FCS）を含むRPMI1640培地で生育させ、MART-1ペプチドを発現していないFM３黒色腫細胞（6ウェルプレートに2×10⁵/ウェル存在）を、光増感剤AlPcS_2a 10μg／mlで18時間処理した。次いで該細胞はダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）においてEDTA（0.1M）で基質から解離させ、100％FCS中で1時間、⁵¹Cr（60 μCi/ml Na₂CrO₄）を細胞に負荷をかけている間、該細胞を溶液内にとどめ、つぎに10%FCSにおいてRPMI1640中のMART-1ペプチド5μg／mlで５時間インキュベートし、該細胞はそのまま溶液内にとどめた。MART-1ペプチドの配列は次の通りである：TAEEAAGIGILTVILG。その後、細胞は10%FCSを含むRPMI1640培地で2回洗浄し、96ウェルプレートに播種した（100μl の培地(RPMI1640/10%FCS）中に、2000/ ウェル)。細胞はつぎに1.35mW/cm²の細胞に到達する光強度で、シネモイド（Cinemoid）35フィルターを通して光（フィリップス社TL20W/09）に図３に表示する回数だけ曝した（Rodalら、1998, J.Photochem. Photobiol. B:Biol. 45:150-9)）。光に曝して18時間後、培地を除去して細胞傷害性Tリンパ球（100μlにCTLを40,000/ウェル加えた）に特異的なMART-1／HLA-A2を含む培地を加えた。4時間のインキュベーション後、培地をFM3細胞から分離し、培地に遊離した⁵¹Cr を（溶解した細胞の指標として）カウントするほか、前に記載したようにして自発的な最大の遊離もカウントした（Fossumら, 1995, Cancer Immunol. immunother.40:165-172）。特異的なクロム遊離のパーセンテージを次式により算出した：
（実験的遊離―自発的遊離）／（最大遊離―自発的遊離）×100
図３に示す結果からわかるように、FM3細胞は、上に概略を示したようにMART-1ペプチドのPCIの後、光依存性のCD8⁺Tリンパ球の細胞障害に対する感受性を示す。
【００４４】
【実施例３】
PCI は細胞内に取り込まれた分子の大部分の放出を誘導する
このことは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）のPCI誘導インターナリゼーション/エンドサイトーシスにより示された。
HRPを使用することにより、PCIが、細胞内にエンドサイトーシスされたＨＲＰの大部分（>60%）が細胞質ゾルに放出することを促進することが示される（図４を参照）
この実験において、NHIK3025細胞（ヒト頚部からの該部位の腫瘍細胞）は、光増感剤TPPS_2a（3.2μg／ml）およびHRP １mg／mlにより18時間処理された。次いで図４に示された光量に曝す前に、培地を薬物フリーの培地と交換した。HRP活性をSteinmanら、J.Cell Biol.,68:665-687,1976に記載された操作に従って測定した。細胞質ゾルは、細胞質ゾルフリー細胞残骸からエレクトロポレーションならびに密度遠心分離技術により分離された（Bergら、Int. J. Cancer 59:814-822,1994）。
【００４５】
【実施例４】
PCI は機能遺伝子の送達を促進するために用い得る
これを示すためTHX細胞は、緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードするプラスミド（pEGFP-N1）のpLys複合体とトランスフェクションされた。
GFPの発現は、フローサイトメトリー（図５、aおよびb）および蛍光顕微鏡（データは示さず）により分析された。図５aから明らかなように、AlPcS_2a と光との処理は、GFPを発現している細胞の割合において強い増加をもたらした。このレポーター分子に陽性である細胞の割合は、光処理がない場合の１％から5分の光に曝した後には50%に増加した。光増感剤のないときにｐEGFP−ｐLysで処理された細胞では、GFP発現は光による強化はなかった。無関係なプラスミド（ヘムオキシゲナーゼをコードする）とpLysとの複合体は、AlPcS_2a と光とを併せた場合でも、緑色蛍光を誘導しなかった（データは示さず）。それゆえ光−導入方法において、PCIは機能遺伝子をTHX細胞にトランスフェクションする効率を実質的に上昇させることができる。同様の結果は、光増感剤としてTPPS_2aを用い、BHK-21およびHCT-116を標的細胞として用いた場合にも得られた（データは示さず）。本質的に非リソソーム的に局在化する光増感剤3−THPPは、GFP発現について僅かな増加しか誘導しなかった（図５b）。ｐLysと複合体を形成しないｐEGFP-N1のPCIは、GFPの発現を誘導しなかった（データは示さず）。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＣＴＬ細胞を刺激するためにＰＣＩがどう用いられるかを示す模式的な図である。抗原提示細胞にペプチドまたはタンパク質（Ｐ）が細胞外から適用される。Ｐは、ＰＣＩにより細胞内に取り込まれ細胞質ゾルに放出される。その後そのペプチドまたはタンパク質はプロテアソームにより部分的に分解され、ＭＨＣ（ＨＬＡ）クラスＩと複合体を形成して細胞表面に輸送される。そこで該複合体はＣＴＬ細胞により認識される。
【図２】図２は、光化学的に誘導されるペプチドの再局在化を示す。ＢＬ２−Ｇ−Ｅ６細胞は、フルオレセイン標識ｐ２１^ras−由来5-21、Val¹²ペプチドおよびAlPcS_2aとインキュベートされた。細胞は、赤色光に4分間照射する前（上パネル）およびその30分後（下パネル）に、蛍光顕微鏡によりフルオレセイン−ペプチドおよびAlPcS_2aの局在化について調べられた。横線は20μmを示す。
【図３】図３は、MART-1ペプチドのＰＣＩ後における、FM3黒色腫細胞に対するCD8⁺Tリンパ球クローンによる細胞傷害作用を示す。
【図４】図４は、HRPを細胞質ゾルに送達するPCIの能力を示す。NHIK3025細胞をTPPS_2a3.2μg/mlおよびHRP 1mg/mlで18時間処理した。その培地を指定の光投与量に曝す前に薬物を含まない培地に交換した。HRP活性は、完全な細胞（●）およびエレクトロポレーションならびに密度遠心分離技術により細胞質ゾルフリー細胞残骸（▼）から分離された細胞質ゾル（○）について測定した。
【図５】図５は、光化学的に誘導されたGFPの発現を示す。
a. AlPcS_2aおよび光がない場合またはAlPcS_2aが存在する場合に、pEGFP-N1-pLys複合体で処理し、次いで図に示される光に曝したときのTHX細胞でのGFPの発現を示す。細胞はフローサイトメトリーにより分析され、GFP発現に陽性であるとして描かれた線の右側にある細胞を計数した。
b. 18時間、光増感剤（20μg/ml AlPcS_2a または0.25μg/ml 3-THPP）で処理し、次いでpEGFP-N1-pLys複合体で６時間トランスフェクションをしてさらに細胞の５０％を不活性化させる光露出をしたTHX細胞でのGFP発現を示す。GFP発現はa.のようにフローサイトメトリーにより分析した。

Claims

細胞を抗原分子またはその一部ならびに光増感剤と接触させ、当該分子および当該増感剤をそれぞれ該細胞の細胞内の膜で区切られたコンパートメントに取り込み、
当該細胞を、光増感剤を活性化するのに効果的な波長の光で照射し、細胞を殺すことなく、当該細胞内コンパートメントの膜を破壊し該分子を細胞質ゾルに放出させ、
当該放出された抗原分子またはその一部が続いて該細胞の表面に提示されることを特徴とする、抗原分子またはその一部を細胞表面上に発現させるためのインビトロでの方法。
前記抗原分子が免疫応答を刺激し得る分子であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
前記抗原分子がワクチン抗原またはワクチン成分であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
前記抗原分子がペプチドであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
前記細胞が、リンパ球、樹枝状細胞、マクロファージ、およびガン細胞からなる群より選ばれる抗原提示細胞であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
前記光増感剤が、ポルフィリン、フタロシアニン、プルプリン、クロリン、ベンゾポルフィリン、ナフタロシアニン、陽イオン性色素、テトラサイクリンおよびリソソーム向性の弱塩基またはその誘導体からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
前記光増感剤が、TPPS₄、TPPS_2a、またはAlPcS_2aであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
抗原分子および／または光増感剤が、一以上の標的薬物または担体分子に結合されていることを特徴とする請求項１〜７いずれかに記載の方法。
細胞を抗原分子またはその一部ならびに光増感剤と接触させ、当該分子および当該増感剤をそれぞれ該細胞の細胞内の膜で区切られたコンパートメントに取り込み、
当該細胞を、光増感剤を活性化するのに効果的な波長の光で照射し、細胞を殺すことなく、当該細胞内コンパートメントの膜を破壊し該分子を細胞質ゾルに放出させ、
当該放出された抗原分子またはその一部が続いて該細胞の表面に提示されることを特徴とする、抗原分子またはその一部を細胞表面上に発現させるインビトロでの方法であって、前記細胞が、リンパ球、樹枝状細胞、およびマクロファージからなる群より選ばれる抗原提示細胞であることを特徴とする方法。
前記方法が請求項２〜４または請求項６〜８のいずれかに記載の方法である、請求項９に記載の方法。
細胞の表面に、抗原分子またはその一部を発現させるための組成物であって、請求項１〜４または請求項８のいずれか１つに記載の抗原分子および請求項１または６〜８のいずれか１つに記載の増感剤を含むことを特徴とする組成物。
治療において用いられることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
抗原分子またはその一部を細胞の表面に発現させて免疫応答を刺激するための、またはCTLを刺激するための薬剤を調製する際における抗原分子および光増感剤の使用。
前記細胞を前記抗原分子またはその一部ならびに光増感剤と接触させ、当該分子および当該増感剤をそれぞれ該細胞の細胞内の膜で区切られたコンパートメントに取り込み、
当該細胞を、光増感剤を活性化するのに効果的な波長の光で照射し、細胞を殺すことなく、当該細胞内コンパートメントの膜を破壊し該分子を細胞質ゾルに放出させ、
当該放出された抗原分子またはその一部が続いて該細胞の表面に提示されることを特徴とする請求項１３に記載の使用。
前記抗原分子、光増感剤および細胞が請求項２〜８のいずれかに記載されたものであることを特徴とする請求項１３または１４に記載の使用。
前記薬剤がワクチン接種に使用されることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれかに記載の使用。
前記薬剤が、ウイルス性疾患、ガン、または多発性硬化症の治療に使用されることを特徴とする請求項１３〜１６のいずれか１つに記載の使用。
前記抗原分子またはその一部を細胞の表面に発現させる際に、同時に、別々にまたは連続的に使用するための組み合わせとして、請求項１〜４または請求項８のいずれか１つに記載の抗原分子および請求項１または請求項６〜８のいずれか１つに記載の光増感剤を含むことを特徴とする抗原分子またはその一部を細胞の表面に発現させるための製品。
抗原分子またはその一部を細胞の表面上に発現させるためのキットであって、請求項１〜４または請求項８のいずれか１つに記載の抗原分子を含む第一の容器；および
請求項１または請求項６〜８のいずれか１つに記載の光増感剤を含む第二の容器を含むことを特徴とするキット。