PT783323E - Transferencia de moleculas para o citosol de celulas por meio de compostos fotossensibilizantes - Google Patents

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DESCRIÇÃO "TRANSFERÊNCIA DE MOLÉCULAS PARA O CITOSOL DE CÉLULAS POR MEIO DE COMPOSTOS FOTOSSENSIBILIZANTES" A presente invenção refere-se a um método para a introdução de moléculas em células por ruptura de membranas endossómicas e lisossómicas utilizando tratamento fotodinâmico, sem causar a morte da maioria das células pelo tratamento fotodinâmico. A maioria das moléculas não penetram facilmente nas membranas celulares. Os métodos para a introdução de moléculas no interior do citosol de células vivas são ferramentas úteis para a manipulação e para o estudo de processos biológicos. Entre os métodos utilizados mais habitualmente hoje em dia podem citar-se a microinjecção, a fusão mediada por glóbulos vermelhos fantasmas e a fusão de lipossomas, a lise osmótica de pinossomas, a carga por raspagem, a electroporação, o fosfato de cálcio e a transfecção mediada por virus. Estas técnicas são úteis para investigações de células em cultura, se bem que em muitos casos sejam impraticáveis, demoradas, pouco eficazes ou induzam uma morte celular significativa. Estas técnicas não são, por conseguinte, óptimas para utilização em investigação biológica e médica ou em terapia em que se pretenda que as células se mantenham funcionais. É bem sabido que as porfirinas e muitos outros compostos fotossensibilizantes induzem efeitos citotóxicos sobre as células e os tecidos. Estes efeitos são baseados no facto de que os compostos fotossensibilizantes libertam após exposição à luz oxigénio singuleto (1¾) que decompõe as membranas das células e as estruturas celulares e acaba por provocar a morte das células se a destruição é profunda. Estes efeitos têm sido utilizados para tratar vários tipos de doenças neoplásicas. 0 1 tratamento é designado terapia fotodinâmica (TFD) e baseia-se na injecçào de um corante fotossensibilizaaLe e de localização do tumor seguida da exposição da região do tumor à luz. 0 efeito citotóxico é mediado principalmente por meio da formação de oxigénio singuleto. Este intermediário reactivo tem um tempo de vida muito curto nas células (<0,04 ps) . Deste modo, o efeito citotóxico primário do TFD) é executado durante a exposição à luz e muito perto dos locais de formação de ^2. O 102 reage com as proteínas (histidina, triptofano, metionina, cisteína c tirosina), com o ADN (guanina), com ácidos gordos insaturados e com o colesterol e oxida-os. Uma das vantagens do TFD é que cs tecidos não expostos à luz não são afectados. Existe extensa documentação sobre a utilização de TFD para destruir populações de células indesejadas, por exemplo células neoplásicas. Várias patentes referem-se a compostos fotodinâmicos isolados ou conjugados com imunoglobulinas dirigidas a determinantes receptores de células neoplásicas que tornam o complexo mais especifico em relação ao tipo de células. Alguns compostos fotoquímicos, tais como derivados da hematoporfirina, têm além disso uma capacidade inerente para se concentrarem em células malignas. Estes métodos e compostos, que se destinam a destruir as células indesejáveis, estão descritos na Patente norueguesa NO 173319, nos pedidos de Patentes norueguesas n.°s 90 0731, 90 2634, 90 1018, 94 1548, 85 1897, 93 4837, 92 4151 e 89 1491.

Em PCT/US93/00683 descreve-se um sistema de libertação de fármacos que é constituído por um fármaco anticanceroso e um fármaco fotoactivável ligados a um suporte copolimérico. Após administração, este complexo entra no interior da célula por pinocitose ou fagocitose e localiza-se no interior dos endossomas e dos lisossomas. Nos lisossomas, a ligação entre o composto antineoplástico e o polímero é hidrolisada e o composto pode difundir-se passivamente através da membrana do lisossoma para o citosol. Assim, este método está limitado a composto de moléculas pequenas que podem difundir-se através das membranas dos lisossomas. Após deixar transcorrer um 2 período para a difusão, aplica-se uma fonte luminosa de comprimento de onda e energia apropriados a fim de activar υ composto fotoactivável. 0 efeito combinado do fármaco anticanceroso e do fármaco fotoactivável destrói a célula. Deste modo, toda a utilização conhecida de compostos fotoactiváveis é dirigida para a destruição extensa de estruturas celulares levando à morte das células. Não é conhecido qualquer método para libertar moléculas a que a membrana é impermeável no interior do citosol após a ruptura das membranas endossómicas/lisossómicas. 0 objecto da presente invenção é por conseguinte proporcionar um método para o transporte de moléculas para o interior do citosol de células vivas, em cultura ou em tecidos, por exposição das células a um composto fotoactivável, a(s) molécula(s) que se pretende transportar para o interior do citosol, podendo ser em ambos os casos o transporte facilitado por vários veículos, exposição da célula à luz de comprimento de onda e energia adequados a fim de causar a ruptura das membranas endossómicas e lisossómicas e libertar as moléculas no interior do citosol sem destruir a funcionalidade da maioria das células. 0 fotossensibilizante e a(s) molécula(s) que se pretende transportar para o interior do citosol podem opcionalmente estar conjugados com veículos adequados, os quais podem ser iguais ou diferentes, facilitando a entrada das moléculas de interesse. Estes veículos podem ter acoplados a si tanto o composto de modificação do processo celular a ser libertado no citosol como o composto fotossensibilizante, ou pelo menos um veículo tem acoplado a si o composto a ser libertado no citosol e outro veículo igual ou diferente tem acoplado a si o composto fotossensibilizante.

Este objecto é alcançado pela presente invenção caracte-rizada pelas reivindicações em anexo. Ά presente invenção refere-se a um método para o transporte dc qualquer molécula para o interior do citosol de 3 células vivas após o que as moléculas ficarão disponíveis no citosoi e a célula manterá a sua f uncionalidade. l3to é efectuado por exposição da(s) célula(s) a um composto fotoactivável que é absorvido pela célula e fica localizado em endossomas, lisossomas ou outros compartimentos celulares, conjugado a ou em conjunto mas em separado com moléculas veiculares, imunoglobulinas de direccionamento e as moléculas a serem transportadas para o interior do citosoi e exposição das células a luz de comprimento de onda adequado a fim de activar o composto fotossensibilizante, de modo que apenas as membranas endossómicas, lisossómicas ou de outros compartimentos celulares se rompem e as moléculas são libertadas no citosoi sem que as células percam a sua funcionalidade por acção do composto fotoactivado e possível acção do conteúdo endossómico/lisossómico.

Em seguida a presente invenção é descrita em pormenor e ilustrada pelas figuras, nas quais;

Fig. 1 representa a ilustração de como as moléculas podem ser introduzidas no interior do citosoi celular por meio da presente invenção. 0 f otossensibilizante (S) e as moléculas seleccionadas (M) são incorporadas por endocitose nas células (I, ilustra a invaginação da membrana plasmática iniciando o processo de endocitose) e ambas as substâncias acabam por ficar nas mesmas vesículas {II) . Quando estas vesículas são expostas à luz, as membranas das vesículas rompem-se e o seu conteúdo é libertado (III);

Fig. 2 ilustra a síntese proteica em células NHIK 3025 após tratamento com gelonina na ausência ou na presença de TPPS2a e exposição à luz durante 50 s. Símbolos: o, TPPS2a + luz; ·, -TPPS2a - luz; V, +TPPS2a “ luz; T, -TPPS2a + luz. As células foram tratadas com 3,2 μ9/πι1 de TPPS2a e com a 4 concentração indicada de gelonina de um dia para o outro e em Lodos os casos receberam a mesma do3e de luz. A síntese proteica foi medida por medição da incorporação de 3[H]leucina nas proteínas 24 h após a exposição à luz;

Fig. 3 apresenta as curvas de dose-resposta para células tratadas com TPPS2a e luz apenas (o) ou em combinação com 0,2 μg/ml (V) ou 2,0 μg/ml de gelonina conforme descrito na Fig. 2; e

Fig. 4 apresenta a síntese proteica em células NHIK 3025 após tratamento com 3,2 μg/ml de TPPS2a e luz na ausência ou na presença de 0,2 μς/ιηΐ de gelonina. Símbolos: ·, TPPS2a - gelonina; o, TPPS2a + gelonina. As células foram tratadas com TPPS2a na ausência ou na presença de gelonina de um dia para o outro e expostas às doses indicadas de luz. A sintese proteica foi medida por medição da incorporação de 3[H]leucina nas proteínas.

Fig. 5 ilustra a síntese proteica em células V79 após tratamento com 25 pg/ml de AlPcS2 e luz na ausência e na presença de 1 μς/πιΐ de gelonina. Símbolos: ·, fotossensibilizante + toxina; o, fotos-sensibilizante,

Fig. 6 ilustra a síntese proteica em células H146 após tratamento com 0,3 pg/ml de TPPS2a e luz na ausência e na presença de 1 μg/ml de gelonina. Símbolos: como na Fig. 5,

Fig. 7 ilustra a síntese proteica em células V79 após tratamento com 1 μ9/ιη1 de TPPS2a e luz na ausência e na presença de 1 μg/ml de gelonina. Símbolos: como na Fig. 5, 5

Fig. 8 ilustra a síntese proteica em células NHIK3025 após Lr ei Lamento com 3,2 pg/ml de TFFG2a e luz na ausência e na presença de 1 μ9/πι1 de agrostina. Símbolos: como na Fig. 5,

Fig. 9 ilustra a síntese proteica em células NHIK3025 após tratamento com 3,2 μς/ιηΐ de TPPS2a e luz na ausência e na presença de 1 pg/ml de saporina. Símbolos: como na Fig. 5,

Fig. 10 ilustra a síntese proteica em células NHIK3025 após tratamento com 0,25 pg/ml de 3-THPP e luz na ausência e na presença de 1 μς/πιΐ de gelonina. Símbolos: como na Fig. 5,

Fig. 11 ilustra a síntese proteica em células COS-7 após tratamento com 3 μ9/πι1 de TPPS2a e luz na ausência e na presença de 1 pg/ml de gelonina. Símbolos: como na Fig. 5,

Fig. 12 ilustra a sintese proteica em células NHIK 3025 após tratamento com gelonina na ausência ou na presença de TPPS4 e exposição à luz durante 50 s. Símbolos: , TPPS4 + luz; ▼, -TPPS4 - luz; 0, +RPPS4 - luz. As células foram tratadas com 75 pg/ml de TPPS4 e com a concentração indicada de gelonina de um dia para o outro e em todos os casos receberam a mesma dose de luz. A síntese proteica foi medida por medição da incorporação de 3[H]leucina nas proteínas 24 h após a exposição à luz; e

Fig. 13 ilustra a síntese proteica em células OHS após tratamento com 3 pg/ml de TPPS2a durante 18 horas seguido de 4 horas na ausência de TPPS2a e na ausência ou na presença de 3 μg/ml de gelonina antes de exposição à luz. As células foram incubadas durante as 6 mesmas 4 horas em cloroquina 50 μΜ ou NH4C1 10 mM a fim de inibir α degradação lisossóinica de proteínas.

Está bem documentado que vários fármacos, incluindo a ftalocianina tetrassulfonada de alumínio, as tetrafenilporfinas suilonadas (TPPSr.) , o azul do Nilo, os derivados da clorina e^, a uroporfirina I, a filoeritrina e possivelmente a hematoporf irina e o azul de metileno estão localizados nos endossomas e lisossemas de células em cultura. Na maioria dos casos isto é devido a actividade de endocitose. Os inventores mostraram que a exposição à luz de células que contêm fotos-sensibilizantes nos seus lisossomas levam a uma permeabilização dos lisossomas e à lioertação do fotossensibilizante. Em alguns casos, p. ex. no caso de TPPS2a e de TPPSi, foram encontradas quantidades substanciais de actividade de enzima lisossómica no citosol após TFD, indicando que o conteúdo lisossómico pode ser libertado para o citosol sem perder a sua actividade. Este efeito de corantes fotossensibilizantes pode ser utilizado para libertar moléculas que sofreram endocitose a partir de endossomas e lisossomas em geral de acordo com a presente investigação. A introdução de moléculas no interior do citoplasma celular é conseguida pela exposição em primeiro lugar das células ou do tecido a um corante fotossensibilizante, à(s) molécula(s) que se pretende introduzir no interior do citosol das células em conjunto ou não com moléculas veiculares e imunoglobulinas, devendo todos estes localizar-se de preferência nos endossomas e/ou nos lisossomas. Em segundo lugar, as células ou o tecido são expostos a luz de comprimento de onda e energia adequados induzindo uma reacção fotodinâmica. Esta reacção fotodinâmica levará à ruptura das membranas lisossómicas e/ou endossómicas e o conteúdo destas vesículas será libertado para o citosol.

Os princípios da presente invenção encontram-se ilustrados 7 na Fig. i. É necessário que o fotossensibilizante e a molécula a ser introduzida nas células estejam localizados nos mesmos compartimentos. Deve também enfatizar-se que é possível que moléculas adicionadas externamente se acumulem em compartimentos intracelulares para além dos lisossomas e dos endossomas, p. ex. nos aparelhos de Golgi e no retículo endoplasmático. Nestes casos, os compostos fotossensibilizantes localizados nos mesmos compartimentos podem em combinação com a luz ser utilizados para os mesmos fins desde que a combinação de dose de luz e de composto fotossensibilizante não destrua a funcionalidade das células. A presente invenção baseia-se na demonstração pelos inventores de que um fotossensibilizante, por exemplo TPPS2a (tetrafenilporfina com 2 grupos sulfonato nos grupos fenilo adjacentes) em combinação com luz pode induzir a libertação de conteúdo lisossómico funcionalmente intacto sem causar a morte de uma grande fracção de células. 0 mesmo efeito pode ser obtido por utilização de outros compostos fotossensibilizantes isoladamente ou associados com /ligados a outras moléculas ou partículas utilizadas como vectores para o direccionamento dos fotossensibilizantes para os endossomas / lisossomas ou outros compartimentos intracelulares. Estes vectores podem ser anticorpos específicos ou outros ligandos que se ligam à superfície da célula, aumentando deste modo a absorção do fotossensibilizante por meio de endocitose mediada por receptor. Outro vector poderia ser a utilização de partículas de LDL reconstituídas. Estas partículas são também absorvidas por endocitose mediada por receptor. 0 número de moléculas de fotossensibilizante por partícula de LDL e a ligação das partículas de LDL podem deste modo ser aumentados em comparação com a prc-ligação a LDL nativo. A presente invenção não se restringe à utilização in vitro, mas pode também ser utilizada in vivo, quer por tratamento local ou por tratamento ex vivo seguido de injecção 8 das células tratadas. A absorção no interior dos endossomas e dos lisossomas pode ser intensificada do iuesmo modo conforme descrito anteriormente para o tratamento in vitro. Todos os tecidos podem ser tratados desde que o fotossensibilizante seja absorvido pelas células visadas e que a luz possa ser fornecida de modo aaequado. A presente invenção baseia-se simultaneamente num fotossensibilizante e na luz. A luz deve ser absorvida pelo fotossensibilizante ou induzir indirectamente um estado excitado do fotossensibilizante. A região de comprimentos de onda a utilizar dependerá por conseguinte do fotossensibilizante. A luz a utilizar para a exposição não necessita de ser monocromática ou colimada. Pode utilizar-se qualquer fonte de luz que emita nos comprimentos de onda apropriados.

Surpreendentemente, aprece que a acção fotodinâmica de acordo com a presente invenção neutraliza o efeito potencialmente citotóxico da libertação do conteúdo lisossómico. Os presentes autores provaram deste modo que a catepsina lisossómica é substancialmente inibida pela acção fotodinâmica do TPPS2a numa cultura de células NHIK 3025. Este facto foi um efeito surpreendente da presente invenção e ajuda a manter a viabilidade e a funcionalidade das células após o transporte de moléculas para o interior do citosol por ruptura de membranas endossómicas/lisossómicas.

Exemplos de utilização experimental e clínica 1) Tratamento de cancro Vários fotossensibilizantes acumulam-se preferencialmente nos tecidos neoplásticos, sendo a selectividade para um tumor em relação ao tecido circundante normalmente de um factor de 2 a 3, mas este factor pode em alguns casos, tais como em relação aos tecidos cerebrais, ser superior, isto é, até 30. Por meio 9 da presente invenção é possível introduzir no interior do citosol moléculas que podem ser de interesse clínico para o tratamento do cancro, mas que sofrem restrições por uma baixa absorção ou absorção nula pelo citosol. A gelonina, conforme exemplificado mais adiante, é um exemplo de uma molécula destas. Podem ser utilizadas várias outras moléculas, quer isoladamente quer ligadas a outras moléculas, (p. ex. anticorpos, transferrina, fotossensibilizantes, apoB sobre partículas de LDL reconstituídas) . A vantagem de um tratamento de combinação como os referidos será 1) intensificar o efeito citotóxico em camadas mais profundas dos tecidos do tumor, uma vez que são suficientes doses reduzidas e subtóxicas de luz para a ruptura dos lisossomas e dos endossomas; 2) intensificar a especificidade da toxina, uma vez que o TFD é apenas dado à área de localização do tumor. 2) Terapia genética A terapia genética, isto é, a transferência terapêutica de genes para as células do doente, é um método prometedor para o tratamento de muitas afecções genéticas tais como cancro, fibrose cística, doenças cardiovasculares e muitas outras doenças. 0 problema principal hoje reside na transfecção que deve ocorrer in vivo ou em alguns casos pode ser efectuada ex vivo. Hoje em dia, o vector mais frequentemente utilizado, isto é, a estrutura que ajuda o fornecimento de moléculas de ADN para o interior das células, é constituído por diferentes tipos de vírus, em especial de retrovírus e de adenovírus. As desvantagens destes métodos são uma reduzida estabilidade do vector, uma especificidade limitada, baixos rendimentos e a introdução de ADN de vírus nas células humanas. É possível introduzir ADN, quer ADN anti-sentido quer genes inteiros, em células com o auxílio de ruptura induzida por meios fotoquímicos em endossomas e/ou em lisossomas. 0 tratamento pode ser efectuado in vivo. 10 3) Utilização experimental A presente invenção pode ser utilizada para introduzir uma ampla variedade de moléculas no interior de células em cultura, p. ex. genes, anticorpos, proteínas manipuladas e compostos para os quais a membrana plasmática não é normalmente permeável. A invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos não limitativos.

Exemplo 1. Este exemplo demonstra que o tratamento fotodinâmico liberta para o interior do citosol um composto que inibe a síntese proteica. Várias toxinas vegetais causam a morte celular por penetração no citosol e inactivação enzimática da função ribossómica. A maioria das proteínas vegetais citotóxicas são constituídas por duas cadeias polipeptídicas, A e B, ligadas entre si por pontes de dissulfureto. A função da cadeia B é ligar a proteína à superfície das células, enquanto que a cadeia A contém a actividade enzimática. A gelonina é uma toxina vegetal que inibe eficazmente a síntese proteica em sistemas isentos de células, mas tem um efeito reduzido ou nulo sobre as células intactas. O reduzido efeito citotóxico sobre células intactas é provavelmente devido à ausência da cadeia B na gelonina.

Incubaram-se células NHIK 3025 com TPPS2a (Fórmula I) e gelonina, separadamente ou em conjunto durante 18 h, e em seguida durante uma hora em meio isento de TPPS2a e gelonina antes de expor as células à luz. Mediu-se a síntese proteica 24 h após a exposição à luz. O tratamento fotodinâmico, que mata 10 a 20 % das células apenas, reduziu a síntese proteica em 30 a 40 % (Fig. 2) . Conforme se observa na Fig. 2, a gelonina isolada na presença ou na ausência de luz inibe a síntese proteica num deLerminado grau. Νυ enLunlo, a aiulese proLeiua pode ser 11 completamente inibida combinando o TFD com a gelonina cpm uma IC5o=0,2 μς/ιηΐ de gelonina. Deste modo, na ausência do tratamento fotodinâmico a gelonina essencialmente não penetra no citosol. Este exemplo indica que o TPPS2s e a luz podem ser utilizados para introduzir macromoléculas funcionalmente intactas no citosol celular. r4

TPPS4 : Rl-4=SC>3 TPPS2a: Rlr3 = SC>3 , R2,4=H TPPS2a: Rl(2=S03 , R3,4=H TPPSi: Ri =S03 , R2-4=H

Exemplo 2. Este exemplo ilustra como a dose de luz (com o comprimento de onda que é absorvido pelo corante) pode ser utilizada para decidir a dimensão da fracção celular sobrevivente.

Incubaram-se células NHIK 3025 com TPPS2a e gelonina de acordo com o esquema do Exemplo 1.

Mediu-se a sobrevivência clonogénica das células 24 h após a exposição à luz. Conforme se ilustra na Fiq. 3, virtualmente 12 todas as células foram mortas com TPPS2a e luz quando se aumentou a exposição à luz. Este facto está de acordo com α técnica anterior relativa à morte de células indesejáveis com TFD. Quando se adiciona gelonina, a taxa de sobrevivência reduz-se devido ao efeito inibidor da gelonina sobre a síntese proteica, mostrando que a gelonina é agora libertada no cítosol. 0 aumento da concentração da gelonina adicionada leva a que exista mais gelonina no citosol, conforme é indicado pelo aumento da sensibilidade das células à inactivação produzida pela luz. A presente invenção oferece portanto a possibilidade de ajustar o nível de sobrevivência em cada caso e de seleccionar o composto fctossensibilizante e a exposição à luz que conservarão viva a fracção de células desejada.

Exemplo 3. Este exemplo ilustra como a alteração das doses de luz controla a quantidade de gelonina libertada no citosol, conforme determinado pela síntese proteica relativa.

Incubaram-se células NHIK 3025 com TPPS2a e gelonina de acordo com o esquema do Exemplo 1. A Figura 4 mostra que a exposição à luz acima do nivel tóxico de 50 s fez aumentar a fracção de gelonina no citosol, conforme determinado pela síntese proteica relativa. O Exemplo 4-11 demonstra a utilização do método de acordo com a presente invenção sobre diferentes linhas de células e com diferentes fotossensibilizantes e toxinas. A localização intracelular dos fotossensibilizantes é lisossómica (TPPS4, TPPS2a, AlPcS2a) e extralisossómica (3-THPP) . Utilizam-se as seguintes abreviaturas: AlPcS2a para ftalocianina de alumínio com 2 grupos sulfonato em anéis fenilo adjacentes; TPPS4 para meso-tetrafeniiporfina com 4 grupos sulfonato; TPPS2a para meso--tetrafenilporfína com 2 grupos sulfonato em anéis fenilo adjacentes; 3-THPP para tetra-hidroxi1feni 1 -porfina. As linhas 13 de células utilizadas são de células de carcinoma in situ do colo uterino humano (NH1K 3025), fibroblastos de pulmão de criceto chinês (V 79) , rim de símio Verde Africano transformado por SV-40 (células semelhantes a fibroblastos de simio CV1) células de osteossarcoma humano (Cos-7) (OHS) e células de cancro de pulmão de células pequenas (H146). Todas as experiências seguiram os procedimentos do Exemplo 1.

Exemplo 4. Este exemplo refere-se à utilização do fotos-sensibilizante AlPcS2a em células V79 com/sem gelonina como toxina. Por selecção de uma dose de luz especifica (tempo de irradiação) demonstra-se que sem a toxina se produz um dano muito pequeno às células, conforme se ilustra pela pequena redução na síntese proteica, enquanto que com gelonina a síntese proteica se reduz profundamente. Este facto mostra o transporte de moléculas de gelonina para o interior do citoplasma celular por meio dos lisossomas sem danificar essencialmente as células mesmo tendo em conta que a localização intracelular do AlPcS2a é lisossómica (Moan, J., Berg, K., Anholt, H. e Madslien, K. (1944). Sulfonated aluminium phtalocyanínes as sensitizers for photochemoterapy. Effects of small light doses on localization, dye fluorescence and photosensitivity in V79 cells. Int. J. Câncer 58: 865-870).

Exemplo 5. Este exemplo demonstra o transporte da toxina gelonina para o interior de células H146 sem afectar essencialmente a viabilidade das células. (Fig. 6). Sabe-se que a TPPS20 se localiza nos lisossomas na célula. (Berg, K., Western, A., Bommer, J. e Moan, J. (1990) Intracellular localisation of sulfonated meso-tetraphenylporphines in a human carcinoma cell line. Photochem. Photobiol. 52:481-487; Berg, K. , Madslien, K., Bommer J.C., Oftebro, R., Winkelman, J.C. e Moan, J. (1991). Light induced relocalization of sulfonated meso-tetraphenylporphines in NHIK 3025 cells and effects of dose fractionation. Photochem. Photobiol. 53:203-210; Berg, K. e Moan, J. (1994) Lysosomes as photochemical targets. Int. J. Câncer. 59:814 822). 14

Exemplo 6. Este exemplo demonstra o método de acordo com a presente invenção em células V79 uLilizando TPPS2a como fotos-sensibilizante (Fig. 7) .

Exemplo 7. Este exemplo demonstra o transporte para células NHIK 3025 da toxina agrostina utilizando o fotossensibilizante TPP2a (Fig. 6; .

Exemplo 8. Este exemplo demonstra o transporte da toxina saporina para células NHIK 3025 utilizando o fotossensibilizante TPP2a (Fig. 9).

Exemplo 9. Este exemplo serve de comparação para demonstrar que quando um fotossensibilizante (3-THPP) que não penetra nas vesículas endociticas (isto é, nos endossomas e lisossomas) (Peng, Q., Danielsen, H.E. e Moan, J. (1994) Potent photosensitizers for photodynamic therapy of câncer: Applications of confocal laser scanning microscopy for fluorescence detection of photosensitizing fluorophores in neoplastic cells and tissues. Em: Proceedings of Microscopy, Holography, and Interferometry in Biomedicine. SPIE vol. 2083:71-82), não há uma diferença significativa entre o efeito sobre a síntese proteica de 3THPP com e sem gelonina (Fig. 10). Deste modo, a gelonina nâo é transportada para o interior do citosol das células.

Exemplo 10. Este exemplo demonstra o transporte de gelonina para o interior de células COS-7 utilizando TPPS2a de acordo com a presente invenção (Fig. 11) .

Exemplo 11. Este exemplo demonstra o transporte de gelonina para o interior de células OHS utilizando TPPS2a de acordo com a presente invenção (Fig. 13) . Nesta linha de células há uma degradação considerável de proteína nos lisossomas, que no presente exemplo é inibida por incubação das células durante 4 horas em cloroquina 50 μΜ ou em NH4CI 10 mM. 15

Exemplo 12. De modo semelhante ao exemplo 1, este exemplo demonstra o transporte de gelonina para o interior de células NHIK 3025 como uma função da concentração de gelonina quando as células são incubadas com TPPS4 e diferentes concentrações de gelonina e expostas à luz (Fig. 12) . Quando as células são incubadas com gelonina apenas e expostas à luz, ou incubadas com TPPS4 e gelonina sem exposição à luz, não foi obtido transporte de gelonina para o interior das células.

Os exemplos demonstram que é possível introduzir diferentes moléculas no interior do citosol celular com uma ampla variedade de células utilizando diferentes fotos-sensibilizantes e doses de luz. É possivel introduzir moléculas exógenas no citosol celular após doses de fotossensibilizantes e de luz que não causam a morte das células, desde que as moléculas a ser introduzidas e os fotossensibilizantes sejam transportados para os mesmos compartimentos celulares. 0 efeito fotoquímico sobre um compartimento biológico depende da quantidade de fotossensibilizantes nesse compartimento, da dose de luz aplicada e de várias propriedades da fonte de luz. 0 melhor modo de avaliar os efeitos fotoquímicos nas células em cultura consiste por conseguinte em medir a sobrevivência das células 24 horas após o tratamento. Existe uma boa correlação entre o efeito sobre a morte das células e a inibição da síntese proteica 24 horas após os tratamentos, conforme se apresenta anteriormente (dados não apresentados) .

Lisboa, 30 de Novembro de 2001

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Claims (25)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método in vitro para a introdução de moléculas no interior do citosoi de células vivas por utilização de compostos f otossensibilizantes e de luz absorvida pelo composto fotossensibiliaante caracterizado por a) o composto fotossensibilizante e a(s) molécula (s) a serem transportadas, que podem opcionalmente estar ligadas às mesmas ou diferentes moléculas veiculares, serem aplicados às células vivas e; b) serem em seguida translocadas por via endocitica ou por outras vias para o interior de endossomas, lisossomas ou outros compartimentos intracelulares limitados por membranas, sendo as células; c) expostas à luz com comprimentos de onda adequados de acordo com o espectro de absorção do composto fotossensibilizante, em doses variáveis em função da taxa de sobrevivência pretendida de tal modo que as membranas dos endossomas, dos lisossomas ou de outros compartimentos intracelulares sofrem ruptura e as moléculas a serem introduzidas no citosoi são libertadas no citosoi, e por o composto fotossensibilizante activado pela luz não causar por si próprio a morte da maioria das células.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que as referidas moléculas veiculares têm ligados a si tanto o composto a ser libertado no citosoi como o composto fotossensibilizante, ou em que pelo menos um veiculo tem ligado a si o composto a ser libertado no citosoi e outro veículo semelhante uu diferente tem ligado a si o composto fotossensibilizante .
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por as moléculas que são libertadas no citosoi serem 1 seleccionadas de um grupo constituído por ADN, oligo-(desoxi)nucleólidos, ARNm, ADN anti-sentido, açúcares, proteínas, peptídeos, fármacos aos quais as membranas são impermeáveis, outras moléculas às quais as membranas são impermeáveis e combinações com ligações covalentes ou não covalentes das moléculas referidas atrás.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que as moléculas que são libertadas no citosol são proteínas ou peptídeos.
5. 5. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracte-rizado por as moléculas que são libertadas no citosol serem seleccionadas de um grupo constituído por substâncias que modificam a actividade de síntese proteica.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o composto que é libertado no citosol ser gelonina, saporina ou agrostina ou qualquer combinação destas.
7. 7. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado por os compostos fotossensibilizantes utilizados serem seleccionados de um grupo constituído por porfirinas, ftalocianinas, purpurinas, clorinas, benzoporfirinas, naftalocianinas, corantes catiónicos, tetraciclinas e bases fracas lisossomotrópicas e seus derivados.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o composto fotossensibilizante utilizado ser tetrafenil-porfina com 2 grupos sulfonato em anéis fenilo adjacentes (TPPS2a), meso-tetrafenilporfina com 4 grupos sulfonato (TPPS4) ou ftalocianina de alumínio com 2 grupos sulfonato em anéis fenilo adjacentes (AlPcS2a) ou qualquer combinação destes compostos.
9. 9. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizado por as moléculas veiculares utilizadas serem 2 moléculas de direccionamento a sítios que facilitam a absorção do composto fotossensibilizante ou das moléculas que se pretende libertar no interior do citosol.
10. 10. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, caracterizado por a fracção de sobrevivência das células ser regulada por selecção da dose de luz em relação à concentração do composto fotossensibilizante.
11. 11. Composição para modificar processos neoplásticos ou outros processos celulares em animais de sangue quente ou em culturas de células que contêm tanto um composto ao qual a membrana é impermeável a ser libertado no interior do citosol como um fotossensibilizante que por activação por luz causa a ruptura das membranas de compartimentos intracelulares, componentes estes que podem opcionalmente estar ligados à mesma molécula veicular ou a moléculas veiculares diferentes para facilitar a translocação para o interior dos compartimentos intracelulares, tais como endossomas, lisossomas ou outros compartimentos intracelulares.
12. 12. Composição de acordo com a reivindicação 11, em que as referidas moléculas veiculares têm ligados a si tanto o composto de modificação do processo celular a ser libertado no citosol como o composto fotossensibilizante, ou em que pelo menos um veículo tem ligado a si o composto a ser libertado no citosol e outro veículo semelhante ou diferente tem ligado a si o composto fotossensibilizante.
13. 13. Composição de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracte-rizada por o referido composto a ser libertado no citosol ser um composto antineoplástico.
14. 14. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por o composto antineoplástico ser gelonina. 3
15. 15 · Composição de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracte-rizada por o referido composto a ser liberLado no citosol ser seleccionado de um grupo constituído por ADN, oligo-(desoxi) nucleótidos, ARNm, ADN anti-sentido, açúcares, proteínas, peptídeos, fármacos aos quais as membranas são impermeáveis, outras moléculas às quais as membranas são impermeáveis e combinações com ligações covalentes ou não covaientes das moléculas referidas atrás.
16. 16. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 15, caracterizada por o composto fotossensibilizante utilizado ser seleccionado de um grupo constituído por porfirinas, ftalocianinas, purpurinas, clorinas, benzoporfirinas, naftalocianinas, corantes catiónicos, tetraciclinas e bases fracas lisossomotrópicas e seus derivados.
17. 17. Composição de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por o composto fotossensibilizante ser tetra fenilporfina com dois grupos sulfonato em grupos fenilo adjacentes.
18. 18. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 17, caracterizada por as moléculas veiculares serem seleccionadas de moléculas de direccionamento a sítios que facilitam a absorção dos compostos fotossensibilizantes ou das moléculas que se pretende libertar no interior do citosol.
19. 19. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 18 para utilização na terapia de cancro.
20. 20. Composição conforme definida em qualquer das reivindicações 11, 12 ou 16 a 18, em que o referido composto a ser libertado no citosol é seleccionado de um grupo constituído por ADN, oligo (desoxi) nucleótidos, ARNm ou ADN anti-sentido e combinações com ligações covalentes ou não covalentes das moléculas referidas atráo para utilização em terapia 4 genética .
21. 21. Conjunto para realizar o método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, caracterizado por conter compostos fotossensibilizantes, as moléculas a serem transportadas e opcionalmente compostos veiculares que podem facilitar o transporte destas moléculas.
22. 22. Util ização de um composto fotossensibilizante para a preparação de uma composição para a introdução de moléculas no interior do citosol de células vivas caracterizado por a) o composto fotossensibilizante e a(s) molécula (s) a ser (em) transportada(s), que podem opcionalmente estar ligadas às mesmas ou diferentes moléculas veiculares, serem aplicados às células vivas e; b) serem em seguida translocadas por via endocitica ou por outras vias para o interior de endossomas, lisossomas ou outros compartimentos intracelulares limitados por membranas, sendo as células; c) expostas à luz com comprimentos de onda adequados de acordo com o espectro de absorção do composto fotossensibilizante, em doses variáveis em função da taxa de sobrevivência pretendida de tal modo que as membranas dos endossomas, dos lisossomas ou de outros compartimentos intracelulares sofrem ruptura e as moléculas a serem introduzidas no citosol são libertadas no citosol, e por o composto fotossensibilizante activado pela luz não causar por si próprio a morte da maioria das células.
23. 23. Utilização de acordo com a reivindicação 22, em que as referidas moléculas veiculares, as referidas moléculas a serem transportadas e os referidos compostos fotos-sensibilizantes são como definidos em qualquer das reivindicações 2 a 9. 5
24. 24. Utilização de acordo com a reivindicação 22 ou a reivindicação 23, caraclerizada pui a fiacção de sobrevivência das células ser regulada por selecção da dose de luz em relação à concentração do composto fotos-sensibilizante.
25. 25. Ur:Irzação de acordo com qualquer das reivindicações 22 a li para terapia genética ou tratamento genético. Lisboa, 30 de Novembro de 2001 .ShNTii Oi-ICiAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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