JP2002541072A

JP2002541072A - 方法

Info

Publication number: JP2002541072A
Application number: JP2000604874A
Authority: JP
Inventors: クリスティンバーグ; トールンイー．テジェール; アンダースホッグセット; リーナプラスミケイト
Original assignee: フォトキュアエイエスエイ
Priority date: 1999-03-15
Filing date: 2000-03-10
Publication date: 2002-12-03
Anticipated expiration: 2020-03-10
Also published as: US9737594B2; WO2000054802A3; NO20014491L; NZ514228A; CN100379450C; DK1223973T3; MXPA01009316A; AU771990B2; ES2319255T3; EP1223973B1; PL355015A1; KR20010110664A; HU227604B1; KR100769113B1; NO20014491D0; HUP0202441A3; US8216587B1; NO331101B1; ATE419866T1; HUP0202441A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、光化学的インターナリゼーションにより細胞質ゾルに分子を導入する段階を含み、続いて、当該分子またはその一部が細胞の表面に提示されることを特徴とする抗原分子またはその一部を抗原提示細胞の表面に発現させる方法を提供するものである。また、当該細胞を含む組成物とともに、この方法を含むワクチン接種方法、および抗原分子を発現させる細胞を含む使用もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、光力学的治療（PDT）を利用してワクチン成分を細胞内に導入し、
抗原提示を達成する段階を含むワクチン接種の方法およびこのような方法におい
て有用なワクチン組成物に関する。

【０００２】大半の分子は、細胞膜を容易に通過することができない。生きている細胞の細
胞質ゾルに分子を導入する方法は、生物学的プロセスを扱い、研究するための有
用な手段である。今日、最も一般に利用されている方法の中には、マイクロイン
ジェクション、赤血球ゴースト媒介融合およびリポソーム融合、ピノソームの浸
透溶解、スクレープ負荷（scrape loading）、エレクトロポレーション（電気穿
孔法）、リン酸カルシウムおよびウイルス媒介トランスフェクションがある。こ
れらの技術は、多くの場合、非実用的で、時間を浪費し、非効率的であるか、あ
るいは、重大な細胞死を引き起こすこともあるが、培養中の細胞を調べるのに有
用である。したがって、細胞に生存能力があり、かつ／または機能的なままに維
持することが要求されるところでは、このような技術は、生物学的または医学的
研究、あるいは治療における使用には適していない。

【０００３】ポルフィリンおよび他の多くの光増感化合物が、細胞および組織に対し、細胞
毒性作用を引き起こすことがあることはよく知られている。これらの作用は、光
増感化合物を光にさらすことにより、毒性となるか、または、細胞膜および細胞
構造を含む細胞物質または生体分子にダメージを及ぼす一重項酸素（¹O）または
他の酸化ラジカルのような毒性物質を放出するに違いない事実、ならびにこのよ
うな細胞または膜のダメージが最終的に細胞を殺すに違いない事実を根拠にして
いる。これらの作用は、特に腫瘍性疾患を含む、さまざまな異常または疾患の治
療に利用されてきた。この治療は、光力学的治療（PDT）と名づけられており、
身体の患部に光増感（光化学治療）剤を投与し、次いで、光増感剤を活性化し、
これらを細胞毒性型に変換させるために、光活性化光線にさらす段階を含んでお
り、このことにより、病変細胞が殺され、あるいはその増殖能力が低減される。
光増感剤は、優先的に、あるいは選択的に、所望の標的部位、具体的には腫瘍ま
たは他の病変に局在化するであろうことが知られている。

【０００４】光増感剤の範囲は知られており、たとえば、著名なソラーレン、ポルフィリン
、クロリンおよびフタロシアニンが挙げられる。このような薬剤は、光に曝され
た時に毒性となる。光増感剤は、直接的または間接的に様々なメカニズムによって、その効果を発
揮するであろう。したがって、たとえば、ある光増感剤は、光により活性化され
て直接毒性となるが、一方で、脂質、タンパク質、核酸のような、細胞物質およ
び生体分子に対し非常に破壊的である、たとえば、一重項酸素または他の酸素由
来のフリーラジカルのような酸化剤といった毒性種を発生するように作用するも
のもある。

【０００５】ポルフィリン光増感剤は、毒性酸素種の発生により間接的に作用し、PDTのた
めに特に好ましい候補として認識されている。ポルフィリンは、ヘム合成の際、
自然界に生成する前駆体である。特に、ヘムは、酵素フェロケラターゼの作用に
より、プロトポルフィリンIX（Pp）に鉄（Fe³⁺）が組み込まれたときに造られる
。Ppは、非常に強力な増感剤であるが、ヘムは、光増感作用を有しない。当該分
野では、ポルフィリンを主体とした、またはポルフィリン関連のさまざまな光増
感剤が知られており、文献に記載されている。

【０００６】細胞毒性作用は、主に、一重項酸素の形成を通じて媒介される。この反応中間
体は、細胞中では存在期間が非常に短い（＜0.04μs）。したがって、PDTの最初
の細胞毒性作用は、光照射の間に、一重項酸素（¹O）の形成部位の極めて近傍で
達成される。¹Oは、タンパク質（ヒスチジン、トリプトファン、メチオニン、シ
ステイン、チロシン）、DNA（グアニン）、不飽和脂肪酸およびコレステロール
と反応し、酸化する。PDTの利点の一つとしては、光に曝されない組織は影響さ
れないまま残ることができることである。すなわち、選択的なPDT効果を得るこ
とができることである。たとえば腫瘍細胞などの望まない細胞集団を破壊するた
めの、PDTの利用に関する多くの文献がある。特許文献には、多くの光力学的化
合物が、単独に、あるいは、たとえば、より細胞特異的な複合体とすべく腫瘍細
胞レセプター決定因子に向けられる免疫グロブリンなどの標的試薬との複合体形
成も記載されている。ヘマトポルフィリン誘導体のような、ある種の光化学的化
合物は、さらに、有害な細胞に局在化する固有の能力を有している。このような
方法および化合物は、ノルウェー特許NO173319号、ノルウェー特許出願No.90073
1号、176645号、176947号、180742号、176786号、301981号、300499号、および8
91491号に記載されている。

【０００７】 WO93/14142では、抗ガン剤およびコポリマー担体に結合した光活性化剤（すな
わち、光増感剤）を含む薬物送達システムが記載されている。投与の際、この複
合体はピノサイトーシスまたはファゴサイトーシスにより細胞内に入り、エンド
ソーム（ピノソーム）およびリソソーム内部に局在化する。リソソームでは、抗
腫瘍薬とポリマー間の結合が加水分解され、前者は、抵抗なくリソソーム膜を通
過して、細胞質ゾルに拡散し得る。この方法の効用は、したがって、リソソーム
膜を横切って拡散することができる小分子化合物に制限される。拡散のための時
間のずれをみた後、適切な波長およびエネルギーの光源を光活性な化合物を活性
化するのに適用される。抗がん剤および光活性化剤の共同作用により、細胞が破
壊される。

【０００８】したがって、上述したようなPDT法は、細胞構造の破壊に向けられ、細胞死に
導かれる。他方、WO96/07432は、広範な細胞破壊あるいは細胞死を招かない方式で細胞質
ゾル中に他の方法では膜を透過しない分子を導入するためのメカニズムとして、
光力学的作用を用いた方法に関する。この方法では、分子は、光増感剤とともに
、細胞中の細胞内小胞（例：リソソームまたはエンドソーム）に共に内在化され
る（より具体的には、”細胞内取り込みされる”）。その後、細胞は、光活性化
光線にさらされ、光増感剤を”活性化”させ、次に、小胞膜に破壊または破裂を
引き起こし、分子を含む小胞内容物を細胞内部に、すなわち、細胞質ゾルに放出
する。このような方法では、大多数の細胞の機能または生存能力が、有害な影響
を受けていないことがわかった。したがって、”光化学的インターナリゼーショ
ン”と呼ばれる、このような方法の有用性が、治療薬を含むさまざまな異なる分
子を細胞質ゾル、すなわち、細胞内部に移送するために提案されている。

【０００９】今回、我々は、このような方法が、分子を細胞内部に移送するためだけではな
く、細胞表面上に提示しあるいは発現させるためにも好適に使用し得ることを見
出した。したがって、分子を細胞質ゾルに移送し、かつ放出した後に、該分子は
、細胞表面に移送されてもよく、そこで、細胞の外側、すなわち、細胞の表面上
に提示されてもよい。このような方法は、特にワクチン接種の分野で有用であり
、その際、免疫応答を誘発させ、促進し、あるいは増大させるために、ワクチン
成分、すなわち、抗原または免疫原は、細胞表面上に提示するために細胞に導入
されてもよい。

【００１０】したがって、最も一般的には、本発明は、光化学的インターナリゼーションに
より、細胞質ゾルに分子を導入する段階を含み、続いて、前記分子またはその一
部が前記細胞表面上に提示されていることを特徴とする、細胞、好ましくは抗原
提示細胞の表面に抗原性分子またはその一部を発現させる方法を提供するもので
ある。

【００１１】本明細書で用いる、”発現する”または”提示する”とは、前記細胞の表面上
に分子またはその一部が存在していることをいい、したがって、少なくともその
分子の一部は、その細胞を取り囲む環境にさらされ、接触可能である。”表面”
上での発現は、発現される分子が、細胞膜および／または膜内に存在してもよく
、もしくは膜に存在することになる成分と接触する場合に達成されてもよい。

【００１２】このような抗原提示は、好適には、免疫応答、好ましくは、前記抗原分子また
はその一部からなるまたは含む存在物による後の攻撃に対し保護を与えるような
免疫応答の刺激をもたらしてもよく、結果的に、本発明は、ワクチン接種の方法
として、特に有用性を見出している。さらに詳しくは、本発明の当該側面は、抗原分子またはその一部を細胞表面上
に発現するための方法を提供するものであって、以下の段階を含んでいることを
特徴としている：前記細胞を前記抗原分子および光増感剤と接触させ、前記分子および前記増感
剤をそれぞれ前記細胞の細胞内の膜で区切られたコンパートメントにそれぞれ取
り込む段階、および前記細胞を、光増感剤を活性化させるのに効果的な波長の光で照射し、当該細
胞を殺すことなく、当該細胞内コンパートメントの膜を破壊し、前記分子を細胞
質ゾル中に放出させ、その後、当該放出された抗原分子またはその一部が該細胞の表面上に提示され
る段階。

【００１３】本明細書で使用しているように、”破壊された”コンパートメントとは、中に
含まれている抗原分子を放出させるのに充分なほど、永久的にまたは一時的にそ
のコンパートメントの膜の構築を破壊することをいう。別の観点からみると、本発明の当該側面は、また、好ましくは免疫応答を刺激
するために、細胞の表面に抗原分子またはその一部を発現させる際に使用する組
成物であって、抗原分子および光増感剤を含む組成物を提供するものである。当
該組成物は、医薬品基準に合っていることが好ましく、また、医薬品基準に合っ
た賦形剤あるいは希釈液をも含んでいることが好ましい。

【００１４】さらなる面では、本発明はまた、免疫応答を刺激するために、細胞表面に前記
抗原分子またはその一部を発現させる際に使用する薬剤の調製における、抗原分
子および光増感剤の用途を提供するものである。本発明のよりさらなる面は、好ましくは免疫応答を刺激するために、細胞表面
に、前記抗原またはその一部を発現させる際に、同時に、別々にまたは連続的に
使用するための製剤の組み合わせとして、抗原分子および光増感剤を含む製品を
提供するものである。

【００１５】本発明のもう一つの面は、細胞の表面に抗原分子またはその一部を発現させる
際に使用するためのキットであって、前記抗原分子を含む第一の容器、および光増感剤を含む第二の容器を含むキットを提供するものである。

【００１６】本発明においては、抗原分子は、適切な様式で免疫系に提示された時に、当該
分子またはその一部が免疫応答を刺激し得るものであれば、どのような分子であ
ってもよい。したがって、好適には、抗原分子は、たとえばポリペプチドを含む
存在物などの、ワクチン抗原またはワクチン成分であろう。多くのこのような抗原または抗原性ワクチン成分が、当該分野で知られており
、たとえば、すべての種類の細菌性またはウイルス性抗原、あるいは、さらに、
原生動物またはより高等な生物を含む任意の病原種の抗原または抗原成分が挙げ
られる。

【００１７】一方、従来より、ワクチンの抗原成分は、生物全体（生きているか、死んでい
るか、減毒されているかを問わない）からなり、すなわち、全細胞ワクチンであ
るが、さらには、サブユニットワクチン、すなわち、生物の特定抗原成分、具体
的には、タンパク質またはペプチド、あるいは炭水化物でさえも主成分とするワ
クチンが、広く研究され、文献に報告されている。このような”サブユニット”
系ワクチン成分のいずれかを、本発明の抗原分子として用いてもよい。しかしな
がら、本発明は、特にペプチドワクチンの分野に有用性を見出している。したが
って、本発明によれば、抗原分子としては、ペプチドが好ましい（本明細書では
、ペプチドとして、長さのより短いものとより長いものの両方、すなわち、ペプ
チド、オリゴペプチド、またはポリペプチド、並びに、タンパク質分子またはそ
の断片であって、具体的には、5〜500、より具体的には、10〜250、たとえば、1
5〜75または8〜25のアミノ酸からなるペプチドなどを包含するように定義される
）。提示されまたは発現されている抗原分子の一部は、好ましくは、細胞内の抗
原処理機構によって発生する部分を含む。しかしながら、該部分は、適切な抗原
設計（例：pH感受性バンド）または他の細胞処理手段を通じて達成されるような
別の手段によって発生させられてもよい。一般に、そのような部分は、免疫応答
を生じるのに充分な大きさである、例えば、5より大きいペプチドの場合、ある
いは例えば、大きさが10または20のアミノ酸より大きい場合である。

【００１８】たとえば、AIDS/HIV感染またはインフルエンザ、イヌ由来パルボウイルス、ウ
シ由来白血病ウイルス、肝炎などのようなウイルス性疾患および感染の処置では
、多数のペプチドワクチン候補が、文献に提案されている（例：Phanuphakら、A
sian Pac. J. Allergy. Immunol. 1997, 15(1), 41-8; Naruse, Hokkaido Igaku
Zasshi 1994, 69(4), 811-20; Casalら、J. Virol., 1995, 69(11), 7274-7; B
elyakovら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95(4), 1709-14; Naruseら、P
roc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91(20), 9588-92; Kabeyaら、Vaccine 1996
, 14(12), 1118-22; Itohら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83(23), 917
4-8）。実際には、他の生物または種由来のペプチド抗原を用いてもいいように
、同様に、細菌のペプチドを用いてもよい。

【００１９】病原性生物に由来する抗原に加えて、ペプチドもまた、ガンまたは多発性硬化
症のような他の疾患に対するワクチンとして使用することが提案されている。た
とえば、突然変異性ガン遺伝子のペプチドは、細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激する
際、抗原を演じるガンワクチンとして、多大な有望性を有している（Schirrmach
er, Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 1995, 121, 443-451;
Curtis Cancer Chemotherapy and Biological Response Modifiers, 1997, 17,
316-327）。合成ペプチドワクチンもまた、転移性黒色腫治療に評価されている
（Rosenbergら、Nat. Med. 1998, 4(3), 321-7）。多発性硬化症の治療のための
Ｔ細胞受容体ペプチドワクチンが、Wilsonら、J. Neuroimmunol. 1997, 76(1-2)
, 15-28に記載されている。実際に、文献中にペプチドワクチンとして記載また
は提案されているペプチドのいずれも用いてもいいように、このようなペプチド
ワクチン成分のいずれかを、本発明の抗原分子として使用してもよい。したがっ
て、ペプチドは、合成されたものでも、または単離されたものでも、あるいは生
物由来の他の方法によるものであってもよい。

【００２０】本発明の方法、使用などに用いられる細胞は、細胞質ゾルに投入され、移送さ
れた分子を細胞表面に発現し、あるいは提示し得る細胞であればいかなるもので
もよい。本発明の第一の有用性は、抗原提示またはワクチン接種にあるため、細胞は、
免疫エフェクター細胞、すなわち、免疫応答に関与する細胞であることが好まし
い。しかしながら、他の細胞もまた、免疫系に抗原を提示する場合もあり、これ
らも、本発明の範囲に含まれる。

【００２１】したがって、本発明の細胞は、抗原提示細胞であることが好ましい。抗原提示
細胞は、体液性および細胞媒介免疫の両方を含む免疫応答のいかなる局面、また
は“戦力（arm）”、具体的には、抗体産生の刺激、あるいは細胞毒性または傷
害性細胞の刺激に関わっていてもよい。これにより、“外来”抗原を細胞表面に
発現する細胞を認識しかつ破壊（または、その他の方法で排除）し得るであろう
。したがって、“免疫応答を刺激する”という用語は、それらを刺激するための
あらゆる種類の免疫応答およびメカニズムを包含している。

【００２２】細胞傷害性の細胞または抗体産生細胞の刺激は、抗原提示細胞により特定の方
法で刺激される細胞に、抗原が提示されること、たとえば、MHCクラスIの提示を
必要とする（例：CD8^-細胞傷害性T細胞の活性化は、MHC-I抗原提示を必要とする
）。抗原提示細胞は、当該分野で知られており、また、文献に記載されていて、た
とえば、リンパ球（T細胞およびB細胞の両方）、樹状細胞、マクロファージなど
が挙げられる。その他には、たとえば、黒色腫細胞などのガン細胞が挙げられる
。

【００２３】抗原提示細胞による細胞傷害性T細胞（CTL）への抗原提示のためには、抗原分
子は、抗原提示細胞の細胞質ゾルに入ることを必要とする（Germain, Cell, 199
4, 76, 287-299）。本発明は、抗原分子の細胞質ゾルへの効率的な送達方法を提
供するものである。抗原分子は、光化学的インターナリゼーション処理により細胞質ゾルに放出さ
れると直ぐに、細胞の抗原処理機構により処理され、たとえば、MHCクラスIによ
り適当な方法で細胞表面に提示されるだろう。この処理は、抗原の分解、たとえ
ば、タンパク質またはポリペプチド抗原のペプチドへの分解を含んでおり、その
ペプチドは、提示のためにMHCの分子と複合体を形成する。したがって、本発明
により細胞表面に発現されまたは提示される抗原分子は、内在化（エンドサイト
ーシス）される抗原分子の一部または断片であってもよい。

【００２４】抗原は、抗原提示細胞によるエンドサイトーシスにより取り込まれ、エンドサ
イトーシス小胞（endocytic vesicles）中でペプチドに分解されてもよい。これ
らのペプチドは、エンドソーム中で、MHCクラスII分子に結合し、細胞表面に移
送されるが、そこで、ペプチド−MHCクラスII複合体は、CD⁴⁺ヘルパーT細胞によ
り認識され、免疫応答が誘発されるだろう。あるいは、細胞質ゾル中にあるタン
パク質は、たとえばプロテアソームにより分解され、TAP（抗原提示に関係する
輸送体）の手段によって、小胞体中に移送されてもよく、さらに、そこでペプチ
ドはMHCクラスI分子に結合し、図１に図示したように細胞表面に移送されるに違
いない（YewdellおよびBennink、1992, Adv. Immunol. 52: 1-123）。もし、ペ
プチドが外来抗原起源のものであるならば、ペプチド−MHCクラスI複合体はCD8+
細胞傷害性T細胞（CTL）により認識されるであろう。CTLは、ペプチド−MHC（HL
A）クラスI複合体に結合し、それによって活性化され、増殖を開始し、CTLのク
ローンを形成するであろう。標的細胞および細胞表面に同一のペプチド−MHCク
ラスI複合体を有する他の標的細胞は、CTLクローンにより殺される。もし、充分
な量の抗原が細胞質ゾルに導入され得る場合は、外来性抗原に対する免疫が、確
立されることになる（YewdellおよびBennink、1992, 上記；Rock, 1996, Immuno
logy Today 17: 131-137）。これが、とりわけガンワクチンの開発の基礎となる
。最も実際的な問題のうちの一つは、充分な量の抗原（または抗原の一部）を細
胞質ゾルに導入することである。これは、本発明では、PCIにより解決すること
ができる。この原理は、図１に図示されており、図１は、どのようにしてPCIが
利用され、CTLを刺激するかを示している。ペプチドまたはタンパク質（P）は、
抗原提示細胞へ細胞外より適用される。Pは、PCIによりエンドサイトーシスされ
、細胞質ゾル中に放出される。その後、ペプチドまたはタンパク質は、プロテア
ソームにより、部分的に分解され、MHC（HLA）クラスIと複合体を形成したまま
、細胞表面に移送されるであろう。そこで、複合体は、CTLにより認識され得る
。

【００２５】後述の実施例でより詳細に記載されているように、本発明によれは、光化学的
インターナリゼーションは、ガン特異的ペプチドの細胞質ゾルへの送達のために
効果的に使用され得ることが示されている。抗原分子および／または光増感剤は、標的薬剤、具体的には標的に特異的な送
達系または担体系、あるいは担体分子を使用することにより、特定の細胞または
組織に向けることができる。したがって、たとえば、抗原分子および／または光
増感剤をベクターまたは担体系、具体的には再構成されたLDL−粒子を用いて、
細胞に送達することができる。担体分子は、抗原分子、光増感剤または両方に結
合され、または複合化されてもよく、また、同一または異なる担体分子を用いて
もよい。抗原分子および／または光増感剤もまた、部位を標的にするリガンド、
たとえば、特定の細胞タイプまたは特定の細胞構造に特異的なリガンド、具体的
にはある細胞タイプに発現される表面抗原、たとえば腫瘍に特異的な抗原を認識
する抗体、に結合していてもよい。このようなメカニズムは、受容体に媒介され
るエンドサイトーシスによる光増感剤および／または抗原分子の取り込みを増加
させるように作用してもよい。抗原分子および／または光増感剤を細胞内コンパ
ートメントに運ぶために、このような標的分子の担体またはベクターが用いられ
てもよい。

【００２６】細胞内の膜により限定されたコンパートメントは、細胞内にあるコンパートメ
ントであればいずれであってもよい。好ましくは、該コンパートメントは膜性の
小胞、特にエンドソームもしくはリソソームであろう。しかし、該細胞内コンパ
ートメントは、ゴルジ装置または小胞体を含むこともできる。要件とされること
は、抗原分子と光増感剤が同一の細胞内コンパートメントを探し当てることであ
る。

【００２７】光化学的インターナリゼーション処理はWO96／07432（参照により本明細書の
一部をなす内容）にさらに詳細に記載されている。PDTの方法もまた、今では文
献に広く記載されている。本発明によって使用される光増感剤は、細胞内コンパートメント、とりわけエ
ンドソームもしくはリソソームに局在化するものであれば何でもよい。そのよう
な光増感剤の範囲は当業界で知られており、WO96／07432を含む文献に記載され
ている。この点につき、培養細胞のエンドソームもしくはリソソームの位置を突
き止めることが示されているジ‐およびテトラスルホン化アルミニウムフタロシ
アニン、スルホン化テトラフェニルポルフィリン（TPPS_n）、ナイルブルー、ク
ロリンｅ₆誘導体、ウロポルフィリンI、フィロエリスリン、ヘマトポルフィリン
およびメチレンブルーを挙げることができる。これはほとんどの場合、エンドサ
イトーシス活性によるものである。

【００２８】したがって言及すべき適切な光増感剤の種類は、ポルフィリン、フタロシアニ
ン、プルプリン、クロリン、ベンゾポルフィリン、ナフタロシアニン、陽イオン
性色素、テトラサイクリンおよびリソソーム向性の弱塩基またはそれらの誘導体
を含むものである（Bergら、 Photochemistry and Photobiology, 1997, 65, 40
3-409）。

【００２９】好ましい光増感剤はTPPS₄（Zabnerら、 J.Biol.Chem., 1995, 270, 18997- 19
007）、ＴＰＰＳ_2aおよびAlPcS_2aを含むものである。本発明による光化学的インターナリゼーション過程は、当業界ではよく知られ
、標準的であるＰＤＴ法およびこの方法において有効である技術の適切な変法を
使用して行なうことができる。かくしてPDTの技術分野で公知である手法および
手段により、抗原分子および光増感剤を適用または投与することにより細胞に導
入することができる。

【００３０】本発明の方法は、同所発生部位での処置または生体外での処置のいずれかによ
りインビトロもしくはインビボで使用してもよく、続いて処理した細胞を投与さ
れる。したがって、本発明のもうひとつの面は、表面で抗原分子またはその一部分を
発現している抗原提示細胞を提供することであり、本明細書の先に定義した方法
によりそのような細胞を得ることが可能である（得られる）。本発明の別の面は
、そうした細胞の集団または培養株、特にそのような細胞の活きた機能的に完全
である集団または培養株ならびに治療上、具体的には免疫応答を刺激するための
、とりわけCTLを刺激するための、そうした細胞（または細胞の集団もしくは培
養株）の使用を提供する。

【００３１】免疫応答を刺激するための、特にCTL細胞を刺激するための治療薬（たとえば
ワクチン組成物）を調製するためにそうした細胞（または細胞の集団もしくは培
養株）の利用もまた提供する。インビボでは、当業界で通常のあるいは標準的である任意の投与方式を使用し
てもよく、たとえば注射、点滴、体内の表面または体外の表面へのいずれの局部
投与などがある。インビボでの使用では、固形の組織のみならず体液中にあるも
のを含め、標的細胞を含むいずれの組織に関しても本発明を使用することができ
る。光増感剤が標的細胞により取り込まれかつ光が適切に届くかぎり、あらゆる
組織を処置することができる。

【００３２】したがって、本発明の組成物は製剤技術において知られた技法および操作に従
い、たとえば製剤上許容される一以上の担体または賦形剤を使用して、任意の好
都合な方式で処方することができる。組成物、担体もしくは賦形物質の特性、用
量などは、投与の選択と所望する経路、ワクチン投与の目的などに応じて常法的
に選択することができる。同様に用量は常法的に決定してもよく、抗原分子の特
性、ワクチン投与の目的、患者の年齢、投与方法などに依存するであろう。その
際、光増感剤に関連して、照射により細胞膜が破壊される潜在性／作用力もまた
考慮に入れられるべきである。

【００３３】光増感剤を活性化するための光照射段階もまた当業界でよく知られた技術およ
び操作に従って行われるだろう。たとえば光の波長および強度は、使用する光増
感剤によって選択されるであろう。適切な光源は当業界ではよく知られている。すでに述べたようにそしてWO96／０７４３２に記載されたように、このような
方法において光化学的インターナリゼーションは、細胞の生存性および機能に対
して有害に作用しないことが見出されている。特に本発明の方法に従って、複数
の細胞または細胞の集団が処置されたとき、その処置で大多数の細胞は殺される
ことなく生き延び、実質的に機能が完全であることが見出されている。

【００３４】本明細書では、「細胞を殺すことなく」なる用語は、そうした状況を定義する
ことを意図するものである。換言すると複数の細胞または細胞の集団、あるいは
実質上すべての細胞、あるいは著しく大多数（具体的には、細胞の少なくとも７
５％、より好ましくは少なくとも８０，８５，９０もしくは９５％）が殺されな
いですむことである。

【００３５】明らかに複数の細胞または細胞の集団への光照射を取り扱う場合、細胞の特定
グループまたは組織の特定部分が、細胞の他のグループまたは組織の他の部分よ
りも多い光を受けたり、あるいは何らかの方法で、より大きいPCI効果を受けた
りすることはありうる。したがって、細胞の生存について与えられたパーセンテ
ージの値は、照射された集団全体にわたって必ずしも一様である必要はなく、当
該値は照射された集団に残り生存している細胞のパーセントを指すこととなる。
その要件は、照射された細胞のうち充分な割合が生存することだけである。加え
て、照射により誘導される細胞死はある時間を要し、たとえばそれが起こるのに
長時間を要するなどである。この場合、最後は死ぬ細胞もまた本発明の方法に従
ってその表面に抗原性の分子を発現することができることは認められ得ることで
あり、したがって本発明の方法、利用などが関わり得ることとなる。かくして「
％細胞死」は、照射の数時間内（たとえば照射後、４時間まで）に生存したまま
の細胞のパーセントを意味するが、より好ましくは照射して４時間以上してから
の「生存細胞％」を言及する。

【００３６】本発明の方法は、光増感剤の濃度に関連して光量を選択することにより、生存
する細胞の比率または割合を調整するように修飾することもできる。またそのよ
うな技法は、当業界では公知である。本発明は、極めて多様な抗原分子を送達する効率的な手段を提供する。本発明
は、該手段をワクチン送達の道具として特に好適なものとするいくつかの特徴を
有する。1)送達する分子が、標的細胞によりエンドサイトーシスをされ得るかぎ
りそのサイズに制限を付さない。2)それは、細胞の増殖に依存しない。3)光に曝
される部分のみが影響を受ける意味において部位特異的である。4)腫瘍形成性で
はない。さらに、光化学的インターナリゼーションは、部位特異的または組織特
異的な薬物作用を生じさせるための他の原理と組み合わされる可能性を有する。
たとえば細胞表面の構造に対する特異的なリガンドを使用することによる標的化
、組織特異性を付与する調節遺伝子エレメントを利用すること、疾患特異的な薬
剤の使用などである。これにより標的細胞に対する薬物の特異性に実質的に相乗
的効果を得る可能性を切り開くこととなる。

【００３７】本発明を、添付した図の参照しつつ限定されない次の実施例においてさらに詳
細に記載することとする。

【００３８】

【実施例】材料および方法照射 2つの異なる光源を細胞の処理のために用いた。いずれも４個の蛍光管列から
なる。TPPS₄、TPPS_2a、および3-THPP（ポルフィリンプロダクツ、ローガン、UT
）で処理された細胞を、1.5mW/cm²の細胞に到達する光強度で青色光（モデル302
6；アップライドフォトフィジックス社、ロンドン、UK）に曝し、一方，AlPcS_2a （ポルフィリンプロダクツ、ローガン、UT）で処理された細胞は1.35mW/cm²の細
胞に到達する光強度で、シネモイド（Cinemoid）35フィルターを通した赤色光（
フィリップス社TL20W/09）に曝した。蛍光顕微鏡 Berg.K.,ら Biochem. Biophys. Acta., 1370:317-324,1998に記載された蛍光
顕微鏡により細胞を分析した。フルオレセイン標識分子の分析のため、顕微鏡に
450-490nm励起フィルター、510nm二色光線スプリッターおよび510-540nmバンド
パス発光フィルターを装備した。プラスミド−ｐLys複合体の調製および細胞の処理プラスミド−ｐLys複合体（チャージ比1.7）は、HBS 75 μlにあるプラスミド
（pEGFP-N1;クローンテックラボラトリーズ社、パロアルト、CA）5μgとHBS 75
μl中のｐLys（MW 20,700; シグマ社、セントルイス、MO）5.3μgとを温和に混
ぜることにより調製した。溶液は室温で30分間インキュベートし、培養培地で希
釈して細胞に加えた。

【００３９】 THX細胞は、37℃で18時間 AlPcS_2a20μg/mlとインキュベートし、洗浄して
さらに3時間、増感剤フリーの培地にインキュベートしてから2時間、プラスミド
−pLys複合体とインキュベートした。 pEGFP-N1／ｐLys処理THX細胞は、一度洗浄してから光に照射する前に添加物の
ない培養培地で２時間インキュベートした。細胞は、フローサイトメトリーによ
るGFP発現の分析の前に、2日間３７℃でインキュベートして継代培養し、さらに
５日間インキュベートした。

【００４０】 HCT-116細胞は、AlPcS_2a20μg/mlで18時間インキュベートし洗浄して、次い
で光照射前にプラスミドフリー培地でプラスミド-pLys複合体を用いて６時間ト
ランスフェクションした。37℃における40時間のインキュベーション後、GFP発
現を顕微鏡で調べた。フローサイトメトリー分析細胞は、トリプシン処理をして遠心分離後、400μlの培養培地に再懸濁して50
μmメッシュのナイロンフィルターを通して濾過した。その後これらの細胞をFAC
Star付きフローサイトメーター（ベクトン・ディキンソン社）で分析した。488n
mに調整したアルゴンレーザー（200mW）で励起後、510-530nmフィルターを通し
て、緑色蛍光タンパク質（GFP）を測定した。351-356nmに調整したクリプトンレ
ーザー（50mW）で励起した後、650nmロングパス・フィルターを通して、AlPcS_2a を測定した。二組の細胞は、GFP蛍光シグナルのパルス幅をゲート調整すること
により単一の細胞から区別された。データはPCライシス（Lysys）IIソフトウェ
ア（ベクトン・ディキンソン社）で解析された。フルオレセイン−ペプチドの調製および細胞の処理フルオレセイン標識ペプチドVal¹²-p21^ras（残基5〜21）がAlan Cuthbertson
（ニコムドアマーシャム社）により合成され、提供された。

【００４１】 BL2-G-E6細胞を、フルオレセイン標識p21^ras由来ペプチド、30μg／mlで18時
間インキュベートし、次いで18時間、AlPcS_2a 20μg／mlにそして赤色光に曝す
前に薬物フリーの培地中で１時間インキュベートした。

【００４２】

【実施例１】光化学的インターナリゼーション（PCI）はペプチドが細胞の細胞質ゾルに入る
ことができるようにするために用いることができるガンに特異的なペプチドの細胞質ゾルへの送達についてPCIを評価するために
、残基5〜21を包含しVal¹²変異（G12V）を含むフルオレセイン標識p21^rasペプチ
ドが用いられた(Gjertsen,M.K.,ら Int. J. Cancer, 72:784-790,1997)。BL2-6-
E6マウス線維芽細胞において、rasペプチドはAlPcS_2aと良好にともに局在化し
た。このことは該ペプチドのエンドサイトーシスを示している（図２）。光に4
分曝した後、フルオレセイン標識rasペプチドおよびAlPcS_2aが細胞質内に拡散
的に局在化していることがわかった。類似の効果はフルオレセイン標識rasペプ
チドおよび光にのみ曝された細胞では観察されなかった（データは示さず）。

【００４３】

【実施例２】抗原提示ならびにCD8⁺Tリンパ球媒介の細胞殺生を誘導するためのPCIの使用 10%牛胎児血清（FCS）を含むRPMI1640培地で生育させ、MART-1ペプチドを発現
していないFM３黒色腫細胞（6ウェルプレートに2×10⁵/ウェル存在）を、光増感
剤AlPcS_2a10μg／mlで18時間処理した。次いで該細胞はダルベッコのリン酸緩
衝化生理食塩水（PBS）においてEDTA（0.1M）で基質から解離させ、100％FCS中
で1時間、⁵¹Cr（60 μCi/ml Na₂CrO₄）を細胞に負荷をかけている間、該細胞を
溶液内にとどめ、つぎに10%FCSにおいてRPMI1640中のMART-1ペプチド5μg／mlで
５時間インキュベートし、該細胞はそのまま溶液内にとどめた。MART-1ペプチド
の配列は次の通りである：TAEEAAGIGILTVILG。その後、細胞は10%FCSを含むRPMI
1640培地で2回洗浄し、96ウェルプレートに播種した（100μl の培地(RPMI1640/
10%FCS）中に、2000/ ウェル)。細胞はつぎに1.35mW/cm²の細胞に到達する光強
度で、シネモイド（Cinemoid）35フィルターを通して光（フィリップス社TL20W/
09）に図３に表示する回数だけ曝した（Rodalら、1998, J.Photochem. Photobi
ol. B:Biol. 45:150-9)）。光に曝して18時間後、培地を除去して細胞傷害性T
リンパ球（100μlにCTLを40,000/ウェル加えた）に特異的なMART-1／HLA-A2を含
む培地を加えた。4時間のインキュベーション後、培地をFM3細胞から分離し、培
地に遊離した⁵¹Cr を（溶解した細胞の指標として）カウントするほか、前に記
載したようにして自発的な最大の遊離もカウントした（Fossumら, 1995, Cancer
Immunol. immunother.40:165-172）。特異的なクロム遊離のパーセンテージを
次式により算出した：（実験的遊離―自発的遊離）／（最大遊離―自発的遊離）×100 図３に示す結果からわかるように、FM3細胞は、上に概略を示したようにMART-1
ペプチドのPCIの後、光依存性のCD8⁺Tリンパ球の細胞障害に対する感受性を示す
。

【００４４】

【実施例３】PCIは細胞内に取り込まれた分子の大部分の放出を誘導するこのことは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）のPCI誘導インターナリゼー
ション/エンドサイトーシスにより示された。 HRPを使用することにより、PCIが、細胞内にエンドサイトーシスされたＨＲＰ
の大部分（>60%）が細胞質ゾルに放出することを促進することが示される（図４
を参照）この実験において、NHIK3025細胞（ヒト頚部からの該部位の腫瘍細胞）は、光
増感剤TPPS_2a（3.2μg／ml）およびHRP １mg／mlにより18時間処理された。次
いで図４に示された光量に曝す前に、培地を薬物フリーの培地と交換した。HRP
活性をSteinmanら、J.Cell Biol.,68:665-687,1976に記載された操作に従って測
定した。細胞質ゾルは、細胞質ゾルフリー細胞残骸からエレクトロポレーション
ならびに密度遠心分離技術により分離された（Bergら、Int. J. Cancer 59:814-
822,1994）。

【００４５】

【実施例４】PCIは機能遺伝子の送達を促進するために用い得るこれを示すためTHX細胞は、緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードするプラスミ
ド（pEGFP-N1）のpLys複合体とトランスフェクションされた。 GFPの発現は、フローサイトメトリー（図５、aおよびb）および蛍光顕微鏡（デ
ータは示さず）により分析された。図５aから明らかなように、AlPcS_2aと光と
の処理は、GFPを発現している細胞の割合において強い増加をもたらした。この
レポーター分子に陽性である細胞の割合は、光処理がない場合の１％から5分の
光に曝した後には50%に増加した。光増感剤のないときにｐEGFP−ｐLysで処理さ
れた細胞では、GFP発現は光による強化はなかった。無関係なプラスミド（ヘム
オキシゲナーゼをコードする）とpLysとの複合体は、AlPcS_2aと光とを併せた
場合でも、緑色蛍光を誘導しなかった（データは示さず）。それゆえ光−導入方
法において、PCIは機能遺伝子をTHX細胞にトランスフェクションする効率を実質
的に上昇させることができる。同様の結果は、光増感剤としてTPPS_2aを用い、BH
K-21およびHCT-116を標的細胞として用いた場合にも得られた（データは示さず
）。本質的に非リソソーム的に局在化する光増感剤3−THPPは、GFP発現について
僅かな増加しか誘導しなかった（図５b）。ｐLysと複合体を形成しないｐEGFP-N
1のPCIは、GFPの発現を誘導しなかった（データは示さず）。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＣＴＬ細胞を刺激するためにＰＣＩがどう用いられるかを示
す模式的な図である。抗原提示細胞にペプチドまたはタンパク質（Ｐ）が細胞外
から適用される。Ｐは、ＰＣＩにより細胞内に取り込まれ細胞質ゾルに放出され
る。その後そのペプチドまたはタンパク質はプロテアソームにより部分的に分解
され、ＭＨＣ（ＨＬＡ）クラスＩと複合体を形成して細胞表面に輸送される。そ
こで該複合体はＣＴＬ細胞により認識される。

【図２】図２は、光化学的に誘導されるペプチドの再局在化を示す。ＢＬ２−
Ｇ−Ｅ６細胞は、フルオレセイン標識ｐ２１^ras−由来5-21、Val¹²ペプチドおよ
びAlPcS_2aとインキュベートされた。細胞は、赤色光に4分間照射する前（上パネ
ル）およびその30分後（下パネル）に、蛍光顕微鏡によりフルオレセイン−ペプ
チドおよびAlPcS_2aの局在化について調べられた。横線は20μmを示す。

【図３】図３は、MART-1ペプチドのＰＣＩ後における、FM3黒色腫細胞に対す
るCD8⁺ Tリンパ球クローンによる細胞傷害作用を示す。

【図４】図４は、HRPを細胞質ゾルに送達するPCIの能力を示す。NHIK3025細胞
をTPPS_2a3.2μg/mlおよびHRP 1mg/mlで18時間処理した。その培地を指定の光投
与量に曝す前に薬物を含まない培地に交換した。HRP活性は、完全な細胞（○）
およびエレクトロポレーションならびに密度遠心分離技術により細胞質ゾルフリ
ー細胞残骸（▼）から分離された細胞質ゾル（●）について測定した。

【図５】図５は、光化学的に誘導されたGFPの発現を示す。 a. AlPcS_2a および光がない場合またはAlPcS_2aが存在する場合に、pEGFP-N1-p
Lys複合体で処理し、次いで図に示される光に曝したときのTHX細胞でのGFPの発
現を示す。細胞はフローサイトメトリーにより分析され、GFP発現に陽性である
として描かれた線の右側にある細胞を計数した。 b. 18時間、光増感剤（20μg/ml AlPcS_2aまたは0.25μg/ml 3-THPP）で処理
し、次いでpEGFP-N1-pLys複合体で６時間トランスフェクションをしてさらに細
胞の５０％を不活性化させる光露出をしたTHX細胞でのGFP発現を示す。GFP発現
はa.のようにフローサイトメトリーにより分析した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 31/12 35/00 35/00 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者プラスミケイトリーナノールウェーエヌ−0280 オスロセントエドモンスフェイ 39ディーＦターム(参考） 4C076 CC27 CC35 DD60 4C085 AA03 BB11 CC22 4C087 AA01 BB33 BB63 NA14 ZB26 ZB33

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】光化学的インターナリゼーションにより、抗原分子を細胞質ゾルに導入する段
階を含み、続いて当該分子またはその一部が当該細胞表面上に提示されることを
特徴とする抗原分子またはその一部を細胞表面上に発現させる方法。
【請求項２】上記細胞を上記抗原分子またはその一部ならびに光増感剤と接触させ、当該分
子および当該増感剤をそれぞれ該細胞の細胞内の膜で区切られたコンパートメン
トに取り込み、当該細胞を、光増感剤を活性化するのに効果的な波長の光で照射し、細胞を殺
すことなく、当該細胞内コンパートメントの膜を破壊し該分子を細胞質ゾルに放
出させ、当該放出された抗原分子またはその一部が続いて該細胞の表面に提示されるこ
とを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記抗原分子が免疫応答を刺激し得る分子であることを特徴とする請求項１ま
たは２に記載の方法。
【請求項４】前記抗原分子がワクチン抗原またはワクチン成分であることを特徴とする請求
項３に記載の方法。
【請求項５】前記抗原分子がペプチドであることを特徴とする先行する請求項のいずれかに
記載の方法。
【請求項６】前記細胞が、リンパ球、樹枝状細胞、マクロファージ、およびガン細胞からな
る群より選ばれる抗原提示細胞であることを特徴とする先行する請求項のいずれ
かに記載の方法。
【請求項７】前記光増感剤が、ポルフィリン、フタロシアニン、プルプリン、クロリン、ベ
ンゾポルフィリン、ナフタロシアニン、陽イオン性色素、テトラサイクリンおよ
びリソソーム向性の弱塩基またはその誘導体からなる群より選ばれることを特徴
とする先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】前記光増感剤が、TPPS₄、TPPS_2a、またはAlPcS_2aであることを特徴とする請求
項７に記載の方法。
【請求項９】抗原分子および／または光増感剤が、一以上の標的薬物または担体分子に結合
されていることを特徴とする先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】前記方法がインビボまたはインビトロで実施されることを特徴とする先行する
請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】抗原提示により免疫応答が刺激されることを特徴とする先行する請求項のいず
れかに記載の方法。
【請求項１２】先行する請求項のいずれか一つに記載されている方法を含むワクチン接種方法
。
【請求項１３】細胞の表面に、抗原分子またはその一部を発現させる際に使用する組成物であ
って、請求項１〜５または請求項９のいずれか１つに記載の抗原分子および請求
項２または７〜９のいずれか１つに記載の増感剤を含むことを特徴とする組成物
。
【請求項１４】請求項１〜１２のいずれか１つに記載の方法により得られ得るものであって、
抗原分子またはその一部を細胞表面に発現させる細胞、またはそれらの集団。
【請求項１５】治療において用いられることを特徴とする請求項１３に記載の組成物または請
求項１４に記載の細胞集団。
【請求項１６】前記抗原分子またはその一部を細胞の表面に発現させて免疫応答を刺激する際
に使用するための、またはCTLを刺激するための薬剤を調製する際における先行
する請求項のいずれかに記載の抗原分子および光増感剤の使用。
【請求項１７】免疫応答を刺激するための、またはCTLを刺激するための薬剤を調製するため
の請求項１４に記載の細胞集団の使用。
【請求項１８】前記薬剤がワクチン接種に使用されることを特徴とする請求項１６または１７
に記載の使用。
【請求項１９】前記薬剤が、ウイルス性疾患、ガン、または多発性硬化症の治療に使用される
ことを特徴とする請求項１６〜１８のいずれか１つに記載の使用。
【請求項２０】前記抗原分子またはその一部を細胞の表面に発現させる際に、同時に、別々に
または連続的に使用するための製剤の組み合わせとして、請求項１〜５または請
求項９のいずれか１つに記載の抗原分子および請求項２または請求項７〜９のい
ずれか１つに記載の光増感剤を含むことを特徴とする製品。
【請求項２１】抗原分子またはその一部を細胞の表面上に発現する際に使用されるキットであ
って、請求項１〜５または請求項９のいずれか１つに記載の抗原分子を含む第一の容
器；および請求項２または請求項７〜９のいずれか１つに記載の光増感剤を含む第二の容
器を含むことを特徴とするキット。