CN114904014B - 一种自产氧型仿生光动力/铁死亡/免疫抑制微环境调节纳米平台及其制备和应用 - Google Patents

一种自产氧型仿生光动力/铁死亡/免疫抑制微环境调节纳米平台及其制备和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114904014B
CN114904014B CN202210421120.3A CN202210421120A CN114904014B CN 114904014 B CN114904014 B CN 114904014B CN 202210421120 A CN202210421120 A CN 202210421120A CN 114904014 B CN114904014 B CN 114904014B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bsa
iron death
photodynamic
self
nano
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210421120.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114904014A (zh
Inventor
杨小叶
翟光喜
赫志静
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong University
Original Assignee
Shandong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong University filed Critical Shandong University
Priority to CN202210421120.3A priority Critical patent/CN114904014B/zh
Publication of CN114904014A publication Critical patent/CN114904014A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114904014B publication Critical patent/CN114904014B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0071—PDT with porphyrins having exactly 20 ring atoms, i.e. based on the non-expanded tetrapyrrolic ring system, e.g. bacteriochlorin, chlorin-e6, or phthalocyanines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/555—Heterocyclic compounds containing heavy metals, e.g. hemin, hematin, melarsoprol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6925—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a microcapsule, nanocapsule, microbubble or nanobubble
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供一种自产氧型仿生光动力/铁死亡/免疫抑制微环境调节纳米平台及其制备和应用。所述纳米平台由包载光敏剂二氢卟吩e6(Ce6)、产氧剂/铁死亡诱导剂血红素(Hemin)的牛血清白蛋白(BSA)的CH/BSA内核与连接PEP20多肽的M1极化巨噬细胞膜通过共挤出法构建而成。M1极化巨噬细胞膜赋予纳米平台肿瘤靶向能力和更高的稳定性，将Ce6、Hemin、PEP20高效递送至肿瘤部位，在660nm近红外光照射下，Ce6产生ROS，该PDT作用被Hemin的催化产氧性能增强；Hemin中的Fe3+被还原为Fe2+，促进脂质过氧化物(LPO)的产生，PDT也参与该过程；PEP20作为CD47‑SIRPα剂，具有免疫激活作用，刺激IFN‑γ的分泌，下调System‑Xc‑，减少谷胱甘肽(GSH)合成，增强铁死亡作用。三者协同作用，发挥更强的杀伤肿瘤效果。

Description

一种自产氧型仿生光动力/铁死亡/免疫抑制微环境调节纳米 平台及其制备和应用
技术领域
本发明属于药物制剂和生物医药技术领域，具体涉及一种自产氧型仿生光动力/铁死亡/免疫抑制微环境调节纳米平台及其制备和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
光动力疗法(PDT)作为一种无创、有效且时空可控的抗癌方式，在肿瘤联合治疗中受到广泛关注。然而，要获得满意的PDT效果，仍然存在几个重要问题。首先，在肿瘤细胞中存在固有的和获得性的抗凋亡能力，增加了PDT治疗失败和治疗后复发的风险。因此，需要将其他细胞死亡模式与PDT相结合。其次，肿瘤微环境(TME)中的缺氧是TME的内在标志，阻碍了PDT的ROS产生。此外，缺氧还可能将肿瘤相关巨噬细胞从免疫增强型M1重新调节为免疫抑制M2型，从而促进肿瘤细胞的免疫逃逸。因此，在PDT期间缓解肿瘤缺氧至关重要。最后，虽然已报道PDT通过诱导免疫原性细胞死亡(ICD)来激活T细胞免疫，但效率远远不够，这可能归因于TME中存在多种免疫逃避机制。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明设计了一种新型纳米平台(MP@CH/BSA NP)，以牛血清白蛋白(BSA)作为二氢卟吩e6(Ce6，C)和血红素(Hemin， H)的载体，形成CH/BSA NP。PEP20(Mal-PLGLAG-AWSATWSNYWRH)通过MMP-2敏感肽序列(-PLGPAG-,L)被修饰到M1巨噬细胞膜上形成MP，最后用MP包覆CH/BSA NP形成MP@CH/BSA NP。Ce6在NIR照射下触发 MP@CH/BSA NP的溶酶体逃逸和Hemin释放，从而促进血红素诱导的铁死亡活化；在MP@CH/BSA NP的溶酶体逃逸过程中，突然释放的Fe2+加剧了细胞内 Fe2+过载并通过非经典模式激活铁死亡；Ce6介导的PDT消耗细胞内GSH并下调肿瘤细胞的System Xc-表达，这促成了铁死亡的经典激活。在免疫调节作用方面，MP@CH/BSA NP同时增强巨噬细胞和T细胞免疫，全面逆转免疫抑制 TME，从而消除原发性肿瘤，抑制肿瘤转移。在巨噬细胞免疫方面，本发明创新性地设计了用于CD47抑制肽(PEP20)递送的MMP2响应纳米囊泡，以实现 ICB的目的。此外，本发明首次揭示了PEP20可以通过刺激IFN-γ分泌和下调 System Xc-来使铁死亡敏感，桥接CD47-SIRPα阻断和铁死亡治疗，为肿瘤联合治疗提供更多可能性。
第一方面，本发明提供一种自产氧型仿生光动力/铁死亡/免疫抑制微环境调节纳米平台MP@CH/BSA，所述自产氧型仿生光动力/铁死亡/免疫抑制微环境调节纳米平台以牛血清白蛋白(BSA)作为二氢卟吩e6(Ce6，C)和血红素 (Hemin，H)的载体，PEP20通过MMP-2敏感肽序列(-PLGPAG-,L)被修饰到M1巨噬细胞膜上形成MP，以MP包覆纳米粒得到具有肿瘤蓄积能力的纳米平台。
所述PEP20为Mal-PLGLAG-AWSATWSNYWRH，其序列如SEQ NO.1所示。
进一步的，Ce6为光敏剂，载药量为6.75-10.08％；Hemin为产氧剂和铁死亡诱导剂，载药量为6.68-10.76％。
第二方面，本发明提供了一种自产氧型仿生光动力/铁死亡/免疫抑制微环境调节纳米平台MP@CH/BSA NP的制备方法，包括以下步骤：
S1：将牛血清白蛋白溶于PBS缓冲液中，二氢卟吩e6、血红素溶于DMSO 后缓缓滴入牛血清白蛋白溶液中得到反应液，超声分散后，将反应液装入透析袋中透析，离心取上清液，得到CH/BSA NP；
S2：RAW264.7细胞用脂多糖处理以获得M1极化巨噬细胞；4℃下M1 极化巨噬细胞在低渗裂解缓冲液中破碎过夜后，将细胞悬液差速离心以获得细胞膜碎片；向细胞膜碎片中加入过量的Traut’s试剂获得巯基化细胞膜，然后将PEP20-L-Mal加入巯基化细胞膜溶液中，并在氮气保护下搅拌12h；用纯水充分透析以获得MP；
S3：在微型脂质体挤出器中通过400nm聚碳酸酯多孔膜物理挤出数个循环制备MP细胞膜囊泡；将CH/BSA NP和MP细胞膜囊泡的混合物通过200nm 聚碳酸酯多孔膜挤出获得MP@CH/BSA NP。
进一步的，步骤S1中探头超声时间为2-8min。
进一步的，步骤S1中牛血清白蛋白用量为8-12mg。
进一步的，步骤S1中二氢卟吩e6、血红素的质量比为1：0.5-1：2。
进一步的，步骤S2中脂多糖浓度为0.5-1μg/mL，处理时间为12-24h。
进一步的，步骤S2中获得细胞膜碎片离心转速为80000-100000g，时间为0.5-2h。
进一步的，步骤S3中MP、CH/BSA NP的体积比为1：1-1：3。
进一步的，步骤S1、S3中的透析袋截留分子量为8000-14000Da。
优选地，所述的自产氧型仿生光动力/铁死亡/免疫抑制微环境调节纳米平台MP@CH/BSA NP的制备方法，包括以下步骤：
S1:将8mg牛血清白蛋白溶解在2.5mL PBS缓冲液中；向其中滴加200μL Ce6(DMSO中10mg/mL)和100μL Hemin(DMSO中10mg/mL)，混合液在黑暗中超声处理4min。最后，将所得悬浮液在截留分子量(MWCO)为 3.5kDa的透析袋中纯化24h，然后离心去除沉淀的药物。所得上清液为 CH/BSA NP溶液。
S2：RAW264.7细胞用脂多糖(LPS,1μg/mL)处理24h以获得M1极化巨噬细胞。4℃下M1极化巨噬细胞在低渗裂解缓冲液(20mM Tris HCl,10mM MgCl2,10mM KCl,pH 7.4)中破碎过夜后，将细胞悬液3200g离心5min以去除重细胞器，80000g离心1.5h以获得细胞膜碎片。向细胞膜碎片中加入过量的Traut’s试剂，混合物在含有5mM EDTA、pH调至8的PBS中温和搅拌 (100rpm)反应1h获得巯基化细胞膜。通过微量总巯基测定试剂盒测定巯基浓度。然后将等体积PEP20-L-Mal加入巯基化细胞膜溶液中，并在氮气保护下搅拌混合物12h。所得溶液用纯水(MWCO＝10kDa)充分透析以获得MP；
S3:PEP20连接细胞膜后，在微型脂质体挤出器LF-1中通过400nm聚碳酸酯多孔膜物理挤出20个循环来制备MP细胞膜囊泡；将MP细胞膜囊泡、 CH/BSA NP体积比1：2混合后通过200nm聚碳酸酯多孔膜挤出20个循环获得MP@CH/BSA NP。
第三方面，本发明提供上述自产氧型仿生光动力/铁死亡/免疫抑制微环境调节纳米平台在制备抗肿瘤方面产品的应用；优选的，所述产品为药物组合物。
相较于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明的纳米平台MP@CH/BSA NP用于肿瘤细胞的光动力治疗、铁死亡激活和免疫抑制微环境逆转。
本发明借助EPR效应和M1极化的巨噬细胞膜对肿瘤的趋向作用精准递送Ce6、Hemin和PEP20。
本发明实现了自产氧，既改善了肿瘤缺氧微环境，又为PDT提供O2以产生更多ROS，提高PDT的治疗效果并参与Hemin铁死亡消耗GSH、产生LPO 的过程，实现PDT、铁死亡相互促进。
本发明中PDT可诱导肿瘤细胞ICD，促进DC成熟并激活T细胞免疫；铁死亡机制的加入对该环节有增效作用。
本发明中CD47-SIRPα信号通路的阻断可以提高瘤内IFN-γ水平，而 IFN-γ的分泌可以下调System Xc-水平，从而增敏铁死亡。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为MP@CH/BSA NP的合成示意图。
图2为CH/BSA NP和MP@CH/BSA NP的粒径分布。
图3为MP、CH/BSA NP和MP@CH/BSA NP的Zeta电位。
图4为CH/BSA NP和MP@CH/BSA NP的透射电镜图像。
图5为BSA、H/BSA、C/BSA、CH/BSA、MP@CH/BSA在200-900nm 的紫外吸收图谱。
图6为细胞裂解液、细胞膜、MP@CH/BSA的SDS-PAGE图谱和Western Blot条带。
图7为不同制剂在PBS(pH 7.4)下的释放曲线。
图8示出了不同时间处理后4T1细胞对游离Ce6和MP@C/BSA的摄取结果(标尺：100μm)。
图9示出了不同制剂在不同处理条件下在细胞中的ROS生成量。
图10为小鼠尾静脉注射不同制剂后体内的实时荧光图像及24h后离体器官和肿瘤的荧光图像。
图11为给药后荷瘤小鼠肿瘤的照片和H&E染色结果(标尺：100μm)。
图12为本发明的技术原理图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本申请所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本申请所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实验材料：牛血清白蛋白(BSA，Klontech)；二氢卟吩e6(Ce6，北京百灵威科技有限公司)；氯化血红素(Hemin)、二甲基亚砜(DMSO)(上海阿拉丁生化科技有限公司)；PEP20(Mal-PLGLAG-AWSATWSNYWRH,生工生物技术(上海)有限公司)；活性氧检测试剂盒、4％多聚甲醛、4'，6-二脒基-2- 苯基吲哚(DAPI)(上海碧云天生物技术有限公司)。
实施例1：将8mg BSA溶解在2.5mL PBS中，向其中滴加200μL Ce6 (DMSO中10mg/mL)和100μL Hemin(DMSO中10mg/mL)，混合液在黑暗中超声处理4min。将所得悬浮液在MWCO＝3.5kDa的透析袋中纯化24h，然后离心去除沉淀的药物。所得上清液为CH/BSA NP溶液，其中Ce6和Hemin 的载药量分别为9.77±0.73％和7.91±1.23％，包封率分别为47.55±4.69％和 77.05±13.82％。
实施例2：RAW264.7细胞用脂多糖(LPS,1μg/mL)处理24h以获得M1极化巨噬细胞。取LPS处理前后的巨噬细胞进行Western Blot分析iNOS蛋白，图6a条带的出现表明M1的成功极化。4℃下细胞在低渗裂解缓冲液(20mM Tris HCl,10mM MgCl2,10mM KCl,pH 7.4)中破碎过夜后，将细胞悬液3200 g离心5min以去除重细胞器，80000g离心1.5h以获得细胞膜碎片。将细胞膜碎片分散到PBS溶液中得到细胞膜溶液，向细胞膜溶液中加入过量的Traut’s试剂，混合物在含有5mM EDTA、pH调至8的PBS中温和搅拌(100 rpm)反应1h获得巯基化细胞膜。然后将等体积PEP20-L-Mal加入巯基化膜溶液中，并在氮气保护下搅拌混合物12h。所得溶液用纯水(MWCO＝10kDa) 充分透析以获得MP。
实施例3:用微型脂质体挤出器LF-1通过400nm聚碳酸酯多孔膜物理挤出细胞膜20个循环以制备细胞膜囊泡；将MP、CH/BSA NP体积比1：2混合后通过200nm聚碳酸酯多孔膜挤出20个循环获得MP@CH/BSA NP(合成示意图可见图1)。取实施例1中获得的CH/BSA、实施例2中获得的MP、实施例3中获得的MP@CH/BSA测定粒径、电位，如图2、3所示，相较于CH/BSA，MP@CH/BSA粒径增大了约14nm，电位接近膜囊泡MP，说明MP的成功包覆。图4的透射电镜图更直观地证明MP附着于CH/BSA表面，形成粒径均一的MP@CH/BSA仿生纳米粒。图6b、c表明MP@CH/BSA保留了MP的特征蛋白β1，与MP蛋白图谱相同，进一步证明了MP的成功包覆及功能性蛋白的保留。
实验例4：将8mg BSA溶解在2.5mL PBS中，向其中滴加300μL Ce6 (DMSO中10mg/mL)或300μL Hemin(DMSO中10mg/mL)，混合液在黑暗中超声处理4min。将所得悬浮液在MWCO＝3.5kDa的透析袋中纯化24h，然后离心去除沉淀的药物。所得上清液为C/BSA NP或H/BSANP溶液。取 BSA、实施例4中的H/BSA、C/BSA、实施例1中的CH/BSA、实施例3中的 MP@CH/BSA，在200-900nm波长范围内进行紫外扫谱，如图5所示， MP@CH/BSA包含了C/BSA在660nm处的特征峰和H/BSA在401nm处的吸收峰，表明Ce6、Hemin的成功包载。
实施例5：在黑暗条件下通过动态膜透析(MWCO＝3.5kDa)法测定游离药物、CH/BSANP和MP@CH/BSA NP在pH 7.4下的药物释放行为。取15mL 离心管装6mL释放介质(PBS+50％乙醇)，不同制剂加入透析袋中，绑紧透析袋两端，没入释放介质中。将装有样品的离心管置于37℃，100r/min恒温振荡器中孵育。在给定的时间点，从离心管中取出1mL的释放介质，并重新补加等体积的空白释放介质。用紫外-可见分光光度法测定两种药物的浓度，计算各采样点的累积释放百分比，最后绘制药物释放曲线。为研究ROS是否能促进血红素释放，MP@CH/BSA NP组用660nm近红外激光(100mW/cm2， 2min)照射，检测Hemin释放行为并与不加光照组对比。结果如图7所示，与CH/BSA相比，MP@CH/BSA的Hemin释放略有减少，而加光照后，由于 ROS的产生破坏了MP的脂质双分子层，使Hemin释放增多，与CH/BSA组无显著差异。
实施例6：以小鼠乳腺癌细胞4T1为测试细胞系。4T1细胞在含10％胎牛血清(FBS)、青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)的RPMI-1640培养基中孵育。所有细胞均在37℃、5％CO2的气氛中培养。
将4T1细胞以105个细胞/孔的密度接种在12孔培养板中，并培养24h。然后将细胞分别用Ce6溶液(5μg/mL)或MP@C/BSA NP(含Ce6 5μg/mL)处理0.5、1、2或4h。用4％多聚甲醛固定10min并用DAPI染色、PBS清洗后，收集爬片，用抗荧光猝灭液封片，在高速转盘共聚焦显微镜(Dragonfly 200， Andor，England)下观察。如图8所示，Ce6、MP@C/BSA NP的荧光随时间增加而增加，说明药物的摄取具有时间依赖性，并且，在每个时间点 MP@C/BSA NP的荧光均比游离Ce6更强，表明MP@C/BSANP的制备显著增加了4T1细胞对药物的摄取，有利于药物充分发挥治疗效果。
实施例7：将4T1细胞以105个细胞/孔的密度接种在12孔培养板中并孵育24h。然后加入含有不同制剂的培养基，培养细胞4h，再加入1mL DCFH-DA工作液，培养20min。然后，用NIR激光(660nm，100mW/cm2， 1min)照射细胞，并在37℃下再孵育20min。将细胞固定并用DAPI染色。最后，每孔加入400μL PBS，用高速转盘共聚焦显微镜(Dragonfly 200，Andor，England)观察细胞内ROS的产生。Ⅰ组：对照组，Ⅱ组：Hemin，Ⅲ组：Ce6，Ⅳ组：MP@C/BSA，Ⅴ组：MP@CH/BSA，Ⅵ组：Ce6+L，Ⅶ组：MP@C/BSA+L，Ⅷ组：MP@CH/BSA+L。结果如图9所示，未加光照的PBS、Ce6、MP@C/BSA、 MP@CH/BSA组均无ROS产生，而加光照后，Ce6、MP@C/BSA、MP@CH/BSA 组均出现绿色荧光，表明ROS的产生，且绿色荧光强度递增，说明MP@C/BSA 相较于游离Ce6组增加了胞内摄取从而具有更强的ROS产生能力，而包载 Hemin后由于O2的产生使得Ce6的PDT能力显著增强。
实施例8：雌性Balb/c小鼠(4-6周龄)购自北京维通利华动物科技有限公司。所有动物实验均严格按照山东大学实验动物中心批准的方案进行。为了获得4T1异种移植荷瘤小鼠模型，将2×106个4T1细胞皮下注射到每只小鼠的右腋窝。当肿瘤体积达100mm3时，可以进行不同的治疗。肿瘤体积通过下式计算，其中a代表最大长度(mm)和b代表最小长度(mm)。
Figure BDA0003607707040000101
实施例9：将4T1荷瘤小鼠随机分为两组(n＝3)，尾静脉注射Ce6(4mg/kg) 或MP@C/BSA NP(含Ce6 4mg/kg)。对于体内成像，通过腹腔内注射水合氯醛对小鼠进行麻醉，并在预定时间点(1、2、4、6、12和24h)用IVIS光谱系统(PerkinElmer,USA)进行成像。为了研究MP@C/BSA NP的生物分布，在注射后24h处死小鼠，并在IVIS光谱系统下记录主要器官(心、肝、脾、肺、肾)和肿瘤的荧光强度。如图10a所示，与游离Ce6组相比，MP@C/BSA 组在所有时间点在肿瘤部位显示出更强的荧光，表明制造的纳米平台有利于肿瘤特异性递送药物，这可能归因于EPR效应和M1巨噬细胞膜介导的肿瘤募集。图10b与体内成像结果一致，MP@C/BSA组肿瘤的荧光信号明显更强，定量结果表明MP@C/BSA组肿瘤的平均荧光强度是游离Ce6组的11.10倍。
实施例10：将4T1荷瘤小鼠随机分为10组(n＝5)，尾静脉或皮下注射不同制剂(Ce6等效为4mg/kg，Hemin等效为3.2mg/kg，PEP20等效为2.8 mg/kg)。Ⅰ组：对照组(尾静脉注射生理盐水)，Ⅱ组：Ce6组(尾静脉注射Ce6)，Ⅲ组：Hemin组(尾静脉注射Hemin)，Ⅳ组：MP@C/BSA组(尾静脉注射MP@C/BSA)，Ⅴ组：MP@CH/BSA组(尾静脉注射MP@CH/BSA)，Ⅵ组：PEP20组(皮下注射PEP20)，Ⅶ组：Ce6+L组(尾静脉注射Ce6且2 h后进行NIR照射)，Ⅷ组：MP@C/BSA+L组(尾静脉注射MP@C/BSA且 2h后进行NIR照射)，Ⅸ组：MP@CH/BSA+L组(尾静脉注射MP@CH/BSA 且2h后进行NIR照射)，Ⅹ组：MP@CH/BSA+L+DFO组(尾静脉注射 MP@CH/BSA、腹腔注射DFO且2h后进行NIR照射)。NIR辐射设置为660 nm，200mW/cm2，5min。在第0天、第5天和第10天重复注射。每两天记录小鼠的肿瘤体积和体重。14天后处死小鼠，收集各组肿瘤并称重。摘眼球取血并通过ELISA测量血液中的细胞因子(IFN-γ、TNF-α和IL-6)。解剖各组主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)和肿瘤，切片进行H&E染色。此外，对肿瘤进行TUNEL、CD4和CD8免疫荧光染色，进一步研究治疗效果。此外，将每组的脾脏、淋巴结和肿瘤进行研磨和离心以提取淋巴细胞、肿瘤相关巨噬细胞和肿瘤浸润淋巴细胞。最后，DC(用APC抗CD11c、FITC抗CD80和PE抗CD86染色)、Ths(用FITC抗CD3和APC抗CD4染色)、CTL(用 FITC抗CD3和PE抗CD8a染色)、巨噬细胞(用PE抗-F4/80、APC抗-CD11b、 FITC抗-CD86染M1和Percp-Cy5.5抗-CD206染M2)和吞噬巨噬细胞(用 PE抗F4/80和FITC抗CD47染色)。如图11所示，Hemin、PEP20、未加光照的Ce6、MP@C/BSA、MP@CH/BSA组与生理盐水组肿瘤差距不明显，而加光照后的Ce6、MP@C/BSA、MP@CH/BSA组抑瘤效果逐渐增强，腹腔注射20mg/kg DFO组瘤体积增加，说明了铁死亡激活对于抑瘤效果的重要性。与之相对应地，H&E染色图显示，加光照后的Ce6、MP@C/BSA、MP@CH/BSA、 MP@CH/BSA+DFO组肿瘤表现出相同趋势的病理损伤，进一步证明了 MP@CH/BSANP的PDT、铁死亡、免疫调节联合治疗抑瘤效果显著。
如图12所示，血红素参与MP@CH/BSA NP通过其过氧化氢酶模拟活性减轻肿瘤的缺氧，改善Ce6的PDT效率。关于铁死亡，MP@CH/BSA NP通过经典(抑制GPX4通路)和非经典(诱导Fe2+过载)模式激活铁死亡。Ce6 通过以下途径加剧铁死亡：(A)Ce6在660nm近红外光照射下触发 MP@CH/BSA NP的溶酶体逃逸；体外释放的结果证实它可以加速 MP@CH/BSA NP中的血红素释放，从而促进血红素诱导的铁死亡活化。(B) 由于溶酶体是Fe2+的细胞内贮库，在MP@CH/BSA NP的溶酶体逃逸过程中，突然释放的Fe2+加剧了细胞内Fe2+过载并通过非经典模式激活铁死亡。在免疫调节作用方面，MP@CH/BSA NP同时增强巨噬细胞和T细胞免疫，全面逆转免疫抑制肿瘤微环境，从而消除原发性肿瘤，抑制肿瘤转移。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 一种自产氧型仿生光动力/铁死亡/免疫抑制微环境调节纳米平台及其制备和
应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Pro Leu Gly Leu Ala Gly Ala Trp Ser Ala Thr Trp Ser Asn Tyr Trp
1 5 10 15
Arg His

Claims (6)

1. 一种自产氧型仿生光动力/铁死亡/免疫抑制微环境调节纳米平台，其特征在于，所述自产氧型仿生光动力/铁死亡/免疫抑制微环境调节纳米平台以牛血清白蛋白作为二氢卟吩e6和血红素的载体形成纳米粒，PEP20-L-Mal通过 MMP-2敏感肽序列被修饰到M1巨噬细胞膜上形成MP，以MP包覆纳米粒得到所述自产氧型仿生光动力/铁死亡/免疫抑制微环境调节纳米平台；所述PEP20-L-Mal为Mal-PLGLAG-AWSATWSNYWRH；Ce6为光敏剂，载药量为6.75-10.08%；Hemin为产氧剂和铁死亡诱导剂，载药量为6.68-10.76%。
2.根据权利要求1所述自产氧型仿生光动力/铁死亡/免疫抑制微环境调节纳米平台的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将牛血清白蛋白溶于PBS缓冲液中，二氢卟吩e6、血红素溶于DMSO后缓缓滴入牛血清白蛋白溶液中得到反应液，超声分散后，将反应液装入透析袋中透析，离心取上清液，得到CH/BSA NP；
S2：RAW264.7细胞用脂多糖处理以获得M1极化巨噬细胞； 4℃下M1极化巨噬细胞在低渗裂解缓冲液中破碎过夜后，将细胞悬液差速离心以获得细胞膜碎片；向细胞膜碎片中加入过量的Traut’s试剂获得巯基化细胞膜，然后将PEP20-L-Mal加入巯基化细胞膜溶液中，并在氮气保护下搅拌12 h；用纯水充分透析以获得MP；
S3：在微型脂质体挤出器中通过400 nm聚碳酸酯多孔膜物理挤出数个循环制备MP细胞膜囊泡；将CH/BSA NP和MP细胞膜囊泡的混合物通过200 nm聚碳酸酯多孔膜挤出获得自产氧型仿生光动力/铁死亡/免疫抑制微环境调节纳米平台；
步骤S1中牛血清白蛋白用量为8-12 mg；步骤S1中二氢卟吩e6、血红素的质量比为1：0.5-1：2；
步骤S2中脂多糖浓度为0.5-1 µg/mL，处理时间为12-24 h；
步骤S3中MP、CH/BSA NP的体积比为1：1-1：3。
3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中探头超声时间为2-8 min。
4. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中获得细胞膜碎片离心转速为80000-100000 g，时间为0.5-2 h。
5. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1、S3中的透析袋截留分子量为8000-14000 Da。
6.根据权利要求1所述自产氧型仿生光动力/铁死亡/免疫抑制微环境调节纳米平台在制备抗肿瘤方面产品的应用；所述产品为药物组合物。
CN202210421120.3A 2022-04-21 2022-04-21 一种自产氧型仿生光动力/铁死亡/免疫抑制微环境调节纳米平台及其制备和应用 Active CN114904014B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210421120.3A CN114904014B (zh) 2022-04-21 2022-04-21 一种自产氧型仿生光动力/铁死亡/免疫抑制微环境调节纳米平台及其制备和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210421120.3A CN114904014B (zh) 2022-04-21 2022-04-21 一种自产氧型仿生光动力/铁死亡/免疫抑制微环境调节纳米平台及其制备和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114904014A CN114904014A (zh) 2022-08-16
CN114904014B true CN114904014B (zh) 2023-06-02

Family

ID=82765180

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210421120.3A Active CN114904014B (zh) 2022-04-21 2022-04-21 一种自产氧型仿生光动力/铁死亡/免疫抑制微环境调节纳米平台及其制备和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114904014B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116059356A (zh) * 2022-08-18 2023-05-05 湖南省人民医院(湖南师范大学附属第一医院) 一种具有自产氧能力的dna纳米酶及其制备方法与应用
CN115804841A (zh) * 2022-10-21 2023-03-17 山东大学 一种基于聚谷氨酸共轭光敏剂的肿瘤靶向载药纳米制剂
CN115715805B (zh) * 2022-11-14 2024-01-19 山东大学 一种基于钒的仿生纳米材料及其制备方法与应用
CN116585622B (zh) * 2023-07-12 2023-10-10 四川省肿瘤医院 光动力药片及其制备方法、抗肿瘤模型的构建方法及系统

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102397545A (zh) * 2011-11-21 2012-04-04 上海交通大学 一种用于光动力治疗的纳米光敏剂给药系统及其制备方法
CN104587466A (zh) * 2014-12-15 2015-05-06 苏州大学 蛋白-聚吡咯复合物及蛋白-聚吡咯复合物衍生物的制备方法与应用
CN110201169A (zh) * 2019-07-08 2019-09-06 上海交通大学医学院 氧气自给型靶向纳米光动力治疗系统
CN110801431A (zh) * 2018-08-03 2020-02-18 山东大学 一种核-壳型智能纳米递送系统的构建及应用
CN112451680A (zh) * 2020-11-24 2021-03-09 吉林化工学院 一种具有协同诱导光动力治疗和铁死亡的ros敏感性纳米试剂及其制备方法
CN112933078A (zh) * 2021-04-14 2021-06-11 广西大学 一种诱导铁死亡的纳米复合物及制备方法以及其在肿瘤治疗中的应用
CN112972420A (zh) * 2021-02-24 2021-06-18 中国药科大学 一种仿生细胞膜纳米粒及其制备方法和应用
CN113456836A (zh) * 2021-07-07 2021-10-01 中国科学院精密测量科学与技术创新研究院 一种锰-血红素配位聚合物纳米颗粒及其制备方法和应用
CN113456613A (zh) * 2021-07-07 2021-10-01 中山大学 一种近红外光激活型巨噬细胞-纳米前药靶向递药系统的构建及其应用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102397545A (zh) * 2011-11-21 2012-04-04 上海交通大学 一种用于光动力治疗的纳米光敏剂给药系统及其制备方法
CN104587466A (zh) * 2014-12-15 2015-05-06 苏州大学 蛋白-聚吡咯复合物及蛋白-聚吡咯复合物衍生物的制备方法与应用
CN110801431A (zh) * 2018-08-03 2020-02-18 山东大学 一种核-壳型智能纳米递送系统的构建及应用
CN110201169A (zh) * 2019-07-08 2019-09-06 上海交通大学医学院 氧气自给型靶向纳米光动力治疗系统
CN112451680A (zh) * 2020-11-24 2021-03-09 吉林化工学院 一种具有协同诱导光动力治疗和铁死亡的ros敏感性纳米试剂及其制备方法
CN112972420A (zh) * 2021-02-24 2021-06-18 中国药科大学 一种仿生细胞膜纳米粒及其制备方法和应用
CN112933078A (zh) * 2021-04-14 2021-06-11 广西大学 一种诱导铁死亡的纳米复合物及制备方法以及其在肿瘤治疗中的应用
CN113456836A (zh) * 2021-07-07 2021-10-01 中国科学院精密测量科学与技术创新研究院 一种锰-血红素配位聚合物纳米颗粒及其制备方法和应用
CN113456613A (zh) * 2021-07-07 2021-10-01 中山大学 一种近红外光激活型巨噬细胞-纳米前药靶向递药系统的构建及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114904014A (zh) 2022-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114904014B (zh) 一种自产氧型仿生光动力/铁死亡/免疫抑制微环境调节纳米平台及其制备和应用
Zhou et al. Rational design of a minimalist nanoplatform to maximize immunotherapeutic efficacy: Four birds with one stone
Gao et al. Engineering nanoparticles for targeted remodeling of the tumor microenvironment to improve cancer immunotherapy
Li et al. Targeting photodynamic and photothermal therapy to the endoplasmic reticulum enhances immunogenic cancer cell death
Liu et al. ER-targeting PDT converts tumors into in situ therapeutic tumor vaccines
Cheng et al. Tumor Associated Macrophages and TAMs‐Based Anti‐Tumor Nanomedicines
Zhang et al. How to improve photodynamic therapy-induced antitumor immunity for cancer treatment?
Zhou et al. Bimetallic PdPt-based nanocatalysts for photothermal-augmented tumor starvation and sonodynamic therapy in NIR-II biowindow assisted by an oxygen self-supply strategy
Zhao et al. Combination of phototherapy with immune checkpoint blockade: Theory and practice in cancer
CZ20031791A3 (cs) Způsob zavedení molekuly do cytosolu buňky
Qin et al. A carrier-free photodynamic nanodrug to enable regulation of dendritic cells for boosting cancer immunotherapy
Li et al. Tri-component programmable nanoregulator with Three-pronged penetration boosts immunotherapy of Triple-Negative breast cancer
CN112546062B (zh) 一种全氟化碳硅质体及其制备方法和应用
Wang et al. Controllable hypoxia-activated chemotherapy as a dual enhancer for synergistic cancer photodynamic immunotherapy
WO2022253344A1 (zh) 一种装载溶瘤肽的聚合物囊泡及其与囊泡免疫佐剂、pd-1单抗的联合用药
Jiao et al. Tumor cell-derived extracellular vesicles for breast cancer specific delivery of therapeutic P53
Cheng et al. Versatile red blood cells for triple‐negative breast cancer treatment via stepwise Photoactivations
Li et al. Ginsenoside Rg3-engineered exosomes as effective delivery platform for potentiated chemotherapy and photoimmunotherapy of glioblastoma
Li et al. Cell membrane-based biomimetic technology for cancer phototherapy: mechanisms, recent advances and perspectives
Liu et al. Lipid-hybrid cell-derived biomimetic functional materials: A state-of-the-art multifunctional weapon against tumors
Han et al. Biomimetic nano-drug delivery system: an emerging platform for promoting tumor treatment
Li et al. Modified hollow mesoporous silica nanoparticles as immune adjuvant-nanocarriers for photodynamically enhanced cancer immunotherapy
Li et al. Palliating the escalated post-PDT tumor hypoxia with a dual cascade oxygenation nanocomplex
Bao et al. Novel active stealth micelles based on β2M achieved effective antitumor therapy
He et al. Enhancing photodynamic immunotherapy by reprograming the immunosuppressive tumor microenvironment with hypoxia relief

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant