KR100769113B1 - 광화학적 내부이행을 통해 항원 제시 세포의 표면상에항원을 발현시키는 방법 - Google Patents
광화학적 내부이행을 통해 항원 제시 세포의 표면상에항원을 발현시키는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항원분자를 광화학적 내부이행에 의해서 세포 사이토졸 내로 도입시키고, 이어서 이 항원분자 또는 그의 일부분을 세포의 표면 상에 제시되도록 하는 단계를 포함함을 특징으로하여, 항원분자 또는 그의 일부분을 항원 제시 세포의 표면상에 발현시키는 방법을 제공한다. 이 방법을 포함하는 백신접종방법도 이 세포를 함유하는 조성물 및 항원분자를 발현하는 세포와 연관된 용도와 함께 제공된다.
항원, 항원 제시, 사이토졸, 광화학적 내부이행, 세포독성, 발현, 백신, 광감작제, 면역반응
Description
본 발명은 광역학 치료법 (photodynamic treatment; PDT)을 이용하여 세포 내로 백신성분을 도입시켜 항원제시 (antigen presentation)를 획득하도록 하는 백신접종 (vaccination) 방법 및 이러한 방법에서 유용한 백신 조성물에 관한 것이다.
대부분의 분자들은 세포막을 용이하게 투과하지 못한다. 분자를 생세포의 사이토졸에 도입시키는 방법은 생물학적 과정을 조작하고 연구하는데 유용한 도구이다. 오늘날 가장 통상적으로 이용되는 방법에는 미량주사, 적혈구 고스트-매개된 융합 (fusion) 및 리포좀 융합, 피노솜 (pinosome)의 삼투성 용해, 스크레이프 로딩 (scrape loading), 일렉트로포레이션 (electroporation), 인산칼슘 및 바이러스-매개된 트랜스펙션 (transfection)이 있다. 이들 기술은 대부분의 경우에 비실용적이고 시간이 걸리며 비효율적이거나, 상당한 세포사를 야기시킬 수 있지만, 이들은 배양물 중의 세포를 조사하는데 유용하다. 따라서, 이러한 기술은 세포가 생육가능하고/하거나 기능적인 상태로 유지되는 것이 필요한 생물학적 또는 의학적 연구에서 또는 치료방법에서 사용하는데 최선의 것은 아니다.
포르피린 및 그밖의 다수의 다른 광감작성 화합물이 세포 및 조직에 대하여 세포독성 효과를 유도할 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 이들 효과는, 광감작성 화합물을 광선에 대해 노출시키면 독성이 될 수 있거나, 세포 및 세포구조물의 막을 포함한 세포성 물질 또는 생체분자를 손상시키는 단일항 (singlet) O 또는 그밖의 다른 산화성 래디칼과 같은 독성물질을 방출시킬 수 있으며, 이러한 세포 또는 막 손상은 결국 세포를 사멸시킬 수 있다는 사실에 근거한 것이다. 이들 효과는 특히 종양성 질병을 포함하는 다양한 비정상 상태 또는 질환의 치료에 이용되어 왔다. 이러한 치료는 광역학적 치료법 (PDT)이라고 부르며, 신체의 상해부위에 광감작제 (광화학요법제)를 투여하고, 이어서 광감작제를 활성화시키고 세포독성 형태로 전환시키기 위해서 광활성화 광선에 노출시킴으로써 상해세포를 사멸시키거나 이들의 증식잠재성을 감소시키는 것을 포함한다. 목적하는 표적부위, 예를 들어 종양 또는 다른 병소에 우선적으로 또는 선택적으로 축적되는 광감작제가 공지되어 있다.
특히 프소랄렌, 포르피린, 클로린 및 프탈로시아닌을 포함하는 다양한 광감작제가 공지되어 있다. 이러한 약물은 광선에 노출시키면 독성으로 된다.
광감작성 약물은 다양한 기전에 의해서 직접적으로 또는 간접적으로 그들의 효과를 나타낼 수 있다. 즉, 예를 들어 특정 광감작제는 광선에 의해서 활성화되면 직접적으로 독성으로 되는 반면에, 다른 것은 세포성 물질 및 지질, 단백질 및 핵산과 같은 생체분자에 대해 매우 파괴적인 독성물질, 예를 들어 단일항 O 또는 그밖의 다른 산소계 자유래디칼과 같은 산화제를 생성시키는 작용을 한다.
포르피린 광감작제는 독성 산소성분의 생성을 통해 간접적으로 작용하며, PDT를 위해서 특히 바람직한 후보물질인 것으로 간주된다. 포르피린은 헴 (heme)의 합성시에 천연적으로 나타나는 전구체이다. 특히, 헴은 효소인 페로킬레이타제 (ferrochelatase)의 작용에 의해서 철 (Fe3+)이 프로토포르피린 IX (Pp) 내에 통합되면 생산된다. Pp는 매우 강력한 광감작제인 반면에 헴은 광감작효과를 갖지 않는다. 다양한 포르피린계 또는 포르피린-관련 광감작제가 본 기술분야에서 공지되어 있으며 문헌에 기술되어 있다.
세포독성효과는 주로 단일항 산소의 형성을 통해서 매개된다. 이 반응성 중간체는 세포내에서 매우 짧은 수명을 갖는다 (< 0.04 μs). 따라서, PDT의 일차적인 세포독성효과는 광선에 노출시키는 동안에 O의 형성부위에 매우 인접해서 일어난다. O는 단백질 (히스티딘, 트립토판, 메티오닌, 시스테인, 티로신), DNA (구아닌), 불포화 지방산 및 콜레스테롤과 반응하여 이들을 산화시킨다. PDT의 잇점 중의 한가지는 광선에 노출되지 않은 조직은 상해를 입지않고 유지된다는 점, 즉 선택적 PDT 효과를 수득할 수 있다는 점이다. 원치않는 세포집단, 예를 들어 종양세포를 파괴하기 위해서 PDT를 사용하는데 관한 광범위한 문헌이 있다. 특허문헌에는 단독으로 사용되거나 표적화제 (targeting agent), 예를 들어 종양세포 수용체 결정인자에 대해 지향되는 면역글로불린과 컨쥬게이트되어 더 세포 특이적인 복합체를 형성하는 다수의 광역학적 화합물이 기술되어 있다. 헤마토포르피린 유도체 와 같은 특정의 광화학적 화합물은 더구나 악성세포에 집중되는 고유의 능력을 갖는다. 이러한 방법 및 화합물은 노르웨이 특허 제 173319호 및 노르웨이 특허출원 제 90 0731, 176 645, 176 947, 180 742, 176 786, 301 981, 30 0499 및 89 1491호에 기술되어 있다.
WO 93/14142에는 항암제, 및 코폴리머성 캐리어에 부착된 광활성화제 (즉, 광감작제)를 함유하는 약물전달시스템이 기술되어 있다. 이 복합체는 투여한 후에 세포흡수작용 (pinocytosis) 또는 식작용 (phagocytosis)에 의해서 세포내로 들어가서 엔도좀 및 라이소좀 내부에 위치한다. 라이소좀 내에서 항종양제와 폴리머 사이의 결합은 가수분해되어 전자는 라이소좀 막을 통해서 사이토졸 내로 수동적으로 확산할 수 있다. 따라서, 이 방법의 유용성은 라이소좀 막을 가로질러서 확산할 수 있는 작은 분자화합물로 제한된다. 확산을 위한 지체시간 (time lag)이 있은 후에, 적절한 파장 및 에너지의 광원을 적용하여 광활성화 화합물을 활성화시킨다. 항암제와 광활성화제의 효과가 합쳐져서 세포를 사멸시킨다.
따라서, 상기에 기술한 바와 같은 그러한 PDT 방법은 세포구조의 파괴를 지시하여 세포사를 유도한다.
한편, WO 96/07432는 막불투과성인 분자를 광범한 세포파괴 또는 세포사를 일으키지 않으면서 세포의 사이토졸 내로 도입시키는 기전으로서 광역학적 효과를 이용하는 방법에 관한 것이다. 이 방법에서, 목적하는 분자는 광감작제와 함께 세포에 있는 세포내 소포 (예를 들어, 라이소좀 또는 엔도좀) 내로 공동-내부이행된다 (더욱 특히는 "세포내이입"된다). 그후 세포를 광활성화성 광선에 노출시켜 광 감작제를 "활성화"시키고, 이 광감작제가 다시 소포막의 붕괴 또는 파열을 야기시켜 목적하는 분자를 포함한 소포 내용물을 세포내부, 즉 사이토졸 내로 방출시킨다. 이러한 방법에서 대부분의 세포의 기능성 또는 생육력은 유해한 영향을 받지 않는 것으로 밝혀졌다. 따라서, "광화학적 내부이행 (internalization)"이라고 불리우는 이러한 방법이 치료제를 포함한 여러가지 상이한 분자들을 사이토졸 내로, 즉 세포의 내부로 수송하는 데 유용한 것으로 제안되었다.
본 발명자들은 이러한 방법이 세포의 내부로 분자를 전달하기 위해서뿐 아니라 세포표면에 이들을 제시하거나 발현시키기 위해서도 유리하게 사용될 수 있음을 밝혀내었다. 따라서, 분자들이 세포 사이토졸 내로 수송되어 방출된 후에 세포의 표면으로 수송될 수 있으며, 여기에서 분자는 세포의 외부에, 즉 세포표면에 제시될 수 있다. 이러한 방법은 면역반응을 유도하거나, 촉진시키거나 또는 증강시키기 위해서 백신성분, 즉 항원 또는 면역원을 해당 세포의 표면 상에 제시하기 위해 세포에 도입시킬 수 있는 백신접종의 분야에서 특별한 유용성을 갖는다.
따라서 가장 일반적인 것으로, 본 발명은 세포, 바람직하게는 항원 제시 세포의 표면 상에 항원분자 또는 그의 일부분을 발현시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 분자를 광화학적 내부이행에 의해서 세포 사이토졸 내로 도입시키고, 이어서 이 분자 또는 그의 일부분이 해당 세포의 표면 상에 제시되도록 하는 것으로 이루어진다.
본 명세서에서 사용된 것으로, "발현" 또는 "제시"는 해당 분자의 적어도 일 부분이 해당 세포 주위의 환경에 노출되어 접근할 수 있도록 세포의 표면상에 분자 또는 그의 일부분이 존재하는 것을 의미한다. 발현시키고자하는 분자가 세포막 및(또는) 상기의 막에 존재하거나 존재하도록 유도될 수 있는 성분과 접촉하고 있는 상태인 "표면" 상에서의 발현이 이루어질 수 있다.
이러한 항원성 제시는 유리하게는 면역반응, 바람직하게는 항원분자 또는 그의 일부분으로 이루어지거나 이들을 함유하는 물체에 의한 후속공격에 대한 보호작용을 부여하는 면역반응의 촉진을 가져올 수 있으며, 따라서 본 발명은 백신접종방법으로서 특별한 유용성을 가진다.
더욱 특히, 본 발명의 이러한 일면은 세포의 표면 상에 항원분자 또는 그의 일부분을 발현시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 세포를 항원분자 및 광감작제와 접촉시켜 항원분자 및 광감작제가 각각 세포의 세포내 막으로 한정된 구획 내로 흡수되도록 하는 단계; 및 이 세포에 광감작제를 활성화시키는데 효과적인 파장의 광선을 조사하여 상기 세포내 구획의 막을 붕괴시켜 세포를 사멸시키지 않으면서 세포의 사이토졸 내로 상기 분자를 방출시키고, 이어서 방출된 항원분자 또는 그의 일부분이 세포의 표면 상에 제시되도록 하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것으로, "붕괴된" 구획은 해당하는 구획의 막의 일체성 (integrity)이 그 안에 함유된 항원분자가 방출되도록 하기에 충분히 영구적으로 또는 일시적으로 파괴된 것을 의미한다.
다른 식으로 볼 때, 본 발명의 이 일면은 또한 항원분자 또는 그의 일부분을 세포의 표면 상에 발현시켜 바람직하게는 면역반응을 촉진시키는데 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 여기에서 이 조성물은 항원분자 및 광감작제를 함유한다. 바람직하게는, 이 조성물은 약제학적으로 허용되며, 또한 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 희석제를 함유한다.
추가의 일면에서, 본 발명은 또한 항원분자 또는 그의 일부분을 세포의 표면 상에 발현시켜 면역반응을 촉진시키는데 사용하기 위한 약제를 제조하는데 있어서의 항원분자 및 광감작제의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 추가의 일면은 항원분자 또는 그의 일부분을 세포의 표면상에 발현시켜 바람직하게는 면역반응을 촉진시키는데 동시에, 별도로 또는 연속적으로 사용하기 위한 조합 제제로서, 항원분자 및 광감작제를 함유하는 제품을 제공한다.
본 발명의 추가의 또 다른 일면은 항원분자 또는 그의 일부분을 세포의 표면 상에 발현시키는 데 사용하기 위한 키트를 제공하는 것이며, 여기에서 이 키트는 항원분자를 함유하는 제 1 용기 및 광감작제를 함유하는 제 2 용기를 포함한다.
본 발명에서 항원분자는 해당 분자 또는 그의 일부분이 적절한 방식으로 면역시스템에 대해 제시되었을 때 면역반응을 촉진시킬 수 있는 어떤 분자라도 될 수 있다. 따라서 유리하게는, 항원분자는 폴리펩타이드-함유 물질과 같은 백신 항원 또는 백신 성분일 수 있다.
다수의 이러한 항원 또는 항원성 백신 성분이 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 모든 양식의 세균성 또는 바이러스성 항원, 또는 그뿐만 아니라 원생동물 또는 더 고등유기체를 포함한 모든 병원성 종의 항원 또는 항원성 성분을 포함한다. 전통적으로 백신의 항원성 성분은 전체 유기체 (살아 있거나, 죽었거나 또는 약독화된 유기체)로 이루어져서, 즉 전세포 백신인 반면에, 또한 서브-유니트 백신, 즉 유기체의 특정한 항원성 성분, 예를 들어 단백질 또는 펩타이드 또는 탄수화물까지도 기본으로 하는 백신도 광범위하게 연구되고 문헌에 보고되었다. 이러한 "서브-유니트"계 백신성분은 모두 본 발명의 항원분자로서 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 펩타이드 백신의 분야에서 특별한 유용성을 보인다. 따라서, 본 발명에 따르는 바람직한 항원분자는 펩타이드이다 (여기에서, 이 펩타이드는 짧은 것과 긴 것 모두, 즉 펩타이드, 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드, 및 또한 단백질 분자 또는 그의 단편, 예를 들어 5 내지 500개의 아미노산, 예를 들어 15 내지 75개, 또는 8 내지 25개의 아미노산과 같이 10 내지 250개의 아미노산으로 된 펩타이드를 포함하는 것으로 정의된다). 제시되거나 발현된 항원분자의 일부분은 바람직하게는 세포내의 항원-처리기구 (antigen-processing machinery)에 의해서 생성되는 부분을 함유한다. 그러나, 이 부분은 적절한 항원 디자인 (예를 들어, pH 감수성 밴드)에 의해서 또는 다른 세포처리수단을 통해서 달성될 수 있는 다른 수단에 의해서 생성될 수도 있다. 편리하게는, 이러한 부분은 면역반응을 생성시키기에 충분한 크기, 예를 들어 펩타이드의 경우에는 아미노산 5개 이상, 예를 들어 아미노산 10 또는 20개 이상의 크기를 갖는다.
예를 들어 AIDS/HIV 감염 또는 인플루엔자, 개의 파르보바이러스, 소의 백혈병 바이러스, 간염 등과 같은 바이러스성 질병 및 감염증의 치료에 있어서 다수의 펩타이드 백신 후보물질들이 문헌에 제안되었다 (참조예: Phanuphak et al., Asian Pac. J. Allergy. Immunol. 1997, 15(1), 41-8; Naruse, Hokkaido Igaku Zasshi 1994, 69(4), 811-20; Casal et al., J. Virol., 1995, 69(11), 7274-7; Belyakov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95(4), 1709-14; Naruse et al., Proc. Natl. Sci. USA, 1994, 91(20), 9588-92; Kabeya et al., Vaccine 1996, 14(12), 1118-22; Itoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83(23) 9174-8). 마찬가지로, 세균성 펩타이드가 사용될 수 있을 뿐 아니라, 다른 유기체 또는 종으로부터 유도된 펩타이드가 사용될 수도 있다.
병원성 유기체로부터 유도된 항원 이외에도 펩타이드는 또한 암 또는 다발성 경화증과 같은 다른 질병에 대한 백신으로서 사용하도록 제안되었다. 예를 들어, 돌연변이체 종양원 펩타이드는 세포독성 T-림프구의 시뮬레이션 (simulation)에서 항원처럼 작용하는 암 백신으로서의 큰 가능성을 보유한다 (Schirrmacher, Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 1995, 121, 443-451; Curtis Cancer Chemotherapy and Biological Response Modifiers, 1997, 17, 316-327). 합성 펩타이드 백신이 또한 전이성 흑색종의 치료에 관하여 평가되었다 (Rosenberg et al., Nat. Med. 1998, 4(3), 321-7). 다발성 경화증의 치료를 위한 T-세포 수용체 펩타이드 백신은 문헌 (Wilson et al., J. Neuroimmunol. 1997, 76(1-2), 15-28)에 기술되어 있다. 이러한 펩타이드 백신성분은 어떤 것이라도 본 발명의 항원분자로서 사용될 수 있을 뿐 아니라, 문헌에서 펩타이드 백신으로서 기술되거나 제안된 펩타이드 중의 어떤 것이라도 될 수 있다. 따라서, 펩타이드는 합성된 것이거나, 유기체로부터 분리되거나 다른 식으로 유도된 것일 수 있다.
본 발명의 방법, 용도 등에 적용되는 세포는 그의 사이토졸 내로 투여되거나 수송된 분자를 그의 표면 상에 발현시키거나 제시할 수 있는 어떠한 세포라도 될 수 있다.
본 발명의 일차적인 유용성은 항원 제시 또는 백신접종에 있기 때문에, 세포는 편리하게는 면역주효세포, 즉 면역반응에 연관된 세포이다. 그러나, 다른 세포도 또한 면역시스템에 항원을 제시할 수 있으며, 이들도 또한 본 발명의 범주내에 포함된다. 따라서, 본 발명에 따르는 세포는 유리하게는 항원 제시 세포 (antigen-presenting cell)이다. 항원 제시 세포는 체액성 및 세포-매개된 면역성 둘 다를 포함한 면역반응의 모든 측면 또는 "갈래 (arm)", 예를 들어 항체생산의 촉진, 또는 표면상에 "이종" 항원을 발현하는 세포를 인식하고 파괴 (또는 다른 식으로는 제거)할 수 있는 세포독성 또는 살해세포의 자극에서 연관될 수 있다. 따라서, 용어 "면역반응을 촉진"하는 것은 모든 형태의 면역반응 및 이들을 촉진시키는 기전을 포함한다.
세포독성 세포 또는 항체-생산 세포의 자극은 항원이 항원 제시 세포에 의해서 특별한 방식으로 자극되는 세포에 제시되는 것, 예를 들어 MHC 클래스 I 제시를 필요로 한다 (예를 들어, CD8+ 세포독성 T-세포의 활성화는 MHC-1 항원제시를 필요로 한다).
항원 제시 세포는 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 문헌에 기술되어 있고 예를 들어, 림프구 (T 및 B 세포 둘다), 수상돌기세포, 대식세포 등을 포함한다. 그밖의 다른 것으로는 예를 들어, 흑색종 세포 등의 암세포가 포함된다.
항원 제시 세포에 의해 세포독성 T-세포 (CTL)에 대해서 항원제시를 하기 위해서는 항원분자가 항원 제시 세포의 사이토졸 내에 들어가는 것이 필요하다 (Germain, Cell, 1994, 76, 287-299). 본 발명은 사이토졸 내로 항원분자를 전달하는 효율적인 수단을 제공한다.
일단 광화학적 내부이행과정에 의해서 세포 사이토졸 내에 방출된 항원분자는 세포의 항원 처리 기구에 의해서 처리되어 적절한 방식으로, 예를 들어 클래스 I MHC에 의해서 세포표면 상에 제시될 수 있다. 이 처리 과정에는 항원의 분해, 예를 들어 단백질 또는 폴리펩타이드 항원이 펩타이드로 분해되는 것이 포함될 수 있으며, 이 펩타이드는 그후에 제시를 위해 MHC의 분자와 복합체를 형성한다. 따라서, 본 발명에 따라서 세포의 표면 상에 발현되거나 제시된 항원분자는 내부이행된 (세포내이입된) 항원분자의 일부분 또는 단편일 수 있다.
항원은 세포내이입에 의해서 항원 제시 세포에 의해 흡수되어 세포봉입성 소포 (endocytic vesicle) 내에서 펩타이드로 분해될 수 있다. 이들 펩타이드는 엔도좀 내에서 MHC 클래스 II 분자에 결합하여 세포표면으로 수송될 수 있으며, 여기에서 펩타이드-MHC 클래스 II 복합체는 CD4+ T 헬퍼세포에 인식되어 면역반응을 유도할 수 있다. 또 다른 방식으로, 사이토졸 내의 단백질은 예를 들어, 프로테아좀 (proteasome)에 의해서 분해되어 TAP (항원제시와 관련된 수송체 (transporter))를 이용하여 내형질세망 내로 수송될 수 있으며, 여기에서 도 1에 도시한 바와 같이 펩타이드는 MHC 클래스 I 분자에 결합하여 세포표면으로 수송될 수 있다 (Yewdell and Bennink, 1992, Adv. Immunol. 52: 1-123). 펩타이드가 이종항원으로부터 유래한 것인 경우에, 펩타이드-MHC 클래스 I 복합체는 CD8+ 세포독성 T-세포 (CTL)에 의해서 인식될 수 있다. CTL는 펩타이드-MHC (HLA) 클래스 I 복합체에 결합하고, 이렇게하여 활성화되고 증식하기 시작하여 CTL의 클론을 형성할 수 있다. 표적세포 및 세포표면 상에 동일한 펩타이드-MHC 클래스 I 복합체를 갖는 그밖의 다른 표적세포는 CTL 클론에 의해서 사멸될 수 있다. 충분한 양의 항원이 사이토졸 내로 도입될 수 있다면 이종항원에 대한 면역성이 확립될 수 있다 (Yewdell and Bennink, 1992, 상기 참조; Rock, 1996, Immunology Today 17: 131-137). 이것은 특히 암 백신의 개발에 대한 기초가 된다. 최대의 실제적인 문제중의 하나는 충분한 양의 항원 (또는 항원의 일부분)을 사이토졸 내에 도입시키는 것이다. 이것은 본 발명에 따라서 PCI에 의해서 해결될 수 있다. 이러한 원리는 PCI를 이용하여 어떻게 CTL을 자극할 수 있는지를 보여주는 도 1에 설명되어 있다. 펩타이드 또는 단백질 (P)은 세포외에서 항원 제시 세포에 적용된다. P는 세포내이입되어 PCI에 의해서 사이토졸 내로 방출된다. 그 후에 펩타이드 또는 단백질은 프로테아좀에 의해서 부분적으로 분해되고, MHC (HLA) 클래스 I과 복합체를 형성하여 세포표면에 수송되며, 여기에서 복합체는 CTL에 의해서 인식될 수 있다.
이하의 실시예에 더 상세히 기술되는 바와 같이, 광화학적 내부이행은 암-특이적 펩타이드의 사이토졸내 전달을 위해서 본 발명에 따라 효율적으로 사용될 수 있다는 것이 입증되었다.
항원분자 및(또는) 광감작제는 표적화제, 예를 들어 표적-특이적 전달 또는 캐리어 시스템 또는 캐리어 분자를 이용함으로써 특정 세포 또는 조직을 표적으로 삼을 수 있다. 따라서, 예를 들어 항원 및(또는) 광감작제는 벡터 또는 캐리어 시스템, 예를 들어 재구성된 LDL-입자를 사용하여 세포에 전달될 수 있다. 캐리어 분자는 항원분자, 광감작제 또는 둘다에 결합되거나 컨쥬게이트될 수 있으며, 동일하거나 상이한 캐리어 분자가 사용될 수 있다. 항원분자 및(또는) 광감작제는 또한 특정한 세포 형태 또는 특정한 세포구조에 대해 특이적인 리간드와 같은 부위-표적화 리간드, 예를 들어 종양-특이적 항원과 같이 특정한 세포 형태에서 발현되는 표면항원을 인식하는 항체에 컨쥬게이트될 수도 있다. 이러한 기전은 수용체-매개된 세포내이입을 통한 광감작제 및(또는) 항원분자의 흡수를 증가시키는 작용을 할 수 있다. 이러한 표적화 분자 캐리어 또는 벡터를 사용하여 또한 항원분자 및(또는) 광감작제가 세포내 구획으로 향하도록 지시할 수도 있다.
세포내 막으로 한정된 구획은 세포내에 존재하는 이러한 구획 중의 어떤 것이라도 될 수 있다. 바람직하게는 구획은 막 소포, 특히 엔도좀 또는 라이소좀일 수 있다. 그러나, 세포내 구획은 또한 골지체 또는 내형질세망을 포함할 수도 있다. 단지 필요한 것은 항원분자 및 광감작제가 동일한 세포내 구획(들)에 위치하여야 한다는 점이다.
광화학적 내부이행과정은 WO 96/07432 (그의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다)에 더욱 상세히 기술되어 있다. PDT의 방법은 또한 현재 문헌에 광범하게 기술되어 있다.
본 발명에 따라 사용되는 광감작제는 세포내 구획, 특히 엔도좀 또는 라이소 좀에 축적되는 성분 중의 어떤 것이라도 될 수 있다. 이러한 광감작제의 종류는 본 기술분야에서 공지되어 있으며, WO 96/07432를 포함한 문헌에 기술되어 있다. 이에 관하여는 배양물에서 세포의 엔도좀 및 라이소좀 내에 위치하는 것으로 밝혀진 디- 및 테트라설폰화 알루미늄 프탈로시아닌, 설폰화 테트라페닐포르핀 (TPPSn), 나일블루, 클로린 e6 유도체, 유로포르피린 I, 필로에리트린, 헤마토포르피린 및 메틸렌블루가 언급될 수 있다. 이것은 대부분의 경우에 세포봉입체 활성에 기인한 것이다.
따라서, 언급될 수 있는 적합한 광감작제의 부류에는 포르피린, 프탈로시아닌, 푸르푸린, 클로린, 벤조포르피린 나프탈로시아닌, 양이온성 염료, 테트라사이클린 및 라이소좀지향성 약염기 또는 그의 유도체가 포함된다 (Berg et al., Photochemistry and Photobiology, 1997, 65, 403-409).
바람직한 광감작제에는 테트라(4-술포네이토페닐)포르핀 (TPPS4)(Zabner et al., J. Biol. Chem. 1995, 270, 18997-19007), 인접한 페닐 고리들에 2-술포네이트기를 갖는 메조-테트라페닐포르핀 (TPPS2a) 또는 인접한 페닐 고리들에 2-술포네이트 기를 갖는 알루미늄 프탈로시아닌 (AlPcS2a)이 포함된다.
본 발명에 따르는 광화학적 내부이행은 본 기술분야에서 공지되어 있으며 표준기술인 PDT 방법 및 이 방법에서 효과적인 이러한 기술의 적절한 변형방법을 사용하여 수행할 수 있다. 따라서, 항원분자 및 광감작제는 본 기술분야에서 공지되어 있는 PDT의 방법 및 수단에 따라 적용하거나 투여함으로써 세포에 전달될 수 있다.
본 발명의 방법은 발생부위에서의 처리 또는 생체외 처리에 이어서 처리된 세포를 투여함으로써 시험관내 또는 생체내에서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가의 일면은 전술한 바와 같이 정의되는 방법에 의해서 수득될 수 있는 (또는 수득된) 것으로서, 그의 표면상에 항원분자 또는 그의 일부분을 발현하는 항원 제시 세포를 제공한다. 본 발명의 또 다른 일면은 이러한 세포의 집단 또는 배양물, 특히 이러한 세포의 생육가능하며 기능적으로 완전한 집단 또는 배양물, 및 또한 특히 면역반응을 촉진시키기 위한, 특히는 CTL을 자극하기 위한 치료법에서 이러한 세포 (또는 세포의 집단 또는 배양물)의 용도를 제공한다.
또한, 면역반응을 촉진시키는, 특히는 CTL을 자극하는 약제 (예를 들어, 백신 조성물)의 제조를 위한 이러한 세포 (또는 세포의 집단 또는 배양물)의 용도가 제공된다.
생체내에서는 본 기술분야에서 통상적이거나 표준기술인 모든 투여방식, 예를 들어 주사, 주입, 내부 및 외부 신체표면 둘다에 대한 국소투여 등이 사용될 수 있다. 생체내 사용의 경우에, 본 발명은 체액 위치 및 고체조직을 포함한, 표적세포를 함유하는 어떠한 조직과 관련하여서라도 사용될 수 있다. 광감작제가 표적세포에 의해서 흡수되고 광선이 적절하게 전달될 수 있는 한은 모든 조직이 처리될 수 있다.
따라서, 본 발명의 조성물은 예를 들어 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용되는 캐리어 또는 부형제를 사용하여, 약제학적 기술분야에서 공지되어 있는 기술 및 절차에 따라 편리한 어떠한 방식으로도 제제화될 수 있다. 조성물 및 캐리어 또는 부형제 물질의 성질, 투여량 등은 투여의 종류 및 목적하는 경로, 백신 접종의 목적 등에 따라 통상적인 방식으로 선택될 수 있다. 투여량은 마찬가지로 통상적인 방식으로 결정될 수 있으며, 항원분자의 성질, 백신접종의 목적, 환자의 연령, 투여방식 등에 따라 좌우될 수 있고, 광감작제과 관련하여서는 광선 조사시에 막을 붕괴시키는 효능/능력도 또한 고려되어야 한다.
광감작제를 활성화시키기 위한 광선조사단계도 마찬가지로 본 기술분야에서 잘 알려져 있는 기술 및 절차에 따라 수행할 수 있다. 예를 들어, 광선의 파장 및 강도는 사용된 광감작제에 따라 선택될 수 있다. 적합한 광원은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다.
전술하였으며 WO 96/07432에 기술된 바와 같이, 이러한 방식의 광화학적 내부이행은 세포의 생육력 및 기능성에 유해한 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 특히, 세포의 집단 또는 다수의 세포를 본 발명에 따라 처리하면 대부분의 세포는 사멸되지 않고 실질적으로 기능적으로 완벽하게 처리를 견디어내는 것으로 확인되었다.
본 명세서에서 사용된 것으로, 용어 "세포를 사멸시키지 않고"는 이러한 상황을 정의하기 위한 의도로 사용된다. 즉, 세포의 집단 또는 다수의 세포에서 실질적으로 모든 세포 또는 거의 대부분 (예를 들어, 세포의 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 80, 85, 90 또는 95%)이 사멸되지 않는다.
명백하게, 세포집단 또는 다수의 세포에 광선을 조사하여 처리하면, 세포의 특정한 그룹 또는 조직의 특정한 영역이 더 다량의 광선을 수용할 수 있거나, 일부 다른 방식으로는 세포의 다른 그룹 또는 조직의 다른 영역에 비해서 더 큰 PCI 영 향을 받을 수 있도록 하는 것이 가능하다. 따라서, 세포 생존율에 대한 소정의 백분율 값은 전체 광선조사된 집단에 걸쳐서 반드시 균일하지는 않으며, 광선조사된 집단에서 잔류하는 생육가능한 세포의 백분율을 의미하는 것으로, 여기에서 필요조건은 단지 광선조사된 세포의 충분한 비율이 생존하는 것 뿐이다. 또한, 광선조사에 의해서 유도된 세포사는 일어나기 까지 약간의 시간, 예를 들어 몇시간이 소요될 수 있다. 이 경우에, 결국 사멸하는 세포는 또한 본 발명의 방법에 따라 그들의 표면상에 항원분자를 발현할 수 있으며, 따라서 본 발명의 방법, 용도 등에 영향을 미칠 수 있음을 볼 수 있다. 따라서, 세포사의 비율 %는 광선조사한지 몇시간 (예를 들어 광선조사 후 4시간 이하) 내에 생육가능하게 잔류하는 세포의 백분율을 의미하지만, 바람직하게는 광선조사한지 4 시간 또는 그 이상의 시간 후에 생육가능한 세포의 비율 %를 의미한다.
본 발명의 방법은 생존세포의 분획 또는 비율이 광감작제의 농도와 관련하여 광선량 (light dose)을 선택함으로써 조절될 수 있도록 변형될 수도 있다. 이러한 기술도 역시 본 기술분야에서 공지되어 있다.
본 발명은 다양한 항원분자의 전달을 위한 효율적인 수단을 제공한다. 본 발명은 특히 백신 전달도구로서 적합하도록 만드는 다수의 특징을 갖는다: 1) 분자가 표적세포에 의해서 세포내이입될 수 있는 한은 전달될 분자의 크기에 대한 제한이 없다; 2) 세포증식에 대한 의존성이 없다; 3) 광선에 노출된 영역만이 영향을 받는다는 점에서 부위-특이적이다; 4) 종양원성이 아니다. 또한, 광화학적 내부이행은 표적세포에 대한 약물의 특이성에서 실질적으로 상승적 효과를 얻을 수 있는 가능성을 제공하도록 세포표면 구조에 대해 특이적인 리간드를 사용하여 표적화시키거나, 조직특이성을 부여하는 조절성 유전자요소를 사용하거나 또는 질병-특이적 약물을 사용하는 것과 같이 부위 또는 조직 특이적 약물작용을 발생시키는 다른 원리와 잠재적으로 조합될 수도 있다.
본 발명은 이하의 도면을 참고로하여 이하의 비제한적 실시예에서 더욱 상세히 기술된다.
도 1은 PCI를 이용하여 어떻게 CTL을 자극할 수 있는지를 보여주는 도식적 표현을 나타낸 것이다. 펩타이드 또는 단백질 (P)은 세포외에서 항원 제시 세포에 적용된다. P는 세포내이입되어 PCI에 의해서 사이토졸 내로 방출된다. 그후에 펩타이드 또는 단백질은 프로테아좀에 의해서 부분적으로 분해되어 MHC (HLA) 클래스 I과 복합체를 형성하여 세포표면으로 수송되고, 여기에서 복합체는 CTL에 의해서 인식될 수 있다.
도 2는 펩타이드의 광화학적으로 유도된 재축적 (relocalization)을 나타낸 것이다. BL2-G-E6 세포는 플루오레세인-표지된 p21ras-유래 5-21, Val12 펩타이드 및 AlPcS2a와 함께 배양하였다. 세포는 적색광선에 4분간 노출시키기 전 (상부 패널) 및 노출시킨 지 30분 후 (하부 패널)에, 형광현미경검사에 의해 플루오레세인-펩타이드 및 AlPcS2a 축적에 대해서 검사하였다. 막대 길이 20 ㎛.
도 3은 MART-1 펩타이드의 PCI 후에 FM3 흑색종 세포에 대한 CD8+ T 림프구 클론의 세포독성을 나타낸 것이다.
도 4는 HRP를 사이토졸 내로 전달하는 PCI의 능력을 나타낸 것이다. NHIK 3025 세포를 3.2 ㎍/㎖ TPPS2a 및 1 ㎎/㎖ HRP로 18시간 동안 처리하였다. 그후, 지시된 광선량에 노출시키기 전에 배지를 약물-비함유 배지로 교체하였다. HRP 활성을, 완전세포 (●)에서 및 전기투과 (electropermeabilisation) 및 밀도원심분리기술에 의해서 사이토졸-비함유 세포사체 (cell corpses) (▼)로부터 분리된 사이토졸 (○)에서 측정하였다.
도 5는 GFP의 광화학적으로 유도된 발현을 나타낸 것이다. a는 AlPcS2a 및 광선이 부재하는 경우, 또는 AlPcS2a가 존재하고, 이어서 도면에 지적된 바와 같이 광선에 노출시키는 경우에 pEGFP-N1-pLys 복합체로 처리된 THX 세포에서 GFP의 발현을 나타낸 것이다. 세포는 GFP 발현에 대해 양성인 것으로 그어진 선의 우측에 있는 세포를 계산하는 유동세포계산 (flow cytometry)에 의해서 분석하였다. b는 광감작제 (20 ㎍/㎖ AlPcS2a 또는 0.25 ㎍/㎖ 3-THPP)로 18시간 동안 처리하고, 이어서 pEGF-N1-pLys 복합체로 6시간 동안 트랜스펙션시키고 세포의 50%를 불활성화시키는 광선에 노출시킨 THX 세포에서 GFP의 발현을 나타낸 것이다. GFP 발현은 a에서 기술한 바와 같은 유동세포계산에 의해서 분석하였다.
물질 및 방법
광선조사
세포의 처리를 위해서 두개의 상이한 광원을 사용하였으며, 이들은 둘다 4개의 형광튜브로 구성된다. TPPS4, TPPS2a 및 3-THPP (포르피린 제품, Logan, UT)로 처리된 세포는 세포에 도달하는 광선강도가 1.5 mW/㎠인 청색광선 (모델 3026; Appl. Photophysics, London, UK)에 노출시키는 반면, AlPcS2a (포르피린 제품, Logan, UT)로 처리된 세포는 세포에 도달하는 광선강도가 1.35 mW/㎠인, 시네모이드 (Cinemoid) 35 필터를 통해서 여과된 적색광선 (Philips TL 20W/09)에 노출시켰다.
형광현미경검사
세포는 문헌 (Berg, K., et al., Biochem. Biophys. Acta., 1370: 317-324, 1998)에 기술된 바와 같은 형광현미경검사에 의해서 분석하였다. 플루오레세인-표지된 분자의 분석을 위해서는 현미경에 450-490 ㎚ 여기필터, 510 ㎚ 이색성 비임분할기 (dichroic beam splitter) 및 510-540 ㎚ 밴드통과 방출필터를 장치하였다.
플라스미드-pLys 복합체의 제조 및 세포의 처리
플라스미드-pLys 복합체 (충전비율 1.7)는 HBS 75 ㎕ 중의 플라스미드 (pEGFP-N1; Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) 5 ㎍을 HBS 75 ㎕ 중의 pLys (MW 20700; Sigma, St. Louis, MO) 5.3 ㎍과 온화하게 혼합시킴으로써 제조하였다. 용액을 실온에서 30분 동안 배양하고 배양배지로 희석하여 세포에 첨가하였 다.
THX 세포를 AlPcS2a 20 ㎍/㎖와 함께 37℃에서 18시간 동안 배양하고, 세척하여, 감작제-비함유 배지 내에서 3시간 동안 배양한 후에 플라스미드-pLys 복합체와 함께 2시간 동안 배양하였다. pEGFP-N1/pLys 처리된 THX 세포를 1회 세척하고, 첨가제 없이 배양배지 중에서 2시간 동안 배양한 후에 광선에 노출시켰다. 세포를 37℃에서 2일 동안 배양하고, 계대배양한 다음, 추가로 5일 동안 더 배양한 후에 유동세포계산에 의해서 GFP 발현을 분석하였다.
HCT-116 세포는 AlPcS2a 20 ㎍/㎖와 함께 18시간 동안 배양하고, 세척하여, 플라스미드-pLys 복합체로 6시간 동안 트랜스펙션시킨 후에 플라스미드-비함유 배지중에서 광선에 노출시켰다. 37℃에서 40시간 동안 배양한 후에 GFP 발현을 현미경검사에 의해서 연구하였다.
유동세포계산 분석
세포를 트립신처리하고, 원심분리하여 배양배지 400 ㎕ 중에 재현탁시키고 50 ㎛ 메쉬 나일론 필터를 통해서 여과하였다. 그후, 세포를 FAC스타 플러스 유동세포계수기 (FACStar plus flow cytometer; Becton Dickinson)에서 분석하였다. 녹색 형광성 단백질 (GFP)은 488 ㎚로 설정된 아르곤 레이저 (200 mW)로 여기시킨 후에 510-530 ㎚ 필터를 통해서 측정하였다. AlPcS2a는 351-356 ㎚로 설정된 크립톤 (krypton) 레이저 (50 mW)로 여기시킨 후에 650 ㎚ 롱패스 (longpass) 필터를 통해서 측정하였다. 세포 이중체 (doublet)는 GFP 형광시그날의 펄스폭에 대해서 게이트로 제어함으로써 단일세포로부터 구별하였다. 데이타는 PC 라이시스 II 소프트웨어 (PC Lysys II software; Becton Dickinson)로 분석하였다.
플루오레세인-펩타이드의 제조 및 세포의 처리
플루오레세인-표지된 Val12-p21ras-펩타이드 (잔기 5-21)를 합성하였으며, 알란 커트버트슨 (Alan Cuthbertson, Nycomed Amersham)에 의해서 제공되었다.
BL2-G-E6 세포를 플루오레세인-표지된 p21ras-유도된 펩타이드 30 ㎍/㎖와 함께 18시간 동안 배양하고, 이어서 AlPcS2a 20 ㎍/㎖와 함께 18 시간 및 약물-비함유 배지 중에서 1시간 동안 배양한 후에 적색광선에 노출시켰다.
실시예 1
광화학적 내부이행 (PCI)을 사용하여 펩타이드를 세포의 사이토졸 내로 들어가게 할 수 있다.
암-특이적 펩타이드의 사이토졸내 전달을 위한 PCI를 평가하기 위해서, 잔기 5-21을 포함하며 Val12 돌연변이 (G12V)를 함유하는 플루오레세인-표지된 p21ras 펩타이드를 사용하였다 (Gjertsen, M.K., et al., Int. J. Cancer, 72: 784-790, 1997). BL2-6-E6 마우스 섬유아세포에서, ras 펩타이드는 AlPcS2a와 함께 잘 공동축적하였으며, 이것은 펩타이드의 세포봉입성 흡수를 시사하는 것이다 (도 2). 광선에 4-분 노출시킨 후에, 플루오레세인-표지된 ras 펩타이드 및 AlPcS2a는 사이토플라즘 내에 분산되어 위치하는 것으로 확인되었다. 유사한 효과는 플루오레세인- 표지된 ras 펩타이드 및 광선에 대해서만 노출시킨 세포에서는 관찰되지 않았다 (데이타는 제시되지 않음).
실시예 2
항원제시 및 CD8
+
T 림프구 매개된 세포사멸을 유도하기 위한 PCI의 용도
10% 태자송아지혈청 (FCS)를 함유하는 RPMI 배지 내에서 성장시킨 것으로, MART-1 펩타이드를 발현하지 않는 FM3 흑색종 세포 (6-웰 플레이트에서 2×105/웰)를 광감작제 AlPcS2a 10 ㎍/㎖로 18시간 동안 처리하였다. 그후에 세포를 둘베코 포스페이트-완충된 식염수 (PBS) 내의 EDTA (0.1 M)를 사용하여 기질로부터 방출시키고, 세포를 100% FCS 중에서 1시간 동안 51Cr (60 μCi/㎖ Na2CrO4)로 부하시키는 동안에 용액상태로 유지시키고, 이어서 10% FCS 중의 RPMI 1640 내에서 MART-1 펩타이드 5 ㎍/㎖와 함께 5시간 동안 배양하는 한편, 세포는 여전히 용액상태로 유지시켰다. MART-1 펩타이드의 서열은 TAEEAAGIGILTVILG였다. 그후, 세포를 10% FCS를 함유하는 RPMI 1640 배지 중에서 2회 세척하고, 96-웰 플레이트에 접종하였다 (배지 (RPMI 1640/10% FCS) 100 ㎕ 중에서 2000/웰). 그후, 세포를 도 3에 지시된 바와 같은 시간 동안 광선에 노출시켰다 ((Philips TL 20W/09) 세포에 도달하는 광선강도가 1.35 mW/㎠로 시네모이드 35 필터를 통해서 여과됨 (Rodal et al., 1998, J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 45: 150-9)). 광선에 노출시킨지 18시간 후에, 배지를 제거하고 MART-1/HLA-A2 특이적 세포독성 T 림프구 (CTL - 100 ㎕ 중에 첨가된 40,000/웰)를 함유하는 배지를 첨가하였다. 배양한 지 4시간 후에, 배지를 FM3 세포로부터 분리시키고, 전술한 바와 같이 자발적 방출량 및 최대방출량 뿐 아니라 배지에 방출된 51Cr (용해된 세포의 지표임)을 계수하였다 (Fossum et al., 1995, Cancer Immunol. Immunother. 40: 165-172). 특이적 크롬유리의 백분율은 수학식 (실험적 방출 - 자발적 방출)/(최대 방출 - 자발적 방출) ×100에 의해서 계산하였다. 도 3에 나타낸 결과로부터, 상기에 개략적으로 설명한 바와 같이 MART-1 펩타이드를 PCI시킨 후에 FM3 세포가 CD8+ T 림프구 세포독성에 대해 광선-의존적 감수성을 나타내는 것을 알 수 있다.
실시예 3
PCI는 세포내이입된 분자 대다수의 방출을 유도한다.
이것은 호스래디쉬 (horseradish) 퍼옥시다제 (HRP)의 PCI 유도된 내부이행/세포내이입에 의해서 나타났다.
HRP를 사용함으로써, PCI는 세포내이입된 HRP의 과반수 (> 60%)가 사이토졸 내로 방출되도록 유도한다는 것이 입증된다 (도 4 참조).
이 실험에서, NHIK 3025 세포 (인간 경부로부터 발생부위에 있는 암세포)를 광감작제 TPPS2a (3.2 ㎍/㎖) 및 HRP 1 ㎎/㎖로 18시간 동안 처리하였다. 그후, 배지를 약물-비함유 배지로 대체시킨 후에 도 4에 지시된 바와 같은 광선량에 노출시키켰다. HRP 활성은 문헌 (Steinman et al., J. Cell Biol., 68: 665-687, 1976)에 기술된 절차에 따라 측정하였다. 사이토졸은 전기투과 및 밀도원심분리기술에 의해서 사이토졸-비함유 세포사체로부터 분리시켰다 (Berg et al., Int. J. Cancer 59: 814-822, 1994).
실시예 4
PCI를 사용하여 기능적 유전자의 전달을 증진시킬 수 있다.
이것을 입증하기 위해서, THX 세포를 녹색 형광성 단백질 (GFP)을 코딩하는 플라스미드 (pEGFP-N1)의 pLys-복합체로 트랜스펙션시켰다. GFP의 발현은 유동세포계산 (도 5, a 및 b) 및 형광현미경검사 (데이타는 제시되지 않음)에 의해서 분석하였다. 도 5a로부터 볼 수 있는 바와 같이, AlPcS2a 및 광선에 의한 처리는 GFP를 발현하는 세포의 백분율에 있어서 강력한 증가를 유도하였다. 이 리포터 분자에 대해 양성인 세포의 분획은 광선 비처리시에 1%로부터 5-분 광선노출 후에 50%로 증가하였다. GFP 발현은 광감작제의 부재하에서 pEGFP-pLys로 처리된 세포에서는 광선에 의해서 증진되지 않았다. 관련이 없는 플라스미드 (헴 옥시게나제를 코딩하는 것)와 pLys의 복합체는 AlPcS2a 및 광선과 조합하였을 때 녹색 형광을 유도하지 않았다 (데이타는 제시되지 않음). 따라서, 광선-지시된 방식으로 PCI는 THX 세포에 대한 기능적 유전자의 트랜스펙션 효율을 실질적으로 증가시킬 수 있다. 유사한 결과가 광감작제로서 TPPS2a 및 표적세포로서 BHK-21 및 HCT-116을 사용하여 수득되었다 (데이타는 제시되지 않음). 실질적으로 라이소좀에 위치하지 않는 감작제 3-THPP는 GFP 발현의 미량증가만을 유도하였다 (도 5b). pLys와 복합체를 형 성하지 않은 pEGFP-N1의 PCI는 GFP의 발현을 유도하지 않았다 (데이타는 제시되지 않음).
Claims (33)
- 세포를 펩티드 항원 분자 또는 그 일부 및 광감작제와 접촉시켜, 상기 항원 분자 및 광감작제가 각각 상기 세포의 세포내 막으로 한정된 구획 내로 흡수되도록 하는 단계; 및상기 세포에 상기 광감작제를 활성화시키는데 유효한 파장의 광선을 조사하여, 세포를 사멸시키지 않으면서 세포내 구획의 막을 붕괴시켜 세포의 사이토졸 내로 상기 항원 분자를 방출시키고, 이어서 상기 방출된 항원 분자 또는 그 일부가 상기 세포의 표면 상에 제시되도록 하는 단계를 포함하는, 펩티드 항원 분자 또는 그 일부를 생체내에서 비인간 세포의 표면상에 발현시키거나 또는 시험관내에서 체액으로부터 얻어진 인간 세포 또는 비인간 세포의 표면상에 발현시키는 방법.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 항원 분자가 면역반응을 촉진시킬 수 있는 분자인 방법.
- 제 3 항에 있어서, 항원 분자가 백신 항원 또는 백신 성분인 방법.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서, 세포가 림프구, 수상돌기세포, 대식세포 및 암세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원 제시 세포인 방법.
- 제 1 항에 있어서, 광감작제가 포르피린, 프탈로시아닌, 푸르푸린, 클로린, 벤조포르피린, 나프탈로시아닌, 양이온성 염료, 테트라사이클린 및 라이소좀지향성 약염기 또는 그 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제 7 항에 있어서, 광감작제가 테트라(4-술포네이토페닐)포르핀 (TPPS4), 인접한 페닐 고리들에 2-술포네이트기를 갖는 메조-테트라페닐포르핀 (TPPS2a) 또는 인접한 페닐 고리들에 2-술포네이트 기를 갖는 알루미늄 프탈로시아닌 (AlPcS2a)인 방법.
- 제 1 항, 제 7 항 및 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 항원 분자, 광감작제 또는 이들 둘다가 표적화제 또는 캐리어 분자에 결합된 것인 방법.
- 삭제
- 제 1 항, 제 7 항 및 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 항원제시가 면역반응의 촉진을 야기시키는 것인 방법.
- 제 1 항, 제 7 항 및 제 8 항 중 어느 한 항에서 정의된 방법을 포함하는 백신접종 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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- 삭제
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- 삭제
- 삭제
- 펩티드 항원 분자 또는 그 일부 및 광감작제를 포함하는, 세포의 표면 상에 상기 항원 분자 또는 그 일부를 발현시켜 면역반응을 촉진시키거나 세포독성 T 세포를 자극하는데 사용하기 위한 약제.
- 제 22 항에 있어서, 세포를 펩티드 항원 분자 또는 그 일부 및 광감작제와 접촉시켜, 상기 항원 분자 및 광감작제가 각각 상기 세포의 세포내 막으로 한정된 구획 내로 흡수되도록 하고; 상기 세포에 상기 광감작제를 활성화시키는데 유효한 파장의 광선을 조사하여, 세포를 사멸시키지 않으면서 세포내 구획의 막을 붕괴시켜 세포의 사이토졸 내로 상기 항원 분자를 방출시키고, 이어서 상기 방출된 항원 분자 또는 그 일부가 세포의 표면 상에 제시되도록 하는 약제.
- 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서, 펩티드 항원 분자, 광감작제 및 세포가 제 1 항, 제 7 항 및 제 8 항 중 어느 한 항에 정의된 것인 약제.
- 제 1 항, 제 7 항 및 제 8 항 중 어느 한 항에서 정의된 방법에 의해 얻을 수 있는 세포집단을 포함하는, 면역반응을 촉진시키거나 세포독성 T 세포를 자극하기 위한 약제.
- 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서, 백신접종에 사용되는 약제.
- 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서, 바이러스성 질병, 암 또는 다발성 경화증의 치료에 사용되는 약제.
- 제 25 항에 있어서, 백신접종에 사용되는 약제.
- 제 1 항에서 정의된 펩티드 항원 분자 및 제 1 항, 제 7 항 및 제 8 항 중 어느 한 항에서 정의된 광감작제를 포함하는, 상기 항원 분자 또는 그 일부를 세포 표면상에 발현시키는데 있어서 동시에, 별도로 또는 순차적 사용을 위한 조합 제제로서의 제품.
- 제 1 항에서 정의된 펩티드 항원 분자를 함유하는 제 1 용기, 및 제 1 항, 제 7 항 및 제 8 항 중 어느 한 항에서 정의된 광감작제를 함유하는 제 2 용기를 포함하는, 세포의 표면상에 항원 분자 또는 그 일부를 발현시키는데 사용하기 위한 키트.
- 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서, 펩티드 항원 분자가 백신 항원 또는 백신 성분인 약제.
- 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서, 세포가 림프구, 수상돌기세포, 대식세포 및 암세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원 제시 세포인 약제.
- 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서, 펩티드 항원 분자, 광감작제 또는 이들 둘다가 표적화제 또는 캐리어 분자에 결합된 것인 약제.
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