CN113456836A - 一种锰-血红素配位聚合物纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种锰‑血红素配位聚合物纳米颗粒及其制备方法和应用,所述的纳米颗粒由锰离子和血红素中特有的两个羧基通过配位聚合作用形成,且所述的纳米颗粒呈立方体结构,平均边长约为20nm。其制备方法为:在pH=7的NaOH溶液中,锰源与血红素在120℃下进行水热合成反应,反应时间为3h。该纳米颗粒是由锰离子和血红素自组装形成,由于铁、锰元素的存在,该纳米颗粒可用于肿瘤的1H‑MRI成像,同时,该纳米颗粒具有优异的光热转化性能,可用于肿瘤的光热治疗和光声成像。而且,该纳米颗粒自身具有纳米酶催化活性,可通过Fenton反应高效催化H2O2生成剧毒性的.OH,引起细胞内的脂质过氧化,并通过铁死亡通路促使细胞发生凋亡或坏死,进而可以应用于肿瘤的CDT和Fe死亡治疗。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤诊疗技术领域,具体涉及一种锰-血红素配位聚合物纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
据世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)最近发布的2020年全球新癌症负担数据结果显示,2020年全球新发癌症病例1929万例,全球癌症死亡病例996万例,癌症依然是威胁人类健康和生命的”头号敌人”。过去,肺癌一直是全球发病率最高的癌症,而2020年最新数据显示,乳腺癌新增人数为226万,多于肺癌新增人数220万,首次超越肺癌,居于癌症发病率的首位。但在2020年全球癌症死亡病例的统计中,肺癌死亡病例数多达180万例,远超其他癌症类型,依旧是全球第一大致死癌症。众所周知,肺癌的诊断和治疗难点在于,早期肺癌没有明显的症状,容易被忽视,早期筛查率仅有16%,很多患者一旦确诊为肺癌,往往已经处于中晚期或者发生远端转移,错失了最佳治疗时机,五年生存率急剧下降至20%以下。如果肺癌能在早期被发现,并及时采取相应的干预手段进行规范治疗,那么患者的五年生存率高达80%。因此,早发现和早治疗是临床治愈肺癌的关键。现阶段,我们亟需精准的诊疗手段及早发现肺癌并及时实施干预治疗,进而全面提高肺癌诊疗管理水平。
磁共振成像(MRI)是目前临床中使用最为广泛且成熟的医疗影像技术之一,具有非侵入性、无电离辐射损伤、软组织分辨率高以及不受穿透深度限制等优点,可提供全面的三维解剖结构信息。但目前研究发现,临床中广泛使用的钆增强MRI造影剂不仅有可能引起肾源性系统性纤维化,还存在脑部钆沉积的风险。因此,发展新型的1H-MRI造影剂以替代钆基造影剂,避免较强毒性重金属离子的使用,对临床MRI诊断具有十分重要的意义。
光学成像技术虽具有很高的灵敏度,但由于生物组织对光波的散射作用,其空间分辨率通常较低,同时光在生物组织中的穿透深度有限,这极大地限制了其应用。而光声成像作为一种基于激光超声的生物医学成像新方法,集合了光学成像高对比度和超声成像高穿透深度的优点,因此光声成像具有跨越分子、细胞、组织、器官等多个尺度的高分辨成像能力和可以提供生物系统的解剖、功能、代谢、分子、基因等多维度丰富信息的优点。
因此,将MRI和PAI相结合,既能提供高分辨率的解剖结构学信息,同时又能提供高灵敏的功能学信息,最终可实现解剖结构学显像和功能学显像的有机统一。
由于具有开壳层的电子结构,自由基通常被认为是一种高活性、瞬态性和有害性的物质,在生物医学应用方面表现出许多独特的优势,如强细胞毒性、高反应活性、分子磁性、优异的光声性能和光热转换能力等。近年来,活性氧介导的肿瘤化学动力学治疗和光动力学治疗以及治疗作用温和的光热治疗受到了广泛关注,被越来越多地应用到肿瘤的协同治疗中。
诊疗一体化是将成像诊断功能与治疗功能集成到同一平台的新兴研究领域,作为一个集成化平台,诊疗一体化具有许多突出的优点:1、单次给药即可同时实现诊断和治疗,减少多次注射给患者带来的痛苦,避免药物的过量使用或造影剂残留给人体带来的风险;2、给药后,在对疾病进行治疗的同时还可实时监控治疗过程,动态调整治疗策略,实现精准治疗,从而极大地提高疗效,显著延长患者的生存时间。
因此,发展一种在为肿瘤患者治疗的同时还可监测治疗过程,方便医生实时为患者提供个性化的精准治疗方案的纳米诊疗探针具有十分重要的意义!
发明内容
基于上述现有技术,本发明提供了一种锰-血红素配位聚合物纳米颗粒及其制备方法和应用,该纳米颗粒是由锰离子和血红素通过配位聚合作用自组装形成的,由于铁、锰元素的存在,该纳米颗粒可用于1H-MRI成像,同时,在808nm近红外光照射下,该纳米颗粒具有优异的光热转化性能,可用于肿瘤的光热治疗和光声成像,而且,该纳米颗粒自身具有纳米酶催化活性,可通过Fenton反应高效催化H2O2生成剧毒性的·OH,引起细胞内的脂质过氧化,进而通过铁死亡通路促使细胞发生凋亡或坏死。总之,所述的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒不仅可以用于1H-MRI成像和光声成像,还可用于肿瘤的光热治疗、化学动力学治疗和铁死亡治疗,对肿瘤的生长具有较好的协同抑制作用。
实现本发明上述目的所采用的技术方案为:
一种锰-血红素配位聚合物纳米颗粒,所述的纳米颗粒由锰离子和血红素中特有的两个羧基通过配位聚合作用形成,且所述的纳米颗粒呈立方体结构,平均边长为17~20nm。
进一步,所述的血红素为氯化高铁血红素。
一种锰-血红素配位聚合物纳米颗粒的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
在pH=7的NaOH溶液中,锰源与血红素在120℃下进行水热合成反应,水热合成反应时间为3h,反应完成后,得到所述的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒。
进一步,所述的锰源为MnCl2.4H2O,血红素为氯化高铁血红素。
进一步,所述的锰源中锰离子与血红素的摩尔比为1:160。
一种锰-血红素配位聚合物纳米颗粒在制备多模态成像显影剂中的应用。
进一步,所述的多模态成像包括磁共振成像和光声成像。
一种锰-血红素配位聚合物纳米颗粒在制备肿瘤药物中的应用。
进一步,所述的肿瘤包括肺癌肿瘤,肿瘤治疗包括光热治疗、化学动力学治疗和铁死亡治疗。
与现有技术相比,本发明的有益效果和优点在于:
1、本发明的纳米颗粒是一种新型的纳米材料,避免了重金属钆的使用,具有良好的生物安全性和弛豫性能,可作为非钆基1H-MRI显影剂,应用于活体MRI成像。
2、本发明的纳米颗粒中含有的血红素是一种铁卟啉化合物,是人体血红蛋白的组成成分之一,也是肌红蛋白、细胞色素、过氧化物酶和过氧化氢酶等的辅基,具有类过氧化物酶的催化活性,可以催化H2O2生成羟基自由基等活性氧物种,破坏癌细胞的氧化还原稳态,进而对癌细胞产生较强的氧化损伤作用,促使癌细胞通过铁死亡通路发生凋亡或坏死。因此,该纳米颗粒对肺腺癌肿瘤的生长具有很好的抑制作用。
3、本发明的纳米颗粒具有优异的光热转换性能,可用于光声成像与光热治疗,同时还可以协同增强化学动力学治疗和铁死亡治疗效果。
4、本发明的纳米颗粒为立方体结构,平均边长为17~20nm,具有合适的体循环时间,其特有的孔道结构还可负载其他成像显影剂或治疗药物,进一步拓宽其在多模态成像和肿瘤治疗中的应用范围。
附图说明
图1为实施例1制备的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒的TEM图和SEM图:其中,图1(a)为TEM图,标尺为50nm,图1(b)为SEM图,标尺为100nm。
图2为实施例1制备的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒的粒径分布图。
图3为实施例1制备的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒的孔径分布图。
图4为实施例1制备的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒的ζ电势图。
图5为实施例1制备的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒的弛豫效率图:其中,图5(a)为纵向弛豫效率图,图5(b)为横向弛豫效率图。
图6为实施例1制备的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒的光热性能图:其中,图6(a)为不同浓度MH NPs溶液的光热升温曲线,图6(b)为不同浓度MH NPs溶液的光热循环曲线;图6(c)为MH NPs溶液在不同功率激光照射下的光热升温曲线。
图7为实施例1制备的的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒对A549非小细胞肺腺癌细胞的CDT/PTT/Fe死亡的试验结果图。
图8为实施例1制备的的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒的活体PAI成像效果图。
图9为实施例1制备的的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒的活体T2-MRI成像图。
图10为实施例1制备的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒对活体肿瘤的光热效果图。
图11为实施例1制备的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒对活体肿瘤的治疗效果图:其中,11(a)治疗期间A549肺腺癌裸鼠的体重变化曲线;11(b)治疗期间A549肺腺癌裸鼠的肿瘤体积变化曲线;11(c)治疗结束后,各组A549肺腺癌裸鼠肿瘤的重量;11(d)治疗结束后,各组A549肺腺癌裸鼠肿瘤的照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
1、称取160mg NaOH于40ml超纯水中,搅拌溶解,配制0.1M的NaOH溶液;
2、称取8.2mg氯化高铁血红素,加入到25ml 0.1M NaOH溶液中,超声至完全溶解,调节体系的pH=7,得到0.5mM氯化高铁血红素溶液;
3、称取395.8mg MnCl2.4H2O于50ml超纯水中,搅拌溶解,配制0.04M MnCl2溶液;
4、将50ml 0.04M MnCl2溶液在1500rpm转速下缓慢地滴加到25ml氯化高铁血红素溶液中,滴加完毕后,调节体系的pH=7,接着在室温和转速1500rpm条件下搅拌1h,得到混合溶液;
5、将混合溶液转移至100ml高压反应釜中,加热至120℃,在120℃水热反应3h,反应结束后,自然冷却至室温,得到混合产物;
6、将混合产物在20℃和20000rpm转速条件下离心30min,去除上清液,用无水乙醇洗涤沉淀,重复操作3次,将所得的固体物在60℃下真空干燥过夜,得到所述的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒,命名为MH NPs;
将本实施例制备的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒用透射电子显微镜和扫描电子显微镜进行扫描,所得的TEM图如图1(a)所示,所得的SEM图如图1(b)所示,从图1(a)和图1(b)中可以看出,所制得的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒呈立方体结构,且大小均一,平均边长为17~20nm。
将本实施例制备的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒的粒径分布图如图2所示,从图2可以看出,所制得的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒粒径均一。
将本实施例制备的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒进行氮气吸附脱附测试,所得的孔径分布图如图3所示,由图3可知,所制得的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒为多孔材料,其孔径约为3nm。
将本实施例制备的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒进行ζ电势测试,所得的ζ电势如图4所示,由图4可知,所制得的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒的ζ电势约为-17.8mV。
试验一、本发明的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒的核磁性能测试
试验方法:
将实施例1制备的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒按照不同的比例加入纯水中,超声分散均匀,配制不同铁元素浓度的MH NPs溶液,将各浓度的MH NPs溶液做如下处理:取400μL MH NPs溶液放入5mm核磁管中,再将核磁管置于7T小动物磁共振成像仪中测试;
试验结果:
不同浓度的MH NPs溶液的纵向弛豫效率如图5(a)所示,不同浓度的MH NPs溶液的横向弛豫效率如图5(b)所示,由图5可知,实施例1制备的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒的纵向弛豫效率为2.665mM-1·s-1,横向弛豫效率为33.817mM-1·s-1,这表明本发明的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒具有良好的T2 1H-MRI成像性能,可进一步用于A549肺腺癌肿瘤的T2 1H-MRI成像。
试验二、本发明的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒的光热性能试验
1、不同浓度的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒的光热升温试验
试验方法:
将实施例1制备的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒按照不同的比例加入纯水中,超声分散均匀,配制质量浓度分别为100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml和1000μg/ml的MH NPs溶液,然后取1ml各浓度的MH NPs溶液做如下处理:将MH NPs溶液分别置于功率为500mW的808nm激光下进行照射,并用近红外热成像相机监测温度,每隔1min测试并记录MHNPs溶液的温度;
试验结果:
不同浓度的MH NPs溶液的光热升温曲线如图6(a)所示,从图6(a)可以看出,在500mW激光照射下,MH NPs溶液的升温速度和最高抵达温度随其浓度的增大而增大,其中,400μg/ml的MH NPs溶液经过一段时间照射后升温幅度即可超过20℃,而1mg/ml的MH NPs溶液更是在照射150s后,升温幅度就超过20℃。这表明本发明的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒具有优异的光热转换性能,可进一步拓展应用于A549肺腺癌肿瘤的光热治疗。
2、不同浓度的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒的光热循环稳定性试验
试验方法:
将实施例1制备的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒按照不同的比例加入纯水中,超声分散均匀,配制质量浓度分别为100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml和1000μg/ml的MH NPs溶液,然后取1ml各浓度的MH NPs溶液做如下处理:将MH NPs溶液分别置于功率为500mW的808nm激光下,多次循环施加和关闭激光照射,并用近红外热成像相机监测温度,记录MH NPs溶液在每次循环照射下(每隔1min测试并记录下MH NPs溶液的温度)温度变化情况;
试验结果:
不同浓度的MH NPs溶液的光热循环曲线如图6(b)所示,从图6(b)可以看出,在多次循环施加和关闭激光照射下,MH NPs的升温降温曲线基本一致,无明显变化。由此表明,本发明的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒具有良好的光热循环稳定性,具有对A549肺腺癌肿瘤进行多次光热治疗的潜力。
3、锰-血红素配位聚合物纳米颗粒在不同功率激光照射下的光热升温试验
试验方法:
将实施例1制备的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒加入纯水中,超声分散均匀,配制5ml质量浓度为200μg/ml的MH NPs溶液,然后分别取1ml 200μg/ml的MH NPs溶液于5个1.5ml PE管中,再将5个PE管分别置于功率为100mW、200mW、300mW、400mW和500mW的808nm激光下进行照射,并用近红外热成像相机监测温度,每隔1min记录各PE管中MH NPs溶液的温度;
试验结果:
MH NPs溶液在不同功率激光照射下的光热升温曲线如图6(c)所示,从图6(c)可以看出,不同功率激光照射下,MH NPs溶液的升温速度和最高抵达温度随功率的增大而增大。
试验三、本发明的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒对A549非小细胞肺腺癌细胞的CDT/PTT/Fe死亡试验
试验方法:
将人非小细胞肺腺癌A549细胞置于含10%胎牛血清及1%双抗(青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml)的F12K完全培养基中,在CO2含量为5%、相对湿度为90%和温度为37℃的细胞培养箱中进行常规传代培养,当细胞处于对数生长期时,先用0.25%胰蛋白酶消化2~5min,消化完成后,弃去胰酶,加入3ml完全培养基,吹打制成细胞悬液,然后向6孔板中各加入500μl细胞悬液,补加完全培养基至2ml,于细胞培养箱中过夜。次日,将六孔板中的A549细胞分别用不含血清的F12K培养基和MH NPs溶液(将实施例1制备的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒用纯水分散均匀配制MH NPs溶液,且MH NPs的孵育终浓度为100μg/ml)孵育4h,孵育结束后,吸出孵育溶液并用PBS清洗3次,各加入2ml PBS,分别得到F12K培养基孵育的非小细胞肺腺癌A549细胞(标记为F12K-A549细胞),以及MH NPs孵育的非小细胞肺腺癌A549细胞(标记为MH NPs-A549细胞),将其中一组F12K-A549细胞置于1W、808nm激光下照射10min,记为PBS+808nm组;另一组F12K-A549细胞不做任何处理,记为PBS组;将其中一组MHNPs-A549细胞置于1W,808nm激光下照射10min,记为MH NPs+808nm组;另一组MH NPs-A549细胞不做任何处理,记为MH NPs组;最后将PBS组细胞、PBS+808nm组细胞、MH NPs组细胞、MHNPs+808nm组细胞分别用DCFH-DA染色试剂盒、活细胞/死细胞双染试剂盒(Calcein-AM/PI试剂盒)、吖啶橙染色试剂盒和C11-BODIPY染色试剂盒标记后,用荧光共聚焦显微镜进行观察;
实验结果:
实施例1制备的MH NPs对A549非小细胞肺腺癌细胞的CDT/PTT/Fe死亡的结果如图7所示,从图7中可以看出:
DCFH-DA染色结果显示,与PBS组相比,PBS+808nm组细胞中无绿色荧光,MHNPs组细胞中有明亮的绿色荧光,施加激光的MH NPs+808nm组细胞中的绿色荧光更强,这表明单独激光照射并不能使A549细胞产生·OH,MH NPs自身具有的纳米酶催化性能可通过Fenton反应使A549细胞产生大量·OH,施加激光照射后,光热作用增强了MH NPs的纳米酶催化活性,促使A549细胞产生了更多的.OH;
活细胞/死细胞染色结果显示,PBS组细胞、PBS+808nm组细胞和MH NPs组细胞均发出活细胞特有的绿色荧光,而MH NPs+808nm组细胞激光照射区域内A549细胞全部显示死细胞的红色荧光,这与前面DCFH-DA的染色结果一致,MH NPs+808nm处理会使A549细胞发生坏死;
吖啶橙染色结果显示,PBS组和PBS+808nm组细胞的细胞核呈均匀的绿色荧光,MHNPs组细胞染色质发生固缩,断裂成大小不等的片段,形成凋亡小体,呈现碎片颗粒状的绿色荧光,而MH NPs+808nm组细胞黄绿色荧光大大减弱,这表明单独的激光照射不影响细胞的活性,MH NPs具有的纳米酶催化性能可通过Fenton反应破坏细胞的氧化还原稳态,促使细胞发生脂质过氧化,进而通过Fe死亡通路诱导A549细胞发生凋亡,进一步施加808nm激光后,光热协同增强作用会使A549细胞发生坏死;
C11-BODIPY染色结果显示,PBS组和PBS+808nm组细胞没有荧光产生,MH NPs组细胞呈现脂质过氧化特有的绿色荧光,进一步施加808nm激光后,A549细胞内的绿色荧光增强,脂质过氧化现象更加严重,这表明单独激光照射不能使A549细胞发生Fe死亡,具有纳米酶催化活性的MH NPs可以通过Fenton反应触发Fe死亡通路,诱导A549细胞发生凋亡,进一步施加808nm激光后,光热作用可以增强Fe死亡策略对A549细胞的氧化损伤作用,使A549细胞发生坏死;
综上所述,MH NPs具有固有的纳米酶催化活性,可以通过Fe死亡通路诱导A549细胞发生凋亡,施加激光后,光热作用可大大增强MH NPs对A549细胞的杀伤作用,进一步使A549细胞发生坏死。
试验四、本发明的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒的PAI/1H-MRI试验
1、锰-血红素配位聚合物纳米颗粒的PAI试验
试验方法:
1.1、将人非小细胞肺腺癌A549细胞置于10%胎牛血清及1%双抗(青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml)的F12K完全培养基中,在CO2含量为5%、相对湿度为90%和温度为37℃的细胞培养箱中进行常规传代培养,当细胞处于对数生长期时,用0.25%胰蛋白酶消化2~5min,消化完成后,弃去胰酶,加入完全培养基,吹打制成初始A549细胞悬液。将所得的初始A549细胞悬液于1000r/min离心3min后,弃去上层清液,离心管底部的细胞用无菌PBS重新吹打分散均匀,得到浓度约为2×107/ml的试验A549细胞悬液;
将实施例1制备的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒用纯水分散均匀,得到MH NPs溶液;
1.2、在每只成年雄性Balb/c裸鼠的右后腿皮下注射200μl A549细胞试验悬液,经2~4周培养,当肿瘤直径约为1cm时,在肿瘤部位原位注射100μl 500μg/ml的MH NPs溶液,用MSOT小动物多光谱断层扫描仪观测MH NPs在肿瘤部位的PA成像效果;
试验结果:
A549肺腺癌裸鼠原位注射MH NPs的PAI图像如图8所示,从图8可以看出,注射MHNPs后,A549肺腺癌裸鼠肿瘤部位显示出很强的光声信号,MH NPs对肿瘤具有优良好的PA成像效果。
2、锰-血红素配位聚合物纳米颗粒的1H-MRI试验
试验方法:
2.1、将人非小细胞肺腺癌A549细胞置于10%胎牛血清及1%双抗(青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml)的F12K完全培养基中,在CO2含量为5%、相对湿度为90%和温度为37℃的细胞培养箱中进行常规传代培养,当细胞处于对数生长期时,用0.25%胰蛋白酶消化2~5min,消化完成后,弃去胰酶,加入完全培养基,吹打制成初始A549细胞悬液。将所得的初始A549细胞悬液于1000r/min离心3min后,弃去上层清液,离心管底部的细胞用无菌PBS重新吹打分散均匀,得到浓度约为2×107/ml的试验A549细胞悬液;
将实施例1制备的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒用纯水分散均匀,得到MH NPs溶液;
2.2、在每只成年雄性Balb/c裸鼠的右后腿皮下注射200μl A549细胞试验悬液,经2~4周培养,当肿瘤直径约为1cm时,在肿瘤部位原位注射50μl 2mg/ml的MH NPs溶液,用7T小动物磁共振成像仪观测MH NPs在肿瘤部位的MRI造影效果,其中试验参数为:TR/TE=2500/80ms,RF=4,Number of average=4,FOV=30mm*30mm,MTX=256*256,Slice=4;
试验结果:
A549肺腺癌裸鼠原位注射MH NPs的MRI图像如图9所示,从图9可以看出,注射MHNPs后,A549肺腺癌裸鼠肿瘤部位显示出很强的T2-MRI信号,这表明MH NPs可以显著缩短质子的横向弛豫时间,具有良好的T2-MRI效果。
试验五、本发明的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒的活体肿瘤治疗效果试验
1、锰-血红素配位聚合物纳米颗粒对活体肿瘤的光热效应试验
试验方法:
1.1、将人非小细胞肺腺癌A549细胞置于10%胎牛血清及1%双抗(青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml)的F12K完全培养基中,在CO2含量为5%、相对湿度为90%和温度为37℃的细胞培养箱中进行常规传代培养,当细胞处于对数生长期时,用0.25%胰蛋白酶消化2~5min,消化完成后,弃去胰酶,加入完全培养基,吹打制成初始A549细胞悬液。将所得的初始A549细胞悬液于1000r/min离心3min后,弃去上层清液,离心管底部的细胞用无菌PBS重新吹打分散均匀,得到浓度约为2×107/ml的A549细胞试验悬液;
将实施例1制备的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒用纯水分散均匀,得到MH NPs溶液;
1.2、在每只成年雄性Balb/c裸鼠的右后腿皮下注射200μl A549细胞试验悬液,经2~4周培养,当肿瘤生长至体积约为100mm3时,将所有的A549肺腺癌肿瘤裸鼠随机分为2组,分别给予尾静脉注射200μl生理盐水(空白对照组)、尾静脉注射200μl 2mg/ml MH NPs溶液(实验组),尾静脉注射生理盐水和MH NPs溶液8h后,采用气麻装置麻醉裸鼠,让各组A549肺腺癌肿瘤裸鼠的肿瘤完全暴露在激光(波长808nm,光功率密度为0.8W/cm2)下照射10min,期间用近红外热成像相机监测不同时间节点肿瘤部位的温度;
试验结果:
A549肺腺癌裸鼠原位注射生理盐水和MH NPs溶液后肿瘤部位在激光照射下的升温情况如图10所示,由图10可知,激光照射10min后,空白对照组裸鼠肿瘤部位由26.2℃升至28.9℃,升温幅度仅有2.7℃,而试验组裸鼠肿瘤部位由22.4℃升至49.6℃,升温幅度高达27.2℃,由此表明,MH NPs能通过EPR效应富集在裸鼠肿瘤部位,并在808nm激光照射下产生显著的光热效应,可用于A549肺腺癌肿瘤的光热治疗。
2、锰-血红素配位聚合物纳米颗粒对活体肿瘤的治疗效果试验
试验方法:
2.1、将人非小细胞肺腺癌A549细胞置于10%胎牛血清及1%双抗(青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml)的F12K完全培养基中,在CO2含量为5%、相对湿度为90%和温度为37℃的细胞培养箱中进行常规传代培养,当细胞处于对数生长期时,用0.25%胰蛋白酶消化2~5min,消化完成后,弃去胰酶,加入完全培养基,吹打制成初始A549细胞悬液。将所得的初始A549细胞悬液于1000r/min离心3min后,弃去上层清液,离心管底部的细胞用无菌PBS重新吹打分散均匀,得到浓度约为2×107/ml的试验A549细胞悬液;
将实施例1制备的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒用纯水分散均匀,得到MH NPs溶液;
2.2、向20只成年雄性Balb/c裸鼠的右后腿皮下注射200μl A549细胞试验悬液,经2~4周培养,当肿瘤生长至体积约为100mm3时,将20只A549肺腺癌肿瘤裸鼠随机均分为4组,4组肺腺癌肿瘤裸鼠每间隔2天进行如下治疗处理,总共治疗3次:
将两组肺腺癌肿瘤裸鼠尾静脉注射200μl生理盐水,其中一组注射生理盐水的裸鼠不进行照射,标记为Saline组;另一组注射生理盐水的裸鼠在注射生理盐水8h后,采用气麻装置麻醉裸鼠,将裸鼠肿瘤完全暴露在激光(波长为808nm,光功率密度为0.8W/cm2)下照射15min,标记为Saline+808nm组;
将剩下两组肺腺癌肿瘤裸鼠尾静脉注射200μl,2mg/ml的MH NPs溶液,其中一组注射MH NPs溶液的裸鼠不进行激光照射,标记为MH NPs组;另一组注射MH NPs溶液的裸鼠在注射MH NPs溶液8h后,采用气麻装置麻醉裸鼠,将裸鼠肿瘤完全暴露在激光(波长为808nm,光功率密度为0.8W/cm2)下照射15min,标记为MH NPs+808nm组;
4组肺腺癌肿瘤裸鼠的治疗周期为15天,间隔一天测量裸鼠的体重以及肿瘤的体积;
试验结果:
锰-血红素配位聚合物纳米颗粒对A549肺腺癌肿瘤裸鼠的治疗效果如图11所示,从图11(b)和图11(d)中可以看出,Saline组裸鼠的肿瘤生长非常迅速,肿瘤体积增长了约6倍,Saline+808nm组裸鼠的肿瘤生长也很快,肿瘤体积增长了约4倍,而MH NPs组裸鼠的肿瘤生长缓慢,肿瘤体积缩小为初始体积的0.86倍,MH NPs+808nm组裸鼠的肿瘤生长十分缓慢,其中有两只裸鼠的肿瘤在治疗过程中消失,由此表明,本发明的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒具有优异的光热转换性能和抑制肿瘤生长的作用,进一步施加808nm激光可显著抑制A549肺腺癌裸鼠肿瘤的生长,光热治疗可协同增强CDT和铁死亡治疗非小细胞肺腺癌肿瘤的效果。另外,通过监测治疗周期内裸鼠的体重可以发现,各组裸鼠的体重变化稳定,这表明该纳米材料对裸鼠无明显的毒副作用。
Claims (9)
1.一种锰-血红素配位聚合物纳米颗粒,其特征在于:所述的纳米颗粒由锰离子和血红素中特有的两个羧基通过配位聚合作用形成,且所述的纳米颗粒呈立方体结构,平均边长为17~20nm。
2.根据权利要求1所述的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒,其特征在于:所述的血红素为氯化高铁血红素。
3.一种权利要求1所述的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
在pH=7的NaOH溶液中,锰源与血红素在120℃下进行水热合成反应,水热合成反应时间为3h,反应完成后,得到所述的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒的制备方法,其特征在于:所述的锰源为MnCl2.4H2O,血红素为氯化高铁血红素。
5.根据权利要求3所述的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒的制备方法,其特征在于:所述的锰源中锰离子与血红素的摩尔比为1:160。
6.一种权利要求1所述的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒在制备多模态成像显影剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒的应用,其特征在于:所述的多模态成像包括磁共振成像和光声成像。
8.一种权利要求1所述的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒在制备肿瘤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的锰-血红素配位聚合物纳米颗粒的应用,其特征在于:所述的肿瘤包括肺癌肿瘤,肿瘤治疗包括光热治疗、化学动力学治疗和铁死亡治疗。
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