JPH10508295A - 細胞サイトゾルへの分子移入 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 分子をエンドソーム，リソソームまたは他の細胞区画に摂取させ、エンドソーム膜，リソソーム膜または他の細胞区画の膜を破壊すべき光増感性化合物の光活性を利用することにより、細胞の大部分を殺すことなく、細胞のサイトゾルに前記分子を放出する方法が記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞サイトゾルへの分子移入 本発明は、光力学処理によって細胞の大部分を殺すことなく、光力学処理を用 いてエンドソームおよびリソソーム膜を破壊することによって細胞に分子を導入 する方法に関する。 大部分の分子は細胞膜を容易には通過できない。生細胞のサイトゾルへ細胞を 導入する方法は生物学的プロセスの操作および実験で有用な手段である。今日最 も普通に使用されている方法のうちには、マイクロインジェクション、赤血球細 胞ゴースト媒介融合およびリソソーム融合、ピノソームの浸透圧溶解、スクレー プローディング、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムおよびウイルス媒 介トランスフェクションがある。多くの場合、非現実的で時間を消費し、効果的 でなく、あるいは有意な細胞死滅を誘導するにも拘わらず、これらの技術は培養 中の細胞の調査で有用である。かくして、それらは生物学的および医学的研究ま たは細胞の機能を保持したままであるべき治療における使用には最適ではない。 ポルフィリン類および多くの他の光増感性化合物が細胞および組織に対して細 胞障害効果を誘導することはよく知られている。これらの効果は、露光に際して 、光増感性化合物がシングレット¹Ｏ₂を放出し、これが細胞の膜および細胞構造 を分解し、もし破壊がひどければ結局は細胞を殺すという事実に基づく。これら の効果はいくつかのタイプの新生物病を治療するのに利用されてきた。この治療 は光力学療法（PDT）と命名され、光増感性を有し且つ腫瘍位置を決定できる染 料の注入、続いての腫瘍領域の光の暴露に基づく。 細胞障害効果は主としてシングレット酸素の形成を通じて媒介される。この反応 性中間体は非常に短い細胞中寿命（＜0.04μ秒）を有する。かくして、PDT の第 一の細胞障害効果は光照射の間に¹Ｏ₂の形成部位の非常に近くで発揮される。¹ Ｏ₂はタンパク質（ヒスチジン、トリプトファン、メチオニン、システイン、チ ロシン）、DNA（グアニン）、不飽和脂肪酸およびコレステロールと反応しそれ を酸化する。PDT の利点の１つは、光に曝されなかった組織が影響されないとい うことである。望まない細胞集団、例えば、新生物細胞を破壊するためのPDT の 使用に関して多くの文献がある。単独の光力学化合物、または複合体をより細胞 特異的とする新生物細胞レセプター抗原決定基に指向された免疫グロブリンと結 合された光力学化合物に関するいくつかの特許がある。ヘマトポルフィリンのご ときある種の光化学化合物はさらに悪性細胞に濃縮する固有の能力を有する。望 まない細胞を破壊することに向けられたこれらの方法および化合物はノルウェー 特許第173319号、ノルウェー特許出願第900731号、第902634号、第901018号、第 941548号、第851897号、第934837号、第924151号および第891491号に記載されて いる。 PCT/US93/00683において、コポリマー担体に結合させた抗癌薬物および光活性 化薬物からなる薬物送達系が記載されている。投与に際して、この複合体は、飲 作用または食作用によって細胞内部に侵入し、エンドソームおよびリソソーム内 部に止まるであろう。リソソームでは、抗新生物化合物とポリマーとの間の結合 が加水分解され、前者はリソソーム膜を通って受動的にサイトゾルまで拡散でき る。かくして、この方法はリソソーム膜を通過して拡散できる小さな分子化合物 のための方法に限定する。拡散のタイムラグの後、適当な波長およびエネルギー の光源を適用して、光増感性化合物を活性化させる。抗癌薬物および光活性化薬 物の組み合わせた効果により、細胞が破壊される。かくして、公知の光活性化化 合物のすべての使用は細胞死滅に導く細胞構造の広範な破壊に向けられている。 エンドソーム／リソソーム膜の局所的破壊の後に膜不浸透性分子をサイトゾルに 放出する方法は知られていない。 かくして、本発明の目的は、その摂取が共に種々の担体によって容易となる得 る光活性化化合物とサイトゾルに輸送すべき分子（類）とに細胞を曝し、適当な 波長およびエネルギーの光に細胞を曝して、細胞の大部分の機能を破壊すること なく、エンドソーム膜およびリソソーム膜を破壊し、前記分子をサイトゾルに放 出することによって、培養または組織中の、生細胞のサイトゾルに分子類を輸送 する方法を提供することにある。光増感剤とサイトゾルに輸送すべき分子（類） とは複合体化されるか、あるいは適当な担体と一緒に分離状態で与えられ、随意 に注目する分子の摂取を容易とすることができる。 この目的は、添付の請求の範囲によって特徴付けられる本発明に よって得られる。 本発明は、いずれかの分子を生細胞のサイトゾルに輸送する方法に関し、しか る後、サイトゾルで利用可能であるべきで、また細胞はその機能を維持すべきで ある。これは、担体分子類、標的化免疫グロブリン類およびサイトゾルに輸送さ れるべき分子類に結合された状態で、または分離された状態で一緒に細胞に摂取 され、エンドソーム、リソソームまたは他の細胞区画に位置するであろう光活性 化化合物に細胞を曝し、光増感性化合物を活性化する適当な波長の光に細胞を曝 して、光活性化化合物の作用およびエンドソーム／リソソーム内容物の可能な作 用によって、エンドソーム、リソソームまたは他の細胞区画膜のみが破壊され、 細胞がその機能を喪失することなく該分子類がサイトゾルに放出されることによ って達成される。 以下、本発明を詳細に記載し、図面により説明する。 図１は、本発明によって、どのようにして分子を細胞サイトゾルに導入できる かを図に示している。光増感剤（Ｓ）および選択した分子（Ｍ）は細胞（Ｉは飲 食プロセスを開始する原形質膜の嵌入部を示す）によって飲食され、両物質は同 一の小胞（II）に至る。これらの小胞が光に曝されると、小胞の膜は破壊され、 内容物は放出される（III）。 図２は、TPPS_2aの不存在下および存在下におけるゲロニンでの処理および50秒 での光照射の後におけるNHIK3025細胞におけるタンパク質合成を示す。記号：○ 、TPPS_2a＋光；●、-TPPS_2a−光；▽、＋TPPS_2a−光；▼、-TPPS_2a＋光。細胞を 3.2 μg/ml TPPS_2aおよび示した濃度のゲロニンで一晩処理し、すべての場合、 同一の光量とする。タンパク質合成は、光照射の24時間後における³[Ｈ]ロイシ ンのタンパク質への取込を測定することによって測定した。 図３は、TPPS_2aおよび光のみで処理した（○）、または図２に記載した0.2 μ g/ml（▽）もしくは2.0 μg/mlゲロニンと組み合わせて処理した細胞についての 用量−反応曲線を示す。 図４は、0.2 μg/mlゲロニンの不存在下および存在下における3.2 μg/ml TPP S_2aでの処理後におけるNHIK3025細胞でのタンパク質合成を示す。記号：●、TPP S_2a−ゲロニン；○、TPPS_2a＋ゲロニン。ゲロニンの不存在下または存在下で細 胞をTPPS_2aで一晩処理し、示した量の光に曝した。タンパク質合成は、³[Ｈ]ロ イシンのタンパク質への取込を測定することによって測定した。 図５は、１μg/mlゲロニンの不存在下および存在下における 25μg/ml AlPcS₂ および光での処理後のV79細胞でのタンパク質合成を示す。記号：●光増感剤＋ トキシン；○光増感剤。 図６は、１μg/mlゲロニンの不存在下および存在下における0.3 μg/ml TPPS_{2 a} および光での処理後のＨ146 細胞でのタンパク質合成を示す。記号：図５に同 じ。 図７は、１μg/mlゲロニンの不存在下および存在下における１μg/ml TPPS_2a および光での処理後のＶ79細胞でのタンパク質合成を示す。記号：図５に同じ。 図８は、１μg/mlアグロスチンの不存在下および存在下における3.2 μg/ml T PPS_2aおよび光での処理後のNHIK3025細胞でのタンパク質合成を示す。記号：図 ５に同じ。 図９は、１μg/mlサポニンの不存在下および存在下における3.2 μg/ml TPPS_{2 a} および光での処理後のNHIK3025細胞でのタンパク質合成を示す。記号：図５に 同じ。 図10は、１μg/mlゲロニンの不存在下および存在下における0.25 μg/ml 3-T HPPおよび光での処理後のNHIK3025細胞でのタンパク質合成を示す。記号：図５ に同じ。 図11は、１μg/mlゲロニンの不存在下および存在下における３μg/ml TPPS_2a および光での処理後のCOS-7 細胞でのタンパク質合 成を示す。記号：図５に同じ。 図12は、TPPS４の不存在下または存在下におけるゲロニンでの処理および50秒 の光照射後のNHIK3025細胞でのタンパク質合成を示す。記号：■TPPS₄＋光；▼ −TPPS₄−光；◇＋RPPS₂−光。細胞を75μg/ml TPPS₄および示した濃度のゲロニ ンで一晩処理し、すべての場合、光量は同じとする。タンパク質合成は光照射24 時間後に³[Ｈ]ロイシンのタンパク質への取込を測定することによって測定した 。 図13は、光の照射前に、３μg/mlゲロニンの不存在下または存在下において、 ３μg/ml TPPS_2aで18時間、続いてTPPS_2a不存在下で４時間処理した後のOHS細胞 におけるタンパク質合成を示す。細胞を50μＭクロロキンまたは10mM NH₄Cl 中 、同一の４時間インキュベートして、リソソームタンパク質分解を阻害した。 ジスルホン化アルミニウムフタロシアニンおよびテトラスルホン化アルミニウ ムフタロシアニン、スルホン化テトラフェニルポルフィリン（TPPS_n）、ナイル ブルー、クロリンｅ₆誘導体、ウロポルフィリンＩ、フィロエリスリンおよび恐 らくはヘマトポルフィリンおよびメチレンブルーを含めた多数の薬物が培養中の 細胞のエンドソームおよびリソソームに存在することはよく記載されている。こ れは、ほとんどの場合、飲食作用活性によるものである。本発明者らは、それら のリソソームに光増感剤を含有している細胞を光に曝すことがリソソームの浸透 性化および光増感剤の放出に導くことを示す。いくつかの場合、例えば、TPPS_2a およびTPPS₁の場合、実質量のリソソーム酵素活性がPDT 後のサイトゾルで見い 出されており、これは、リソソーム内容物がその活性を失うことなくサイトゾル に 放出され得ることを示す。光増感剤色素のこの効果は、一般に、本研究によると 、エンドソームおよびリソソームからの飲食された分子を放出させるのに使用す ることができる。 分子の細胞質への導入は、光増感剤色素、担体分子および免疫グロブリンと一 緒にまたは別々に細胞のサイトゾルに送達することを欲する分子に、これら分子 はすべてエンドソームおよび／またはリソソームに優先的に局在すべきものであ るが、細胞または組織をまず曝すことによって達成される。第２に、細胞または 組織を適当な波長およびエネルギーの光に曝し、光力学反応を誘導する。この光 力学反応はリソソームおよび／またはエンドソーム膜の破壊に導き、これらの小 胞の内容物はサイトゾルに放出される。 本発明の原理は図１に示す。光増感剤および細胞に導入すべき分子は同一区画 に局在することが必要である。また、外に添加された分子はリソソームおよびエ ンドソーム以外の細胞内区画、例えば、ゴルジ装置および小胞体に蓄積し得る。 かかる場合において、同一区画に局在した光増感性化合物は光と組み合わせて同 一目的で使用できる。但し、光量および光増感性化合物の組合せは細胞の機能を 破壊しない。 本発明は、光と組み合わせた光増感剤、例えば、TPPS_2a（隣接するフェニル基 上に２のスルホネート基を持つテトラフェニルポルフィン）は大部分の細胞を殺 すことなく機能的に無傷のリソソーム内容物の放出を誘導できるという我々のイ ン・ビトロ証明に基づくものである。同一の効果は、単独の、または光増感剤を エンドソーム・リソソームまたは他の細胞内区画に方向づける媒介体として使用 する他の分子または粒子と組み合わせた、および／または、それに連結させた他 の光増感性化合物を用いることによっても得られる。かかる媒介体は細胞表面に 結合し、かくしてレセプター媒介飲食作用を通じて光増感剤の摂取を増加させる 組織または細胞特異的抗体または他のリガンドであり得る。もう１つの媒介体は 復元したLDL −粒子の使用であろう。これらの粒子もレセプター媒介飲食作用に よって摂取される。LDL 粒子当たりの光増感剤の数およびLDL −粒子への結合は 、このようにして、天然LDL への予備結合と比較して増大し得る。 本発明は、イン・ビトロ使用に限定されず、イン・シトゥ処理またはエクス・ ビボ処理、続いて処理した細胞の注入によって、イン・ビボでも同様に使用でき る。エンドソームおよびリソソームへの摂取はイン・ビトロ処理につき前記した と同様にして増強できる。光増感剤が標的細胞によって摂取され、光が適当にデ リバーされる限り、すべての組織を処理することができる。 本発明は、光増感剤および光の双方に基づく。光は光増感剤によって吸収され なければならないか、または光増感剤の励起状態を間接的に誘導するものなけれ ばならない。使用する波長領域は、従って、光増感剤に依存する。照射光は単色 または平行にしたものである必要はない。適当な波長を放射するいずれの光源も 使用できる。 驚くべきことに、本研究によると光力学作用は、リソソーム内容物を放出する 潜在的細胞障害効果を中和するようである。本著者らは、NHIK3025細胞の培養に おいて、リソソームカテプシンがTPPD_2aの光力学作用によって実質的に阻害され ることを立証している。こ れは驚くべき本発明の効果であって、エンドソーム／リソソーム膜を破壊するこ とによって分子をサイトゾルに輸送した後に細胞の生存性および機能を維持する のを助ける。実験例および臨床利用例 １）癌処理 いくつかの光増感剤は新生物組織に優先的に蓄積し、回りの組織を越えて腫瘍 を選ぶ選択性は通常２〜３のファクターであるが、このファクターは脳組織のよ うないくつかの場合にはより高く、すなわち、30までである。癌の治療で臨床的 に興味深いことであるが、サイトゾルへの低い摂取または摂取がないことによっ て制限される分子は、本発明の手段によって導入することができる。後記にて例 示するゲロニンはこのような分子の例である。いくつかの他の分子は、単独でま たは他の分子（例えば、抗体、トランスフェリン、光増感剤、復元したLDL−粒 子上のアポＢ）に連結して使用できる。かかる組合せ処理の利点は、１）毒性下 での低い光の量はリソソームおよびエンドソームの破壊に十分であるので、腫瘍 組織の深い層での細胞障害効果が増強される；２）PDTは腫瘍局在領域に対して のみ与えられるのでトキシンの特異性が増強するということであろう。 ２）遺伝子治療 遺伝子治療、すなわち、患者細胞に対する遺伝子の治療的移入は、癌、嚢胞性 線維症、心血管病および多くの他の病気のごとき遺伝的 障害を治療する方法として有望である。今日、主な問題は、イン・ビボで起こり 得る、あるいはいくつかの場合にはエクス・ビボで達成し得るトランスフェクシ ョンである。今日、最も頻繁に使用されるベクター、すなわち、DNA 分子を細胞 にデリバーするのを助力する構造体は異なるタイプのウイルス、特にレトロウイ ルスおよびアデノウイルスである。かかる方法の欠点は、ベクターの安定性の低 さ、限定された特異性、低収率およびウイルスDNAのヒト細胞への導入である。 アンチセンスDNA または全遺伝子のいずれかのDNA は、エンドソームおよび／ またはリソソームの光化学的に誘導された破壊の助力によって細胞に導入できる 。処理はイン・ビボで達成できる。 ３）実験的利用 本発明は、広範囲の分子、例えば、通常は原形質膜に不浸透性である遺伝子、 抗体、操作されたタンパク質および化合物を培養中の細胞に導入するのに使用で きる。 本発明を以下の非限定的実例によってさらに説明する。実施例１ 本実施例は、光力学処理によってタンパク質合成阻害化合物がサイト ゾルに放出されることを説明する。 多数の植物トキシンは、サイトゾルに侵入し、リボソーム機能を酵素的に不活 化することによって細胞を殺す。ほとんどの細胞毒性植物タンパク質は、ジスル フィド架橋によって一緒に連結された２ のポリペプチド鎖ＡおよびＢからなる。鎖Ｂの機能はタンパク質を細胞の表面に 結合させることにあり、他方、鎖Ａは酵素的活性を含有する。ゲロニンは、無細 胞系でタンパク質合成を効果的に阻害する植物トキシンであるが、無傷細胞に対 してはほとんどまたは全く効果を有しない。無傷細胞に対する低い細胞障害効果 は、恐らくは、ゲロニンにおけるＢ鎖の欠如によるものであろう。 細胞を光に曝す前に、NHIK3025細胞をTPPS_2a（式Ｉ）およびゲロニンで、別々 にまたは一緒に18時間、続いてTPPS_2aおよびゲロニン無しの培地中で１時間イン キュベートした。タンパク質合成を光の照射24時間後に測定した。細胞単独を10 〜20％殺す光力学処理はタンパク質合成を30〜40％低下させた（図２）。図２に 示すごとく、ゲロニン単独は、光の存在下または不存在下でタンパク質合成をい くぶん阻害する。しかしながら、PDT にIC₅₀＝0.2μg/mlゲロニンを組み合わせ ることによって完全に阻害できる。このように、光力学処理の不存在下では、ゲ ロニンは実質的にサイトゾルに侵入しなかった。本実施例は、TPPS_2aおよび光を 用いて、機能的に無傷のマクロ分子を細胞サイトゾルに導入するのに使用できる ことを示す。 実施例２ 本実施例は、（色素に吸収される波長を持つ）光の量により、生存す る細胞分率の大きさをどのようにして決定できるかを説明する。 NHIK3025細胞を、実施例１の設計に基づいて、TPPS_2aおよびゲロニンと共にイ ンキュベートした。 細胞のクローン原性は光照射の24時間後に測定した。図３に示すごとく、光照 射を増加させた場合、実質的に全ての細胞がTPPS_2aおよび光で殺された。これは 、望まない細胞をPDT で殺すことに関する先行技術と合致する。ゲロニンを添加 すると、タンパク質合成に対するゲロニンの阻害効果のため、生存率は降下し、 これは今やゲロニンがサイトゾルに放出されたことを示す。濃度を増加させたゲ ロニンの添加は、光不活化に対する細胞の感受性の増加によって示されるように 、サイトゾルにおけるゲロニンの増加に導く。 このように、本発明は、各場合において、生存レベルを設定し、生きた細胞の 所望の分率を維持する光増感性化合物と光照射との組合せを選択する可能性を供 する。実施例３ 本実施例は、タンパク質合成比により判断して、いかにして光量変化 によりサイトゾルに放出されるゲロニンの量が制御されるかを説明する。 実施例１の設計に従って、NHIK3025細胞をTPPS_2aおよびゲロニンと共にインキ ュベートした。 図４は、タンパク質合成比によって判断して、50秒の毒素量を超える光がサイ トゾルにおけるゲロニン分率を増大させたことを示す。 実施例４〜11は、異なる細胞系に対する、異なる光増感剤およびトキシンでの 、本発明による方法の使用を示す。光増感剤の細胞内位置はリソソーム（TPPS₄ 、TPPS_2a、AlPcS_2a）およびリソソーム外（3-THPP）である。以下の省略を用い る：隣接するフェニル環上の２個のスルホネート基を持つアルミニウムフタロシ アニンをAlPcS_2a；４個のスルホネート基を持つメソテトラフェニルポルフィン をTPPS₄；隣接フェニル環上の２個のスルホネート基を持つメソテトラフェニル ポルフィンをTPPS_2a；テトラヒドロキシフェニルポルフィンを3-THPP。使用した 細胞系は、ヒト子宮頚（NHIK3025）、チャイニーズハムスター肺繊維芽細胞（V7 9）、SV40−形質転換アフリカミドリザル腎臓（CV1 −シミアン繊維芽細胞様の 細胞）（Cos-７）、ヒト骨肉腫細胞（OHS）および小細胞肺癌細胞（H146）から のイン・シトゥ・カルシノーマ細胞である。すべての実験は実施例１におけるご とくに設計した。実施例４ 本実施例は、トキシンとして機能するゲロニンの有り無しでのV79 細 胞における光増感剤AlPcS_2aの使用に関する（図５）。特異的光量（放射時間） を選択することによって、トキシンがない場合には、タンパク質合成のわずかな 減少によって示されるごとく非常に少ない細胞損失しか生じず、他方、ゲロニン については、タンパク質合成は顕著に減少することを示す。これは、AlPcS_2aの 細胞内局所化がリソソームであるにも拘わらず(Moan，J.Berg，K.，Anholt，H． およびMadslien，K.(1994)，光化学療法のための増感剤としてのスルホン化アル ミニウムフタロシアニン、V79 細胞にお ける局所化、色素蛍光および光感受性に対する小光量の効果，Int．J．Cancer 5 8:865-870)、実質的に細胞を障害することなく、リソソームを介してゲロニン分 子が細胞質に輸送されることを示す。実施例５ 本実施例は、細胞の生存に実質的に影響することなく、トキシンゲロ ニンがH146細胞に輸送されることを示す（図６）。TPPS_2aは細胞中でリソソーム に存在することが知られている（Berg，K.，Western，A.，Bommer，J．およびMo an，J.(1990)，ヒト・カルシノーマ細胞系におけるスルホン化メソ−テトラフェ ニルポルフィン類の細胞内局所化，Photochem．Photobiol．52:481-487;Berg,K. ，Madslien,K.,Bommer J．C.，Oftebro,R.，Winkelman，J.C.およびMoan，J．(1 991)、NHIK3025細胞におけるスルホン化メソテトラフェニルポルフィン類の光誘 導再局所化および用量分率の効果，Photochem．Photobiol．53:203-210; Berg， K.およびMoan，J.(1994)、光化学標的としてのリソソーム,Int．J．Cancer，59: 814-822）。実施例６ 本実施例は、光増感剤としてTPPS_2aを用いるV79 細胞における本発明 方法を説明する（図７）。実施例７ 本実施例は、光増感剤としてTPP_2aを用いるトキシンアグロスチンのN HIK細胞3025への輸送を説明する（図８）。実施例８ 本実施例は、TPP_2aを用いるトキシンサポニンのNHIK3025細胞の輸送 を説明する（図９）。実施例９ これは、エンドサイトーシス小胞（すなわち、エンドソームおよびリ ソソーム）（Peng，Q.，Danielsen,H.E.およびMoan,J. (1994)、癌の光力学療法についての優れた光増感剤：新生物細胞および組織にお ける光増感剤発蛍光団の蛍光検出のための共焦点レーザー走査顕微鏡の適用：Pr oceedings of Microscopy，Holography，and Interferometry in Biomedicine， SPIE Vol．2083:71-82）へ侵入しない光増感剤の場合、ゲロニンの有り無しにて 、３THPPのタンパク質合成効果間の有意な差異はない（図10）。このように、ゲ ロニンは細胞のサイトゾルに輸送されない。実施例10 本実施例は、本発明に従いTPPS_2aを用いることによるゲロニンのCOS- 7 細胞への輸送を示す（図11）。実施例11 本実施例は、本発明に従いTPPS_2aを用いることによるOHS 細胞へのゲ ロニンの輸送を示す（図13）。この細胞系では、リソソームにおいてかなりのタ ンパク質分解があり、これは、本実施例において、50μＭクロロキンまたは10mM NH₄Clいずれか中で細胞を４時間インキュベートすることによって阻害される。実施例12 実施例１と同様、本実施例は、細胞をTPPS₄および異なる濃度のゲロ ニンと共にインキュベートし、光に曝した場合に、ゲロニン濃度の関数としての 、NHIK3025細胞へのゲロニンの輸送を示す（図12）。細胞をゲロニン単独と共に インキュベートし、光に曝した場合、あるいは光の照射なくしてTPPS₄およびゲ ロニンと共にインキュベートした場合、ゲロニンの細胞への輸送は得られなかっ た。 本実施例は、異なる光増感剤および異なる光量を用い、広範囲の細胞において 、異なる分子を細胞サイトゾルに導入できることを示 す。導入すべき分子および光増感剤を同一細胞区画に輸送する限り、細胞を殺さ ない用量の光増感剤および光の後、外因性分子を細胞サイトゾルに導入すること ができる。生物学的区画に対する光化学効果は、その区画における光増感剤の量 、適用した光の量および光源の特性に依存する。培養における細胞に対する光化 学効果を評価する最善の方法は、従って、処理の24時間またはそれ以上の後に細 胞生存を測定することである。前記した処理の24時間後における細胞死滅および タンパク質合成に対する効果間に相関がある（データは示さず）。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９６年７月１１日 【補正内容】 PCT/US93/00683において、コポリマー担体に結合させた抗癌薬物および光活性 化薬物からなる薬物送達系が記載されている。投与に際して、この複合体は、飲 作用または食作用によって細胞内部に侵入し、エンドソームおよびリソソーム内 部に止まるであろう。リソソームでは、抗新生物化合物とポリマーとの間の結合 が加水分解され、前者はリソソーム膜を通って受動的にサイトゾルまで拡散でき る。かくして、この方法はリソソーム膜を通過して拡散できる小さな分子化合物 のための方法に限定する。拡散のタイムラグの後、適当な波長およびエネルギー の光源を適用して、光増感性化合物を活性化させる。抗癌薬物および光活性化薬 物の組み合わせた効果により、細胞が破壊される。かくして、公知の光活性化化 合物のすべての使用は細胞死滅に導く細胞構造の広範な破壊に向けられている。 エンドソーム／リソソーム膜の局所的破壊の後に膜不浸透性分子をサイトゾルに 放出する方法は知られていない。 かくして、本発明の目的は、その摂取が共に種々の担体によって容易となる得 る光活性化化合物とサイトゾルに輸送すべき分子（類）とに細胞を曝し、適当な 波長およびエネルギーの光に細胞を曝して、細胞の大部分の機能を破壊すること なく、エンドソーム膜およびリソソーム膜を破壊し、前記分子をサイトゾルに放 出することによって、培養または組織中の、生細胞のサイトゾルに分子類を輸送 する方法を提供することにある。光増感剤とサイトゾルに輸送すべき分子（類） とは夫々が適当な担体と複合体化し、随意に注目する分子の摂取を容易とするこ とができる。 この目的は、添付の請求の範囲によって特徴付けられる本発明によって得られ る。 本発明は、いずれかの分子を生細胞のサイトゾルに輸送する方法に関し、しか る後、サイトゾルで利用可能であるべきで、また細胞はその機能を維持すべきで ある。これは、担体分子類、標的化免疫グロブリン類およびサイトゾルに輸送さ れるべき分子類に結合された状態で、または分離された状態で一緒に細胞に摂取 され、エンドソーム、リソソームまたは他の細胞区画に位置するであろう光活性 化化合物に細胞を曝し、光増感性化合物を活性化する適当な波長の光に細胞を曝 して、光活性化化合物の作用およびエンドソーム／リソソーム内容物の可能な作 用によって、エンドソーム、リソソームまたは他の細胞区画膜のみが破壊され、 細胞がその機能を喪失することなく該分子類がサイトゾルに放出されることによ って達成される。 【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９６年７月１１日 【補正内容】 請求の範囲 １．光増感性化合物と該光増感性化合物に吸収される光とを用いることによっ て生細胞のサイトゾルに分子類を導入する方法において、 ａ）互いに結合しているかまたは分離している、前記光増感性化合物、担体分 子、および輸送すべき分子（類）を生細胞に与え； ｂ）次いで、飲食作用によりまたは他の方法にて、前記光増感性化合物、前記 担体分子および前記分子（類）を、エンドソーム、リソソームまたは他の細胞内 の膜制限区画に移動させ、それにより、細胞を； ｃ）所望の生存率に依存して量を変化させた、前記光増感性化合物の吸収スペ クトルに応じた適当な波長の光に曝すことにより、エンドソーム膜、リソソーム 膜または他の細胞内区画膜を破壊し、前記サイトゾルに導入されるべき分子類を 前記サイトゾルに放出し、そして光活性化された光増感性化合物は自身で細胞の 大部分を殺さないことを特徴とする分子導入方法。 ２．前記サイトゾルに放出される分子類は、DNA、オリゴ（デオキシ）ヌクレ オチド、mRNA、アンチセンスDNA、糖類、タンパク質類、ペプチド類、膜不浸透 性薬物類、他の膜不浸透性分子類、および前記分子類の共有結合または非共有結 合した組合せを含む群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。 ３．前記サイトゾルに放出される分子類は、タンパク質合成活性を修飾する物 質の群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。 ４．前記サイトゾルに放出される化合物は、ゲロニン、サポリンまたはアグロ スチンまたはこれらのいずれかの組合せであることを特徴とする請求項２記載の 方法。 ５．使用される光増感性化合物は、ポルフィリン類、フタロシアニン類、プル プリン類、クロリン類、ベンゾポルフィリン類、ナフタロシアニン類、カチオン 性色素類、テトラサイクリン類およびリソソーム指向性塩基類およびこれらの誘 導体を含む群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。 ６．使用される光増感性化合物は、隣接するフェニル基上に２個のスルホネー ト基を持つテトラフェニルポルフィン（TPPS_2a）、４個のスルホネート基を持つ メソテトラフェニルポルフィン（TPPS₄）または隣接するフェニル環上に２個の スルホネート基を持つアルミニウムフタロシアニン（AlPcS_2a）またはこれらの いずれかの組合せであることを特徴とする請求項５記載の方法。 ７．使用する担体分子類は、光増感性化合物またはサイトゾルに放出されるべ き分子類の摂取を容易とする、部位−指向性分子類であることを特徴とする請求 項１記載の方法。 ８．細胞の生存分率は、光増感性化合物の濃度に関連した光量を選択すること によって調節されることを特徴とする請求項１記載の 方法。 ９．サイトゾルに放出されるべき化合物と光増感剤と担体とを含有する、温血 動物または細胞培養における新生物および他の細胞プロセスの修飾用組成物にお いて、 ａ）サイトゾルに放出されるべき細胞のプロセス−修飾化合物と、光活性化に 際して細胞内区画膜を破壊する光増感性化合物との双方に結合され、エンドソー ム、リソソームまたは他の細胞内区画のごとき細胞内区画への移動を容易とする 担体、 ｂ）サイトゾルに放出されるべき化合物に結合された少なくとも１つの担体、 及び前記光増感性化合物に結合されたもう１つの同様のまたは同様ではない担体 のうちのいくつか、及び ｃ）サイトゾルに放出されるべき化合物または前記光増感性化合物のいずれか に結合された担体類の混合物、 からなる群から選択される構成部分を備えることを特徴とする。 10．前記サイトゾルに放出されるべき前記化合物は抗新生物化合物であること を特徴とする請求項９記載の組成物。 11．前記抗新生物化合物はゲロニンであることを特徴とする請求項10記載の組 成物。 12．サイトゾルに放出される前記化合物は、DNA、オリゴ（デオキシ）ヌクレ オチド、mRNA、アンチセンスDNA、糖類、タンパク質類、ペプチド類、膜不浸透 性薬物類、他の膜不浸透性分子類、および前記分子類の共有結合したまたは非共 有結合した組合せを含む群から選択されることを特徴とする請求項９記載の組成 物。 13．前記光増感性化合物は、ポルフィリン類、フタロシアニン類、プルプリン 類、クロリン類、ベンゾポルフィリン類、ナフタロシアニン類、カチオン性色素 類、テトラサイクリン類およびリソソーム指向性塩基類およびそれらの誘導体を 含む群から選択されることを特徴とする請求項９記載の組成物。 14．前記光増感性化合物は、隣接するフェニル基上に２個のスルホネート基を 持つテトラフェニルポルフィンであることを特徴とする請求項11記載の組成物。 15．前記担体は、光増感性化合物またはサイトゾルに放出されるべき分子類の 摂取を容易とする、部位−指向性分子類から選択されることを特徴とする請求項 ９記載の組成物。 16．光増感性化合物類、輸送されるべき分子類およびこれらの分子の輸送を容 易とし得るであろう担体化合物を含有することを特徴とする請求項１記載の方法 を実施するためのキット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．光増感性化合物と該光増感性化合物に吸収される光とを用いることによっ て生細胞のサイトゾルに分子類を導入する方法において、 ａ）互いに結合しているかまたは分離している、前記光増感性化合物、任意の ベクター分子、および輸送すべき分子（類）を生細胞に与え； ｂ）次いで、飲食作用によりまたは他の方法にて、前記光増感性化合物、前記 担体分子および前記分子（類）を、エンドソーム、リソソームまたは他の細胞内 の膜制限区画に移動させ、それにより、細胞を； ｃ）所望の生存率に依存して量を変化させた、前記光増感性化合物の吸収スペ クトルに応じた適当な波長の光に曝すことにより、エンドソーム膜、リソソーム 膜または他の細胞内区画膜を破壊し、前記サイトゾルに導入されるべき分子類を 前記サイトゾルに放出し、そして光活性化された光増感性化合物は自身で細胞の 大部分を殺さないことを特徴とする分子導入方法。 ２．前記サイトゾルに放出される分子類は、DNA、オリゴ（デオキシ）ヌクレ オチド、mRNA、アンチセンスDNA、糖類、タンパク質類、ペプチド類、膜不浸透 性薬物類、他の膜不浸透性分子類、および前記分子類の共有結合または非共有結 合した組合せを含む群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。 ３．前記サイトゾルに放出される分子類は、タンパク質合成活性を修飾する物 質の群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。 ４．前記サイトゾルに放出される化合物は、ゲロニン、サポリンまたはアグロ スチンまたはこれらのいずれかの組合せであることを特徴とする請求項２記載の 方法。 ５．使用される光増感性化合物は、ポルフィリン類、フタロシアニン類、プル プリン類、クロリン類、ベンゾポルフィリン類、ナフタロシアニン類、カチオン 性色素類、テトラサイクリン類およびリソソーム指向性塩基類およびこれらの誘 導体を含む群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。 ６．使用される光増感性化合物は、隣接するフェニル基上に２個のスルホネー ト基を持つテトラフェニルポルフィン（TPPS_2a）、４個のスルホネート基を持つ メソテトラフェニルポルフィン（TPPS₄）または隣接するフェニル環上に２個の スルホネート基を持つアルミニウムフタロシアニン（AlPcS_2a）またはこれらの いずれかの組合せであることを特徴とする請求項５記載の方法。 ７．使用するベクター分子類は、光増感性化合物またはサイトゾルに放出され るべき分子類の摂取を容易とする、部位−指向性分子類またはエンハンサ類であ ることを特徴とする請求項１記載の方法。 ８．細胞の生存分率は、光増感性化合物の濃度に関連した光量を 選択することによって調節されることを特徴とする請求項１記載の方法。 ９．サイトゾルに放出されるべき化合物と光増感剤と担体とを含有する、温血 動物または細胞培養における新生物および他の細胞プロセスの修飾用組成物にお いて、 ａ）サイトゾルに放出されるべき細胞のプロセス−修飾化合物と、光活性化に 際して細胞内区画膜を破壊する光増感性化合物との双方に結合され、エンドソー ム、リソソームまたは他の細胞内区画のごとき細胞内区画への移動を容易とする 担体、 ｂ）サイトゾルに放出されるべき化合物に結合された少なくとも１つの担体、 及び前記光増感性化合物に結合されたもう１つの同様のまたは同様ではない担体 のうちのいくつか、及び ｃ）サイトゾルに放出されるべき化合物と前記光増感性化合物と共に分離され ている担体類の混合物、 からなる群から選択される構成部分を備えることを特徴とする。 10．前記サイトゾルに放出されるべき前記化合物は抗新生物化合物であること を特徴とする請求項９記載の組成物。 11．前記抗新生物化合物はゲロニンであることを特徴とする請求項10記載の組 成物。 12．サイトゾルに放出される前記化合物は、DNA、オリゴ（デオキシ）ヌクレ オチド、mRNA、アンチセンスDNA、糖類、タンパク質類、ペプチド類、膜不浸透 性薬物類、他の膜不浸透性分子類、および前記分子類の共有結合したまたは非共 有結合した組合せを含む群 から選択されることを特徴とする請求項９記載の組成物。 13．前記光増感性化合物は、ポルフィリン類、フタロシアニン類、プルプリン 類、クロリン類、ベンゾポルフィリン類、ナフタロシアニン類、カチオン性色素 類、テトラサイクリン類およびリソソーム指向性塩基類およびそれらの誘導体を 含む群から選択されることを特徴とする請求項９記載の組成物。 14．前記光増感性化合物は、隣接するフェニル基上に２個のスルホネート基を 持つテトラフェニルポルフィンであることを特徴とする請求項11記載の組成物。 15．前記担体は、光増感性化合物またはサイトゾルに放出されるべき分子類の 摂取を容易とする、部位−指向性分子類またはエンハンサ類から選択されること を特徴とする請求項９記載の組成物。 16．光増感性化合物類と、細胞膜輸送を修飾し、ある種の細胞集団または他の 関連機能を容易とする化合物類とを含有することを特徴とする請求項１記載の方 法を実施するためのキット。