JP2001516729A - 皮膚の抗原提示細胞に遺伝子を運搬する方法 - Google Patents

皮膚の抗原提示細胞に遺伝子を運搬する方法

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dna
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ジュリアナ・リスジーウィッツ
フランコ・ロリ
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ジェネティック・イミューナティ・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー
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Abstract

(57)【要約】 外来遺伝子材料と複合体形成された非ウイルス遺伝子運搬システムから、抗原提示細胞に対して特異的な分子運搬複合体が形成される。複合体は特異的受容体を介して標的細胞に入り、分解機構を克服し、細胞による外来遺伝子材料の機能的取り込み、または形質導入による遺伝子発現が起こる。本発明はまた、注射針を必要としない遺伝的免疫感作方法を含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本出願は、1997年9月15日に出願された米国特許出願60/058933号の部分継続出
願であり、該特許の全内容は本明細書の一部を構成する。本発明は、細胞中に外
来遺伝子材料を運搬するための方法及び組成物に関する。特に、細胞中への遺伝
子の受容体媒介運搬技術に関する。特定の型の標的細胞と適合し得る遺伝子運搬
複合体が、外来遺伝子材料、ベクター、及び、場合によりキャリアーより形成さ
れる。その後、受容体媒介エンドサイトーシスが可能な条件下で、複合体を細胞
に曝すと、外来遺伝子材料の機能的取り込みまたは形質導入が起こる。この方法
は、イン・ヴィトロだけでなく、皮膚ランゲルハンス細胞中への経皮的遺伝子運
搬として具体的に記載される、イン・ビボにおける抗原提示細胞中への遺伝子の
運搬にも有用である。外来遺伝子材料が感染性ウイルスと関連する抗原及び粒子
の実質的な一部分をコードするＤＮＡのような免疫原であり、そして、注入によ
る運搬が望ましくない場合に、本技術は、特に予防的及び治療的遺伝的免疫感作
で有用である。
【０００２】 （背景技術） 動物の免疫系は、細胞性免疫応答及び体液性免疫応答の2つの異なった、しか し関連した応答を含む。細胞性免疫応答では、外来と認識されるマーカーを表面
に有する細胞を殺すＴリンパ球が産生される。このような認識マーカーを表面に
有する細胞は、抗原を「提示している」と言われ、抗原提示細胞(ＡＰＣ)と呼ば
れる。さらに、血漿細胞の前駆体であるＢ細胞を助けることにより、Ｔリンパ球
は、体液性応答をも刺激する。
【０００３】 体液性免疫応答により、液状で特異的分子に対して働く抗体の、血漿細胞によ
る産生が起こる。抗体(または免疫グロブリン)は、外来物質の存在に応答して動
物により産生されるタンパク質である。これらは、Ｂリンパ球(Ｂ細胞)に由来す
る血漿細胞により分泌される。これらの可溶性タンパク質は、体液性免疫応答の
認識成分である。各抗体は、その産生を刺激する外来物質に対する特異的アフィ
ニティーを有する。即ち、抗体は、外来物質に付着する抗原結合部位と呼ばれる
、セグメントまたは部位を有する。自身に対する抗体の形成を導くことができる
外来大型分子は、抗原と呼ばれる。タンパク質及び多糖類は、通常、効果的な抗
原である。抗体の特異的アフィニティーは、全大型分子抗原に対するものではな
く、抗原決定基またはエピトープと呼ばれる、分子上の特定の部位に対するもの
である。抗体は、外来分子を溶液中及び膜上で、分子の置かれている状態に関り
なく認識する。体液性免疫は、細胞外媒質中で細菌及びウイルスに対抗するのに
最も効果的がある(「humor(体液性)」は、流体または液体という意味のラテン語
である)。病気に対する免疫を授ける方法の1つとして、本物のウイルスまたは細
菌ではなく、ウイルスまたは細菌に関連する1または複数の抗原に個体を曝す方 法がある。このようなワクチンは、サブユニットワクチンとして知られ、抗体の
産生を刺激するのに特によく機能する。
【０００４】 Ｔ細胞は、細胞性免疫応答を媒介する。体液性免疫と比べて、細胞性免疫応答
はウイルス感染した細胞、寄生体及び癌細胞を破壊する。Ｔ細胞の表面には、他
の細胞表面の外来分子を認識するＴ細胞受容体と呼ばれる膜貫通タンパク質が存
在する。即ち、Ｔ細胞は抗原提示細胞(ＡＰＣｓ)を認識する。Ｔ細胞は単独の外
来分子は認識しない。外来単位は、細胞の表面上に位置する必要があり、そして
、主要組織適合遺伝子複合体(ＭＨＣ)として知られる宿主の染色体超可変領域に
コードされる特定の膜タンパク質により、Ｔ細胞に提示されなければならない。
ＭＨＣは、3つのクラスの膜貫通タンパク質をコードする。ほとんど全ての型の 細胞に発現しているＭＨＣクラスＩタンパク質は、外来エピトープを細胞障害性
Ｔ細胞に提示する。免疫系細胞及び食細胞に発現しているＭＨＣクラスＩＩタン
パク質は、ヘルパーＴ細胞に外来エピトープを提示する。ＭＨＣクラスＩＩＩタ
ンパク質は、補体カスケードとして知られる工程の構成要素である。
【０００５】 ＭＨＣタンパク質に結合した外来エピトープを提示する細胞を破壊する、細胞
障害性Ｔリンパ球(ＣＴＬ、またはキラーＴ細胞)を含む、多様なＴ細胞が存在す
る。外来エピトープ-ＭＨＣタンパク質の結合体がＴ細胞受容体に結合すると、 Ｔ細胞は、重合して膜貫通孔を形成することにより細胞をこじ開けたりまたは細
胞溶解を誘導するパーフォリンを含む小粒を分泌する。ヘルパーＴ細胞と呼ばれ
る、別のクラスのＴ細胞はリンフォカインと呼ばれるペプチド及びタンパク質を
分泌する。これらのホルモン様分子は、他の細胞の運動及び活動を支配する。い
くつかの例として、インターロイキン-２(ＩＬ-２)、インターロイキン-４(ＩＬ
-４)、インターフェロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ-ＣＳＦ
)及び腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)が挙げられる。微生物及び感染された細胞の破壊を 起こす、精密に調節される複数の事象の複合系列である補体カスケードに、Ｔ細
胞は含まれる。細胞の原形質膜での大きな孔の形成に先立つ複数単位抗原-抗体 複合体の形成には、15以上の可溶性タンパク質が協同する。
【０００６】 抗原提示細胞(ＡＰＣ)による外来遺伝子の発現は、動物での効率的なＣＴＬ応
答を生じさせるのに有用な場合がある。そのため、ウイルス感染及び癌を含む様
々な病気に対する有効なワクチン並びに治療による取り組み方を生む可能性を、
ＡＰＣの遺伝子導入及び遺伝子修飾は有する。ポックスウイルス、アデノウイル
ス及びレトロウイルス等の種々の外来抗原を発現する活性組換えウイルスベクタ
ーにより、ウイルス感染を真似ることにより体液性及び細胞性免疫応答の両方を
導くことができる。また、生きた、毒性を減弱した(または、弱めた)ウイルスが
ワクチンとして提案されてきた。ＤＮＡ予防接種戦略も探求されている。様々な
ウイルス遺伝子が、プラスミドＤＮＡにクローン化され、筋肉、皮膚または皮下
注射されている。これらの構造物は、タンパク質を発現することができ、細胞性
及び体液性免疫応答の両方を導く。
【０００７】 ウイルス病が、遺伝的免疫感作の技術に反応するかもしれないことが提唱され
てきた。樹状細胞のような特定の細胞が、抗原を捕え、体組織からリンパ組織へ
と移動することが知られている。リンパ器官中でこれらの細胞は抗原を提示、即
ち、ＭＨＣタンパク質に結合した外来エピトープを提示する。このような抗原提
示細胞(ＡＰＣｓ)は、免疫応答機構の公知の要素である。樹状細胞(ＤＣ)等の細
胞が、感染性は有するが、有効な複製することはできないウイルスをコードする
ＤＮＡを含むように修飾した場合、従来通りに抗原を提示できるだけではなく、
ウイルス粒子及び多種多様なウイルスタンパク質を産生、または、発現するよう
操作することができる。代理人書類番号RGT-100A、米国特許出願08/803,484号「
予防的及び治療的遺伝的免疫感作の方法、及び、組成物(Methods and Compositi
ons for Protective and Therapeutic Genetic Immunization)」に新規な技術が
記載されており、その全内容は、本明細書の一部を構成する。複製能のないウイ
ルスを抗原提示細胞に組み込むことができ、それがリンパ器官に移動し、ウイル
ス抗原及びウイルス粒子の全成分を産生し、それにより体液性及び細胞性免疫応
答の両方を誘導することが、その中で明らかにされている。リンパ器官中のＤＣ
が全てのウイルス抗原を発現し得、「原型と同じに見える(authentic looking) 」ウイルス粒子を産生することが教示されている。これらのウイルス粒子は、そ
のため付加的な免疫応答を生じさせるのに中枢的な役割を果たす。
【０００８】 この文献の実施例１３には、ＡＰＣを含む細胞の「イン・ビボ形質導入」が記
載されている。その実施例中、ウイルス及び非ウイルス遺伝子運搬を含むいくつ
かの周知の方法が例示されている。実施例１４には、ＡＰＣを含む細胞の「イン
・ビボ形質導入」が記載されている。これらでは、(1)ＤＮＡの直接注入、(2)Ｄ
ＮＡを含むリポソームまたはヴィロソームの注入、(3)4型ポックスウイルスの脾
臓への直接注入、及び、(4)遺伝子運搬ビヒクルを運ぶ直腸及び膣坐剤が使用さ れる。しかしながら、この文献にはイン・ヴィトロ及びイン・ビボの遺伝子運搬
の方法が詳細に記載されていない。それが、本発明の主題である。
【０００９】 ＡＰＣの遺伝的修飾が、動物及びヒトの新生児並びに成体を予防接種するのに
効果的であることを示す事実が幾つかある。Ridgeら(Science,第271号,第1723〜
1726頁,1996年)は、別の動物から単離した外来抗原を発現するＤＣをマウスに静
脈注射した。これらのＤＣを注射されたマウスの新生児及び成体の両方において
、標的細胞がＣＴＬによりよく殺された。これらの実験により、外来抗原を発現
するＤＣが、ウイルス感染の際、感染細胞を排除することができる予防的細胞媒
介免疫応答を誘導できることが示された。さらに、これらの実験により、新生児
のＤＣ媒介免疫感作が場合により可能であることが示された。これらの実験では
本発明に記載されるような遺伝的に修飾された細胞、複数の外来抗原、または、
ウイルスは使用されなかった。
【００１０】 Sarzottiら(Science,第271巻,第1726〜1728頁,1996年)は、ウイルスによる低 用量接種により、ＣＴＬ応答を生じさせる保護的免疫応答(Ｔｈ１型)が引き起こ
されるが、高用量接種によっては、主として抗体を産生する非保護的免疫応答( Ｔｈ２型)が引き起こされることを示した。これらのＣＴＬ応答は、長持ちし、 新生児においても生じさせることができた。高用量のウイルスは、ＤＣがＴ細胞
を活性化する前に、Ｔ細胞を圧倒し、無力化するのかも知れない。そして、前述
のように注入によるのではなく、ＤＣの提示による投与経路が重要である。これ
らの発見は、低用量ウイルスにより優先的に細胞(Ｔｈ１型)免疫応答が誘発され
ることを示す他の結果と一致する。マカークザルでは、低用量ＳＩＶは、抗体産
生の見られないＴｈ１型応答を引き出し、高用量の投与に対して動物を保護した
(Clericiら、AIDS,第8巻,第1391〜1395頁,1994年)。ヒトでも同様の結果が、Rowl
and-Jonesら(Nature Med.,第1巻,第59〜64頁,1995年)により示された。
【００１１】 細胞に外来遺伝子材料を含ませる、細胞修飾の方法は遺伝子導入、トランスフ
ェクションまたは形質導入と呼ばれる。本明細書中に挙げられた文献の何れも、
イン・ヴィトロであれ、イン・ビボであれ、抗原提示細胞中への効率的な遺伝子
導入の証拠を示していない。ＤＣ等の抗原提示細胞中への遺伝子導入の背景技術
として、リポソーム媒介遺伝子導入、エレクトロポレーション、並びに、レトロ
ウイルスベクター及びアデノウイルスベクター媒介遺伝子導入を含む「低効率」
のイン・ヴィトロの方法が、記載されてきた(Arthur, J.F.ら、Cancer Gene The rapy ,第4巻,第1号,第17〜21頁,1997年；Song, E.S.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S .A. ,第94巻,第5号,第1943〜1948頁,1997年）。これらの全てのイン・ヴィトロの
方法は、実験室において遺伝子運搬ビヒクルにより処置される非常に多数の細胞
の単離を含む。全てのヒトまたは動物へのこの技術の応用は、これらの遺伝的に
修飾された細胞の再導入を含む。このため、イン・ヴィトロ細胞運搬方法は、多
数の個体の予防接種または処置が可能なものではない。公知のイン・ビボの手法
には、組換えウイルスベクターの皮内または筋肉内注射、並びに、プラスミドＤ
ＮＡの皮内、皮下及び筋肉内注射が含まれる。これらの方法の何れにおいても、
樹状細胞等の抗原提示細胞中へ効果的に遺伝子が運ばれることが示されず、皮膚
を通して遺伝子がランゲルハンス細胞中へ運ばれることはもっとまれであった。
【００１２】 （図面の詳細な説明） 図１には、Ｆｃ受容体を発現する細胞中への、抗体媒介遺伝子運搬の工程が概
念的に説明される。1または複数の受容体(2a、b、c、d)を有する標的細胞(1)が 、キャリアー(4)、及び、外来遺伝子材料を含むベクター(5)を含有する遺伝子運
搬複合体(3)に曝される。遺伝子運搬複合体(3)は、細胞(1)の受容体(2a、b、c、
d)に結合し、エンドサイトーシス、または、エンドソーム(6)の食作用によりベ クター(4)は細胞に取り込まれる。ベクター(4)は、エンドソーム(6)を壊す性質 を有し、それにより外来遺伝子材料が細胞内に放出される。
【００１３】 図２には、マンノース受容体を発現する細胞中への、糖媒介遺伝子運搬の工程
が概念的に説明される。この例においては、1または複数のマンノース受容体(12
)を持つ未分化ランゲルハンス細胞である標的細胞(10)が、外来遺伝子材料と複 合体形成されたポリエチレンイミン-糖(マンノース)を含む遺伝子運搬複合体(13
)に曝される。遺伝子運搬複合体(13)は、細胞(10)の受容体(12)に結合し、ＰＥ Ｉ-ｍａｎ-ＤＮＡは、エンドソーム(14)によるエンドサイトーシスを介して細胞
に取り込まれる。ベクター(ＰＥＩ-ｍａｎ)は、エンドソームを壊す(15)能力を 有し、それにより外来遺伝子材料が細胞内に放出される。細胞は成熟し(16)、そ
して外来遺伝子材料によりコードされるタンパク質(17)を発現する。
【００１４】 図３には、イン・ビボにおける、マンノース受容体を発現する細胞中への糖媒
介遺伝子運搬を示す、実験が説明される。標的細胞は、皮膚のランゲルハンス細
胞であり、マンノース受容体を発現することが知られている。マウス(21)に麻酔
をかけ、各マウスの背中の領域(22)を剃った。剃った表面をエタノールでふいた
。8％グルコース中のＰＥＩ-ｍａｎ-ＤＮＡ遺伝子運搬複合体(23)を、各マウス の剃った領域(22)に塗布した。剃った領域の皮膚(22)に存在するランゲルハンス
細胞(24)は、上述の図2に記載されるように複合体をとらえ、活性化され、拡散 性リンパ節(25)に移動する(24)。移動中、ランゲルハンス細胞(24)は、樹状細胞
(26)へと成熟し、ＤＮＡによりコードされるタンパク質(27)を発現する。
【００１５】 図４には、ＰＥＩ-ＤＮＡ対ＰＥＩ-ｍａｎ-ＤＮＡ複合体を用いた、イン・ヴ ィトロにおける遺伝子運搬の実験結果が示される。詳細な説明中に記載されるよ
うにヒトＤＣを培養し、複合体でトランスフェクトした。グリーン蛍光タンパク
質(ＧＦＰ)をコードするマーカー遺伝子をＤＮＡとして使用した。これらの実験
では、複合体はＮａＣｌ溶液に溶解した。実験により、ＰＥＩ-ｍａｎの方がＰ ＥＩよりも、培養ＤＣのトランスフェクト効率がよいことが示された。
【００１６】 図５〜６には、実験結果が示され、以下の実施例の部分で詳細に論じられる。
【００１７】 (発明の概要） 本発明の目的は、イン・ビボ及びイン・ヴィトロにおける、細胞中への効率的
の高められた遺伝子導入を提供することである。本発明のさらなる目的は、抗原
提示細胞中への遺伝子導入効率を上げ、それにより改善された遺伝的免疫感作の
方法を提供することである。そして、本発明のさらなる目的は、導入された遺伝
子材料のタンパク質産物に対する体液性及び細胞性の両方の免疫応答を刺激する
手段を提供することである。そして、また別の本発明の目的は、ウイルス病に対
して効果的な免疫応答を提供することである。また別の本発明の目的は、ウイル
ス病に対して効果的で、そして安全性も改善されたワクチンを提供することであ
る。
【００１８】 本発明の利点は、多種多様な病気に対する免疫治療及び予防接種に使用できる
イン・ビボの遺伝子導入法を提供できることである。
【００１９】 本発明の別の利点は、腫瘍遺伝子、免疫原(アレルギーを引き起こす)、ウイル
スタンパク質、若しくは、種々の型の複製欠損ウイルス、欠損ウイルス粒子、及
び、プラスミドＤＮＡ等の免疫原をコードするプラスミドＤＮＡを含む、いかな
る型のＤＮＡ、またはＲＮＡでも、使用し得ることである。
【００２０】 本発明の別の利点は、ＤＮＡに代えて、腫瘍形成タンパク質(例えば、変異ｐ ５３若しくはＲａｓ)、免疫原(アレルギーを引き起こす)、ウイルスタンパク質 、または、種々の型の複製欠損ウイルスのようなタンパク質を使用し得ることで
ある。
【００２１】 これらの、そしてその他の本発明の目的及び利点は、詳細な説明及び実施例に
より明らかにされる。
【００２２】 本発明の目的及び利点は、ベクター(所望の外来遺伝子材料を含む)及びキャリ
アー(細胞及び遺伝子運搬材料の両方に結合できる)からなる遺伝子運搬複合体を
形成し、エンドサイトーシスが起こりうる条件下で、標的細胞を複合体に曝すこ
とによって、達成することができる。遺伝子材料がエンドソームによる分解を免
れ、所望の外来遺伝子材料を細胞質または核へ運搬することができるという特徴
をベクターは有する。遺伝的に修飾された細胞により、外来タンパク質は発現さ
れ、免疫系に対して提示され得る。代理人書類番号No.RGT-100A,米国特許出願「
予防的及び治療的遺伝的免疫感作のための方法及び組成物(Methods and Composi
tions for Protective and Therapeutic Genetic Immunization)」(該文献の全 内容は、本明細書の一部を構成する)に記載されるように、外来遺伝子材料が、 複製欠損ウイルスをコードする場合、変異された標的細胞は、リンパ器官でウイ
ルス抗原を提示し、さらにウイルス粒子及びタンパク質を発現して、細胞性免疫
応答と同時に体液性免疫応答を効果的に生じ得る。
【００２３】 （発明の詳細な説明） 本発明は、細胞中へ外来遺伝子材料を運搬するための方法及び組成物に、最も
関るものである。抗原提示細胞(ＡＰＣｓ)等の免疫系に含まれる特定の細胞中へ
の遺伝子運搬効率を上げることにより、遺伝的免疫感作の効率を高めることは、
特に有用である。発明者の最終目的は、遺伝子材料を細胞内に運ぶことであるが
、本発明により、適当な大きさ及び立体配置のいずれの分子であっても細胞中へ
運搬できることが予期される。よって、例えば、薬剤またはタンパク質等の他の
材料も、本明細書中に記載の技術により標的細胞に運搬することができる。
【００２４】 本発明は、動物内に存在する幾つかの天然の経路を利用するものである。
【００２５】 例えば、特定のタンパク質が受容体により媒介されるエンドサイトーシスによ
って細胞内に運び込まれることが知られている。この経路では、特定のタンパク
質またはリガンドは、細胞の原形質膜に存在する特異的受容体に結合する。膜が
タンパク質の周りに小胞、または、袋を形成し、最後にリガンドを内側に取り込
んでしまう。即ち、タンパク質を細胞内に運搬する。後に、エンドソームはこれ
らの複合体を一般的には、リソソームへ運搬し、複合体はそこで構成部分である
ペプチドに分解される。ＭＨＣ発現が起こる細胞では、ペプチド-ＭＨＣ複合体 がリソソームに集積し、抗原提示と呼ばれる過程により細胞の表面に到達する。
受容体媒介エンドサイトーシスは、必須代謝産物、ホルモン及び成長因子等の巨
大分子を細胞に運搬するための手段である。これは、多くのウイルスおよび毒素
が細胞に入り込むために活用する経路でもあり、免疫応答においても役割を果た
す。例えば、食細胞は、抗原-抗体複合体を取り込めるような受容体を持ってい る。
【００２６】 ＩｇＧのような抗体、Ｃ３ｂのような補体、または、その両方と複合体形成し
た粒子は、受容体媒介エンドサイトーシス及び食作用により、細胞に効率的に入
り込める。抗体、または免疫グロブリンは、異なる機能を示すことができる、別
の部分を有している。例えば、免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)は、抗原結合部位のあ
る2つのＦabセグメント、及び、エフェクター機能を媒介するＦcセグメントを持
つＹ型の分子である。多価抗原は、複数の抗体と結合することができ、免疫複合
体を形成する。これらの免疫複合体の大きさは、抗原及び抗体の相対的な濃度と
相関している。
【００２７】 エンドサイトーシスは、オプソニン作用として知られる工程により増幅させ得
る。オプソニン作用とは、抗体が抗原を包むことにより免疫系の他の構成成分に
より抗原が認識され、抗原に応答する過程である。適当なＦabサイトを持つ免疫
グロブリンを、抗原粒子を包むのに利用し得、引き続き、対応するＦc受容体が 、オプソニン化された抗原のＦc部分を認識し、直ちにエンドサイトーシスによ り取り込まれる。Ｃ３ｂ、Ｃ４ｂ及びＣ３ｂｉ等の補体もまたオプソニン作用活
性を有する。小さい免疫複合体よりも、大きいものの方が免疫グロブリン分子の
Ｆc部分に対する受容体を発現するＢ細胞、単核食細胞、顆粒球、好中球及び樹 状細胞のような細胞により、より効率的に食作用を受ける。
【００２８】 ＩｇＧ抗体は、動物に抗原をアジュバンドと共に、または、なしで注射するこ
とにより得られる。また、分子遺伝学の技術を用いて抗体をクローン化およびヒ
ト化することができる。免疫系の細胞の膜上に一般に存在する他の受容体には、
免疫系細胞の形質導入に簡単に利用できる、例えばトランスフェリン、マンノー
ス及びアシアロ糖タンパク質受容体が含まれる。抗体のＦc受容体部もまた、分 子遺伝学の技術を用いて他の受容体結合ドメインと置換することができる。本発
明の目的としては、遺伝子をさらに樹状細胞まで運搬する働きを提供するので、
Ｆc受容体及び対応するＩｇＧ分子が適当である。
【００２９】 分子が一度、細胞内にエンドサイトーシスまたは食作用により取り込まれると
、エンドソームと呼ばれるタンパク質-受容体複合体中に含まれることとなる。 エンドソームは、細胞内の酸性の区画であり、分別を行うのに役立つ。食作用に
より生じる、ファゴソームは、巨大(10×〜20×)エンドソームである。材料がペ
プチド、ヌクレオチド及び糖のようなより小さい産物に分解されるリソソームに
エンドソームは融合する。本発明では、ベクターの役割は、外来遺伝子を細胞に
入れ、遺伝子の分解を避けさせることである。即ち、ベクターはエンドソームを
破壊し、遺伝子を細胞内液、細胞質または核上に放出しなければならない。アデ
ノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ポックスウイルスベクター及び
ＳＶ-４０ウイルス等のウイルス遺伝子運搬粒子を含む、多数の粒子が、受容体 媒介エンドサイトーシスの後、エンドソームを破壊することが知られている。非
ウイルス遺伝子運搬粒子には、ポリリシン、ポリエチレンイミン及びその誘導体
、リポソーム、ヴィロソーム、並びに、エンドソーム内のｐＨを上昇させるクロ
ロキン等の化学物資とＤＮＡとの抱合体(conujugate)が含まれる。
【００３０】 標的細胞 本発明は、受容体媒介エンドサイトーシスまたは食作用を行うことができるい
かなる細胞にも適用できる。標的細胞は、相補的な分子と結合することにより、
所望の分子をエンドソームまたはファゴソームに取り込むことができる受容体部
を発現していなければならない。本発明の目的として、免疫応答にかかわる細胞
が好ましい。これらの細胞には、抗原の受容体媒介エンドサイトーシス及び食作
用に従事できるものを含む。このような細胞には、例えば、Ｂ細胞、単核食細胞
、顆粒球、好中球及び樹状細胞が含まれる。これらの細胞は、免疫グロブリンの
Ｆc部、補体受容体、または、その両方に対する受容体を発現する。外来抗原を 効率的に提示することにより、細胞性免疫応答またはＣＴＬ応答を誘発するので
、樹状細胞及びマクロファージが特に好ましい。トランスフェリン及びマンノー
ス受容体等の他の受容体を介して細胞を標的とすることもできる。
【００３１】 樹状細胞は、脾臓、扁桃及びリンパ節と同じようにリンパ組織に属するが、樹
状細胞は、血液、表皮、粘膜、及び他の末梢組織で見つかる。これらの細胞は抗
原を捕え、抗原と一緒にリンパ組織へと移動する。皮膚では、ランゲルハンス細
胞と呼ばれる樹状細胞が、表皮で見つけられる。それらが抗原をエンドサイトー
シスにより取り込むと、それらは局所リンパ節へ移動する。リンパ節の中では、
それらの細胞は相互連結細胞と呼ばれ、ナイーブＴ細胞に対して抗原を提示し、
細胞性免疫応答を誘発する。
【００３２】 遺伝子導入の効率を高めるために、利用できる樹状細胞の数は最大にするべき
である。場所の選択もその要因であり得る。高密度の樹状細胞が、例えば、口、
膣及び直腸の皮膚、並びに、粘膜で見つかっている。組織中の未成熟ＤＣは、効
率的にエンドサイトーシスすることができるので、遺伝子を受容体媒介エンドサ
イトーシスによって運搬する遺伝子運搬複合体のよい標的である。しかしながら
、有効なＭＨＣ分子の発現及び抗原提示のためには、ＤＣはさらに活性化されな
ければならない。イン・ヴィトロでは、未成熟ＤＣは、末梢血よりＧＭ-ＣＳＦ 及びＩＬ-４、または、骨髄前駆体よりＧＭ-ＣＳＦを用いて産生することができ
る。これら未成熟のＤＣの活性化は、イン・ヴィトロ及びイン・ビボで、リポ多
糖及びＴＮＦ-αのような細菌の産物により誘導することができる(Watts C.、Na ture ,第338号,第724〜725頁,1997年)。
【００３３】 細胞または組織の損傷等の免疫系にかかわる事象により、樹状細胞を特定の部
位に引き寄せ、活性化させることができる。本発明の目的のため、樹状細胞を含
む抗原提示細胞の引き寄せ及び活性化は、予防接種またはウイルス感染とはかか
わりのない免疫応答により媒介することができる。一例としては、薬、毒物、化
粧品及び環境抗原のような化学物質に対する接触過敏により引き起こされる皮疹
が挙げられる。化学的な刺激物が皮膚に塗布されると、通常、暴露後24〜48時間
で発疹または外傷が現れる。外傷は、化学物質がランゲルハンス細胞の表面タン
パク質に結合されたことにより作られた新抗原のためである。新抗原は、抗体に
より認識される、共有結合により修飾された「普通の」タンパク質(例えば、リ ン酸化)である。この部位で、通常量より多くの樹状細胞を見つけ得、そして、 それらの多くがより活性化され易く、即ち、抗原のエンドサイトーシスをより受
け入れやすい状態になっている。刺激物の選択は、ＤＣを引き寄せる効率及びそ
の副作用に依存する。本発明の他の態様において、免疫複合体媒介創傷を作るこ
とができる。この場合、Ｂ細胞及び補体カスケードを活性化するために抗原及び
抗体の両方を持つ免疫複合体が、作られた組織損傷と共に使用できる。
【００３４】 細胞は特定のクラスの受容体により標的化されるので、本発明における特別の
利点は、特定の細胞に標的を絞って遺伝子運搬複合体を作ることができるという
ことである。ＩｇＧ、または、適当な澱粉若しくは糖で修飾されたポリエチレン
イミンを用いて、遺伝子運搬複合体を形成すると、主に抗原提示細胞により取り
込まれる。これは、遺伝子を基礎とするワクチンの開発における、大きな利点で
ある。例えば、補体受容体またはトランスフェリン受容体を発現する細胞を標的
化することも、前述したように可能である。
【００３５】 遺伝子運搬複合体 本発明の遺伝子運搬複合体は、或る受容体を持つ細胞にイン・ヴィトロまたは
イン・ビボで遺伝子を運搬するのに使用することができる。遺伝子運搬複合体は
2つの部分より構築される：遺伝子材料及び運搬粒子、そしてさらにキャリアー を含み得る(図１参照)。1つの態様として、遺伝子材料は弱毒化されたＨＩＶウ イルス由来であり、運搬粒子は非ウイルスベクターである。
【００３６】 他の態様では、同じ、または、異なる遺伝子材料をウイルスベクター及びキャ
リアーと結合させ得る。この場合、キャリアーは好ましくは、標的細胞の表面上
に存在する受容体に相補的な部位、及び、所望の運搬粒子に対する抗原結合部位
を有する抗体である。そのようなキャリアーは、細胞及び運搬粒子の両方に対し
て特異的である。遺伝的免疫感作のため、遺伝子運搬粒子に特異的なヒトＩｇＧ
が、好んで選ばれる。抗体が市販されていない場合には、当業者に公知の手法に
より抗体を作ることができる。遺伝子運搬粒子が複製欠損ＨＩＶ-１である場合 には、ヒトＩｇＧをキャリアーとし得、受動免疫治療のため、それは大量に入手
可能である。遺伝子運搬粒子は、抗体と一緒に5分間、室温でインキュベートす ることにより複合体形成させることができる。遺伝子運搬粒子及び抗体の相対量
は、遺伝子運搬粒子をオプソニン化することが望ましいかどうかにより決定され
る。
【００３７】 遺伝子材料 ＤＮＡまたはＲＮＡが遺伝子材料として、運搬複合体により運ばれる。1また は複数の遺伝子が、1つのプラスミドＤＮＡ鎖、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ上に コードされ得る。或いは、遺伝子運搬粒子として使用する場合には、遺伝子材料
は、組換えウイルスとして構築することができる。遺伝子導入の目的が免疫応答
を誘導することであれば、遺伝子材料は、1つまたは複数の免疫原タンパク質を 発現するものでなければならない。形質導入された細胞は、その後、十分な免疫
応答(例えば、個体を野生型ウイルスの感染から防護する)を誘発するのに必要な
だけの免疫原タンパク質(異なるウイルス抗原、及び、確実に十分なウイルス粒 子を産生する)を発現するであろう。
【００３８】 遺伝子運搬粒子の選択は、病気及び選択された導入する遺伝子(群)により決定
される。ＨＩＶ等の逆転者酵素依存性ウイルスに対するワクチンを作ることが望
まれる場合、少なくとも複製若しくは組み込み欠損ウイルスの実質的一部分、ま
たは、複製若しくは組み込み欠損ウイルス自体を、好ましくは、ＤＮＡはコード
する。これらに限定されるわけではないが、例としては、ＨＩＶ-１／ＬＷ等の 二親和性初代純粋培養物(dual-tropic primary isolate)のインテグラーゼ欠損 変異体、及び、ｇａｇ遺伝子のプロテアーゼ切断部位に欠失を有するその誘導体
が含まれる。予防的及び治療的遺伝子免疫の方法及び組成物については、1997年
2月20日に出願された米国特許出願08/803484号参照。それらの全内容は、本明細
書の一部を構成する。癌のためのワクチンを作ることが望まれる場合、免疫原は
、1または複数の腫瘍遺伝子をコードするＤＮＡである。他のＤＮＡ構造物は、 複製欠損ヒト乳頭腫ウイルス(子宮頸癌を起こす)、複製欠損肝炎Ａ、Ｂ及びＣウ
イルス(肝炎及び肝癌を起こす)をコードするＤＮＡ、並びに、ウシ白血病ウイル
スまたは猫免疫欠損ウイルス等の動物ウイルスの複製欠損体をコードするＤＮＡ
であり得る。外来遺伝子材料を組み込む運搬粒子の選択には、(a)複製欠損ＨＩ Ｖまたは他のレトロウイルス、(b)組換えアデノウイルス、(c)ＰＥＩまたはＰＥ
Ｉの誘導体と複合体形成されたプラスミド若しくは直鎖ＤＮＡ、または、ＲＮＡ
、(d)何等かのＤＮＡまたはＲＮＡを含むヴィロソーム、(e)ＤＮＡまたはＲＮＡ
を含むリポソーム、(f)プラスミドＤＮＡ-ポリリシン-ウイルス複合体、(g)何等
かのＤＮＡまたはＲＮＡと複合体形成された糖が、含まれ得る。
【００３９】 運搬システム 細胞中へ効果的に遺伝子を運搬するために、遺伝子運搬システムは、運搬され
るべき遺伝子または遺伝子群を含み、そして、リソソームへ運ばれたり、細胞の
外表面に分離されて分解の標的とならずに、エンドソーム(またはファゴソーム)
を破壊する能力を有する必要がある。さらに、遺伝子運搬システムは、細胞の遺
伝子材料の中への外来遺伝子材料の組み込みを促進させねばならない。
【００４０】 遺伝子運搬システムは、ウイルスまたは非ウイルスベクターのどちらでも含み
得る。ウイルス遺伝子運搬システムには、アデノウイルスベクター、レトロウイ
ルスベクター、ポックスウイルスベクター、変異体ウイルス(上述)、及びヴィロ
ソーム等の組換えウイルスが含まれる。非ウイルス遺伝子運搬システムには、糖
、ポリリシン、ポリエチレンイミン、ポリエチレンイミン誘導体及びリポソーム
、並びに、それらの誘導体とのＤＮＡ抱合体が含まれる。
【００４１】 糖、糖誘導体、リポソーム、リポソーム誘導体、及び、ポリエチレンイミンま
たはポリエチレンイミン誘導体を用いた非ウイルス遺伝子運搬システムが好まし
い。これらのうち、免疫系細胞のマンノースレセプターを標的とするようにした
糖及びポリエチレンイミン誘導体が特に好ましい。
【００４２】 非ウイルス遺伝子運搬システムには、ウイルス運搬システムに比べていくつか
の利点がある：1)第一に、非ウイルスベクターは免疫系により認識されないので
、それに対する免疫応答を生じさせない。その結果として、複数回にわたる免疫
感作において当該ワクチンにより処置された個体が、免疫寛容となり、適切な免
疫応答を発揮し得る。2)予期しない様式でシステムが変異する可能性がないので
、非ウイルスシステムの方が、潜在的にウイルスシステムよりも安全である。3)
非ウイルスシステムは、化学的に大量に合成し得るので、そのため潜在的により
安価である。
【００４３】 好ましい態様は、陽イオンポリマーであるポリエチレンイミン(ＰＥＩ)をベー
スにする。ＰＥＩはＤＮＡに結合し、複合体を形成する。ＰＥＩ-ＤＮＡ複合体 は、皮膚の抗原提示細胞、ランゲルハンス細胞のエンドソームに、アシアロ糖タ
ンパク質受容体媒介エンドサイトーシスにより入り込むことができる。その後、
この複合体のＰＥＩ成分は、エンドソーム緩衝及び膨張を細胞質への脱出機構と
して利用する(Pollard H., Remy J.S., Loussourarn G., Demolombe S., Behr J
.P.、J.Biol.Chem.,第273巻,第13号,第7507〜7511頁,1998年3月27日)。他の受容
体を標的とするようにＰＥＩを修飾すこともできる。例えば、糖修飾ＰＥＩ等の
ＰＥＩ誘導体によっても、細胞のマンノース受容体を介して取り込まれるという
以外、同様の結果が得られる。このような誘導体は、実験室で作ることができる
。例えば、イソチオシアントフェニルフェニルマンノース誘導体を25ｋＤａのＰ
ＥＩにつなぐことにより、リガンド(または、マンノース受容体に対して低いア フィニティー(1ｍＭ)のマンノース残基)が得られる。他の可能性としては、直鎖
ＰＥＩ(22ｋＤａ)誘導マンノテンパオースリガンドの使用が挙げられる。(これ らの材料は、Jean-Paul Behr博士(Laboratoire de Chimie Genetique, Faculte
de Pharmacie, CNRS-UMR 7514 74 route du Rhin 67401 Illkirch, France)によ
り提供された。）
【００４４】 マンノース受容体は、175ｋＤａの膜貫通糖タンパク質であり、マクロファー ジ及びランゲルハンス細胞の表面に特異的に発現されている。マンノース受容体
の細胞外ドメインは、8つの炭水化物認識ドメインを有する。マンノース受容体 は、細菌、寄生体、酵母、カビ及びマンノース化されたリガンドにわたる多数の
ものを修飾する糖のパターンを認識する(Takahashi K., Donovan M.J., Rogers
R.A., Ezekowitz R.A.、 Cell Tissue Res.,第292巻,第2号,第311〜323頁,1998 年5月)。Ｆc受容体と対照的に、マンノース受容体は、その結合物を放出する際 に自分自身を再構成する(Stahlら、Cell,第19巻,第207頁、1980年)。従って、マ
ンノース受容体は、トランスフェリン受容体と類似の仕組みによって、リガンド
を連続的に取り込み、抗原の捕獲のための持続した能力を示す(Goldsteinら、An nu.Rev.Cell Biol. ,第1巻,第1頁,1985年)。液相を介して取り込まれた抗原と比 べて、マンノース受容体を介して吸収された抗原は、Ｔ細胞への抗原提示効率が
100倍良いことが、最近発見された(Engeringら、Eur.J.Immunol.,第27巻,第2417
〜2425頁,1997年)。この増幅された抗原提示能は、マンノース受容体を介した非
常に効率的な抗原の吸収による。これらの理由により、マンノース受容体を標的
とすることによって、抗原提示細胞への特異性を生じさせると同時に、エンドソ
ームへの複合体の機能的吸収の効率が上がると考えられた。
【００４５】 キャリアー 本発明のキャリアーは、遺伝子運搬システムを細胞受容体と結合させる遺伝子
運搬複合体の一部である。1つの態様として、キャリアーは免疫グロブリンＧ(Ｉ
ｇＧ)である。ＩｇＧは、抗原結合部位を有する2つのＦabセグメント及びＦc受 容体と呼ばれる細胞受容体に結合するＦcセグメントを有するＹ型の分子である 。Ｂ細胞、単核食細胞、顆粒球白血球、及び、樹状細胞等の免疫系細胞はＦc受 容体を有する。ＩｇＧをキャリアーとして使用した場合、Ｆc受容体を有する細 胞が特異的に標的となる。
【００４６】 他の細胞を標的とするようにキャリアーの特異性を変える場合、抗体のＦc部 分を、補体、糖またはトラスフェリン等の他の受容体結合ドメインに置換するこ
とができる。
【００４７】 キャリアーが抗体である場合、巨大な複合体が形成され、キャリアーと遺伝子
運搬システムは好ましくは、等比で結合される。粒子をオプソニン化することが
望ましい場合、キャリアーの量は、遺伝子運搬粒子の量を遥かに上まる。巨大な
複合体、及び、オプソニン化された粒子では、エンドサイトーシス及び食作用の
両方が増幅される。遺伝子運搬複合体は、望ましくはキャリアーによりオプソニ
ン化される。外来遺伝子材料を包含する運搬粒子と複合体形成された抗体から作
られた、オプソニン化された遺伝子運搬複合体が個体に投与された場合、体液性
免疫に比べ細胞性免疫が最大限に活性化されるであろう。オプソニン化された複
合体により樹状細胞が活性化され、エンドサイトーシスがより効率的になるであ
ろう。さらに、多数の抗体により運搬粒子の抗原決定基(エピトープ)がブロック
される。そのため、運搬粒子に対する直接的な抗体反応は期待できないであろう
。さらに、抗体結合した抗原がＢ細胞のＦc受容体部位に結合し、抗体反応をさ らに阻害する。しかしながら、樹状細胞及びマクロファージを含む様々な抗原提
示細胞により、複合体はエンドサイトーシスまたは食作用を受けるので、細胞性
免疫は刺激され得る。
【００４８】 好ましい態様では、キャリアーは非ウイルス遺伝子運搬システムに共有結合さ
れる。ＰＥＩは、糖(例えば、マンノース、グルコース、ガラクトース等)により
化学修飾され得る。この場合のキャリアーは糖リガンドで、マンノース受容体に
より認識される。キャリアーの特異性を変えるため、糖を他の受容体結合ドメイ
ンに置換することもできる。
【００４９】 イン・ビボ遺伝子運搬 遺伝子運搬複合体は、血液、皮膚、または、キャリアー結合特異性に対応する
細胞が存在する他の場所に、直接注入することができる。複合体は、皮膚または
粘膜上に直接塗布することができる。その場合、表面のランゲルハンス細胞が活
性化されることが好ましい。活性化は、受容体(例えば、マンノース受容体)への
刺激、毒素活性化(例えば、コレラ毒素)、炎症のような組織または細胞損傷、及
びその他の抗原刺激により達成され得る。
【００５０】 ヒト若しくは動物の成体、または、新生児の場合、小児科用の給餌管を経口、
経膣または直腸経由で用いて、複合体を注入することができる。経口投与は、成
人よりも新生児の方に向くかもしれない。または、遺伝子運搬複合体を坐剤とし
てまとめ、膣または直腸に挿入することもできる。
【００５１】 ウイルス運搬粒子が使用される場合、、イン・ビボの抗体産生を高力価にする
ために2期に分けて、対象個体の筋肉または皮膚に、アジュバンドの存在下また は不在で複合体を直接注射することができる。最初の注射により主として体液性
免疫応答が引き起こされる。即ち、多数の抗体を産生する能力が生じる。運搬粒
子をオプソニン化する十分なＩｇＧ抗体濃度(経験に基づき測定または評価でき る)が利用できる場合、上述1〜3に記載のように運搬粒子をもう一度、投与する ことができる。2度目の投与の部位は、オプソニン化された抗原を食作用または エンドサイトーシスにより取り込むことができる細胞が存在するよう、慎重に決
定されねばならない。
【００５２】 進行性の感染の処置 本発明のワクチンは、活動性のＨＩＶ感染を処置する方法にも場合により使用
し得る。ＨＩＶは多量に複製し、素早く変異し、即ち、存在するＨＩＶ粒子の型
に対して免疫系が有効な反応を備え得る前に、免疫系を出し抜くのに十分な粒子
の新規変異体が産生されている。免疫系が実質的に損傷を受ける前に、或いは、
免疫系が回復できるくらいに十分な時間、野生型ウイルスの複製を抑制すること
ができれば、本発明のワクチンを免疫系のウイルスの新規変異体を認識する能力
を高めるために使用し、それにより既に感染している個体内でのウイルス複製を
調整する手段を提供することができる。
【００５３】 少なくとも一時的に、ＨＩＶ複製を抑制するのに効果的な薬剤の組合せは公知
である。発明者らは、オキシ尿素、1または複数の逆転写酵素阻害剤、場合によ り、1または複数のプロテアーゼ阻害剤を含む薬剤の組み合わせが特に有効であ り、患者によっては、それにより投薬治療をかなりの期間にわたって中止するこ
とができることを示した。米国特許出願09/056,691号(1998年4月8日出願)「オキ
シ尿素、ヌクレオシドアナログ、及びプロテアーゼ阻害剤の複合使用によるHIV 阻害方法(Method of Inhibiting HIV by Combined Use of Hydroxyurea, a Nucl
eoside Analog, and a Protease Inhibitor)」、米国特許出願09/048,753号(199
8年3月26日出願)「イン・ヴィトロにおいてオキシ尿素及び逆転写酵素阻害剤を 使用したＨＩＶ阻害方法(Method of Inhibiting HIV using Hydroxyurea and Re
verse Transcriptase Inhibitor in vitro」、並びに、米国特許出願09/048,756
号(1998年3月26日出願)「イン・ビボにおいてＨＩＶ個体群を複製欠損にする方 法(Method of Rendering a HIV Population Replication Incompetent in vivo 」参照。これらの全内容は、本明細書の一部を構成する。本発明は、進行性のＨ
ＩＶに感染した患者を適切な薬剤の組み合わせにより血液中のウイルス負荷が望
ましい低レベル、50,000コピー／ｍｌ以下、好ましくは10,000コピー／ｍｌ以下
、より好ましくは200〜500コピー／ｍｌ以下となるまで処置する方法を含む。薬
剤の組合せにより野生型ウイルスの複製が抑制されている間に、本発明のものを
使用して、患者にワクチン接種する。
【００５４】 以下に、本発明の実施を説明するために実施例を示す。それにより、発明また
は特許請求の範囲が、限定されるものではない。
【００５５】 実施例 １．培養ＤＣにおける複製欠損ＨＩＶをコードするプラスミドＤＮＡの発現 ＤＣ源はいくつか存在する。ＤＣは、骨髄ＣＤ３４＋造血前駆細胞から単離す
ることができる。骨髄単核細胞は、Ficoll-Hypaque勾配遠心により分離し得る。
これらの細胞は、磁気ビーズ(Dynal Detachabeads)に結合したヒトＣＤ３４抗体
によりポジティブ選択が可能で、ＣＤ３４＋細胞は磁気ビーズから、ＣＤ３４モ
ノクローナル抗体に対する高アフィニティーポリクローナル抗体によって置換さ
れ得る。これらの細胞は、幹細胞因子、ＧＭ-ＣＳＦ及びＴＮＦ-αと共に培養す
ることによりＤＣに分化させることができる(Canque,B., M.Rosenzwajgら、「イ
ン・ヴィトロにおけるヒト免疫不全ウイルス感染により樹状細胞分化及び機能へ
の影響(The effect of in vitro human immunodeficiency virus infection on
dendritic-cell differentiation and function)」、Blood,第88巻,第11号,第42
15〜4228頁,1996年)。
【００５６】 単球由来ＤＣは、ＧＭ-ＣＳＦ及びＩＬ-４の存在下で、末梢血単核細胞から作
成した(Bender,A.,M.Sappら、「ヒト血液中の非増殖前駆体からの樹状細胞を作 る改良された方法(Improved methods for the generation of dendritic cells
from nonproliferating progenitors in human blood)」J.Immunol.Methods,第1
96巻,第2号,第121〜135頁,1996年）。4日目に、細胞をＨＩＶ-１／Ｌ Ｗｉｎｔ-
(米国特許出願08/803,484号に記載の、組込み及び複製欠損ＨＩＶ)をコードする
プラスミドＤＮＡと複合体形成したリポフェクタミンによりトランスフェクトし
た。リポフェクタミンは、トランスフェクション試薬として有用な、市販のカチ
オン性リポソームである(Gibco BRL Life Technology, PM. Gaithersburg, Md.,
USより入手可能)。48時間後、細胞を洗浄し分析した。表面マーカー(FACS)を測
定する蛍光標識細胞分取器(FACS)により特徴付けられたＤＣの純度は、90.6％で
あった。ＦＡＣＳ分析により決定されたＤＣの細胞型は、ＣＤ３-、ＣＤ１９-、
ＣＤ５６-、ＣＤ１４-及びＨＬＡ ＤＲ＋であった。透過された細胞における、 ＨＩＶ-１ Ｇａｇ、ＥＮＶ及びＴａｔタンパク質の発現も、ＦＡＣＳにより測定
した。同位体コントロールＩｇによる非特異的結合は、コントロールで形質導入
したものと、特異的プラスミドで形質導入したもので同じであった。我々は、3 つの無関係な実験によりＨＩＶ-１／Ｌ Ｗｉｎｔ-形質導入ＤＣが、Ｅｎｖ、Ｇ ａｇ及びＴａｔタンパク質を発現することを突きとめた。形質導入した試料の25
〜37％の細胞が、ＨＩＶタンパク質を発現していた。形質導入及びコントロール
細胞を、マクロファージではなくＤＣが抗原を発現していることを証明するため
に、ｐ２４及びＢ７-２抗体で、形質導入された細胞及びコントロール細胞試料 を二重染色した。これらの結果は驚くほど良好で、同じ手法で他のプラスミドＤ
ＮＡ(ＣＭＶに制御されるインフルエンザウイルス遺伝子のヘマグルチニン)を用
いたところ、トランスフェクトされた細胞の5〜8％のみがタンパク質を発現した
。これらの結果は、欠損ＨＩＶが形質導入ＤＣにより、効率的に発現されること
を示す。
【００５７】 ２．１または複数のタンパク質をコードするＤＮＡよりも複製欠損ウイルスをコ
ードするＤＮＡの方が、より効率的な抗原となる 独立した実験により、ＤＣでの2つの異なるＨＩＶプラスミド(ＨＩＶ-１／Ｌ
Ｗｉｎｔ-及びＬＴＲ-ｔａｔ)の発現を比較した。どちらの構築物も同じプロモ ータ(ＨＩＶ-１-ＬＴＲ)により制御され、どちらの構築物の発現もＴａｔのトラ
ンス活性化に依存する。実施例１に記載のようにトランスフェクションを行い、
48時間後に、Ｔａｔタンパク質の発現をＦＡＣＳにより分析した。ＨＩＶ-１／ Ｌ Ｗｉｎｔ-プラスミドによりトランスフェクトしたＤＣの32％が、Ｔａｔタン
パク質を発現していることを発見した。それに対して、ＬＴＲ-ｔａｔでトラン スフェクトしたＤＣの10％のみが、同じＴａｔタンパク質を発現していた。この
比較実験では、異なる構築物で同じくらいの効率を期待していたので、この結果
は意外であった。複製欠損ウイルスは、細胞から放出され得るウイルス粒子を形
成する能力を明らかに有する。抗原提示はＤＣでの遺伝子発現に依存するので、
この実験により、欠損ウイルスをコードするＤＮＡの方が、1または複数のタン パク質をコードするＤＮＡよりも、より効率的な抗原であることが示された。
【００５８】 ３．形質導入、培養されたＤＣによる、イン・ヴィトロ、ナイーブＣＴＬの活性
化 形質導入後、ＤＣを自己由来のＴ細胞と共に、1：10の比で培養した。7日後、
これらのＴ細胞を、使い勝手のよいラベルとして使用されるＨＩＶタンパク質、
ｐ５５で刺激した同じドナー由来の単球／マクロファージ細胞を溶解する(殺す)
エフェクターとして使用した。このＣＴＬ活性は、Ｃｒ-放出分析により測定し た。図５に示されるように、形質導入したＤＣにより誘導されたＣＴＬは、標的
細胞を特異的、そして、効果的に溶解した。イン・ヴィトロでＣＴＬを生じさせ
るのはイン・ビボの場合よりも難しいので、これらの実験により、遺伝的免疫感
作に付された細胞が、イン・ビボで効果的に感染細胞を溶解するようナイーブＣ
ＴＬを活性化し得ることが示された。さらに、これらの実験は欠損ウイルスをコ
ードするＤＮＡがＨＩＶ遺伝子を効率的に発現するだけでなく、効果的な免疫応
答を生じさせることを示す。
【００５９】 ４．形質導入されたＤＣによるエクス・ビボの遺伝的免疫感作 サルにおいて、遺伝的免疫感作のイン・ビボでの効力を証明するために、ブタ
オザルの末梢血40ｍｌから樹状細胞を産生した。細胞を、実施例５に記載のよう
にポリエチレンイミンを使用して、ＬＷ／ｉｎｔ-プラスミドでトランスフェク トした。トランスフェクトしたＤＣを洗浄し、トランスフェクション36〜48時間
後、若いブタオザルに注射した。トランスフェクトしたＤＣの一部は皮下に、一
部は静脈注射した。4週間後、たった1回の免疫感作によって、既に一匹のサルが
ＣＴＬ応答を示し(図６)、これにより、イン・ヴィトロの結果が、動物において
イン・ビボで再現できることが示唆された。対照的に、ヒト臨床試験のフェーズ
IIIで現在試験中のＨＩＶサブユニットワクチンは、複数回にわたる免疫感作試 験の後にも、どのようなＣＴＬ応答をも生じさせることが示されていない。
【００６０】 ５．培養樹状細胞中へのポリエチレンイミン媒介遺伝子導入 リポフェクタミンに代えてポリエチレンイミン(親切にもBehr博士より提供さ れたＰＥＩ)を用いた以外は実施例１のように、ＨＩＶ-１／ＬＷｉｎｔ-をコー ドするプラスミドで樹状細胞を形質導入した。細胞は実施例１と同様に試験し、
リポフェクタミンを使用して形質導入した細胞の25〜37％がＨＩＶタンパク質を
発現していたのに対し、ポリエチレンイミンを使用して形質導入した樹状細胞の
60％以上がＨＩＶタンパク質を発現していた。現在まで、ＤＣにプラスミドＤＮ
Ａを導入するのにリポフェクチンは最もよい遺伝子導入方法であったので、この
実験によりＤＣに遺伝子を導入するのにＰＥＩが、最も効率的な非ウイルス遺伝
子運搬システムであることが証明された。しかしながら、トリパンブルー染色に
よる測定の結果、ＰＥＩ及びリポフェクチンは樹状細胞に対して似たような毒性
を示した。
【００６１】 ６．マンノース受容体を介したＤＣの特異的標的化 未成熟ＤＣを上述の実施例１のように産生し、グリーン蛍光タンパク質(ＧＦ Ｐ)をコードするＤＮＡでトランスフェクトした。グリーン蛍光タンパク質を発 現する細胞は、蛍光刺激後、グリーンに光るので、このＤＮＡを遺伝子発現のマ
ーカーとして使用した。従って、トランスフェクトされた細胞は、蛍光顕微鏡及
びフローサイトメトリー(ＦＡＣＳ)により明視化できる。
【００６２】 マンノース受容体は、細菌、寄生体、酵母及びカビ上の糖の全パターンを認識
するので、いろいろな糖で修飾されたＰＥＩを樹状細胞の表面上のマンノース受
容体を標的化するために選んだ。ＤＮＡをＰＥＩ及び異なる糖と結合したポリエ
チレンイミン(顧客注文ベースで、Jean-Paul Behr博士(Laboratoire de Chimie
Genetique, Faculte de Pharmacie, CNRS-UMR 7514 74 route du Rhin 67401 Il
lkirch, France)より入手可能)と複合体形成させた。2μｇのＤＮＡを、室温で 、150ｍＭのＮａＣl中の異なるＰＥＩ誘導体(10：1 Ｎ：Ｐ比)と5分間インキュ ベートした。その後、6時間かけてＤＣを複合体で形質導入し、洗浄し、48時間 後にグリーンの蛍光を発する細胞を分析した。ＰＥＩ-マンノースが最も有効な ＰＥＩ-糖修飾であることを発見した(表１)。
【表１】 樹状細胞のイン・ヴィトロにおける形質導入のための種々の複合体
【００６３】 ７．培養樹状細胞中へのイン・ヴィトロにおけるＰＥＩ-マンノース媒介遺伝子 導入 マンノース結合ポリエチレンイミン(ＰＥＩ-ｍａｎ)は、25ｋＤａのＰＥＩに 結合したリガンド(または、マンノース受容体に対して低いアフィニティーのマ ンノース残基、１ｍＭ)を持つ、イソチオシアンアントフェニルフェニルマンノ ース誘導体である。アシアロ糖タンパク質受容体(ＰＥＩにより利用)を介して細
胞内に入るには、複合体は帯電している必要があることが、以前証明された。即
ち、ＤＮＡより多くのＰＥＩを使用する必要があるということである。複合体が
中和されると、即ち、ＰＥＩがＤＮＡにより中和されると、複合体はアシアロ糖
タンパク質受容体を介して細胞に入ることができない(Zanta M.A.;Boussif O.;A
dib A.;Behr J.P.,Bioconjug.Chem.,第8巻,第6号,第839〜844頁,1997年11月〜12
月)。これらの研究者らは、肝細胞用の複合体を開発し、これは、生体での肝臓 への遺伝子運搬に向くと思われるいくつかの特色を含んでいる；1)他の細胞への
非特異的結合を防止した静電気的に中性な粒子、及び、2)アシアロ糖タンパク質
受容体媒介エンドサイトーシスの防止。このシステムは、プラスミドＤＮＡと縮
合し、中性になっている5％のガラクトースを結合したポリエチレンイミン(ＰＥ
Ｉ-ｇａｌ)ポリマーに基づいている。
【００６４】 ＰＥＩ-ｍａｎ-ＤＮＡ複合体では、ＰＥＩに比べてより少ないＤＮＡがＰＥＩ
-ｍａｎを中和するのに必要とされることを発見した。異なるＮ：Ｐ比のＰＥＩ-
ＤＮＡ複合体を使用したゲル電気泳動実験により、３：１(Ｎ：Ｐ)のＰＥＩ-Ｄ ＮＡ複合体と比較して、５：１(Ｎ：Ｐ)のＰＥＩ-ｍａｎ-ＤＮＡ複合体が中性の
電荷を持つことが示された。（ＰＥＩのＤＮＡによる中和は、Ｎ(窒素)：Ｐ(リ ン酸)比に依存する；1μｇＤＮＡ＝3×109モル濃度Ｐ、及び、1ｍＭＰＥＩ＝109 モル濃度Ｎ／μｌ。これは、例えば10：1比は、3μｌの10ｍＭＰＥＩ、及び、1 μｇのＤＮＡの混合物であることを意味する。）
【００６５】 上述のようにヒトＤＣを単離した。ＦＡＣＳにより決定された、ＤＣの純度は
99％以上であった。トリパンブルー染色により細胞生育力を測定することにより
、ＰＥＩ-ｍａｎの方がＰＥＩよりも毒性が低いことを発見した。また、ＰＥＩ 及びＰＥＩ-ｍａｎの両方がＤＣにＤＮＡを導入できるが、ＰＥＩ-ｍａｎの方が
より効率的であることを発見した。5：1(Ｎ：Ｐ)比では、ＰＥＩ-ｍａｎ-ＤＮＡ
複合体は中性であり、そのために、この複合体はＤＣにマンノース受容体を介し
てのみ入ることができる。この条件下で、30％のＤＣがグリーン蛍光タンパク質
を発現していた。それと比べて、5：1(Ｎ：Ｐ)比のＰＥＩ-ＤＮＡ複合体は荷電 しており、アシアロ糖タンパク質受容体を介して取り込まれる。この条件下で、
14％のＤＣがグリーン蛍光タンパク質を発現する(図4)。
【００６６】 ８．皮膚ランゲルハンス細胞中へのイン・ビボでの遺伝子運搬 皮膚では、マンノシル化されたリガンドを細胞内に取り込むことができる唯一
の細胞は、ランゲルハンス細胞である。そのため、イン・ビボでＰＥＩ-(ｍａｎ
)複合体が、皮膚を通過し、ランゲルハンス細胞をトランスフェクトできるかど うかが主要な疑問であった。ＰＥＩ-(ｍａｎ)を、グリーン蛍光タンパク質(ＧＦ
Ｐ)をコードするプラスミドＤＮＡと複合体形成させた。図３に記載されるよう に、異なる遺伝子運搬複合体を用いて実験を行った。複合体は、50μｇのＤＮＡ
、及び、5〜10％グルコース溶液(至適＝8％)中の8.25μｌの100ｍＭＰＥＩ-ｍａ
ｎを含んでいた。ＢＡＬＢ／ｃマウスを麻酔し、マウスの背中を剃った。0.1ｍ ｌの複合体を表2に示されるように皮膚に1時間塗布、または、皮下注射した。マ
ウスを免疫感作6時間後に殺し、皮膚試料を10％のウシ胎児血清及び抗生物質を 補ったＤＭＥＭ溶媒中に入れた。これらの条件下で、ランゲルハンス細胞を含む
細胞は、皮膚から移動する。1日後、移動した細胞を集め、分析によりグリーン 蛍光タンパク質を発現する細胞を識別することができるので、フローサイトメト
リー(ＦＡＣＳ)を用いて分析した。樹状細胞及びランゲルハンス細胞は共に大き
く、密集する細胞群であることが知られているので、分析では大きく、密集した
細胞集団のみを分析した。
【表２】 皮膚ランゲルハンス細胞のイン・ビボ形質導入
【００６７】 これらの実験により、1)経皮的遺伝子運搬を用いた方が、皮下運搬を用いた場
合よりもランゲルハンス細胞中への効率的な遺伝子導入が行われる(実験2及び4 、または、3及び5を比較)。現在の最も優れた予防接種では皮下注射が使用され ているので、このことは重要である。2)アシアロ糖タンパク質受容体を介した取
り込みに比べて、マンノース受容体を介した取り込みの方が、イン・ビボでラン
ゲルハンス細胞に形質導入するのに効率的である(実験4及び6を比較)、これらの
、イン・ビボにおける実験により、本願のイン・ヴィトロにおける実験が確認さ
れる(図４参照)。よって、糖修飾された遺伝子運搬システムが抗原提示細胞に形
質導入するのに好ましい。
【００６８】 ９．形質導入されたランゲルハンス細胞のリンパ節への移動 実施例８のように、ＢＡＬＢ／ｃマウスを用意し、0.1ｍｌのＰＥＩ-ｍａｎ- ＤＮＡ複合体を1時間、皮膚に塗布した。2日後、動物を殺し、リンパ節(ＬＮ)を
取り除いた。背中の拡散性リンパ節であり、ランゲルハンス細胞が見つけられる
と考えられた補助リンパ節について研究を行った。ＬＮを凍結し、スライスし、
蛍光顕微鏡下で検査した。実験対象のマウスのＬＮを、コントロールのマウスの
ＬＮと比較した。実験対象のＬＮの試料から約15のグリーン蛍光細胞を見つける
ことができ、コントロールのものでは見つけられなった。これらの結果により、
皮膚に存在する細胞に複合体が入り、細胞はＬＮへと移動してグリーン蛍光タン
パク質を発現することができたことが示される。これらグリーンの細胞の形態は
ＤＣの形態に類似している(これらは大きな細胞であり、グリーン蛍光の局在は ＤＣの特徴である「デコボコ(bumpy)」なパターンを示す)(他の細胞、例えば２ ９３細胞では、細胞質中に散ったグリーンのパターンを示す）。さらに、ランゲ
ルハンス細胞は、抗原を取り込み、移動することができる唯一の細胞である。こ
れらの細胞は、複合体を取り込むためのマンノース受容体を持ち、活性化後、拡
散性ＬＮへと移動することが知られている皮膚にある唯一の細胞である。
【００６９】 これらの実験により、ＰＥＩ-(Ｍａｎ)-ＤＮＡ複合体が、皮膚中を浸透し、Ｄ
ＮＡをランゲルハンス細胞中へと運べることが示された。ランゲルハンス細胞は
活性化され、拡散性ＬＮへ移動し、ＬＮ中でＤＮＡ構築物によりコードされる遺
伝子を発現した。体内に注入された培養ＤＣがＬＮへ移動し、効果的な免疫応答
を誘導することが知られている。本発明は、ランゲルハンス細胞中への遺伝子導
入、または、リンパ器官における遺伝子発現に、ＤＣのイン・ヴィトロ分離が必
要でないことを示す。また、複製欠損ウイルスのＤＣでの発現が、イン・ヴィト
ロ、及び、イン・ビボにおいて、ＣＴＬ応答を効率的に誘導することを示した( 上述参照)。従って、複合体(ＰＥＩ-ｍａｎ-ＤＮＡ等)を用いた経皮的遺伝子運 搬をＤＮＡによりコードされるタンパク質に対する免疫応答を誘導するのに使用
できことが示された。
【００７０】 １０．皮膚ランゲルハンス細胞に形質導入するための糖-ＤＮＡ複合体 表２に記載の実験結果は、ＰＥＩ-ｍａｎ不在下で、糖-ＤＮＡ複合体がイン・
ビボでランゲルハンス細胞に形質導入できることを示す。ＰＥＩを含まない、糖
と複合体形成されたＤＮＡは、ＰＥＩと複合体形成されたＤＮＡよりも皮下及び
経皮的な方法のどちらにおける使用でも、より効率的である(表２、実験３及び ５参照)。これは、とても驚くべき結果である。これは、糖(例えばこれらの実験
では8％のグルコース)がＤＮＡと複合体形成でき、マンノース受容体を介してラ
ンゲルハンス細胞中へＤＮＡを運搬できることを示している。最も重要なことは
、イン・ビボにおけるランゲルハンス細胞中への遺伝子運搬で最も効率的であっ
たのは、糖と複合体形成したＤＮＡを経皮的に使用した場合であったことである
。
【００７１】 糖-ＤＮＡ複合体による免疫感作により、ランゲルハンス細胞が拡散性リンパ 節へ移動することが期待された。それは、マンノース受容体媒介性吸収という同
じ機構が、ランゲルハンス細胞中へ入る際に利用されているからである。現在使
用されている予防接種技術で、糖をアジュバンドとする利点は、より高いパーセ
ンテージのランゲルハンス細胞が、免疫応答を誘導するのに引き込まれ得る点に
ある。本発明の予防接種戦略でも、これにより効率が明らかに上げられることが
期待される。例えば、ＤＮＡ及びタンパク質抗原の皮下、皮内及び筋肉内注射に
、糖とワクチンと混合する。
【００７２】 １１．経皮的免疫感作の包含 注射針を必要としないので、この発明により免疫感作の手法を根本から変え得
る。記載された経皮的免疫感作は、とても簡単な手法であり、先進国及び発展途
上国の両方において、安価な予防接種の方法として使用し得る。
【００７３】 この方法体系の単純さ、及び、抗原提示細胞が効率的に形質導入されるという
事実により、免疫原タンパク質を生じ得るどのようなＤＮＡ配列でも使用するこ
とを可能にする。それにより、例えば、感染症及び癌のような最も広範囲にわた
る病気が、免疫感作の標的となり得る。
【００７４】 ＨＩＶ感染、肝炎、マラリア等の感染性の病気を根絶する唯一の方法は、単純
で安価な予防接種による方法である。
【００７５】 注射針を刺す必要のない予防接種は、特に小さな子供を持つ親により歓迎され
るだろう。
【００７６】 本発明の使用により、より安全なワクチンの開発が潜在的に見込まれる。古典
的なワクチンに対するネガティブな反応は、ワクチンの製造工程の副産物に対す
るアレルギー反応によるものであることが時にある。このような付加的な材料( 例えば、卵アルブミン)は排除され得る場合、同時にネガティブな反応の割合を 下げることができる。
【００７７】 本発明は、化学療法と組合せて、または、組合せずに病気を処置するための免
疫感作において使用し得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｆｃ受容体を発現する細胞中への抗体媒介遺伝子運搬を説明。
【図２】 樹状細胞及びランゲルハンス細胞中への、ＰＥＩ-ｍａｎ-ＤＮＡ
複合体を用いた、マンノース受容体を介した遺伝子運搬を説明。
【図３】 経皮的遺伝子運搬へのアプローチを説明。
【図４】 本発明の2つの異なる複合体を用いたヒトＤＣのイン・ヴィトロ トランスフェクションの効果の比較。
【図５】 ＣＴＬ分析。形質導入されたＤＣが、ナイーブＴ細胞から細胞障
害性Ｔ細胞を生じさせることができることを説明。インテグラーゼ-ＨＩＶプラ スミドでトランスフェクションされたＤＣの％細胞障害性をコントロールＤＣの
それと比較。
【図６】 エクス・ビボの遺伝的免疫感作により得られたＣＴＬ応答の説明
、トランスフェクションされたＤＣを用いて得られたイン・ビボのＣＴＬ応答と
の比較。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ジュリアナ・リスジーウィッツ アメリカ合衆国20814メリーランド州ベセ ズダ、イースト・ウエスト・ハイウェイ 4400番 (72)発明者 フランコ・ロリ アメリカ合衆国20814メリーランド州ベセ ズダ、イースト・ウエスト・ハイウェイ 4400番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA35 CA01 CA07 CA11 DA02 EA04 GA11 HA17 4C084 AA13 NA14 ZB332 ZC551 ZC552 4C085 AA03 BA65 BA69 CC02 CC08 DD62 EE01 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 MA56 MA63 ZB33 ZC55

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 外来遺伝子材料、及び、該外来遺伝子材料に対し特異的アフ
    ィニティーを有する第1部位と、抗原提示細胞上の受容体に対し特異的アフィニ ティーを有する第2部位とを持つ非ウイルスベクターを含む遺伝子運搬複合体。
  2. 【請求項２】 外来遺伝子材料が、ＲＮＡ及びＤＮＡからなる群より選択さ
    れる、請求項１に記載の遺伝子運搬複合体。
  3. 【請求項３】 外来遺伝子材料が、逆転写酵素依存ウイルスまたは逆転写酵
    素依存ウイルス変異体をコードする、請求項１に記載の遺伝子運搬複合体。
  4. 【請求項４】 外来遺伝子材料が、少なくとも複製欠損ヒト免疫不全ウイル
    スの実質的な一部分をコードするＤＮＡである、請求項３に記載の遺伝子運搬複
    合体。
  5. 【請求項５】 外来遺伝子材料が、少なくとも組込み欠損ヒト免疫不全ウイ
    ルスの実質的な一部分をコードするＤＮＡである、請求項３または４に記載の遺
    伝子運搬複合体。
  6. 【請求項６】 外来遺伝子材料が、少なくともヒト免疫不全ウイルスの二親
    和性初代純粋培養物のインテグラーゼ欠損変異体の実質的な一部分をコードする
    ＤＮＡである、請求項５に記載の遺伝子運搬複合体。
  7. 【請求項７】 ＤＮＡがさらに、インテグラーゼ遺伝子の1または複数のリ ーディングフレーム中に、1若しくは複数のストップコドンを有する、請求項６ に記載の遺伝子運搬複合体。
  8. 【請求項８】 複合体が、糖、ポリエチレンイミン、ポリエチレンイミン誘
    導体、及び、それらの混合物のＤＮＡ抱合体からなる群より選択される、請求項
    １に記載の遺伝子運搬複合体。
  9. 【請求項９】 複合体が糖修飾ポリエチレンイミンのＤＮＡ抱合体である、
    請求項８に記載の遺伝子運搬複合体。
  10. 【請求項１０】 複合体がグルコースのＤＮＡ抱合体である、請求項８に記
    載の遺伝子運搬複合体。
  11. 【請求項１１】 複合体が、マンノース受容体に対して特異的アフィニティ
    ーを有する、請求項８に記載の遺伝子運搬複合体。
  12. 【請求項１２】 抗原提示細胞がランゲルハンス細胞である、請求項１に記
    載の遺伝子運搬複合体。
  13. 【請求項１３】 抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項１に記載の遺伝子
    運搬複合体。
  14. 【請求項１４】 受容体がマンノース受容体である、請求項１に記載の遺伝
    子運搬複合体。
  15. 【請求項１５】 細胞に外来遺伝子材料を形質導入する方法であって、請求
    項１〜１０のいずれか1項に記載の遺伝子運搬複合体に、細胞を曝す工程を含む 方法。
  16. 【請求項１６】 遺伝子運搬複合体を製造する方法であって、 (a)受容体部位を有する標的細胞を選択する工程、 (b)請求項１〜１０のいずれか１項に記載されるような運搬複合 体 を選択する工程、 (c)受容体媒介エンドサイトーシスに適した条件下で細胞を遺伝 子 運搬複合体に曝す工程、 を含む方法。
  17. 【請求項１７】 動物の予防的及び治療的免疫感作方法であって、動物を請
    求項１〜１０のいずれか1項に記載の遺伝子運搬複合体に曝す方法。
  18. 【請求項１８】 逆転者酵素依存ウイルス感染に対する動物の予防的及び治
    療的免疫感作方法であって、 動物から樹状細胞を単離する工程、 請求項１７に記載の遺伝子運搬複合体に細胞を曝す工程、及び、 細胞を動物の体に再導入する工程 を含む方法。
  19. 【請求項１９】 逆転者酵素依存ウイルス感染に対する動物の予防的及び治
    療的免疫化方法であって、皮膚または粘膜表面の部分で、請求項１７に記載の遺
    伝子運搬複合体に動物を曝す工程を含む方法。
  20. 【請求項２０】 活動性のウイルス感染を処置する方法であって、 処置を必要とする患者を、ウイルス負荷を抑制するのに適した 薬剤の組合せで処置する工程、 患者を請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子運搬複合 体で免疫感作する工程、 免疫応答が発達するまでウイルス負荷を抑制するのに適した薬 剤の組合せによる処置を続ける工程、 患者におけるウイルス負荷のリバウンドを観測し、ウイルス負 荷がリバウンドした場合には該薬剤の組合せ、または、ウイルス 負荷を抑制するのに適した別の薬剤の組合せによる処置を再度始 め、患者を請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子運搬複 合体で免疫感作する工程 を含む方法。
  21. 【請求項２１】 活性なウイルス感染がＨＩＶ感染である、請求項２０に記
    載の方法。
  22. 【請求項２２】 経皮的な遺伝的免疫感作方法であって、外来遺伝子材料を
    糖、ポリエチレンイミン、ポリエチレンイミン誘導体及びそれらの混合物からな
    る群より選択される非ウイルスベクターと複合体形成させる工程、並びに、複合
    体を動物の皮膚または粘膜表面に適用する工程を含む方法。
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