CN113456613A - 一种近红外光激活型巨噬细胞-纳米前药靶向递药系统的构建及其应用 - Google Patents

一种近红外光激活型巨噬细胞-纳米前药靶向递药系统的构建及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明设计并合成了羧酸化铂前药，利用离子与前药的配位作用，制备配位纳米内核。纳米内核外包裹脂质，并将光敏剂分散其中构建前药纳米载体。利用巨噬细胞(BMDM)的吞噬功能负载纳米前药，制得近红外光(NIR)激活型巨噬细胞‑纳米前药递药系统。该系统具备高载药量、光控激活及保留自身活性与功能的特征，静注后能实现原发瘤与转移瘤的高效、同步递药。同时，在给予原发肿瘤NIR照射后，能触发药物快速释放并实现化疗‑光动力联合治疗，起到对肿瘤细胞的杀伤和免疫系统激活的目的。通过化疗‑光动力‑免疫三种模式的联合，最终实现原发与转移瘤的双重治疗。

Description

一种近红外光激活型巨噬细胞-纳米前药靶向递药系统的构 建及其应用
技术领域
本发明属于生物科学与药物载体相结合的技术领域，具体涉及一种近红外光激活型巨噬细胞递药系统的构建及其应用。
背景技术
癌症已成为21世纪人类健康的首要威胁。研究表明，原发瘤并非致死的首要因素，高达90％以上的肿瘤致死案例均与转移相关。常见的人类肿瘤，都极易发生转移。化疗作为临床肿瘤治疗最常用的治疗手段，严重受限于化疗药物的低肿瘤选择性及毒副作用。近年来，纳米递药系统介导的靶向递送，可在一定程度上提高靶部位的药物浓度。但是，高度血管化的原发肿瘤通常具有弯曲的脉管系统和较高的静水压力，导致纳米粒渗透性较差。而转移瘤，尤其是多发性微小转移灶，其不具备完整的脉管系统，导致纳米载体的被动靶向严重受限。研究表明，纳米载体进入血液循环后要跨越多重生理屏障，尤其是网状内皮系统(RES)的清除，使得静射后纳米载体在肿瘤中的分布极少。由此，由于原发肿瘤与转移瘤微环境的差异性、转移瘤微环境的复杂性，设计可同步靶向原发及转移区域进行治疗的纳米载体极为困难。亟需新的靶向递药策略。
近年来，基于自身循环细胞的药物递送载体，如红细胞、血小板、干细胞、单核细胞/巨噬细胞、淋巴细胞、树突细胞和嗜中性粒细胞等，已成为药物递送领域的新兴药物载体。该类细胞药物递送系统，具有长循环，提高的生物相容性和固有的生物可降解性等优势，可逃逸机体RES的清除。同时，基于巨噬细胞的载体可在肿瘤或者炎症区域分泌的细胞因子的作用下，克服多重生理屏障，将药物选择性递送到肿瘤区域，其作为一种潜在的“特洛伊木马”，在靶向药物递送领域备受关注，有望为原发瘤及转移瘤的同步靶向治疗提供新的治疗策略。
但是，如果直接将细胞毒药物装载于细胞载体中，细胞毒药物也将杀伤载体细胞，进而影响载体细胞本身的功能。针对此问题，有研究提出将巨噬细胞与纳米载体相结合的策略，利用纳米载体先稳定细胞毒药物，避免其对载体细胞的杀伤。然而，巨噬细胞到达靶部位后，如何实现细胞载体中药物的可控释放，也是目前基于细胞的递药系统面临的难题。为此，Lang等人利用炎性单核细胞携载pH敏感的胶束，利用细胞载体的肿瘤趋向特性，同步靶向乳腺癌原发肿瘤及肺转移区域，利用细胞内溶酶体酸性环境触发药物释放，实现显著抑制原发肿瘤及肺转移的作用(LANG T等.Advanced Functional Materials，2017，27(26)：1701093)。Ullah等人在巨噬细胞中装载热敏感键毒素功能化的、二氧化硅包裹的超顺磁性氧化铁纳米粒，当载体细胞到达靶部位后，给予交变电磁场，产生高热作用，断裂热敏感键，触发药物释放，实现靶向及可控的治疗模式(ULLAH S等.Journal of ControlledRelease，2019，294：327-336)。
虽然基于巨噬细胞的递药载体已有较多研究报导，但是基于巨噬细胞的递药载体中，尚未有利用巨噬细胞同步递送光敏活性分子与化疗前药的报导，并且基于巨噬细胞载体的可控释药机制中，尚未有利用近红外光同步释放光敏分子及细胞毒性化疗药物的报道。此外，尚未有基于巨噬细胞的递药系统，通过光照射原位肿瘤，进而激活化疗及光动力作用，诱导肿瘤发生免疫原性细胞死亡，从而抑制远端转移瘤的报导。
发明内容
鉴于上述现状，本申请的发明人拟构建一种近红外光激活型巨噬细胞-纳米前药递药系统，期望实现高载药量、高细胞活力及光控释药。利用巨噬细胞的固有功能，实现原发肿瘤与转移瘤的高效、同步递药。同时，期望在给予原发肿瘤NIR照射后，药物能快速从细胞载体储库中释放，并实现化疗-光动力联合治疗，起到对肿瘤细胞的杀伤和宿主免疫反应激活的目的。通过化疗-光动力-免疫三种治疗模式的联合，最终实现原发瘤与转移瘤的双重治疗。
本发明的目的在于克服现有技术的两大缺陷，一是克服现有纳米载体难以实现原发肿瘤与转移肿瘤同步靶向及高效同步治疗的难题，二是克服现有巨噬细胞递药载体难以实现高载药量、高细胞活力及精准可控释药的难题。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种近红外光激活型巨噬细胞-纳米前药靶向递药系统，其特征在于，以巨噬细胞作为靶向递药载体，内部负载载有近红外光可激活光敏剂与前药的纳米载体，负载方式为巨噬细胞的主动吞噬作用，其具有以下通式：
Macrophages-(PSs-Prodrugs)
其中，Macrophages为巨噬细胞；
PSs-Prodrugs为载有光敏剂与前药的前药纳米载体。
在其中一些实施例中，所述巨噬细胞为鼠源巨噬细胞与人源巨噬细胞；所述鼠源巨噬细胞包括永生化巨噬细胞与原代巨噬细胞，人源巨噬细胞为原代巨噬细胞；所述鼠源永生化巨噬细胞包括：RAW264.7；所述鼠源原代巨噬细胞包括：骨髓来源的巨噬细胞，腹腔来源的巨噬细胞；所述的人源原代巨噬细胞包括：血液单核细胞。
在其中一些实施例中，所述鼠源及人源巨噬细胞类型，包括巨噬细胞的M0表型或M1表型；所述的M1表型巨噬细胞由脂多糖(LPS)诱导，或者由其中所载的前药纳米载体中的药物诱导，其中诱导所用LPS的浓度为500ng/mL，诱导时间为24小时。
在其中一些实施例中，所述的载有光敏剂与前药的前药纳米载体，其具有下述通式：
PSs-Prodrugs
其中，PSs为光敏剂，包括：卟吩姆钠、原卟啉、酞箐锌、二氢卟吩或维替泊芬；
所述近红外光为卟吩姆钠、原卟啉、酞箐锌、二氢卟吩或维替泊芬光敏剂的最大发射波长；所述近红外光触发释药的光照时间为5～10分钟；所述近红外光照射的激光功率为250mW cm-2；
所述Prodrugs为含有羧酸或磷酸等配位基团的前药，包括：羧基化四价奥沙利铂前药、羧基化四价顺铂前药、磷酸化四价奥沙利铂前药、磷酸化四价顺铂前药、地西他滨磷酸酯前药或吉西他滨磷酸酯前药；
所述羧基化四价奥沙利铂前药具有如下结构通式：
Figure BSA0000246651330000031
其中n为1～6；
所述羧基化四价顺铂前药具有如下结构通式：
Figure BSA0000246651330000032
其中n为1～6；
所述的磷酸化四价奥沙利铂前药具有如下1、2或3结构式：
Figure BSA0000246651330000033
所述磷酸化四价顺铂前药具有如下1、2或3结构式：
Figure BSA0000246651330000041
所述地西他滨磷酸酯前药具有如下结构式：
Figure BSA0000246651330000042
所述吉西他滨磷酸酯前药具有如下结构式：
Figure BSA0000246651330000043
在其中一些实施例中，所述的PSs-Prodrugs纳米载体具有核壳结构，内核通过离子与Prodrugs的配位作用制备，对内核进行脂质包裹，并将PSs载入脂质双分子层中作为壳层。
在其中一些实施例中，所述与Prodrugs配位的离子为Zn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mg2+或Ca2+。
在其中一些实施例中，所述前药纳米内核中离子与Prodrugs的摩尔比为4∶1、5∶1、6∶1或8∶1。
本发明的另一目的在于提供一种上述的近红外光激活型巨噬细胞-纳米前药靶向递药系统在制备原发肿瘤及其相关转移瘤的靶向治疗药物中的用途。
在其中一些实施例中，所述的肿瘤是乳腺癌，肺癌，卵巢癌、胰腺癌，前列腺癌及其相关转移瘤；所述相关转移瘤主要为肿瘤骨转移与肺转移。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
将基于前药的技术与光敏活性分子引入纳米载体中，实现了巨噬细胞载体的高载药量、高细胞活力及光控释药特征，克服了基于巨噬细胞的载体载药量低及难以实现可控药物释放的难题。
克服了纳米载体靶向递药效率低及难以实现原发瘤与转移瘤同步靶向递药的难题，实现了原发瘤及转移瘤的同步、高效递药以及同步、高效治疗。
通过细胞载体介导的递药策略，实现了在对原发肿瘤治疗的同时，激活机体免疫系统，从而同步抑制远端肿瘤的效果。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，其中：
图1为实施例1中光激活前药纳米载体的透射电镜图。
图2为实施例2中流式细胞仪检测BMDM表面F4/80和CD11b双阳性细胞的比例。
图3为实施例3中BMDM与不同浓度的前药纳米载体孵育2h后每BMM中游离药物(左)和光敏剂(右)。
图4为实施例4中CCK-8法检测BMDM与不同浓度前药纳米载体(左)和游离药物(右)孵育2h后再继续培养2h，6h，12h和24h的细胞存活率。
图5为实施例5中透射电子显微镜观察BMDM与前药纳米载体孵育2h后前药纳米载体摄取情况。
图6为实施例6中光学显微镜观察空白BMDM和载药BMDM在普通生长介质及4T1TCM中的迁移能力(左)；迁移细胞的定量统计(右)；标尺＝200μm，***p＜0.001。
图7为实施例7中光照及非光照条件下空白BMDM和载药BMDM对4T1细胞的毒性，(+)代表激光照射(671nm，20mW cm-2，10min)。
图8为实施例8中荧光分光光度检测(左)和激光共聚焦考察巨噬细胞-纳米前药载体光触发释药行为(右)。
图9为实施例8中非载药巨噬细胞(左)及巨噬细胞-纳米前药载体(右)在光触发及非光触发条件下，细胞释放上清液对4T1肿瘤细胞的细胞毒性。
图10为实施例9中游离药物、前药纳米载体、巨噬细胞-前药纳米载体的药动学行为。
图11为实施例10中光敏剂、前药纳米载体、巨噬细胞-前药纳米载体的体内靶向原发肿瘤与转移肿瘤的能力。
图12为实施例11中游离药物、前药纳米载体、巨噬细胞-前药纳米载体在光照及非光照条件下小鼠原发肿瘤生长曲线。
图13为实施例11中游离药物、前药纳米载体、巨噬细胞-前药纳米载体在光照及非光照条件下，通过生物发光成像评估抑制小鼠转移瘤生长的能力。
图14为实施例11中游离药物、前药纳米载体、巨噬细胞-前药纳米载体在光照及非光照条件下，通过3D Micro-CT成像评估抑制抑制小鼠骨转移导致的骨溶蚀情况。
具体实施方式
以下结合附图对发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明的近红外光激活型巨噬细胞-纳米前药靶向递药载体经实验，体外结果显示，得益于纳米前药的优势，该细胞载体具有高细胞活力及高载药量，透射电子显微镜观察到细胞内有大量球形粒子，且体外具有与未载药巨噬细胞相当的肿瘤趋向能力。该细胞载体在生理条件下药物释放较为缓慢，但具有光触发释药特性，经NIR照射后，药物释放显著加快，并且化疗药与光敏剂可同步释放，不仅能增强药物疗效，且能起到进一步增强化疗与光动力联合治疗的作用。
本发明的近红外光激活型巨噬细胞-纳米前药靶向递药载体经实验，体内实验结果显示，该细胞载体可以显著延长药物在血液中的循环时间，并可显著增加药物在原发及骨转移瘤中的蓄积。给予原发肿瘤近红外光照射后，与单纯纳米载体相比，细胞载体能显著抑制原发肿瘤与骨转移瘤。
本发明涉及的方法属于本领域已知方法，实验相关的试剂与细胞可通过商业途径获得。
实例1：光激活前药纳米载体的制备：
采用反向微乳法制备DOPA包裹的前药纳米载体内核。具体操作如下：配制含0.3M曲拉通和1.5M正己醇的环己烷溶液作为微乳液法的油相。将200μL羧基化奥沙利铂钠盐溶液(8.83mg/mL)缓慢加入5mL油相中作为药物相，同时将200μL Zn2+水溶液(25mg/mL)缓慢加入到另一份相同的5mL油相中作为离子相，室温各自搅拌5min形成透亮的W/O型微乳液。将30μL DOPA氯仿溶液(138mM)加入到离子相中，继续搅拌5min后，将药物相在搅拌条件下缓慢滴加到离子相中。混合溶液在室温下继续搅拌45min后，加入10mL无水乙醇，17745g离心15min收集产物，分别用无水乙醇/四氢呋喃(1∶1)混合溶液洗涤2次、无水乙醇洗涤1次，最后用氯仿分散得到前药纳米载体内核，转移至玻璃瓶中，4℃储存备用。
光激活前药纳米载体的制备方法如下：将适量DOPC/Chol(摩尔比2∶1)的氯仿溶液，少量酞箐锌的DMSO溶液加入到前药纳米载体内核的氯仿溶液中，混合均匀，50℃旋转蒸发除去氯仿，加入2mL PBS复溶，超声分散，得到光激活型前药纳米载体，高速离心除去游离脂质体后重悬于PBS中，4℃储存备用。
透射电镜结果显示(图1)：所制得的光激活前药纳米载体粒径约为40nm，分布均一。
实例2：BMDM的获取：
首先制备L929细胞条件培养液(L929-CM)，具体制备操作如下：L929细胞传代后，长至50％-80％密度时，继续培养5-7天。收集上清，1000rpm离心6min后，0.22μm滤膜过滤分装于5mL EP管中，-20℃冰箱保存备用。
BMDM的制备操作如下：取8-12周龄的C57BL/6小鼠，颈椎脱臼处死后立即浸泡于75％乙醇溶液中5min，随后转移至超净台，逆向解剖法快速分离皮肤肌肉，游离洁净且完整的股骨和胫骨。无菌预冷PBS洗涤后，用手术剪小心暴露骨髓腔，用带1mL注射器针头的10mL注射器吸取无血清DMEM插入到骨髓腔中反复冲洗，直至骨髓腔发白。移液枪吹打冲出的骨髓祖代细胞，吸取细胞悬液过70μm细胞筛网，1200rpm离心6min。弃去上清液后，加入含30％L929-CM、15％FBS和1％青-链霉素的DMEM培养液，或含市售M-CSF(20ng/mL)的DMEM培养液轻轻吹打，重悬细胞，调整细胞密度，将细胞种于100mm培养皿，于37℃、5％CO2的培养箱中培养。培养到第30h及第4天更换上述新鲜培养液，用普通显微镜观察细胞的形态变化。培养到第6天或第7天获取BMDM，胰酶消化细胞制成单细胞悬液，加入抗小鼠CD16/32Fcγ受体阻断抗体室温孵育20min，阻断细胞膜上的Fc受体，再用FITC标记的抗小鼠F4/80抗体及PE标记的抗小鼠CD11b抗体4℃避光孵育30min，PBS洗涤后，使用流式细胞仪检测FITC及PE双阳性细胞以鉴定细胞的纯度。
流式细胞仪结果显示(图2)，使用L929-CM作为刺激巨噬细胞分化的细胞因子，所制得巨噬纯度较高，达95％以上。
实例3：细胞载体载药量测定：
将相同数目的BMDM(1×106个)分别与相同体积不同浓度的前药纳米载体在37℃条件下孵育2h，其中铂的孵育浓度为500、400、300、150和75μM；对应的光敏剂的孵育浓度为200、160、120、60和30μM。孵育结束后，细胞用PBS洗涤3次。细胞中光敏剂酞箐锌的含量通过荧光分光光度计测定。具体方法为：孵育结束后，细胞用PBS洗涤3次，收集细胞并用细胞裂解液裂解后，50℃旋转蒸发除去水溶液，随后加入氯仿溶解，以破坏类脂质细胞膜、DOPC与胆固醇等脂质分子对酞箐锌的包裹，释放游离的酞箐锌，然后50℃旋转蒸发除去氯仿，加入3mL DMSO复溶样品以溶解酞箐锌。建立酞箐锌在DMSO中(Ex＝670nm，Em＝690nm)的标准曲线，将样品稀释合适倍数使其荧光强度落在标准曲线范围内，同条件检测样品的荧光强度，并代入标准曲线中计算得到酞箐锌的含量。细胞中铂含量测定的具体操作为：向洗涤后的细胞中加入浓HNO3，在80℃水浴锅中加热消化数小时，直至细胞完全溶解形成澄清的溶液，随后转移到70℃烘箱中继续加热至样品完全干燥，加入1mL 1％HNO3复溶，稀释至合适倍数，采用石墨炉原子吸收分光光度计测定铂的含量。所测得的细胞中酞箐锌及铂的含量除以细胞数目即得每细胞中酞箐锌及铂的含量。
巨噬细胞内铂及酞箐锌的含量测定结果显示(图3)，细胞中铂及酞箐锌的含量均随着孵育浓度的增加而增加，当铂的孵育浓度大于或等于300μM，对应的酞箐锌的孵育浓度大于或等于120μM时，每细胞中铂和ZnPc的含量达10pg左右或大于10pg，具有较高的载药量。
实例4：光激活前药纳米载体对巨噬细胞的毒性考察：
使用CCK-8法考察不同浓度前药纳米载体及原料药，在非光照条件下对小鼠BMDM细胞活力的影响。具体操作如下：将接种于96孔板中贴壁过夜的BMDM分别与不同浓度的前药纳米载体和游离药物在37℃条件下孵育2h，其中铂的孵育浓度为500、400、300、150和75μM；对应的光敏剂的孵育浓度为200、160、120、60和30μM。孵育结束后，弃去含药培养基，用PBS溶液洗涤3次后更换新鲜培养基(含10％FBS的DMEM)，培养箱中分别继续培养2h、6h、12h和24h。在预定时间点每孔加入10μL CCK-8检测试剂，培养箱中继续孵育2h，振荡后用酶标仪测定450nm处各孔的OD值。以不加药物的孔作为对照组，按照以下公式计算细胞的相对存活率。
Figure BSA0000246651330000081
实验结果显示(图4)，当Oxa(IV)@ZnPc的初始浓度为400μM铂时，细胞存活率在6h时高于80％，并在12h时维持在70％以上，而将孵育浓度提高到500μM铂时，12h的细胞存活率低于70％，24h的细胞存活率降低至50％左右。结果表明，当孵育浓度增加至500μM铂时，虽然细胞具有更高的载药量，但此孵育浓度对细胞的活力造成了较大的影响，而当孵育浓度为400μM铂时，细胞不仅具有较高载药量同时细胞活性也维持较好。游离原料药在相同的孵育浓度下，继续孵育6h、12h和24h时，呈现出比前药纳米载体更显著的细胞毒性，体现出将化疗药物制备成前体药物的优势。综合权衡载药量和细胞活力，最终确定巨噬细胞-前药纳米载体的制备方法为：将105～108个BMDM与前药纳米载体在细胞培养液或PBS缓冲液中共孵育，孵育时间为2～4h，药物浓度为：光敏剂160μM，前药浓度400μM，孵育药物溶液体积为400μL-2mL，孵育温度为37℃。孵育结束后，(900rpm，5min)除去药物溶液，PBS洗涤3次后即得最终细胞载体。在此孵育条件下，制得的巨噬细胞-前药纳米载体具有较高的载药量，每个细胞约含20pg化疗药和15pg酞箐锌。
实例5：透射电子显微镜观察巨噬细胞中的前药纳米载体：
采用最终制备条件制备巨噬细胞-纳米前药靶向递药载体后，用PBS洗涤3次，离心(1,000g，10min)使细胞成团，静置2-5min后，吸走培养液，小心加入1mL 2.5％戊二醛固定液，然后用牙签将细胞团底部挑起，置于4℃冰箱中固定。固定完成后，将细胞团用1％四氧化锇(OsO4)处理1.5h，随后在一系列浓度梯度酒精中脱水，最后将溶液替换成100％的丙酮。然后将细胞包埋于SPI 812中，在60℃下固化并用切片机切成100nm的厚度，最后用透射电子显微镜观察纳米粒的摄取情况。
透射电镜图片显示(图5)，巨噬细胞中含有大量的球形结构的纳米前药载体，进一步证明了巨噬细胞具有高的药物负载能力。
实例6：巨噬细胞载体体外肿瘤趋向性考察：
采用Transwell小室法，考察BMDM载药前后在生理条件及模拟肿瘤环境中细胞的迁移能力。使用含10％FBS的DMEM模拟生理条件、4T1肿瘤细胞条件培养液模拟肿瘤环境。具体操作如下：将800μL含10％FBS的DMEM及4T1肿瘤细胞条件培养液分别加入到24孔板中，随后将Transwell(8μm孔径)小室放入培养板中，保证液面接触部位无气泡，将相同数目的空白BMDM和载药BMDM(2h载药完成后立即使用)细胞悬液200μL加入到Transwell小室的上室(5×104细胞/小室)，继续培养6h。培养结束后，将Transwell小室取出，PBS洗涤2次后，用4％多聚甲醛固定20min，用棉签轻微擦拭去除小室上表面的细胞后，用结晶紫染色30min，随后用PBS将小室清洗干净，室温下自然风干后，剪下聚碳酸酯膜，使用细胞成像系统进行拍照观察，并统计随机视野中迁移的细胞数目。
实验结果显示(图6)，下室为10％FBS的DMEM时，由于不含有肿瘤趋化因子，只有非常少量的非载药巨噬细胞和巨噬细胞-前药纳米载体通过Transwell膜，而下室为4T1 TCM时，通过Transwell膜的非载药巨噬细胞和巨噬细胞-前药纳米载体的数量显著增加。结果表明，巨噬细胞本身具有较强肿瘤趋向能力，且在载药后其肿瘤趋向能力基本不受影响，体现出高细胞活力与功能。
实例7：光激活巨噬细胞-纳米前药载体的体外抗肿瘤活性：
采用巨噬细胞-纳米前药载体与肿瘤细胞共孵育的方法，考察巨噬细胞-纳米前药载体的体外抗肿瘤能力。具体操作为：将4T1乳腺癌细胞以2.5×103个/孔的密度接种在96孔板中，培养箱中过夜贴壁后，将4T1与巨噬细胞-纳米前药载体和未载药巨噬细胞孵育24h。孵育结束后，用LED灯(671nm，20mW cm-2)照射细胞10min，置于培养箱中继续培养24h。培养结束后，采用MTT法考察细胞存活率。
结果显示(图7)，未载药巨噬细胞在有或无光照处理的条件下对4T1细胞基本无杀伤作用。巨噬细胞-纳米前药载体在非光照条件下显示出中等的细胞毒性。经光照处理后，巨噬细胞-纳米前药载体的细胞杀伤能力较不光照时显著增强。以上结果表明，巨噬细胞-纳米前药载体具有化疗及光动力双重杀伤细胞的途径，可将化疗与光动力联合起来增强细胞杀伤效果，在药物浓度较低时，该联合作用尤为明显。
实例8：光激活巨噬细胞-纳米前药载体的光触发释药特征：
巨噬细胞-纳米前药载体制备完成后，取900μL细胞-纳米前药载体的细胞悬液于1.5mL EP管(5×106个/管)中，随后置于恒温摇床中进行实验(37℃、50rpm)。考察静息状态下的药物释放：在预定时间点，将非光照处理组的细胞悬液离心，取出介质400μL，并补充等体积的释放介质。考察近红外激光照射对药物释放的影响：在光照处理组中，取完静息状态下孵育4h的点后，立即使用近红外激光(671nm，250mW cm-2)照射细胞5min，后续取样时间和取样操作均与非光照处理组相同。采用相同处理方法对细胞母液及细胞释放液进行处理，用荧光分光光度法测定各样品中酞箐锌的含量。
使用激光共聚焦进一步对非光照处理组及光照处理组6h(孵育4h后光照再继续放置2h)释放介质中的药物含量进行定性考察。具体操作为：将4T1细胞接种于预先放置细胞爬片的24孔板上，于37℃细胞培养箱中培养过夜。将两组细胞释放介质稀释同等倍数后与4T1细胞孵育12h。孵育结束后，细胞用PBS洗涤3次，4％多聚甲醛固定15min以及DAPI染色后，取出细胞爬片，封片剂封片。使用激光共聚焦显微镜观察光敏剂的相对含量。
分别以“(-)”表示生理环境组，“(+)”表示4h后进行近红外光照射组。实验结果显示(图8)，在近红外光触发前，4h(-)和4h(+)上清液的荧光强度基本一致。取完4h上清，对光照组进行近红外光照射，并继续孵育2h后的细胞上清液命名为“6h(+)上清液”。同法获取的、未进行光照处理的细胞上清液命名为“6h(-)上清液”。6h(+)释放上清液的荧光强度与6h(-)相比，显著增强。激光共聚焦实验呈现相同的结果。上述结果表明，近红外光照射可加速药物释放。
进一步通过考察近红外光触发后巨噬细胞-纳米前药载体释放介质对4T1细胞的细胞毒性，间接考察载体细胞的光触发药物释药特征。静息状态孵育4h后，将细胞暴露于LED灯(671nm，20mW cm-2)下照射10min，在光照结束后第4h(8h w-CM)收集细胞培养液。该细胞上清液在载体细胞悬液加入培养板后，总共孵育了8h，定义为8h光照组释放上清液(8hw-CM)，采用相同操作方法收集8h非光照组释放上清液(8h w/o-CM)。同法制备非载药巨噬细胞的光照及非光照上清液。将各组上清液分别与4T1细胞孵育，并分别对4T1细胞进行光照与非光照处理，通过MTT法测定4T1细胞的存活率。
结果显示(图9)，非载药巨噬细胞组的w/o-CM和w-CM基本无细胞杀伤能力，细胞存活率接近100％。巨噬细胞-纳米前药载体组的w/o-CM和w-CM均有显著的细胞杀伤作用，且w-CM对4T1细胞的细胞毒性显著强于w/o-CM组；对4T1细胞光照处理后，w/o-CM组和w-CM组的细胞毒性均显著增强，并且w-CM光照组也显著强于w/o-CM光照组。以上结果表明，巨噬细胞-纳米前药载体具有光触发释药特性，且化疗药及光敏剂可同步释放起效。
实例9：细胞载体体内药动学考察：
取SD大鼠9只，随机分成3组，每组3只。将原料药、前药纳米载体和细胞载体以1mg奥沙利铂/kg的剂量尾静脉注入SD大鼠体内，于给药后10min、20min、30min、40min、1h、2h、4h、8h、12h和24h，采用剪尾取血的方式从尾静脉取血约450μL，将全血置于经肝素钠预处理后的1.5mL EP管中，于4℃下1000g离心10min，收集上层血浆250`L于2mL EP管中，加入750μL王水，90℃孵育4h，随后转移到85℃烘箱中继续加热至样品完全干燥，加入1mL 1％HNO3复溶，并用0.45μm滤膜过滤后，用石墨炉原子吸收分光光度计测定铂的含量。
结果显示(图10)，与原料药相比，前药纳米载体和巨噬细胞-前药纳米载体的血液循环时间均明显延长。同时，巨噬细胞-前药纳米载体在注射后2h和24h血浆中的铂含量分别比前药纳米载体组高4倍和8.5倍。结果表明，巨噬细胞-前药纳米载体可以伪装纳米颗粒，使其成为隐形载体，从而显著提高药物在血液中的循环时间，为后续增强药物在肿瘤组织中的蓄积奠定基础。
实例10：细胞载体体内同步靶向原发肿瘤与骨转移瘤的能力考察：
构建原发瘤-骨转移瘤双肿瘤动物模型。将造模成功小鼠随机分组，尾静脉分别注射游离光敏剂，光激活前药纳米载体，及光激活巨噬细胞细胞-纳米前药载体，剂量为以1mg酞箐锌/kg的当量尾静脉注入荷瘤小鼠体内。在注射后的预定时间点(2h、4h、8h、12h和24h)，用小动物活体成像仪监测各制剂在小鼠中的分布情况。24h活体拍照完成后，脊椎脱臼处死各组小鼠，立即解剖收集心、肝、脾、肺、肾、原发瘤、肿瘤转移胫骨和正常胫骨，用生理盐水洗去各组织表面的浮血，用干净的定性滤纸吸干水分，置于活体成像仪中拍摄，获取各制剂在离体组织中的分布图像。激发波长和发射波长分别为660nm和710nm，曝光时间为1s。并用系统自带软件分析主要脏器和肿瘤组织的荧光强度。
结果显示(图11)，在所有检测时间点，巨噬细胞-前药纳米载体组在原发瘤及骨转移瘤中的荧光强度均高于游离光敏剂组及前药纳米载体组。以上结果表明，相比于前药纳米载体，巨噬细胞-前药纳米载体可高效、同步靶向到原发瘤及骨转移瘤区域。
实例11：细胞载体体内同步抑制原发肿瘤与骨转移瘤的能力考察。
将100μL 4T1细胞悬液(1×107个/mL)接种至雌性BALB/C小鼠左侧后背皮下，建立小鼠乳腺癌原发瘤皮下移植瘤模型。接种完成后逐日观察肿瘤生长状况。原发瘤接种10后，肿瘤体积约长至80mm3时，采用胫骨内注射的方法在小鼠右侧胫骨骨髓腔接种骨转移瘤。具体操作如下：腹腔注射4％水合氯醛于接种有原发瘤的小鼠中，待其完全处于麻醉状态时，将小鼠的右后腿膝关节弯曲一定角度，75％乙醇擦拭消毒，然后用1mL注射器吸取100μLLuc-4T1(带荧光素酶的4T1肿瘤细胞)细胞悬液(1×106个/mL)，将针头倾斜缓慢插入到小鼠胫骨的骨髓腔内，缓慢注射肿瘤细胞，构建小鼠乳腺癌骨转移瘤模型。注射完成后，用棉花按压20-30s。术后，隔天观察小鼠接种部位肿瘤生长情况。骨转移瘤接种第3天，向小鼠腹腔内注射D-荧光素(150mg/kg)，注射完10-20分钟后，通过小动物活体成像仪进行生物发光成像，并用系统自带软件分析骨转移瘤的荧光强度。
骨转移瘤接种后第4天，即生物发光成像后第二天，取接种有原发瘤(100-150mm3)且骨转移瘤生物发光成像荧光强度相近的小鼠随机分组，每组5只。分别尾静注射生理盐水，游离化疗药物，光激活前药纳米载体，光激活巨噬细胞-前药纳米载体。含光敏剂组设置光照组及非光照组。注射巨噬细胞数约为1×106个/小鼠。给药频次为每2天给药一次，总共给药3次。在注射后第4h和24h，原发肿瘤部位给予近红外激光(671nm，250mW cm-2)照射10min，骨转移瘤不进行光照处理。给药开始后隔天记录原位瘤的长径(L)、短径(W)和小鼠体重；肿瘤体积(V)计算公式为：V＝L×W2/2。通过生物发光成像监测骨转移瘤荧光强度考察骨转移瘤的生长情况，具体为：在接种Luc-4T1细胞后第3、10、16和22天，通过BLI记录骨转移瘤的荧光强度。
对小鼠原发肿瘤的抑制结果显示(图12)，与前药纳米载体不光照组相比，巨噬细胞-前药纳米载体不光照组对原发瘤及转移瘤的抑制作用均有一定程度的增强。经NIR照射后，前药纳米载体光照组和巨噬细胞-前药纳米载体光照组能显著抑制原发瘤的生长，与PBS光照组相比，原发瘤肿瘤抑制率分别为75％和84％，强于非光照组(单一化疗组)，表明化疗-光动力联合治疗能显著抑制原发瘤。
同时，巨噬细胞-前药纳米载体光照组对转移瘤的抑制效果显著强于前药纳米载体光照组(图13)。除此之外，巨噬细胞-前药纳米载体光照组对骨转移诱导的骨溶蚀的缓解能力，也强于前药纳米载体光照组(图14)。上述结果表明，与单纯前药纳米载体相比，巨噬细胞-前药纳米载体介导的化疗-光动力联合治疗不仅能显著抑制原发肿瘤，还能显著抑制转移瘤，并缓解肿瘤骨转移导致的骨溶蚀，具有强大的远端效应。

Claims (10)

1.一种近红外光激活型巨噬细胞-纳米前药靶向递药系统，其特征在于，以巨噬细胞作为靶向递药载体，内部负载载有近红外光可激活光敏剂与前药的纳米载体，负载方式为巨噬细胞的主动吞噬作用，其具有以下通式：
Macrophages-(PSs-Prodrugs)
其中，Macrophages为巨噬细胞；
PSs-Prodrugs为载有光敏剂与前药的前药纳米载体。
2.根据权利要求1所述的近红外光激活型巨噬细胞-纳米前药靶向递药系统，其特征在于，所述巨噬细胞为鼠源巨噬细胞与人源巨噬细胞；所述鼠源巨噬细胞包括永生化巨噬细胞与原代巨噬细胞，人源巨噬细胞为原代巨噬细胞；所述鼠源永生化巨噬细胞包括：RAW264.7；所述鼠源原代巨噬细胞包括：骨髓来源的巨噬细胞，腹腔来源的巨噬细胞；所述人源原代巨噬细胞包括：血液单核细胞。
3.根据权利要求2所述的近红外光激活型巨噬细胞-纳米前药靶向递药系统，其特征在于，所述鼠源及人源巨噬细胞类型，包括巨噬细胞的M0表型或M1表型；所述的M1表型巨噬细胞由脂多糖(LPS)诱导，或者由其中所载的前药纳米载体中的药物诱导，其中诱导所用LPS的浓度为500ng/mL，诱导时间为24小时。
4.根据权利要求1所述的近红外光激活型巨噬细胞-纳米前药靶向递药系统，其特征在于，所述的载有近红外光可激活光敏剂与前药的前药纳米载体，其具有下述通式：
PSs-Prodrugs
其中，PSs为光敏剂，包括：卟吩姆钠、原卟啉、酞箐锌、二氢卟吩或维替泊芬；
所述近红外光为卟吩姆钠、原卟啉、酞箐锌、二氢卟吩或维替泊芬光敏剂的最大发射波长；所述近红外光触发释药的光照时间为5～10分钟；所述近红外光照射的激光功率为250mW cm-2；
所述Prodrugs为含有羧酸或磷酸等配位基团的前药，包括：羧基化四价奥沙利铂前药、羧基化四价顺铂前药、磷酸化四价奥沙利铂前药、磷酸化四价顺铂前药、地西他滨磷酸酯前药或吉西他滨磷酸酯前药；
所述羧基化四价奥沙利铂前药具有如下结构通式：
Figure FSA0000246651320000011
其中n为1～6；
所述羧基化四价顺铂前药具有如下结构通式：
Figure FSA0000246651320000012
其中n为1～6；
所述的磷酸化四价奥沙利铂前药具有如下1、2或3结构式：
Figure FSA0000246651320000021
所述磷酸化四价顺铂前药具有如下1、2或3结构式：
Figure FSA0000246651320000022
所述地西他滨磷酸酯前药具有如下结构式：
Figure FSA0000246651320000023
所述吉西他滨磷酸酯前药具有如下结构式：
Figure FSA0000246651320000031
5.根据权利要求4所述的近红外光激活型巨噬细胞-纳米前药靶向递药系统，其特征在于，所述的PSs-Prodrugs纳米载体具有核壳结构，内核通过离子与Prodrugs的配位作用制备，对内核进行脂质包裹，并将PSs载入脂质双分子层中作为壳层。
6.根据权利要求5所述的近红外光激活型巨噬细胞-纳米前药靶向递药系统，其特征在于，所述与Prodrugs配位的离子为Zn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mg2+或Ca2+。
7.根据权利要求5或6所述的近红外光激活型巨噬细胞-纳米前药靶向递药系统，其特征在于，所述前药纳米内核中离子与Prodrugs的摩尔比为4∶1、5∶1、6∶1或8∶1。
8.根据权利要求1-7任一项所述的近红外光激活型巨噬细胞-纳米前药靶向递药系统在制备原发肿瘤及其相关转移瘤的肿瘤靶向治疗药物中的用途。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤是乳腺癌，肺癌，卵巢癌、胰腺癌，前列腺癌及其相关转移瘤。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述相关转移瘤主要为肿瘤骨转移与肺转移。
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