JP4339598B2 - 毒素サブユニットまたはそのフラグメントと共に、又はこれとコンジュゲートされたアレルゲンの経皮投与によるアレルギー反応の抑制 - Google Patents

Description

本出願は２００１年５月２３日に出願された出願番号６０／２９３，１４２による優先権を３５ＵＳＣ§１１９（ｅ）の下に主張する。
本発明はコレラ毒素の粘膜性結合サブユニットまたはそのフラグメントと共に、またはそれと連結して投与される特異的アレルゲンの経皮投与による哺乳類におけるＩ型過敏性反応の抑制のための経皮投与用治療薬に関する。

アレルギー
アレルギーは全世界の個体の多数が経験している不快症状である。アレルギー応答を誘発する物質（以下「アレルゲン」と記載する）に対して個体を非感受性化するためにアレルゲンの一定量を注射するという試みは、今日まで全てのアレルギー個体において再現性良くアレルギー症状を完全に緩解することに成功していない。アレルギー応答は技術用語であり明確な意味をもつ。本発明の観点において、アレルギー性またはレアギン性の応答には、特に、以下の特徴、すなわち１）個体血清中のＩｇＥの異常に高い濃度の生産、２）ヒスタミンの放出をもたらすアレルゲン、個体のＩｇＥおよび白血球の間の免疫学的相互作用、３）過敏症による蕁麻疹、発赤、虫指されおよび紅潮および類似の皮膚科学的症状の形成、および、４）アナフィラキシー、のうちの少なくとも１つを含む。

アレルギー応答は過剰な免疫応答が特定の抗原またはアレルゲンへの曝露により誘導される過敏症の１つの状態である。過敏性反応は即時型または遅延型に分類される。即時型またはＩ型の過敏症（またはアナフィラキシー応答）は、極めて急速に、即ち、原因アレルゲンへの患者の曝露の数秒間または数分間内に発症するアレルギー反応の形態であり、Ｂリンパ球により生産されるＩｇＥ抗体により媒介される。非アレルギー患者においては、臨床的に問題になるようなＩｇＥ抗体は存在しないが、アレルギー性疾患に罹患している人間においては、ＩｇＥ抗体は皮膚、リンパ様臓器、眼、鼻及び口の膜、および呼吸系および腸に遍在する肥満細胞を感作することにより即時型の過敏症を媒介する。

活性化されたＢ細胞から分泌されたＩｇＥは、化学的媒介物質、例えばヒスタミンの充填された多くの原形質顆粒を含む肥満細胞および好塩基性の顆粒球の表面上に位置するＦｃ受容体に結合することができる（非特許文献１及び２を参照）。この受容体は極めて高い親和性で循環系のＩｇＥと結合し、これを長時間に渡り肥満細胞表面に保持する。活性化はＦｃ受容体結合ＩｇＥの１種以上の多価の分子にアレルゲンが同時に結合することにより達成される。この少なくとも２個の表面結合ＩｇＥ分子の「交叉結合」によりＦｃ受容体蛋白は肥満細胞の原型質膜の面内において相互に緊密に会合することになる。

結合したＩｇＥが適切なアレルゲンと接触すると、肥満細胞は活性化される。この受容体と会合しているキナーゼはこの近接化の結果として活性化され、第２のメッセンジャーカスケードを開始し、これにより、細胞表面の膜との顆粒の融合が起こり、顆粒の内容物、例えばヒスタミン、サイトカインおよびロイコトリエンの周囲組織へのエキソサイトーシスが起こり、同時にアレルギー症状が誘導される。気道または腸の平滑筋の収縮、小血管の拡張およびその水や血漿中蛋白に対する透過性の上昇、濃厚で粘着性の粘液の分離、および、皮膚においては、発赤、浮腫および掻痒感野党痛をもたらす神経末端の刺激のような、時型過敏症の典型的な臨床症状の原因は上記物質の活性である。

遅延型の過敏性（ＤＴＨ）反応は、Ｔ細胞およびマクロファージにより媒介され、１〜２日後に顕在化し、数日間〜数週間持続する。ＤＴＨは細胞媒介性過敏症（即ちＴ細胞媒介性）とも称され、細胞媒介免疫と称される反応のより大きい群の部分である。

アナフィラキシーまたはアナフィラキシー性ショックとは急性の全身性（身体全体）の型のアレルギー反応である。これは人間が特定の物質またはアレルゲンにより感作された場合（即ち、そのアレルゲンを身体に対して危険なものと認識するように免疫系が異常にトリガーされている）に起こる。その物質への２回目以降の曝露により、アレルギー反応が起こる。この反応は突然で重度のものであり、全身に関るものである。アナフィラキシーは生命を脅かすものであり、如何なる時点でも起こり得る。

治療上は、肥満細胞および好塩基球からの媒介物質の放出を防止し、そして／または、標的組織に対する媒介物質の作用をブロックまたは低減することにより下流の事象に対処するために多くの物質が使用されている。治療薬は一般的に以下の主要な群に分類される。
１）抗ヒスタミンは放出されたヒスタミン、即ちアレルギー応答の主要な媒介物質をブロックして除去する。
２）β１β２アゴニスト例えばエピネフリン、サルブタモールは血管および平滑筋に対する下流の作用を間接的に克服する。
３）クロモグリケートは肥満細胞／好塩基球の脱顆粒化の一次的防止に有用である。この予防法は持続的に行なわなければならない。ＩｇＥの交叉結合は防止しないが、その後の事象を何らかの態様で妨害する。
４）テオフィリンおよび他のホスホジエステラーゼ阻害剤もまた環状ヌクレオチドに関っている下流の生化学的事象に影響する。
５）ステロイドはアレルギー応答に対して複数の活性部位を有している。局所的および／または全身的に投与される。

上記治療法の何れも、眠気を含む副作用のような固有の問題点を有しており、免疫系における特異性も欠いているため全身性の免疫抑制性をもたらすことから、アレルギー応答のモジュレーションのためには理想的なものではない。更にまた、これらの治療薬の多くが持続的に投与される必要がある。従って、上記制限事項を伴わないでアレルギー応答を予防的および／または治療的に抑制するための新しい進歩した治療法が常時探求されている。
アレルゲンに対して脱感作することを望む個体は、まず毎週または１週おきに所定量のアレルゲンの注射を受け、その後、年間を通じて隔月〜毎月に漸減することが必要である場合が多い。このような注射は一般的に少量のアレルゲンで開始し、その後、最大寛容維持用量に達するまで漸増される。次に個体は長期間、または、アレルゲンへのアレルギー反応が生じなくなるまで、維持用量を継続する。
他の治療方法はアレルギー応答を低減または排除するために考案されている。アレルゲン注射療法（皮下免疫療法（ＳＣＩＴ）としても知られているアレルゲン免疫療法は）はアレルギー性鼻炎の重症度を低減することがわかっている。この治療は異なる形態の抗体、即ち「ブロッキング抗体」とも称される保護性抗体の生成を利用する（非特許文献３を参照。）。ＩｇＥとその受容体との間の相互作用を抑制する薬品が開発されている（特許文献１（Cheng等）及び特許文献２（Ra等）を参照）。ＩｇＥ拮抗剤もまたアレルギー疾患を治療するために使用されており（特許文献３(Presta等)を参照）、免疫抑制活性を示し、ヒスタミン放出を抑制する化合物も知られている（特許文献４(Bycroft等)を参照）。

エスティー、レミ（Ｓｔ．Ｒｅｍｙ）等は特定のアレルゲンおよびそのアレルゲンに対する相当する抗体の組み合わせを利用したアレルギーの治療のためのアレルゲンの免疫複合体を開示している（特許文献５を参照）。複合体の患者への注射はその特異的抗原に対する患者のアレルギー応答を低減するとされている。他の文献によれば、特定のヒト蛋白はＩｇＥの肥満細胞との相互作用をブロックすることによりこれを中和することができるとされているが、これは臨床的に有効な治療法としては明確に確立されていない（非特許文献４を参照）。パターソン(Patterson)等はアレルギー患者におけるアレルゲンに対するＩｇＥ抗体を低減するための方法および製剤を開示しており、その際、物質Ｐ（ニューロペプチド）およびアレルゲンまたはアレルゲンのフラグメントまたはアレルゲンとして作用するハプテンを共にアレルギー患者に非経口投与している（特許文献６を参照）。

アジュバントとしてのコレラ毒素およびＢサブユニット
コレラ毒素（ＣＴ）および緊密に関連する大腸菌(Escherichia coli)の熱不安定性毒素（ＬＴ）は種々の粘膜経路で抗原と同時投与された場合に例外的に強力な免疫アジュバントとなることが知られている（非特許文献５、６及び７を参照）。ＣＴおよびＬＴは共に、それらが２種の異なる構造的および機能的成分、即ち単一の毒性活性Ａサブユニット成分およびＧＭ１ガングリオシド受容体に対して強力な結合親和性を有する非毒性細胞結合Ｂサブユニットホモ５量体成分よりなるという点において、「ＡＢ」毒素として認識されている（非特許文献８を参照）。このような受容体は大部分の哺乳類細胞、例えば、皮膚および他の上皮細胞上、全ての知られた抗原提示細胞、例えば樹状細胞（ＤＣ）およびランゲルハンス細胞（ＬＣ）並びにＢおよびＴリンパ球上に存在することが知られている。

最近、グレン(Glenn)等は動物またはヒトにおいて免疫応答を誘導する経皮免疫化のための系（例えば体液性および／または細胞性のエフェクター）を開示している（特許文献７を参照）。系は抗原および全コレラ毒素（ＣＴ）またはＬＴであるアジュバントより成る製剤をげっ歯類およびヒトの未損傷の皮膚に単純に適用し、これにより同時投与された抗原および毒素の双方に対する特異的抗体媒介免疫応答を誘導するものである（非特許文献９、１０及び１１を参照）。この体液性免疫応答は他の適用経路によるＣＴの使用に起因する全身毒性を起こすことなく発生されている。チャールトン−ケルステン(Scharton-Kersten)等はジフテリア毒素に対する体液性応答を発生させるためにアジュバントとしてＣＴまたはＬＴを用いた経皮免疫化を開示している（非特許文献１２を参照）。

コリンズ(Collins)等はアレルゲンを含有するリポソームを含むアレルゲンに対するヒトおよび／または動物の脱感作のための薬剤を開示している（特許文献８を参照）。ルーセル−ジョンズ(Russell-Jones)等は担体分子（エンテロトキシン性 E.coli（ＥＴＥＣ）の熱不安定性毒素またはＥＴＥＣの熱不安定性毒素の結合サブユニット）に連結した免疫原の粘膜提示を開示しており（特許文献９を参照）、これは脊椎動物の宿主の粘膜上皮との特異的に相互作用することが可能であり、そして脊椎動物宿主において細胞および／または粘膜の免疫応答を起越す。これらの所見が重要である点は、それらが、このようなアジュバント付加経皮免疫化（ＴＣＩ）が効率的な針を用いないワクチンデリバリーのための有用な方法であり、注射針の再使用や安全でない廃棄の現状に関る健康上の有害性を鑑みれば、全世界的に優先度が高いという点である。

プロトタイプの蛋白抗原（破傷風トキソイド）をＣＴまたはＬＴと共に皮膚表面に適用するとＴｈ１／Ｔｈ２混合型の表現型ではあるが、明確にＴｈ２に偏った特徴を有する全身性の抗原特異的増殖Ｔ細胞応答が誘導された（非特許文献１３を参照）。しかしながら、このＴｈ２型サイトカインパターンへの偏りはＴＣＩの広範な使用に関る重大な問題を呈するものであり、その理由は、過去の試験により、Ｔｈ２応答に好都合な種々のワクチンデリバリー方法は全てＩｇＥサブクラスのレアギン性の免疫グロブリンの高濃度の生成の誘導、および、アトピー性皮膚炎の発症をもたらしているためである（非特許文献１４及び１５を参照）。

そのホロトキシン対部分（ＣＴおよびＬＴ）とは対照的に、より毒性の低いＢサブユニット（ＣＴＢおよびＬＴＢ）は、これらの蛋白に物理的に連結された種々の抗原に関して、粘膜抗体応答の誘導のため（非特許文献１６、１７、１８及び１９を参照）、並びに粘膜誘導された全身性Ｔ細胞（非特許文献２０を参照）、およびＢ細胞の経口寛容性（非特許文献２１、２２、及び２３を参照）の誘導のための極めて効率的な担体分子である。しかしながら、ＣＴＢおよびＬＴＢは、未結合の同時投与抗原のための免疫アジュバントとしては非効率的（経口免疫化）であるか、または最良でも部分的（経鼻免疫化）にしか効率的ではない（非特許文献２４及び２５を参照）。更にまた粘膜免疫化のためのＣＴＢ（またはＬＴＢ）への抗原のカップリングは、コンジュゲートされた抗原に対する粘膜ＩｇＡの免疫応答は促進するものの、ＣＴホロトキシンを用いた場合に観察されるコンジュゲート抗原への全身寛容性を排除することとは反対に全身寛容性の誘導を強く増強する（非特許文献２６を参照）。

本発明者等は以前に、コレラ毒素（ＣＴ）のＢサブユニットにカップリングさせた粒子状または固体の抗原の少量を単回経口投与するとナイーブおよび全身免疫の動物において全身免疫応答が顕著に抑制されることを発見した。粘膜結合分子にコンジュゲートした抗原の少量の経口投与に基づくこの免疫誘導方法は望ましくない免疫応答を予防ないしは排除するために有用である（非特許文献２７を参照）。

２００１年５月１４日に国出願６０／２９０，７３２号として、そして２００２年５月１４日にＰＣＴ／ＩＢ０２／０１６３８号として出願された「コレラ毒素およびそのＢサブユニットを用いた抗原提示を促進し免疫応答をモジュレートするための方法」と題される同時係争中の出願は、参照により本明細書に組み込まれるが、そこにおいて本発明者等は、エクスビボの種々の抗原提示細胞（ＡＰＣ）の機能を介した抗原提示の促進および免疫応答の増強のための担体分子およびアジュバントとしてのＣＴおよびそのＢサブユニットＣＴＢの使用に関する結果を記載している。ＣＴＢは、同系マウスにパルスＡＰＣをワクチン接種し、その後蛋白またはペプチドによりブーストすることにより観察されるとおり、樹上細胞および他のＡＰＣのエクスビボ抗原パルシングのための効率的な担体分子であり、Ｔｈ２応答を強力に促進することがわかっている。アジュバントとしてのＣＴの樹状細胞への投与はまたその免疫刺激能力を顕著に増強したが、Ｔｈ１応答の傾向ももたらした。

結論として、ＣＴＢおよび／またはＬＴＢのような粘膜結合分子への抗原のコンジュゲートはその粘膜免疫原性を劇的に増強することができ、そしてこの方法は粘膜ワクチンの調製において有用であることが解かった（非特許文献２８を参照）。
米国特許５，９６５，６０５号公報 米国特許６，０９０，９３４号公報 米国特許５，９６５，７０９号公報 米国特許５，９６９，１５８号公報 米国特許４，７４０，３７１号公報 米国特許５，３１４，６９０号公報 米国特許５，９８０，８９８号公報 米国特許５，０１３，５５５号公報 米国特許６，１０３，２４３号公報 J.Klein, "Immunology", Blackwell Sci. Pub., London, 1990 E.Benjamini & S.Leskowitz, "Immunology", Wiley-Liss, N.Y. 1991 Cooke, RA et al., Serologic Evidence of Immunity with Coexisting Sensitization in a Type of Human Allergy, Exp.Med.1935;62:733 Stanworth et al., Allergy Treatment with a Peptide Vaccine, Lancet 1990;336:1279-81 Elson et al., J.Immunol.1984;133:2892-2897 Holmgren et al., Vaccine 1973;11:1179-1184 Lycke et al., Eur.J.Immunol.1992;22:2277-2281 Holmgren et al., Nature 1981;292:413-417 Glenn et al., Nature 1998; 391:85 Glenn et al., lmmun. 1999; 67:1100-1106 Glenn et al., Nature Med. 1000;6:1403-1406 Infection and Immunity 2000; 68:5306-5313 Hammond et al., Vaccine. 2001; 19:2701-2707 Spergel et al., J.Clin.Invest.1988;101:1614-1622 Wang et al., J.Immunol. 1986;156:4079-4082 Czerkinsky et al., Infect Immun. 1989;57:1072-7 Holmgren et al., Walter de Gruyter, Berlin, New York 1996 Lipscombe et al., Mol.Microbiol. 1991; 5:1385-1392 McKenzic et al., Immunol. 1984; 133:1818-1824 Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994;91:10795-10799 Rask et al.,Clin. Exp. Allergy 2000;30:1024-1032 Tamura et al.,Vaccine 1997;15:225-229 Wiedermann et al.,Int.Immunol.1999;11:1717-1724 Czerkinsky et al., Immunol. Rev. 170:197-222 Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994;91:10795-10799 Elson et al., J.Immunol. 1984;133:2892-2897 Sun JB, Holmgren J, and Czerkinsky C. et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994;91(23):10795-9 Rask C, Fredriksson M, Lindblad M, Czerkinsky C and Holmgren J., APMIS, 108(3):178-86, 2000

発明の概要
本発明はアレルギー反応を抑制するために有効な量の非ＡＤＰリボシル化毒素または毒素サブユニットと連係させてアレルゲンを経皮投与することによる、哺乳類におけるＩｇＥ媒介アレルギー反応を抑制するための方法を提供する。
１つの実施態様において、アレルゲンは非ＡＤＰリボシル化毒素または毒素サブユニットと混合される。
別の実施態様において、アレルゲンは非ＡＤＰリボシル化毒素または毒素サブユニットと化学的にコンジュゲートされる。
更に別の実施態様において、アレルゲンは非ＡＤＰリボシル化毒素または毒素サブユニットと遺伝子的に融合される。
別の実施態様において、アレルゲンと非ＡＤＰリボシル化毒素または毒素サブユニットは局所または経皮投与に適する製剤中に含まれる。
更に別の実施態様において、アレルゲンとＡおよびＢサブユニットを含むホロトキシンはアルデヒドとともに製剤中に含まれる。

本発明の上記特徴およびその他の特徴は、本発明の明細書、請求項、および図面を参照することにより当業者が容易に理解できるものである。
本明細書中に引用した全ての特許出願、特許および参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

添付図面の説明
図１（ＡおよびＢ）。ＣＴまたはＣＴＢと共にＯＶＡで経皮免疫化した後の血清抗体応答。１５匹のマウスの群にそれぞれ卵白アルブミン（３００μｇ）を単独でまたはＣＴ（○）またはＣＴＢ（□）５０μｇと同時に、第１、１４および２１日に三回局所投与した。別のマウス群には分析の３週間前にアルミニウム吸着ＯＶＡ（陽性対照）１００μｇを腹腔内注射した。抗−ＣＴＢ（Ａ）および抗−ＯＶＡ（Ｂ）ＩｇＧは、ＥＬＩＳＡ試験により皮膚表面免疫化の初回および２回目の２週間後（Ａ）および最終回の３週間後に血清中で検出した。データはＩｇＧの幾何平均の力価＋１標準偏差として表示し、対数スケール上に表示する。＊はｐ＜０．０５におけるＷｉｌｃｏｘｏｎの順位検定により計算した比較群間の有意差を示す。

図２（ＡおよびＢ）。ＣＴまたはＣＴＢの存在下のＯＶＡの皮膚表面免疫化の後の部分的（連絡リンパ節）および全身（脾臓）の増殖応答である。マウスの群にそれぞれ卵白アルブミン（３００μｇ）を単独（対照）またはＣＴまたはＣＴＢのいずれか５０μｇ同時に、またはＣＴＢ−ＯＶＡコンジュゲート（３００μｇ）を、第１、１４および２１日に三回局所投与した。１つのマウス群には分析の３週間前に陽性対照として完全フロイントアジュバント中ＯＶＡ１００μｇを皮下注射した。ＯＶＡ誘発局所（Ａ）および全身（Ｂ）増殖応答は２ｍｇ／ｍｌＯＶＡで連絡リンパ節および脾細胞をインビトロ刺激することにより、最終皮膚表面投与後４週間測定した。データはマウス１５個体の群で求めた算術平均（±ＳＤ）で示す。

図３。ＣＴおよびＣＴＢは、ＣＴまたはＣＴＢの存在下に卵白アルブミンを皮膚表面免疫化した後、連絡リンパ節細胞および脾細胞によるＴｈ１およびＴｈ２サイトカイン生産に対し、異なる様式で影響した。図２に示すとおりＣＴ（斜線棒グラフ）またはＣＴＢ（無地棒グラフ）のいずれかと共に同時投与したＯＶＡで皮膚表面免疫化されたマウス由来の連絡リンパ節または脾細胞の培養をＯＶＡ存在下（２ｍｇ／ｍｌ）で行なった。培養上澄み中のサイトカイン生産は、サンドイッチＥＬＩＺＡ方により２４時間後（ＩＬ−２）および４８時間後（ＩＦＮ−γ、アミのＩＬ−４およびＩＬ−５）に測定した。結果は３回の独立した実験の代表を示す。

図４。ＣＴＢ存在下のＯＶＡの予備皮膚表面投与による全身ＩｇＥ応答の予防。８匹のマウスの群にそれぞれのマウス６個所に卵白アルブミン（ＯＶＡ）（３００μｇ）を単独またはＣＴ５０μｇまたはＣＴＢ５０μｇと同時に、２日おきに２週間局所投与し、その３週間後にアルミニウム吸着ＯＶＡ１００μｇを腹腔内注射することにより惹起した。感作後３週間に血清を採取し、材料および方法において記載するとおり受動皮膚アナフィラキシー力価（ＰＣＡ）により分析した。結果は独立した２つの実験の代表である。

図５（Ａ−Ｃ）。皮膚表面ＣＴまたはＣＴＢ投与により表皮シート中のＬＣ数が増大した。３匹のマウスの群にそれぞれ皮膚適用により１時間のあいだ０．１％ツイーン２０を含有するＰＢＳに溶解したＣＴまたはＣＴＢ２０μｇを投与した。（Ａ）耳介を皮膚表面投与後９０分に採取し、材料および方法に記載するとおり表皮シートを調製した。ＭＣＨＩＩ＋ＬＣの分析は、先ずマウスＩＡ−ＩＥ分子に特異的なビオチンにコンジュゲートしたラットモノクローナル抗体Ｄ９を用いて免疫組織化学的染色を行ない、その後、ストレプトアビジンペルオキシダーゼおよび基質としてのＡＥＣを用いた酵素的手法により行ない、ＭＨＣＩＩ＋ＬＣを計数した。結果は試料当たり１０視野を計数して得た個数／ｍｍ２の平均数として表示する。（Ｂ）３６時間前に４５分間のＵＶ−Ｃ照射を受けたマウスに対して行なった皮膚表面投与の後９０分に耳を採取し、材料および方法に記載するとおり表皮細胞懸濁液を調製した。機械的抽出により得られた細胞懸濁液をＦＩＴＣコンジュゲート抗−ＣＤ１１ｃ、ＰＥコンジュゲート抗−ＭＨＣＩＩで二重染色した後に分析した。ＣＴおよびＣＴＢ投与マウスの表皮懸濁液中のＬＣ出現頻度を対照マウスと比較し、１００％を非照射対照マウスにおけるＬＣ数とした％で表示した。（Ｃ）対照、ＣＴ−またはＣＴＢ投与マウスの耳の横断方向パラフィン包埋切片（１０ｍｍ）を皮膚表面投与後種々の時点（４０分、１８０分）で調製し、上記したとおり免疫組織化学的染色を行なうことによりＭＣＨＩＩ＋細胞を同定した。切片はエオシンヘマトキシリンにより逆染色した。

図６。ＣＴの皮膚表面投与は表皮樹状細胞に対する同時刺激分子Ｂ７−１およびＢ７−２のアップレギュレーションを誘導するがＣＴＢは誘導しない。マウスにＣＴ（２０μｇ）（水平線棒グラフ）、組み換えＣＴＢ（２０μｇ）（斜線棒グラフ）またはＰＢＳ（対照）（黒色棒グラフ）を投与し、材料および方法に記載するとおり皮膚表面投与後９０分（Ａ）または２４時間（Ｂ）に表皮シートを調製した。機械的抽出により得られた細胞懸濁液をＦＩＴＣコンジュゲート抗−ＣＤ１１ｃ、ＰＥコンジュゲート抗−ＭＨＣＩＩおよびＢ７−１、Ｂ７−２およびＣＤ４０分子に対するビオチンコンジュゲート抗体で３重染色し、その後、ストレプトアビジントリカラーに付した後に分析した。結果は各マーカーに関する平均の蛍光としてＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋ＬＣについて表示し、３回の独立した実験の代表とした。
図７。皮膚表面のＣＴおよびＣＴＢの投与はＤＬＮＤＣによるナイーブのＴ細胞の抗原特異的増殖を強化した。材料および方法に記載したとおり、調製の２４時間前に、耳介、鼡径部および腋窩の連絡リンパ節由来のＤＣをＣＴ（水平線棒グラフ）、ＣＴＢ（斜線棒グラフ）またはＰＢＳ（黒色棒グラフ）を皮膚表面適用することにより投与した動物から精製した。（Ａ）リンパ節由来の精製されたトランスジェニックＴＣＲ−ＨＡ Ｔ細胞を７２時間ＨＡペプチド（ａａ１１０−１１９）（５ｍＭ）の存在下または非存在下にＣＴ−、ＣＴＢ投与または対照マウスのいずれかより単離した１０^４個のＤＣと共にＴ細胞２ｘ１０^５個／ウェルの濃度で平底９６穴プレート中でインビトロ培養し、培養の最後１８時間は［^３Ｈ］チミジン１ｍＣｉでパルスした。データは３連で分析した試料のｃｐｍの平均（±ＳＤ）として表した。これらの結果は３回の独立した実験の代表であり、同様の結果であった。

図８（Ａ−Ｃ）。ＣＴおよびＣＴＢの皮膚方面投与は連絡リンパ樹状細胞上のＢ７−１、Ｂ７−２およびＣＤ４０の同時刺激分子の発現に対し異なる影響を与えた。材料および方法に記載したとおり、調製の２４時間前に、耳介、鼡径部および腋窩の連絡リンパ節由来のＤＣをＣＴ（水平線棒グラフ）、ＣＴＢ（斜線棒グラフ）またはＰＢＳ（黒色棒グラフ）を皮膚表面適用することにより投与した動物から精製した。ＤＣはＦＩＴＣコンジュゲート抗−ＣＤ１１ｃ、ＰＥコンジュゲート抗−ＣＤ８ａおよびビオチンコンジュゲートマーカー（抗−Ｂ７−１、抗−Ｂ７−２および抗−ＣＤ４０モノクローナル抗体）を用いて３重染色し、その後、ストレプトアビジントリカラーに付した後にサイトメトリー分析した。ＤＣサブセットのＢ７−１、Ｂ７−２およびＣＤ４０の発現は、対照のＣＴまたはＣＴＢ皮膚投与マウス由来のゲート化された（ｇａｔｅｄ）ＣＤ８＋（Ａ）、ＣＤ８ｉｎｔ（Ｂ）またはＣＤ８−（Ｃ）のＤＣに相当する種々の耳介ＤＣサブセットの平均蛍光を示す棒グラフとした。顕著な特徴は、ＣＴ投与マウス由来の全ＤＣサブセットによるＢ７−２の一貫して増大した発現である。

今回、意外にも抗原と混合した、または、これと化学的または遺伝子的にコンジュゲートされたＣＴＢの経皮投与により樹立されたＩｇＥ媒介アレルギー反応が抑制できることが解かった。このことは、ネイティブのＣＴホロトキシンを同抗原とともに経皮投与することは、原型がＩｇＥであるＴｈ２応答に対する顕著な偏向を有するＴ細胞の応答をこのような方法が誘導することを示したＧｌｅｎｎ等の報告から予測されるとおり、該抗原に対する強力なＩｇＥ応答が誘導されたという事実に鑑みると、きわめて意外である。ＩｇＥに対するＣＴＢの予測されなかった抑制作用には、Ｔｈ１型のＴ細胞媒介免疫応答の誘導および皮膚ＤＣの集中および表皮ランゲルハンス細胞（ＬＣ）数の増大が伴っていた。

多くの系におけるＣＴおよびＣＴＢの免疫モジュレート作用が顕著に異なっていたり、場合により逆であったりすることに基づき、同時投与されたプロトタイプの抗原、ＴＣＩにおける卵白アルブミン（ＯＶＡ）に対する免疫応答に対するＣＴおよびＣＴＢの作用を本出願において比較した。ＣＴＢは皮膚に局所投与された場合に自身に対するかなりの抗体応答を誘発できるが、同時投与されたＯＶＡ抗原への全身抗体応答の誘導に関しては比較的非効率的である。一方、ＣＴＢとコンジュゲートまたは混合された抗原への皮膚曝露は異種抗原に対する顕著なＴ細胞増殖応答を引き起こす。更にまた、そしてＴｈ１およびＴｈ２サイトカインの両方の生産を増強するＣＴとは異なり、そして出願番号６０／２９０，７３２号における本発明者等の所見と異なり、ＣＴＢは高度にＴｈ１に分極化した応答を誘導した。細胞免疫応答に対するＣＴおよびＣＴＢのアジュバント活性は表皮および真皮における未成熟ＤＣの急速な集中を伴っていた。これらの結果を総合すると、ＴＣＩにおけるＴｈ１およびＴｈ２誘発応答に関するＣＴのアジュバント特性にはそのＡおよびＢサブユニットに伴う構造的に異なる部分がそれぞれ関与しており、そしてＣＴＢはＴｈ１誘発免疫応答をもたらすためにはＴＣＩにおいて免疫アジュバントとして有用であり、これにより同時投与された抗原に対するＩｇＥ形成の危険性が回避されると考えられる。

定義
本明細書において使用する用語は一般的に、本発明の内容の範囲において、そして各用語が使用される特定の範囲において、当該分野で通常の意味を有する。特定の用語を以下および明細書中の別の個所に記載することにより、本発明の組成物および方法、およびその製造および使用方法の説明において、当業者に対して更に指針が与えられる。
本明細書においては、「アレルゲン」とはアレルゲンのフラグメントまたはアレルゲンとして機能するハプテンを包含する。これらには、アレルギー患者においてＩｇＥ媒介応答をもたらすことのできる全ての特異的アレルゲンが包含される。従って本発明はヒト、他の霊長類およびイヌ、ネコおよびウマのような哺乳類対象におけるアレルギー疾患の治療に有用であると考えらえる。

「抑制する」という用語はアレルギー応答またはＩ型過敏性反応の作用を完全または部分的に緩解することを意味する。
本明細書においては、「過敏性反応」とはアレルゲンのような外来性物質に対する過剰な免疫応答に対して身体が反応する際の、変化した反応性の状態を包含する。
「抑制するために有効な量」とは、アレルギー応答をモジュレートするアレルゲンの量である。このような免疫応答のモジュレートは例えば脱感作または免疫抑制のような治療手段を与える。

本明細書においては、「経皮」または「皮膚表面」または「局所」という用語は皮膚を貫通することなく皮膚の真皮を通過して侵入することを意味する。

「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は構成的に、または隣接細胞またはその産物による、または、外因性の手段による刺激の後に、免疫応答をもたらすような状態で免疫系の細胞に抗原を提示することのできる何れかの哺乳類細胞である。ＡＰＣの例には例えば、種々の型および成熟段階の樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ（ＭΦ）、Ｂ細胞、ランゲルハンス細胞、肥満細胞および上皮細胞（後者は例えば皮膚から誘導された上皮細胞（ケラチノサイト）、口腔上皮、腸上皮、または泌尿器生殖器管上皮である）が包含される。

「ランゲルハンス細胞（ＬＣ）」とは抗原のプロセシングおよび提示に関与する補助的細胞としてそれらが機能している表皮の基底層に存在する協力にＭＨＣクラスＩＩ陽性で弱い貪食作用を有する樹状の外観を有する細胞である。抗原に曝露されると、リンパ節に移行する。ＬＣは骨髄由来であり、未成熟の樹状細胞である。それらの存在位置である免疫監視機構系の部分は、表皮バリアを貫通する抗原にそれらが容易に曝露されることを意味する。

「Ｔｈ１」応答は増大したＩＦＮ−γおよびＩＬ−２生産および細胞毒性ＣＤ８＋Ｔ細胞のより強い誘導を特徴とする。
「Ｔｈ２」応答はＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂまたはＩｇＥのような抗体の特定のクラスおよびサブクラスの生産、ＩＬ４およびＩＬ−５生産の増大およびＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比の低下を特徴とする。
「細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）」とはクラスＩ組織適合性分子の部分であるエピトープに結合するＣＤ８＋「キラー」Ｔ細胞である。それらはそれらが結合している細胞を破壊する分子を分泌する。ウィルスに感染している、または癌により形質転換されている細胞の本体を取り除くことに加えて、ＣＴＬは組織および臓器の移植片の拒絶反応にも関与している。

「同時刺激分子」は抗原提示細胞の表面上に発現される受容体リガンド対とＴ細胞との間の相互作用に関わっている。受容体リガンド対の一例はＤＣ表面上のＢ７同時刺激分子およびＴ細胞上のその対向受容体ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４である（参照文献：Freeman,et al. Science 1993;262:909-911; Young等,J.Clin.Invest.1992;90:229;Nabavi et al.,Nature 360:266）。他の重要な同時刺激分子はＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６である。

「連絡リンパ節フィールド」とは本明細書においては、集合したリンパが一連の所定のリンパ節集団を通過して循環する解剖学的領域を意味する（例えば頸部、腋窩、鼡径部、上腕骨内側上顆、膝窩、腹部および胸部のもの）。

「主要組織適合性複合体」即ち「ＭＨＣ」とはＴ細胞への抗原提示のため、および、急速な移植片拒絶のために必要とされる細胞表面分子をコードする遺伝子の複合体を指す。ヒトにおいては、ＭＨＣ複合体はまたＨＬＡ複合体としても知られている。ＭＨＣ複合体によりコードされる蛋白は「ＭＨＣ分子」として知られており、クラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ分子に分類される。クラスＩのＭＨＣ分子にはβマイクログロブリンと非共有結合的に会合しているＭＨＣにおいてコードされるα鎖よりなる膜ヘテロダイマー蛋白を含む。クラスＩＭＨＣ分子は殆ど全ての有核細胞により発現され、ＣＤ８＋Ｔ細胞への抗原提示において機能することがわかっている。クラスＩ分子にはヒトにおけるＨＬＡ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃが含まれる。クラスＩＩＭＨＣ分子もまた非共有結合的に会合したα、およびβ鎖よりなる膜ヘテロダイマー蛋白を含む。クラスＩＩＭＨＣはＣＤ４＋Ｔ細胞への抗原提示に関与することがわかっており、ヒトにおいては、ＨＬＡ−ＤＰ、−ＤＱおよびＤＲを含む。
ＭＨＣクラスＩＩ分子は抗原提示細胞の外部で生成される蛋白に由来するペプチドに結合する。一方、ＭＨＣクラスＩ分子は細胞内部で生産される蛋白から誘導されるペプチドに結合する。クラスＩＩ分子の意味においてペプチドを提示するためには、ＡＰＣは抗原を貪食して細胞内ベシクル中に取りこみ、ここで抗原を切断し、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合させ、次に抗原提示細胞の表面に戻す。

「アジュバント」という用語は、本明細書においては、抗原への免疫応答の誘導を促進するために製剤に添加される物質を意味する。
「連係させて」とは２種以上の反応体（例えば抗原またはその部分と免疫モジュレート剤、例えばコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）または他の毒素Ｂサブユニット（例えばＥ．ｃｏｌｉＬＴＢ）の部分であって、場合によりサイトカインや免疫モジュレート性の核酸またはオリゴヌクレオチドを含む他の薬剤の存在下または非存在下のもの）の間の製剤として定義され、ここで、これらの反応体は何れかの効果的な製剤中、例えば混合物、化学コンジュゲート、遺伝子融合蛋白または反応の何れかまたはすべてのコードする核酸調製物中で、相互に連携してＰＣに提示される。

「経皮的」または「皮膚表面」または「局所的」という用語は本発明の複合体の投与経路を説明するために互換的に用いられる。
「コレラ毒素（ＣＴ）」はＡＤＰリボシル化体外毒素のファミリーに属する細菌体外毒素である。大部分のＡＤＰリボシル化体外毒素はＡ：Ｂ二量体として機能的に組織されており、ここで結合Ｂ部またはサブユニットまたはＡ部またはサブユニットはＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性を含んでいる。このような毒素には、ジフテリア毒素、シュードモナス体外毒素Ａ、ＣＴ、Ｅ．ｃｏｌｉ熱感受性エンテロトキシン（ＬＴ）、百日咳毒素（パーツシゲン）、Ｃ．ボツリナム毒素Ｃ２、Ｃ．ボツリナム毒素Ｃ３、Ｃ．リモサムエキソ酵素、Ｂ．セレウスエキソ酵素、シュードモナス体外毒素Ｓ、スタフィロコッカス・アウレウスＥＤＩＮおよびＢ．サフェリカス毒素が包含される。
ＣＴはＡおよびＢサブユニットにより組織されているＡＤＰリボシル化体外毒素の原型の例である。Ｂサブユニットは結合サブユニットであり、単一のサブユニットであるＡサブユニットに非共有結合的に結合するＢサブユニットのホモ５量体よりなる。Ｂサブユニット５量体は標的細胞上のＧＭ１−ガングリオシドに結合する左右対称のドーナツ型の構造に構成されている。Ａサブユニットは環状ＡＭＰの細胞内濃度上昇をもたらすＧｓ蛋白を含むヘテロ３量体ＧＴＰ蛋白（Ｇ蛋白）のサブセットのαサブユニットをＡＤＰリボシル化する作用を有する。これによりコレラの症例において腸細胞からのイオンおよび液体の放出が促進される。

コレラ毒素およびそのＢサブユニット（ＣＴＢ）は筋肉内または経口の免疫原のいずれかとして使用される場合にアジュバント特性を有する（参考文献：Elson and Dertzbaugh,J Immunol. 1995;154(3):1032-40; Trach等.,Lancet,1997;349(9047):231-5）。別の抗原であるＥ．ｃｏｌｉ由来の熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）はＣＴとアミノ酸レベルで８０％の相同性を有し、同じ結合特性を有し、これはまた腸内のＧＭ１−ガングリオシド受容体に結合すると考えられ、同様のＡＤＰリボシル化体外毒素活性を有する。別のＡＤＰリボシル化体外毒素であるシュードモナス体外毒素Ａ（ＥＴＡ）はα−２−マクログロブリン受容体−低密度リポ蛋白受容体−関連蛋白に結合する（参考文献：Kounnaset等,J Biol Chem,1993;268(19):14176-81）。ＡＤＰリボシル化体外毒素は（Krueger and Barbieri,Clin Microbiol Rev,1995;8(1):34-47により）検討されている。しかしながら、本明細書に記載するＣＴとＣＴＢとの間の重要な相違点は、Ｂサブユニット、そして他の非ＡＤＰリボシル化外毒素、例えばＥ．ｃｏｌｉのＬＴのＢサブユニットはアレルゲンとともに経皮投与されるとアレルギー反応を抑制する点である。

ＣＴＢおよび誘導体は、ＥＬＩＳＡまたはＧＭ１−ＥＬＩＳＡ試験により検出する場合に、ＧＭ１ガングリオシドに結合するか、および／またはＣＴＢに対するポリクローナル抗血清と反応する何れかの蛋白として定義され、例えばエシェリシア・コリＢ由来の熱感受性エンテロトキシンのＢサブユニット（ＬＴＢ）および、何れかまたはすべての突然変異した、延長した、トランケートされたまたは何らか別の態様に修飾された形態のＢサブユニット、または、ＧＭ１と、またはこのような型の抗血清と反応する何れかの他の蛋白、並びにこのような基準を満足する蛋白をコードする何れかの核酸調製物を含む。ＣＴＢおよび誘導体はＡＤＰリボシル化活性を有していない。

分子生物学の定義
「約」または「概ね」という用語は、数値を計測または測定する方法、即ち測定系の限度に一部依存している、当業者により決定される特定の数値の許容できる誤差範囲内にあることを意味する。例えば「約」とは当該分野の慣行により、標準偏差１またはそれ以上の範囲内にあることを意味する。或いは、「約」とは所定の数値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで更に好ましくは１％までの範囲にあることを意味する。或いは、特に生物学的な系または方法に関しては、用語はあるオーダー内、好ましくは数値の５倍以内、更に好ましくは２倍以内にあることを意味する。

「突然変異体」または「突然変異」という用語は遺伝子的物質、例えばＤＮＡにおける見地可能な何らかの変化、またはそのような変化の何らかの過程、機序または結果を意味する。これには、遺伝子の構造（例えばＤＮＡ配列）が変化するような遺伝子の突然変異、何らかの突然変異過程により生じる何らかの遺伝子またはＤＮＡ、および、修飾された遺伝子またはＤＮＡの配列により発現される何らかの発現産物（例えばＲＮＡ、蛋白または酵素）が包含される。「変異体」という用語もまた修飾または改変された遺伝子、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ、酵素、細胞等、即ち、何れかの種類の突然変異体を指すために使用してよい。
「類縁体」とは、経皮投与時に非ＡＤＰリボシル化毒素サブユニットの生物学的作用、例えば非ＡＤＰリボシル化毒素サブユニットの特徴である免疫抑制活性を摸倣できる物質である。

本明細書において「精製された」という用語は無関係の物質、即ち混在物、例えばその物質の入手元である天然物の存在が低減されているか排除されている条件下に単離されている物質を意味する。例えば精製された蛋白は好ましくは、それが細胞内で会合している他の蛋白または核酸を実質的に含有せず；精製された核酸分子は好ましくはそれが細胞内で共存している蛋白または他の核酸分子を実質的に含有しない。本明細書においては、「実質的に含有しない」とは、場合により、物質の分析試験の関連において用いる。好ましくは、混在物を実質的に含有しない精製された物質は少なくとも５０％純粋；より好ましくは少なくとも９０％純粋、そして更に好ましくは少なくとも９９％純粋である。純度はクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成分析、生物学的試験、および他の当該分野で知られた方法により評価できる。

精製方法は当該分野でよく知られている。例えば核酸は沈殿、クロマトグラフィー（プリペラティブ固相クロマトグラフィー、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションおよび３重螺旋クロマトグラフィーを含む）、超遠心分離および他の手段で精製することができる。ポリペプチドおよび蛋白は種々の方法、例えばプリペラティブディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、イオン交換および分配クロマトグラフィー、沈殿および塩析クロマトグラフィー、抽出および向流分配により精製できる。一部の目的のためには、精製を容易にする別の配列タグ、例えばポリヒスチジン配列、または抗体に特異的に結合する配列、例えばＦＬＡＧおよびＧＳＴを蛋白が含んでいる組み換え系においてポリペプチドを作成することが好都合である。次にポリペプチドを適切な固相マトリックス上のクロマトグラフィーにより宿主細胞の粗製溶解物から精製することができる。或いは、蛋白に対して、またはそれより誘導されたペプチドに対して作成された抗体を精製試薬として使用することができる。細胞は種々の方法、例えば遠心分離、マトリックス分離（例えばナイロンウール分離）、パニングおよび他の免疫選択的方法、枯渇（例えば汚染細胞の補体枯渇）および細胞ソーティング（例えば蛍光活性化細胞ソーティング［ＦＡＣＳ］）により精製することができる。他の精製方法も可能である。精製された物質はそれが元々会合していた細胞成分の約５０％未満、好ましくは約７５％未満、最もＰＤＥ７Ａ１約９０％未満を含有してよい。「実質的に純粋な」とは、当該分野で知られた従来の精製方法を用いて達成できる最高水準の純度を指す。

「コーディング配列」または発現産物、例えばＲＮＡ、ポリペプチド、蛋白または酵素を「コードする」配列とは、発現されるとこのようなＲＮＡ、ポリペプチド、蛋白または酵素の生産をもたらすヌクレオチド配列であり；即ち、ヌクレオチド配列はそのようなＲＮＡを「コード」するか、そのポリペプチド、蛋白または酵素に対するアミノ酸配列をコードする。
「プロモーター配列」とは細胞内でＲＮＡポリメラーゼに結合することができ、下流（３’方向）のコーディング配列の転写を開始できるＤＮＡ調節領域である。本発明の定義の目的のためには、プロモーター配列はその３’末端において転写開始部位に結合し、上流（５’方向）に伸長し、バックグラウンドを超えて検出可能な濃度で転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含むものである。プロモーター配列内には転写開始部位（好都合には例えばヌクレアーゼＳ１によるマッピングにより発見できる）並びにＲＮＡポリメラーゼへの結合に関与する蛋白結合ドメイン（コンセンサス配列）が存在する。

コーディング配列は、ＲＮＡポリメラーゼがそのコーディング配列をＲＮＡに転写し、それが次にトランスＲＮＡスプライスされ（イントロンを含む場合）、そして、配列が蛋白をコードしている場合は蛋白に翻訳される場合に、細胞内の転写および翻訳の制御配列の「制御下にある」か、これと「作動可能に連結されている」。
「発現する」または「発現」という用語は、遺伝子またはＤＮＡ配列中の情報の顕在化を可能化または誘発する、例えば相当する遺伝子またはＤＮＡ配列の転写および翻訳に関与する細胞内機能を活性化することによりＲＮＡ（例えばｒＲＮＡまたはｍＲＮＡ）または蛋白を生産することを意味する。ＤＮＡ配列は細胞により発現され、これによりＲＮＡ（例えばｍＲＮＡまたはｒＲＮＡ）のような「発現産物」を形成する。発現産物そのもの、例えば形成したＲＮＡまたは蛋白もまた細胞により「発現された」と言ってもよい。

「トランスフェクション」という用語は外来性の核酸が細胞内に導入されることを意味する。「形質転換」という用語は「外来性」（すなわち、外因性または細胞外の）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の宿主細胞への導入により宿主細胞が導入された遺伝子または配列を発現し、これにより所望の物質、本発明においては典型的には導入された遺伝子または配列によりコードされるＲＮＡであるが、やはり導入された遺伝子または配列によりコードされる蛋白または酵素であってもよいものを生産することを意味する。導入された遺伝子または配列はまた「クローニングされた」または「外来性の」遺伝子または配列と称される場合もあり、これには、調節配列または制御配列（例えば開始、終止、プロモーター、シグナル、分泌または細胞の遺伝的機序により使用されるその他の配列）が包含される。遺伝子または配列は非機能性の配列または機能が未知である配列を含んでもよい。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受領して発現する宿主細胞は「形質転換され」、そして「形質転換体」または「クローン」となる。宿主細胞に導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、何らかの入手源、例えば宿主と同じ属または種の細部または異なる属または種の細胞から得たものであることができる。

「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」という用語はこれによりＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば外来性遺伝子）を宿主細胞に導入することができ、これにより宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば転写および翻訳）を促進することのできるベヒクルを意味する。ベクターにはプラスミド、ファージ、ウィルス等が包含され、後により詳細に説明する。

一般的に、該等異性ＤＮＡはベクターＤＮＡの１箇所以上の制限部位に挿入され、次にベクターにより伝達性ベクターＤＮＡと共に宿主細胞内に運ばれる。発現ベクターのような、挿入された、または付加されたＤＮＡを有するＤＮＡのセグメントまたは配列はまた「ＤＮＡコンストラクト」とも称される。ベクターの一般的な形態は「プラスミド」であり、これは遺伝的には通常は細菌起源の二重鎖ＤＮＡの自己含有分子であり、別の（外来性の）ＤＮＡを容易に受け入れ、適当な宿主細胞に用意に導入できるものである。プラスミドおよびカビベクターを含む多数のベクターが、種々の真核細胞および原核細胞の宿主における複製および／または発現に関して報告されている。「宿主」という用語は、細胞による物質の製造のための何れかの方法において選択され、修飾され、形質転換され、生育されまたは使用ないしは操作される何れかの生物の何れかの細胞を意味する。例えば、宿主細胞は特定の遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、蛋白または酵素を発現する様に操作されたものであってよい。宿主細胞はさらに後に記載するスクリーニングまたは他の試験のために用いることもできる。宿主細胞はインビトロで培養して良く、または、非ヒト動物（例えばトランスジェニックな動物または一過性にトランスフェクトされた動物）の１種以上の細胞であってよい。

広範な種類の宿主／発現ベクター組み合わせ（即ち発現系）を用いて本発明のＤＮＡ配列を発現させてよい。有用な発現ベクターは例えば染色体、非染色体および合成のＤＮＡ配列のセグメントより成るものであってよい。安定なベクターにはＳＶ４０の誘導体および既知の細菌プラスミド、例えばＥ．ｃｏｌｉプラスミドｃｏｌ Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（参考文献：Smith等.,Gene 67:31-40,1988）、ｐＭＢ９およびその誘導体、ＲＰ４のようなプラスミド；ファージＤＮＡ、例えばファージｌの種々の誘導体、例えばＮＭ９８９および他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３およびフィラメント１重鎖ファージＤＮＡ；コウボプラスミド、例えば２ｍプラスミドまたはその誘導体；真核細胞で有用なベクター、例えば昆虫または哺乳類細胞で有用なベクター；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせから誘導されたベクター、例えばファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を用いるように修飾されたプラスミド等が包含される。更にまた、種々の腫瘍細胞系統も本発明の発現系に使用することができる。

コウボ発現系もまた目的の何れかの蛋白を発現するために本発明に従って使用することができる。例えば非融合ｐＹＥＳ２ベクター（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＧｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、Ｋｐｎ１およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；Invitrogen）または融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨ１、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂を用いて精製し、エンテロキナーゼで切断したＮ末端ペプチド；Invitrogen）が２つの例として挙げられるが、これらは本発明に従って用いることができる。

蛋白またはペプチドの発現は当該分野で知られている何れかのプロモーター／エンハンサーエレメントにより制御してよいが、これらの調節エレメントは発現のために選択された宿主において機能可能でなければならない。遺伝子の発現のために使用してよいプロモーターは、例えばサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許５，３８５，８３９号および５，１６８，０６２号に記載）、ＳＶ４０早期プロモーター領域（参考文献：Benoist and Chambon,1981,Nature 290:304-310）、ラウス肉腫ウィルスの３’長鎖末端リピートに含まれるプロモーター（参考文献：Yamamoto et al.,Cell 22:787-797,1980）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（参考文献：Wagner等.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445,1981）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（参考文献：Brinster等.,Nature 296:39-42,1982）；β−ラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター（参考文献：Villa-Komaroff等.,Proc. Natl. Acad. Sci.,USA,75:3727-3731,1978）またはｔａｑプロモーター（参考文献：DeBoer等.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1983; 80:21-25；"Useful proteins from recombinant bacteria",Scientific American,242:74-94,1980
）に記載のもの；コウボまたは他のカビに由来するプロモーターエレメント、例えばＧａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター；および造血組織特異性を示す転写制御領域、特に：骨髄性細胞において活性なβグロビン遺伝子調節領域（参考文献：Mogram等.,Nature,315:338-340,1985; Kollias et al.,Cell 46:89-94,1986）、造血幹細胞分化因子プラスミド、エリスロポエチン受容体プロモーター（参考文献：Maouche等.,Blood,15:2557,1991）等である。

特に細胞のインビトロおよびインビボの試験のために好ましいベクターはウィルスベクター、例えばレンチウィルス、レトロウィルス、ヘルペスウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、ワクシニアウィルス、バキュロウィルスおよび所望の細胞向性を有する他の組み換えウィルスである。即ち、機能性または突然変異性の蛋白またはそのポリペプチドドメインフラグメントをコードする遺伝子は、ウィルスベクターを用いるか、またはＤＮＡの直接導入を介して、インビボ、エクスビボ、またはインビトロで導入することができる。標的組織における発現を行なうには、ウィルスベクターまたは受容体リガンドを用いるか、または、組織特異的プロモーターを用いるかその両方により、トランスジェニックなベクターを特定の細胞にターゲティングする。ターゲティングされた遺伝子のデリバリーは１９９５年１０月に公開された国際特許出願ＷＯ９５／２８４９４に記載されている。

インビボまたはエクスビボのターゲティングおよび治療処置に共通して使用されているウィルスベクターはＤＮＡ系ベクターおよびレトロウィルスベクターである。ウィルスベクターの構築および使用の方法は当該分野で知られている（参考文献：Miller and Rosman,BioTechniques,7:980-990,1992）。好ましくは、ウィルスベクターは複製能欠損であり、即ち、これらは標的細胞内で自己複製できない。好ましくは、複製能欠損ウィルスは最小ウィルスであり、即ち、ゲノムをカプシド化してウィルス粒子を形成するために必要なゲノムの配列のみを保有する。

「発現系」という用語は、例えばベクターにより担持され、宿主細胞に導入される外来性ＤＮＡによりコードされた蛋白の発現のために適する条件下における宿主細胞と適合するベクターを意味する。一般的な発現系にはＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞とプラスミドベクター、昆虫宿主細胞、例えばＳｆ９、Ｈｉ５またはＳ２細胞とバキュロウィルスベクター、ショウジョウバエ細胞（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ細胞）と発現系、魚細胞と発現系（例えば、American Type Culture Collectionより入手可能であり受託番号ＣＲＬ−１７１０で登録されているニジマス由来のＲＴＨ−１４９細胞）および哺乳類宿主細胞およびベクターを包含する。

「異種の」という用語は天然には存在しないエレメントの組み合わせを指す。例えば、本発明はｒＲＮＡ配列およびｒＲＮＡ配列の部分ではない異種のＲＮＡ配列を有するキメラＲＮＡ分子を包含する。この点に関し、異種ＲＮＡ配列はリボソームＲＮＡ配列内に天然には位置しないＲＮＡ配列を指す。或いは、異種ＲＮＡ配列はリボソームＲＮＡ配列内に天然に位置してもよいが、それが天然には存在しないｒＲＮＡ配列内の位置に存在する。別の例として、異種ＤＮＡは細胞内または細胞の染色体部位中に天然には位置しないＤＮＡを指す。好ましくは異種ＤＮＡは細胞にとって外来である遺伝子を含む。異種発現調節エレメントは、それが天然に作動可能に会合しているものとは異なる遺伝子と作動可能に会合している調節エレメントである。

１つの実施態様において、ペプチドまたは蛋白はＣＴＢに化学的にカップリングされるか遺伝子的に融合される。ＣＴＢにペプチドおよび蛋白を化学的にカップリングさせるための方法は以下の「方法」のセクションにおいて記載する。如何なる化学カップリングも使用される。好ましくは、カップリングは市販の官能性アダプターを用いる。これらは全て多くの入手元、例えば、シグマケミカルコーポレーション（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびＭｅｒｃｋ（Ｗｈｉｔｅ Ｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪ）から入手可能である。ペプチド−蛋白担持重合体はカルボジイミド類のような従来の交叉結合剤を用いて形成してよい。

免疫臓器としての皮膚
皮膚の上皮、即ち表皮は大分子や病原体の吸収を防止するための角質層により被覆されたケラチノサイト（ＫＣ）の多層により形成される重層扁平角化上皮である。皮膚は専属の抗原提示樹状細胞、例えばランゲルハンス細胞（ＬＣ）を表皮に、そして皮膚樹状細胞（ＤＣ）を真皮に含んでいる。ＬＣは形態学的には、ＫＣの間に樹状突起を突出させている細胞のネットワークから生じる、その長細い原形質突起を特徴とする。皮膚を通過して抗原が侵入した後、ＬＣは急速に真皮ＤＣ前駆体から表皮に集合し、そこでエンドサイトーシスにより抗原を捕獲して内在化し、そしてネイティブの抗原からエンドサイト経路のＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）ベシクル内に貯留されているペプチドへのプロセシングを開始する。ＬＣによる抗原の捕獲によりＬＣの形態学的変化および可動化が起こり、これにより求心性のリンパを経由して連絡リンパ節（ＤＬＮ）のＴ細胞領域に移行し、そこで指状突起を有するＤＣとして認識され、リンパ節Ｔ細胞と密着する。この段階までに、Ｂ７ファミリーの同時刺激分子の発現、ペプチドに結合したＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子のアップレギュレートされた表面発現およびＩＬ−１２、ＩＬ１のような前炎症性サイトカインを高濃度で分泌する能力を獲得している。即ち、指状突起を有するＤＣはナイーブのＴ細胞から抗原特異的Ｔ細胞への活性化において高度に特殊化されている。

近年、治療（即ち抗腫瘍）またはワクチン接種（抗感染症）目的のための免疫系の操作には、ＤＣによる効率的な抗原取りこみを可能とする免疫化を必要とすることが益々明確になってきた。感染症に対抗する保護的免疫の誘導のために皮膚を経由して抗原をデリバリーすることの実現可能性はワクチン学の分野から生じており、そしてより最近ではサブユニットワクチンのデリバリーにより例示されている。サブユニットワクチンの概念は、生体減衰されたウィルスまたは細菌によるワクチン接種の後に起こる場合があり、これにより免疫無防備状態にある個体における使用が制限される有害な合併症およびビルレンスへの潜在的な復帰が、組み換え蛋白、合成ペプチド、または、対象となる抗原をコードするＤＮＡの形態の病原体の抗原成分によるワクチン接種により克服され得るという考えに基づいている。

細胞媒介免疫応答
抗原特異的Ｔ細胞の活性化の第１段階は、同時刺激シグナルとともに細胞表面上のＭＨＣクラスＩＩとの複合体において抗原を吸着、加工および提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）により制御される。次に応答したＴ細胞はＣＤ４＋サブセットとなり、Ｔｈ１またはＴｈ２または他のヘルパーまたは調節細胞の何れかに成長する。ＡＰＣはまた、細胞表面のＭＨＣクラスＩ、または、より最近の報告によれば、ＣＤ１分子の何れかとの複合体において抗原を提示することもできる。ＭＨＣクラスＩの意味において提示される抗原は通常は、例えば細胞内の細菌、ウィルスまたは寄生性の抗原（細胞内で異種の抗原を発現するように操作された組み換え体のこのような生物を含む）による感染の結果としてＡＰＣ内において細胞内生産され、そして細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ）に成長する場合のある同族のＣＤ８＋Ｔ細胞により認識される。しかしながら、一部の型の外来性抗原、例えば粒子状の抗原製剤はまたＡＰＣＭＨＣクラスＩ経路に転座され、ＣＴＬを含むＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激する場合がある。蛋白のＣＤ１ファミリーは大部分のＡＰＣにおいて顕著に発現され、これらの蛋白は最近では、主に種々の脂質および糖脂質の抗原をＣＤ１反応性／制限性Ｔ細胞、例えばＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＣＤ４／ＣＤ８二重陰性Ｔ細胞に提示することにより、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩに加えて別の抗原提示系をもたらすことが解かった。

ＡＰＣは細胞の型により異なる複数の抗原取りこみ機序を利用している。樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージ（ＭΦ）はＦｃ受容体およびＣ型マルチレクチン受容体を介したブロードな結合特異性を有しており、マクロピノサイトーシスおよび貪食作用によっても抗原を吸収することができる（参考文献：Banchereau等.,Nature 1998;392;245-252）。抗原の性質の外に、関与するＡＰＣおよび提示される、そして／または誘導されるサイトカインの性質がその後のＴ細胞応答の結果にとって重要な決定要因となる。即ち、Ｔ細胞活性化の水準は、ＡＰＣ表面上に存在する、特異的ペプチド負荷ＭＨＣクラスＩＩおよびＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６のような同時刺激分子の密度により（参考文献：McAdam 等.,Immunol. Rev. 1998; 165:231-247,van Gool等.,Immunol. Rev.1996; 153:47-83）、そして、ＩＬ−１、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８のような生産されるサイトカインの濃度（参考文献：Kohno等.,J. Immunol. 1997;158:1541-1550,O'Garra等.,Immunity. 1998;8:275-283,Weaver等.,Immunol. Today 1990; 11:49-55）により異なる。

経皮的投与およびデリバリー
以前より、免疫応答を誘導するために経皮的投与により薬剤を特殊化された細胞（例えば抗原提示細胞（ランゲルハンス細胞およびリンパ球）にデリバリーされている（Ｂｏｓ， Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７；１０７ Ｓｕｐｐｌ．１：３−５）。しかしながら、本発明は部分的には、特異的免疫応答を誘導する外に、アレルゲンの経皮投与は進行中のアレルギー応答も抑制できるという予測されなかった発見に基づいている。
本発明の１つの特徴は皮膚を穿刺する必要無く未損傷の皮膚を介して過敏性反応をモジュレートするための新しい手段を提供することである。経皮デリバリーシステムはアレルゲンと担体を免疫系、特に、皮膚に伏在する特殊化された抗原提示細胞、例えば、ランゲルハンス細胞にデリバリーすることのできる方法を提供する。

特定の理論に制約されず観察結果を説明すれば、経皮デリバリーシステムはアレルゲンを免疫系の細胞に運び、そこでアレルギー応答をモジュレートすると考えられる。抗原は皮膚の正常な保護外層（即ち角質層）を通過して直接、または、Ｔリンパ球にプロセシングされた抗原を提示する抗原提示細胞（例えばマクロファージ、組織マクロファージ、ランゲルハンス細胞、樹状細胞、皮膚樹状細胞、またはＢリンパ球）を介してアレルギー応答をモジュレートする。場合により、抗原は毛嚢または皮膚オルガネラ（例えば汗腺、皮脂腺）を介して角質層を通過する。

経皮デリバリーシステムは、幾つかの位置を皮膚の広範な表面積中にターゲティングできることから、薬剤の使用よりも効率的に免疫細胞をターゲティングできる。過敏性反応を抑制するために有効な量のアレルゲンは単一の位置において、または複数の連絡リンパ節フィールド（例えば、頸部、腋窩、鼡径部、上腕骨内側上顆、膝窩、腹部および胸部のもの）を網羅する未損傷の皮膚の領域に渡って経皮的にデリバリーしてよい。身体全体に渡る位置の多くの異なるリンパ節に近接するような位置は、少量のアレルゲンを経皮、皮下または筋肉内注射により単一の位置に注射する場合よりもより広範に免疫系に接触することができる。

本発明はアレルギー応答のモジュレーションのための簡素で容易な治療法を与えるものである。経皮デリバリーは皮膚の穿刺を伴わないため、熟練した担当者、滅菌操作および滅菌装置の必要性が大きく低減され、これにより、医療コストが低減される。
経皮デリバリーはパッチ下部のガーゼに含浸したＣＴＢに混合またはコンジュゲートしたアレルゲンの溶液を用いるか、またはたのパッチ法を用いることにより達成される。経皮パッチは当該分野でよく知られている。米国特許４，９９４，２６７号公報；５，６０５，７０１号公報；５，９４８，４３３号公報および６，２６７，９８３号公報が参考にでき、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。経皮デリバリーのための医薬品製剤を調製するための方法は当該分野でよく知られており、これにより抗原およびアジュバントを製薬上許容しうる担体ベヒクルと組み合わせることができる。適当なベヒクルおよびその調製方法は、例えばＥ．Ｗ．マーチン（Martin）による（参考文献:Remington's Pharmaceutical Sciences）に記載されている。このような製剤はヒトまたは動物への投与に適する製薬上許容しうる組成物を調製するためにベヒクル適量と共に抗原およびアジュバントの有効量を含有する。製剤はクリーム、乳液、ゲル、ローション、軟膏、ペースト、溶液、懸濁液、スプレーまたは他の知られた剤型において適用してよい。特に、皮膚の含水、浸透、または両方を促進する製剤が好ましい。他の製薬上許容しうる添加剤または賦形剤、例えば希釈剤、バインダー、安定化剤、保存料、浸透促進剤および着色料も配合してよい。更にまた、経皮デリバリーシステムは未熟練の担当者により施行でき、自己適用も行ないやすい。更にまた、この簡素なデリバリーシステムは小児患者および高齢者、および、第３世界の国の集団においても治療を容易にする。

本発明の１つの実施態様において、リポソームをアレルゲンおよびＣＴＢのデリバリーのために使用してよい。リポソームは内部の水性の空間を包囲する閉鎖された嚢胞である。内部のコンパートメントは異なる脂質分子よりなる２層により外部の媒体から分離されている。本発明においては、アレルゲンは免疫系の特殊化された細胞に対し未損傷の皮膚を通してデリバリーしてよい。アレルゲンの経皮デリバリーはリポソームを用いて行なってよいが、実施例に示すとおり、リポソームは抗原特異的免疫応答をもたらすために必要なものではない。
経皮デリバリーシステムは直接皮膚に適用して風乾するか；皮膚または頭皮に擦り込むか；包帯、パッチまたは吸収材で保持するか、または、皮膚に噴霧することにより、皮膚との接触を旨適化してよい。製剤は吸収材、包帯またはガーゼ中で適用してよい。製剤は閉鎖性包帯、例えばＡＱＵＡＰＨＯＲ（ワセリン、鉱物油、鉱物ワックス、ウールワックス、パンテノール、ビサボールおよびグリセリンの乳液：Beiersdorf, Inc．より入手可能）、プラスチックフィルム、ＣＯＭＦＥＥＬ（Coloplast）またはヴァセリン；または非閉鎖性包帯、例えばＤＵＯＤＥＲＭ（３Ｍ）またはＯＰＳＩＴＥ（Smith&Napheu）で被覆してよい。閉鎖性包帯は水の通過を完全に防止する。

製剤は単一または複数の部位、単一または複数の四肢、または皮膚の広範な表面積に対し完全な浸積により適用してよい。製剤は直接皮膚に適用してよい。
経皮投与を用いることの利点は、注射の必要性が排除されることのほかに、治療のための経口投与と比較して低用量のアレルゲンを使用してアレルギー応答の進歩した治療が可能である点である。経皮投与はまたアレルゲンの患者への投与をより簡素化し、経口投与の場合に起こる吸収の過程における胃腸管の問題を回避でき、そして、初回通過、即ち全身および門脈循環を経由する薬剤の最初の通行が回避することができる。経皮投与はまた単回の適用により複数日の治療が可能であるため、患者の用法遵守が改善される。皮下免疫療法と比較して、経皮投与は非侵襲的な方法であり、特殊な施設や熟練した担当者を必要としない。

アレルゲン
即時型および／または遅延型の過敏症の症状を誘発する外来性化合物を本明細書ではアレルゲンと称する。「アレルゲン」という用語は主に、アレルギー応答を誘発することのできる外来性化合物を指す。アレルゲンに対する動物の感受性に影響する因子には、遺伝的要素および／またはアレルゲンへの環境上の曝露が包含される。動物は動物が過敏となるアレルゲンを反復して注射することによりアレルゲンに対して脱感作することができる。
本発明により包含されるアレルゲンは、環境中の浮遊アレルゲン、雑草花粉アレルゲン、草木花粉アレルゲン、樹木花粉アレルゲン、ハウスダストダニアレルゲン、貯蔵ダニアレルゲン、カビ胞子アレルゲン、動物アレルゲン、食物アレルゲン（例えば卵、ピーナツ、コムギ、牛乳、海産物、果実）、昆虫アレルゲン、害虫毒（膜翅類、スズメバチ、ミツバチ、ジガバチ、クマンバチ、ホタル）およびゴキブリ、ノミ、カ等の他の環境昆虫アレルゲン、細菌、例えば連鎖球菌抗原、寄生虫、例えば回虫の抗原、ウィルス抗原、薬剤抗原、効性物質、全蛋白、例えばホルモン（インスリン）、酵素（ストレプトキナーゼ）および不完全な抗原またはハプテンとして機能することのできるそれらの代謝産物、産業化学物質およびハプテンとして機能することができ免疫系を刺激することのできるそれらの代謝産物、職業場のアレルゲン、例えばパン屋喘息におけるコムギなど、ヒマノミ、コーヒー豆、ラテックス、綿花、羊毛、鉱物油、産業用染料、金属、例えば銅およびコバルトである（参考文献：Lachowski等., Curr Allergy Asthma Rep.2001;1(6):587-93; Stenton, Occup Med.2000;15(2):431-44;Quirce等., Allergy. 1998;53(7):633-41）。このようなアレルゲンに関する詳細な説明は以下の論文が参照できる。
Arruda LK,et al., Curr Allergy Asthma Rep. 2001; 1(5):466-73;
Phipatanakul W., Curr Allergy Asthma Rep. 2001; 1(5):461-5.
Review;Dziadzio L, Curr Allergy Asthma Rep. 2001; 1(5):455-60;
Wurtzen P A., APMIS. 2001; 109(9):561-71;
Fountain DW. et al, Biologist (London). 2002;49(1):5-9;
Zucker-Pinchoff B, Mt Sinai J Med. 2002; 69(1-2):88-95;
Spergel JM et al., Curr Opin Pediatr. 2001; 13(6):517-22;
Esch RE et al., Clin Rev Allergy Immunol. 2001;21(2-3):261-92.

アレルゲンおよび参考文献の包括的な開示または核酸およびアミノ酸の配列が掲載されているゲンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）の受託番号は参考のために本明細書に組み込まれる２００１年９月１３日公開のＰａｎａｃｅａ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳ， ＬＬＣ， のＰＣＴＷＯ０１／６６１３６の付属Ａに記載されている。
本発明のアレルゲンは組み換え手段により発現してよく；遊離または担体蛋白にコンジュゲートされたオリゴペプチドの化学合成を用いて本発明の抗原を得てよい。組み換えポリペプチドを発生させる方法は、例えば、Sambrook,Fritsch & Maniatis,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York;DNA Cloning: A Practical Approach,Volumes I and II (D.N.Glover ed,1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait ed,1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D.Hames & S.J.E Higgins ds. (1985)]Transcription And Translation [B.D.Hames & S.J. Higgins,eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I.Freshney,ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press,(1986)]; B.EPerbal,A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M.Ausubel et al.,(eds.),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.(1994)
に記載されている。

免疫原性ペプチドおよびアレルゲン、ＯＶＡのＣＴＢとの遺伝子的融合に関する非限定的な例は以下の方法のセクションにおいて記載する。
組み換え手段またはペプチド合成により得られるアレルゲン並びに天然の原料または抽出物から得られる本発明の抗原は抗原の物理的および化学的特性により、好ましくは、分画またはクロマトグラフィーにより精製してよい（参考文献：Gregroire et al., Clin Rev Allergy Immunol. 2001;21(2-3):215-27）。或いは非精製の粗製のアレルゲンも使用してよい。
本発明の１つの実施態様においては、ＡＤＰリボシル化活性を有さない毒性サブユニットに連結または融合されたアレルゲン２種以上の組み合わせを用いてよい。或いは、Ｂサブユニット連結および融合アレルゲンの組み合わせも意図される。複数のアレルゲンを含有する製剤を使用して同時に１種より多いアレルゲンに対する免疫応答を誘導してもよい。
アレルゲンは緩衝液中に溶解してよい。適当な緩衝液は例えばリン酸塩緩衝食塩水Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋非含有（ＰＢＳ）、規定食塩水（水中１５０ｍＭ ＮａＣｌ）およびトリス緩衝液である。グリセロールは本発明において使用するための適当な非水生緩衝液である。

コレラ毒素サブユニット
経口慣用性は全身免疫慣用性を誘導するための長期間に渡り認定されてきた方法である。しかしながら、高用量の抗原と頻繁な投与が必要となる場合が多い。本発明によれば、抗原を非毒性の粘膜結合ＣＴＢに連結させた場合、抗原の必要量を劇的に低減することができる。本発明者等は更に、ＣＴＢにカップリングさせたモデルアレルゲンの経口による予防または治療的投与が高ＩｇＥ応答Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいてアレルゲン特異的ＩｇＥ応答をモジュレートすることも発見した。従って、ＣＴＢ−ＯＶＡコンジュゲートの経口投与は抗原特異的Ｔｈ１媒介遅延型過敏症を効果的に抑制し、ＣＴＢコンジュゲートモデルアレルゲンの投与は抗原経験動物においてさえもＴ細胞誘発免疫応答の広範な領域に影響することができる（参考文献：Rask C, Holmgren J,Fredriksson M, Lindblad M, Nordstrom I, Sun JB, and Czerkinsky C, Clin Exp Allergy, Jul;30(7):1024-32,2000）。

本発明は毒素（例えばコレラ毒素またはＥ．ｃｏｌｉＬＴ）の粘膜結合分子または粘膜結合サブユニットまたはドメインを包含するが、最も好ましい粘膜結合サブユニットは純粋なコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）である。「純粋な」とは、この観点においては、コレラ毒素Ｂサブユニットが本質的に、ＣＴＢと組み合わせてコレラ毒素Ａサブユニット（ＣＴＡ）を含有している活性コレラ毒素の検出可能な混在量を含有しないことを意味する。「活性」コレラ毒素分子とは、本明細書においては、ＡＤＰリボシル化活性を有するものを意味する。本発明において使用するためのＣＴＢサブユニットの機能的純度はＣＴＡをコードする遺伝子の非存在下、細菌細胞（例えばＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）中、コレラ毒素Ｂサブユニットをコードする遺伝子を発現することにより行なうことができる。純粋なＣＴＢの大規模発現の方法は例えば米国特許５，２６８，２７６号に記載されている。Ｈｏｌｍｇｒｅｎ等への米国特許５，６８１，５７１号に記載されているとおり、本発明者等は、混在するコレラ毒素Ａサブユニットが少量であっても本発明組成物により誘導される寛容性が損なわれることを発見した。

別の実施態様において、突然変異されたＣＴＢ、または毒素の他の非ＡＤＰリボシル化サブユニットを使用する。このような突然変異の例には、何れかの突然変異点、これらの毒素、サブユニットまたは他の蛋白の欠失または挿入、並びに、蛋白中のアミノ末端、カルボキシ末端またはその他の部位に位置するこれらの蛋白への、そして、それらの蛋白がＢ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープまたは免疫応答を刺激または変動させる他のものであることにより免疫学的特性を有するかどうかに関らない、何れかのペプチドの伸長が包含される。例えば、多くのこのような突然変異が文献に記載されている（参考文献：Clementsへの米国特許6,033,673号;Backstrom等.,Gene 1995;165:163-171; Backstrom等.,Gene 1996;169:211-217; Schodel等.,Gene 1991;99:255-259; Detzbaugh等.,Infect. Immun. 1990;58:70-79）。

本発明を実施するにおいて、アレルゲンおよび細胞結合Ｂサブユニットは相互に直接、または間接的に連結するか、または、単に混合してよい。連結する場合は、連結ブは共結合または非共有結合であってよい（例えば静電気的および／または疎水相互作用による）。
１つの実施態様においては、アレルゲンと細胞結合分子（ＣＴＢ）の間の直接の連結はアレルゲンと細胞結合分のＣＴＢを化学的または遺伝子的に交叉結合することにより行なうことができる。蛋白またはペプチドを担体抗原にコンジュゲートし、融合蛋白を生成する方法は当該分野でよく知られている。
（詳細なプロトコルはRask等.,Clin. Exp. Allergy 2000,30:1024-1032およびSchodel等.,Gene 1991;99:255-59に記載されている。最終交叉結合蛋白が使用する特異的抗原／アレルゲンに対するアレルギー応答の抑制を誘導する能力を保持している限り、如何なる適当な方法も成分の交叉結合に用いてよい。
適当な交叉結合の操作法は当該分野で知られており、例えばCarlsson J.等., Biochem. J. 173:723-737, 1978; Cumber, J.A.等., Methods in Enzymology 112:207-224, 1985; Walden, P.等., J.Mol.Cell Immunol.2:191-197, 1986; Gordon, R.D.等., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: 308-312, 1987; Avramcas, S.等., Immuno-chemistry 6:53, 1969; Joseph, K.C.等., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:2815-2819, 1978; Middlebrook, J.等., Academic Press, New York, pp.311-350, 1981を参照することができる。）

アレルゲンおよびＢサブユニットの間の間接的な連結はスペーサー分子を用いて行うことができる。好ましくは、スペーサー分子はアレルゲン、粘膜結合分子のいずれか、またはその両方に対して親和性を有している。１つの実施態様において、スペーサーは抗体、好ましくはアレルゲンおよび粘膜結合分子を認識する２官能性の抗体を含む。別の実施態様においては、スペーサー分子はＧＭ１ガングリオシド、ガラクトシル−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニル−（シアリル）−ガラクトシルグルコシルセラミドのコレラ毒素結合構造から誘導される。これらの例においては、連結はスペーサーおよび他の成分の間の高親和性結合により形成される。唯一の条件はアレルゲンおよびＢサブユニットは共に粘膜投与の間、スペーサーを介して相互に連結したままで残存しなければならない点である。アレルゲンともＢサブユニットとも特異的親和性を有さないスペーサーの場合は、上記したように化学的交叉結合法を用いて成分間に共有結合を形成してよい。別の実施態様においては、間接的な連結は、表面にＢサブユニットを配置したリポソーム（または同等の生体分解性ベシクル）またはマイクロカプセルのような保護ベヒクルの内部にアレルゲンを封入することにより達成される。この種の提示形態において、アレルゲンはベシクロまたはマイクロカプセルの管腔内空間に遊離の状態で存在するか、または、他の成分に結合していてよい。唯一の条件はアレルゲンおよびＢサブユニットが投与の間十分緊密に接触して存続することによりアレルゲンが効果的に皮膚にデリバリーされなければならない点である。

本発明によれば、ＣＴと共に使用する精製されたアレルゲンの有効量は約１μｇ〜１ｍｇ、好ましくは約１００μｇ／ｃｍ²である。純粋なＣＴＢの有効量は約５〜２５０μｇ／ｃｍ²の範囲にある。投与は組成物中に存在するアレルゲンの性質により変化する。誘発試験、皮膚穿刺試験（参考文献：Rhodius et al., Ann Allegy Asthma Immunol.2002;88(4):374-9）を用いるか、または、アレルゲンに対する特異的ＩｇＥ濃度を求める（参考文献：Pierson-Mullany等., Clin Exp Allergy 2002;32(1):107-16）ことによりこのような濃度を決定することは当業者には困難ではない。１用量を毎週３〜６ヶ月間または一日当たり用量を４週間投与することにより寛容性用量を決定できる。ＣＴＢアレルゲン融合蛋白の用量範囲は活性ＣＴＢの量により推定され、５〜２５０μｇ／ｃｍ^２である。ＣＴＢ１分子は各々がペプチド１個と結合する単量体５個で形成されているため、融合するアレルゲンペプチドの量はＣＴＢ５量体モル当たり５アレルゲンペプチドモル）の比となる。ペプチドの量が不十分であると考えられる場合は、単量体当たりペプチド３個、即ち、ＣＴＢ５量体当たり１５ペプチドまでを含むＣＴＢ融合蛋白を調製することにより増量してよい。

アジュバント
本発明により免疫応答を誘導するための製剤はアジュバントを含有してよく、その際、単一の分子はアジュバントおよび抗原の特性の両方を有していてもよい（例えばコレラ毒素：Elson and Detzbaugh, Infect Immun. 1993;61(1):48-55）。アジュバントは抗原特異的免疫応答を特異的または非特異的に強化するために使用される物質である。通常は、アジュバントおよび製剤は予め混合し、その後抗原提示するが、別法として、それらは短時間の間隔を置いて別個に提示してもよい。アジュバントには、例えば、油性乳液（例えば完全または不完全フロイントアジュバント）、ケモカイン（例えばデフェンシン１または２、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ−２、ＩＬ−８）またはサイトカイン（例えば、インターロイキン−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０またはＩＬ−１２；インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）；腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）；または顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（参考文献：Nohria and Rubin 1994））、ムラミルジペプチド誘導体（例えばムラブチド、スレオニル−ＭＤＰまたはムラミルトリペプチド）、熱ショック蛋白または誘導体、熱帯リーシュマニアＬｅＩＦ（参考文献：Skeiky等., J Exp Med. 1995; 181(4);1527-37）、ＣＴＢ、リポ多糖類（ＬＰＳ）誘導体（例えば脂質Ａまたはモノホスホリル脂質Ａ）、または、スーパー抗原（参考文献：Saloga et al., J Invest Dermatol. 1996;106(5):982-8）が包含される。

本発明を実施例により更に説明するが、それらは本発明を説明するためのものであり、その範囲を限定するものではない。

本発明を以下に示す特定の実施例を含む実施例により更に説明する。明細書の如何なる個所におけるこのような実施例の使用も説明のみを目的としており、本発明の範囲や意味、または例示した用語の何れもを限定するものではない。同様に、本発明は明細書中に記載した如何なる特定の好ましい実施態様にも限定されない。実際、本発明の範囲を逸脱しない多くの変更や改変が本明細書を参考にすることにより当業者には自明となる。従って本発明は請求項に該当する完全な範囲を伴った添付の請求項の用語によってのみ限定される。

方法
呈示した説明および参考文献により、当業者は容易に実験を反復でき、使用する抗原の性質および選択、コンジュゲートまたは遺伝子融合の方法、および、細胞調製方法および免疫学的試験に関して種々の変更や改変が可能となる。
以下の実施例においては以下に記載する材料および方法を用いた。
動物。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ， Ｆｒａｎｃｅ）より購入した。全実験において、６〜８週齢の雌性マウスをＯＶＡ非含有飼料で生育させたものを用いた。
雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗleｙラットの１２〜１４週齢のものをＢＫ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）より購入した。
ＭＨＣクラスＩＩ Ｉ−Ａｄにより制限されるインフルエンザウィルスヘマグルチニン（ａａ１１１−１１９）のＨＡ免疫優性エピトープに特異的なＴＣＲを発現するＴＣＲ−ＨＡトランスジェニックマウスはＨ．ｖｏｎ Ｂｏｅｈｍｅｒ（Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｏｓｔｏｎ）より提供された。
ＯＶＡのアミノ酸３２３番目〜アミノ酸３３９番目に渡る免疫優性エピトープに特異的なＴＣＲを発現するＴＣＲ−ＯＶＡトランスジェニックＢａｌｂ／ｃマウス（ＤＯ１１）はＮ．Ｌｙｃｋｅ（Ｇｏｔｅｂｏｒｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｗｅｄｅｎ）より提供された。

ＣＴＢおよびＣＴＢ−ＯＶＡコンジュゲートの調製。
組み換えＣＴＢはＣＴ遺伝子を欠失しＣＴＢをコードするマルチコピープラスミドでトランスフェクトされたＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ ０１の突然変異株により生産させた。使用したＣＴＢは文献記載の通り炎沈殿およびクロマトグラフィー法の組み合わせにより培地から精製した（参考文献：Lebens et al.,BioTech.11:1574-8,1993およびSanchez et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:481-5, 1989）。
全卵白アルブミン（ＯＶＡ）の等級ＶはＬｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ （Ｃａｍｐｂｅｌｌ， ＣＡ）より入手し、ＧＭ１−ＥＬＩＳＡで測定した所、混在するＣＴＢの量は無視できる者であった（＜０．３％）。ＯＶＡは供給元の指示書に本質的に従って２官能性の試薬としてＮ−スクシンイミジル（３−（２−ピリジル）ジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてＣＴＢにコンジュゲートした。要すれば、ＣＴＢおよびＯＶＡをモル比１：４および１：１．５でそれぞれＳＰＤＰで誘導体化し、その後、ＯＶＡ−ＳＰＤＰを還元してＣＴＢ−ＳＰＤＰと混合した。得られたコンジュゲートは、捕獲系としてＧＭ１（参考文献：Svennerholm et al., Curr. Microbiol. 1978;1:19-23）および検出試薬としてＣＴＢおよびＯＶＡに対する抗体を用いた固相ＥＬＩＳＡによれば、ＧＭ１−結合活性およびＣＴＢおよびＯＶＡの血清学的反応性を温存していた。

ＣＴＢ融合蛋白の構築および精製
ＣＴＢまたはＬＴＢによる融合蛋白の作成のための方法は報告されており、そこでは、目的の抗原のＴまたはＢエピトープの何れかまたは両方をコードする核酸をＣＴＢのＮまたはＣ末端の何れかまたは両方のコーディング配列に遺伝子的に融合させるか、またはＣＴＢまたはＬＴＢコーディング配列内の鎖内位置にいれるか、またはＣＴＡまたはＬＴＡの同じ位置に連結させる（参考文献：Backstrom等.,Gene 1995;165:163-171; Backstrom等.,Gene 1994;149:211-217; Schodel等.,Gene 1991;99:255-259;）。方法はまたＣＴＡまたはＬＴＡのカルボキシまたはアミの末端へのペプチドの融合に関し、および、ＣＴＢまたはＬＴＢを用いたこれらの融合蛋白の同時発現に関して記載している（参考文献：Sanchez 等.,FEBS Lett,1986;208:194-198,Sanchez 等.,FEBS Lett,1997;401:95-97）。

２種の組み換えＣＴＢ融合分子が米国特許出願６０／２９０，７３２号に記載されている。そのうち１つの分子においては、ＯＶＡのペプチド３２３〜３３９がＣＴＢのＣ末端に融合し（ＣＴＢ：：ＯＶＡｐ）、そしてもう１つにおいてはインフルエンザウィルスヘマグルチニン残基１０８〜１１９（ＨＡ）に相当するペプチドがＣＴＢ構造の残基５６〜６３を置き換えていたものであった（ＣＴＢ５６ ６３Ｈａｐ）。
ＣＴＢ：：ＯＶＡｐ：ＯＶＡペプチドの１７アミノ酸をコードする合成オリゴヌクレオチドを合成した（Ｉｎｎｏｖａｇｅｍ ＡＢ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）。オリゴヌクレオチドをアニーリングし、次にＣＴＢ遺伝子の３’末端に連結した。最終プラスミドｐＭＬＣＴＢ：：ＯＶＡのＤＮＡ配列決定により、遺伝子融合の最終配列を確認した。

ＣＴＢ５６ ６３ＨＡｐ：１２アミノ酸ＨＡペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチドを合成した（Ｉｎｎｏｖａｇｅｍ ＡＢ）。オリゴヌクレオチドを成熟ＣＴＢの５５位および６４位の間でプラスミドｐＣＢ５６ ６３ｇｐ１２に挿入した（参考文献：Backstrom et al.,Gene 1995;165:163-171）。ＤＮＡ配列決定を用いてｐＣＢ５６ ６４ＨＡ中のインサートの配列を確認した。
ＣＴＢに挿入されたペプチドを担持する組み換え蛋白はＮまたはＣ末端に連結したペプチドを担持するものよりも安定である（参考文献：Backstrom et al.,Gene 1994;149:211-217;）。即ち、ＣＴＢ５６ ６３ＨＡｐはＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ中に発現されるが、ＣＴＢ：：ＯＶＡｐはＥ．ｃｏｌｉ中に発現され、ＣＴＢ上のｃ末端ペプチドの伸長を用意に破壊することがわかっている細胞外のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅプロテアーゼによる切断を回避する（参考文献：Schodel 等.,Gene 1991;99:255-259;）。

ｐＣＢ５６ ６３ＨＡｐをＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ株ＪＳ１５６９内にエレクトロポレーションにより移行させ（参考文献：Lebens 等.,Bio Technology 1993;11:1574-1578）、そして次に０．２Ｍトリス塩酸ｐＨ８．０の最小容量に再溶解し、ＰＢＳｐＨ７．２に対して透析した。
ｐＭＬ ＣＴＢ：：ＯＶＡｐをＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１中に移行させた（参考文献：Grodberg 等.,Bacteriol. 1998; 170:1245-1253）。使用したＣＴＢ遺伝子は原形質周囲への合成蛋白の輸送を指向するシグナルペプチドを欠いていた。このため、単量体としての生成物（ＣＴＢ：：ＯＶＡｐ）の原形質蓄積が起こり、これにより不溶性の封入体が形成された。これを６．５Ｍ尿素に溶解し、透析により再組立した（Ｌ’Ｈｏｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １９９０；８９：４７−５２）。
Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ ＦＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（バイオラッド，Ｃａ，ＵＳＡ）を用いながら、イオン交換（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑ カラム，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびＦＰＬＣゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６０カラム，ファルマシア バイオテック，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により、ＣＴＢ：：ＯＶＡｐおよびｐＣＢ５６ ６４ＨＡｐの融合蛋白を更に精製した。

ビオチニル化抗−ＣＴＢモノクローナル抗体を用いたＧＭ１ ＥＬＩＳＡによればＣＴＢ融合蛋白はＧＭ１結合活性を保有していたことがわかった。
免疫化および飼料の調製。皮膚表面免疫化のために、免疫化の２４時間前に、外科用ナイフを用いてＢａｌｂ／ｃマウスの腹部を剃毛した。次に動物にナトリウムペントバルビタール（６０ｍｇ／ｇマウス）（Ｓａｎｏｆｉ）を腹腔内注射することにより１時間麻酔し、免疫化溶液２００ｍｌを４ｃｍ２の表面積に渡って剃毛皮膚上に置き、１時間放置した。インキュベーションの後、マウスを水道水で十分洗浄した。第１、１４および２８日に三回の一連の皮膚表面免疫化を行った。マウスには更に、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）中に乳化した１００μｇのＯＶＡを用いて一方の足掌中に皮下注射して免疫化するか、他の実験ではＢａｌｂ／ｃマウスをＡｌ（ＯＨ）_３（Ｓｉｇｍａ）２μｇに吸着させた１０ｍｇのＯＶＡを用いて腹腔内で感作、惹起した。血清は免疫化前および後のマウスの尾静脈血から調製した。
ＩｇＥ抗体応答の誘導。第０日および１４日に、表１に示す各数値で示した時点において、Ｂａｌｂ／ｃマウスをＡｌ（ＯＨ）_３ゲル（ミョウバン，Ｓｕｐｅｒｆｏｓ，Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ， Ｋｖｉｓｔｇａａｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）２ｍｇに吸着させた１００μｇのＯＶＡを用いて腹腔内で感作、惹起した。血清は尾静脈血から調製した。

血清中ＩｇＧ濃度の測定。血清中のＣＴＢおよびＯＶＡに対する抗体は酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。要すれば、高結合９６穴ポリスチレンプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）をＣＴＢ（１００ｍｌ中０．１ｍｇ）またはＯＶＡ（１００ｍｌ中１ｍｇ）のいずれかで一夜室温（ＲＴ）でコーティングした後、２０ｍｇ／ｍｌＢＳＡで９０分間飽和させた。前工程を室温で行い、ＰＢＳ−ツイーン（０．０５％）で３回洗浄した。血清は２ｍｇ／ｍｌＢＳＡで連続希釈し、３時間コーティングされたウェル中でインキュベートした。洗浄後、プレートをＰＢＳ−ツイーン中に希釈されたＨＲＰ−標識やギ抗−マウス全ＩｇＧ（Ｓｏｕｒｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）と共に１時間インキュベートし、固相結合ＨＲＰ活性をＯＰＤおよびＨ２Ｏ２より成る発色基質を添加後にモニタリングし、４５０ｎｍの吸光度を分光光度計により分析した。ＯＶＡに対する特異的血清ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ抗体の濃度を検出するために、９６穴低結合ポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ， Ｒｏｓｋｉｌｄｅ， Ｄｅｎｍａｒｋ）をＯＶＡ（１０μｇ／ｍｌ０．１Ｍ ＮａＨＣＯ_３、一夜室温）でコーティングした。
連続希釈されたマウス血清を１時間インキュベートし、プレートをＰＢＳで洗浄した。固相結合抗体の検出は、上記したとおり、マウスＩｇＧまたはＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂに対するパーオキシダーゼ標識ヤギ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共にインキュベートし、最終的に酵素基質で展開することにより行なった。血清の力価は、バックグラウンドより０．４高値の吸光度を与える最も高い希釈度の逆数として表示した。ノンパラメトリックのＷｉｌｃｏｘｏｎ Ｍａｎｎ−Ｗｉｔｈｎｅｙの順位試験を用いて実験群の統計学的有意差を比較した。

血清中ＩｇＥ濃度の測定。血清中ＩｇＥの総濃度を固相サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。要すれば、９６穴の高結合ポリスチレンプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ， Ｌａｂｔｅｃｈｉｎｉｋ， Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）をＰＢＳ中２μｇ／ｍｌに希釈したマウスＩｇＥに対するラットモノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）で室温で一夜コーティングした。連続希釈したマウス血清を室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、ビオチニル化ラットモノクローナル抗−マウスＩｇＥ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）抗体試薬を添加し、室温で１時間インキュベートした。最後にパーオキシダーゼコンジュゲートアビジン（Ｓｉｇｍａ， Ｓ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）を１時間室温で添加した。プレートを洗浄し、Ｈ₂Ｏ₂およびオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）（Ｓｉｇｍａ）で展開し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。総ＩｇＥの濃度は精製されたマウスＩｇＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の既知量を用いた試験により得た標準曲線から外挿した。

リンパ球増殖
ＯＶＡ特異的増殖応答は、免疫化されたまたは対照のマウスから得たＤＬＮ細胞懸濁液の３連培養物を用いて測定した。細胞を９６穴培養プレートの平底ウェル当たり４ｘ１０^５個の密度で播種した。ＯＶＡ（２ｍｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下に７２時間３７℃でインキュベートした後、培養物を更に１８時間、１μＣｉの［^３Ｈ］チミジンでパルスした。或いは、ＣＴまたはＣＴＢを皮膚表面投与されたマウスまたは対照マウスのＤＬＮから単離した１０^４個のＭＬＮ ＤＣドデカペプチドＨＡ（インフルエンザヘマグルチニン由来ａａ１１１−１１９）の存在下または非存在下に２×１０^５個のトランスジェニックＴＣＲ−ＴＨ Ｔ細胞と共に７２時間培養し、最後の１８時間の培養中に１μＣｉの［^３Ｈ］チミジンでパルスした。培養物をセルハーベスターを用いてガラスフィルター上に回収し、取りこまれた放射性チミジンをβシンチレーションカウンターで測定した。

サイトカイン試験
ＯＶＡによるインビトロの刺激の後のＤＬＮから得た培養上澄みのＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−５含量について、Ｒ＆Ｄｄｕｏｓｅｔを用いたＥＬＩＳＡにより製造元の指示書に従って測定した。要すれば、高結合９６穴ポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を室温で一夜０．１Ｍリン酸塩緩衝液中の抗−ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−５コーティング抗体（２μｇ／ｍｌ）のいずれか１００μｌでコーティングし、その後、０．１２％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を含有する１％脱脂乳粉中６０分間飽和させた。全工程とも室温で行い０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。上澄みを１％脱脂乳を含有するＰＢＳＴで２〜５倍希釈し、室温で２時間インキュベートした。洗浄後、ＰＢＳＴ中ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４またはＩＬ−５に対するビオチニル化抗体（０．１μｇ／ｍｌ）に１時間ウェルを曝露し、ストレプトアビジンビオチニル化セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ複合体、Ａｍｅｒｓｈａｍ）および３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）／Ｈ₂Ｏ₂（Kirkegaard and Perry laboratories, Gaitherburg， ＭＡ）を段階的に添加して展開した。

受動皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）力価。循環系中の抗−ＯＶＡＩｇＥ抗体の濃度をＰＣＡにより測定した（参考文献：Ovary, Z., Ackroyd, J.F. eds. Immunological Methods. Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1964:259-84, Watanabe, N and Ovary, Z., J. Immunol. Meth., 14:381-90, 1977）。要すれば、Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットをＨｙｐｎｏｒｍ（商標名）（０．０３２ｍｇクエン酸フェタニルおよび１ｍｇフルアニソン／ラット）およびＳｔｅｓｏｌｉｄ、Ｎｏｖｍ（商標名）（０．５ｍｇ／ラット）で麻酔した。被験マウスの血清をＰＢＳで連続２倍希釈し、各希釈度の５０ｍｌをラットの剃毛ハイブリダイゼーション皮膚内に皮内注射した。７２時間の後、ラットに１％エバンズブルー（Ｓｉｇｍａ）含有発熱物質非含有ＰＢＳ１ｍｌ中に希釈した５ｍｇのＯＶＡで静脈内惹起した。１時間後、ラットを屠殺し、皮膚領域に青色の反応が出現しているかどうか調べた。ＰＣＡ力価は直径５ｍｍより大きい青色のスポットを与える血清の最高希釈度の逆数として定義した。

ＩｇＥ抗体のクラスの特徴は熱処理（５６℃４時間）によりその皮膚感作能が消失する点である（参考文献：Ovary, Z., J.Immunol.Meth., 14:381-90, 1977）。生理食塩水投与ＯＶＡ感作およびＯＶＡ惹起動物由来の任意に選択された血清の熱処理（５６℃３０分間）では、相当する血清のＰＣＡ活性が実質的に消失しており、測定されたＰＣＡ活性はほぼＩｇＥ抗体のみにより媒介されたものであることが示された。

表皮ＬＣおよびＤＬＮのＤＣの調製。マウスから採取した耳介を７０％エタノールで洗浄し、ピンセットを用いて背部側と腹部側に半分割し、３７℃で４５分間２０ｍＭＥＤＴＡの存在下５％ＦＣＳを含有するＰＢＳ中でインキュベートすることにより真皮から表皮を分離させた。次に表皮シートをスライドガラス上に搭載し、乾燥した。別法として、背部側と腹部側の半分を３７℃で４５分間５％ＦＣＳを含有するＰＢＳ中、０．５％トリプシン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）と共にインキュベートすることにより、真皮から表皮を分離させた。次に分離した表皮から細胞を機械的に抽出することにより表脾細胞懸濁液を調製したところ、ＬＣは総細胞数の０．５〜４％であった。

以前に記載されている単離方法（参考文献：Anjuere 等., Dendritic cell protocols, 2001; vol.64, Humana Press Inc., Tlowa,NJ.; Anjuere 等., Blood, 1999;93:590-598）に従ってＤＣをＤＬＮから精製した。要すれば、連続的に攪拌子ながら３７℃で１０分間５％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中、コラゲナーゼＡ（０．５ｍｇ／ｍｌ；ベーリンガーマインハイム（Boehringer-Mannheim），マインハイムドイツ（Mannheim, Germany））およびＤＮａｓｅＩ（０．４ｍｇ／ｍｌ，ベーリンガーマインハイム）でＤＬＮを消化した。消化したフラグメントをステンレスシーブで濾過し、洗浄後、細胞懸濁液を冷等張性ＯｐｔｉｐｒｅｐＴＭ溶液（Nyegaar Diagnostics, Oslo, Norway）、ｐＨ７．２、密度１．０６１ｇ／ｃｍ³中に再懸濁した。１０分間１７００ｘＧで遠心分離することにより初期細胞集団の約１％に相当する低密度画分を得た。次に抗−ＣＤ３（クローンＫＴ３−１．１）、抗−マクロファージ抗原Ｆ４／８０（クローンＣ１．Ａ３−１）、抗−ＢＢ２０（クローンＲＡ３−６Ｂ２）および抗顆粒球抗原Ｇｒ１（クローンＲＢ６−８Ｃ５）を含むｍＡｂの混合物を４℃で４０分間、回収された低密度細胞に投与することによりＴ直系細胞、Ｂ細胞、マクロファージおよび顆粒球を枯渇させた。望ましくない細胞は、抗−マウスＩｇおよび抗−ラットＩｇコーティング磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ， Dynal, Oslo, Norway）の１：１混合物と共に７：１のビーズ対細胞の比で４℃で３０分間インキュベートして磁気的に除去した。このようにして得られたＤＣ調製物の純度は８５％より高値であった。

ＵＶ−Ｃ照射によるＬＣのインビボ枯渇。マウスをペントバルビタールで麻酔し、その耳介をＵＶ−Ｃ光源（Ｇ４０Ｔ１０ＵＶランプ）から約３０ｃｍト成るように置き、４５分間照射した（総照射量：８０ｍＪ／ｃｍ²）。ＬＣの枯渇は表皮シートおよび表皮細胞懸濁液の両方をＭＨＣＩＩ染色することにより確認した。
パラフィン包埋耳横断切片の調製。マウスをＣＴまたはＣＴＢの皮膚表面投与の後種々の時点で屠殺し、その耳介を切開した。次に耳介を抗原の温存が可能な方法を用いて低融点のパラフィンに包埋した（参考文献：Becksteadt et al., J.Histochem. Cytochem. 1994;42:1127-1134）。要すれば、耳介を酢酸亜鉛（０．５％）および塩化亜鉛（０．５％）を含有するトリス酢酸カルシウム緩衝液中４℃で一夜固定し、アセトン溶液（７０％および１００％）で脱水した。次に標本を低融点パラフィンワックス（ＢＤＨ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， 融点３７〜３９℃）に包埋した。１０μｍの連続切片を調製し、顕微鏡のスライドガラス（Ｓｔａｒｆｒｏｓｔ）に移した。スライドガラスを室温で一夜乾燥し、４℃で保存した。

免疫組織化学的検討。
スライドガラスを３分間アセトンで脱ワックス処理し、ＰＢＳで洗浄した。切片に防水ペン（Ｄａｋｏ）で丸を付した。非特異的結合部位を室温で３０分間ＰＢＳ中に希釈した１０％ウシ胎児結成（ＦＣＳ）でブロッキングした。次に切片を室温で１時間同じ濃度のビオチンコンジュゲート抗−ＭＨＣＩＩモノクローナル抗体（クローン２Ｇ９、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）（１μｇ／ｍｌ）またはアイソタイプの対照抗体（クローンＢ３９−４、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共にインキュベートした。特異的染色は、ＡＢＣ−ＨＲＰ複合体と共に３０分間インキュベートし、その後発色基質（Ｈ_２Ｏ₂および３−アミノ−９−エチルカルバゾール；Ｈ₂Ｏ₂−ＡＥＣ）と共にインキュベートすることにより明らかにした。スライドガラスをヘマトキシリンエオシンで逆染色した。

フローサイトメトリー。
ＤＣのサブ集団の表現型分析は、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）−コンジュゲート抗−ＣＤ１１ｃ（クローンＮ４１８、実験室で調製）、フィコエリスリン（ｐｅ）コンジュゲート抗−ＣＤ８ａ（クローン５３−６‐７２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびビオチンコンジュゲート抗−ＣＤ１１ｂ（クローンＭ１／７０、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗−Ｂ７−１（クローン１６−１０Ａ１、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗−Ｂ７−２（クローンＧＬ１、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗−ＣＤ４０（クローン３／２３、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いた３重染色、次いでストレプトアビジントリカラー（Ｃａｌｔａｇ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ）処理の後に行なった。ＬＣの分析は、ＰＥ−コンジュゲート抗−ＭＨＣＩＩ（クローン２Ｇ９、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびフルオレセインコンジュゲート抗−ＣＤ１１ｃ、ビオチンコンジュゲート抗−Ｂ７−１、ビオチンコンジュゲート抗−Ｂ７−２、ビオチンコンジュゲート抗−ＣＤ４０を用いた二重染色、次いでストレプトアビジントリカラー処理の後に行なった。全ての染色肯定は５ｍＭＥＤＴＡおよび２％ＦＣＳを含有するＰＢＳ中０〜４℃で行った。分析はＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏ．， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）を用いて行った。

統計学的処理。
データはノンパラメトリックのＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙまたはＦｉｓｈｅｒのｅｘａｃｔ試験により比較し、両側でｐ値＜０．０５を有意とした。
実施例１：ＣＴおよびＣＴＢは共にそれらに対する強力な血清抗体応答を経皮的に誘導する。
皮膚に局所投与された場合、ＣＴＢはそれ自体への特異的な抗体の生産の誘導においてＣＴと同等に効率的であった（図１Ａ）。３回の皮膚表面投与の後、全てのマウスは１００００以上の抗−ＣＴＢ抗体力価で応答した。
実施例２：同時投与ＯＶＡへの全身抗体応答の促進においてＣＴＢはＣＴよりも低効率である。

ＣＴと比較した場合のＣＴＢがプロトタイプの同時投与抗原（ＯＶＡ）への全身抗体応答を促進する能力を評価した。図１Ｂに示すとおり、ＣＴＢと共にＯＶＡを局所適用した場合、顕著な抗ＯＶＡＩｇＧの生産（幾何平均力価＝７２０）がもたらされたのに対し、皮膚に投与されたＯＶＡはそれ自体に対するＩｇＧの生産を誘導できなかった（力価は１０以下）。しかしながら、ＣＴＢと同時投与されたＯＶＡにより誘導された抗ＯＶＡ応答の程度はＣＴと共にＯＶＡにより誘発された数値（幾何平均力価＝３５００）よりも５倍低値であった（図１Ｂ）。その場合でも、抗ＯＶＡ特異的抗体の後者の濃度はミョウバン中のＯＶＡの腹腔内注射により誘導された濃度よりも低値であった（図１Ｂ）。

実施例３：ＯＶＡとＣＴまたはＣＴＢのいずれかとの同時投与は連絡リンパ節内および遠位の全身部位の両方において旺盛なＯＶＡ特異的Ｔ細部尾増殖応答をもたらす。
免疫化の皮膚表面部位に連絡するリンパ節（ＤＬＮ）由来および脾臓由来の細胞における特異的増殖応答を評価した。このために、この細胞のＯＶＡ誘導増殖を、３回の連続皮膚表面免疫化後の２ｍｇ／ｍｌのＯＶＡによるインビトロ再刺激の間に測定した。
ＣＴまたはＣＴＢと共にＯＶＡを局所適用する事により、ＤＬＮ細胞において同様に強力な抗−ＯＶＡ増殖応答が起こった（図２Ａ）。これらの応答は、未関連の蛋白抗原ＬＡＣＫに対するインビトロの応答がないことにより示されるとおり、ＯＶＡに対して特異的なものであった（データ示さず）。興味深い事に、ＯＶＡおよびＣＴまたはＣＴＢの皮膚表面投与は、細胞応答を誘導するのに極めて強力であることが知られている治療であるＣＦＡ中のＯＶＡの皮下注射と同様に、抗−ＯＶＡ増殖応答誘導において効率的であった。

更にまた、ＣＴまたはＣＴＢのいずれかの存在下にＯＶＡと組み合わせたＴＣＪは脾臓においても同様に強力な抗−ＯＶＡ増殖応答をもたらした（図２Ｂ）。同等のＯＶＡ特異的増殖応答がＣＴＢ−ＯＶＡコンジュゲートの局所適用後も観察され、ＯＶＡの経皮輸送はＯＶＡからＣＴＢの共有結合によるカップリングに依存していないことが示された。

実施例４：ＣＴＢは卵白アルブミンに対する皮膚表面誘導されたＩｇＥ応答を抑制する。
マウスを遊離のＯＶＡ単独か、またはＣＴまたはＣＴＢのいずれか５０μｇと同時に投与されるＯＶＡのいずれかで、２日おきに２週間、皮膚表面から免疫化した。最後のＴＣＩの３週間後、動物をアルム吸着ＯＶＡで全身感作した。血清を感作３週間後に採取し、その抗−ＯＶＡレアギン性抗体力価をラットレシピエントにおけるＰＣＲにより測定した。図４Ａに示されるとおり、皮膚表面ＣＴは高抗−ＯＶＡＩｇＥを強化したが、ＣＴＢの皮膚表面投与ではＯＶＡのみで皮膚表面免疫化した対照動物と比較してＰＣＡ力価が低下していた。
ＣＴＢと組み合わせられたＴＣＩが感作マウスにおけるアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体応答を抑制するかどうかを調べるために、第１日および第１４日にミョウバン吸着ＯＶＡの腹腔内注射によりマウスを感作し、惹起した。ＯＶＡ単独またはＣＴまたはＣＴＢのいずれかとの同時投与を第１２週から第１６週まで、即ちブースター注射の前２週間前と後、連続４週間、週３回行なった。ＰＣＡ力価をＯＶＡブースター注射の直前および３週間後に測定した。図４Ｂに示されるとおり、ＯＶＡおよびＣＴＢと組み合わせたＴＣＩは対照マウスと比較して大部分の動物（６／７）においてＩｇＥ応答を有意に抑制した（ｐ＜０．０２）が、ＣｔはＩｇＥ応答を抑制せず、逆にＩｇＥ力価を増大させた。

実施例５：ＣＴＢはＴｈ２依存性応答に影響することなくＴｈ１誘発応答を強化し、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γの生産を増大させる。
ＯＶＡによるインビトロ再刺激の後に、ＯＶＡ単独またはＯＶＡとＣＴまたはＣＴＢの組み合わせを用いた回連続ＴＣＩの後のＤＬＮまたは脾細胞により生産されるサイトカインを分析した。図３および表１に示されるとおり、ＣＴＢは、対照マウスと比較して免疫化されたマウスの脾細胞により生産される、そして程度はより低いがＤＬＮ細胞により生産されるＩＬ−２およびＩＦＮ−γの生産を選択的に強化した。このような投与は一方において、インビトロのＯＶＡ誘導ＩＬ−４およびＩＬ−５応答は増大させなかった。一方、ＣＴＢと共に抗原を同時投与したものは、ＩＬ−４およびＩＬ−５濃度を誘導せず、これはＤＬＮにおいてＯＶＡ単独（または未免疫化対照Ｔ細胞）による誘導とは異なっていた。
これとは対照的に、ＣＴは脾細胞によるＴｈ−１（ＩＦＮ−γ）およびＴｈ−２（ＩＬ−４、ＩＬ−５）サイトカインの両方の生産を強化した（表１）。同様の結果がＤＬＮ細胞においても得られた（図３）。更にまた、ＣＴＡとＣＴＢの混合物によるＴＣＩはＣＴによる誘導と同等のＴＨ１（ＩＦＮ−γ）およびＴｈ２（ＩＬ−４およびＩＬ−５）サイトカインの濃度を誘導した。興味深いことにＯＶＡに対して検出可能な抗体応答および増殖応答を誘導できなかったＯＶＡおよびＣＴＡを用いたＴＣＩは、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−４およびＩＬ−５）の生産を選択的に増強し（下記表１）、皮膚を通過する遊離のＩＶＡの経路をＣＴＡは貫通および／または促進することが示唆された。

表１のデータはＯＶＡに４８時間曝露された脾細胞の３連培養において測定されたサイトカインの算術平均値として示し、３回の実験の代表である。

実施例６：表皮表面のＣＴおよびＣＴＢの投与は表皮中のＬＣ数を増大させた。
耳介皮膚へのＣＴおよびＣＴＢの局所適用が表皮のＬＣ密度に影響するかどうかを調べた。ＣＴおよびＣＴＢの皮膚表面投与後９０分にマウス耳介から表皮シートを摘出し、酵素免疫組織化学的染色を行った後にＭＨＣＩＩ＋細胞を計数することによりシート中のＬＣ数を評価した。図５Ａに示されるとおり、ＣＴまたはＣＴＢ２０μｇの皮膚表面投与により対照の表皮シートと比較してＬＣが２０％および５０％増大した。
更にまた、表皮におけるＬＣの代謝回転は遅いことが知られているため、本発明者等はＬＣの枯渇を誘発するのに最も有効なＵＶ処置であることが報告されているＵＶ−Ｃ商社への皮膚の曝露により皮膚表面投与の前に常在ＬＣの部分的排除を誘発した（参考文献：Anjuere 等., Blood 2000;96:1633-1637; Nithiuthai, Immunology, 1984;51:143-156）。

即ち、４５分間のＵＶ−Ｃ照射の３６時間後、マウスにＣＴまたはＣＴＢを投与し、その後緩衝液投与対照マウスにおけるＬＣ数と比較して表皮中のＬＣ数を測定した。免疫組織化学的染色後の表皮シートおよびＭＨＣＩＩおよびＣＤ１１ｃ分子に特異的な蛍光抗体による染色後の表皮細胞懸濁液の両方のＭＨＣＩＩ＋ＬＣを計数し、フローサイトメトリー分析を行った。図５Ｂに示すとおり、対照と比較して、ＵＶＣ照射はＬＣの５０％枯渇をもたらし、ＣＴおよびＣＴＢの投与はそれぞれ３倍および２倍多いＬＣの集中をもたらした。ＬＣ密度の同様の相違が表皮シートにおいて観察された（データ示さず）。更にまた、ＭＨＣＩＩ線食後、ＣＴおよびＣＴＢ投与マウスの表皮シートはＭＨＣＩＩ＋ＬＣ細胞の多くのクラスターを示していた（データ示さず）。

ＣＴおよびＣＴＢの局所投与により誘導されるＬＣの集中の速度論を検討するために、ＣＴおよびＣＴＢの皮膚表面投与後２０、４０、９０および１８０分の皮膚横断切片を調製し、ＬＣの出現頻度および局在化について、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ１１ｃおよびＤＥＣ−２０５に特異的なモノクローナル抗体による染色、次いで、免疫酵素的検出により分析した。図５Ｃに示すとおり、対照マウスにおいては、真皮および表皮の両方において抗−ＭＨＣＩＩ抗体による染色が観察された。ＣＴまたはＣＴＢのいずれかの投与後４０分もの早期において、クラスターとして組織化され、耳介横断切片の真皮表皮接合部に特に局在化したＭＨＣＩＩ＋細胞の蓄積が観察されたが、対照マウスと比較して表皮により多くのＭＨＣＩＩ＋細胞が存在した。この蓄積はＣＴまたはＣＴＢの皮膚表面適用後３時間にむしろより顕著となり、少なくとも５時間持続した（表２）。結果は希釈剤（ＰＢＳ）を投与した対照マウスと比較した場合のＣＴおよびＣＴＢ投与マウスにおけるＬＣ数の％増大として表示する。更にまた、連絡リンパ節のＣＤ１１ｃ、ＭＣＨクラスＩＩ＋細胞のフローサイトメトリーによる分析によれば、ＣＴはリンパ節のＤＣ数を増大させたが、ＣＴＢは指せなかったことがわかった（表２）。ＣＴで観察されたこのような増大は、投与後２４時間に最大トなり、４８時間までに徐々に減少した。

実施例７：皮膚表面ＣＴおよびＣＴＢ投与は表皮の成熟状態を異なる態様で修飾した。
ＬＣの成熟状態は、ＬＣ懸濁液の染色後のフローサイトメトリーにより同時刺激分子Ｂ７−１、Ｂ７−１およびＣＤ４０、並びにＭＨＣＩＩ分子の発現濃度の分析を行なうことにより、これら分子に特異的な蛍光モノクローナル抗体に関して前述したとおり調べた。図６Ａに示すとおり、ＣＴおよびＣＴＢの局所適用後、９０分では対照ＬＣと比較して、ＬＣによるＢ７−２発現の２倍低下、および、ＣＤ４０およびＢ７−１発現の３倍低下が観察された。即ち、ＣＴおよびＣＴＢの皮膚表面投与後の皮膚におけるＬＣ密度の急速な増大は表皮における成熟度の低い移入細胞の集中に相関していると考えられる。更にまた、ＣＴの皮膚表面投与後２０時間には、ＬＣによるＢ７−１発現の２倍増大が観察され（６Ｂ）、これに対し、ＣＴＢはＢ７−１、Ｂ７−２またはＣＤ４０分子の何れのアップレギュレーションも誘導しなかった。ＭＨＣＩＩの発現は何れの場合も有意に影響されなかった（データ示さず）。

実施例８：皮膚表面ＣＴおよびＣＴＢ投与はインビトロのＤＣの免疫刺激性に影響した。
ＬＣは連絡リンパ節（ＤＬＮ）に移行し、そこで成熟ＤＣとして免疫応答を誘導することができることに関して多くの報告がある。連絡リンパ節において、皮膚へのＣＴおよびＣＴＢの局所投与の免疫モジュレート作用を調べるために、ＣＴまたはＣＴＢを２４時間前に皮膚表面投与したマウスまたは対照マウス由来の連絡リンパ節ＤＣ（ＤＬＮＤＣ）のインビトロ免疫刺激性を調べた。４日間の抗原依存性増殖においてインビトロでナイーブなトランスジェニックＴＣＲ−ＨＡのＴ細胞の増殖を誘導するＤＬＮＤＣの能力を調べた。図７に示すとおり、ＣＴおよびＣＴＢを皮膚表面投与したマウスから単離したＤＬＮＤＣは、ＰＢＳ投与対照マウスから単離したＤＣよりも、ナイーブなＴ細胞の増殖の誘導において、それぞれ５０％および２５％より効率的であった。

次に、ＣＴおよびＣＴＢ投与マウス由来のＤＬＮＤＣサブセットによる同時刺激分子Ｂ７−１、Ｂ７−２およびＣＤ４０の発現を調べた。図８Ａに示すとおり、ＤＣの３種類の異なるサブセットが見とめられ、これらは免疫化の皮膚表面部位に連絡する末梢リンパ節（鼡径部、腋窩および耳介リンパ節）におけるＣＤ８ａおよびＣＤ１１ｂの異なる発現に基づきＣＤ８＋、ＣＤ８ｉｎｔおよびＣＤ８−として形成されていた。ＣＤ８＋ＤＣ、ＣＤ８ｉｎｔＤＣ、およびＣＤ８−ＤＣはそれぞれ全ＤＣの５％、７６％および１６％であった。図８Ｂからわかるとおり、ＣＴ投与マウスのＤＣサブセットは全て、対照およびＣＴＢ投与ＤＣと比較して、１．６のファクターでＢ７−２同時刺激分子の発現をアップレギュレートしていたが、そのＣＤ４０発現は僅かにダウンレギュレートされていた（図８Ｂ）。一方、ＣＤＢは３つのＤＬＮＤＣサブセットの何れによるＢ７−２またはＣＤ４０の発現の検出可能な変化も誘導しなかったが、ＣＤ８＋ＤＣのみによるＢ７−１の発現は２倍増大させた。全ての場合において、Ｂ７−１、Ｂ７−２およびＣＤ４０の発現の濃度はＬＣによる発現濃度よりも高値であり（図６）、これはそのより成熟した状態と合致していた。

実施例９：ＣＴＢと融合したアレルゲン誘導ペプチドの経皮投与はＣＴＢと混合した場合よりも高度にネイティブアレルゲンＯＶＡへのＩｇＥ応答を抑制する。
６〜８匹のＢａｌｂ／ｃマウスの群に、第０、第１、第２、第３および第４日の連続５回、局所皮膚適用により１０μｇのＯＶＡｐまたは６０μｇのＣＴＢ：ＯＶＡｐ融合蛋白と混合したＣＴＢ５０μｇを投与した。最終適用の５日後（第１０日）、ミョウバン中１０μｇのＯＶＡ蛋白をマウスに腹腔内注射した。対照として、別の群のマウスには無関係の融合蛋白（ＣＴＢ：ＨＡｐ），ＯＶＡペプチドのみ、ＣＴＢのみまたはベヒクル（ＰＢＳ）のみを投与した。ＰＣＡ力価はＯＶＡ／ミョウバン注射の直前および３週間後に測定した。

表３に示すとおり、ＣＴＢと混合した、または遺伝子融合蛋白としてＣＴＢにコンジュゲートしたＯＶＡペプチドの投与により、ＩｇＥ抗体応答を抑制することができた。ＯＶＡペプチド単独または無関係の遺伝子融合蛋白と組み合わせた投与ではこのような応答を抑制することはできなかった。即ち、アレルゲンＯＶＡの配列に由来し、ＣＴＢと混合された遊離の形態、またはＣＴＢと連結されて皮膚上に与えられた短ペプチドは、ネイティブのアレルゲンの全身注射により誘導されるアレルギー応答を抑制することができた。

実施例１０：アルデヒド修飾コレラ毒素は毒性を消失し、ＩｇＥ抗体応答の抑制特性を獲得する。
グルタルアルデヒドによるコレラ毒素の処理：コレラ毒素（１ｍｇ）（ＬＩＳＴ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を０．０１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ６．８中０．０５、０．２または０．５％（終濃度）のグルタルアルデヒド（シグマケミカル（Sigma Chemicals），Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と共に２時間インキュベートした。次に蛋白を０．１ＭＮａＨＣＯ₃緩衝液ｐＨ８に対して４℃で一夜透析した。
ホルムアルデヒドによるコレラ毒素の処理：コレラ毒素（１ｍｇ）を０．１、０．５、または２．５％パラホルムアルデヒド（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）と共に４℃で１時間インキュベートし、使用時まで凍結保存した。
ＧＭ１結合活性を測定するために、アルデヒド修飾ＣＴ調製物をＬＴＢに対するビオチニル化抗体を用いた固相ＧＭ１ＥＬＩＳＡにより試験した。
毒性を測定するために、アルデヒド修飾ＣＴ調製物を発熱物質非含有生理食塩水に対して４℃で一夜透析し、各調製物１０マイクログラムを含有する生理食塩水２０マイクロリットルをＢａｌｂ／ｃマウスの右後肢手掌部に注射した。４時間後、カリパスを用いて浮腫応答を測定し、未修飾のコレラ毒素１マイクログラムを注射したマウスの所見と比較した。データはコレラ毒素投与動物の手掌浮腫の％として表示した。
表４に示すとおり、グルタルアルデヒドでＣＴを処理することにより毒素の毒性は用量依存的に漸減した。０．２％の濃度において、毒性は本質的に焼失したが、トキソイドはＧＭ１結合活性を温存していた。同様に、０．５％以上の濃度のホルムアルデヒドによるＣＴの処理も同じ作用を示した。

グルタルアルデヒドまたはホルムアルデヒドで修飾されたＣＴがＯＶＡへのアレルギー応答を抑制することができるかどうか調べるため、マウスを、第０日、第４日および第１０日にＯＶＡと共に０．２％グルタルアルデヒドまたは０．５％ホルムアルデヒドのいずれかで修飾したＣＴ（投与当たり５０マイクログラム）の連続３回皮膚表面投与に付した。第１４日に、マウスにミョウバン吸着ＯＶＡを腹腔内注射することによりＩｇＥ応答を誘発した。グルタルアルデヒドまたはホルムアルデヒド修飾ＣＴを投与した動物においてはＩｇＥ応答は抑制されたが、ネイティブのＣＴで同様に処理された動物では応答は擬似免疫化マウスと比較してむしろ増強されていた（表５）。

上記所見に鑑み、本発明はまた、局所投与用のアレルゲン、非ＡＤＰリボシル化毒素またはサブユニット、および、アルデヒドを含有する製剤も意図する。
考察
本明細書に記載したものは、ＣＴホロトキシンおよびＣＴの非毒性の受容体結合部分ＣＴＢの両方が、皮膚に適用された場合に、皮膚障壁を貫通し、そして、重要な点は、同時に投与された混合または連結された異種の抗原に対し、通過促進および／または別の手段による免疫応答増強をもたらすことができることを示す実験である。従って、ＣＴおよびＣＴＢの両方を皮膚表面適用すると、それらに対し、そして同時投与された異種の抗原に対しても免疫応答が誘導される。しかしながら、異種抗原に対して強力な体液性および細胞性の応答の両方を誘発したＣＴとは対照的に、ＣＴＢと共に適用した抗原を用いたＴＣＩは旺盛な全身性Ｔｈ１細胞応答の発生には寄与するが、プロトタイプの蛋白抗原への全身抗体応答の促進においては、僅かな効率性しか示さない。意外にも、ＣＴＢと共に適用した抗原を用いたＴＣＩは、樹立されたＩｇＥ媒介性のアレルギー免疫応答を抑制できたのに対し、ＣＴと共に適用した抗原を用いたＴＣＩはアレルギー免疫応答を増強した。

これらのデータは、ＣＴは皮膚に同時投与された場合に種々の可溶性蛋白抗原に対する体液性および細胞性の免疫応答の誘導のための効果的なアジュバントとして機能できるという最近の報告を裏付けている（参考文献：Glenn 等., Nature 1998; Glenn 等., Immun. 1999;67:1100-1106; Glenn 等., Nature Med. 2000;6:1403-1406）。この研究はまた、ホロトキシンのＡＤＰリボシル化活性がそれ自体または同時に投与された蛋白抗原が表皮を通過することを可能とするために重要であるとは考えられず、むしろ、アレルギー応答の増強に関与していると考えられる。即ち、毒素およびそのＢサブユニットがＧＭ１受容体に結合する能力は表皮を通過するこれらの分子の輸送に関与する最も重要な因子であると考えらえる。

皮膚へのＣＴの局所適用後に発生する全身性のＩｇＧ抗体応答は、アイソタイプの分布は同等であったがＣＴＢで観察されたものよりも程度において優れていたという観察結果は、意外なものではない。実際、ＣＴは粘膜（参考文献：Elson 等., J.Immunol. 1984;133:2892-2897; Lycke 等., Immunology 1986;59:301-308）または全身（参考文献：Holmgren et al., Immunol Commun 1976;737-756）経路により投与された場合には強力なアジュバントであるが、ＣＴＢはこれらの経路で投与された場合アジュバント活性は有さないと考えられる。これらの観察結果は、体液性免疫応答のためのＣＴまたはＬＴのアジュバント特性はその酵素敵、ＡＤＰリボシル化活性に主に関っていると考えられるという指摘（参考文献：Lycke 等., Eur.J.Immunol. 1992;22:2277-2281）。

ＣＴＢは皮膚に同時投与された場合に同時投与された抗原に対する中等度の全身性抗体応答を促進し、そして同時投与の反復を要するが、それは細胞媒介免疫応答のための意外にも強力なこれまで知られていなかったアジュバントとしての挙動を示す。この点に関し、ＣＴＢおよびプロトタイプ抗原への皮膚曝露により誘導される増殖性応答の程度はＣＴの存在下に同じ抗原の皮膚曝露により誘導されるものと同等であった。このＣＴＢ誘導応答はまた、細胞免疫応答の誘導のための最も強力なアジュバントの１つであるフロイントの完全アジュバント中で同じ抗原を全身注射した後に観察されたものとも同等であった。
皮膚を通して同時投与された抗原への全身体液性ｖｓ細胞媒介性の免疫応答に対するＣＴＢおよびＣＴの一貫しない活性は、ＣＴＢはＣＴのようにＴｈ１サイトカインの生産は増強するが、ＣＴとは異なりＴｈ２サイトカイン生産に影響しないという観察結果と矛盾しない。これらの観察結果は本実験（図５）およびプロトタイプアレルゲンと共にＣＴを皮膚表面適用することにより全身ＩｇＥ抗体応答（Ｔｈ２応答の原型）に関してマウスを感作できるが、同じ経路で同時適用したＣＴＢはこのような応答を誘発できず、そして実際、これらの応答を抑制することを示した別の研究の両方の結果を説明しているとも言える。

全ＣＴのアルデヒド処理により毒性は抑制されるがＧＭ１結合は維持され、アレルゲンとの皮膚同時適用の場合の抗−ＩｇＥ活性に関っていたという観察結果は、ネイティブのＣＴの毒性活性が前Ｔｈ２活性と関っているという指摘を裏付けるものである。
皮膚の同時適用された抗原への細胞媒介免疫応答に対するＣＴおよびＣＴＢの齢学的なアジュバント活性は部分的には、曝露された表皮へのＤＣの急速な集中とその後の上皮からＤＬＮへの退出を誘導するそれらの能力と関っていると考えられる。この点に関し、ＣＴまたはＣＴＢへの皮膚のばく露は表皮、そして特に伏在する真皮におけるＤＣ密度の急速な上昇に関っていた。更にまた、ＣＴまたはＣＴＢに曝露された表皮シートから単離したＤＣの表現型の分析によれば、ＭＨＣＩＩおよびＣＤ１１ｃを発現する細胞の出現頻度が増大し、ＣＤ４０、Ｂ７．１およびＢ７．２の発現は低下していることが解かった。未成熟のＤＣに特徴的なこの表現型は、ＣＴまたはＣＴＢの投与後に表皮に移行したＤＣの大部分が主に皮膚起源のものであることを示唆しており、そして、未成熟ＤＣにより新たに構成された表皮ＤＣの成熟特性の全体的低下を説明すると考えられる。

ＣＴＢとは異なりＣＴの投与はＤＬＮからの樹状細胞に対するＢ７．２の増強された発現およびＩＬ−４およびＩＬ−５の増強された生産をもたらしたという所見は、Ｂ７．２がＣＤ４＋Ｔｈ２細胞の優先的刺激と関っているという指摘と合致している（参考文献：Freeman 等., Immunity. 1995; 2:523-532）。
異なる刺激の作用のもと、ケラチノサイトは、ＬＣおよびＤＣの遊走挙動および分化に影響するサイトカイン（顆粒球ーマクロファージ刺激因子／ＧＭ−ＣＳＦ；ＴＮＦ−α）およびケモカイン（ＭＣＰ−１を分泌することが解かっている（参考文献：Bos 等., Immunol. Today. 1994;14:75-78）。
これらのデータは、ＣＴおよびＣＴＢ投与マウスの皮膚上皮細胞が、表皮ＬＣの移動（参考文献：Charbonnier 等., J.Exp.Med.1999;190:1755-1768）、および皮膚へのＬＣ前駆体の誘引（参考文献：Dieu-Nosjean 等., J.Exp.Med.2000;192:705-718）において主要な役割を果たすケラチノサイトにより生産されるケモカインであるＭＩＰ−３αｍＲＮＡを高濃度で発現することを示す以前の試験（参考文献：Nakayama 等., Int. Immunol. 1001;13:95-103）と合致している。

本明細書に記載したとおり、ＴＨ１およびＴｈ２誘発応答に対するＣＴのアジュバント特性にはそれぞれＢおよびＡサブユニットに付随する異なる構造的決定因子が関っている。ＣＴＢは粘膜経路で投与されれば全身Ｔｈ１応答を抑制するが、皮膚表面経路で投与されるとこれらの応答を強化するという事実は、免疫調節における上皮ミクロ環境の役割を強調するものである。
本発明は記載した特定の実施態様により範囲を限定されるわけではない。実際、前述の説明および添付した図面から、当業者には本明細書に記載したもののほかに本発明の種々の変更が明らかであろう。このような変更は添付した請求項の範囲内に含まれるものである。
更に、全ての数値は概数であり、説明を目的としている、
本明細書中を通じて特許、特許出願、参考文献、製品の説明書およびプロトコルを引用したが、その開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

アレルゲンに関する付属表を以下の表６〜２３に示し、付属表等に関する参考文献を表２４〜３６に示す。

付属Ａ

図１Ａは、ＣＴまたはＣＴＢと共にＯＶＡで経皮免疫化した後の血清抗体応答を示すグラフ図である。 図１Ｂは、ＣＴまたはＣＴＢと共にＯＶＡで経皮免疫化した後の血清抗体応答を示すグラフ図である。 図２Ａは、ＣＴまたはＣＴＢの存在下のＯＶＡの皮膚表面免疫化の後の部分的（連絡リンパ節）および全身（脾臓）の増殖応答を示す図である。 図２Ｂは、ＣＴまたはＣＴＢの存在下のＯＶＡの皮膚表面免疫化の後の部分的（連絡リンパ節）および全身（脾臓）の増殖応答を示す図である。 。 図３のＡ〜Ｄは、ＣＴおよびＣＴＢ、並びにＣＴまたはＣＴＢの存在下に卵白アルブミンを皮膚表面免疫化した後、連絡リンパ節細胞および脾細胞によるＴｈ１およびＴｈ２サイトカイン生産に対する図である。 図４は、ＣＴＢ存在下のＯＶＡの予備皮膚表面投与による全身ＩｇＥ応答の予防を示す図である。 図５Ａは、フィラキシー力価（ＰＣＡ）により分析したＣＴまたはＣＴＢ投与により表皮シート中のＬＣ数が増大するグラフ図である。 図５Ｂは、フィラキシー力価（ＰＣＡ）により分析したＣＴまたはＣＴＢ投与により表皮シート中のＬＣ数が増大するグラフ図である。 図５Ｃは、フィラキシー力価（ＰＣＡ）により分析したＣＴまたはＣＴＢ投与により表皮シート中のＬＣ数が増大する免疫組織化学的染色のＭＣＨＩＩ＋細胞を同定した図である。 図６Ａ及びＢは、ＣＴの皮膚表面投与における表皮樹状細胞に対する同時刺激分子Ｂ７−１およびＢ７−２のアップレギュレーションを誘導するがＣＴＢは誘導しない、マウスにＣＴ（２０μｇ）（水平線棒グラフ）、組み換えＣＴＢ（２０μｇ）（斜線棒グラフ）またはＰＢＳ（対照）（黒色棒グラフ）を投与し、皮膚表面投与後９０分（Ａ）または２４時間（Ｂ）に表皮シートを調製したものを示す図である。 図７は、皮膚表面のＣＴおよびＣＴＢの投与におけるＤＬＮＤＣによるナイーブのＴ細胞の抗原特異的増殖を強化し、耳介、鼡径部および腋窩の連絡リンパ節由来のＤＣをＣＴ（水平線棒グラフ）、ＣＴＢ（斜線棒グラフ）またはＰＢＳ（黒色棒グラフ）を皮膚表面適用することにより投与した動物から精製したものを示す図である。 図８Ａは、ＣＴおよびＣＴＢの皮膚方面投与における連絡リンパ樹状細胞上のＢ７−１、Ｂ７−２およびＣＤ４０の同時刺激分子の発現に対し、耳介、鼡径部および腋窩の連絡リンパ節由来のＤＣをＣＴ（水平線棒グラフ）、ＣＴＢ（斜線棒グラフ）またはＰＢＳ（黒色棒グラフ）を皮膚表面適用することにより投与した動物から精製したものを示す図である。 図８Ｂは、ＣＴおよびＣＴＢの皮膚方面投与における連絡リンパ樹状細胞上のＢ７−１、Ｂ７−２およびＣＤ４０の同時刺激分子の発現に対し、耳介、鼡径部および腋窩の連絡リンパ節由来のＤＣをＣＴ（水平線棒グラフ）、ＣＴＢ（斜線棒グラフ）またはＰＢＳ（黒色棒グラフ）を皮膚表面適用することにより投与した動物から精製したものを示す図である。 図８Ｃは、ＣＴおよびＣＴＢの皮膚方面投与における連絡リンパ樹状細胞上のＢ７−１、Ｂ７−２およびＣＤ４０の同時刺激分子の発現に対し、耳介、鼡径部および腋窩の連絡リンパ節由来のＤＣをＣＴ（水平線棒グラフ）、ＣＴＢ（斜線棒グラフ）またはＰＢＳ（黒色棒グラフ）を皮膚表面適用することにより投与した動物から精製したものを示す図である。

Claims (17)

1. 哺乳類におけるＩｇＥ媒介過敏性アレルギー反応を抑制するための治療を必要とする哺乳類に経皮投与される経皮投与用治療薬であって、下記成分：
   ａ）アレルゲン少なくとも１種；および、
   ｂ）コレラ毒素Ｂサブユニット及びＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素Ｂサブユニットから選択される少なくとも１種以上の非ＡＤＰリボシル化毒素またはそのサブユニット、
   を含有し、ａ）およびｂ）の量は共に該アレルギー反応を抑制するために有効である組成物、を包含する経皮投与用治療薬。
2. 該アレルゲンが蛋白である請求項１記載の治療薬。
3. 該アレルゲンがペプチドである請求項１記載の治療薬。
4. 該非ＡＤＰリボシル化毒素サブユニットが、Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素Ｂサブユニットである請求項１記載の治療薬。
5. 該アレルゲンおよび該非ＡＤＰリボシル化毒素またはサブユニットが化学的に連結される請求項１記載の治療薬。
6. 該アレルゲンおよび該非ＡＤＰリボシル化毒素またはサブユニットが遺伝子的に融合される請求項１記載の治療薬。
7. 該アレルゲンおよび該非ＡＤＰリボシル化毒素またはサブユニットが混合される請求項１記載の治療薬。
8. 該アレルゲンおよび該非ＡＤＰリボシル化毒素またはサブユニットがパッチを使用して投与される請求項１記載の治療薬。
9. 該組成物と共にアジュバントを投与することを更に包含する請求項１記載の治療薬。
10. 複数のアレルゲンを投与することを更に包含する請求項１記載の治療薬。
11. 該非ＡＤＰリボシル化毒素サブユニットがコレラ毒素Ｂサブユニットである請求項１記載の治療薬。
12. 該アレルゲンが食物アレルゲン、植物アレルゲン、花粉アレルゲン、樹木アレルゲン、動物アレルゲン、寄生虫アレルゲン、ダニアレルゲン、細菌アレルゲン、ウィルスアレルゲン、マイコプラズマアレルゲン、カビアレルゲン、薬物アレルゲンおよび職業上のアレルゲンよりなる群から選択される請求項１記載の治療薬。
13. 該過敏性反応が即時型の過敏性反応である請求項１記載の治療薬。
14. 該非リボシル化毒素がアルデヒド処理毒素を含む請求項１記載の治療薬。
15. 該アレルゲンおよび該非リボシル化毒素サブユニットがアルデヒドを含有する製剤として投与される請求項１４記載の治療薬。
16. 該非リボシル化毒素がコレラ毒素Ｂサブユニットである請求項１４記載の治療薬。
17. 該非リボシル化毒素がＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素Ｂサブユニットである請求項１４記載の治療薬。

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