JP2022506990A - トランスサイトーシスのための送達構築物および関連する方法 - Google Patents
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Abstract
本開示は、担体を有するＩＬ－２２等の治療カーゴ部分を含む天然に存在しない融合分子を提供する。本開示はまた、融合分子の産生、精製、リフォールディング、製剤化および投与のための方法および組成物を提供する。疾患または障害を処置および予防するために、精製された分子を使用するための方法も、本明細書に提供される。様々な態様では、本開示は、配列番号１５もしくは配列番号１７に示すアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む送達構築物を提供する。
Description
相互参照
本願は、２０１８年１１月７日に出願された米国特許仮出願第６２／７５６，８８９号、２０１９年８月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／８８８，１３３号および２０１９年８月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／８８８，２３８号、２０１９年９月１１日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５０７０８、および２０１９年３月８日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２１４７４の利益を主張し、これらの出願は、それらの全体を参照により本明細書に組み込む。
本願は、２０１８年１１月７日に出願された米国特許仮出願第６２／７５６，８８９号、２０１９年８月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／８８８，１３３号および２０１９年８月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／８８８，２３８号、２０１９年９月１１日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５０７０８、および２０１９年３月８日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２１４７４の利益を主張し、これらの出願は、それらの全体を参照により本明細書に組み込む。
タンパク質は、インタクトな上皮関門を越えて拡散することも、タイトジャンクションの関門を通過することもできないため、腸上皮は、タンパク質等の大型の治療分子を経口投与する試みを阻んできた。上皮細胞によって吸収されると、治療タンパク質は、破壊をもたらすリソソーム輸送経路に進入する場合がある、または放出されて腸管腔内へと戻る場合がある。このように、腸管上皮を越えて容易に輸送され得ないことは、特に、ポリペプチドに基づく治療薬のための、商業的に実現可能な経口製剤の開発における制限因子となり得る。
静脈内または皮下投与等の非経口的投与は、解決策となり得るが、これらの投与経路は多くの場合、相当な副作用を生じ、治療有効性を低減させ、患者利便性を低下させて服薬遵守に悪影響を与え得る。上皮、例えば、腸上皮を越えて治療薬を輸送するための改善された組成物および方法が必要とされている。
その上、正確にフォールディングされ、生物活性があり、安定したポリペプチドを高収量かつ低エンドトキシンレベルで得るための、生物活性があるポリペプチドの精製およびリフォールディングは依然として、生物学的治療薬（例えば、ポリペプチド）の対費用効果が高くかつ資源効率の良い（cost- and resource effective）産生のための最も難易度の高い側面の１つと考慮される。よって、斯かる生物活性がある分子の産生（発酵、リフォールディング、精製および製剤化）のための改善された方法も必要とされている。
様々な態様では、本開示は、配列番号１５もしくは配列番号１７に示すアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む送達構築物を提供する。
様々な態様では、本開示は、配列番号７または配列番号９に示すアミノ酸配列からなる担体を含む送達構築物を提供する。一部の例では、担体は、異種ペイロードにカップリングされている。一部の例では、異種ペイロードは、ヒトＩＬ－２２である。一部の例では、ヒトＩＬ－２２は、配列番号１１に示すアミノ酸配列からなる。一部の例では、担体は、ＩＬ－２２に共有結合によりまたは非共有結合によりカップリングされている。一部の例では、担体は、スペーサーを介してＩＬ－２２に共有結合によりカップリングされている。一部の例では、スペーサーは、配列番号１３に示すアミノ酸配列からなる。一部の例では、送達構築物は、配列番号１５または配列番号１７に示すアミノ酸配列からなる。
対象における炎症性疾患を処置する方法であって、対象に、有効量の本明細書に記載されている送達構築物（例えば、配列番号１５または配列番号１７）を投与するステップを含む方法が本明細書に提供される。一部の例では、炎症性疾患は、肝炎、肥満、脂肪性肝疾患、肝臓の炎症または膵炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、嚢炎、直腸炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病、関節リウマチまたは乾癬である。一部の例では、疾患は、クローン病または潰瘍性大腸炎である。
ある特定の実施形態では、精製された天然に存在しない融合タンパク質を得るための方法であって、天然に存在しない融合タンパク質を含む混合物においてアニオン交換クロマトグラフィーを行って、天然に存在しない融合タンパク質を含む第１の画分を得るステップを含み、天然に存在しない融合タンパク質が、ＩＬ－２２および担体を含む、方法が本明細書に記載されている。一部の実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーを行うステップは、天然に存在しない融合タンパク質をアニオン性交換樹脂に結合させるステップと、天然に存在しない融合タンパク質のその後の溶出のための増加する塩勾配を提供して、第１の画分を得るステップとを含む。一部の実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーを行うステップは、混合物を、アミン官能化ポリメタクリレートビーズを含む樹脂と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、樹脂は、ＮＨ２－７５０Ｆ樹脂である。
一部の実施形態では、本方法は、アニオン交換クロマトグラフィーを行うステップに先立ち、天然に存在しない融合タンパク質をリフォールディングするステップをさらに含む。一部の実施形態では、天然に存在しない融合タンパク質をリフォールディングするステップは、封入体由来のカオトロープ可溶化タンパク質をリフォールディング溶液と接触させるステップを含み、リフォールディング溶液は、アルギニン（０．７５Ｍ～１．２５Ｍ）；グリセロール（２％～２０％ｖ／ｖ）；システイン（０．５ｍＭ～１０ｍＭ）；およびシスタミン（０．２ｍＭ～１０ｍＭ）を含み、リフォールディング溶液は、７．５～８．５の間のｐＨを有する。一部の実施形態では、アルギニンは、リフォールディング溶液中に０．９Ｍ～１．１Ｍの間の濃度で存在し、グリセロールは、リフォールディング溶液中に７％～１３％（ｗ／ｗ）の間の濃度で存在し、システインは、リフォールディング溶液中に１．５ｍＭ～６ｍＭの間の濃度で存在し、シスタミンは、リフォールディング溶液中に０．６ｍＭ～３ｍＭの間の濃度で存在し、リフォールディング溶液は、７．８～８．２の間のｐＨを有する。
一部の実施形態では、本方法は、第１の画分を含む試料をヒドロキシアパタイト樹脂に供して、天然に存在しない融合タンパク質を含む第２の画分を得るステップをさらに含む。一部の実施形態では、ヒドロキシアパタイト樹脂は、ＣａＰｕｒｅ－ヒドロキシアパタイト樹脂である。一部の実施形態では、本方法は、第１の画分を含む試料においてカチオン交換クロマトグラフィーを行うステップをさらに含む。一部の実施形態では、カチオン交換クロマトグラフィーを行うステップは、第１の画分を含む試料を、サルフェート官能化ポリメタクリレートビーズを含む樹脂と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、樹脂は、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬサルフェート－６５０Ｆ樹脂である。
一部の実施形態では、細胞との接触時に、担体は、天然に存在しない融合タンパク質のエンドサイトーシスまたはトランスサイトーシスを促進する。一部の実施形態では、細胞との接触時に、担体は、天然に存在しない融合タンパク質のトランスサイトーシスを促進する。一部の実施形態では、細胞は、腸上皮細胞である。一部の実施形態では、腸上皮細胞は、極性化された腸上皮細胞である。一部の実施形態では、担体は、天然に存在するまたは天然に存在しないコリックス（cholix）ポリペプチドのトランケートバリアントである。一部の実施形態では、担体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、２２または２３のうちいずれか１種に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有する。一部の実施形態では、天然に存在しない融合タンパク質は、配列番号１４～２１のうちいずれか１種の配列に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＩＬ－２２は、配列番号１０、１１または１２のうちいずれか１種に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有する。
一部の実施形態では、担体は、それ自体、第１の等電点（ｐＩ）を有し、ＩＬ－２２は、それ自体、第２の等電点を有し、第１の等電点は、第２の等電点よりも少なくとも１ｐＨ単位、少なくとも１．５ｐＨ単位、少なくとも１．７ｐＨ単位または少なくとも２ｐＨ単位低い。例えば、一部の実施形態では、担体は、約５．１のｐＩ等、４．８～５．４の間、４．９～５．３の間、５．０～５．２の間のｐＩを有する。一部の実施形態では、ＩＬ－２２のｐＩは、約７．１等、約６．９～７．３の間、約７．０～７．２の間等、約６．８～７．４の間である。一部の実施形態では、天然に存在しない融合タンパク質は、本明細書に記載されている方法のいずれかによって得られる。
ある特定の実施形態では、担体およびＩＬ－２２を含む天然に存在しない融合タンパク質をリフォールディングする方法であって、（ｉ）天然に存在しない融合タンパク質を含む封入体を、カオトロピック剤を含む可溶化溶液と接触させて、可溶性の天然に存在しない融合タンパク質を産生するステップと、（ｉｉｉ）天然に存在しない融合タンパク質をリフォールディング溶液と接触させるステップとを含み、リフォールディング溶液が、アルギニン（０．７５Ｍ～１．２５Ｍ）；グリセロール（２％～２０％ｖ／ｖ）；システイン（０．５ｍＭ～１０ｍＭ）；およびシスタミン（０．２ｍＭ～１０ｍＭ）を含み、リフォールディング溶液が、７．５～８．５の間のｐＨを有する、方法が本明細書に記載されている。
一部の実施形態では、アルギニンは、リフォールディング溶液中に０．９Ｍ～１．１Ｍの間の濃度で存在し、グリセロールは、リフォールディング溶液中に７％～１３％（ｗ／ｗ）の間の濃度で存在し、システインは、リフォールディング溶液中に１．５ｍＭ～６ｍＭの間の濃度で存在し、シスタミンは、リフォールディング溶液中に０．６ｍＭ～３ｍＭの間の濃度で存在し、リフォールディング溶液は、７．８～８．２の間のｐＨを有する。
参照による援用
参照による援用
本明細書で言及されているあらゆる刊行物、特許および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが、参照により組み込まれると特にかつ個々に指し示されているのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の新規特色は、添付の特許請求の範囲に詳細に示されている。本開示の特色および利点のより十分な理解は、本開示の原理が利用されている説明的な実施形態を示す次の詳細な説明と、次に説明する添付の図面を参照することにより得られるであろう。
図５Ｂは、ｒｈＩＬ－２２（配列番号１２）およびｒｍＩＬ－２２が、マウスＨｅｐａ１－６細胞におけるＳＴＡＴ３リン酸化も誘導したことを実証する。
図６Ｂは、ｒｈＩＬ－２２（配列番号１２）およびｒｍＩＬ－２２が、マウスＨｅｐａ１－６細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化も誘導したことを実証する。
図７Ｂは、図７Ａに記載されている試験で使用される実験および対照群の特徴を示す。
図８Ｂは、最初の１０試験日にわたる実験および対照動物の体重の変化を示す。試験期間にわたるＣｓＡ群平均体重は、二元配置ＡＮＯＶＡによって査定された場合、６日目から１０日目に媒体対照と比べて有意に改善された（＊、＊＊、＊＊＊）。ｒｈＩＬ－２２（ｉ．ｐ．）体重は、二元配置ＡＮＯＶＡによって査定された場合、１０日目に媒体対照と比べて有意に改善された（＊）、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
図１０Ｂは、健康なＣＤ－１マウスにおけるｒｈＩＬ－２２の単一および複数用量後の、標的関与のバイオマーカー（複数可）を同定するように設計された、複数用量（亜慢性投薬）ｉｎ ｖｉｖｏ試験の概観を示す。
図１１Ｂは、図１１Ａに記載されている急性および亜慢性投薬実験において測定されたいくつかの薬物動態パラメーターを示す。
図１２Ｂは、ｒｈＩＬ－２２（配列番号１２）の急性投薬の１日後の、血漿ｍＣＲＰ濃度の倍の変化を示す。
図１２Ｃは、５日間のｒｈＩＬ－２２（配列番号１２）の亜慢性投薬の後の、血漿ｍＣＲＰ濃度の倍の変化を示す。
図１３Ｂは、ｒｈＩＬ－２２（配列番号１２）の急性投薬の１日後の、血漿ｍＳＡＡ濃度の倍の変化を示す。
図１３Ｃは、５日間のｒｈＩＬ－２２（配列番号１２）の亜慢性投薬の後の、血漿ｍＳＡＡ濃度の倍の変化を示す。
図１４Ｂは、ｒｈＩＬ－２２（配列番号１２）の急性投薬の１日後の、血漿Ｒｅｇ３β濃度の倍の変化を示す。
図１４Ｃは、５日間のｒｈＩＬ－２２（配列番号１２）の亜慢性投薬の後の、血漿Ｒｅｇ３β濃度の倍の変化を示す。
本開示は、天然に存在しない融合タンパク質（例えば、１種または複数の異種ペイロード分子を輸送することができる送達構築物）、ならびに天然に存在しない融合タンパク質のリフォールディングおよび精製のための方法について記載する。例えば、天然に存在しない融合タンパク質は、本明細書に記載されているＩＬ－２２送達構築物であり得る。
下に記す用語は、当業者によるこれらの用語の理解に加えて、本明細書で使用されている用語の意義を説明するために記述されている。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈がそれ以外を明らかに指示しない限り、複数形の指示対象を含む。特許請求の範囲が、いずれかの必要に応じたエレメントを除外するように起草され得ることがさらに認められる。そのようなものとして、この表現は、特許請求の範囲のエレメントの列挙に関連した「もっぱら」、「～のみ」等の排他的な用語法の使用、または「否定的」限定の使用のための先行詞（antecedent basis）として機能することが意図される。
ある特定の範囲または数は、用語「約」を前に付けた数値により本明細書に提示されている。本明細書に使用されている用語「約」は、この用語が指す数のプラスまたはマイナス１％、２％、３％、４％または５％を意味するものとする。本明細書で使用される場合、用語「対象」および「個体」は、互換的に使用されており、哺乳動物（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）を含む任意の動物であり得る。
本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置すること」または「処置」および他の文法上の同等物は、疾患もしくは状態の１種もしくは複数の症状を軽減、緩解もしくは軽快させること、疾患もしくは状態の１種もしくは複数の追加的な症状の出現、重症度もしくは頻度を軽快、予防もしくは低下させること、疾患もしくは状態の１種もしくは複数の症状の根底にある原因を軽快させ、もしくは予防すること、例えば、疾患もしくは状態の発症を停止すること等、疾患もしくは状態を阻害すること、疾患もしくは状態を緩和すること、疾患もしくは状態の退縮を引き起こすこと、疾患もしくは状態によって引き起こされた状態を緩和すること、または予防的および／もしくは治療的のいずれかで、疾患もしくは状態の症状を阻害することを含む。
本明細書に記載されている場合、用語「パーセント（％）配列同一性」およびそれに関係する用語は、アミノ酸配列の文脈において、配列を整列し、必要であればギャップを導入して、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮することなく、最大パーセント配列同一性を達成した後に、選択された配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージである。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のための整列は、当業者の技能範囲内の様々な仕方で、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公開されているコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較されている配列の全長にわたる最大整列の達成に必要とされる任意のアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメーターを決定することができる。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すように本明細書で互換的に使用されている。ペプチドはまた、アミド結合とは対照的にエーテルによって連接されたアミノ酸等のペプチドミメティックを含むがこれに限定されない、基本的にいかなるポリアミノ酸も含む。
ペイロードおよび送達構築物
ペイロードおよび送達構築物
トランスサイトーシスにより上皮細胞（例えば、極性化された腸上皮細胞）を越えて固有層中へと、１種または複数の異種ペイロード分子（例えば、１種または複数の治療ペイロード）を輸送することができる送達構築物が本明細書に提供される。送達構築物は、異種ペイロードにカップリングされた担体を含むことができる。送達構築物は、天然に存在しない融合タンパク質であり得る。担体は、内在性輸送経路を使用して、極性化された上皮細胞（例えば、極性化された腸上皮細胞）を越えて異種ペイロードを輸送することが可能である。内在性輸送経路の利用は、受動拡散の使用とは対照的に、担体が、上皮細胞を越えて、これらの細胞の関門機能または異種ペイロードの生物活性を損なうことなく、迅速かつ効率的に異種ペイロードを往復させることを可能にすることができる。本明細書に記載されている送達構築物の精製およびリフォールディングのための方法がさらに本明細書に提供される。
本明細書における担体は、細菌によって分泌されたポリペプチドに由来し得る。斯かる担体は、Ｖｉｂｒｉｏ ＣｈｏｌｅｒａｅまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａから分泌されたポリペプチドに由来し得る。Ｖｉｂｒｉｏ Ｃｈｏｌｅｒａｅによって分泌されたポリペプチドは、コリックスポリペプチドであり得る。コリックスポリペプチドに由来する担体は、天然に存在しても天然に存在しなくてもよい。例えば、天然に存在しないコリックスポリペプチドは、配列番号１（コリックス１～６３４の一例）（表１）に示すアミノ酸配列からなることができる。コリックスポリペプチドに由来する担体は、コリックスに由来するポリペプチドのトランケートおよび／または突然変異したバリアントであり得る。例えば、担体は、配列番号１または配列番号２６のアミノ酸残基１～２０６、１～２４５、１～２５１、１～２６６および１～３８６を有するアミノ酸配列を含むまたはこれらからなることができる。一部の例では、斯かる担体は、配列番号４のアミノ酸残基１～２０６、１～２４５、１～２５１、１～２６６および１～３８６を有するアミノ酸配列を有する。突然変異（複数可）は、１個または複数の置換（複数可）、欠失（複数可）および／または付加（複数可）を含むことができる。例えば、本明細書における担体は、Ｖ１Ｌ置換を含むことができる。別の言い方をすれば、一部の実施形態では、コリックス関連担体は、「１」位にロイシンアミノ酸を有する（１位は、Ｎ末端メチオニンを有しないバリアントの１番目のアミノ酸、またはＮ末端メチオニンを含むバリアントにおける２番目の位置を指す。換言すると、担体の長さの決定において、Ｎ末端メチオニンは、存在するのであれば、無視される）。一部の実施形態では、Ｖ１Ｌ置換を含む担体は、Ｎ末端アミノ酸の切断の低下または排除を経験する。一部の実施形態では、Ｖ１Ｌ置換を含む担体は、Ｎ末端アミノ酸のアセチル化の低下または排除を経験する。本明細書に提供される担体は、天然に存在するコリックスバリアントと比べて、ＡＤＰリボシル化活性（例えば、伸長因子２のリボシル化）が低下（例えば、少なくとも５０％低下）しているまたは消失している場合がある。一部の実施形態では、担体は、Ｎ末端メチオニンを含むことができる。他の実施形態では、Ｎ末端メチオニンは存在しない。
トランケートされたコリックス担体は、配列番号２６（式Ｉ）に示す配列のアミノ酸残基１～３８６からなる、これから本質的になるまたはこれを含むことができる。トランケートされたコリックス担体は、配列番号２６（式Ｉ）に示す配列のアミノ酸残基１～２６６からなる、これから本質的になるまたはこれを含むことができる。斯かる例では、担体は、配列番号１に示す配列のアミノ酸残基１～２６６からなる、これから本質的になるまたはこれを含むことができる。よって、一部の例では、担体は、配列番号２（コリックス１～３８６の一例）または配列番号３（コリックス１～２６６の一例）に示すアミノ酸配列からなる。一部の例では、担体は、Ｖ１Ｌ置換を有する配列番号２によって表されるアミノ酸配列を有する。よって、一部の例では、担体は、配列番号４（Ｖ１Ｌ－コリックス１～３８６の一例）または配列番号５（Ｖ１Ｌコリックス１～２６６の一例）に示すアミノ酸配列からなる。これらの担体のいずれかは、様々な微生物（例えば、細菌）における発現のため、そのＮ末端に１個または複数のアミノ酸、例えば、Ｎ末端メチオニンを含むことができる。斯かる担体は、配列番号６～９に示すアミノ酸配列を有することができる。
コリックスポリペプチドは、配列番号１～９または配列番号２２～２３のうちいずれか１種に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％配列同一性を有するまたは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、これから本質的になるまたはこれからなるタンパク質であり得る。コリックスポリペプチドの例は、配列番号１または配列番号２２として本明細書に提供される。極性化された上皮細胞（例えば、極性化された腸上皮細胞）を越えてペイロードを輸送することができる、トランケートされたコリックスポリペプチドバリアントも本明細書で企図される。斯かるコリックスポリペプチドは、参照配列、例えば、配列番号１、配列番号２２もしくは配列番号２６、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％配列同一性を有するアミノ酸配列と比較して、２０６～６３３のアミノ酸位置のうちいずれか１種でトランケートされていてよい。
上述の配列に対して高い配列同一性を有する担体を含む送達構築物も本明細書で企図される。斯かる高い配列同一性は、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を含むことができる。よって、一部の例では、担体は、配列番号６～９に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性の配列同一性（identify）を含む。
本明細書で企図される担体は、異種ペイロード等のペイロードにカップリングされていてよい。斯かるペイロードは、治療ペイロードであり得る。治療ペイロードは、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、治療抗体、抗原、上述のうちいずれかの機能的な断片、または生物活性、治療活性を有する他の任意のタンパク質、または対象において欠乏し得るタンパク質（例えば、ある特定のタンパク質の遺伝子的／遺伝性欠乏）であり得る。本明細書で企図されるサイトカインは、単量体のケモカインおよびインターロイキン（本明細書において、同様に「ＩＬ」と省略）を含む。インターロイキンは、ＩＬ－２２であり得る。インターロイキンは、任意の種（例えば、ヒトまたは齧歯類）に由来することができる。インターロイキンは、ヒトインターロイキンであり得る。ヒトＩＬ－２２は、配列番号１０（ＩＬ－２２１～１７９）または配列番号１１（ＩＬ－２２３４～１７９）に示すアミノ酸配列を有することができる。本明細書におけるＩＬ－２２は、例えば、斯かるＩＬ－２２タンパク質が細菌により発現される場合、そのＮ末端にメチオニンをさらに含むことができる。一例では、ＩＬ－２２は、配列番号１２（Ｍ＋ＩＬ－２２３４～１７９）に示すアミノ酸配列を有する。本明細書におけるＩＬ－２２は、例えば、斯かるＩＬ－２２タンパク質が細菌により発現される場合、そのＮ末端にメチオニンをさらに含むことができる。一例では、ＩＬ－２２は、配列番号１２（Ｍ＋ＩＬ－２２３４～１７９）に示すアミノ酸配列を有する。ＩＬ－２２は、配列番号１０、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％％配列同一性を有するアミノ酸配列、またはその断片を含む、これから本質的になるまたはこれからなることができる。ＩＬ－２２は、ＩＬ－２２の分泌形態である配列番号１１（ＩＬ－２２３４～１７９）、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％％配列同一性を有するアミノ酸配列、またはその断片を含む、これから本質的になるまたはこれからなることができる。ＩＬ－２２は、例えば、斯かるＩＬ－２２タンパク質が細菌により発現される場合、そのＮ末端にメチオニンを含むことができる。斯かるＩＬ－２２は、配列番号１２（Ｍ＋ＩＬ－２２３４～１７９）に示すアミノ酸配列からなる、これから本質的になるまたはこれを含むことができる。
一部の例では、本明細書における送達構築物のいずれかにおいて使用される担体は、上皮（例えば、対象の極性化された腸上皮）を越えて治療ペイロードを輸送することができるタンパク質または別の種類の分子であり得る。斯かる輸送は、トランスサイトーシスを含むことができる。本明細書で参照される場合、「トランスサイトーシス」は、極性化された上皮細胞を通った融合分子の輸送を指す。斯かる輸送は、極性化された上皮細胞の側底膜からの生物活性があるカーゴの放出を可能にする。トランスサイトーシス過程には、上皮の細胞（例えば、極性化された腸上皮細胞）の頂端および／または基底表面（複数可）ならびに上皮の細胞の内側における１種または複数の受容体（複数可）および／またはタンパク質（複数可）と担体との相互作用（複数可）が関与し得る。担体は、上皮、担体、ならびに／またはペイロードの生物学的および／もしくは治療的機能を損なうことなく、上皮を越えて治療ペイロードを輸送することが可能である。
担体は、共有結合によりまたは非共有結合により、および、直接的にまたは間接的に、治療ペイロードにカップリングすることができる。治療ペイロードは、担体のＮ末端またはＣ末端に直接的にカップリングすることができる。担体がペイロードに共有結合によりカップリングされる例では、担体は、スペーサー（本明細書において、リンカーとも称される）を介して斯かるペイロードにカップリングすることができる。スペーサーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０個またはそれよりも多いアミノ酸残基を含むことができる。スペーサーアミノ酸残基は、例えば、グリシン、セリンおよび／またはトリプトファンであり得る。スペーサーは、切断性または非切断性スペーサーであり得る。切断性スペーサーは、酵素によってまたはｐＨ依存的様式で切断性であり得る。
本明細書で企図されるスペーサーの例は、Ｓ、（ＧＳ）ｘ、（ＧＧＳ）ｘ、（ＧＧＧＳ）ｘ（配列番号２７）、（ＧＧＧＧＳ）ｘ（配列番号２８）または（ＧＧＧＧＧＳ）ｘ（配列番号２９）（式中、ｘ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５）等のオリゴペプチド配列を含む。一部の場合では、スペーサーは、配列番号１３（（Ｇ４Ｓ）３）（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）に示す配列からなる、これから本質的になるまたはこれを含む。一部の場合では、スペーサーは、配列番号３１（（Ｇ４Ｓ）５）（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）に示す配列からなる、これから本質的になるまたはこれを含む。一部の例では、送達構築物は、非共有結合により連結された（例えば、イオン性相互作用、ファンデルワールス相互作用、π－π相互作用等により）、治療ペイロードおよび担体を含む。担体は、そのＮ末端および／またはＣ末端に、１個または複数の特色、エレメント、アミノ酸または修飾をさらに含むことができる。例えば、一部の実施形態は、担体のＮ末端にＮ末端メチオニンを含む。異種の系における発現のための修飾を含む、他の修飾（例えば、アセチル化）が存在することもできる。
本明細書における送達構築物は、配列番号１５または１７（Ｍ＋コリックス１～２６６－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－２２３４～１７９の例）（表１）に示すアミノ酸配列を有することができる。他の送達構築物は、配列番号２４または２５に示すアミノ酸配列を有することができる（例えば、ＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞において発現される場合）。斯かる例示的な送達構築物は、インタクトな極性化された腸上皮細胞を越えて固有層中へと、ＩＬ－２２を輸送する。
様々な実施形態では、天然に存在しない融合タンパク質は、配列番号１４～２１、２４もしくは２５に示すアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。配列番号１５に示すアミノ酸配列を含む天然に存在しない融合タンパク質の担体、スペーサーおよびペイロードの概略図を図１６に説明する。
表１は、本明細書に開示されている方法と組み合わせて使用される、生物活性がある分子の例示的なアミノ酸配列を示す。
一部の実施形態では、天然に存在しない融合タンパク質は、配列番号１～９、２２～２３および２６に示す配列のうちいずれか１種からなる群から選択される担体、ならびに配列番号１０～１２に示す配列のうちいずれか１種からなる群から選択されるペイロードを含みまたはこれからなり、担体およびペイロードは、配列番号１３および２７～２９に示す配列のうちいずれか１種からなる群から選択されるスペーサーによって必要に応じてカップリングされている。
送達構築物および１種または複数の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物がさらに本明細書に提供される。一部の場合では、送達構築物は、配列番号１５に示すアミノ酸配列からなる。一部の場合では、送達構築物は、配列番号１７に示すアミノ酸配列からなる。斯かる医薬組成物は、対象への投与のために製剤化することができる。一部の例では、医薬組成物は、対象への経口投与のために製剤化される。
送達構築物を含む医薬組成物は、それを必要とする対象（例えば、ヒト）に投与して、疾患を処置することができる。本開示の送達構築物を使用して処置することができる疾患は、自己免疫性疾患および炎症性疾患を含む。一部の例では、疾患は、上皮細胞傷害または上皮細胞膜（例えば、ＧＩ管内の）の損傷である。一部の例では、疾患は、肝炎、肥満、脂肪性肝疾患、肝臓の炎症または膵炎、クローン病（例えば、フィステル形成性クローン病）、潰瘍性大腸炎（例えば、軽度から中等度または中等度から重度の）、嚢炎、直腸炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病、関節リウマチまたは乾癬である。
精製方法および組成物
精製方法および組成物
本開示は、精製された天然に存在しない融合タンパク質を得るための方法を企図する。天然に存在しない融合タンパク質は、ＩＬ－２２および担体、ならびに必要に応じて、ＩＬ－２２を担体にカップリングするスペーサーを含むことができる。天然に存在しない融合タンパク質は、配列番号１４～２１、２４または２５に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％配列同一性を有するまたは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、これから本質的になるまたはこれからなるタンパク質であり得る。本明細書に記載されている方法および組成物の利点は、精製されたポリペプチドまたはタンパク質の高い純度および生物活性の維持を含む。
本明細書に開示されている方法の具体的な利点は、ａ）特別に開発されたフォールディング緩衝剤を使用した正確なフォールディングによる、天然に存在しない融合タンパク質の高い生物活性；ｂ）低い毒性と対になる、精製された天然に存在しない融合タンパク質の高い化学的純度；ｃ）精製に付された材料の高い回収収量；ｄ）結果の再現性が、信頼できる産生およびサプライを可能にすること；ｅ）臨床および商業適用のための、数グラムおよび数キログラムスケールへの製造可能性およびスケーラビリティ；ｆ）材料および資源の持続可能な使用が、臨床的に関連する分子のための対費用効果が高く物流上（logistically）有効な精製方法をもたらすことを含む。その上、改善された製造方法は、このような精製されたタンパク質が治療用途に開発され得るスピードを増加させることができる（図２２）。
本明細書に記載されている天然に存在しない融合タンパク質の精製のための例示的なプロセスを図１７に示し、この図は、精製プロセスの各ステージにおける天然に存在しない融合タンパク質の例示的な純度および回収量をさらに説明する。
本明細書で使用される場合、「純度」は、所望しないタンパク質または所望しない形態のタンパク質（例えば、天然に存在しない融合タンパク質の凝集体、不正確にフォールディングされたタンパク質、またはこれらの組合せ）も含み得る組成物における、所望のタンパク質（例えば、天然に存在しない融合タンパク質）または所望の形態のタンパク質（例えば、天然に存在しない融合タンパク質の単量体、正確に（corrected）フォールディングされた天然に存在しない融合タンパク質、またはこれらの組合せ）のレベルを指し示す。レベルは、所望のタンパク質または所望の形態のタンパク質のパーセンテージ（％）によって表すことができる。例えば、純度は、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％よりも多くなることができる、または１００％であり得る。用語「精製された」は、純度の増加を経験した組成物を指し示すように使用することができる。純度の増加は、アニオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、またはこれらの組合せ等、本明細書に記載されている精製手順によるものであり得る。
一部の場合では、本開示の方法および組成物は、タンデム型で行われる少なくとも２個のクロマトグラフィーカラムの使用と、それに続く濃縮／緩衝液交換ステップ（溶液を濃縮および緩衝液交換するための限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ））を含む。クロマトグラフィーカラムは、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ（ＧＥ）のＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０カラムまたはＡＫＴＡ Ｐｉｌｏｔカラム等の低圧クロマトグラフィーシステムであり得る。一部の場合では、少なくとも１個のカラムは、アニオン交換樹脂（例えば、ＮＨ２－７５０Ｆ樹脂）を含有し、少なくとも１個のカラムは、ヒドロキシアパタイト樹脂（例えば、ＣａＰｕｒｅ（登録商標）樹脂）を含有する。一部の場合では、アニオン交換樹脂を含有する少なくとも１個のカラムは、捕捉ステップに使用され、一方、ヒドロキシアパタイト樹脂を含有する少なくとも１個のカラムは、洗練ステップに使用される。一部の場合では、ヒドロキシアパタイトカラムの代わりに（またはそれに加えて）、カチオン交換カラムを使用することができる。例えば、一部の実施形態では、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬサルフェート－６５０Ｆ等のサルフェート官能化ポリメタクリレート樹脂を有するカチオン交換カラムが使用される。可溶化されたタンパク質の純度は、ＵＦ／ＤＦ後に４４％から４７％へと、アニオン交換クロマトグラフィー後に９３％から９７％へと、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー後に少なくとも９９％へと増加することができる。可溶化されたタンパク質の回収は、アニオン交換クロマトグラフィー後に７０％から７３％へと、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー後に少なくとも９７％へと増加することができる。
封入体からの天然に存在しない融合タンパク質の単離
一部の実施形態では、精製される天然に存在しない融合タンパク質は、封入体（ＩＢ）から単離される。本明細書に記載されているＩＢは、タンパク質およびポリペプチド等の安定した物質の核または細胞質凝集体であってもよい。一部の実施形態では、発酵由来の天然に存在しない融合タンパク質（例えば、配列番号１４～２１）を含む２回洗浄（double-washed）封入体（ＤＷＩＢ）は、特異的な緩衝系（実施例６を参照）に再懸濁される。
一部の場合では、ＤＷＩＢの濃度は、約０．５ｇ ＤＷＩＢ／１００ｍＬ緩衝剤～約５ｇ ＤＷＩＢ／１０ｍＬ緩衝剤である。一部の場合では、ＤＷＩＢの濃度は、約２ｇ ＤＷＩＢ／５０ｍＬ緩衝剤～約５ｇ ＤＷＩＢ／５０ｍＬ緩衝剤である。一部の場合では、ＤＷＩＢの濃度は、約１ｇ ＤＷＩＢ／２０ｍＬ緩衝剤～約１ｇ ＤＷＩＢ／１０ｍＬ緩衝剤である。一部の場合では、ＤＷＩＢの濃度は、少なくとも１ｇ ＤＷＩＢ／１００ｍＬ緩衝剤である。一部の場合では、ＤＷＩＢの濃度は、少なくとも１ｇ ＤＷＩＢ／１０ｍＬ緩衝剤である。
再懸濁のための緩衝系は、種々の緩衝薬剤および成分を含むことができる。一部の場合では、再懸濁のための緩衝系は、少なくとも１Ｍ、少なくとも２Ｍ、少なくとも４Ｍ、少なくとも６Ｍ、少なくとも８Ｍの濃度のグアニジン／ＨＣｌ（Ｇｕ－ＨＣｌ）を含む。一部の場合では、Ｇｕ－ＨＣｌの濃度は、約４Ｍ～約８Ｍである。一部の場合では、再懸濁のための緩衝系は、Ｔｒｉｓ緩衝剤を含み、Ｔｒｉｓの濃度は、少なくとも５ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭまたは少なくとも１００ｍＭである。一部の場合では、Ｔｒｉｓ緩衝剤は、約４０ｍＭ～約６０ｍＭの濃度を有する。Ｔｒｉｓ緩衝剤は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌであり得る。Ｔｒｉｓ－ＨＣｌは、８．０～８．５のｐＨを有することができる。Ｔｒｉｓ－ＨＣｌは、８．２のｐＨを有することができる。一部の場合では、再懸濁のための緩衝系は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む。ＤＴＴは、少なくとも７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭまたは７０ｍＭの濃度を有することができる。ＤＤＴは、７ｍＭ～１１ｍＭ、８ｍＭ～１０ｍＭまたは９ｍＭ～１０ｍＭの濃度を有することができる。一部の場合では、再懸濁のための緩衝系は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む。ＥＤＴＡは、少なくとも１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭまたは２．５ｍＭの濃度を有することができる。ＥＤＴＡは、１ｍＭ～２．５ｍＭまたは１．９ｍＭ～２．１ｍＭの濃度を有することができる。一部の実施形態では、再懸濁のための緩衝系は、Ｔｒｉｓ緩衝剤、Ｇｕ－ＨＣｌおよびＤＴＴを含む、これらから本質的になるまたはこれらからなる。再懸濁に使用される緩衝系は、約６～約１０のｐＨを有することができる。一部の場合では、緩衝系は、約７．５～約８．５のｐＨを有する。一部の場合では、緩衝系のｐＨは、少なくとも７である。一部の場合では、緩衝系のｐＨは、少なくとも８である。一部の場合では、緩衝系のｐＨは、少なくとも８．５である。
可溶化された天然に存在しない融合タンパク質の還元
還元剤を再懸濁溶液に添加することができる。還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）であり得る。使用される還元剤の量は、再懸濁溶液の体積、および当該溶液に存在する融合タンパク質に依存することができる。一部の場合では、使用される還元剤の量は、約０．０２５ｍＭ～約５０ｍＭ、０．５ｍＭ～３０ｍＭ、１ｍＭ～１０ｍＭである。一部の場合では、使用される還元剤の量は、少なくとも２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭまたは１０ｍＭ（またはこれらの間）である。
可溶化された天然に存在しない融合タンパク質（例えば、配列番号１４～２１）溶液は、約２℃～約４０℃に及ぶ様々な温度でインキュベートすることができる。一部の場合では、タンパク質溶液は、室温（ＲＴ）でインキュベートすることができる。インキュベーションは、溶液を撹拌しながら行うことができる。溶液を磁気撹拌プレート上で撹拌し、次いで遠心分離することができる。遠心分離は、約１，０００×ｇ～約２０，０００×ｇで行うことができる。一部の場合では、遠心分離は、１５，９７０×ｇで９０分間４℃にて行われる。インキュベーション時間は、成分の濃度、融合タンパク質（例えば、配列番号１４～２１）の濃度に応じて、約２０分間～約１８０分間に変動し得る。
本明細書に記載されている方法および手順による様々な溶液におけるタンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイを使用して測定することができる。可溶化された天然に存在しない融合タンパク質の濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬであり得る。一部の場合では、可溶化された天然に存在しない融合タンパク質の最終濃度は、約３ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬであり得る。一部の場合では、可溶化された天然に存在しない融合タンパク質の最終濃度は、約５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬであり得る。一部の場合では、可溶化された天然に存在しない融合タンパク質の最終濃度は、少なくとも１５ｍｇ／ｍＬであり得る。
天然に存在しない融合タンパク質のリフォールディング
本開示の天然に存在しない融合タンパク質は、その特異的な三次元構造またはフォールディングによって、その生物活性を発揮することができる。したがって、このようなポリペプチドのリフォールディングは、このようなポリペプチドの医薬品適用のための開発において重要となり得る。少なくとも担体およびＩＬ－２２を含む融合タンパク質の望ましいリフォールディングは、相同な天然に存在する担体もしくはＩＬ－２２配列の三次構造と同様の三次構造、または担体（例えば、融合タンパク質のトランスサイトーシス）およびＩＬ－２２の所望の活性の維持をもたらす三次構造への、担体またはＩＬ－２２のリフォールディングを含むことができる。本明細書に記載されている方法は、可溶化された天然に存在しない融合タンパク質をリフォールディングして、リフォールディングされた天然に存在しない融合タンパク質を産生するステップを含むことができる。リフォールディングは、アニオン交換クロマトグラフィーを行う前に起こり得る。
可溶化されたタンパク質（例えば、配列番号１４～２１）は、リフォールディング緩衝液とも称されるリフォールディング溶液に添加することができる。使用される可溶化されたタンパク質の量は、０．１ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬ、または約１５ｍｇ／ｍＬであり得る。可溶化されたタンパク質の量は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｍｇ／ｍＬであり得る。可溶化されたタンパク質の量は、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍｇ／ｍＬ以下であり得る。リフォールディング溶液は、７．５～８．５の間または約７．０のｐＨを有することができる。
リフォールディング緩衝液は、アミノ酸、ポリオール、塩、糖、レドックス試薬、カオトロープ、またはこれらの組合せを含むことができる。アミノ酸は、プロリン、グリシン、アルギニンまたはアラニンであり得る。ポリオールは、グリセロールであり得る。塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）または塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）であり得る。糖は、グルコースまたはスクロースであり得る。レドックス試薬は、システイン、シスタミン、グルタチオン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）または硫酸銅（ＣｕＳＯ４）であり得る。一部の実施形態では、リフォールディング緩衝剤は、Ｔｒｉｓ塩基、アルギニン－ＨＣｌ、尿素、ＥＤＴＡ、グリセロール、Ｌ－システイン、シスタミン－２ＨＣｌ、ＤＴＴ、Ｇｕ－ＨＣｌ、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、リフォールディング緩衝剤は、Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５、アルギニン、グリセロール、システインおよびシスタミンを含む、これらから本質的になるまたはこれらからなる。Ｔｒｉｓ緩衝剤の濃度は、約２０ｍＭ～約２００ｍＭに及び、ｐＨは、約６～約９に及び得る。アルギニン－ＨＣｌの濃度は、約０．１Ｍ～約１．５Ｍ、約０．７５Ｍ～１．２５Ｍまたは約１．０Ｍに及び得る。尿素の濃度は、約０．５Ｍ～１．５Ｍに及び得る。ＥＤＴＡの濃度は、１ｍＭ～３ｍＭに及び得る。グリセロールの濃度は、約２％ｖ／ｖ～約２０％ｖ／ｖ、約８％ｖ／ｖ～約１２％ｖ／ｖまたは約１０％ｖ／ｖに及び得る。システインの濃度は、１ｍＭ～５ｍＭ、２ｍＭ～４ｍＭまたは約３ｍＭであり得る。システインは、Ｌ－システインであり得る。シスタミンの濃度は、約０．５ｍＭ～約５ｍＭ、約１ｍＭ～約４ｍＭまたは約３ｍＭに及び得る。シスタミンは、シスタミン－２ＨＣｌであり得る。ＤＴＴの濃度は、約０．１ｍＭ～約１ｍＭに及び得る。Ｇｕ－ＨＣｌの濃度は、約５０ｍＭ～約５００ｍＭに及び得る。リフォールディング緩衝剤は、Ｔｒｉｓ、Ｌ－アルギニン、尿素、ＥＤＴＡ、システインおよびシスタミンを含む、これらから本質的になるまたはこれらからなることができる。リフォールディング緩衝剤は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５、１Ｍアルギニン、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、３ｍＭ Ｌ－システインおよび１ｍＭシスタミン－２ＨＣｌを含む、これらから本質的になるまたはこれらからなることができる。可溶化された天然に存在しない融合タンパク質をリフォールディング緩衝剤に添加して、リフォールディング混合物を産生することができる。天然に存在しない融合タンパク質の濃度は、リフォールディング混合物への添加後に、約０．１ｍｇ／ｍＬ～１．０ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ～１．５ｍｇ／ｍＬ、０．７５ｍｇ／ｍＬ～１．２５ｍｇ／ｍＬまたは約１ｍｇ／ｍＬであり得る。リフォールディング混合物における天然に存在しない融合タンパク質の濃度は、０．５ｍｇ／ｍＬ未満、０．６ｍｇ／ｍＬ未満、０．７ｍｇ／ｍＬ未満、０．８ｍｇ／ｍＬ未満、０．９ｍｇ／未満または１．０ｍｇ／ｍＬ未満であり得る。
様々な実施形態では、約１００ｍＬ～約１０，０００Ｌの体積のリフォールディング緩衝剤が使用される。一部の場合では、体積は、約５０ｍＬ～約１５００Ｌである。一部の場合では、体積は、約１０Ｌ～約３００Ｌである。一部の場合では、体積は、少なくとも２００Ｌである。
リフォールディング溶液は、ある特定の温度を有することができる。例えば、リフォールディング溶液は、約２～１２℃に予め冷却（pre-chilled）されていてよい。一部の場合では、リフォールディング溶液は、少なくとも約３℃に予め冷却される。このリフォールディングプロセスは、使用されるタンパク質および適用に応じて最適化することができる（図１８）。
本開示の一部の実施形態では、リフォールディング混合物は、ある特定の期間インキュベートされる。一部の場合では、プロセスは、約１時間、２時間、４時間、５時間または２０時間であり得る。一部の場合では、リフォールディングプロセスは、約１５～約２５時間を要する。一部の場合では、蠕動ポンプは、可溶化された材料をリフォールディング溶液に送達するために、溶液の構成（例えば、濃度または体積）に応じてある特定の流速で設定される。一部の場合では、蠕動ポンプは、６０～８０ｍｌ／分の流速で設定される。最適化プロセスは、１５種の異なるマトリックス、１２種の変数および２００種のリフォールディング反応の実験の設計（ＤＯＥ）を利用した。決断は消去法によって下された。
様々な実施形態では、定量的解析を行って、リフォールディングされた天然に存在しない融合タンパク質を含む溶液における正確にフォールディングされたタンパク質の量またはパーセンテージを決定することができる。一部の例では、ＳＥＣ－ＨＰＬＣを行って、リフォールディング試料に存在する適正にフォールディングされた天然に存在しない融合タンパク質の量を決定する。
リフォールディングされた天然に存在しない融合タンパク質の純度は、４５％～６５％、４０％～６０％または４５％～５５％であり得る。リフォールディングされた天然に存在しない融合タンパク質の純度は、少なくとも４０％、４５％、５０％または５５％であり得る。
可溶化されたＩＬ－２２送達構築物の接線流濾過（ＴＦＦ）
様々な実施形態では、タンパク質リフォールディングは、ある特定の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）による接線流濾過（ＴＦＦ）システム（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）システムと組み合わせてまたはそれに先立って行われる。
タンパク質リフォールディング混合物をその後、ＴＦＦによって処理して、溶液を濃縮および緩衝液交換することができる。一部の場合では、プロセスは、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって行われる。限外濾過において、溶液は、８倍～１２倍または約１０倍に濃縮することができる。限外濾過に続いて、透析濾過緩衝剤による透析濾過の際に５倍緩衝液交換を行うことができる。ＵＦ／ＤＦは、１～２ｍ２ ＴＦＦ平板カセットを用いた、１０～２０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｃｅｌｌ Ｐｅｌｌｉｃａｎ３フィルターの使用を含むことができる。特異的なパラメーター（すなわち、ＴＭＰ）は、タンパク質の分子特徴に応じて変動し得る。透析濾過緩衝剤は、約７～約８．５のｐＨの１０～２５ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基および５０～２００ｍＭ ＮａＣｌを含むことができる。特異的なパラメーターは、タンパク質の分子特徴に応じて変動し得る。ＵＦ／ＤＦプロセスの終わりにおける最終体積は、約５Ｌ～約１００Ｌであり得る。一部の場合では、最終体積は、約１０～約５０Ｌに及ぶ。一部の場合では、最終体積は、約８０ｍＬ～約１０Ｌに及ぶ。
その後の濾過は、流動濾過システムを使用して行うことができる。一部の場合では、流動濾過システムは、ＡｋｒｏＰａｃフィルターシステムならびにＣｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ蠕動ポンプおよびチューブである。ブラッドフォードアッセイを行って、タンパク質濃度、収量およびステップ回収を決定することができる。
様々な実施形態では、定量的解析を行って、試料溶液における正確にフォールディングされたタンパク質の量またはパーセンテージを決定することができる。一部の例では、ＳＥＣ－ＨＰＬＣを行って、リフォールディングおよびＵＦ／ＤＦ試料に存在する適正にフォールディングされた天然に存在しない融合タンパク質の量を決定する。
ＵＦ／ＤＦ後のリフォールディングされた天然に存在しない融合タンパク質を含む溶液の純度は、３５％～５５％、４０％～５０％、４３％～４７％または約４５％であり得る。ＵＦ／ＤＦ後のリフォールディングされた天然に存在しない融合タンパク質を含む溶液の純度は、少なくとも３５％、４０％または４５％であり得る。ＵＦ／ＤＦ後の可溶化されたリフォールディングされた天然に存在しない融合タンパク質の回収は、８７％～９７％、９０％～９４％、９２％～９３％または約９２．５％であり得る（他の濃縮および緩衝液交換システムを使用することもできる）。
天然に存在しない融合タンパク質の精製および回収
以前に記載された通り、アニオン交換クロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（またはそれに代えてカチオン交換クロマトグラフィー）等、タンデム型での２個のクロマトグラフィー方法の使用は、溶液からの、本明細書に記載されているＩＬ－２２送達構築物等の天然に存在しない融合タンパク質の増加した純度および回収をもたらすことができる。本開示の様々な実施形態では、クロマトグラフィーの仕様（例えば、カラムの型、樹脂、流速、緩衝系、勾配および伝導度）は、様々なパラメーター、例えば、精製されるタンパク質に応じて決定および最適化される。本明細書に記載されているタンパク質精製に種々の精製カラムを使用することができる。
アニオン交換クロマトグラフィー
本明細書に記載されている方法は、天然に存在しない融合タンパク質を含む混合物においてアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）を行うステップを含むことができる。混合物は、リフォールディングされた天然に存在しない（non-naturally）融合タンパク質を含む溶液であり得る。アニオン交換クロマトグラフィーを行うステップは、天然に存在しない融合タンパク質を含む第１の画分を産生することができる。
本開示の方法および組成物と組み合わせて種々の樹脂を使用することができる。一部の場合では、樹脂は、アミン官能化ポリメチルアクリレートビーズを含む。一部の場合では、アニオン交換樹脂ＮＨ２－７５０Ｆがタンパク質精製に使用される。少なくとも１５ｃｍ、２０ｃｍ、２５ｃｍまたは３０ｃｍのベッドの高さを有するカラムに樹脂を詰めることができる。１０～５０ｃｍのベッドの高さを有するカラムに、適切な動的結合能（例えば、＞２０ｇ／Ｌ）を容易にすることができるカラム体積を確実にする仕方で樹脂を詰め、所望の含量のタンパク質の産生を可能にすることができる。一部の場合では、カラムの動的結合能は、５ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ～３０ｇ／Ｌまたは２０ｇ／Ｌ～２５ｇ／Ｌである。
アニオン交換クロマトグラフィーにおける溶出（例えば、勾配溶出）に使用される緩衝系は、１、２、３または４種の異なる緩衝液（例えば、緩衝剤Ａ～Ｄ）を含むことができる。一部の実施形態では、２種の緩衝剤がアニオン交換クロマトグラフィーにおいて使用され、これらは本明細書において、緩衝剤Ａおよび緩衝剤Ｂと称される。一部の場合では、緩衝液は、Ｔｒｉｓ（例えば、１０～５０ｍＭ、ｐＨ７～９）および／またはＮａＣｌ（例えば、０．１～５Ｍ）を含む。一部の場合では、緩衝液は、グリセロールをさらに含む。一部の実施形態では、例えば、緩衝剤Ａまたは緩衝剤Ｂ等、アニオン交換クロマトグラフィーにおいて使用される緩衝液（複数可）は、Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５およびＮａＣｌ、ならびに必要に応じてグリセロールを含む、これらから本質的になるまたはこれらからなる。
緩衝剤Ａは、１０ｍＭ～３０ｍＭ、１５ｍＭ～２５ｍＭ、１９ｍＭ～２１ｍＭまたは約２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５を含むことができる。緩衝剤Ａは、０．２５Ｍ～０．９５Ｍ、０．３５Ｍ～０．７５Ｍ、０．４５Ｍ～０．５５Ｍ、約０．５Ｍ、０．６５Ｍ～０．７５Ｍまたは約０．７Ｍ ＮａＣｌを含むことができる。緩衝剤Ｂは、１０ｍＭ～３０ｍＭ、１５ｍＭ～２５ｍＭ、１９ｍＭ～２１ｍＭまたは約２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５を含むことができる。緩衝剤Ｂは、１Ｍ～３Ｍ、１．５Ｍ～２．５Ｍ、１．９Ｍ～２．１Ｍまたは約２Ｍ ＮａＣｌを含むことができる。緩衝剤Ａは、８％～１２％、９％～１１％または約１０％（ｖ／ｖ）グリセロールをさらに含むことができる。緩衝剤Ｂは、８％～１２％、９％～１１％または約１０％（ｖ／ｖ）グリセロールをさらに含むことができる。
配列番号１５のアニオン交換クロマトグラフィーのため、緩衝剤Ａは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５および０．５Ｍ ＮａＣｌを含むことができ、緩衝剤Ｂは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５および２．０Ｍ ＮａＣｌを含むことができる（表４）。配列番号１７のアニオン交換クロマトグラフィーのため、緩衝剤Ａは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５および０．５Ｍ ＮａＣｌを含むことができ、緩衝剤Ｂは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５および２．０Ｍ ＮａＣｌを含むことができる。配列番号１４のアニオン交換クロマトグラフィーのため、緩衝剤Ａは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、０．７Ｍ ＮａＣｌおよび１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含むことができ、緩衝剤Ｂは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、２．０Ｍ ＮａＣｌおよび１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含むことができる（表５）。
一部の実施形態では、ある特定の体積の塩溶液が、タンパク質溶液に添加される。一部の場合では、約０．１～約５Ｍに及ぶ（raging）濃度を有するＮａＣｌ溶液が、タンパク質溶液に添加される。
タンパク質および固相（例えば、樹脂）の適切な相互作用を確実にするような特異的な流速および特異的なカラム滞留時間を観察することができるように、タンパク質溶液をカラムにロードすることができる。一部の場合では、流速は、カラム滞留時間が約３０秒間～約６分間または約５分間となるように制御される。カラム滞留時間は、少なくとも３０秒間または１、２、３、４もしくは５分間であり得る。カラム滞留時間は、３、４、５、６、７、８、９または１０分間以下であり得る。フロースルーを採取および解析して、損失として考慮される結合されていないタンパク質が存在するか否か決定することができる。タンパク質解析および精製のため、タンパク質濃度およびタンパク質純度のためのＳＥＣ－ＨＰＬＣのために約２８０ｎｍにおける吸光度が決定される。
一部の実施形態では、あるパーセンテージ（例えば、０～１００％）または流速（例えば、１～１０ｍＬ／分）の第１の緩衝剤を、第２の緩衝剤と組み合わせて、カラム精製システムの特異的最終流速（例えば、１～１０ｍＬ／分）を達成する。例えば、０．０～６２．５％Ｂ（１００～３７．５％Ａ）からの２０カラム体積（ＣＶ）の直線勾配と、それに続く追加的な５ＣＶにわたる１００％Ｂ（０％Ａ）へのステップ勾配が、タンパク質精製のために行われる。一部の場合では、０～７５％Ｂ（１００～２５％Ａ）４０ＣＶ、ステップ１００％Ｂ、１０ＣＶの勾配を、９１～９３％純粋タンパク質および回収＞９０％を指し示す溶出勾配として行うことができる。
第１の画分における天然に存在しない融合タンパク質の純度は、９０％～９９％または９１％～９５％であり得る。第１の画分における可溶化された天然に存在しない融合タンパク質の純度は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％であり得る。第１の画分における可溶化された天然に存在しない融合タンパク質の回収は、６１％～８１％、６６％～７６％または７１％～７２％であり得る。
カチオン交換クロマトグラフィーまたはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー
本明細書に記載されている方法は、アニオン交換クロマトグラフィー後に得られた第１の画分をカチオン交換樹脂に供して、天然に存在しない融合タンパク質を含む第２の画分を得るステップをさらに含むことができる。カチオン交換樹脂は、サルフェート官能化メタクリレート樹脂であり得る。カチオン交換樹脂は、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）サルフェート－６５０Ｆ樹脂であり得る。
本明細書に記載されている方法は、その上またはそれに代えて、アニオン交換クロマトグラフィー後に得られた第１の画分をヒドロキシアパタイト樹脂に供して、天然に存在しない融合タンパク質を含む第２の画分を得るステップを含むことができる。ヒドロキシアパタイト樹脂は、カルシウム親和性をさらに含むカチオン交換樹脂であり得る。ヒドロキシアパタイト（hydroxyapaptite）樹脂は、リン酸カルシウムを含むことができる。ヒドロキシアパタイト樹脂は、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２の化学式を含むことができる。ヒドロキシアパタイト樹脂は、３０μｍ～５０μｍ、３５μｍ～４５μｍまたは約３９μｍの粒径を含むことができる。ヒドロキシアパタイト樹脂は、ＣａＰｕｒｅ（登録商標）樹脂であり得る。
ＣａＰｕｒｅ（登録商標）樹脂の利点は、ａ）水溶液中の高い伝導度でのタンパク質吸着を可能にする、塩耐性；ｂ）ロードに先立つ、タンパク質（例えば、配列番号１４～２１等の融合タンパク質）の調製が要求されないこと；ｃ）高い回収（＞９０％）をもたらすこと；ｄ）高い結合能（＞２０ｍｇ／ｍＬ樹脂）；ｅ）低分子量（ＬＭＷ）不純物の除去により純度を増加させること；およびｆ）エンドトキシンクリアランス（＜１．０ＥＵ／ｍｇ）を確実にすることを含むことができる。
カチオン交換樹脂またはヒドロキシアパタイト樹脂を使用して、クロマトグラフィーカラムを充填することができる。カラムは、１０ｃｍ～５０ｃｍまたは約２０ｃｍのベッドの高さを含むことができる。カラムは、少なくとも１０ｃｍ、１５ｃｍ、２０ｃｍ、２５ｃｍまたは３０ｃｍのベッドの高さを含むことができる。カラムは、２０ｃｍ、３０ｃｍ、４０ｃｍまたは５０ｃｍ以下のベッドの高さを含むことができる。一部の場合では、ヒドロキシアパタイト混合モード樹脂ＣａＰｕｒｅ（登録商標）を使用して、１０～５０ｃｍのベッドの高さを有するカラムを充填し、最大１０～１００ｇ／Ｌの動的結合能を容易にするカラム体積を確実にして、所望の含量のタンパク質の産生を可能にする。
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにおける溶出（例えば、勾配溶出）に使用される緩衝系は、１、２、３または４種の異なる緩衝液（例えば、緩衝剤Ａ～Ｄ）を含むことができる。一部の実施形態では、２種の緩衝剤がヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにおいて使用され、これらは本明細書において、緩衝剤Ａおよび緩衝剤Ｂと称される。一部の場合では、緩衝液は、Ｔｒｉｓ（例えば、１０～５０ｍＭ、ｐＨ７～９）および／またはＮａＣｌ（例えば、０．１～５Ｍ）を含む。一部の場合では、緩衝液は、グリセロールをさらに含む。一部の実施形態では、例えば、緩衝剤Ａ等、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにおいて使用される第１の緩衝液は、Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、ＮａＣｌおよびＣａＣｌ２を含む、これらから本質的になるまたはこれらからなる。一部の実施形態では、例えば、緩衝剤Ｂ等、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにおいて使用される第２の緩衝液は、リン酸ナトリウムｐＨ７．０、ＮａＣｌおよびＣａＣｌ２を含む、これらから本質的になるまたはこれらからなる。
緩衝剤Ａは、１０ｍＭ～３０ｍＭ、１５ｍＭ～２５ｍＭ、１９ｍＭ～２１ｍＭまたは約２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５を含むことができる。緩衝剤Ａは、８０ｍＭ～１２０ｍＭ、９０ｍＭ～１１０ｍＭまたは約１００ｍＭ ＮａＣｌを含むことができる。緩衝剤Ａは、０．５ｍＭ～１．５ｍＭ、０．７５ｍＭ～１．２５ｍＭ、０．９ｍＭ～１．１ｍＭまたは約１ｍＭのＣａＣｌ２を含むことができる。緩衝剤Ｂは、１５０ｍＭ～２５０ｍＭ、１７５ｍＭ～２２５ｍＭ、１９０ｍＭ～２１０ｍＭまたは約２００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０を含むことができる。緩衝剤Ｂは、５０ｍＭ～１５０ｍＭ、７５ｍＭ～１２５ｍＭ、９０ｍＭ～１１０ｍＭまたは約１００ｍＭ ＮａＣｌを含むことができる。緩衝剤Ｂは、０．５ｍＭ～１．５ｍＭ、０．７５ｍＭ～１．２５ｍＭ、０．９ｍＭ～１．１ｍＭまたは約１ｍＭのＣａＣｌ２を含むことができる。
配列番号１５のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーのため、緩衝剤Ａは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＣａＣｌ２を含むことができ、緩衝剤Ｂは、２００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＣａＣｌ２を含むことができる（表６）。配列番号１７のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーのため、緩衝剤Ａは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＣａＣｌ２を含むことができ、緩衝剤Ｂは、２００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＣａＣｌ２を含むことができる。配列番号１４のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーのため、緩衝剤Ａは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＣａＣｌ２を含むことができ、緩衝剤Ｂは、２００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＣａＣｌ２を含むことができる（表７）。
カチオン交換樹脂またはヒドロキシアパタイト樹脂の使用後の可溶化されたタンパク質の純度は、９９％～１００％であり得る。ヒドロキシアパタイト樹脂の使用後の可溶化されたタンパク質の純度は、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であり得る。ヒドロキシアパタイト樹脂の使用後の可溶化されたタンパク質の回収は、８５％～１００％、９６％～９９％または９７％～９８％であり得る。ヒドロキシアパタイト樹脂は、ＣａＰｕｒｅ（登録商標）であり得る。
精製された化合物（例えば、融合タンパク質）を含有する、カラムクロマトグラフィーの際に採取された画分は、緩衝液交換または透析濾過を使用して、投与のために濃縮および製剤化することができる。例えば、ＣａＰｕｒｅ（登録商標）の際に採取された画分は、タンパク質を濃縮するためのＴＦＦシステム（例えば、Ｐａｌｌ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して濃縮および製剤化することができる。タンパク質は、２０ｍｇ／ｍＬの最終濃度に濃縮し、続いて、５倍緩衝液交換することができる。濾過プロセスは、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃａｎ３、０．１１４ｍ２ ＴＦＦ平板カセットによる限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）およびフィルターを使用して行うことができる。濾過システムのＭＷＣＯは、精製されるタンパク質（例えば、分子量）に応じて変動し得る。透析濾過緩衝剤は、１０～２０ｍＭリン酸ナトリウム、約ｐＨ７．０、５０～１００ｍＭ ＮａＣｌからなることができる。製剤化された配列番号１４～２１はその後、ＡｋｒｏＰａｃ ０．８／０．２ｕｍフィルターならびにＣｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ蠕動ポンプおよびチューブを用いた流動濾過システムを使用して濾過することができる。精製および製剤化されたタンパク質は、さらなる使用まで、アリコートに分けて－８０℃で貯蔵することができる。
特定の実施形態では、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって解析されたタンパク質は、ＴＳＫｇｅｌ ＧＷ３０００ＳＷＸＬ、５μｍ、７．８ｍｍ ＩＤ×３０．０ｃｍ Ｌカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、８５４１）を使用して、９７％を上回る純度（典型的には＞９８％）を示すことができる。
タンパク質解析
タンパク質解析
異なる画分由来の試料は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＭＰイメージングシステムを使用したＳＤＳ－ＰＡＧＥによって解析することができ、カラムクロマトグラフィーの際に採取された画分は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｏｎｅ（商標）を使用して、タンパク質含有量について解析することができる。タンパク質検出または解析のための一般的技法は、ゲル電気泳動、蛍光顕微鏡、キャピラリー電気泳動、質量分析、電気泳動移動度シフトアッセイまたは核磁気共鳴を含む。
処置方法
処置方法
本開示の様々な実施形態では、本開示の融合分子を含む医薬組成物が、炎症性疾患の処置および／または予防における使用のために提供される。このような医薬組成物は、経口送達のために製剤化することができる。「炎症性疾患」は、急性または慢性炎症に関連するあらゆる疾患を含むことができる。急性炎症は、有害な刺激に対する身体の初期応答であり、血液から傷害された組織への血漿および白血球（例えば、顆粒細胞等）の移動の増加に起因する。いくつもの生化学的事象が、炎症性応答を伝播および成熟させ、これには、局所的脈管系、免疫系、および傷害された組織内の様々な細胞が関与する。延長された炎症は慢性炎症と称され、これは、炎症の部位に存在する細胞の型の漸進的シフトをもたらし、炎症性過程からの組織の同時破壊および治癒によって特徴付けられる。炎症性疾患は、例えば、熱傷、化学的刺激物、凍傷、毒素、病原体による感染、物理的傷害、過敏症が原因の免疫反応、電離放射線、または例えば、破片、ほこりおよびデブリ等の異物に起因し得る。一部の実施形態では、炎症性疾患は、上皮細胞傷害、肝炎、肥満、脂肪性肝疾患、肝臓の炎症、膵炎、クローン病、フィステル形成性クローン病、潰瘍性大腸炎、軽度から中等度の潰瘍性大腸炎、中等度から重度の潰瘍性大腸炎、嚢炎、直腸炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病、関節リウマチまたは乾癬である。
対象における疾患または状態を処置するための方法であって、天然に存在しない融合タンパク質を対象に投与するステップを含む方法がさらに本明細書に記載されている。一部の実施形態では、疾患または状態は、上皮細胞傷害、肝炎、肥満、脂肪性肝疾患、肝臓の炎症、膵炎、クローン病、フィステル形成性クローン病、潰瘍性大腸炎、軽度から中等度の潰瘍性大腸炎、中等度から重度の潰瘍性大腸炎、嚢炎、直腸炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病、関節リウマチまたは乾癬である。天然に存在しない融合タンパク質は、対象に経口投与することができる。対象は、ヒトであり得る。
本実施例は、単に説明目的のために提供され、本明細書に提供される特許請求の範囲を限定するものではない。
（実施例１）
送達構築物の発現
（実施例１）
送達構築物の発現
本実施例では、コリックスに由来する担体配列、スペーサー配列、および治療ペイロードを含む単一のアミノ酸配列としての送達構築物の調製について概略的に記載する。
先ず、配列番号１５の送達構築物をコードする核酸配列をＰＣＲによって、ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩとＰｓｔＩ、ＡｇｅＩとＥｃｏＲＩ、またはＰｓｔＩとＥｃｏＲＩ部位の制限酵素ペアをＰＣＲ産物の２末端に取り込みつつ増幅した。制限酵素消化後に、ＰＣＲ産物を、対応する制限酵素ペアで消化された細胞発現に適切なプラスミドへとクローニングした。プラスミドは、配列番号１５に示すアミノ酸配列を含む送達構築物をコードした。
次の通りに送達構築物を発現させた：適切なプラスミドの存在下で標準熱ショック方法を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳコンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）を形質転換して、送達構築物発現細胞を生成し、アンピシリン含有培地において選択し、抗生物質を有するルリア・ベルターニ（Luria-Bertani）ブロス（Ｄｉｆｃｏ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、Ｎ．Ｊ．）において単離および育成し、次いで、ＯＤ ０．６において１ｍＭイソプロピル－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によりタンパク質発現のために誘導した。ＩＰＴＧ誘導の２時間後に、５，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により細胞を収集した。細胞溶解後に封入体を単離し、１ｇ／１０ｍＬ比の水で２回洗浄した。細胞溶解から得たペレットを水で再懸濁し、続いて、１０，０００ｒｐｍで４℃にて１時間遠心分離した。この洗浄を次に１回反復した。その中にある２回洗浄ＩＢ（ＤＷＩＢ）を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、６ＭグアニジンＨＣｌおよび１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する緩衝剤において可溶化した。次に、可溶化された材料を、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝８．５、４℃）、１．０Ｍ Ｌ－アルギニン、１０％グリセロール、３ｍＭ Ｌ－システイン、１ｍＭシスタミン－２ＨＣｌを含有するリフォールディング緩衝剤に希釈した。配列番号１５を有するリフォールディングされたタンパク質を、アニオン交換クロマトグラフィー（Ｑセファロースイオン交換）およびＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲル濾過クロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｗｅｄｅｎ）によって精製した。タンパク質の純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび分析的ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｉｎｃ．Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）によって査定した。
送達構築物を評価して、その予想される分子サイズに関して適正なフォールディングを検証した。誘導後に、発現されたタンパク質を封入体から採取した。封入体を使用して、送達構築物の発現の程度をゲル電気泳動によって検証し、見かけ上の分子量を計算された質量と比較した。
結果は、高い収量および純度での機能的な送達構築物の安定で効率的な産生を実証した。
（実施例２）
上皮細胞単層を越えたペイロードの輸送を査定するｉｎ ｖｉｔｒｏモデル
（実施例２）
上皮細胞単層を越えたペイロードの輸送を査定するｉｎ ｖｉｔｒｏモデル
本実施例は、本明細書に記載されているペイロードまたは送達構築物の輸送特性を評価するように設計されたｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを実証する。
図１は、上皮細胞単層の上にある頂端チャンバーおよび斯かる上皮細胞単層の下にある基底チャンバーを含むセットアップを模式的に示す。
頂端から側底への透過性のため、被験物質（例えば、送達構築物、ペイロード等）を頂端（Ａ）側に添加し、透過の量を側底（Ｂ）側で決定した。側底から頂端への透過性のため、被験物質を側底（Ｂ）側に添加し、透過の量を頂端（Ａ）側で決定した。
データは、次の方程式に従った透過性（Ｐａｐｐ）として表すことができる：Ｐａｐｐ＝（ｄＱ／ｄｔ）／（Ｃ０＊Ａ）。Ｑ／ｄｔは、透過の速度であり、Ｃ０は、被験物質の初期濃度であり、Ａは、単層の面積である。流出輸送比（Ｒｅ）は、次の方程式に従って計算することができる：（Ｒｅ）＝Ｐａｐｐ（Ｂ－Ａ）／Ｐａｐｐ（Ａ－Ｂ）。Ｒｅ＞２は、Ｐ－ｇｐの潜在的な基質または他の活性流出輸送体を指し示すことができる。
ＳＭＩ－１００またはＣａｃｏ－２細胞を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで担体または送達構築物のトランスサイトーシス機能を査定することができる。
Ｃａｃｏ－２細胞のため、ＥＬＩＳＡアッセイを行って、トランスサイトーシスによりＣａｃｏ－２細胞単層を越えて移動する担体または送達構築物の能力を評価した。Ｃａｃｏ－２（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－３７（商標））細胞は、５％ＣＯ２で３７℃にて完全培地において維持した：１０％ウシ胎仔血清、２．５ｍＭグルタミン、１００Ｕのペニシリン／ｍｌおよび１００μｇのストレプトマイシン／ｍｌを補充したダルベッコ変法イーグル培地Ｆ１２（ＤＭＥＭ Ｆ１２）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．）。細胞に、２～３日毎にこの培地（完全培地と命名）を供給し、５～７日毎に継代した。アッセイのため、細胞を２４または９６ウェルプレートに播種し、コンフルエンスになるまで育成した。
Ｃａｃｏ－２細胞を、コラーゲンでコーティングされた０．４μｍポアサイズのポリカーボネート膜トランスウェルサポート（Ｃｏｒｎｉｎｇ－Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）上にコンフルエントな単層として育成し、ｃｈｏｐｓｔｉｃｋ Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ－ＥＲＳ（登録商標）電圧計（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して測定された＞２５０Ω・ｃｍ２の経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）を達成してから１８～２５日後に使用した。このような単層を越えた担体または送達構築物の頂端から側底への（Ａ→Ｂ）輸送は、３７℃での送達構築物の４．７ｎＭ、２３．６ｎＭおよび２３６ｎＭ頂端アプライ後のある特定の時点（例えば、１５、３０および４５分目）で、輸送されたタンパク質の量を測定することにより決定した。ＴＥＲ測定および１０ｋＤａ蛍光デキストランの程度（ＨＰＬＣサイズ排除プロトコールを使用して測定）を使用して、試験の経過における単層関門特性を検証した。送達構築物（例えば、配列番号１５）の輸送の程度は、細胞に基づく細胞傷害性アッセイにおける採取された培地のタイトレーションにより決定した。輸送された送達構築物は、捕捉および検出のための抗体（例えば、抗担体または抗ペイロード、例えば、抗ＩＬ－２２抗体）を使用した酵素結合免疫吸着（immunosorbant）アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定した。
細胞培養インサート上に確立されたヒト小腸組織（ＳＭＩ－１００、ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）のコンフルエントな単層を、使用に先立ち２４時間３７℃で安定化させた。４００Ω・ｃｍ２より高い経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を有するインサートのみを、試験における使用に十分な単層統合性を有するとみなした。単層統合性の二次検証は、７０ｋＤデキストラン輸送の抑制を査定することにより行った。チャンバーを輸送緩衝剤（ＰＢＳ）で１回洗浄した。２０μｇ／ｍＬの濃度で調製された被験分子は、１００μＬ体積でインサートの頂端表面にアプライした。５００μＬ ＰＢＳの側底体積を、輸送試験のために各時点で置き換えた。各実験条件は３連で行った。
（実施例３）
極性化された腸上皮細胞を越えたＩＬ－２２の担体媒介性輸送
（実施例３）
極性化された腸上皮細胞を越えたＩＬ－２２の担体媒介性輸送
本実施例は、担体（配列番号７）が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで極性化された腸上皮細胞を越えてＩＬ－２２ペイロード（配列番号１１）を輸送することができることを実証する。本実施例は、配列番号７を有する担体が、ｉｎ ｖｉｖｏで、極性化された腸上皮細胞を越えて固有層へと、生物活性があるＩＬ－２２ペイロードを輸送することができることをさらに実証する。
Ｃａｃｏ－２細胞単層および小腸上皮組織（本明細書においてＳＭＩ－１００とも称される）を越えた送達構築物（配列番号１５）の輸送は、頂端（Ａ）から基底（Ｂ）への輸送に関する実施例２に従って、また図１に説明される通り、送達構築物を上皮細胞の頂端膜にアプライすることにより試験した。実験は２連で行い、頂端アプライ後１５、３０および４５分目に側底チャンバーから試料を採取して、輸送されたタンパク質の量を決定した。トランスサイトーシスされたタンパク質の量は、実施例２に記載されている通り、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。
図２および図３におけるデータは、担体（配列番号７）が、ＩＬ－２２（配列番号１１）にカップリングされると、時間依存的様式で、Ｃａｃｏ－２（図２）とＳＭＩ－１００（図３）の単層のどちらをも越えてＩＬ－２２ペイロードの輸送をもたらしたこと、また、送達構築物が、担体にカップリングされていないＩＬ－２２（配列番号１２、Ｍ＋ＩＬ－２２３４～１７９）単独と比較して、上皮細胞を通過する約２～３倍多いＩＬ－２２をもたらしたことを示す。
ｉｎ ｖｉｖｏ実験のため、雄ウィスターラットを使用して、トランスサイトーシスを試験した。雄ウィスターラットは、１２／１２時間の明／暗サイクルにてケージ当たり３～５匹で収容し、試験が行われたときに約２２５～２７５ｇ（およそ６～８週齢）であった。実験は、連続的イソフルラン麻酔を使用する非回復プロトコールを使用して、明期中に遂行した。空腸中央（mid-jejunum）領域を露出する４～５ｃｍ正中線腹部切開を遂行した。３．８６×１０－５Ｍの送達構築物（配列番号１５）のストック溶液をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）において調製し、２９ゲージ針を使用した腔内注射（ＩＬＩ）によって５０μＬ（２５０ｇラット当たり）を投与した。次に、注射部位の腸間膜を永続的マーカーでマークした。試験終結時に、マークされた腸管セグメントを捕捉した３～５ｍｍ領域を単離し、顕微鏡査定のために処理した。
送達構築物（配列番号１５）のトランスサイトーシス活性の結果を図４に示し、これは、相当量のＩＬ－２２ペイロード（配列番号１１）が、ＩＬ－２２にカップリングされたコリックス由来担体（配列番号７）を含む送達構築物の一部として提供された場合、ｉｎ ｖｉｖｏでインタクトな極性化された腸上皮を通過したことを実証する。この顕微鏡画像は、ウィスターラットの空腸への配列番号１５の送達構築物の管腔アプライ後の、腸上皮の頂端部位（白色の矢印＃１で強調）から上皮細胞の基底部位（白色の矢印＃２で強調）へのおよび固有層（「ｌ．ｐ．」と省略）中への、ＩＬ－２２ペイロード（配列番号１１）の輸送を示す。画像は、ＩＬ－２２が、有意な程度まで、固有層内の細胞および極性化された上皮の基底外膜（白色の矢印＃３で強調）に位置するＩＬ－２２受容体と相互作用しこれに結合したことをさらに示す。ＩＬ－２２局在は、白色の矢印＃２および＃３によって指し示される。
（実施例４）
組換えヒトＩＬ－２２は、マウスＩＬ－２２受容体に結合する
（実施例４）
組換えヒトＩＬ－２２は、マウスＩＬ－２２受容体に結合する
本実施例は、組換えヒトＩＬ－２２（ｒｈＩＬ－２２、配列番号１２）が、組換えマウスＩＬ－２２（ｒｍＩＬ－２２）に匹敵する用量依存的様式でマウスＩＬ－２２受容体に結合することを実証する。
図５Ａは、アゴニスト濃度（ｐＭ単位）の関数としてのマウスＦＬ８３ Ｂ細胞におけるＳＴＡＴ３リン酸化を実証し、アゴニストは、ｒｈＩＬ－２２（配列番号１２）またはｒｍＩＬ－２２である。データは、ｒｈＩＬ－２２およびｒｍＩＬ－２２が、濃度依存的様式でＳＴＡＴ３リン酸化を誘導したことを示し、ヒトＩＬ－２２タンパク質が、マウスＩＬ－２２と同程度に有効に、マウスＩＬ－２２受容体に結合し、それを介したシグナル伝達を誘導することができることを実証する。
図５Ｂは、ｒｈＩＬ－２２（配列番号１２）およびｒｍＩＬ－２２が、マウスＨｅｐａ１－６細胞におけるＳＴＡＴ３リン酸化も誘導したことを実証する。
図６Ａは、ｒｈＩＬ－２２（配列番号１２）およびｒｍＩＬ－２２が、用量依存的様式でマウスＦＬ８３ Ｂ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化を誘導したことを実証し、ヒトＩＬ－２２タンパク質が、マウスＩＬ－２２に匹敵する有効性で、マウスＩＬ－２２受容体に結合し、それを介したシグナル伝達を誘導することができることを実証する。
図６Ｂは、ｒｈＩＬ－２２（配列番号１２）およびｒｍＩＬ－２２が、マウスＨｅｐａ１－６細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化も誘導したことを実証するが、追加的な用量範囲（ranging）がフォローアップ実験において行われる必要があるであろう。
これらのデータは、ｒｈＩＬ－２２（例えば、配列番号１０または１１を有する送達構築物において使用される）が、マウス細胞においてＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５を活性化することができることの強力な証拠を提供し、よって、ＩＬ－２２活性および機能を査定するためのマウスモデルにおける斯かる送達構築物の使用についての理論的根拠を提供する。
（実施例５）
大腸炎モデルにおける配列番号１５を有する送達構築物のｉｎ ｖｉｖｏ有効性
（実施例５）
大腸炎モデルにおける配列番号１５を有する送達構築物のｉｎ ｖｉｖｏ有効性
本実施例は、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）マウスモデルにおいて、ＩＬ－２２単独（配列番号１２）と比較して、配列番号１３を有するリンカーを介して配列番号１１を有するＩＬ－２２にカップリングされたコリックス由来の配列番号７の担体を含む配列番号１５を有する送達構築物のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を実証する。
図７Ａは、２種の１日１回用量レベルの１ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇにおける配列番号１５の送達構築物の経口的（ｐ．ｏ．）投与ならびに４ｍｇ／ｋｇのｒｈＩＬ－２２の１種の１日１回投与（腹腔内（ｉ．ｐ．））を比較するための、ｉｎ ｖｉｖｏ試験設計および予定表の概観を示す。ｉｎ ｖｉｖｏ試験は、通常の固形飼料を与えた、８～１０週齢の、ほぼ２３ｇの雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて行った。大腸炎は、自由摂取の飲料水中の２．５％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）により化学的に誘導した。試験エンドポイントは、体重のパーセント変化、疾患活動性指標、結腸の長さおよび重量、ならびに病理組織学を含んだ。
図７Ｂは、図７Ａに記載されている試験で使用される実験および対照群の特徴を示す。
図８Ａは、様々な実験および対照群の、０日目と比べた試験１０日目における動物の体重のパーセント（％）変化を示す。媒体と比べた、配列番号１２を有するｒｈＩＬ－２２または配列番号１５を有する送達構築物によるベースライン（０ｖｓ．１０日目）体重変化は、一元配置ＡＮＯＶＡによって査定された場合、有意ではなかった。陽性モデル対照（シクロスポリン）ＣｓＡは、一元配置ＡＮＯＶＡによって査定された場合、媒体と比べて有意に異なった。
図８Ｂは、最初の１０試験日にわたる実験および対照動物の体重の変化を示す。試験期間にわたるＣｓＡ群平均体重は、二元配置ＡＮＯＶＡによって査定された場合、６日目から１０日目に媒体対照と比べて有意に改善された（＊、＊＊、＊＊＊）。ｒｈＩＬ－２２（ｉ．ｐ．）体重は、二元配置ＡＮＯＶＡによって査定された場合、１０日目に媒体対照と比べて有意に改善された（＊）、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
図９は、ＩＬ－２２血漿レベルを決定するための血漿ＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。結果は、血漿ｒｈＩＬ－２２濃度が、配列番号１５を有する送達構築物の１および３０ｍｇ／ｋｇ用量の両方の経口経管栄養後に、用量依存的様式での、血漿中レベルの増加に向かう傾向があったことを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；平均＋ＳＥＭ；ｎ＝２匹のナイーブ、５匹の媒体、５匹のＣｓＡ、１０匹のその他）。
これらのデータは、配列番号１５を有する送達構築物が、経口経管栄養による投与後に、体重改善に向かう用量依存的傾向を誘導したことを示す。ＩＬ－２２は、配列番号１５を有する送達構築物の１および３０ｍｇ／ｋｇ用量の両方の経口経管栄養後に、用量依存的様式で血漿中レベルが増加していることが測定によりわかった。これらのデータは、配列番号１５を有する経口投与された送達構築物が、ｉ．ｐ．投与されたｒｈＩＬ－２２と匹敵して、ＤＳＳマウスモデルにおける大腸炎の症状を低下させることができることを示唆する。
加えて、後述するＣＤ－１マウスにｒｈＩＬ－２２を投与することにより、配列番号１５を有する経口投与可能な（administrable）送達構築物のバイオマーカーを評価した。
図１０Ａは、健康なＣＤ－１マウスにおけるｒｈＩＬ－２２の単一（急性）投薬後の、標的関与のバイオマーカー（複数可）を同定するように設計された、単一用量ｉｎ ｖｉｖｏ試験の概観を示す。
図１０Ｂは、健康なＣＤ－１マウスにおけるｒｈＩＬ－２２の単一および複数用量後の、標的関与のバイオマーカー（複数可）を同定するように設計された、複数用量（亜慢性投薬）ｉｎ ｖｉｖｏ試験の概観を示す。
図１１Ａは、ｒｈＩＬ－２２の急性および亜慢性投与が、一貫してＩＬ－２２濃度を増加させることを示す。
図１１Ｂは、図１１Ａに記載されている急性および亜慢性投薬実験において測定されたいくつかの薬物動態パラメーターを示す。
図１２Ａは、ｒｈＩＬ－２２（配列番号１２）の急性投薬の１日後および５日間のｒｈＩＬ－２２（配列番号１２）の亜慢性投薬の後に応答した、誘導された循環するマウスＣ反応性タンパク質（ｍＣＲＰ）濃度を示す。結果は、両方の試験群における循環するｍＣＲＰの時間依存的増加を示す。
図１２Ｂは、ｒｈＩＬ－２２（配列番号１２）の急性投薬の１日後の、血漿ｍＣＲＰ濃度の倍の変化を示す。
図１２Ｃは、５日間のｒｈＩＬ－２２（配列番号１２）の亜慢性投薬の後の、血漿ｍＣＲＰ濃度の倍の変化を示す。
図１３Ａは、ｒｈＩＬ－２２（配列番号１２）の急性投薬の１日後および５日間のｒｈＩＬ－２２（配列番号１２）の亜慢性投薬の後に応答した、誘導された循環するマウス血清アミロイドタンパク質Ａ（ｍＳＡＡ）濃度を示す。結果は、両方の試験群における循環するｍＳＡＡの時間依存的増加を示し、およその血漿ピーク濃度は、投与の約８時間後である。
図１３Ｂは、ｒｈＩＬ－２２（配列番号１２）の急性投薬の１日後の、血漿ｍＳＡＡ濃度の倍の変化を示す。
図１３Ｃは、５日間のｒｈＩＬ－２２（配列番号１２）の亜慢性投薬の後の、血漿ｍＳＡＡ濃度の倍の変化を示す。
図１４Ａは、ｒｈＩＬ－２２（配列番号１２）の急性投薬の１日後および５日間の亜慢性投薬ｒｈＩＬ－２２（配列番号１２）後に応答した、誘導された循環する再生膵島由来タンパク質３β（Ｒｅｇ３β）を示す。
図１４Ｂは、ｒｈＩＬ－２２（配列番号１２）の急性投薬の１日後の、血漿Ｒｅｇ３β濃度の倍の変化を示す。
図１４Ｃは、５日間のｒｈＩＬ－２２（配列番号１２）の亜慢性投薬の後の、血漿Ｒｅｇ３β濃度の倍の変化を示す。
これらの結果は、標的関与の３種の潜在的なＩＬ－２２ ＰＤバイオマーカー：Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドタンパク質Ａ（ＳＡＡ）および再生膵島由来タンパク質３β（Ｒｅｇ３β）が、配列番号１５または１７を有するもの等の送達構築物の薬力学（ＰＤ）を評価する試験において使用し得ることを実証する。
（実施例６）
タンパク質可溶化
（実施例６）
タンパク質可溶化
配列番号１５発酵由来の６２７ｇの２回洗浄封入体（ＤＷＩＢ）を、４５００ｍＬの８Ｍグアニジン／ＨＣｌ（Ｇｕ－ＨＣｌ）および５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に再懸濁した。その後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５を添加して、６．０Ｌの体積を完了した。溶液を撹拌プレート上で穏やかに撹拌し、９．２２５ｇの還元剤ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加した。６Ｌの最終的な可溶化されたタンパク質（配列番号１５）溶液は、６Ｍ Ｇｕ－ＨＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＤＴＴおよびほぼ１ｇのＤＷＩＢ／１０ｍＬ緩衝剤からなった。可溶化されたタンパク質（配列番号１５）溶液を、磁気撹拌プレート上で撹拌しながら室温（ＲＴ）でインキュベートし、次いで、１５，９７０×ｇで９０分間４℃にて遠心分離した。可溶化されたタンパク質を含む上清を、５５２０ｍＬの総体積で新たな容器に慎重に移した。タンパク質濃度決定は、ブラッドフォードアッセイにより行い、１５ｍｇ／ｍＬに決定された。
データは、上述の手順を使用してタンパク質可溶化を行うことができることを実証する。
（実施例７）
タンパク質リフォールディング
（実施例７）
タンパク質リフォールディング
本実施例は、図１７のフローチャートに記載されている精製プロセスの一部としてのタンパク質リフォールディングを実証する。
リフォールディング溶液は、慎重に研究、開発および最適化した（図１８）。最適化プロセスは、１５種の異なるマトリックス、１２種の変数および２００種のリフォールディング反応の実験設計（ＤＯＥ）を利用した。決断は消去法によって下された。初期リフォールディング混合物（初期リフォールディング溶液およびリフォールディングされた可溶化されたタンパク質（配列番号１５）を含有する）を表２に提示する。最適化されたリフォールディング混合物（最適化されたリフォールディング溶液およびリフォールディングされた可溶化されたタンパク質（配列番号１５）を含有する）を表３に提示する。
１０５Ｌのリフォールディング溶液を４℃で１６時間インキュベートし、次いで、０．８／０．２ｕｍ膜ならびにＣｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ蠕動ポンプおよびチューブを使用してフローフィルター（Ｐａｌｌ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＡｋｒｏＰａｃまたはＳａｒｔｏｒｉｕｓのＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２ＸＬＧ）を通して濾過した。
実施例６由来の可溶化されたタンパク質（配列番号１５）（１０５ｇ）を、４℃に予め冷却された１００Ｌの最適化されたリフォールディング溶液に添加した。
本プロセスは、７３ｍｌ／分に設定されたＣｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ蠕動ポンプを使用して１時間にプログラムした。本プロセスは、４℃の低温室で行われた。
最適化されたリフォールディング緩衝液は、配列番号１５の凝集体と比べて、より大量の配列番号１５を産生した（図１９～図２０）。初期リフォールディング溶液の使用は、約１０％～１５％の正確にリフォールディングされた配列番号１５を産生した。最適化されたリフォールディング溶液の使用は、約４５％～５５％の正確にリフォールディングされた配列番号１５を産生した。
（実施例８）
ＴＦＦ ＵＦ／ＤＦによるタンパク質濃縮および緩衝液交換
（実施例８）
ＴＦＦ ＵＦ／ＤＦによるタンパク質濃縮および緩衝液交換
本実施例は、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）原理に基づく接線流濾過（ＴＦＦ）を使用したタンパク質濃縮および緩衝液交換を実証する。
リフォールディングされたタンパク質（例えば、配列番号１５の）をＴＦＦシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により処理して、これを１０倍に濃縮し、５倍に緩衝液交換した。プロセスは、４個の１０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｃｅｌｌ Ｐｅｌｌｉｃａｎ３、１．１４ｍ２ ＴＦＦ平板カセットを使用した限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）により行った。透析濾過緩衝剤は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基ｐＨ７．５および１００ｍＭ ＮａＣｌからなった。ＵＦ／ＤＦプロセスの終わりにおける最終体積は、１０Ｌであった。この材料をその後、Ｐａｌｌ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＡｋｒｏＰａｃ ０．８／０．２ｕｍフィルターならびにＣｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ蠕動ポンプおよびチューブを用いた流動濾過システムを使用して濾過した。ブラッドフォードアッセイを行って、タンパク質濃度、収量およびステップ回収を決定した。この時点で、定量的ＳＥＣ－ＨＰＬＣを行って、リフォールディングおよびＵＦ／ＤＦ試料に存在する配列番号１５を有する適正にフォールディングされたタンパク質の量を決定した。公知の濃度の市販のＢＳＡを参照標準として使用し、これからブラッドフォードアッセイのための検量線を作成した。Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステムおよびＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＳＷ３０００、４μｍ、４．６ｍｍ ＩＤ×３０．０ｃｍ Ｌ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１８６７５）カラムを使用した。この定量的アッセイに基づき、リフォールディング効率を決定した。
データは、緩衝液交換およびＴＦＦ ＵＦ／ＤＦを使用してタンパク質リフォールディングを行うことができることを示す。
（実施例９）
捕捉ステップＮＨ２－７５０Ｆ（登録商標）樹脂を使用したタンパク質クロマトグラフィー
（実施例９）
捕捉ステップＮＨ２－７５０Ｆ（登録商標）樹脂を使用したタンパク質クロマトグラフィー
本実施例は、ＮＨ２－７５０Ｆ（登録商標）樹脂を使用したタンパク質アニオン交換クロマトグラフィーにおける捕捉ステップを実証する。
Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ（ＧＥ）のＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０またはＡＫＴＡ Ｐｉｌｏｔ ＦＰＬＣシステムをタンパク質クロマトグラフィーに使用した。Ｔｏｓｏｈアニオン交換樹脂ＮＨ２－７５０Ｆ（登録商標）を使用して、カラムに少なくとも２０ｃｍの最小ベッドの高さを充填し、２０～２５ｇ／Ｌの動的結合能を容易にするであろうカラム体積を確実にした。２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５または２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．５の緩衝剤を使用して、カラムに充填した。使用された緩衝剤を次に示す：緩衝剤Ａ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、０．５Ｍ ＮａＣｌ；緩衝剤Ｂ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、２．０Ｍ ＮａＣｌ。次に、３０分間の接触時間により０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液でＮＨ２－７５０Ｆカラムを洗い、次いで少なくとも３カラム体積（ＣＶ）にわたり、またはｐＨおよび伝導度が、予想される値（ｐＨ７．５～ｐＨ７．７、ほぼ４９ｍＳ／ｃｍ＋／－１ｍＳ／ｃｍ）の安定したラインに達するまで緩衝剤Ａで平衡化した。
カラムへのロードに先立ち、ＵＦ／ＤＦタンパク質（配列番号１５）溶液に、５Ｍストック溶液を添加することにより０．４Ｍ ＮａＣｌを補充し、伝導度を測定して、４９ｍＳ／ｃｍ＋／－２ｍＳ／ｃｍの伝導度を確実にした。タンパク質（配列番号１５）溶液を、最小で５分間のカラム滞留時間の流速によりカラムにロードし、フロースルーを採取した。３ＣＶの緩衝剤Ａで、または２８０ｎｍにおける吸光度が戻り、ベースライン、２８０ｎｍにおける０．０ｍＡＵ付近で安定するまで、カラムを洗浄した。この時点で、０．０～６２．５％Ｂからの２０ＣＶの直線勾配に続き、１００％Ｂまでのステップ勾配を追加的な５ＣＶにわたり行った。その間、画分を採取し、それらの体積は、カラム体積の０．５以下であった。Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＭＰイメージングシステムを使用したＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、異なる画分由来の試料を解析し、９０％超の配列番号１５を含有する画分をプールし、ＮＨ２－７５０Ｆ－プールと命名した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｏｎｅ（商標）を使用して、配列番号１５に関して１．２２の消衰係数および２６０／２８０ｎｍ比＜０．６を考慮しつつ、２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）を読み取ることにより、ＮＨ２－７５０Ｆ－プールのタンパク質濃度を測定した。ＮＨ２－７５０Ｆ－プールは、およそ１．０Ｍ ＮａＣｌを含有する。
配列番号１５のＮＨ２－７５０Ｆ精製後の例としてのクロマトグラムは、２０ｃｍのベッドの高さおよび１０ｍＬのカラム体積に関しては図２１Ａに、３０ｃｍのベッドの高さおよび４．６Ｌのカラム体積に関しては図２１Ｂに示す。
ＮＨ２－７５０Ｆ精製の概略は、配列番号１５に関しては表４に、配列番号１５と類似の様式で全般に産生、リフォールディングおよび精製された配列番号１４に関しては表５に示す。
（実施例１０）
ＣａＰｕｒｅ（登録商標）手順を使用したタンパク質クロマトグラフィー
ＣａＰｕｒｅ（登録商標）手順を使用したタンパク質クロマトグラフィー
本実施例は、ＣａＰｕｒｅ（登録商標）手順を使用したタンパク質クロマトグラフィーにおける洗練精製ステップを実証する。
Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ（ＧＥ）のＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０またはＡＫＴＡ Ｐｉｌｏｔ ＦＰＬＣシステムを、配列番号１５および配列番号１４のタンパク質のタンパク質クロマトグラフィーに使用した。Ｔｏｓｏｈヒドロキシアパタイト混合モード樹脂ＣａＰｕｒｅ（登録商標）を使用して、配列番号１５および配列番号１４のそれぞれに関して、カラムに少なくとも１０ｃｍの最小ベッドの高さを充填し、最大２０ｇ／Ｌの動的結合能を容易にするであろうカラム体積を確実にした。配列番号１５に関して、使用された緩衝剤を次に示す：緩衝剤Ａ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＣａＣｌ２；緩衝剤Ｂ：２００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＣａＣｌ２。配列番号１４に関して、使用された緩衝剤を次に示す：緩衝剤Ａ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＣａＣｌ２；緩衝剤Ｂ：２００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＣａＣｌ２。次に、３０分間またはそれよりも長い接触時間により０．５ＭのＮａＯＨで各ＣａＰｕｒｅ（登録商標）カラムを洗い、次いで、少なくとも３カラム体積（ＣＶ）にわたり、またはｐＨおよび伝導度が、予想される値（ｐＨ７．５～ｐＨ７．７、ほぼ１１ｍＳ／ｃｍ＋／－１ｍＳ／ｃｍ）の安定したラインに達するまで、緩衝剤Ａで平衡化した。カラムにロードする前にＮＨ２－７５０Ｆ－プールを処置する必要はなかった。このことは、タンパク質損失、時間および資源を有意に低下させた。最小で５分間のカラム滞留時間の流速によりカラムにＮＨ２－７５０Ｆプールをロードし、フロースルーを採取した。３ＣＶの緩衝剤Ａで、または２８０ｎｍにおける吸光度が戻り、ベースライン、０．０ｍＡｕ付近で安定するまで、カラムを洗浄した。この時点で、０～２５％Ｂからの２５ＣＶの直線勾配に続き、１００％Ｂまでのステップ勾配を追加的な５ＣＶにわたり行った。その間、画分を採取し、それらの体積は、溶出プロファイルに応じて、カラム体積の０．３６～１．４３に及んだ。ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＭＰイメージングシステムを使用したＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、異なる画分由来の試料を解析し、９５％超の配列番号１５または配列番号１４を含有する画分をプールし、ＣａＰｕｒｅ－プールと命名した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｏｎｅ（商標）を使用して、配列番号１５に関して１．２２の消衰係数および２６０／２８０ｎｍ比＜０．６を考慮しつつ、２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）を読み取ることにより、ＣａＰｕｒｅ－プールのタンパク質濃度を測定した。
配列番号１５のＣａＰｕｒｅ（登録商標）精製後の例示的なクロマトグラムは、１０ｃｍのベッドの高さおよび５ｍＬのカラム体積に関しては図２２Ａに、２１ｃｍのベッドの高さおよび８００ｍＬのカラム体積に関しては図２２Ｂに示す。
ＣａＰｕｒｅ（登録商標）精製の概略は、配列番号１５に関しては表６に、配列番号１４に関しては表７に示す。
（実施例１１）
ＴＦＦ ＵＦ／ＤＦによるタンパク質濃縮
ＴＦＦ ＵＦ／ＤＦによるタンパク質濃縮
本実施例は、ＴＦＦ ＵＦ／ＤＦ手順によるタンパク質製剤化を実証する。
ＣａＰｕｒｅ（登録商標）プールをＴＦＦシステム（Ｐａｌｌ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により２０ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで濃縮し、続いて５倍に緩衝液交換した。３個の１０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃａｎ３、０．１１４ｍ２ ＴＦＦ平板カセットを使用した限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）により、プロセスを行った。透析濾過緩衝剤は、１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌからなった。製剤化された配列番号１５はその後、Ｐａｌｌ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＡｋｒｏＰａｃ ０．８／０．２ｕｍフィルターならびにＣｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ蠕動ポンプおよびチューブを用いた流動濾過システムを使用して濾過した。次に、製剤化された配列番号１５をアリコートに分けて－８０℃で貯蔵し、次の解析を行って、その生物物理学的品質を確実にした：（１）Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｏｎｅ（商標）を使用し、１．２２のタンパク質消衰係数を考慮して、２６０／２８０比＜０．６により２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによる、２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質（例えば、配列番号１５）濃度；（２）Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ機器によって測定された、１．０Ｅｕ／ｍｇを下回るＬＡＬエンドトキシンレベル；（３）ＴＳＫｇｅｌ ＧＷ３０００ＳＷＸＬ、５μｍ、７．８ｍｍ ＩＤ×３０．０ｃｍ Ｌカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、８５４１）を使用した、９７％を上回る純度（典型的には＞９８％）のＳＥＣ－ＨＰＬＣによる純度；（４）Ｂｉｏ－Ｒａｄゲル装置およびその関連するＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＭＰイメージングシステムを使用したＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析。
（実施例１２）
精製された融合分子のｉｎ ｖｉｖｏ活性の評価
（実施例１２）
精製された融合分子のｉｎ ｖｉｖｏ活性の評価
本実施例は、インタクトな上皮を越えて生物活性があるカーゴを運搬するその能力に関して、融合分子の適正なフォールディングを検証するための方法を実証する。
配列番号１５を有する融合タンパク質は、Ｅ ｃｏｌｉによって発現され、封入体から採取され、上の実施例８に記載されている通り、シャッフル交換緩衝系を使用してフォールディングされる。その結果生じる材料は、融合分子の分子特徴に応じて、実施例９および実施例１０に記載され、例えば、表４～７に要約されている方法に従って精製される。調製物は、ＳＤＳ ＰＡＧＥに基づくほぼ９８％のタンパク質純度を有する。上皮細胞は、２５ｎＭおよび２５０ｎＭの濃度の配列番号１５を有する融合分子で処置する。無処置のマッチした細胞と比較して、配列番号１５処置細胞は、生／死細胞についてフローサイトメトリーによって査定した場合、細胞数の用量依存的減少を生じる。値は、ｎ＝４±標準偏差を表す。
（実施例１３）
融合タンパク質精製のスケールアップ
（実施例１３）
融合タンパク質精製のスケールアップ
本実施例は、配列番号１５の融合タンパク質を使用した精製方法のスケールアップを実証する（図７Ａおよび図７Ｂ）。
配列番号１５を有する融合タンパク質を２種の異なるスケールで精製した。
第１の精製は、ＮＨ２－７５０Ｆ（登録商標）樹脂を充填された１０ｍＬの体積を有するクロマトグラフィーカラム、および次のパラメーター：ベッドの高さ：２０ｃｍ、滞留時間：５分間（流速：２ｍＬ／分）、緩衝剤Ａ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、０．５Ｍ ＮａＣｌ、緩衝剤Ｂ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、２Ｍ ＮａＣｌを使用して、また、次の勾配：０．０～６２．５％Ｂを２０カラム体積（ＣＶ）にわたり使用して行った。配列番号１５を有する融合タンパク質は、９３～９６％の純度、７１％より高い回収、およびエンドトキシンレベル＜１．０ＥＵ／ｍｇで得た。
第２の精製は、ＮＨ２－７５０Ｆ（登録商標）樹脂を充填された４．６Ｌの体積を有するクロマトグラフィーカラム、および次のパラメーター：ベッドの高さ：３０ｃｍ、滞留時間：１１．５５分間（流速：４００ｍＬ／分）、緩衝剤Ａ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、０．５Ｍ ＮａＣｌ、緩衝剤Ｂ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、２Ｍ ＮａＣｌを使用して、また、次の勾配：０．０～６２．５％Ｂを２０カラム体積（ＣＶ）にわたり使用して行った。配列番号１５を有する融合タンパク質は、９３～９６％の純度、７１％より高い回収、およびエンドトキシンレベル＜１．０ＥＵ／ｍｇで得た。
（実施例１４）
プロセスステップ回収の間の一貫性
（実施例１４）
プロセスステップ回収の間の一貫性
精製プロセスを行って、配列番号１５の融合タンパク質を４回精製し（ロット１～４）、精製プロセスの各ステージ後にこの融合タンパク質の回収を査定した（表８）。これらの反復間で融合タンパク質の回収において高度な一貫性が存在した。
これらのデータは、本開示の方法および組成物が、ラージスケールでの治療融合タンパク質の産生および精製を可能にしたこと、また、本明細書に開示されている方法および組成物が、スケールアップにおける高い一貫性を提供したことを実証する。
本明細書に開示および請求されている方法の全てが、本開示を踏まえて過度の実験法を行うことなく、創出および実行することができる。本開示の組成物および方法について、好まれる実施形態の観点から記載してきたが、当業者には、本開示の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されている方法におよび方法のステップまたは方法の一連のステップにおいて、変形形態を適用することができることが明らかであろう。より詳細には、化学的および生理学的の両方で関連するある特定の薬剤を、同じまたは同様の結果が達成されるのであれば、本明細書に記載されている薬剤の代用とすることができることが明らかであろう。当業者に明らかな斯かる同様の代用物および修正は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の趣旨、範囲および概念の内にあると考慮される。
（実施例１５）
配列番号１５および配列番号１７の比較
（実施例１５）
配列番号１５および配列番号１７の比較
配列番号１５および配列番号１７を表す精製された組成物において液体クロマトグラフィー質量分析（mass spectrophotometry）（ＬＣ－ＭＳ）を行い、結果をそれぞれ図２３Ｂおよび図２３Ａに表す。配列番号１７の組成物は、配列番号１５の組成物に関連して上に記載されているものと類似の様式で、産生、リフォールディングおよび精製した。
（実施例１６）
送達構築物のｉｎ ｖｉｖｏ査定
（実施例１６）
送達構築物のｉｎ ｖｉｖｏ査定
本実施例は、媒体と比較した、配列番号１５の配列を有する送達構築物のｉｎ ｖｉｖｏ査定について記載する。
図２４は、構築物の経口（本明細書においてＰ．Ｏ．と省略）送達後の、腸上皮を越えて循環中に至る、配列番号１５の配列を有する送達構築物の輸送を査定するための（単一用量）試験の概観を示す。これらの実験において使用された動物は、絶食させていないＣＤ－１雄マウスであった。一次試験エンドポイントは、総血漿ＩＬ－２２曝露であり、二次エンドポイントは、ＩＬ－２２結合タンパク質（例えば、ＩＬ－２２ＢＰ）を含む血漿バイオマーカーであった。
表９は、液体の（製剤化されていない）送達構築物および媒体に関する情報を含む、実験セットアップに関する詳細を提供する。
表１０は、本実験で送達される配列番号１５構築物の特性について要約する。
表９に示すそれぞれの時点で総血漿ＩＬ－２２曝露を測定した。血液試料および測定が得られた様々な時点において、図２５Ａは、総全身性ＩＬ－２２曝露（ｐｇ／ｍＬ単位）を示し、図２５Ｂは、ＩＬ－２２ＢＰ曝露（ｐｇ／ｍＬ単位）を示す。図２６Ａ～図２６Ｂは、本試験で試験された群毎の個々の測定値およびデータ点を示す。
配列番号１５に示す配列を有する経口投与された送達構築物が、血漿中にＩＬ－２２をもたらしたことが観察された。
（実施例１７）
スペーサーの長さ、および担体のＮまたはＣ末端へのペイロードのカップリングは、ペイロードの生物活性に有意に影響を与えない
（実施例１７）
スペーサーの長さ、および担体のＮまたはＣ末端へのペイロードのカップリングは、ペイロードの生物活性に有意に影響を与えない
本実施例は、様々な長さのアミノ酸リンカー、および担体のＮ末端への異種ペイロードのカップリングが、送達構築物中に含まれた場合に、その標的に結合するペイロードの能力に有意に影響を与えないことを示す。検査されたアミノ酸リンカーは、配列番号１３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）、配列番号２８（ＧＧＧＧＳ）および配列番号３１（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）であった。
ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ ＨＥＫ２９３細胞を播種し、示されている濃度のアゴニスト（ＩＬ－２２ペイロードを含有する送達構築物）を使用して細胞を１６時間インキュベートすることにより（ウェル当たり５，０００個の細胞）、ＩＬ－２２受容体二量体形成アッセイを行った。ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ｅＸｐｒｅｓｓ ＩＬ２２ＲＡ１／ＩＬ１０ＲＢ二量体形成アッセイを使用して、プレートリーダーにおいてエンドポイントルミネセンスを読み取った。
図２７Ａは、配列番号１３、２８および３１を有するアミノ酸スペーサーの長さは、ＩＬ－２２受容体二量体形成を誘導するために、配列番号１５、３２および３３を有する送達構築物に含めた場合に、ＩＬ－２２（配列番号１１）の能力に影響を与えなかったことを示す。対照組換えヒトＩＬ－２２（ｒｈＩＬ－２２、配列番号１２）の受容体二量体形成の誘導を黒色の曲線で示す。
図２７Ｂは、配列番号２８を有するスペーサーを介した配列番号１のアミノ酸残基１～２６６を含む担体のＮまたはＣ末端へのＩＬ－２２ペイロード（配列番号１１）のカップリングが、ＩＬ－２２受容体二量体形成を誘導する、配列番号３２、３４および３５を有する送達構築物の能力を有意に変化させなかったことを示す。対照組換えヒトＩＬ－２２（ｒｈＩＬ－２２）の受容体二量体形成の誘導を黒色の曲線で示す。
様々な濃度を有する１０μＬのアゴニスト（それぞれの送達構築物またはＩＬ－２２対照）と共に１５分間インキュベートされたＣｏｌｏ２０５細胞を使用して、ｐＳＴＡＴ３活性化アッセイを遂行した。次に、ＭＳＤ ＳＴＡＴ３プレート（カタログ番号Ｎ４５０ＳＭＡ－１）を使用して、ｐＳＴＡＴ３活性化の程度を読み取った。
図２７Ｃは、配列番号１３、２８および３１を有するアミノ酸スペーサーの長さは、ｐＳＴＡＴ３活性化を誘導するために、配列番号１５、３２および３３を有する送達構築物に含めた場合のＩＬ－２２（配列番号１１）の能力に影響を与えなかったことを示す。対照組換えヒトＩＬ－２２（ｒｈＩＬ－２２、配列番号１２）のｐＳＴＡＴ３活性化を黒色の曲線で示す。
図２７Ｄは、配列番号２８を有するスペーサーを介した配列番号１のアミノ酸残基１～２６６を含む担体のＮまたはＣ末端へのＩＬ－２２ペイロード（配列番号１１）のカップリングが、ｐＳＴＡＴ３活性化を誘導する、配列番号３２、３４および３５を有する送達構築物の能力を有意に変化させなかったことを示す。対照組換えヒトＩＬ－２２（ｒｈＩＬ－２２）のｐＳＴＡＴ３活性化を黒色の曲線で示す。
Claims (45)
- 配列番号１５または配列番号１７に示すアミノ酸配列を含む送達構築物。
- 配列番号１５に示すアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の送達構築物。
- 配列番号１７に示すアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の送達構築物。
- 担体を含む送達構築物であって、前記担体が、
１９５～３４７位のいずれか１つの位置にそのＣ末端を有し、
３位にグルタミン酸を、４位にアラニンを有し、
極性化された上皮細胞を越えたトランスサイトーシスが可能である、送達構築物。 - 前記担体が、２６６アミノ酸の長さである、請求項４に記載の送達構築物。
- 前記担体が、配列番号７もしくは配列番号９に示すアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも９０％、９５％もしくは９９％配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項４または請求項５に記載の送達構築物。
- 前記担体が、配列番号７に示すアミノ酸配列からなる、請求項６に記載の送達構築物。
- 前記担体が、配列番号９に示すアミノ酸配列からなる、請求項６に記載の送達構築物。
- 前記担体が、ペイロードにカップリングされている、請求項４～８のいずれか一項に記載の送達構築物。
- 前記ペイロードが、ＩＬ－２２である、請求項９に記載の送達構築物。
- 前記ＩＬ－２２が、配列番号１１に示すアミノ酸配列からなる、請求項１０に記載の送達構築物。
- 前記担体が、前記ＩＬ－２２に非共有結合によりカップリングされている、請求項９～１１のいずれか一項に記載の送達構築物。
- 前記担体が、前記ＩＬ－２２に共有結合によりカップリングされている、請求項９～１１のいずれか一項に記載の送達構築物。
- 前記担体が、スペーサーを介して前記ＩＬ－２２に共有結合によりカップリングされている、請求項１３に記載の送達構築物。
- 前記スペーサーが、配列番号１３に示すアミノ酸配列からなる、請求項１４に記載の送達構築物。
- 配列番号１５または配列番号１７に示すアミノ酸配列からなる、請求項１～１５のいずれか一項に記載の送達構築物。
- 対象における炎症性疾患を処置する方法であって、前記対象に、有効量の請求項１～１６のいずれか一項に記載の送達構築物を投与するステップを含む方法。
- 前記炎症性疾患が、肝炎、肥満、脂肪性肝疾患、肝臓の炎症または膵炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、嚢炎、直腸炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病、関節リウマチまたは乾癬である、請求項１７に記載の方法。
- 前記疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項１８に記載の方法。
- 精製された天然に存在しない融合タンパク質を得るための方法であって、
前記天然に存在しない融合タンパク質を含む混合物に対してアニオン交換クロマトグラフィーを行って、前記天然に存在しない融合タンパク質を含む第１の画分を得るステップを含み、
前記天然に存在しない融合タンパク質が、ＩＬ－２２および担体を含む、方法。 - アニオン交換クロマトグラフィーを行うステップが、前記天然に存在しない融合タンパク質をアニオン性交換樹脂に結合させるステップと、前記天然に存在しない融合タンパク質のその後の溶出のための増加する塩勾配を提供して、前記第１の画分を得るステップとを含む、請求項２０に記載の方法。
- アニオン交換クロマトグラフィーを行うステップが、前記混合物を、アミン官能化ポリメタクリレートビーズを含む樹脂と接触させるステップを含む、請求項２０～２１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記樹脂が、ＮＨ２－７５０Ｆ樹脂である、請求項２２に記載の方法。
- アニオン交換クロマトグラフィーを行うステップに先立ち、前記天然に存在しない融合タンパク質をリフォールディングするステップをさらに含む、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記天然に存在しない融合タンパク質をリフォールディングするステップが、封入体由来のカオトロープ可溶化タンパク質をリフォールディング溶液と接触させるステップを含み、前記リフォールディング溶液が、
アルギニン（０．７５Ｍ～１．２５Ｍ）、
グリセロール（２％～２０％ｖ／ｖ）、
システイン（０．５ｍＭ～１０ｍＭ）および
シスタミン（０．２ｍＭ～１０ｍＭ）
を含み、前記リフォールディング溶液が、７．５～８．５の間のｐＨを有する、請求項２４に記載の方法。 - アルギニンが、前記リフォールディング溶液中に、０．９Ｍ～１．１Ｍの間の濃度で存在し、
グリセロールが、前記リフォールディング溶液中に、７％～１３％（ｗ／ｗ）の間の濃度で存在し、
システインが、前記リフォールディング溶液中に、１．５ｍＭ～６ｍＭの間の濃度で存在し、
シスタミンが、前記リフォールディング溶液中に、０．６ｍＭ～３ｍＭの間の濃度で存在し、
前記リフォールディング溶液が、７．８～８．２の間のｐＨを有する、
請求項２５に記載の方法。 - 前記第１の画分を含む試料をヒドロキシアパタイト樹脂に供して、前記天然に存在しない融合タンパク質を含む第２の画分を得るステップをさらに含む、請求項２０～２６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヒドロキシアパタイト樹脂が、ＣａＰｕｒｅ－ヒドロキシアパタイト樹脂である、請求項２７に記載の方法。
- 前記第１の画分を含む試料に対してカチオン交換クロマトグラフィーを行うステップをさらに含む、請求項２０～２６のいずれか一項に記載の方法。
- カチオン交換クロマトグラフィーを行うステップが、前記第１の画分を含む前記試料を、サルフェート官能化ポリメタクリレートビーズを含む樹脂と接触させるステップを含む、請求項２９に記載の方法。
- 前記樹脂が、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬサルフェート－６５０Ｆ樹脂である、請求項３０に記載の方法。
- 細胞との接触時に、前記担体が、前記天然に存在しない融合タンパク質のエンドサイトーシスまたはトランスサイトーシスを促進する、請求項２０～３１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞との接触時に、前記担体が、前記天然に存在しない融合タンパク質のトランスサイトーシスを促進する、請求項３２に記載の方法。
- 前記細胞が、腸上皮細胞である、請求項３２または請求項３３に記載の方法。
- 前記腸上皮細胞が、極性化された腸上皮細胞である、請求項３４に記載の方法。
- 前記担体が、天然に存在するまたは天然に存在しないコリックスポリペプチドのトランケートバリアントである、請求項２０～３５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体が、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、２２または２３のいずれか１種に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有する、請求項２０～３６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記天然に存在しない融合タンパク質が、配列番号１４～２１のいずれか１種の配列に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有する、請求項２０～３７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＩＬ－２２が、配列番号１０、１１または１２のいずれか１種に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有する、請求項２０～３８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記担体が、それ自体、第１の等電点（ｐＩ）を有し、前記ＩＬ－２２が、それ自体、第２の等電点を有し、前記第１の等電点が、前記第２の等電点よりも少なくとも１ｐＨ単位、少なくとも１．５ｐＨ単位、少なくとも１．７ｐＨ単位または少なくとも２ｐＨ単位低い、請求項２０～３９のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項２０～４１のいずれか一項に記載の方法によって得られる、天然に存在しない融合タンパク質。
- 担体およびＩＬ－２２を含む天然に存在しない融合タンパク質をリフォールディングする方法であって、
（ｉ）前記天然に存在しない融合タンパク質を含む封入体を、カオトロピック剤を含む可溶化溶液と接触させて、可溶性の天然に存在しない融合タンパク質を産生するステップと、
（ｉｉ）前記天然に存在しない融合タンパク質をリフォールディング溶液と接触させるステップとを含み、前記リフォールディング溶液が、
アルギニン（０．７５Ｍ～１．２５Ｍ）、
グリセロール（２％～２０％ｖ／ｖ）、
システイン（０．５ｍＭ～１０ｍＭ）および
シスタミン（０．２ｍＭ～１０ｍＭ）
を含み、前記リフォールディング溶液が、７．５～８．５の間のｐＨを有する、方法。 - アルギニンが、前記リフォールディング溶液中に、０．９Ｍ～１．１Ｍの間の濃度で存在し、
グリセロールが、前記リフォールディング溶液中に、７％～１３％（ｗ／ｗ）の間の濃度で存在し、
システインが、前記リフォールディング溶液中に、１．５ｍＭ～６ｍＭの間の濃度で存在し、
シスタミンが、前記リフォールディング溶液中に、０．６ｍＭ～３ｍＭの間の濃度で存在し、
前記リフォールディング溶液が、７．８～８．２の間のｐＨを有する、
請求項４２に記載の方法。 - ペイロードにカップリングされたコリックスポリペプチドを含む送達構築物であって、前記コリックスペプチドが、１９５～３４７位のいずれか１つの位置にそのＣ末端を有し、極性化された上皮細胞を越えたトランスサイトーシスが可能である、送達構築物。
- 前記コリックスポリペプチドが、前記ペイロードに異種カップリングされている、請求項４４に記載の送達構築物。
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