CZ20013328A3

CZ20013328A3 - Způsob exprese molekuly antigenu

Info

Publication number: CZ20013328A3
Application number: CZ20013328A
Authority: CZ
Inventors: Kristian Berg; Torunn E. Tjelle; Anders Hogset; Lina Prasmickaite
Original assignee: Photocure Asa
Priority date: 1999-03-15
Filing date: 2000-03-10
Publication date: 2002-03-13
Also published as: JP2002541072A; US9737594B2; WO2000054802A3; NO20014491L; NZ514228A; CN100379450C; DK1223973T3; MXPA01009316A; AU771990B2; ES2319255T3; EP1223973B1; PL355015A1; KR20010110664A; HU227604B1; KR100769113B1; NO20014491D0; HUP0202441A3; US8216587B1; NO331101B1; ATE419866T1

Description

Předkládaný vynález se týká způsobu očkování, vakcinace, který zahrnuje fotodynamické působení (PDT, photodynamic treatment) k zavedení složek vakcíny do buněk pro dosažení prezentace (nabízení) antigenu a vakcinační prostředky vhodné pro tento způsob.

Většina molekul neprochází snadno buněčnými membránami. Způsoby k zavedení molekul do cytosolu živých buněk jsou vhodnými nástroji k provádění a studiu biologických procesů. Mezi současně nejpoužívanější metody patří mikroinjikace, fúze za účasti červených krvinek (red blood cell ghost-mediated fusion), fúze liposomů, osmotická lyže pinosomů, naškrabání (scrape loading), elektroporace, transfekce zprostředkovaná fosforečnanem vápenatým a virem. Tyto techniky jsou vhodné pro studium buněk v kultuře, i když v mnoha případech mohou být nepraktické, časově náročné, neúčinné nebo mohou indukovat významné odumření buněk. Takové metody tedy nejsou tím nej lepším pro použití v biologickém nebo lékařském výzkumu, nebo při léčbách, kde se vyžaduje, aby buňky zůstaly životaschopné a/nebo funkční.

Je dobře známo, že porfyriny a mnoho jiných fotosenzitizujících sloučenin může indukovat toxické účinky na buňky a tkáně. Tyto účinky jsou založeny na skutečnosti, že během vystavení světlu se mohou fotosenzitizující sloučeniny stát toxickými nebo mohou uvolňovat toxické látky, jako je singlet kyslíku nebo jako jsou jiné oxidační radikály, které poškozují buněčný materiál nebo biomolekuly, včetně buněčných membrán a buněčných struktur Takové buněčné nebo membránové poškození může nakonec buňky usmrtit. Tyto účinky se používaly při léčbě různých abnormalit nebo poruch, zvláště při onemocnění novotvary. Léčba se nazývá fotodynamická léčba (či působení, PDT) a zahrnuje podávání fotosenzitizujících (fotochemoterapeutických) látek do postižené oblasti těla, po němž následuje vystavení fotoaktivujícímu světlu

- 2 • · k aktivování fotosenzitizujících látek a jejich proměně na cytotoxickou formu, tak, aby byly poškozené buňky usmrceny nebo byla zničena jejich schopnost proliferace. Jsou známé takové fotosenzitizující látky, které se budou přednostně nebo výhradně soustřeďovat do požadovaného cílového místa, například do tumoru nebo do jiných leží.

Fotosenzitizujících činidel je známa škála, zahrnující zejména psoraleny, porfyriny, chloriny a ftalocyaniny. Takové látky se po vystavení světlu stávají toxickými.

Fotosenzitizující látky mohou své účinky uplatňovat různými mechanismy, přímo nebo nepřímo. Například některé fotosenzitizující látky se mohou stát přímo toxické po aktivaci světlem, zatímco jiné působí tak, že vytvářejí toxické látky, např. oxidační činidla jako jsou singletní kyslík nebo jiné volné radikály odvozené od kyslíku, které jsou extrémně ničivé vůči buněčnému materiálu a biologickým molekulám jako jsou tuky, bílkoviny a nukleové kyseliny.

Porfyrinové fotosenzitizující látky působí nepřímo, vytvářením toxických kyslíkových sloučenin a pohlíží se na ně jako na zvláště výhodné kandidáty pro PDT. Porfyriny jsou přírodně se vyskytující prekursory v syntéze

-7 i , hernu. Hem je konkrétně vytvářen po začlenění železa (Fe ) do protoporfynnu IX (Pp) působením enzymu ferrochelatázy. Pp je neobyčejně účinná fotosenzitizující látka, zatímco hem nemá žádný fotosenzitizující účinek. V oboru je známo a v literatuře je popsáno množství různých fotosenzitizujících látek, odvozených od porfyrinu nebo na bázi porfyrinu.

Cytotoxický účinek je zprostředkován zejména vytvářením singletního kyslíku. Tento reaktivní meziprodukt má velmi krátkou existenci v buňkách (<0,04 ps). Primární cytotoxický účinek PDT se tedy uskutečňuje během vystavení světlu a velmi blízko míst, kde se vytváří Kyslíkový singlet reaguje s bílkovinami za jejich oxidace (s jejich histidinem, tryptofanem, « «· · · ♦· ·· · · ·· ·· · ♦ · ······· - s - · ··· · · · · · · ·····» ··♦ ·· ··· ··· ·· · methioninem, cysteinem, tyrosinem), s DNA (guaninem), s nenasycenými mastnými kyselinami a s cholesterolem. Jednou z výhod PDT je to, že tkáně nevystavené světlu mohou být ponechány neovlivněné, tj, že lze získat selektivní účinek PDT. Existuje široká dokumentace, která se týká použití PDT ke zničení nežádoucích buněčných populací, například neoplastických buněk. Patentová literatura popisuje množství fotodynamických sloučenin, ať samotných, nebo ve spojení s činidly pro zacílení, například imunoglobuliny zaměřenými vůči receptorovým determinantám neoplastických buněk, které činí celý komplex buněčně více specifickým. Určité fotochemické sloučeniny, jako deriváty hematoporfyrinu, mají nadto vrozenou schopnost soustředit se na maligní buňky. Takové způsoby a sloučeniny jsou popsány v norském patentu NO 173 319 a v norských patentových přihláškách č. 900 731, 176 645, 176 947, 180 742, 176 786, 301 981, 300 499 a 891 491.

Ve WO 93/14142 je popsán systém podávání léků, který zahrnuje protinádorové činidlo a světelně aktivovatelné činidlo (tj. fotosenzitizující látku), připojené na kopolymerní nosiče. Při podání vstupuje tento komplex do nitra buňky pinocytózou nebo fagocytózou a je umístěn uvnitř endosomů a lysosomů. V lysosomech se vazba mezi činidlem působícím proti novotvarům a polymerem hydrolyzuje a první jmenovaný může přes lysosomální membránu pasivně difundovat do cytosolu. Použitelnost této metody je tedy omezena na malé molekulární sloučeniny, schopné difundovat přes lysosomální membrány. Po uplynutí časové prodlevy pro difúzi se uplatní světelný zdroj o vhodné vlnové délce a energii k aktivaci fotoaktivovatelné sloučeniny. Buňka je zničena spojeným účinkem protinádorového činidla a fotoaktivovatelného činidla.

Takové metody PDT, jaká byla popsána výše, jsou tedy zaměřeny na zničení buněčných struktur, vedoucímu k usmrcení buňky.

WO 96/07432 se na druhé straně týká metod, které používají fotodynamický účinek jako mechanismus k zavedení jinak přes membránu • ·

- 4 φφ φ * ·♦ • ·· Φ· φφφ φ φφφφ φ φφφ φ « φφφφ φ φ φφφφ φφφ φφ φφφ φφφ φφ φ neprostupných molekul do cytosolu buňky způsobem, který nevyvolává rozsáhlé poničení buňky nebo usmrcení buňky. V tomto způsobu je molekula spolu-internalizována (konkrétněji endocytozována) do nitrobuňečného měchýřku, vesikulu, v buňce (například lysosomu nebo endosomu) spolu s fotosenzitivujícím činidlem. Poté je buňka vystavena fotoaktivujícímu světlu, které aktivuje fotosenzitizující činidlo, které naopak vyvolá protržení nebo rozrušení membrány měchýřku, čímž se obsah měchýřku, včetně sledované molekuly, do nitra buňky, tj. cytosolu. Bylo zjištěno, že při tomto způsobu nebyla funkčnost nebo životnost většiny buněk zhoubně poškozena. Využití takového způsobu, nazývaného fotochemická internalizace, bylo proto navrženo pro přenos množství různých molekul, včetně léčebných činidel, do cytosolu, tj. do nitra buňky. Autoři tohoto vynálezu nyní zjistili, že takovýto způsob může být výhodně použit nejen k přenosu molekul dovnitř buňky, ale také k jejich nabízení (presentaci) nebo expresi na buněčném povrchu. Po transportu a uvolnění molekuly do buněčného cytosolu může být tato přenesena na povrch buňky, kde může být nabízena na vnější straně buňky, tj, na vnějším buněčném povrchu. Takový způsob je zvláště použitelný v oblasti vakcinace, očkování, kde mohou být vakcinační složka, tj. antigeny nebo imunogeny, zavedeny do buňky k nabízení na povrchu takové buňky, což slouží k indukování, usnadnění nebo zvýšení imunitní odpovědi.

Podstata vynálezu

Nejobecněji řečeno, předkládaný vynález poskytuje způsob exprese (vystavení) antigenní molekuly nebo její části na povrchu buňky, s výhodou buňky nabízející antigeny, přičemž tento způsob zahrnuje zavedení molekuly do cytosolu fotochemickou internalizací, při níž se uvedená molekula nebo její část následně nabízí na povrchu zmíněné buňky.

Jak jsou zde uvedeny, označují výrazy exprese a nabízení přítomnost molekuly nebo její části na povrchu zmíněné buňky tak, že alespoň část této molekuly je vystavena do prostředí obklopujícího buňku a je z něho přístupná.

- 5 ·· 9 * ·· ·» 9 ··· • · * · · · ·· • ♦·· · 9 · · · ·· • · · 9 · ♦· ··· ·· «·· »*· ·· ···

Může být dosaženo exprese na povrchu, při níž je molekula, jež má být exprimována, ve styku s buněčnou membránou a/nebo se složkami, které mohou být na této membráně přítomné nebo mohou být k přítomnosti na této membráně přinuceny.

Výsledkem takového antigenního nabízení může být výhodně posílení (stimulace) imunitní odpovědi, s výhodou pak imunitní odpovědi, která uděluje ochranu vůči následnému napadení jakoukoli entitou, zahrnující nebo obsahující uvedenou antigenní molekulu či její část a v souhlasu s tím předkládaný vynález nachází zvláštní použití jako způsob vakcinace.

Konkrétněji tento aspekt vynálezu poskytuje způsob exprese antigenní molekuly nebo její části na buněčném povrchu, přičemž tento způsob zahrnuje:

uvedení zmíněné buňky a zmíněné antigenní molekuly a fotosenzitizujícího činidla do styku, kdy jsou zmíněná molekula a zmíněné činidlo zavedeny do nitrobuněčného, membránou ohraničeného oddílu (kompartmentu) zmíněné buňky; a ozáření zmíněné buňky světlem vlnové délky, která je účinná k aktivaci fotosenzitizujícího činidla, tak, že je membrána zmíněného nitrobuněčného oddílu rozrušena za uvolnění zmíněné molekuly do cytosolu buňky, aniž by buňka byla usmrcena, přičemž se uvolněná antigenní molekula nebo její část následně nabízí na povrchu zmíněné buňky.

Jak je zde použit, výraz rozrušený oddíl se týká zničení celistvosti membrány takového oddílu buď trvale nebo dočasně, dostatečně pro uvolnění antigenní molekuly v něm obsažené.

Z jiného pohledu tento aspekt vynálezu také poskytuje prostředek pro použití v expresi antigenní molekuly nebo její části na povrchu buňky, s výhodou ke stimulaci imunitní odpovědi, přičemž uvedený prostředek zahrnuje

- 6 9 ♦ 99·

99 9 999 • · · ·· * · · · · ·

9 9 99

999 999 99999 antigenní molekulu a fotosenzitizující činidlo. S výhodou je takový prostředek farmaceuticky přijatelný a obsahuje také farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku nebo ředidlo.

V dalším aspektu vynález také poskytuje použití antigenní molekuly a fotosenzitizujícího činidla v přípravě léčiva pro použití v expresi uvedené antigenní molekuly nebo její části na povrchu buňky pro stimulaci imunitní odpovědi.

V ještě dalším aspektu vynález poskytuje výrobek zahrnující antigenní molekulu a fotosenzitizující činidlo jako kombinovaný preparát pro souběžné, oddělené nebo následné použití v expresi antigenní molekuly nebo její části na povrchu buňky, s výhodou ke stimulaci imunitní odpovědi.

V jiném aspektu vynález poskytuje sadu (kit) pro použití v expresi antigenní molekuly nebo její části na povrchu buňky, přičemž uvedená sada zahrnuje:

první zásobník obsahující uvedenou antigenní molekulu; a druhý zásobník obsahující fotosenzitizující činidlo.

Antigenní molekulou může být ve vynálezu jakákoli molekula, která je schopna stimulovat imunitní odpověď nebo je imunitní odpověď schopna stimulovat její část, při nabízení imunitnímu systému vhodným způsobem. Výhodně proto bude antigenní molekulou vakcinační antigen nebo složka vakcíny, jako je entita obsahující polypeptid.

V oboru je známo mnoho takových antigenů nebo antigenních složek vakcín a zahrnují všechny typy bakteriálních nebo virových antigenů nebo samozřejmě antigenů či antigenních složek jakýchkoli pathogenních druhů včetně prvoků či vyšších organismů. Zatímco tradičně antigenní složky vakcín obsahovaly celé organismy (živé, mrtvé nebo oslabené), tj. šlo o vakcíny obsahující celé buňky, byly navíc široce byly zkoumány a v literatuře popsány i

•	44	•	•	44	9
·· ·	•	44	44	• ·	44
4 · 4	•	•	• ·	•
•	··· ·	•	•	• · ·	•
•	•	•	•	• 4	•
• e·	M	44 4	444	··	»44

tzv. podjednotkové vakcíny, tj. vakcíny, jejichž základem jsou konkrétní antigenní složky organismů, například bílkoviny nebo peptidy, nebo dokonce cukry. Jako antigenní molekula může být v tomto vynálezu použita jakákoli taková složka vakcíny na bázi podjednotek.

Vynález ovšem nachází zvláštní použitelnost v oblasti peptidových vakcín. Upřednostňovanou antigenní molekulou podle vynálezu je tedy peptid (který je zde definován jako zahrnující kratší i delší peptidy, tj. peptidy, oligopeptidy i polypeptidy a rovněž i bílkovinné molekuly nebo jejich fragmenty, například peptidy o 5 až 500, např. 10 až 250, jako o 15 až 75 nebo o 8 až 25 aminokyselinách). Části antigenních molekul, které jsou nabízeny nebo exprimovány s výhodou zahrnují části, které jsou vytvářeny (generovány) mechanismem zpracovávajícím antigeny (antigen-processing machinery) v buňce. Části ovšem mohou být vytvářeny i jinými prostředky, kterých lze dosáhnout prostřednictvím vhodné konstrukce antigenu (např. pásy citlivými vůči pH) nebo prostřednictvím jiných prostředků pro úpravu buněk. Vhodně mají takové části dostatečnou velikost k vyvolání imunitní odpovědi, např. u peptidů je velikost větší než 5, např. větší než 10 nebo 20 aminokyselinových zbytků.

V literatuře bylo navrženo obrovské množství možných peptidových vakcín, například k léčbě virových onemocnění a infekcí jako infekce AIDS/HIV nebo chřipky, psích parvovirů, viru hovězí leukemie, žloutenky (hepatitidy) a podobně (viz nap. Phanuphak se spol., Asian Pac. J. Allergy. Immunol. 15(1), 41-48, 1997; Naruse, Hokkaido Igaku Zasshi 69(4), 811-820, 1994; Casal se spol., J. Virol. 69(11), 7274-7277, 1995; Belyakov se spol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 95.(4), 1709-1714, 1998; Naruse se spol.,Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91(20), 9588-9592, 1994; Kabeya se spol., Vaccine 14(12), 1118-1122, 1996; Itoh se spol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83.(23), 9174-9178, 1986. Podobně mohou být použity bakteriální peptidy a samozřejmě i peptidové antigeny, získané z jiných organismů nebo druhů.

• · • · • · • ·· · • ·

- 8 Kromě antigenů získaných z patogenních organismů, byly peptidy rovněž navrženy pro použití jako vakcíny vůči rakovině nebo jiným onemocněním, jako je roztroušená skleróza. Například peptidy mutantních onkogenů jsou velkým příslibem jako protirakovinné vakcíny, plnící roli antigenů při stimulaci cytotoxických lymfocytů T. (Schirrmacher, Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 121, 443-451, 1995; Curtis, Cancer Chemotherapy and Biological Response Modifiers 17, 316-327, 1997).

Pro léčbu metastatických melanomů byly rovněž hodnoceny syntetické peptidové vakcíny (Rosenberg se spol., Nat. Med. 4(3), 321-327, 1998. Vakcína na bázi peptidového receptoru T-buněk pro léčbu roztroušené sklerózy je popsána v článku Wilsona se spol. v J. Neuroimmunol. 76(1-2), 15-28, 1997. Jakákoli složka takové peptidové vakcíny může být použita jako antigenní molekula podle vynálezu, tak jako může být samozřejmě použit i kterýkoli z peptidů, popsaných nebo navržených jako peptidové vakcíny v literatuře. Peptid tedy může být synthetický nebo isolovaný nebo jinak získaný z organismu.

Buňkou, která je předmětem způsobů, použití a podobně podle vynálezu, může být jakákoli buňka, která je na svém povrchu schopna exprese nebo nabízení molekuly, dodané nebo přenesené do jejího cytosolu.

Vzhledem k tomu, že prvotní využitelnost vynálezu spočívá v nabízení antigenů nebo vakcinaci, vhodně je takovou buňkou imunitní efektorová (výkonná) buňka, tj. buňka, zapojená v imunitní odpovědi. Ovšem nabízet antigen imunitnímu systému mohou i jiné buňky a ty rovněž patří do rozsahu vynálezu. Buňkami podle předkládaného vynálezu jsou tedy s výhodou buňky nabízející antigen. Buňka nabízející antigen může být zapojena v jakékoli části nebo zbrani imunitní odpovědi, zahrnující jak humorální, tak i buněčně zprostředkovanou imunitu, například ve stimulaci tvorby antigenů, nebo ve stimulaci cytotoxických nebo zabíječských (killer) buněk, které mohou rozpoznávat a ničit (nebo jinak eliminovat) buňky, exprimující (vystavující) • ·

- 9 cizí antigeny na svém povrchu. Výraz stimulující imunitní odpověď tedy zahrnuje všechny typy imunitní odpovědi a mechanismy jejich stimulace.

Stimulace cytotoxických buněk nebo buněk vytvářejících protilátky vyžaduje, aby byly antigeny nabízeny buňkám, které mají být stimulovány, konkrétním způsobem buňkami nabízejícími antigen, například je to nabízení za účasti molekul MHC třídy I (např. aktivace CD8' cytotoxických buněk T vyžaduje antigenní nabízení za pomoci molekul MHC-1; MHC” je hlavní histokompatibilní komplex).

Buňky nabízející antigeny jsou v oboru známé a v literatuře jsou popsané a zahrnují například lymfocyty (jak buňky B, tak i buňky T), dendritické buňky, makrofágy a podobně. Jiné zahrnují například rakovinné buňky, např. buňky melanomu.

Pro nabízení (prezentaci) antigenu buňkami nabízejícími antigen cytotoxickým buňkám T (tj. CTL) potřebuje antigenní molekula vstoupit do cytosolu buňky nabízející antigen (Germain, Cell 76, 287-299, 1994). Předkládaný vynález poskytuje účinné prostředky dodání antigenní molekuly do cytosolu.

Jakmile se do cytosolu procesem fotochemické internalizace jednou uvolní, může být antigenní molekula zpracována buněčným mechanismem zpracovávajícím antigeny a nabízena vhodným způsobem na povrchu buňky, například za pomoci molekuly MHC třídy I. Takové zpracování může zahrnovat degradaci antigenu, např. degradaci bílkovinného nebo polypeptidového antigenu na peptidy, kteréžto peptidy jsou pak pro nabízení komplexovány s molekulami MHC. Antigenní molekula exprimovaná nebo nabízená na povrchu buňky podle předkládaného vynálezu může tedy být částí nebo fragmentem (zlomkem) antigenní molekuly, která se internalizuje (je endocytována).

- 10 • · • · · ·· φφφ · ·· φ ·· φφφ φ φ· φ ··· · φ φφφ • φ φφφ φφφ φφ φφφ · φ φ

Antigeny mohou být zavedeny do buněk zpracovávajících antigen endocytózou a mohou být degradovány v endocytárních měchýřcích na peptidy. Tyto peptidy se mohou v endozomech navázat na molekuly MHC třídy II a být přeneseny na buněčný povrch, na němž může být komplex peptidu a molekuly MHC třídy II rozpoznán pomocnými buňkami T CD4⁺ a indukovat imunitní odpověď. Jinou možností je degradace bílkovin v cytosolu, například prostřednictvím proteasomů, a jejich přenos do endoplazmatického retikula prostřednictvím TAP (přenašeč spojený s nabízením antigenu, transportér associated with antigen presentation). V endoplazmatickém retikulu se mohou peptidy navázat na molekuly MHC třídy I a být přeneseny na povrch buňky, jak je znázorněno na Obr. 1 (Yewdell a Bennink, Adv. Immunol. 52. 1-123, 1992). Pokud poptid pochází z cizího antigenu, komplex peptidu a molekuly MHC třídy I bude rozpoznán cytotoxickými buňkami T CD8⁺ (tj. CTL). Tyto CTL se naváží na komplex peptidu a molekuly MHC (HLA, tj. lidského hl. histokompatibilního komplexu) třídy I a tím se aktivují, začnou proliferovat a vytvářen klon CTL (cytotoxických buněk T). Cílové buňky a jiné cílové buňky se stejným komplexem peptidu a molekuly MHC třídy I na buněčném povrchu mohou být zabíjeny klonem CTL. Imunita vůči cizímu antigenu může být vytvořena, pokud lze do cytosolu zavést dostatečné množství antigenu (Yewdell a Bennink, Adv. Immunol. . 52, 1-123, 1992; Rock, Immunology Today 17, 131-137, 1996). To je základem pro rozvoj, kromě jiného, i protirakovinných vakcín.

Jedním z nejrozsáhlejších praktických problémů je zavedení dostatečného množství antigenů (nebo částí antigenů) do cytosolu. To lze řešit podle předkládaného vynálezu, pomocí fotochemické internalizace, PCL Princip je ozřejměn na obr. 1, který ukazuje, jak může být PCI využita ke stimulaci CTL. Peptid nebo bílkovina (P) se extracelulárně nanese na buňky nabízející antigen. P je endocytován a uvolněn do cytosolu pomocí PCL Peptid nebo bílkovina se poté částečně degraduje proteázami a přenese v komplexu s molekulami MHC (HLA) třídy I na buněčný povrch, kde může být tento komplex rozeznán CTL.

- 11 Jak bude podrobněji popsáno v následujících příkladech, bylo ukázáno, že fotochemická internalizace může být podle tohoto vynálezu účinně použita k přísunu rakovinné specifických peptidů do cytosolu.

Antigenní molekula a/nebo fotosenzitivní činidlo mohou být zacíleny do specifických buněk nebo tkání použitím činidel soužících k jejich zacílení, např. specifických dodávacích nebo nosičových systémů nebo molekul nosiče. Tak mohou být například antigenní molekula a/nebo fotosenzitizující činidlo dodány do buňky za použití vektoru nebo systému nosiče, např. rekonstituovaných částic LDL (lipoproteinů o nízké hustotě). Molekula nosiče může být na antigenní molekulu nebo na fotosenzitizující činidlo, nebo na obě látky současně, navázána, může s nimi být konjugována a použity mohou být molekuly stejného nebo rozdílného nosiče. Antigenní molekula a/nebo fotosenzitizující činidlo mohou být také konjugovány na místně zacílený ligand, jako je ligand, specifický pro konkrétní buněčné typy nebo konkrétní buněčné struktury, například protilátku rozeznávající povrchový antigen, exprimovaný na určitých buněčných typech, např. tumorově specifický antigen. Takový mechanismus může působit zvýšený obrat fotosenzitizujícího činidla a/nebo antigenní molekuly prostřednictvím receptorově zprostředkované endocytózy. Takové molekuly nosičů nebo vektorů, sloužící k zacílení, mohou být použity také k navedení antigenní molekuly a/nebo fotosenzitizujícího činidla do nitrobuněčných oddílů (kompartmentů).

Nitrobuněčným membránově ohraničeným oddílem může být jakýkoli takový oddíl, který je přítomný v buňce. S výhodou bude takovým oddílem membránový měchýřek (vesikul), zvláště endosom nebo lysosom. Ovšem nitrobuněčný oddíl může také zahrnovat Golgiho aparát nebo endoplasmatické retikulum. Všechno, co je vyžadováno, je, aby se antigenní molekula a fotosenzitizující činidlo dostaly (soustředily) do stejného nitrobuněčného oddílu či oddílů.

- 12 Proces fotochemické internalizace je podrobněji popsán ve WO 96/07432 (obsah tohoto spisu je zde začleněn jako odkaz). Metody PDT jsou nyní v literatuře také široce popsány.

·· • * · • · • · · · • · •· •· • ·· •·

Fotosenzitizujícím činidlem, které lze použít podle předkládaného vynálezu, může být jakékoli takové činidlo, které se dostane do nitrobuněčných oddílů, zvláště pak endosomů nebo lysosomů. V oboru je známa škála takových fotosenzitizujících činidel a ty jsou popsány i v literatuře, včetně WO 96/07432. V této souvislosti lze zmínit di- a tetrasulfonovaný ftalocyanin hlinitý AlPcS_n, sulfonované tetrafenylporfyriny (TPPS_n), nilskou modř, chlorinové e₆ deriváty, uroporfyrin I, fyloerythrin, hematoporfyrin a methylenovou modř, u nichž bylo prokázáno, že se dostávají do endosomů a lysosomů buněk v kulturách. Ve většině případů je to prostřednictvím endocytární aktivity.

Třídy vhodných fotosenzitizujících činidel, které lze zmínit, tedy zahrnují porfyriny, benzoporfyriny, nafalocyaniny, kationtová barviva, tetracykliny a lysomotropní slabé zásady nebo deriváty takových látek (Berg se spol., Photochemistry and Photobiology 65, 403-409, 1997. Upřednostňovaná fotosenzitizující činidla zahrnují TPPS₄ (Zabner se spol., J. Biol. Chem. 270, 18997-19007, 1995), TPPS_2a a AlPcS_2a.

Fotochemická internalizace podle předkládaného vynálezu může být prováděna za použití postupů PDT, které jsou v oboru známé a jsou standardní a vhodnými modifikacemi takových technik, účinných v tomto postupu. Antigenní molekula a fotosenzitizující činidlo mohou být tedy do buňky dodávány nanesením nebo podáváním takovými způsoby a prostředky, které jsou v oboru PDT známé.

Způsoby podle tohoto vynálezu lze použít v uspořádání in vitro nebo in vivo, buď místní léčbou in šitu nebo léčbou ex vivo, s následným podáváním ovlivněných buněk.

Další aspekt vynálezu tedy poskytuje buňku nabízející antigen, schopnou exprese antigenní molekuly, nebo její části, na svém povrchu, kterážto buňka je získatelná (nebo získána) způsobem, který zde byl výše definován. Jiné aspekty vynálezu poskytují populaci nebo kulturu takových buněk, zvláště životaschopnou a funkčně nenarušenou populaci nebo kulturu takových buněk, a také použití takové buňky (nebo populace či kultury takových buněk) v léčbě, zejména pro stimulaci imunitní odpovědi a zvláště pro stimulaci CTL.

Vynález poskytuje také použití takové buňky (nebo populace či kultury takových buněk) k přípravě léčiva (například vakcinačního prostředku) pro stimulaci imunitní odpovědi a zvláště pro stimulaci CTL.

V uspořádání in vivo je možné použít jakýkoli způsob podávání, který je běžný nebo standardní v oboru, například injikaci, infuzi, místní nanesení, jak na vnitřní tak i na vnější povrchy těla a podobně. Pro použití in vivo může být vynález užit ve vztahu k jakékoli tkáni obsahující cílové buňky, včetně tělních tekutin, stejně jako pevných tkání. Všechny tkáně mohou být léčeny tak dlouho, dokud je fotosenzitizující činidlo cílovými buňkami odebíráno a světlo může být správně dodáváno.

Prostředky podle vynálezu mohou tedy být formulovány jakýmkoli vhodným způsobem podle postupů a procedur známých ve farmaceutickém oboru, například za použití jednoho nebovíce farmaceuticky přijatelných nosičů nebo pomocných látek. Povahu prostředku a nosiče či pomocných látek, dávkování a podobně lze zvolit rutinným způsobem podle přání a žádoucího způsobu podávání, cíle vakcinace a podobně. Dávkování může být obdobně stanoveno rutinným způsobem a může záviset na povaze antigenní molekuly, cíle vakcinace, stáří pacienta, způsobu podávání a podobně; pokud se týká fotosenzitizujícího činidla, měla by být uvážena také účinnost/schopnost rozrušení membrán při ozáření.

- 14 Krok světelného ozáření k aktivaci fotosenzitizujícího činidla se může podobně provádět způsoby a postupy v oboru dobře známými. Například vlnová délka a intenzita světla mohou být zvoleny v závislosti na použitém fotosenzitizujícím činidle. Vhodné vlnové délky jsou v oboru dobře známé.

Jak bylo uvedeno dříve a jak je popsáno ve WO 96/07432, bylo zjištěno, že fotochemická internalizace prováděná tímto způsobem neovlivňuje škodlivě životaschopnost a funkčnost buněk. Konkrétně bylo zjištěno, že pokud je populace nebo velké množství buněk ovlivňováno podle předkládaného vynálezu, většina buněk není usmrcena a přežívá ovlivnění (léčbu) v podstatě funkčně nedotčena.

Tak, jak je zde použit, je výraz bez usmrcení buněk zamýšlen k definování popsané situace. Jinými slovy, v populaci nebo ve velkém množství buněk, v podstatě žádné buňky nejsou usmrceny, nebo významná většina buněk (např. alespoň 75 % a lépe alespoň 80, 85, 90 nebo 95 % z celkového počtu buněk) není usmrcena.

Nepochybně je při styku se světelným ozářením populace nebo velkého množství buněk možné, že některé skupiny buněk nebo některé oblasti tkáně mohou obdržet více záření nebo být nějakým způsobem podrobeny širšímu účinku PCI než jiné skupiny buněk nebo plochy tkáně. Procentní hodnoty týkající se přežití buněk tedy nemusejí být nezbytně jednotné v celé ozářené populaci a týkají se procenta životaschopných buněk, které zůstávají v ozářené populaci. Požadavek je pouze takový, aby přežívala dostatečná část ozářených buněk. Navíc buněčná smrt indukovaná ozářením si může vyžádat určitý čas, např. může nastat v několika hodinách. V takovém případě je zřejmé, že buňky, které nakonec odumřou, mohou být rovněž schopné exprese antigenní molekuly na svém povrchu ve shodě se způsoby podle předkládaného vynálezu a mohou se tedy účastnit tohoto způsobu, použití a podobně podle předkládaného vynálezu. Procento odumřelých buněk se tedy týká procenta buněk, které zůstávají životaschopné během několika hodin po ozáření (např. do 4 hodin po

- 15 *· · · ·· ·· ·· · ···« • · · · ·i • ♦ · · · · ·· 9 • · · ·» • ·· «··«·· *· ozáření), ale s výhodou se týká procenta životaschopných buněk 4 nebo více hodin po ozáření.

Způsob podle vynálezu může být pozměněn tak, že frakce nebo podíl přežívajících buněk se reguluje volbou světelné dávky ve vztahu ke koncentraci fotosenzitizačního činidla. Takové postupy jsou opět v oboru známé.

Předkládaný vynález poskytuje účinné prostředky pro poskytnutí velké rozmanitosti antigenních molekul. Vynález má množství znaků, které ho činí zvláště vhodným nástrojem pro dodávání vakcíny:

1) nemá žádná omezení týkající se velikosti poskytovaných molekul až potud, aby molekula mohla být endocytována cílovou buňkou;

2) není závislý na proliferaci buněk;

3) je místně specifický v tom, že jsou ovlivněny jen oblasti vystavené světlu;

4) není onkogení.

Navíc může být fotochemická internalizace případně kombinována s jinými principy vytváření místně nebo tkáňově specifického působení léčiv, jako je zacílení za použití specifických ligandů pro struktury buněčného povrchu při využití regulačních genových prvků, které propůjčují tkáňovou specifitu, nebo jako je použití léčiv specifických vůči onemocnění, což otevírá možnost získání značných souhlasných (synergických) účinků co do specifičnosti léčiv vzhledem k cílovým buňkám.

Vynález bude nyní popsán podrobněji v následujících příkladech, na něž se neomezuje a ve spojitosti s následujícími vyobrazeními.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 znázorňuje schématickou představu, jak může být PCI použito ke stimulaci CTL. Peptid nebo bílkovina (P) se extracelulárně nanese na buňky nabízející antigen. P se endocytuje a následně uvolní do cytosolu

- 16 prostřednictvím PCI. Poté budou peptid nebo bílkovina částečně degradovány proteasomy a přeneseny na buněčný povrch v komplexu s molekulami MHC (HLA) třídy I, kde bude celý komplex rozpoznán buňkami CTL. ER = endoplasmatické retikulum.

Obr. 2 znázorňuje fotochemicky indukované přemístění peptidu. Buňky BL2-G-E6 byly inkubovány s fluoresceinem značeným peptidem p21^rasodvozeným od zbytků 5-21, s mutací Val¹², a AlPcS_2a. Buňky byly testovány vzhledem k určení místa peptidu s fluoresceinem a AlPcS₂ fluorescenční mikroskopií před (horní snímky) a 30 minut po (dolní snímky) po vystavení červenému světlu v trvání 4 minut. Proužek měřítka představuje 20 μιη.

Obr. 3 znázorňuje cytotoxicitu klonu T lymfocytů CD8⁺ vůči buňkám melanomu FM3 po PCI peptidu MART-1.

Obr. 4 znázorňuje schopnost PCI dodat křenovou peroxidázu (HRP) do cytosolu. Buňky NHIK 3025 (rakovinné buňky in šitu z děl. hrdla) byly ovlivňovány 3,2 mg/ml TPPS a 1 hg/ml HRP po dobu 18 hodin. Pak bylo médium před vystavením udaným dávkám světla nahraženo médiem bez přítomnosti aktivních látek. Aktivita HRP byla měřena v neporušených buňkách (o) a v cytosolu (·), odděleném od buněčných těl (▼) bez obsahu cytosolu elektromermeabilizací a postupem odstřeďování v hustotním gradientu.

Obr. 5 znázorňuje fotochemicky indukovanou expresi zelené fluorescenční bílkoviny, GFP (green fluorescent protein). Část a) je exprese GFP na buňkách THX, ovlivněných komplexem plasmidu a peptidu pEGFP-Nl-pLys v nepřítomnosti AlPcS_2a a světla nebo za přítomnosti AlPcS_2a, s následným vystavením světlu, jak je vyznačeno na nákresu. Buňky byly analyzovány průtokovou cytometrií, počítající buňky na pravé straně narýsované čáry jako positivní vzhledem k expresi GFP. Část b) je exprese GFP na buňkách THX, ovlivňovaných 18 hodin fotosenzitizujícím činidlem (20

- 17 pg/ml AlPcS_2a nebo 0,25 pg/ml 3-THPP), po čemž následovala transfekce v trvání 6 hodin komplexem pEGFP-Nl-pLys a vystavení světlu, inaktivujícímu 50 % buněk. Exprese GFP byla analyzována průtokovou cytometrií tak, jak bylo popsáno u části a).

Příklady provedení vynálezu

Materiál a metody

Ozáření

Pro ovlivnění buněk byly použity dva odlišné zdroje světla, oba sestávající z řady 4 fluorescenčních trubic. Buňky ovlivňované působením TPPS₄, TPPS_2a a 3-THPP (Porphyrin Products, Logan, UT) byly vystaveny modrému světlu (model 3026; Appl. Photophysics, Londýn, Velká Británie) o intenzitě světla dopadající na buňky 1,5 mW/cm , zatímco buňky ovlivňované působením AlPcS_2a (Porphyrin Products, Logan, UT) byly vystaveny červenému světlu (Philips TL 20W/09), filtrovanému přes filtr Cinemoid 35, o intenzitě světla dopadající na buňky 1,35 mW/cm .

Fluorescenční mikroskopie

Buňky byly analyzovány za použití fluorescenční mikroskopie, jak je popsáno v práci K. Berga se pol., Biochem. Biophys. Acta 1370, 317-324, 1998. Pro analýzu fluoresceinem značených molekul byl mikroskop vybaven excitačním filtrem 450-490 nm, separátorem dichroického svazku (dichroic beam splitter) a emisním filtrem pro průchod pásu o vlnových délkách 510 až 540 nm.

Příprava komplexů plasmid-pLys a ovlivnění buněk

Komplexy plasmid-pLys (poměr náboje 1,7) byly připraveny mírným smícháním 5 pg plasmidu (pEGFP-Nl; Clontech Laboratories, lne., Palo Alto, • ··

- 18 CA) v 75 pl HBS (Hank's balanced salts, Sigma) s 5,3 pg pLys (mol. hmotnost 20 700; Sigma, St. Louis, MO) v 75 pl HBS. Roztoky byly inkubovány 30 minut při teplotě místnosti, naředěny kultivačním médiem a přidány k buňkám.

Buňky THX byly inkubovány s 20 pg/ml AlPcS_2a po dobu 18 hodin při 37 °C, prornyty a v médiu bez přítomnosti senzitizačního činidla nejprve 3 hodiny inkubovány před následnou inkubací s komplexy plasmid-pLys v trvání 2 hodin. Buňky THX ovlivněné pEGFP-Nl/pLys byly jednou prornyty a před vystavením světlu 2 hodiny inkubovány v kultivačním médiu bez přídavků. Před analýzou GFP exprese průtokovou cytometrií byly buňky inkubovány 2 dny při teplotě 37 °C, pasážovány a inkubovány po dobu dalších 5 dní.

Buňky HCT-116 byly inkubovány s 20 pg/ml AlPcS_2a po dobu 18 hodin, prornyty a transfekce komplexy plasmid-pLys probíhala 6 hodin před vystavením světlu v médiu neobsahujícím plasmid. Po 40 hodinách inkubace při 37 °C byla exprese GFP studována mikroskopicky.

Analýza průtokovou cytometrií

Buňky byly trypsinizovány, odstředěny, resuspendovány ve 400 pl kultivačního média a filtrovány přes nylonový filtr o velikosti ok 50 pm. Poté byly analyzovány v průtokovém cytometru FACStar plus (Becton Dickinson). Zelená fluorescenční bílkovina, GFP, byla měřena přes filtr o rozsahu 510 až 530 nm po excitaci argonovým laserem (200 mW), seřízeným na 488 nm. AlPcS_2a byl měřen přes filtr propouštějící délku 650 nm po excitaci kryptonovým laserem (50 mW), seřízeným na 351-356 nm. Buněčné dublety byly z jednotlivých buněk rozlišeny vymezením šíře pulsu fluorescenčního signálu GFP. Údaje byly analyzovány pomocí softwaru PC Lysys Π (Becton Dickinson).

Příprava fiuoresceinem značeného peptidu a ovlivnění buněk • 49 ♦ ♦ ··· ·· · · ·♦ «4 · «·· • · · ♦ 4 · ·» • «·« · · · « « · * • · 9 9 9 99 ♦ 49 ♦· ·♦♦ ♦ ·· <· «99

Fluoresceinem značený peptid Val¹²-p21^ras (zbytky 5 až 21) byl syntetizován a poskytnut Alanem Cuthbertsonem, z firmy Nicomed, Amersham.

Buňky BL2-G-E6 byly inkubovány s 30 pg/ml fluoresceinem značeného, od p21^ras odvozeného peptidů po dobu 18 hodin, poté s 20 mg/ml AlPcS_2a po dobu 18 hodin a 1 hodinu v médiu bez obsahu ovlivňujících látek před vystavením červenému světlu.

Příklad 1

Fotochemickou internalizaci (PCI) lze použít k umožnění vstupu peptidů do cytosolu buněk

Ke stanovení PCI pro cytosolární přísun rakovinně-specifických peptidů byl použit fluorsceinem značený peptid p21^ras, zahrnující zbytky aminokyselin 5 až 21 a obsahující mutaci Val¹² (G12V) (Μ. K. Gjertsen se spol., Int. J. Cancer 72, 784-790, 1997). U myších fibroblastů BL2-6-E6 se ras-peptid dobře spolukoncentroval s AlPcS_2a, což ukázalo na endocytární absorbci a inkorporaci peptidů (obr. 2). Po vystavení světlu po dobu 4 minut byl zjištěn difusní výskyt fluoresceinem značeného ras-peptidu a AlPcS_2a v cytoplasmě. Podobné účinky nebyly pozorovány u buněk vystavených pouze fluoresceinem značenému ras-peptidu a světlu (údaje nejsou uvedeny).

Příklad 2

Použití PCI k indukci nabízení antigenu a CD8⁺ lymfocyty T zprostředkovaného zabíjení buněk

Na buňky FM3 melanomu (2 x 10⁵/jamku v 6 jamkové destičce), rostoucí v médiu RPMI 1640 (Sigma) s 10 % fetálním telecím sérem (FCS), neexprimující peptid MART-1, se po dobu 18 hodin působilo 10 pg/ml

- 20 9 · · · · · · ··« ·· ·♦· ♦♦♦ ·» ··· fotosenzitizačního činidla AlPcS_2a. Poté byly buňky ze substrátu uvolněny působením EDTA (0,1 mol/1) v Dulbeccově fosfátem pufrovaném fysiologickém roztoku (D-PBS, Sigma) a byly udržovány v roztoku během ovlivňování buněk isotopem ⁵¹Cr (60 pCi/ml Na₂CrO₄) v trvání 1 hodiny ve 100% FCS. Následovala pětihodinová inkubace s 5 pg/ml peptidů MART-1 v RPMI-1640 s 10 % FCS za stálého udržování buněk v roztoku. Sekvence peptidů MART-1 byla: TAEEAAGIGILTVILG. Pak byly buňky dvakrát promyty v médiu RPMI-1640, obsahjícím 10% FCS a zaočkovány do 96 jamkových destiček (2 000 buněk/jamku ve 100 μΐ média RPMI-1640 s 10% FCS). Buňky byly poté vystaveny světlu po doby, uvedené na obr. 3 (zdroj Philips TL 20W/09 filtrovaný filtrem Cinemoid 35 s intenzitou světla dopadajícího na buňky 1,35 mW/cm² (Rodal se spol. J. Photochem. Photobiol. B: Biol.45. 150-159, 1998). 18 hodin po vystavení světlu bylo médium odstraněno a přidáno bylo médium, obsahující vůči MART-1/HLA-A2 specifické cytotoxické lymfocyty T (CTL - 40 000/jamku, přidávané ve 100 μΐ média). Po 4 hodinách inkubace bylo médium od buněk FM3 odděleno a ⁵¹Cr, uvolněný do média (jako indikátor lysovaných buněk), byl sledován stejně jako spontánní a maximální uvolnění, jak bylo popsáno dříve (Fossum se spol., Cancer Immunol. Immunother. 40, 165-172, 1995). Procentní specifické uvolnění chrómu bylo počítáno podle vztahu:

pokusné uvolnění - spontánní uvolnění _x i00 maximální uvolnění - spontánní uvolnění

Z výsledků znázorněných na obr. 3 je zřejmé, že buňky FM3 po PCI a účinku peptidů MART-1 jak bylo navrženo výše, vykazují na světle závislou citlivost vůči cytotoxicitě CD8⁺ lymfocytů T.

Příklad 3

PCI indukuje uvolnění velkého podílu endocytosované molekuly

- 21 Tento jev byl prokázán internalizací/endocytosou křenové peroxidázy (HRP) indukovanou prostřednictvím PCI.

Za použití HRP je ukázáno, (viz obr. 4), že PCI indukuje uvolnění velkého podílu (> 60 %) endocytosované HRP do cytosolu.

V tomto pokusu byly buňky NHIK 3025 (rakovinné buňky in šitu z děložního hrdla) ovlivňovány fotosenzitizujícím činidlem TPPS_2a (3,2 gg/ml) a 1 mg/ml HRP po dobu 18 hodin. Pak bylo médium nahrazeno médiem bez obsahu těchto látek a buňky byly vystaveny světelným dávkám, jak jsou uvedeny v obr. 4. Aktivita HRP byla měřena způsobem popsaným Steinmanem se spol., J. Cell Biol. 68, 665-687, 1976. Cytosol byl oddělen od buněčných těl, neobsahujících cytosol, elektropermeabilizací a odstředěním v hustotním gradientu (Berg se spol., Int. J. Cancer 59: 814-822, 1994).

Příklad 4

PCI lze použít ke zvýšení přísunu funkčních genů

K prokázání tohoto jevu byla provedena transfekce buněk THX pLys-komplexem plasmidu (pEGFP-Nl), kódujícího zelenou fluorescentní bílkovinu (GFP). Exprese GFP byla analyzována průtokovou cytometrií (obr. 5a a 5b) a za použití fluorescenční mikroskopie (údaje nejsou uvedeny). Jak je zřejmé z obr. 5a, ovlivnění pomocí AlPcS_2a a světla vedlo k silnému zvýšení procenta buněk, exprimujících GPR. Podíl buněk, které byly positivní vzhledem k této reportérové molekule, vzrostl z 1%, zaznamenaného bez ovlivnění světlem, na 50% po 5 minutovém vystavení světlu. Exprese GRP nebyla světlem zvýšena u buněk, ovlivněných pEGFP-pLys v nepřítomnosti fotosenzitizujícího činidla. Komplex nesouvisejícího (irrelevantního) plasmidu kódujícího hem-oxigenázu a p-Lys neindukoval při kombinaci s AlPcS_2a a světlem zelenou fluorescenci (údaje nejsou uvedeny). PCI tedy dokáže, v souvislosti se zaměřením světla, podstatně zvýšit účinnost transfekce funkčního

- 22 genu do buněk THX. Podobné výsledky byly získány za použití TPPS_2a jako fotosenzitizujícího činidla a buněk BHK-21 a HCT-116 jako cílových buněk (tyto údaje nejsou uvedeny). Senzitizační činidlo, zásadně se nevyskytující v lysosomech, 3-THPP, indukovalo pouze menší zvýšení exprese GFP (obr. 5b). U pEGFP-Nl, nekomplexovaného s pLys, fotochemická internalizace expresi GFP neindukovala (údaje nejsou uvedeny).

Claims

1. Způsob exprese molekuly antigenu nebo její části na povrchu buňky, vyznačující se tím, že se fotochemickou internalizací zavede molekula do cytosolu buňky, přičemž se tato molekula nebo její část následně nabízí na povrchu uvedené buňky.

2. Způsob exprese molekuly antigenu podle nároku 1,vyznačující s e t í m, že se zmíněná buňka uvede do styku s uvedenou antigenní molekulou nebo s její částí a s fotosenzitizujícím činidlem, přičemž se jak uvedená molekula tak i uvedené činidlo zavedou do oddílu zmíněné buňky, vymezeného nitrobuněčnou membránou; a zmíněná buňka se ozáří světlem vlnové délky, která je účinná k aktivaci fotosenzitizujícího činidla, tak, že se membrána zmíněného nitrobuněčného oddílu rozruší za uvolnění uvedené molekuly do cytosolu buňky, aniž by buňka byla usmrcena, přičemž se uvolněná antigenní molekula nebo její část následně nabízí na povrchu zmíněné buňky.

3. Způsob exprese molekuly antigenu podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se t í m, že se jako antigenní molekula používá molekula, schopná stimulovat imunitní odpověď.

4. Způsob exprese molekuly antigenu podle nároku 3, vyznačující se t í m, že se jako antigenní molekula používá antigen vakcíny nebo složka vakcíny.

5. Způsob exprese molekuly antigenu podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že se jako antigenní molekula používá peptid.

- 24

6. Způsob exprese molekuly antigenu podle kteréhokoli z předcházejících nároků, v yznačující se tím, že se jako buňka používá buňka nabízející antigen, která se zvolí ze skupiny, zahrnující lymfocyty, dendritické buňky, makrofágy a rakovinné buňky.

7. Způsob exprese molekuly antigenu podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že se fotosenzitizující činidlo zvolí ze skupiny, zahrnující porfyriny, ftalocyaniny, purpuriny, chloriny, benzoporfyriny, naftalocyaniny, kationtová barviva, tetracykliny a lysomotropní slabé báze nebo deriváty takových látek.

8. Způsob exprese molekuly antigenu podle nároku 7, vyznačuj ící se tím, že se jako fotosenzitizující činidlo používá tetrasulfonovaný tetrafenylporfyrin TPPS₄, disulfonovaný tetrafenylporfyrin TPPS_2a nebo disulfonovaný ftalocyanin hlinitý AlPcS_2a.

9. Způsob exprese molekuly antigenu podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že se antigenní molekula a/nebo fotosenzitizující činidlo váže na jedno nebo více činidel pro zacílení nebo nosičových molekul.

10. Způsob exprese molekuly předcházejících nároků, vyznačující provádí v uspořádání in vitro nebo in vivo.

antigenu podle kteréhokoli z se t í m, že se zmíněný způsob

11.

Způsob exprese molekuly antigenu podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že se nabízení antigenu projeví stimulací imunitní odpovědi.

12. Způsob vakcinace, vyznačující se tím, že se využívá způsobu, jak byl popsán v kterémkoli z poředcházejících nároků.

13. Prostředek pro použití v expresi antigenní molekuly nebo její části na povrchu buňky, vyznačující se tím, že zahrnuje antigenní molekulu, jak byla definována v kterémkoli z nároků 1 až 5 nebo v nároku 9 a fotosenzitizující činidlo, jak bylo definováno v kterémkoli z nároků 2 či 7 až 9.

14. Buňka exprimující antigenní molekulu, nebo její část, na svém povrchu, nebo populace takových buněk, vyznačující se tím, že tuto buňku lze získat způsobem, definovaným v kterémkoli z nároků 1 až 12.

15. Prostředek podle nároku 13, nebo buněčná populace podle nároku 14, pro použití k léčení.

16. Použití antigenní molekuly a fotosenzitizujícího činidla, jak jsou definovány v předcházejících nárocích, k výrobě léčiva pro použití k expresi uvedené antigenní molekuly nebo její části na povrchu buňky ke stimulaci imunitní odpovědi, nebo ke stimulaci cytotoxických lymfocytů.

17. Použití buněčné populace, jak je definována v nároku 14, k výrobě léčiva pro stimulaci imunitní odpovědi, nebo pro stimulaci cytotoxických lymfocytů.

18. Použití podle nároku 16 nebo 17, v y z n a č u j í c í se t í m, že uvedené léčivo se používá k vakcinaci.

19. Použití podle kteréhokoli z nároků 16 až 18, vyznačující se tím, že uvedené léčivo se používá k léčbě virových onemocnění, rakoviny nebo roztroušené sklerózy.

20. Výrobek zahrnující antigenní molekulu, jak byla definována v kterémkoli z nároků 1 až 5 nebo v nároku 9, a fotosenzitizující činidlo, jak bylo definováno v kterémkoli z nároků 2 nebo 7 až 9, vyznačující se tím, že je kombinovaným přípravkem pro současné, oddělené nebo následné použití při expresi uvedené antigenní molekuly nebo její části na povrchu buňky.

21. Sada pro použití při expresi antigenní molekuly nebo její části na povrchu buňky, vyznačující se tím, že zahrnuje první zásobník obsahující uvedenou antigenní molekulu, jak byla definována v kterémkoli z nároků 1 až 5 nebo v nároku 9; a druhý zásobník, obsahující fotosenzitizující činidlo, jak bylo definováno v kterémkoli z nároků 2 nebo 7 až 9.