CZ9727U1 - Prostředek pro modifikaci buněčných zejména nádorových procesů - Google Patents

Description

Oblast techniky

Technické řešení se týká prostředku pro modifikaci buněčných zejména nádorových procesů u teplokrevných živočichů nebo kultur buněk, obsahujícího látku zvyšující fotocitlivost, schop5 nou absorpce světla.

Dosavadní stav techniky

Většina molekul neproniká snadno do membrán buněk. Zavádění molekul do cytozolu živých buněk je potřebné pro zpracování a studii biologických dějů. Mezi dnes nejobvykleji používané postupy tohoto druhu patří mikroinjekce, stínově zprostředkovaná fuze pomocí červených krvinek a liposomová fuze, osmotická lyse pinosomů, plnění škrábáním, elektroporace, transfekce zprostředkovaná fosforečnanem vápenatým a viry. Tyto postupy jsou užitečné pro zkoumání buněk v kultuře, ač jsou v mnoha případech nepraktické, časově náročnější, neúčinné nebo způsobují podstatné ničení buněk. Nejsou tudíž optimální pro použití v biologickém a lékařském výzkumu nebo při léčení, při kterém buňky musí zůstat funkční. Je dobře známo, že poríyriny a mnoho dalších látek, které zvyšují fotocitlivost, vyvolávají cytotoxické efekty na buňkách a tkáních. Tyto efekty jsou založeny na skutečnosti, že látky zvyšující fotocitlivost, tj. látky, které po vystavení světlu, včetně světla ultrafialového a infračerveného vyvolávají reakci, vylučují při vystavení světlu 102 singlety, které rozkládají membrány buněk a strukturu buněk a pří rozsáhlé destrukci nakonec buňky zničí. Tyto efekty byly využity při léčbě několika druhů nádorových onemocnění. Léčba je známa pod jménem fotodynamická terapie (Photodynamic Therapy, dále jen PDT) a je založena na injekci fotocitlivého a nádor lokalizujícího barviva, následované vystavením nádorové oblasti světlu. Cytotoxický efekt je zprostředkován zejména tvorbou singletového oxidu. Meziprodukt této reakce má v buňkách velmi krátkou životnost (<0,04 ps). Proto je základní cytotoxický efekt PDT uskutečněn během vystavení světlu a to velmi blízko míst tvorby 102. 102 reaguje s proteiny (his-tidinem, triptofanem, metioninem, cysteinem, tyrosinem), DNA (guaninem), nenasycenými mastnými kyselinami a cholesterolem a oxiduje je. Jedna z výhod PDT spočívá v tom, že tkáň nevystavená světlu zůstane nezasažena. Existuje rozsáhlá dokumentace, týkající se použití PDT pro zničení nežádoucí populace buněk, například nádorových buněk. Několik řešení se týká samotných fotodynamických látek nebo látek spojených s imunoglobuliny zaměřenými na determinanty receptoru nádorové buňky, čímž se komplex stane buňkově více specifický. Některé fotodynamické látky, jako např. odvozeniny hematorfyrinu, které jsou zaměřeny na ničení nežádoucích buněk jsou popsány v norském patentu číslo 173319, v norských patentových přihláškách 900731, 902634, 901018, 941548, 851897, 934837, 924151 a 891491. V PCT/US93/00683 je popsán způsob dodávky léku, tvořeného protinádorovým lékem a fotoaktivaČním lékem připojeným na kopolymemí nosiče. Po podání vstoupí tento komplex do nitra buňky pinocytozou nebo fagocytozou a umístí se uvnitř endosomů a lyzosomů. V lyzosomech je vazba mezi protinádorovou látkou a polymerem hydrolyzována a uvedená látka může pasivně difundovat přes lyzosomovou membránu do cytozolu. Tato metoda je tedy omezena na malé molekulární látky, které jsou schopné difundovat napříč lyzosomními membránami. Po určité časové prodlevě na difúzi se použije světelný zdroj o příslušné vlnové délce a energii pro aktivaci fotoaktivační látky. Sloučený efekt protinádorového léku a fotoaktivačního léku zničí buňku. Všechna známá použití fotoaktivních látek jsou tedy zaměřena na rozsáhlé ničení struktury buněk, vedoucí až ke zničení buňky. Není znám prostředek ani metoda uvolnění buněčné membrány nepropustné molekulám pro proniknutí do cytozolu po místním prolomení endosomních a/nebo lyzosomních membrán. Cílem tohoto technického řešení je tudíž zajistit prostředek pro modifikaci buněčných zejména nádorových procesů, obsahující látku zvyšující fotocitlivost, který by po vystavení buňky světlu o vhodné vlnové délce a energii umožnil narušení endosomních a lyzosomních membrán, aniž by zničil funkčnost většiny buněk.

- 1 CZ 9727 U1

Podstata technického řešení

Nevýhody dosavadního stavu techniky podstatnou měrou odstraňuje a cíl technického řešení splňuje prostředek pro modifikaci buněčných zejména nádorových procesů u teplokrevných živočichů nebo kultur buněk, obsahující látku zvyšující fotocitlivost, schopnou absorpce světla, který podle technického řešení obsahuje látku uvolnitelnou do cytozolu buněk, samu o sobě nepronikající buněčnou membránou, přičemž látka zvyšující fotocitlivost a/nebo látka uvolnitelná do cytozolu buněk nebo jejich komponenty jsou volitelně připojeny ke stejným nebo různým molekulám nosiče. Podle výhodného provedení mohou být molekuly nosiče zvoleny ze skupiny polohově orientovaných molekul, látek usnadňujících absorpci látky zvyšující fotocitlivost nebo molekul, které mají být uvolněny do cytozolu. S výhodou může být látka uvolnitelná do cytozolu zvolena ze skupiny obsahující DNA, oligo(deoxy) nukleotidy, mRNA, protisměrné DNA, cukry, proteiny, peptidy, membránou nepronikající léky, jiné molekuly samy o sobě nepronikající buněčnou membránou akovalentně nebo nekovalentně vázané kombinace shora uvedených molekul. S výhodou může být látka uvolnitelná do cytozolu zvolena ze skupiny látek modifikujících proteosyntetickou aktivitu, může být protinádorovou látkou, která může být alespoň jednou ze skupiny gelonin, saporin, agrostin nebo jejich kombinace. S výhodou může být látka zvyšující fotocitlivost zvolena ze skupiny obsahující porfyriny, ftalocyaniny, purpuriny, choriny, benzoporíyriny, naftalocyaniny, kationová barviva, tetracykliny a lysozomotropicky slabé zásady ajejich deriváty. S výhodou může být rovněž látka zvyšující fotocitlivost alespoň jednou látkou zvolenou ze skupiny tetrafenylporfyrin s dvěma sulfonanovými skupinami na přilehlých fenylových kruzích (TPPS2_a), mezotetrafenylporfin se 4 sulfonanovými skupinami (TPPS4) a ftalocyanin hliníku se 2 sulfonanovými skupinami na přilehlých kruzích (AlPcS2_a). Látka zvyšující fotocitlivost může být s výhodou tetrafenylporfin s dvěma sulfonanovými skupinami na přilehlých fenylových skupinách. Koncentrace látky zvyšující fotocitlivost je s výhodou závislá na množství přežívajících buněk. Látka zvyšující fotocitlivost opčně vektorové molekuly a dopravovaná(é) molekul(y) volitelně připojené ke stejným nebo různým molekulám nosiče mohou být vzájemně sloučené nebo oddělené. Jsou aplikovány na živé buňky a potom endocyticky nebo jiným způsobem přemístěny do endosomů, lyzosomů nebo jiných mezibuněčných, membránou omezených komůrek, přičemž jsou buňky vystaveny světlu o vhodné vlnové délce podle absorpčního spektra látky zvyšující fotocitlivost v rozličných dávkách, závislých na požadované míře přežití tak, aby membrány endosomních, lyzosomních nebo jiných mezibuněčných komůrek se nenarušily a do cytozolu zaváděné molekuly se uvolní do cytozolu, aby samotná světlem aktivovaná látka zvyšující fotocitlivost nezničila většinu buněk. Podle výhodného provedení jsou molekuly uvolňované v cytozolu zvoleny ze skupiny obsahující DNA, oligo(deoxy) nukleotidy, mRNA, protisměrné DNA, cukry, proteiny, peptidy, buněčnou membránou nepronikající léky, jiné buněčnou membránou samy o sobě nepronikající molekuly a kovalentně nebo nekovalentně vázané kombinace shora uvedených molekul, ze skupiny látek modifikujících proteosyntetickou aktivitu, látka uvolňovaná do cytozolu může být s výhodou gelonin, saporin nebo agrostin nebo jakákoliv jejich kombinace, použité látky zvyšující fotocitlivost mohou být zvoleny ze skupiny obsahující porfyny, ftalocyaniny, purpuriny, chloriny, benzoporíyriny, naftalocyaniny, kationová barviva, tetracykliny a lozosomotropické slabé zásady ajejich deriváty, použitá látka zvyšující fotocitlivost může být tetrafenylporfin s 2 sulfonanovými skupinami na přilehlých fenylových kruzích (TPPS2_a), mezotetrafenylporfin se 4 sulfonanovými skupinami (TPPS4) nebo ftalocyanin hliníku se 2 sulfonanovými skupinami na přilehlých kruzích (AlPcS_2a) nebo jakákoliv jejich kombinace, použité vektorové molekuly mohou být polohově orientované molekuly nebo látky, které usnadňují absorpci látky zvyšující fotocitlivost nebo molekul, které mají být uvolněny do cytozolu, frakce přežívajících buněk může být regulována volbou dávky světla ve vztahu ke koncentraci fotocitlivost zvyšující látky. Prostředek pro modifikaci nádorových nebo jiných buněčných procesů u teplokrevných živočichů nebo kultur buněk obsahující jak látku, která má být uvolněna do cytozolu, tak látku zvyšující fotocitlivost a nosiče, může obsahovat člen zvolený ze skupiny složené z nosiče na usnadnění translokace do mezibuněčných komůrek, jako např. endosomy, lyzosomy nebo jiné mezibuněčné komůrky, mající navíc připojené jak látky modifikující buněční proces, které mají

-2CZ 9727 U1 být uvolněny do cytozolu, tak i látku zvyšující fotocitlivost, která po aktivaci světlem prolomí membrány mezibuněčných komůrek, několik z řečených nosičů z nichž nejméně jeden nosič má navíc připojenou látku, která má být uvolněna do cytozolu, ajiný podobný nebo odlišný nosič má navíc připojený fotocitlivost zvyšující látku a oddělenou prostředek nosičů, která má být spolu se látkou uvolněna do cytozolu, a látku zvyšující fotocitlivost s výhodou může být řečená látka, která má být uvolněna do cytozolu, protinádorová látka, kterou může být gelonin, látka, která má být uvolněna do cytozolu, může být zvolena ze skupiny obsahující DNA, oligo(dexy)nukleitidy, mRNA, protisměrnou DNA, cukry, proteiny, peptidy, membránou nepronikající léky, jiné buněčnou membránou samy osobě nepronikající molekuly, kovalentně nebo nekovalentně vázané kombinace shora uvedených molekul, látka zvyšující fotocitlivost může být zvolena ze skupiny obsahující porfyriny, ftalocyaniny, purpuriny, chloriny, benzoporíyriny, nafitalocyaniny, kationová barviva, tertracykliny a lyzosomotropicky slabé zásady a jejich deriváty, může být tetrafenylporfin s dvěmi sulfonanovými skupinami na přilehlých fenylových skupinách nebo mohou být nosiče zvoleny z polohově orientovaných molekul nebo látek, které usnadňují absorpci látek zvyšujících fotocitlivost nebo molekuly, které mají být uvolněny do cytozolu. Předmětem technického řešení je rovněž souprava pro provádění tohoto způsobu obsahující látku zvyšující fotocitlivost a jiné látky modifikující přenos přes membránu buňky, usnadňující určité populace buněk nebo jiné související funkce. Při použití prostředku pro modifikaci buněčných zejména nádorových procesů podle technického řešení zůstanou molekuly dostupné v cytozolu a buňka si udrží svou funkčnost. Fotoaktivační látka, absorbována buňkou a je umístěna vendosomech, lyzosomech nebo jiných buněčných komůrkách, sloučené nebo odděleně, spolu s nosnými molekulami, cílovými imunoglobuliny a molekulami, které se mají dopravit do cytozolu. Vystavením buněk světlu o vhodné vlnové délce pro aktivaci látky zvyšující fotocitlivost jsou prolomeny jen endosomní, lyzosomní a jiné buněčné komory a molekuly budou uvolněny v cytozolu beze ztráty funkčnosti buňky akcí fotoaktivované látky a případnou akcí obsahu endosomu a/nebo lyzosomu.

Přehled obrázků na výkrese

Technické řešení je dále detailně popsáno a ilustrováno vyobrazeními, kde obr. 1 ukazuje, jak mohou být molekuly zavedeny do cytozolu buňky podle tohoto technického řešení. Látka (S) zvyšující fotocitlivost volitelné molekuly (M) jsou endocytovány buňkami (I, představuje invaginaci plazmy membrány spouštějící endocytický postup) a obě látky končí ve stejných vezikulách (váčcích) (II). Po vystavení těchto vezikulí světlu se membrány vezikulí prolomí a obsah se uvolní (III). Obr. 2 představuje syntézu proteinu v buňkách NHIK 3025 po ošetření geloninem za nepřítomnosti nebo přítomnosti TPPS2_a světla po dobu 50 s. Na obr. 2 jsou použity tyto značky: O, TPPS_2a + světlo; ·, -TPPS_2a -světlo, +TPPS_2a -světlo; V , -TPPS_2a + světlo. Tyto buňky byly přes noc ošetřeny pomocí 3,2pg/ml TPPS_2a a indikovanou koncentrací geloninu ave všech případech vystaveny stejné dávce světla. Syntéza proteinu byla měřena měřením vtělení 3 [H] leucinu do proteinů, 24 hodin po vystavení světlu. Obr. 3 představuje křivky dávkové reakce buněk ošetřených jen TPPS_2a a světlem (O) nebo v kombinaci s 0,2 pg/ml (V) nebo 2,0 pg/ml geloninu, jak popsáno v obr. 2. Obr. 4 představuje syntézu v buňkách NHIK 3025 po ošetření pomocí 3,2 pg/ml TPPS_2a a světla za nepřítomnosti nebo přítomnosti 0,2 pg/ml geloninu. Použité značky: ·, TPPS_2a - gelonin; TPPS_2a + gelonin. Buňky byly ošetřeny přes noc pomocí TPPS_2a v nepřítomnosti nebo přítomnosti geloninu a vystaveny naznačeným dávkám světla. Syntéza proteinu byla měřena vtělením 3 [H] leucinu do proteinu. Obr. 5 představuje syntézu v buňkách V79 po ošetření pomocí 25 pg/ml AlPcS₂ a světlem v nepřítomnosti nebo přítomnosti 1 pg/ml geloninu. Použité značky: · látka zvyšující fotocitlivost + toxin; O látka zvyšující fotocitlivost. Obr. 6 představuje syntézu v buňkách H146 po ošetření pomocí 0,3 pg/ml TPPS_2a a světlem v nepřítomnosti nebo přítomnosti lpg/ml geloninu. Použité značky: jako v obr. 5. Obr. 7 představuje syntézu v buňkách V79 po ošetření pomocí 1 pg/ml TPPS_2a a světlem v nepřítomnosti nebo přítomností 1 pg/ml geloninu. Použité značky jako v obr. 5. Obr. 8 představuje syntézu v buňkách NHIK 3025 po ošetření pomocí 3,2 pg/ml TPPS_2a a světlem

-3CZ 9727 Ul v nepřítomnosti nebo přítomnosti 1 pg/ml agrostinu. Použité značky jako v obr. 5. Obr. 9 představuje syntézu v buňkách NHIK 3025 po ošetření pomocí 3,2 pg/ml TPPS_2a a světlem v nepřítomnosti nebo přítomnosti 1 pg/ml saporinu. Použité značky jako v obr. 5. Obr. 10 představuje syntézu v buňkách NHIK 3025 po ošetření pomocí 0,25 pg/ml 3-THPP a světlem v nepřítomnosti nebo přítomnosti 1 pg/ml geloninu. Použité značky jako v obr. 5. Obr. 11 představuje syntézu v buňkách COS-7 po ošetření pomocí 3 pg/ml TPPS2_a a světlem v nepřítomnosti nebo přítomnosti 1 pg/ml geloninu; použité značky jako v obr. 5. Obr. 12 představuje syntézu v buňkách NHIK 3025 po ošetření geloninem v nepřítomnosti nebo přítomnosti TPPS4 a osvětlení po dobu 50 s. Použité značky □ TPPS4 + světlo, V - TPPS₄ 10 světlo; +RPPS4 - světlo. Buňky byly ošetřeny přes noc 75 pg/ml TPPS4 a naznačenou koncentrací geloninu ave všech případech byly vystaveny stejné dávce světla. Syntéza proteinu byla měřena měřením vtělení 3 [H] leucinu do proteinu 24 hodin po vystavení světlu. Obr. 13 představuje syntézu v buňkách OHS po ošetření 3 pg/ml TPPS_2apo dobu 18 hodin, následovaném 4 hodinami bez přítomnosti TPPS_2a a za nepřítomností nebo přítomnosti 3 pg/ml geloninu před vystavením světlu. Buňky byly inkubobány po stejné 4 hodiny v 50 uM chlorochininu nebo 10 mM NH4CI pro zabránění degradace lyzosomního proteinu. Je plně doloženo, že celá řada léků, včetně di- a tetrasulfo-nátovaného hliníku ftalocyaninu, sulfonátovaných tetrafenylprofinů (TPPSn), nilské modře, e6 derivátů chloru, uroporfinu I, ťylloerythrinu a případně hemetoporfyrinu a metylové modře jsou umístěny v endosomech a v lyzosomech buněk v kultuře. Ve většině případů je to způsobeno endocytickou aktivitou. Původci prokázali, že vystavení buněk obsahujících látky zvyšující fotocitlivost ve svých lyzosomech vede k propustnosti lyzosomů a uvolnění látky zvyšující fotocitlivost. V některých případech, jako např. u TPPS₂ a TPPSj, podstatná část aktivity lyzosomního enzymu byla po PDT zjištěna v cytozolu, což naznačuje, že obsah lyzosomů lze uvolnit do cytozolu beze ztráty jeho aktivity. Tento efekt barviv zvyšujících fotocitlivost lze podle této studie použít všeobecně na uvolnění endocytozovaných molekul z endosomů a lyzosomů. Zavedení molekul do buněční cytoplazmy se docílí v prvé řadě vystavením buněk nebo tkáně barvivu zvyšujícímu fotocitlivost, molekulu(y), kterou(é) chceme dodat do cytozolu buněk s nebo bez nosných molekul a imuglobinů, které by všechny měly být přednostně umístěny v endosomech a/nebo lyzosomech. V druhé řadě se buňky nebo tkáň vystaví světlu o vhodné vlnové délce a energii pro vyvolání fotodynamické reakce. Tato fotodynamická reakce povede k prolomení lyzosomních a/nebo endosomních membrán a obsah těchto vezikulí bude uvolněn do cytozolu. Principy tohoto technického řešení jsou naznačeny na obr. 1. Je nutné, aby látka zvyšující fotocitlivost a molekula, které se mají zavést do buněk, byly umístěny v těchže komůrkách. Je rovněž nutné zdůraznit, že externě přidané molekuly se mohou hromadit v mezibuněčných komůrkách, jiných než jsou lyzosomy aendosomy, jako např. v Golgiho aparatuře a v endoplasmatickém retikulu. V takových případech lze fotocitlivost zvyšující látky, nacházející se ve stejných komůrkách, použít ve spojení se světlem pro stejné účely za předpokladu, že kombinace světelné dávky a fotocitlivost zvyšující látka nezničí funkčnost buněk. Toto technické řešení je založeno na naší in vitro demonstraci, podle které fotocitlivost zvyšující látka, např. TPPS_2a (terafenylporfin s 2 sulfinanovými skupinami nebo přilehlými fenylovými skupinami) v kombinaci se světlem mohou vyvolat uvolnění funkčně neporušeného obsahu lyzosomů bez zničení velkého podílu buněk. Téhož efektu lze docílit použitím jiných fotocitlivost zvyšujícími látkami samotnými nebo ve spojení nebo ve vazbě s jinými molekulami a částicemi použitými jako vektory pro nasměrování fotocitlivost zvyšujících látek na endosom a/nebo lyzosomů nebo jiné mezibuněčné komůrky. Takovými vektory mohou být tkáň nebo buněčně specifické protilátky nebo jiné ligandy, které se vážou na povrch buněk, čímž zvyšují absorpci fotocitlivost zvyšujících látek receptory zprostředkované endocytozy. Jiným vektorem by mohlo být použití rekonstruovaných částic LDL. Tyto částice jsou rovněž absorbovány reptory zprostředkované endocytozy. Tímto způsobem lze zvýšit počet fotocitlivost zvyšujících molekul na LDL částici a vazbu na částice LDL v porovnání s předvazbou na původní LDL. Technické řešení není omezeno na použití in vitro, ale může být také použit in vivo, buď na ošetření na místě, nebo na ex vivo ošetření, následované injekcí ošetřených buněk. Absorpce do endosomů a lyzosomů může být zlepšena stejným způsobem,

-4CZ 9727 U1 který byl popsán pro in vitro ošetření. Ošetřit lze všechny tkáně, pokud fotocitlivost zvyšující látka je absorbována cílovými buňkami a světlo je dodáno správně. Kromě fotocitlivost zvyšující látky je podstatné i světlo. Světlo musí být absorbováno fotocitlivost zvyšující látkou nebo musí nepřímo vyvolat vybuzený stav látky zvyšující fotocitlivost. Oblast vlnové délky bude proto záviset na fotocitlivost zvyšující látce. Expoziční světlo nemusí být monochromatické nebo kolimační. Lze použít každý zdroj světla vyzařující příslušnou vlnovou délku. Překvapující je, že fotodynamická akce podle tohoto technického řešení zřejmě neutralizuje potenciálně cytotoxický efekt uvolňování lyzosomního obsahu. Vynálezci tak prokázali, že vzniku lyzosomního katepsinu je podstatně zabráněno fotodynamickou akcí TPPS2_a v kultuře buněk NHIK 3025. To tvoří ío překvapující jev tohoto technického řešení a pomáhá udržet životnost a funkčnost buněk po dopravě molekul do cytozolu narušením endosomních a /nebo lyzosomních membrán.

Příklady experimentálního a klinického využití

Toto technické řešení je dále objasněno následujícími příklady, aniž by bylo na ně omezeno:

1) Léčení rakoviny

Několik fotocitlivost zvyšujících látek se přednostně usazuje v nádorových tkáních, přičemž selektivita nádoru nad okolní tkáň má obvykle faktor 2-3, avšak v některých případech, jako např. u mozkových tkání, tento faktor může být vyšší, konkrétně až do 30. Molekuly, které mohou být klinického zájmu pro léčení rakoviny, ale jsou omezeny nízkou nebo žádnou absorpcí, v cytozolu, mohou být zavedeny do cytozolu pomocí tohoto technického řešení.

Gelonin, jak ukázáno v níže uvedeném příkladu, je například takové molekuly. Rovněž mohou být použity některé další molekuly, a to buď samostatně nebo ve spojení s jinými molekulami (jako např. protilátkami, transferinem, látkami zvyšujícími fotocitlivost, aponemB na rekonstruovaných LDL částicích). Výhoda takového kombinovaného ošetření by spočívala ve zlepšeném cytotoxickém efektu v hlubších vrstvách nádorové tkáně, jelikož nízké a subtoxické dávky světla jsou dostatečné na narušení lyzosomů a endosomů, a ve zlepšené specifičnosti toxinu, jelikož PDT je aplikována jen na oblast nádorové oblasti.

2) Genová terapie

Genová terapie, tj. terapeutický přenos genů do buněk pacienta, tvoří slibnou metodu pro léčení genetických poruch, jako jsou např. rakovina, cystická fibrozitida, kardiovaskulární onemocnění a mnoho dalších nemocí. Hlavní dnešní problém je transfekce, která musí nastatin vivo, nebo v některých případech ji lze provést ex vivo. Dnes nejčastěji používaný vektor, tj. struktura, která pomáhá dodat molekuly DNA do buněk, jsou rozličné druhy virů, zejména retro a endoviry. Nevýhody těchto metod jsou nízká stabilita vektoru, omezená specifičnost, nízká výtěžnost a zavedení DNA viru do lidské tkáně. DNA může být zavedena do buněk, buď jako protismyslá

DNA nebo jako celé geny, prostřednictvím fotochemicky vyvolaného narušení endosomů a/nebo lyzosomů. Ošetření může být provedeno in vivo.

3) Experimentální využití

Toto technické řešení může být použito na zavedení široké škály molekul do buněk v kultuře, jako např. genů, protilátek, upravenými proteiny a látkami, které obvykle samy o sobě nepronika40 jí membránou plazmatu.

Příklad 1

Tento příklad dokládá, že fotodynamické ošetření uvolňuje látku zabraňující syntézu proteinu do cytozolu. Řada rostlinných toxinů ničí buňky tím, že vniká do cytozolu a enzymaticky deaktivuje ribozomní funkci. Nejcytotoxictější rostlinné proteiny jsou tvořeny 2 polypeptidními řetězci, A a B, vzájemně vázanými dvojsiřičitanovými můstky. Funkce řetězce B je vázat protein na povrch buněk, zatímco řetězec A obsahuje enzymatickou aktivitu. Gelonin je rostlinný toxin, který

-5 CZ 9727 Ul účinně brání syntéze proteinu v bezbuněčném systému, ale má jen malý nebo žádný vliv na neporušené buňky. Nízký cytotoxický vliv na neporušené buňky je pravděpodobně způsoben nedostatkem řetězce B v geloninu. Buňky NHIK 3025 byly inkubovány s TPPS_2a (vzorec I) a geloninem, odděleně nebo společně, po dobu 18 hodin a následně 1 hodinu v TPPS_2a a bezgeloninovém prostředí dříve, než byly buňky vystaveny světlu. Syntéza proteinu byla měřena 24 hodin po vystavení světlu. Fotodynamické ošetření, které ničí 10 - 20 % samotných buněk, snížilo syntézu proteinu o 30 - 40 % (obr. 2). Z obr. 2 vyplývá, že samotný gelonin v přítomnosti nebo nepřítomnosti světla zabraňuje do jisté míry syntézu proteinu. Syntéza proteinu může být zcela zamezena 5 kombinací PDT a geloninu o IC50 = 0,2 pg/ml geloninu. ίο V nepřítomnosti fotodynamického ošetření gelonin tedy v podstatě nevnikl do cytozolu. Tento příklad naznačuje, že lze použít TPPS_2a a světla po zavedení funkčně neporušených makromolekul do buněčného cytozolu.

Příklad 2

Tento příklad ukazuje, jak může být dávka světla (o vlnové délce, která je absorbována barvivém) použita na rozhodnutí o velikosti přežívající frakce buněk. Buňky NHIK 3025 byly inkubovány s TPPS_2a a geloninem podle plánu příkladu 1. Klonogenické přežití buněk bylo měřeno 24 hodin po vystavení světlu. Z obr. 3 vyplývá, že prakticky všechny buňky byly zničeny pomocí TPPS_2a a světla při prodloužení expozice světlu. To je v souladu s předchozím stavem techniky týkající se ničení nežádoucích buněk pomocí PDT. Přidáním geloninu klesne míra přežití z důvodu útlumového vlivu geloninu na syntézu proteinu, což značí, že gelonin je nyní uvolněn v cytozolu. Zvýšená koncentrace přidaného geloninu vede k více geloninu v cytozolu, jak naznačeno zvýšenou citlivostí buněk na fotodeaktivaci. Toto technické řešení v každém případě nabízí možnost nastavení hladiny přežití a volbu kombinace fotocitlivost zvyšující látky a vystavení světlu, která zachová životnost žádané frakce buněk.

Příklad 3

Tento příklad předvádí, jak měnící se dávka osvětlení řídí množství geloninu uvolněného v cytozolu, stanoveného relativní syntézou proteinu. Buňky NHIK 3025 byly inkubovány pomocí TPPS_2a a geloninem podle plánu příkladu. Z obr. 4 vyplývá, že shora uvedená toxická dávka 50 s zvýšila frakci geloninu v cytosolu, stanovenou relativní syntézou proteinu. Příklad 4-11 předvádí použití na různých druzích buněk a s různými fotocitlivost zvyšujícími látkami a toxiny. Mezibuněční umístění fotocitlivost zvyšujících látek je lyzosomní (TPPS4, TPPS_2a, AlPcS_2a) a extralyzosomní (3-THPP). Použité značky znamenají: AlPcS_2a je ftalocyanin hliníku s 2 sulfonanovými skupinami na přilehlých fenylových kruzích; TPPS4 je mezotetrafenylporfín se 4 sulfonanovými skupinami; TPPS_2aje mezotetrafenylporfín se 2 sulfonanovými skupinami na přilehlých fenylových kruzích; 3-THPP je tetrahydroxylfenylporfín. Použité druhy buněk jsou karcinomatózní buňky v místě z lidského hrdla (NHIK 3025), plicní fíbroblasty z čínského křečka (V79), SV-40 transformovaná játra z africké zelené opice (CV1-opičí fíbroblastům podobné buňky) (cos-7), lidské osteosarkomní buňky (OHS) a malé buňky plicní rakoviny (H146). Všechny pokusy byly vedeny jako v příkladu č.l.

Příklad 4

Tento příklad se týká použití látek AlPcS_2a zvyšujících fotocitlivost ve V79 buňkách s nebo bez geloninu jako toxinu (obr. 5). Volbou specifické dávky osvětlení (ozařovací doby) je předvedeno, že bez toxinu dochází k velmi malému poškození buňky, jak doloženo malým snížením syntézy proteinu, zatímco s geloninem je syntéza proteinu hluboce snížena. To ukazuje, jak jsou molekuly geloninu přenášeny do cytoplazmy buňky prostřednictvím lyzosomů bez podstatného poškození buněk, přestože mezibuňková lokalizace ALPcS_2a je lyzosomní (Moan.J., Berg.K.; Anholt.H. a Madslien.K.: (1994). Sulfonated aluminium phtalocyanines as sensitzers for phototherapy. Effects of smáli light doses on lacalization, dye fluorescence and photosensitivity in V79 cells. Sufonanované ftalocyaniny hliníku jako zvyšovače citlivosti pro

-6CZ 9727 U1 fotochemoterapii. [Vliv malých dávek světla na lokalizaci, fluorescenci barviv a fotocitlivost v buňkách V79]. Int.J.Cancer 58: 865-870).

Příklad 5

Tento příklad předvádí přenos toxinu geloninu do buněk H146 bez podstatného ovlivnění životnosti buněk. (Obr. 6) je známo, že TPPS2_aje lyzosomně umístěna v buňce. (Berg.K., Westem.A., Bommer.J. aMoan.J.: (1990) Intracellular localisation of sulfonated mesotetraphenylporphines in human carcinoma cell line. [Mezibuňkové umístění sulfonanovaného mezotetrafenylporfmu v lidském karcinomním druhu buněk.] Photochem.Photobiol.52: 481-487, Berg.K., Madslien.K., Bommer J.C., Oftebro.R., Winkelman J.C. aMoan.J.: (1991) Light induced relocalization of sulfonated mesotetraphenyl-porphines in NHIK 3025 cells and effects of dose fractionation. [světlem vyvolaná relokalizace sulfonanových mezotetrafenylporfínův buňkách NHIK 3025 a vlivy frakcionalizace dávkování.] Phochem.Phobiol.53: 203-210; Berg.K. aMoan.J: (1994) Lysosomes as photochemical targets. [Lyzosomy jako fotochemické cíle.] Int.J.Cancer 59: 814-822).

Příklad 6

Tento příklad převádí způsob podle technického řešení v buňkách V79 za použití TPPS2_ajako látky zvyšující fotocitlivost (obr. 8).

Příklad 7

Tento příklad předkládá přenos toxinu agrostin do buněk NHIK 3025 pomocí látky TPP_2a zvyšující fotocitlivost (obr. 9).

Příklad 8

Tento příklad představuje přenos toxinu saporin do NHIK 3025 buněk pomocí TPP2_a (obr. 9).

Příklad 9

Toto je porovnávací příklad předvádějící, že u látky zvyšující fotocitlivost (3-THPP), která nevstupuje do endocytických vezikulí (tj. endosomů a lyzosomů) (Peng.Q., Danielsen, H.E. aMoan.J.: (1994) Potent photosensitizers for photodynamic therapy of cancer: Applications of confocal laser scanning microscopy for fluorescence detection of photosensitizing fluorophores in neoplastic cells and tissues. [Scopné látky zvyšující fotocitlivost pro fotodynamickou terapii rakoviny: Aplikace konfokální (souhniskové) laserové snímací mikroskopie pro fluorescenční detekci fluoronosičů zvyšujících fotocitlivost v nádorovových buňkách a tkáních.]: Proceedings of microscopy, Holography and Interferometry in Biomedicine. SPIE svazek 2083:71-82, neexistuje podstatný rozdíl mezi vlivem 3-THPP snebo bez geloninu na syntézou proteinu (obr. 10). Tudíž gelonin není dopravován do cytozolu buněk.

Příklad 10

Tento příklad předkládá přenos geloninu do buněk COS-7 pomocí TPPS_2a podle technického řešení (obr. 11).

Příklad 11

Tento příklad předkládá přenos geloninu do buněk OHS pomocí TPPS_2a podle technického řešení (obr. 13). U tohoto druhu buněk dochází k podstatné degradaci proteinu v lyzosomech, které jsou v tomto příkladu potlačeny 4-hodinovou inkubací buněk buď v 50 μΜ chlorochininu nebo v 10 mM NH4CL.

-7CZ 9727 Ul

Příklad 12

Tento příklad předvádí, podobně jako v příkladu 1, přenos geloninu do buněk NHIK 3025 jako funkci koncentrace geloninu, když jsou buňky inkubovány s TPPS₄ a s různými koncentracemi geloninu a vystaveny světlu (obr. 12). Při inkubaci buněk jen se samostatným geloninem a vystavení světlu, nebo inkubací s TPPS₄ a geloninem bez vystavení světlu, nedochází k přenosu geloninu do buněk. Příklady ukazují, že různé molekuly mohou být zavedeny do cytozolu širokého sortimentu buněk pomocí různých látek zvyšujících fotocitlivost a světelných dávek. Exogenní molekuly mohou být zavedeny do buněčného cytozolu po dávkách látek zvyšujících fotocitlivost a osvětlení, které neničí buňky, pokud jsou zaváděné molekuly a fotocitlivost ío zvyšující látky dopravovány do těchže komůrek buněk. Fotochemický efekt na biologické komůrky závisí na daném množství fotocitlivost zvyšující látky v této komůrce, na dávce použitého světla a na spektrálních vlastnostech světelného zdroje. Nejlepší způsob vyhodnocení fotochemických účinků na buňky v kultuře je proto měření přežití buňky 24 hodin nebo déle po ošetření. Jak uvedeno shora, existuje dobrá korelace mezi vlivem ničení buněk a potlačením syntézy proteinů 24 hodin po ošetření, jak uvedeno shora (data však nejsou uvedena).

Claims (10)

NÁROKY NA OCHRANU

1. Prostředek pro modifikaci buněčných zejména nádorových procesů u teplokrevných živočichů nebo kultur buněk, obsahující látku zvyšující fotocitlivost, schopnou absorpce světla, vyznačující se tím, že obsahuje látku uvolnitelnou do cytozolu buněk, samu o sobě

20 nepronikající buněčnou membránou, přičemž látka zvyšující fotocitlivost a/nebo látka uvolnitelná do cytozolu buněk nebo jejich komponenty jsou volitelně připojeny ke stejným nebo různým molekulám nosiče.

2. Prostředek pro modifikaci buněčných zejména nádorových procesů podle nároku 1, vyznačující se tím, že molekuly nosiče jsou zvoleny ze skupiny molekul polohově

25 orientovaných, látek usnadňujících absorpci látky zvyšující fotocitlivost nebo molekul, které mají být uvolněny do cytozolu.

3. Prostředek pro modifikaci buněčných zejména nádorových procesů podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že látka uvolnitelná do cytozolu je zvolena ze skupiny obsahující DNA, oligo(deoxy) nukleotidy, mRNA, protisměrné DNA, cukry, proteiny, peptidy, membránou

30 nepronikající léky, jiné molekuly samy o sobě nepronikající buněčnou membránou a kovalentně nebo nekovalentně vázané kombinace shora uvedených molekul.

4. Prostředek pro modifikaci buněčných zejména nádorových procesů podle jednoho z předchozích nároků laž3, vyznačující se tím, že látka uvolnitelná do cytozolu je zvolena ze skupiny látek modifikujících proteosyntetickou aktivitu.

35 5. Prostředek pro modifikaci buněčných zejména nádorových procesů podle jednoho z předchozích nároků laž4, vyznačující se tím, že látka uvolnitelná do cytozolu je protinádorová látka.

5 jednou látkou zvolenou ze skupiny tetrafenylporíyrin s dvěma sulfonanovými skupinami na přilehlých fenylových kruzích (TPPS_2a), mezotetrafenylporfin se 4 sulfonanovými skupinami (TPPS4) a ftalocyanin hliníku se 2 sulfonanovými skupinami na přilehlých kruzích (AlPcS2_a).

6. Prostředek pro modifikaci buněčných zejména nádorových procesů podle nároku 5, vyznačující se tím, že protinádorová látka je alespoň jedna látka ze skupiny gelonin,

40 saporin, agrostin nebo j ej ich kombinace.

7. Prostředek pro modifikaci buněčných zejména nádorových procesů podle jednoho z předchozích nároků laž6, vyznačující se tím, že látka zvyšující fotocitlivost je zvolena

-8CZ 9727 U1 ze skupiny obsahující porfyriny, ftalocyaniny, purpuriny, choriny, benzoporíyriny, naftalocyaniny, kationová barviva, tetracykliny a lysozomotropicky slabé zásady a jejich deriváty.

8. Prostředek pro modifikaci buněčných zejména nádorových procesů podle jednoho z předchozích nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že látka zvyšující fotocitlivost je alespoň

9. Prostředek pro modifikaci buněčných zejména nádorových procesů podle jednoho z nároků laž8, vyznačující se tím, že látka zvyšující fotocitlivost je tetrafenylporfín s dvěma

10 sulfonanovými skupinami na přilehlých fenylových skupinách.

10. Prostředek pro modifikaci buněčných zejména nádorových procesů podle jednoho z nároků laž9, vyznačující se tím, že koncentrace látky zvyšující fotocitlivost je závislá na množství přežívajících buněk.