CN102688495A - 具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体及制备 - Google Patents

具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体及制备 Download PDF

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Abstract

一种具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体，可用于进行肿瘤治疗和体内成像定位。所述的载体是一种肿瘤病灶诱导激活穿膜肽介导的脂质体纳米颗粒，能够在静脉注射后通过循环系统特异性富集于肿瘤病灶，同时具有分子成像及携带多种生物大分子及药物的功能。具体说是通过利用Legumain特异识别的酶切底物封闭活性中心氨基酸的TAT穿膜肽连接PEG修饰的脂质体纳米颗粒，在通过循环系统到达肿瘤病灶部位后，由肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞表达的Legumain会将酶切底物与TAT活性中心分离，从而达到在肿瘤病灶的富集。此种纳米颗粒可以包装各种生物大分子或药物，具有杀伤肿瘤、体内肿瘤示踪及对肿瘤进行早期预防的功能。

Description

具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体及制备
技术领域
本发明属于化学材料技术领域，涉及一种新的具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体及其制备方法。主要阐明了所述脂质体纳米颗粒靶向基团的结构以及其连接方法和作用。
背景技术
目前，恶性肿瘤已经成为全世界非自然死亡致死第一位的疾病，严重地威胁着人类的身心健康。在当今技术条件下，不能及时发现早期的肿瘤，从而导致错过最佳治疗时机，以及不能准确定位和发现肿瘤的转移灶也降低了患者罹患恶性肿瘤后的生存几率。目前多应用化疗进行治疗，大多数化疗药物并不能够特异性地作用于肿瘤细胞，在对肿瘤细胞进行杀伤的同时也会对正常细胞产生一定杀伤作用，从而产生毒副作用，往往并不能获得长期生存，且花费巨大。以上都是当前恶性肿瘤治疗所面临的重要困难，所以找到一种能够靶向多发的肿瘤病灶部位的多项功能载体，将抗癌药物或基因特异性运输到肿瘤病灶，而不对周围的正常组织造成影响将显著提高治疗效果，减低副作用，并且同时可以在体内对肿瘤进行示踪，发现早期的原位肿瘤和肿瘤转移病灶，就显得尤为重要。
近年来有研究应用纳米颗粒载体药物进行试验性的肿瘤治疗，虽然其被证实具有一定的有效性，但这类纳米颗粒可以被装载的物质种类有限，且靶向性差，有较大的副作用，难以应用于临床。
发明内容
本发明的目的在于解决目前不能及时发现早期的肿瘤，不能准确定位和发现肿瘤的转移灶，化疗药物并不能够特异性作用于肿瘤细胞的问题，提供一种新的具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能脂质体纳米颗粒载体及制备方法。
本发明提供的具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体，是一种肿瘤病灶诱导激活穿膜肽介导的脂质体纳米颗粒载体，具体说是通过利用Legumain特异识别的酶切底物封闭活性中心氨基酸的TAT穿膜肽连接PEG修饰的脂质体纳米颗粒，该纳米颗粒能够包装各种生物大分子或药物，当遇到特异性识别酶时，能对酶切底物进行酶切，恢复穿膜肽活性，实现靶向，故该载体能够在经静脉注射后聚集于肿瘤病灶部位。
该具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体利用Legumain特异性识别酶切底物Ala-Ala-Asn的羧基端连接到TAT跨膜穿透肽的活性中心赖氨酸上，使其活性降低，在达到有Legumain表达的部位时，底物被剪切，TAT恢复活性，实现靶向穿膜。
所述纳米颗粒载体能够装载的药物为抗肿瘤药物阿霉素或化学染料DIR，具有特异性杀伤肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞的作用。
所述的多项功能纳米颗粒载体在装载了DIR等化学染料后，能够进行肿瘤病灶的体内示踪，并可高效灵敏的在肿瘤发生早期对体内的肿瘤进行定位，达到肿瘤早期预防的目的。
本发明所涉及的具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体的制备方法，通过以下步骤实现：
⑴按比例混合以下物质；
●DOPE               1~5mM
●DOPC               1~5mM
●Cholesterol        1~5mM
●DOPE-PEG 2000      0.1~1mM
●DSPE-PEG 2000-NH2  0.1~1mM
●Legumain-TAT       0.1~2mM
⑵将以上物质溶解在50ml有机溶剂中，或按相同比例溶解在有机溶剂中，所述的有机溶剂为甲醇、乙醇或氯仿，将混合好的溶液放在4℃过夜；
⑶旋转蒸发有机溶剂，40℃，10分钟，氮气持续干燥1小时；
⑷加入300mM的磷酸氢胺溶液1ml，水化1~2小时；
⑸用蜗旋仪混匀；
⑹水浴超声20min，探头超声5min；
⑺通过挤压将纳米颗粒粒径统一为90~120nm的多项功能纳米颗粒，保存在4℃；
⑻通过NHS-EDC反应，pH 9-10，室温，将Legumain-TAT连接到多项功能纳米颗粒的表面，并使用凝胶柱分离游离的NHS和EDC，从而制备具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体。
⑼利用磷酸氢胺浓度梯度差装载药物或生物大分子进入多项功能纳米颗粒中，所述的药物为阿霉素或DIR，所述的生物大分子为核酸或蛋白质，然后通过凝胶柱分离已装载药物或生物大分子的多项功能纳米颗粒和游离的药物或生物大分子，保存在4℃备用。
本发明所涉及的具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能脂质体纳米颗粒载体的肿瘤靶向治疗、体内示踪的应用方法如下：
1．体内肿瘤靶向治疗：
⑴对6-8周龄雌性BALB/c小鼠4号脂肪垫下原位注射1X105萤火虫荧光素酶标记的4T1小鼠乳腺癌肿瘤细胞，待一周后，在小鼠4号脂肪垫处会形成原位小鼠乳腺癌肿瘤，建成BALB/c小鼠原位乳腺癌模型；
⑵按以上所述方法制备具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体；
⑶通过尾静脉注射的方法对BALB/c小鼠荷瘤小鼠进行治疗，共分为6组，第一组为阴性对照PBS组；第二组为非靶向性单纯脂质体载体包装Doxorubicin组；第三组为Legumain靶向性脂质体载体包装Doxorubicin组；第四组为Legumain靶向性TAT穿膜肽脂质体载体包装Doxorubicin组；第五组为阳性对照，单纯抗肿瘤药物Doxorubicin组；
⑷尾静脉给药剂量为每只BALB/c小鼠每次施以合10mg/kg体重浓度的Doxorubicin、装载Doxorubicin的纳米颗粒或PBS每三天一次；
⑸重复上述步骤⑶和步骤⑷5次。
2．体内化学发光成像：
⑴监测肿瘤病灶生长情况：向4T1乳腺癌原位癌肺部转移模型BALB/c小鼠腹腔注射萤火虫荧光素酶底物D-Luciferin(150mg/kg)，待5分钟后利用Xenogen IVISLumina II活体成像系统检测化学发光信号，曝光时间根据情况为1-30秒；
⑵监测具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒在体内的分布：重复步骤⑴，此时显示的是体内肿瘤的位置，同时利用Xenogen IVIS Lumina II活体成像系统检测DIR近红外区域（吸收波长780nm）的化学发光信号，曝光时间根据情况为1-3分钟，确定肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒在体内的分布与肿瘤病灶的相关性。
3．体外免疫荧光成像：
⑴处死小鼠，取出心、肝、脾、肺、肾、肿瘤等重要组织器官，用OCT包埋，切成5毫米冰冻切片；
⑵用预冷丙酮-20℃固定20分钟；
⑶用10%山羊血清室温封闭1小时；
⑷倾去多余液体，滴加GFP或RFP抗体（1：100），4℃孵育过夜；
⑸TBST缓冲液洗3次，每次5分钟；
⑹滴加荧光二抗（1：200），室温避光孵育0.5小时；
⑺TBST缓冲液洗3次，每次5分钟；
⑻DAPI（1：1000）复染细胞核，室温避光孵育5分钟；
⑼TBST缓冲液洗5分钟；
⑽封片，荧光显微镜下观察；
⑾若进行生物体内分布，则直接进行DAPI染色，后封片进行镜下荧光检测。
本发明的优点和有益效果：
我们构建的Legumain靶向多项功能脂质体纳米颗粒载体，其设计的剪切方法和位点是利用肿瘤细胞及其相关巨噬细胞本身所表达的酶而进行的。其靶向性的实现无需对肿瘤细胞进行改造。这种结构与纳米颗粒载体的设计，使我们可以在活体内对肿瘤病灶及其转移病灶进行早期的标记与定位，并可同时携带多种化学药物对肿瘤细胞及肿瘤相关巨噬细胞进行杀伤，同时对机体本身的伤害极小。此发明将对用于临床肿瘤诊断与治疗的药物载体研究提供一种新的思路和技术方法，具有十分重要的意义。
附图说明
图1具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体合成示意图；
图2Legumain诱导激活的TAT肽的质谱分析图；
图3具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体的表面电位分析结果图；
图4具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体的粒径分布图；
图5具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体的透射电子显微镜图（标尺=100nm）；
图6体外激光共聚焦显微镜显示具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体被摄取能力的分析结果；
图7体外流式细胞仪对具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体被摄取能力的分析结果；
图8组织切片免疫荧光分析经尾静脉注射后具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体在正常BALB/c小鼠原位乳腺癌模型中的体内生物分布(标尺=50μm)；
图9经尾静脉注射后具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体在正常BALB/c小鼠原位乳腺癌模型中的体内示踪；
图10体内活体分子成像分析经尾静脉注射后具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体在正常BALB/c小鼠原位乳腺癌模型后对4T1肿瘤细胞的杀伤作用。
本发明结合附图和具体实施方式做进一步详细说明。
具体实施方式
实施例1
具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能脂质体纳米颗粒载体的制备（见图1）
⑴混合以下物质；
●DOPE            3mM
●DOPC            3mM
●Cholesterol            3mM
●DOPE-PEG 2000          0.45mM
●DSPE-PEG 2000-NH2      0.45mM
●Legumain-TAT           0.51mM
⑵将以上物质溶解在50ml甲醇、乙醇、或氯仿等有机溶剂中，将混合好的溶液放在4℃过夜；
⑶旋转蒸发有机溶剂，40℃，10分钟，氮气持续干燥,1小时；
⑷加入300mM的磷酸氢胺溶液1ml，水化1~2小时；
⑸用蜗旋仪混匀；
⑹水浴超声20min，探头超声5min；
⑺通过挤压将纳米颗粒粒径统一为100nm左右的颗粒，保存在4℃；
⑻利用磷酸氢胺浓度梯度差装载药物或化学小分子如阿霉素，进入脂质体纳米颗粒，后通过凝胶柱分离已装载药物或生物大分子的多项功能纳米颗粒和游离的药物或生物大分子，保存在4℃备用;
⑼通过NHS-EDC反应（pH 9-10,室温）,将Legumain-TAT连接到多项功能纳米颗粒的表面，并使用凝胶柱分离游离的NHS和EDC，从而制备出具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒。
利用超高效液相色谱-质谱联用对我们合成的Legumain诱导激活的TAT穿膜肽进行分析，结果如图2所示，可见在549.55、732.35和1097.95处有三个主峰，证明我们的多肽（MW=2193.51）合成成功；表面电位分析结果如图3所示，具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒的表面电位为零，不带有表面电荷；如图4及图5所示，具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体的粒径分布均一，且投射电子显微镜下，在PBS缓冲液中，可见脂质体纳米颗粒磷脂壁完整、包封完好，无破损的现象。
实施例2
体外肿瘤细胞对具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体的摄取能力分析
⑴用4T1细胞铺24孔板的盖玻片上，密度为2×105细胞/孔，用于激光共聚焦显微镜检测；
⑵用4T1细胞铺6孔板，密度为1.5×106细胞/孔，流式细胞仪检测；
⑶用CoCl2对步骤⑴和⑵铺板的4T1细胞进行刺激诱导出缺氧的微环境；
⑷缺氧诱导24小时后加入200微升纳米颗粒载体，对4T1细胞进行体外摄取能力的检测；
⑸纳米颗粒载体加入2小时后，去掉培养基，使用PBS清洗细胞；
⑹将步骤⑴用于激光共聚焦显微镜检测的细胞按以下步骤进行处理；
●用预冷丙酮-20℃固定20分钟；
●用10%山羊血清室温封闭1小时；
●倾去多余液体，滴加Legumain或actin抗体（1：100），4℃孵育过夜；
●TBST缓冲液洗3次，每次5分钟；
●滴加荧光二抗（1：200），室温避光孵育0.5小时；
●TBST缓冲液洗3次，每次5分钟；
●DAPI（1：1000）复染细胞核，室温避光孵育5分钟；
●TBST缓冲液洗5分钟；
●封片，荧光显微镜下观察。
⑺将步骤⑵用于流式细胞仪检测的细胞按以下步骤进行处理；
●用胰酶消化六孔板中的4T1细胞；
●2%胎牛血清的预冷PBS缓冲液洗3次，每次5分钟；
●上流式细胞仪检测。
结果如图6所示，体外激光共聚焦显微镜显示具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体被摄取能力有显著的提高，其摄取率达到了近95％。而激光共聚焦显微镜（图7）的结果也同样显示具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体携带抗肿瘤药进入细胞（细胞核）的能力。
实施例3
具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的纳米颗粒载体在BALB/c小鼠体内的生物分布
⑴对6-8周龄雌性BALB/c小鼠4号脂肪垫下原位注射1X105萤火虫荧光素酶标记的4T1小鼠乳腺癌肿瘤细胞，待一周后，在小鼠4号脂肪垫处会形成原位小鼠乳腺癌肿瘤，建成BALB/c小鼠原位乳腺癌模型；
⑵按实施例1中的方法制备具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体；
⑶通过尾静脉注射的方法对BALB/c小鼠荷瘤小鼠进行治疗，共分为6组，第一组为阴性对照PBS组；第二组为非靶向性单纯脂质体载体包装Doxorubicin组；第三组为Legumain靶向性脂质体载体包装Doxorubicin组；第四组为Legumain靶向性TAT穿膜肽脂质体载体包装Doxorubicin组；第五组为阳性对照，单纯抗肿瘤药物Doxorubicin组；
⑷尾静脉给药剂量为每只BALB/c小鼠每次施以合10mg/kg体重浓度的Doxorubicin、装载Doxorubicin的纳米颗粒或PBS每三天一次；
⑸重复上述步骤⑶和步骤⑷5次。
⑹处死小鼠，取出心、肝、脾、肺、肾、肿瘤等重要组织器官，用OCT包埋，切成5毫米冰冻切片；
⑺用预冷丙酮-20℃固定20分钟；
⑻进行DAPI染色，后封片进行镜下荧光检测。
体内生物分布结果如图8所示，具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的纳米颗粒载体在肿瘤病灶部分有高浓度的富集，在肾小管中有一定的残留。而非靶向的纳米颗粒则富集于肝脏和脾脏。此显示了Legumain靶向后的纳米颗粒可以有效的在肿瘤病灶富集。
实施例4
具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体在BALB/c小鼠乳腺癌模型中的体内示踪；
⑴对6-8周龄雌性BALB/c小鼠4号脂肪垫下原位注射1X105萤火虫荧光素酶标记的4T1小鼠乳腺癌肿瘤细胞，待一周后，在小鼠4号脂肪垫处会形成原位小鼠乳腺癌肿瘤，建成BALB/c小鼠原位乳腺癌模型；
⑵按实施例1中的方法制备具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体；
⑶监测肿瘤病灶生长情况：向4T1乳腺癌原位癌肺部转移模型BALB/c小鼠腹腔注射萤火虫荧光素酶底物D-Luciferin(150mg/kg)，待5分钟后利用Xenogen IVISLumina II活体成像系统检测化学发光信号，曝光时间根据情况为1-30秒；
⑷监测具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒在体内的分布：重复步骤（3），此时显示的是体内肿瘤的位置，同时利用Xenogen IVIS Lumina II活体成像系统检测DIR近红外（吸收波长780nm）的化学发光信号，曝光时间根据情况为1-3分钟，确定肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒在体内的分布与肿瘤病灶的相关性。
结果如图9所示，具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒在尾静脉24小时后，相较于其它纳米颗粒组及Doxorubicin组在肿瘤病灶有明显的富集作用。
实施例5
具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体在BALB/c小鼠乳腺癌模型后对4T1肿瘤细胞的杀伤作用
⑴对6-8周龄雌性BALB/c小鼠4号脂肪垫下原位注射1X105萤火虫荧光素酶标记的4T1小鼠乳腺癌肿瘤细胞，待一周后，在小鼠4号脂肪垫处会形成原位小鼠乳腺癌肿瘤，建成BALB/c小鼠原位乳腺癌模型；
⑵按实施例1中的方法制备具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体；
⑶通过尾静脉注射的方法对BALB/c小鼠荷瘤小鼠进行治疗，共分为6组，第一组为阴性对照PBS组；第二组为非靶向性单纯脂质体载体包装Doxorubicin组；第三组为Legumain靶向性脂质体载体包装Doxorubicin组；第四组为Legumain靶向性TAT穿膜肽脂质体载体包装Doxorubicin组；第五组为阳性对照，单纯抗肿瘤药物Doxorubicin组
⑷尾静脉给药剂量为每只BALB/c小鼠每次施以合10mg/kg体重浓度的Doxorubicin、装载Doxorubicin的纳米颗粒或PBS每三天一次；
⑸重复上述步骤⑶和步骤⑷5次。
⑹向4T1乳腺癌原位癌肺部转移模型BALB/c小鼠腹腔注射萤火虫荧光素酶底物D-Luciferin(150mg/kg)，待5分钟后利用Xenogen IVIS Lumina II活体成像系统检测化学发光信号，曝光时间根据情况为1-30秒；
⑺通过对萤火虫荧光素底物D-Luciferin的荧光信号强度来评估具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体在BALB/c小鼠乳腺癌模型后对4T1肿瘤细胞的杀伤作用。
如图10所示，相对于其他纳米颗粒对照组，以及阳性对照Doxorubicin组，肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体对BALB/c小鼠4T1乳腺癌原位癌模型的肿瘤有很好的杀伤作用。

Claims (3)

1.一种具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体，其特征在于所述的载体是一种肿瘤病灶诱导激活穿膜肽介导的脂质体纳米颗粒载体，具体说是通过利用Legumain特异识别的酶切底物封闭活性中心氨基酸的TAT穿膜肽连接PEG修饰的脂质体纳米颗粒，该纳米颗粒能够包装各种生物大分子或药物，当遇到特异性识别酶时，能对酶切底物进行酶切，恢复穿膜肽活性，实现靶向，故该载体能够在经静脉注射后聚集于肿瘤病灶部位。
2.如权利要求1所述的多项功能纳米颗粒载体，其特征在于所述的载体利用Legumain特异性识别酶切底物Ala-Ala-Asn的羧基端连接到TAT跨膜穿透肽的活性中心赖氨酸上，使其活性降低，在达到有Legumain表达的部位时，底物被剪切，TAT恢复活性，实现靶向穿膜。
3.一种具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体的制备方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
⑴按比例混合以下物质；
●DOPE                 1~5mM
●DOPC                 1~5mM
●Cholesterol          1~5mM
●DOPE-PEG 2000        0.1~1mM
●DSPE-PEG 2000-NH2    0.1~1mM
●Legumain-TAT         0.1~2mM
⑵将以上物质溶解在50ml有机溶剂中，或按相同比例溶解在有机溶剂中，所述的有机溶剂为甲醇、乙醇或氯仿，将混合好的溶液放在4℃过夜；
⑶旋转蒸发有机溶剂，40℃，10分钟，氮气持续干燥1小时；
⑷加入300mM的磷酸氢胺溶液1ml，水化1~2小时；
⑸用蜗旋仪混匀；
⑹水浴超声20min，探头超声5min；
⑺通过挤压将纳米颗粒粒径统一为90~120nm的多项功能纳米颗粒，保存在4℃；
⑻通过NHS-EDC反应，pH 9-10，室温，将Legumain-TAT连接到多项功能纳米颗粒的表面，并使用凝胶柱分离游离的NHS和EDC，从而制备具有肿瘤及肿瘤相关巨噬细胞靶向性的多项功能纳米颗粒载体。
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