BR112021009003A2 - construtos de liberação para transcitose e métodos relacionados. - Google Patents

construtos de liberação para transcitose e métodos relacionados. Download PDF

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Abstract

CONSTRUTOS DE LIBERAÇÃO PARA TRANSCITOSE E MÉTODOS RELACIONADOS. A presente descrição provê moléculas de fusão de ocorrência não natural compreendendo radicais de carga terapêuticos, tais como IL-22 com um veículo. A descrição provê também métodos e composições para a produção, purificação, redobramento, formulação e administração das moléculas de fusão. Métodos para o uso das moléculas purificadas para tratar e prevenir doenças ou distúrbios são também providos aqui.

Description

CONSTRUTOS DE LIBERAÇÃO PARA TRANSCITOSE E MÉTODOS RELACIONADOS REFERÊNCIA CRUZADA
[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US nº 62/756.889, depositado em 7 de novembro de 2018, Pedido Provisório US nº 62/888.133, depositado em 16 de agosto de 2019 e Pedido Provisório US nº 62/888.238, depositado em 16 de agosto de 2019, Pedido Internacional nº PCT/US2019/050708, depositado em 11 de setembro de 2019 e Pedido Internacional nº PCT/US2019/021474, depositado em março de 2019, pedidos estes que são aqui incorporados como referência em sua totalidade.
ANTECEDENTES
[0002] O epitélio intestinal tem frustrado os esforços para a administração oral de moléculas terapêuticas grandes tais como proteínas tendo em vista que proteínas não podem se difundir através da barreira epitelial intacta através das junções estreitas. Uma vez absorvida por uma célula epitelial, uma proteína terapêutica pode entrar da rota de tráfico lisossômico destrutiva ou pode ser liberada de volta para o lúmen intestinal. Esta inabilidade e, ser prontamente transportada através do epitélio intestinal pode ser um fator limitante no desenvolvimento de formulações orais comercialmente viáveis, particularmente para produtos terapêuticos a base de polipeptídeo.
[0003] A administração parenteral tal como administração intravenosa ou subcutânea pode ser uma solução, no entanto estas rotas de administração podem com frequência criar consideráveis efeitos colaterais, reduzir a eficácia terapêutica e reduzir a conveniência do paciente o que pode afetar negativamente a conformidade. Há uma necessidade por composições e métodos aperfeiçoados parra o transporte de produtos terapêuticos através de um epitélio, por exemplo, um epitélio intestinal.
[0004] Adicionalmente, a purificação e redobramento de polipeptídeos biologicamente ativos de maneira a se obter polipeptídeos corretamente dobrados,
biologicamente ativos e estáveis em altos rendimentos e com baixos níveis de endotoxina são considerados ainda os aspectos mais desafiadores para a produção eficaz em termos de curo e recursos de produtos terapêuticos biológicos (por exemplo, polipeptídeos). Desta forma, há também uma necessidade por métodos aperfeiçoados para a produção (fermentação, redobramento, purificação e formulação) de tais moléculas biologicamente ativas.
SUMÁRIO
[0005] Em vários aspectos, a presente descrição provê um construto de liberação compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17 ou uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência com esta.
[0006] Em vários aspectos, a presente descrição provê um construto de liberação compreendendo um veículo consistindo em uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 9. Em alguns casos, o veículo é acoplado a uma carga útil heteróloga. Em alguns casos, a carga útil heteróloga é uma IL-22 humana. Em alguns casos, a IL-22 humana consiste em uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 11. Em alguns casos, o veículo é acoplado covalentemente ou não covalentemente à IL-22. Em alguns casos, o veículo é acoplado covalentemente à IL-22 por meio de um espaçador. Em alguns casos, o espaçador consiste em uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13. Em alguns casos, o construto de liberação consiste em uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17.
[0007] É provido aqui um método de tratamento de uma doença inflamatória em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo uma quantidade efetiva de um construto de liberação descrito aqui (por exemplo, a SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17). Em alguns casos, a doença inflamatória é hepatite, obesidade, doença do fígado gorduroso, inflamação do fígado, ou pancreatite, doença de Crohn, colite ulcerativa, bolsite, proctite, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, doença do enxerto versus hospedeiro,
artrite reumatoide ou psoríase. Em alguns casos, a doença é a doença de Crohn ou colite ulcerativa.
[0008] São descritos aqui, em certas realizações, métodos para a obtenção de uma proteína de fusão de ocorrência não natural purificada, o método compreendendo: a realização de cromatografia de troca aniônica em uma mistura compreendendo a proteína de fusão de ocorrência não natural de maneira a se obter uma primeira fração compreendendo a proteína de fusão de ocorrência não natural; onde a proteína de fusão de ocorrência não natural compreende IL-22 e um veículo. Em algumas realizações, onde a realização de cromatografia de troca aniônica compreende a ligação da proteína de fusão de ocorrência não natural a resina de troca aniônica e provimento de um gradiente salino crescente para subsequente eluição da proteína de fusão de ocorrência não natural para se obter a primeira fração. Em algumas realizações, a realização da cromatografia de troca aniônica compreende o contato da mistura com uma resina compreendendo esferas de polimetacrilato funcionalizadas em amina. Em algumas realizações, a resina é uma resina NH2-750F.
[0009] Em algumas realizações, o método adicionalmente o redobramento da proteína de fusão de ocorrência não natural antes da realização da cromatografia de troca aniônica. Em algumas realizações, o redobramento da proteína de fusão de ocorrência não natural compreende o contato da proteína caotrópica solubilizada proveniente de corpos de inclusão com uma solução de redobramento, onde a solução de redobramento compreende: arginina (0,75 M a 1,25 M); glicerol (2% a 20% v/v); cisteína (0,5 mM a 10 mm); e cistamina (0,2 mM a 10 mM); onde a solução de redobramento apresenta um pH de entre 7,5 e 8,5. Em algumas realizações, a arginina está presente na solução de redobramento a uma concentração de entre 0,9 M e 1,1 M; o glicerol está presente na solução de redobramento a uma concentração de entre 7% e 13% (em peso); a cisteína está presente na solução de redobramento a uma concentração de entre 1,5 mM e 6 mM; a cistamina está presente na solução de redobramento a uma concentração de entre 0,6 mM e 3 mM; e a solução de redobramento apresenta um pH de entre 7,8 e 8,2.
[0010] Em algumas realizações, o método compreende adicionalmente a submissão de uma amostra compreendendo a primeira fração a uma resina de hidroxiapatita de maneira a se obter uma segunda fração compreendendo a proteína de fusão de ocorrência não natural. Em algumas realizações, a resina de hidroxiapatita é uma resina CaPure-hidroxiapatita. Em algumas realizações, o método compreende adicionalmente a realização de cromatografia de troca catiônica em uma amostra compreendendo a primeira fração. Em algumas realizações, a realização de cromatografia de troca catiônica compreende o contato da amostra compreendendo a primeira fração com uma resina compreendendo esferas de polimetacrilato funcionalizadas em sulfato. Em algumas realizações, a resina é uma resina TOYOPEARL Sulfate-650F.
[0011] Em algumas realizações, pelo contato com uma célula, o veículo promove endocitose ou transcitose da proteína de fusão de ocorrência não natural. Em algumas realizações, pelo contato com a célula, o veículo promove a transcitose da proteína de fusão de ocorrência não natural. Em algumas realizações, a célula é uma célula epitelial intestinal. Em algumas realizações, a célula epitelial intestinal é uma célula epitelial intestinal polarizada. Em algumas realizações, o veículo é uma variante truncada de um polipeptídeo de Cholix de ocorrência natural ou de ocorrência não natural. Em algumas realizações, o veículo apresenta pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 22 ou 23. Em algumas realizações, a proteína de fusão de ocorrência não natural apresenta pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 14–21. Em algumas realizações, a IL-22 apresenta pelo menos 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 10, 11 ou 12.
[0012] Em algumas realizações, o veículo, em si, apresenta um primeiro ponto isoelétrico (pI) e a IL-22, em si, apresenta um segundo ponto isoelétrico, onde o primeiro ponto isoelétrico é pelo menos 1 unidade de pH, pelo menos 1,5 unidades de pH, pelo menos 1,7 unidades de pH ou pelo menos 2 unidades de pH mais baixo que o segundo ponto isoelétrico. Por exemplo, em algumas realizações, o veículo apresenta um pI de entre 4,8 e 5,4, entre 4,9 e 5,3, entre 5,0 e 5,2, tal como um pI de cerca de 5,1. Em algumas realizações, o pI da IL-22 é de entre cerca de 6,8 e 7,4, tal como entre cerca de 6,9 e 7,3, entre cerca de 7,0 e 7,2, tal como cerca de 7,1. Em algumas realizações, a proteína de fusão de ocorrência não natural é obtida por quaisquer dos métodos descritos aqui.
[0013] São descritos aqui, em certas realizações, métodos de redobramento de uma proteína de fusão de ocorrência não natural compreendendo um veículo e IL-22, o método compreendendo: (i) o contato de corpos de inclusão compreendendo a proteína de fusão de ocorrência não natural com uma solução de solubilização compreendendo um agente caotrópico para produzir uma proteína de fusão de ocorrência não natural solúvel; (iii) o contato da proteína de fusão de ocorrência não natural com uma solução de redobramento, onde a solução de redobramento compreende: arginina (0,75 M a 1,25 M); glicerol (2% a 20% v/v); cisteína (0,5 mM a 10 mm); e cistamina (0,2 mM a 10 mM); onde a solução de redobramento apresenta um pH de entre 7,5 e 8,5.
[0014] Em algumas realizações, a arginina está presente na solução de redobramento a uma concentração de entre 0,9 M e 1,1 M; o glicerol está presente na solução de redobramento a uma concentração de entre 7% e 13% (em peso); a cisteína está presente na solução de redobramento a uma concentração de entre 1,5 mM e 6 mM; a cistamina está presente na solução de redobramento a uma concentração de entre 0,6 mM e 3 mM; e a solução de redobramento apresenta um pH de entre 7,8 e 8,2.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
[0015] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados aqui neste relatório são aqui incorporados na mesma extensão em que cada publicação,
patente ou pedido de patente individual estivesse especificamente e individualmente indicado como incorporado como referência.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0016] As novas características da descrição são apresentadas com particularidade nas reivindicações anexas. Um melhor entendimento das características e vantagens da presente descrição será obtido por referência à descrição detalhada a seguir que apresenta realizações ilustrativas, nas quais os princípios da descrição são utilizados e nos desenhos anexos nos quais:
[0017] A FIG. 1 mostra esquematicamente uma configuração compreendendo uma câmara apical acima de uma monocamada de célula epitelial e uma câmara basal abaixo de tal monocamada de célula epitelial. Para a permeabilidade apical para basolateral, artigos de teste (por exemplo, construtos de liberação, cargas úteis etc.) foram aplicados ao lado apical (A) e a quantidade de material permeado (por exemplo, transcitosado) foi determinada no lado basolateral (B).
[0018] A FIG. 2 mostra que um construto de liberação (SEQ ID NO: 15), o qual inclui um veículo (SEQ ID NO: 7) acoplado a uma IL-22 (SEQ ID NO: 11) por meio de um espaçador (SEQ ID NO: 13), transportou a carga útil de IL-22 através de monocamadas de célula epitelial intestinal Caco-2 polarizadas intactas de maneira dependente de tempo (a quantidade de proteína no local basolateral foi medida 15, 30, e 45 minutos após o construto de liberação ter sido aplicado na membrana basal da monocamada tal como descrito acima na FIG. 1). Os dados mostram adicionalmente quando o construto de liberação com um veículo de SEQ ID NO: 7 e IL-22 (SEQ ID NO: 11) é aplicado às células epiteliais Caco-2, cerca de 2-3 vezes mais IL-22 cruzou a monocamada de célula epitelial Caco-2 em comparação com quando uma IL-22 (SEQ ID NO: 12) não estava acoplada com um veículo.
[0019] A FIG. 3 mostra que um construto de liberação (SEQ ID NO: 15) resultou no fato da IL-22 (SEQ ID NO: 11) ser transportada através de monocamadas de célula epitelial intestinal SMI-100 intactas e polarizadas de maneira dependente de tempo (a quantidade de proteína na câmara basolateral foi medida a 15, 30, e 45 minutos após o construto de liberação ter sido aplicado na membrana basal da monocamada). Os dados mostram adicionalmente que quando o construto de liberação incluindo o veículo com a SEQ ID NO: 7 acoplado a IL-22 (SEQ ID NO: 11) é aplicado a células epiteliais SMI-100, cerca de 2-3 vezes mais IL-22 cruzou a monocamada de célula epitelial SMI-100 em comparação com quando uma IL-22 (SEQ ID NO: 12) não estava acoplada a um veículo.
[0020] FIG. 4 demonstra que um construto de liberação (SEQ ID NO: 15) incluindo um veículo (SEQ ID NO: 7) acoplado a uma IL-22 (SEQ ID NO: 11) por meio de um espaçador (SEQ ID NO: 13) resulta na IL-22 sendo transportada em quantidades significativas através de um epitélio intestinal intacto e polarizado in vivo. O local apical do epitélio intestinal é destacado pela seta branca #1. A lamina propria é abreviada como “l.p.” A membrana basal externa do epitélio polarizado é destacada pela seta branca #2. A localização de IL-22 é indicada pela seta branca #3).
[0021] A FIG. 5A demonstra a fosforilação de STAT3 em células FL83 B de murino como uma função da concentração de agonista (em pM), onde o agonista é IL-22 humana recombinante (rhIL-22, SEQ ID NO: 12) ou IL-22 de murino recombinante (rmIL-22;
MAVLQKSMSFSLMGTLAASCLLLIALWAQEANALPVNTRCKLEVSNFQ Q PYIVNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFRGVSAKDQCYLMKQVLN
FTLEDVLLPQSDRFQPYMQEVVPFLTKLSNQLSSCHISGDDQNIQKNVR RLKETVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACV (SEQ ID NO: 30)). Os dados mostram que rhIL-22 e rmIL-22 induziram a fosforilação de STAT3 de maneira dependente de concentração, demonstrando que a proteína IL-22 humana pode ligar e induzir a transdução de sinal por meio de receptores de IL-22 de camundongo tão efetivamente quando a IL-22 de camundongo.
[0022] A FIG. 5B demonstra que rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) e rmIL-22 também induziram a fosforilação de STAT3 em células Hepa1-6 de murino.
[0023] A FIG. 6A demonstra que rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) e rmIL-22 induziram fosforilação de STAT5 em células FL83 B de murino em uma maneira dependente de dose, demonstrando que a proteína IL-22 humana pode ligar e induzir o sinal de transdução por meio de receptores de IL-22 de camundongo tão efetivamente quando a IL-22 de camundongo.
[0024] A FIG. 6B demonstra que rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) e rmIL-22 também induziram a fosforilação de STAT5 em células Hepa1-6 de murino.
[0025] A FIG. 7A mostra uma visão global de um desenho de estudo in vivo e linha no tempo para a comparação da administração perioral (p.o.) do construto de liberação com SEQ ID NO: 15 em dois níveis de dose diária, 1 mg/kg e 30 mg/kg, e uma administração diária (intraperitoneal (i.p.)) de rhIL-22 a 4 mg/kg. O estudo in vivo foi realizado em camundongos C57BL/6 fêmeas com 8-10 semanas de idade, ~23 g, com alimentação normal, A colite foi quimicamente induzida com sulfato de dextrana sódica a 2,5% (DSS) na água de beber, ad libitum. Os desfechos do estudo incluíram a perda percentual de peso corporal, índice de atividade na doença, comprimento e peso do cólon, e histopatologia.
[0026] A FIG. 7B mostra as características dos grupos experimentais e de controle utilizados no estudo descrito na FIG. 7A.
[0027] A FIG. 8A mostra a alteração percentual (%) no peso corporal dos animais no dia de estudo 10 em relação ao dia 10 de vários grupos experimentais e de controle. A alteração do peso corporal na linha de base (dia 0 vs. 10) por rhIL-22 com SEQ ID NO: 12 ou o construto de liberação com SEQ ID NO: 15 em relação ao veículo não foi significativa conforme avaliada por 1-way ANOVA. O controle de modelo positivo (ciclosporina) CsA foi significativamente diferente em relação ao Veículo tal como avaliado por um 1- way ANOVA.
[0028] A FIG. 8B mostra a alteração no peso corporal dos animais experimentais e de controle nos primeiros 10 dias de estudo. O peso corporal médio do grupo CsA no período de estudo foi significativamente aumentado em relação ao controle com veículo do dia 6 ao dia 10 tal como avaliado por 2-way
ANOVA(*, **, ***). O peso corporal com rhIL-22 (i.p.) foi significativamente aumentado em relação ao controle com veículo no dia 10 tal como avaliado por 2-way ANOVA (*), *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
[0029] A FIG. 9 mostra os resultados dos experimentos com ELISA de plasma para determinar os níveis de IL-22 no plasma. Os resultados mostram que as concentrações de rhIL-22 no plasma tenderam no sentido de níveis aumentados no plasma após gavagem oral tanto de doses 1 quanto de 30 mg/kg do construto de liberação com SEQ ID NO: 15 em uma maneira dependente de dose (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. ****p<0,0001; Média + SEM; n = 2 Naïve, 5 Veículo, 5 CsA, 10 outros)
[0030] A FIG. 10A mostra uma visão global de um estudo in vivo de dose única desenhado para identificar biomarcadores de acoplamento a alvo após dose única (dosagem aguda) de rhIL-22 em camundongos CD-1 sadios.
[0031] A FIG. 10B mostra uma visão global de um estudo de dose múltipla (dosagem sub-crônica) in vivo desenhado para identificar biomarcadores de acoplamento a alvo após doses única e múltipla de rhIL-22 em camundongos CD- 1 sadios.
[0032] A FIG. 11A mostra que a administração aguda e sub-crônica de rhIL-22 aumenta consistentemente a concentração de IL-22.
[0033] A FIG. 11B mostra alguns parâmetros farmacocinéticos medidos durante os experimentos de dosagem aguda e sub-crônica descritos na FIG. 11A.
[0034] A FIG. 12A mostra a circulação induzida de concentração de proteína reativa C de murino (mCRP) em resposta 1 dia após a dosagem aguda de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) e após 5 dias de dosagem sub-crônica de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12). Os resultados mostram um aumento dependente de tempo na circulação de mCRP em ambos os grupos de estudo.
[0035] A FIG. 12B mostra a alteração em vezes da concentração de mCRP no plasma 1 dia após a dosagem aguda de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
[0036] A FIG. 12C mostra a alteração em vezes da concentração de mCRP no plasma após 5 dias da dosagem sub-crônica de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
[0037] A FIG. 13A mostra a circulação induzida da concentração de proteína amiloide A (mSAA) em soro de murino em resposta a 1 dia após a dosagem aguda de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) e após 5 dias de dosagem sub-crônica de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12). Os resultados mostram um aumento dependente de tempo na circulação de mSAA em ambos os grupos de estudo, com concentrações aproximadas de pico no plasma cerca de 8 horas após a administração.
[0038] A FIG. 13B mostra a alteração em vezes da concentração de mSAA no plasma 1 dia após a dosagem aguda de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
[0039] A FIG. 13C mostra a alteração em vezes da concentração de mSAA no plasma após 5 dias da dosagem sub-crônica de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
[0040] A FIG. 14A mostra a circulação induzida da proteína 3𝛽 (Reg3𝛽) derivada de ilhota de regeneração em resposta a 1 dia após a dosagem aguda de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) e após 5 dias da dosagem sub-crônica de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
[0041] A FIG. 14B mostra a alteração em vezes da concentração de Reg3𝛽 no plasma 1 dia após a dosagem aguda de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
[0042] A FIG. 14C mostra a alteração em vezes da concentração de Reg3𝛽 no plasma após 5 dias da dosagem sub-crônica de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
[0043] A FIG. 15 ilustra um fluxograma mostrando como a capacidade de manufatura aumentada possibilita a tradução clínica.
[0044] A FIG. 16 ilustra que a SEQ ID NO: 15 é uma proteína de fusão heteróloga compreendendo um domínio de veículo (SEQ ID NO: 7) ligado por meio de um espaçador (SEQ ID NO: 13) à interleucina-22 (IL-22, SEQ ID NO: 11). As proteínas de fusão heterólogas podem ser sequestradas em corpos de inclusão de E. coli (IB) e, desta forma, requerem redobramento e/ou purificação.
[0045] A FIG. 17 ilustra um fluxograma resumindo o redobramento, purificação e formulação das proteínas de fusão heterólogas descritas aqui, tal como, por exemplo as SEQ ID NOS: 14-21, e proteínas de fusão compreendendo um veículo de SEQ ID NO: 1-9, 22 ou 23.
[0046] A FIG. 18 ilustra a otimização iterativa para a eficiência aumentada de redobramento do construto de SEQ ID NO: 15.
[0047] A FIG,19 é uma cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) mostrando o sinal da proteína redobrada otimizada (SEQ ID NO: 15) e agregados de proteína apresentando massas moleculares maiores e, desta forma, tempos menores de retenção.
[0048] A FIG. 20 ilustra uma SDS-PAGE de exemplo da proteína inicial e redobrada otimizada (SEQ ID NO: 15).
[0049] As FIGS. 21A-21B ilustram uma cromatografia por exclusão de tamanho após uma primeira purificação em coluna da SEQ ID NO: 15 pela utilização de uma resina de troca aniônica NH2-750F. A FIG. 21A ilustra uma cromatografia por exclusão de tamanho após uma primeira purificação em coluna da SEQ ID NO: 15 pela utilização de resina de troca aniônica NH2-750F com um volume de coluna de 10 mL e uma altura de leito de 20 cm. A FIG. 21B ilustra uma cromatografia por exclusão de tamanho após uma primeira purificação em coluna da SEQ ID NO: 15 pela utilização de resina de troca aniônica NH2-750F com volume de coluna de 4,6 L e uma altura de leito de 30 cm.
[0050] As FIGS. 22A-22B ilustram uma cromatografia por exclusão de tamanho após uma segunda purificação em coluna da SEQ ID NO: 15 pela utilização de resina de hidroxiapatita CaPure. A FIG. 22A ilustra uma cromatografia por exclusão de tamanho após uma segunda purificação em coluna da SEQ ID NO: 15 pela utilização de resina de hidroxiapatita Ca++Pure com um volume de coluna de 5 mL, uma altura de leito de 10 cm, e um gradiente de 0-25% B, 25C. A FIG. 22B ilustra uma cromatografia por exclusão de tamanho após uma segunda purificação em coluna da SEQ ID NO: 15 pela utilização de resina de hidroxiapatita CaPure com um volume de coluna de 800 mL, uma altura de leito de 21 cm e um gradiente de 0-25%B, 25CV. Para cada figura é mostrada uma SDS-PAGE correspondente de amostras das diferentes frações eluídas a partir da resina CaPure.
[0051] As FIGS. 23A-23B ilustram uma cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) após a purificação de proteínas de fusão heterólogas. A FIG. 23A ilustra uma cromatografia LC-MS da SEQ ID NO: 17. O pico 1 ilustra a SEQ ID NO: 17 corretamente redobrada. A FIG. 23B ilustra uma cromatografia LC-MS da SEQ ID NO: 15. O pico 1 ilustra a SEQ ID NO: 15 corretamente redobrada. O pico 2 ilustra a SEQ ID NO: 15 com o terminal de metionina clivado (ilustrado pela SEQ ID NO: 20). O pico 3 ilustra a SEQ ID NO: 15 com o terminal de metionina clivado (ilustrado pela SEQ ID NO: 20) e a acetilação do aminoácido N-terminal resultante.
[0052] A FIG. 24 ilustra a visão global do estudo do EXEMPLO 16 para a avaliação do transporte do construto de liberação apresentando a sequência da SEQ ID NO: 15 através do epitélio intestinal e na circulação após administração oral (abreviada aqui como P.O.) do construto.
[0053] As FIGS. 25A-25B ilustram gráficos mostrando a concentração de IL-22 no plasma como função do tempo após a administração do construto de liberação de SEQ ID NO: 15. A FIG. 25A ilustra a concentração total de IL-22 no plasma como uma função do tempo após a administração do construto de liberação de SEQ ID NO: 15. A FIG. 25B ilustra a concentração de IL-22BP no plasma como uma função do tempo após a administração do construto de liberação de SEQ ID NO: 15.
[0054] A FIG. 26A (veículo) e a FIG. 26B (SEQ ID NO: 15) são gráficos mostrando a concentração de IL-22 no plasma como uma função do tempo para camundongos individuais.
[0055] As FIGS. 27A-27D ilustram que o comprimento do espaçador e acoplamento da carga útil no terminal N ou C de um veículo não afeta significativamente a atividade biológica de uma carga útil. A FIG. 27A ilustra que o comprimento de vários espaçadores de aminoácido não afetou a indução da dimerização do receptor de IL-22. A FIG. 27B ilustra que o acoplamento da carga útil de IL-22 ao terminal N ou C de um veículo não afeta a indução da dimerização de IL-22. A FIG. 27C ilustra que o comprimento de vários espaçadores de aminoácido não afeta a indução da ativação de pSTAT3. A FIG. 27D ilustra que o acoplamento da carga útil de IL-22 ao terminal N ou C de um veículo não afeta a indução da ativação de pSTAT3.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0056] A presente descrição apresenta proteínas de fusão de ocorrência não natural (por exemplo construtos de liberação capazes de transportar uma ou mais moléculas de carga útil heterólogas) e métodos para o redobramento e purificação de proteínas de fusão de ocorrência não natural. Por exemplo, a proteína de fusão de ocorrência não natural pode ser um construto de liberação de IL-22 descrito aqui.
[0057] Os termos abaixo são discutidos para ilustrar os significados dos termos tal como utilizados neste relatório, em adição à compreensão destes termos por parte dos técnicos no assunto. Tal como utilizadas aqui e nas reivindicações anexas, as formas no singular “um,” “uma”, e “o/a” incluem as formas no plural a não ser que o contexto claramente indique ao contrário. Deve ser observado ainda que as reivindicações podem ser escritas de maneira a excluir qualquer elemento opcional. Como tal, esta explicação destina-se a servir como base antecedente para o uso de tal terminologia exclusiva como “somente”, “apenas” e semelhantes em conexão com o texto dos elementos reivindicados ou uso de uma limitação “negativa”.
[0058] Certas faixas ou números são apresentados aqui com valores numéricos sendo precedidos do termo “cerca de”. O termo “cerca de” como utilizado aqui deve significar mais ou menos 1%, 2%, 3%, 4% ou 5% do número ao qual o termo se refere. Tal como utilizados aqui, os termos “indivíduo” e “individual” são utilizados de forma intercambiável e podem ser qualquer animal, incluindo mamíferos (por exemplo, um humano ou animal não humano).
[0059] Tal como utilizados aqui, os termos “tratar” “tratando” ou “tratamento” e outros equivalentes gramaticais, incluem aliviar, diminuir ou melhorar um ou mais sintomas de uma doença ou condição, melhorar, prevenir ou reduzir o aparecimento, severidade ou frequência de um ou mais sintomas adicionais de uma doença ou condição, melhora ou prevenção de causas subjacentes de um ou mais sintomas de uma doença ou condição, inibição da doença ou condição, tal como, por exemplo, interrupção do desenvolvimento da doença ou condição, alívio da doença ou condição, regressão da doença ou condição, alívio de uma condição causada pela doença ou condição ou inibição dos sintomas da doença ou condição profilaticamente e/ou terapeuticamente.
[0060] Tal como descrito aqui, o termo “identidade percentual (%) de sequência” e termos relacionados a este, no contexto de sequências de aminoácidos, é a percentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos em uma sequência selecionada, após o alinhamento das sequências e introdução de espaços vazios, se necessário, de maneira a se obter uma identidade percentual de sequência máxima e sem considerar quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. O alinhamento para propósitos de determinação da identidade percentual de uma sequência de aminoácidos pode ser obtido de várias formas que estão dentro do conhecimento de um técnico no assunto, por exemplo, a utilização de software de computador disponível publicamente tal como os softwares Clustal Omega, BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar os parâmetros apropriados para a medição de alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para se obter um alinhamento máximo de comprimento completo das sequências sendo comparadas.
[0061] Os termos “polipeptídeo” e “proteína” são utilizados de forma intercambiável para se referirem a um polímero de resíduos de aminoácidos. Peptídeos incluem também essencialmente qualquer poliaminoácido incluindo, mas não se limitando a, peptídeos miméticos tais como aminoácidos unidos por um éter em oposição a uma ligação amida. Cargas Úteis e Construtos de Liberação
[0062] São providos aqui construtos de liberação capazes de transportar uma ou mais moléculas de carga útil heterólogas (por exemplo, uma ou mais cargas úteis terapêuticas) através de células epiteliais (por exemplo, células epiteliais intestinais polarizadas) e para a lamina propria por meio de transcitose. Os construtos de liberação podem compreender um veículo acoplado a uma carga útil heteróloga. O construto de liberação pode ser uma proteína de fusão de ocorrência não natural. O veículo pode ser capaz de transportar a carga útil heteróloga através de células epiteliais polarizadas (por exemplo, células epiteliais intestinais polarizadas) pela utilização de rotas de tráfico endógeno. A utilização de rotas de tráfico endógenas, em oposição ao uso de difusão passiva, pode permitir que o veículo transporte a carga útil heteróloga rapidamente e eficientemente através de células epiteliais sem prejudicar a função de barreira destas células ou a atividade biológica da carga útil heteróloga. Adicionalmente são providos aqui métodos para a purificação e redobramento dos construtos de liberação descritos aqui.
[0063] Um veículo aqui pode ser derivado de um polipeptídeo secretado por uma bactéria. Tal veículo pode ser derivado de um polipeptídeo secretado por Vibrio Cholerae ou Pseudomonas aeruginosa. O polipeptídeo secretado por Vibrio Cholerae pode ser um polipeptídeo de Cholix. Um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix pode ser de ocorrência natural ou de ocorrência não natural. Por exemplo, um polipeptídeo de Cholix de ocorrência não natural pode consistir na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 (um exemplo de um Cholix1-634) (TABELA 1). Um veículo derivado de um polipeptídeo de Cholix pode ser uma variante truncada e/ou mutada de um polipeptídeo derivado de Cholix. Por exemplo, o veículo pode compreender ou consistir em uma sequência de aminoácidos destes com os resíduos de aminoácidos 1-206, 1-245, 1-251, 1-266 e 1-386 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 26. Em alguns casos, tais veículos apresentam uma sequência de aminoácidos daqueles com os resíduos de aminoácidos 1-206, 1-245, 1-251, 1- 266, e 1-386 da SEQ ID NO: 4. A(s) mutação(ões) pode(m) incluir uma ou mais substituições, deleções e/ou adições. Por exemplo, um veículo aqui pode compreender uma substituição V1L. Dito de forma diferente, em algumas realizações, o veículo relacionado a Cholix apresenta um aminoácido leucina na posição “1”. (A posição 1 refere-se ao primeiro aminoácido de variantes que não apresentam metionina no terminal N ou a segunda posição em variantes que incluem uma metionina no terminal N. Em outras palavras, na determinação do comprimento de um veículo, uma metionina no terminal N, se presente, é ignorada). Em algumas realizações, os veículos compreendendo a substituição V1L apresenta clivagem reduzida ou eliminada do aminoácido do terminal N. Em algumas realizações, os veículos compreendendo a substituição V1L apresenta acetilação reduzida ou eliminada do aminoácido do terminal N. Um veículo provido aqui pode apresentar uma atividade de ribosilação de ADP reduzida (por exemplo, pelo menos 50% reduzida) ou atividade de ribosilação de ADP eliminada (por exemplo, a ribosilação do fator de alongamento 2) em relação a uma variante de Cholix de ocorrência natural. Em algumas realizações, o veículo pode compreender uma metionina no terminal N. Em outras realizações, a metionina no terminal N está presente.
[0064] Um veículo de Cholix pode consistir em consistir essencialmente em ou compreender os resíduos de aminoácidos 1-386 de uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 26 (FORMULA I). Um veículo de Cholix truncado pode consistir em consistir essencialmente em ou compreender os resíduos de aminoácidos 1- 266 de uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 26 (FÓRMULA I). Em tais casos, um veículo pode consistir em consistir essencialmente em ou compreender os resíduos de aminoácidos 1-266 de uma sequência apresentada na SEQ ID NO:
1. Desta forma, em alguns casos, o veículo consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 (um exemplo de Cholix1-386) ou SEQ ID NO: 3 (um exemplo de Cholix1-266). Em alguns casos, um veículo apresenta a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 2 com uma substituição V1L. Desta forma, em alguns casos, o veículo consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4 (um exemplo de V1L-Cholix1-386) ou na SEQ ID NO: 5 (um exemplo de V1L Cholix1-266). Qualquer um destes veículos pode incluir um ou mais aminoácidos em seu terminal N para a expressão em vários microrganismos (por exemplo, bactérias), por exemplo, uma metionina no terminal N. Tal veículo pode apresentar uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOS: 6-9.
[0065] O polipeptídeo de Cholix pode ser uma proteína compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 80%, 85%. 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência ou apresentando 100% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1-9 ou SEQ ID NOS: 22-23. Um exemplo de um polipeptídeo de Cholix é provido aqui como SEQ ID NO: 1. ou SEQ ID NO: 22. Também contempladas aqui estão variantes de polipeptídeo de Cholix que são capazes de transportar uma carga útil através de células epiteliais polarizadas (por exemplo, células epiteliais intestinais polarizadas). Tais polipeptídeos de Cholix podem ser truncados em qualquer uma das posições de aminoácido da 206 para a 633 em comparação com uma sequência de referência, por exemplo a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO: 26 ou uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência com estas.
[0066] São também contemplados aqui construtos de liberação compreendendo veículos apresentando alta identidade de sequência com as sequências acima. Tal alta identidade de sequência pode incluir, pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência. Desta forma, em alguns casos, o veículo compreende uma identidade de sequência de pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 6-9.
[0067] Um veículo contemplado aqui pode ser acoplado a uma carga útil, tal como uma carga útil heteróloga. Tal carga útil pode ser uma carga útil terapêutica. Uma carga útil terapêutica pode ser uma citocina, um hormônio, um fator de crescimento um anticorpo terapêutico, um antígeno, um fragmento funcional de qualquer um dos acima ou qualquer outra proteína que apresente atividade biológica terapêutica ou uma proteína que pode estar deficiente em um indivíduo (por exemplo, uma deficiência genética/herdada de uma certa proteína). As citocinas contempladas aqui incluem quimocinas monoméricas e interleucinas (também abreviadas aqui como “ILs”). A interleucina pode ser a IL-22. A interleucina pode ser proveniente de qualquer espécie (por exemplo, de um humano ou um roedor). A interleucina pode ser uma interleucina humana. A IL- 22 humana pode apresentar a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10 (IL-221-179) ou SEQ ID NO: 11 (IL-2234-179). Uma IL-22 aqui pode incluir adicionalmente uma metionina em seu terminal N, por exemplo, quando tal proteína IL-22 é expressa em bactérias. Em um exemplo, uma IL-22 apresenta uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 12 (M+IL-2234-179). Uma IL-22 aqui pode incluir adicionalmente uma metionina em seu terminal N, por exemplo, quando tal IL-22 proteína é expressa por bactérias. Em um exemplo, uma IL-22 apresenta uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 12 (M+IL-2234-179). A IL-22 pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir na SEQ ID NO: 10 ou uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99%% de identidade de sequência com esta ou fragmento desta. a IL-22 pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir na SEQ ID NO: 11 (IL-2234-179), a qual é secretada pela IL-22 ou uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99%% de identidade de sequência com esta ou fragmento desta. Uma IL-22 pode incluir uma metionina em seu terminal N, por exemplo, quando tal proteína IL-22 é expressa por bactérias. Tal IL-22 pode consistir em consistir essencialmente em ou compreender uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 12 (M+IL-2234-179).
[0068] Em alguns casos, um veículo utilizado em qualquer um dos construtos de liberação aqui pode ser uma proteína ou um outro tipo de molécula capaz de transportar a carga útil terapêutica através de um epitélio (por exemplo, um epitélio intestinal polarizado de um indivíduo). Tal transporte pode incluir transcitose. Tal como referida aqui, “transcitose” refere-se ao tráfico de molécula de fusão através de uma célula epitelial polarizada. Tal tráfico permite a liberação da carga biologicamente ativa da membrana basolateral da célula epitelial polarizada. O processo de transcitose pode envolver interação(ões) do veículo com um ou mais receptores e/ou proteínas na(s) superfície(s) apical(is) e/ou basal(is), bem como no interior de uma célula do epitélio (por exemplo, uma célula epitelial intestinal polarizada). O veículo pode ser capaz de transportar a carga útil terapêutica através de um epitélio sem prejudicar o epitélio, o veículo e/ou a função biológica e/ou terapêutica da carga útil.
[0069] Um veículo pode ser acoplado a uma carga útil terapêutica covalentemente ou não covalentemente e diretamente ou indiretamente. A carga útil terapêutica pode ser diretamente acoplada ao terminal N ou terminal C do veículo. Nos casos em que o veículo é covalentemente acoplado à carga útil, o veículo pode ser acoplado a tal carga útil por meio de um espaçador (também referido aqui como um ligante). O espaçador pode compreender pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ou mais resíduos de aminoácidos. Os resíduos de aminoácidos do espaçador podem ser, por exemplo, glicina, serina e/ou triptofano. Um espaçador pode ser um espaçador clivável ou não clivável. Um espaçador clivável pode ser clivado por uma enzima ou de uma maneira dependente de pH.
[0070] Exemplos de espaçadores contemplados aqui incluem sequências de oligopeptídeos tais como S, (GS)x , (GGS)x , (GGGS)x (SEQ ID NO: 27), (GGGGS)x (SEQ ID NO: 28) ou (GGGGGS)x (SEQ ID NO: 29), onde x = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15. Em alguns casos, um espaçador consiste em, consiste essencialmente em ou compreende uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 13 ((G4S)3). (GGGGSGGGGSGGGGS). Em alguns casos, um espaçador consiste em, consiste essencialmente em ou compreende uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 31 ((G4S)5). (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS). Em alguns casos, um construto de liberação compreende uma carga útil terapêutica e um veículo que não são covalentemente ligados (por exemplo, por meio de interações iônicas, interações de van der Waals, interações π-π etc.). Um veículo pode compreender adicionalmente uma ou mais características, elementos, aminoácidos ou modificações em seu terminal N e/ou terminal C. Por exemplo, algumas realizações incluem uma metionina no terminal N no terminal N do veículo. Outras modificações (por exemplo, acetilação) podem estar também presentes, incluindo modificações para a expressão em um sistema heterólogo.
[0071] Um construto de liberação aqui pode apresentar uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15 ou 17 (exemplos de M+Cholix1-266- (G4S)3-IL-2234-179) (TABELA 1). Outros construtos de liberação podem apresentar a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 24 ou 25 (por exemplo, quando expressos em uma célula de mamífero tal como uma célula CHO). Tais construtos de liberação exemplificativos transportam IL-22 através de células epiteliais intestinais intactas polarizadas e para a lamina propria.
[0072] Em várias realizações, a proteína de fusão de ocorrência não natural apresenta uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NO: 14-21, 24 ou 25 ou uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência com estas. Um esquema do veículo, espaçador e carga útil de uma proteína de fusão de ocorrência não natural compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15 é apresentado na FIG. 16.
[0073] A TABELA 1 mostra sequências de aminoácidos exemplificativas de moléculas biologicamente ativas utilizadas em combinação com os métodos descritos aqui.
TABELA 1 –Sequências de Aminoácidos Exemplificativas Categoria SEQ ID NO Sequência de Aminoácidos Cholix1-634 SEQ ID VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDV NO: 1 VLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGE
FATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTY SYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQ QRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSV TRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHW HTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWF GGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSK GNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDD LSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDE QEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQI YNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDA DKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITP QGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGT NHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYV ATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARG VMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIG HSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAV AIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKE
RKDELK Cholix1-386 SEQ ID VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDV NO: 2 VLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGE
FATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTY SYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQ QRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSV TRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHW HTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWF GGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSK GNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDD LSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDE QEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQI YNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQA
Cholix1-266 SEQ ID VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDV NO: 3 VLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGE
FATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTY SYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQ QRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSV TRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHW HTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWF GGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSK
G (V1L)- SEQ ID LEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDV Cholix1-386 NO: 4 VLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGE
FATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTY SYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQ QRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSV TRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHW HTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWF GGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSK GNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDD LSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDE QEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQI
YNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQA (V1L)- SEQ ID LEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDV Cholix1-266 NO: 5 VLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGE
FATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTY SYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQ QRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSV TRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHW HTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWF GGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSK
G M+Cholix1- SEQ ID MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSD 386 NO: 6 VVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIG
EFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKT YSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELD QQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAH WHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNW FGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSK GNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDD LSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDE QEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQI
YNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQA M+Cholix1- SEQ ID MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSD 266 NO: 7 VVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIG
EFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKT YSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELD QQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAH WHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNW FGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSK
G M+(V1L)- SEQ ID MLEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSD Cholix1-386 NO: 8 VVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIG
EFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKT YSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELD QQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAH WHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNW FGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSK GNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDD LSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDE QEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQI
YNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQA M+(V1L)- SEQ ID MLEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSD Cholix1-266 NO: 9 VVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIG
EFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKT YSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELD QQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAH WHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNW FGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSK
G IL-221-179 SEQ ID MAALQKSVSSFLMGTLATSCLLLLALLVQGGA NO: 10 AAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASL
ADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLN FTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLS TCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKA
IGELDLLFMSLRNACI IL-2234-179 SEQ ID APISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLA NO: 11 DNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNF
TLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLST CHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAI
GELDLLFMSLRNACI M+IL-2234-179 SEQ ID MAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASL NO: 12 ADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLN
FTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLS TCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKA
IGELDLLFMSLRNACI (G4S)3 SEQ ID GGGGSGGGGSGGGGS NO: 13 M+Cholix1- SEQ ID MLEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSD 386 -(G4S)3-IL- NO: 14 VVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIG 2234-179 EFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKT
YSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELD QQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAH WHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNW FGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSK GNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDD LSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDE QEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQI YNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAGGGGSGGGG SGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLA KEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLM KQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARL SNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGES
GEIKAIGELDLLFMSLRNACI M+Cholix1- SEQ ID MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSD 266 -(G4S)3-IL- NO: 15 VVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIG 2234-179 EFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKT
YSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELD QQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAH WHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNW FGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSK GGGGGSGGGGSGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQ PYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHG VSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPY MQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQK
LKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI M+(V1L)- SEQ ID MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSD Cholix1-386- NO: 16 VVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIG (G4S)3-IL- EFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKT 2234-179 YSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELD
QQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAH WHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNW FGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSK GNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDD LSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDE QEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQI YNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAGGGGSGGGG SGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLA KEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLM KQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARL SNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGES
GEIKAIGELDLLFMSLRNACI M+(V1L)- SEQ ID MLEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSD Cholix1-266- NO: 17 VVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIG (G4S)3-IL- EFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKT 2234-179 YSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELD
QQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAH WHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNW FGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSK GGGGGSGGGGSGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQ PYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHG VSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPY MQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQK
LKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI Cholix1-386- SEQ ID VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDV (G4S)3-IL- NO: 18 VLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGE 2234-179 FATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTY
SYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQ QRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSV TRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHW HTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWF GGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSK GNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDD LSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDE QEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQI YNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAGGGGSGGGG SGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLA KEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLM KQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARL SNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGES
GEIKAIGELDLLFMSLRNACI (V1L)- SEQ ID LEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDV Cholix1-386- NO: 19 VLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGE (G4S)3-IL- FATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTY 2234-179 SYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQ
QRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSV TRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHW HTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWF GGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSK GNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDD LSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDE QEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQI YNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAGGGGSGGGG SGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLA KEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLM KQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARL SNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGES
GEIKAIGELDLLFMSLRNACI Cholix1-266- SEQ ID VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDV (G4S)3-IL- NO: 20 VLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGE 2234-179 FATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTY
SYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQ QRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSV TRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHW HTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWF GGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSK GGGGGSGGGGSGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQ PYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHG VSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPY MQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQK
LKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI (V1L)- SEQ ID LEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDV Cholix1-266- NO: 21 VLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGE (G4S)3-IL- FATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTY 2234-179 SYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQ
QRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSV TRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHW HTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWF GGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSK GGGGGSGGGGSGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQ PYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHG VSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPY MQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQK
LKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI (V1L)- SEQ ID LEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDV Cholix1-634 NO: 22 VLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGE
FATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTY SYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQ QRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSV TRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHW HTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWF GGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSK GNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDD LSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDE QEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQI YNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDA DKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITP QGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGT NHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYV ATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARG VMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIG HSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAV AIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKE RKDELK
M+(V1L)- SEQ ID MLEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSD Cholix1-634 NO: 23 VVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIG
EFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKT YSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELD QQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAH WHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNW FGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSK GNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDD LSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDE QEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQI YNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDA DKSCVASNNDQANINIESRSGRSYLPENRAVITP QGVTNWTYQELEATHQALTREGYVFVGYHGT NHVAAQTIVNRIAPVPRGNNTENEEKWGGLYV ATHAEVAHGYARIKEGTGEYGLPTRAERDARG VMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAEEHITQVIG HSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMAIHAV AIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKE
RKDELK Cholix1-266- SEQ ID VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDV (G4S)3-IL- NO: 24 VLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGE 2234-179 FATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTY
SYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQ QRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSV TRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHW HTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWF GGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSK GGGGGSGGGGSGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQ PYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHG VSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPY MQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQK
LKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI (V1L)- SEQ ID LEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDV Cholix1-266- NO: 25 VLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGE (G4S)3-IL- FATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTY 2234-179 SYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQ
QRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFSV TRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAHW HTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNWF GGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSK GGGGGSGGGGSGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQ PYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHG VSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPY MQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQK
LKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI M+Cholix1- SEQ ID MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSD 266 -(G4S)1-IL- NO: 32 VVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIG 2234-179 EFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKT
YSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELD QQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAH WHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNW FGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSK GGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLA KEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLM KQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARL SNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGES
GEIKAIGELDLLFMSLRNACI M+Cholix1- SEQ ID MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSD 266 -(G4S)5-IL- NO: 33 VVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIG 2234-179 EFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKT
YSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELD QQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAH WHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNW FGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSK GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAPISSH CRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTD VRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEV LFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEG DDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDL
LFMSLRNACI M+ IL-2234- SEQ ID MAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASL 179 NO: 34 ADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLN -(G4S)1- FTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLS Cholix1-266 TCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKA
IGELDLLFMSLRNACIGGGGSVEEALNIFDECRS PCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDEGVLYYSMT INDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATRHYVN QDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAIN WLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSI DLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPS VSYKAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVP MDAIYNYITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPK VITVKQGIEQKPVEQRIHFSKG
M+Cholix1- SEQ ID MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSD 386 -(G4S)1-IL- NO: 35 VVLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIG 2234-179 EFATVRATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKT
YSYNRKEGEFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELD QQRNIIEVPKLYSIDLDNQTLEQWKTQGNVSFS VTRPEHNIAISWPSVSYKAAQKEGSRHKRWAH WHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQNCTLGDNW FGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRIHFSK GNAMSALAAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDD LSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDE QEPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQI YNDYVTHHPGLTPEQTSAGAQAGGGGSAPISS HCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNT DVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEE VLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIE GDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELD
LLFMSLRNACI Cholix SEQ ID X1-E-X3-X4-L-X6-I-F-D-E-C-R-S-P-C-X16-L-T-P- Consensus NO: 26 E-X21-G-K-X24-I-Q-S-K-L-X30-I-P-X33-D-V-V-L- Sequência D-E-G-V-L-Y-Y-S-M-T-I-N-D-E-Q-N-D-I-X56-D- E-X59-K-G-E-S-I-I-T-X67-G-E-F-A-T-X73-R-A-T- R-H-Y-V-X81-Q-D-A-P-F-G-V-I-X90-L-D-I-T-T-E- N-G-T-K-X101-Y-S-X104-N-R-K-X108-X109-E-F- X112-I-X114-W-L-V-X118-X119-G-E-D-S-P-A-S-I- K-I-S-X131-D-E-X134-D-Q-X137-R-N-I-I-E-V-P- K-L-Y-S-I-D-L-D-N-Q-T-L-E-Q-W-X160-X161-Q- G-N-V-X166-F-X168-V-T-R-P-E-X174-X175-I-A-I- S-W-P-S-V-S-Y-X186-A-A-X189-K-X191-G-X193- R-H-K-R-W-A-X200-W-X202-T-X204-X205-X206-
X207-X208-X209-L-X211-X212-X213-X214-X215- X216-X217-X218-X219-X220-X221-X222-X223- X224-C-T-X227-G-X229-X230-W-X232-G-G- X235-Y-X237-T-V-A-G-X242-P-X244-X245-I- X247-V-K-Q-G-X252-E-Q-K-X256-V-E-Q-R-I-H-F- S-X265-X266-N-A-X269-X270-X271-L-A-A-H-R- V-C-G-V-P-L-E-T-L-A-R-X288-R-K-P-R-X293-L- X295-D-D-L-X299-C-X301-Y-X303-A-Q-X306-I- V-S-L-F-X312-A-T-R-X316-L-F-X319-H-X321-D- S-X324-F-T-L-N-L-X330-X331-Q-X333-P-X335-V- X337-E-R-L-X341-X342-X343-R-X345-I-N-E- X349-N-P-G-X353-V-X355-Q-V-L-T-X360-A-R-Q- I-Y-N-D-Y-V-T-X371-H-P-X374-L-X376-P-E-Q-T- S-A-X383-A-Q-A-A-D-I-L-S-L-X393-X394-P-D- X397-D-X399-X400-C-V-A-X404-X405-X406-D-Q- A-N-I-N-X413-E-S-R-S-G-R-S-Y-L-X423-E-N-R-A- V-I-T-X431-Q-G-V-T-N-W-T-Y-Q-E-L-X443- X444-X445-H-Q-X448-L-T-X451-E-X453-Y-V-F- V-G-Y-H-G-T-N-H-X465-A-A-Q-X469-I-V-N-R-I- X475-P-V-P-R-G-X481-X482-T-E-X485-E-X487- X488-W-G-G-X492-Y-V-X495-T-X497-A-X499- X500-X501-X502-X503-Y-X505-R-X507-X508- X509-G-T-X512-X513-X514-X515-X516-X517-T- X519-X520-X521-X522-X523-X524-R-G-V-M-L- X530-V-Y-X533-X534-X535-A-S-L-E-R-F-Y-R- X544-N-X546-X547-L-E-X550-X551-X552-X553- X554-X555-X556-X557-V-I-G-H-X562-L-P-L-R-N- E-A-F-T-G-X573-X574-X575-X576-X577-G-X579- X580-E-T-X583-I-G-W-D-X588-A-I-X591-X592-V-
A-I-P-S-T-I-P-G-N-X603-Y-X605-X606-L-X608- X609-X610-E-E-A-X614-A-X616-E-Q-S-I-S-X622- K-P-P-Y-K-E-X629-X630-D-E-L-K; onde X1 é selecionado do grupo consistindo em V e L; X3 é selecionado do grupo consistindo em E D; X4 é selecionado do grupo consistindo em A e E; X6 é selecionado do grupo consistindo em N e K; X16 é selecionado do grupo consistindo em S e L; X21 é selecionado do grupo consistindo em P e L; X24 é selecionado do grupo consistindo em P e Q; X30 é selecionado do grupo consistindo em S e F; X33 é selecionado do grupo consistindo em S e G; X56 é selecionado do grupo consistindo em K e M; X59 é selecionado do grupo consistindo em D e G; X67 é selecionado do grupo consistindo em I e F; X73 é selecionado do grupo consistindo em V e I; X81 é selecionado do grupo consistindo em N e S; X90 é selecionado do grupo consistindo em H e N; X101 é selecionado do grupo consistindo em T e M; X104 é selecionado do grupo consistindo em Y e F; X108 é selecionado do grupo consistindo em E e D; X109 é selecionado do grupo consistindo em G e S; X112 é selecionado do grupo consistindo em A e T; X114 é selecionado do grupo consistindo em N e H; X118 é selecionado do grupo consistindo em P e I; X119 é selecionado do grupo consistindo em I e P; X131 é selecionado do grupo consistindo em V e I; X134 é selecionado do grupo consistindo em L e I; X137 é selecionado do grupo consistindo em Q e K; X160 é selecionado do grupo consistindo em K e E; X161 é selecionado do grupo consistindo em T e N; X166 é selecionado do grupo consistindo em S e F; X168 é selecionado do grupo consistindo em S e A; X174 é selecionado do grupo consistindo em H e Q; X175 é selecionado do grupo consistindo em N, S, SIAKQS, e SIAKQSIAKQS; X186 é selecionado do grupo consistindo em K e N; X189 é selecionado do grupo consistindo em Q, E, e H; X191 é selecionado do grupo consistindo em E, N, e D; X193 é selecionado do grupo consistindo em S e A; X200 é selecionado do grupo consistindo em H e N; X202 é selecionado do grupo consistindo em H, L, F, e R; X204 é selecionado do grupo consistindo em G e T; X205 é selecionado do grupo consistindo em L e S;X206 é selecionado do grupo consistindo em A e P; X207 é selecionado do grupo consistindo em L, E, e K;X208 é selecionado do grupo consistindo em C e V; X209 é selecionado do grupo consistindo em W, V, e T; X211 é selecionado do grupo consistindo em V e no aminoácido; X212 é selecionado do grupo consistindo em P e no aminoácido; X213 é selecionado do grupo consistindo em M, I, L, e no aminoácido; X214 é selecionado do grupo consistindo em D e no aminoácido; X215 é selecionado do grupo consistindo em A e no aminoácido; X216 é selecionado do grupo consistindo em I e no aminoácido; X217 é selecionado do grupo consistindo em Y e C; X218 é selecionado do grupo consistindo em N e F; X219 é selecionado do grupo consistindo em Y e F; X220 é selecionado do grupo consistindo em I e E; X221 é selecionado do grupo consistindo em T e D; X222 é selecionado do grupo consistindo em Q e P; X223 é selecionado do grupo consistindo em Q, E, e A; X224 é selecionado do grupo consistindo em N, L, e Q; X227 é selecionado do grupo consistindo em L e Y; X229 é selecionado do grupo consistindo em D e E; X230 é selecionado do grupo consistindo em N e D; X232 é selecionado do grupo consistindo em F, H, e Y; X235 é selecionado do grupo consistindo em S e A; X237 é selecionado do grupo consistindo em E e K; X242 é selecionado do grupo consistindo em T e I; X244 é selecionado do grupo consistindo em K, E, e G; X245 é selecionado do grupo consistindo em V e A; X247 é selecionado do grupo consistindo em T e M; X252 é selecionado do grupo consistindo em I e M; X256 é selecionado do grupo consistindo em P, T, e A; X265 é selecionado do grupo consistindo em K, Q, e N; X266 é selecionado do grupo consistindo em G e K; X269 é selecionado do grupo consistindo em M e I; X270 é selecionado do grupo consistindo em S e E; X271 é selecionado do grupo consistindo em A e T; X288 é selecionado do grupo consistindo em S e G; X293 é selecionado do grupo consistindo em D e Y; X295 é selecionado do grupo consistindo em T, P, e Q; X299 é selecionado do grupo consistindo em S e Q; X301 é selecionado do grupo consistindo em A e
V; X303 é selecionado do grupo consistindo em Q e N; X306 é selecionado do grupo consistindo em N e Q; X312 é selecionado do grupo consistindo em V e L; X316 é selecionado do grupo consistindo em I e M; X319 é selecionado do grupo consistindo em S e T; X321 é selecionado do grupo consistindo em L e I; X324 é selecionado do grupo consistindo em V e I; X330 é selecionado do grupo consistindo em D, E, e H; X331 é selecionado do grupo consistindo em E e G; X333 é selecionado do grupo consistindo em E e A; X335 é selecionado do grupo consistindo em E e A; X337 é selecionado do grupo consistindo em A e T; X341 é selecionado do grupo consistindo em S, D, e T; X342 é selecionado do grupo consistindo em D e A; X343 é selecionado do grupo consistindo em L e I; X345 é selecionado do grupo consistindo em R e Q; X349 é selecionado do grupo consistindo em N e D; X353 é selecionado do grupo consistindo em M e V; X355 é selecionado do grupo consistindo em T e I; X360 é selecionado do grupo consistindo em V e I; X371 é selecionado do grupo consistindo em H e E; X374 é selecionado do grupo consistindo em G e L; X376 é selecionado do grupo consistindo em T e I; X383 é selecionado do grupo consistindo em G e S; X393 é selecionado do grupo consistindo em F e L; X394 é selecionado do grupo consistindo em C e Y; X397 é selecionado do grupo consistindo em A e T; X399 é selecionado do grupo consistindo em K, E, e G; X400 é selecionado do grupo consistindo em S, P,
e H; X404 é selecionado do grupo consistindo em S e L; X405 é selecionado do grupo consistindo em N e D; X406 é selecionado do grupo consistindo em N e S; X413 é selecionado do grupo consistindo em I e V; X423 é selecionado do grupo consistindo em P e L; X431 é selecionado do grupo consistindo em P e Q; X443 é selecionado do grupo consistindo em E e D;X444 é selecionado do grupo consistindo em A e T; X445 é selecionado do grupo consistindo em T e K; X448 é selecionado do grupo consistindo em A e T; X451 é selecionado do grupo consistindo em R e Q; X453 é selecionado do grupo consistindo em G e D; X465 é selecionado do grupo consistindo em V e A;X469 é selecionado do grupo consistindo em T, S, e N; X475 é selecionado do grupo consistindo em A, S, e T; X481 é selecionado do grupo consistindo em N e S; X482 é selecionado do grupo consistindo em N e D; X485 é selecionado do grupo consistindo em N, S, e K; X487 é selecionado do grupo consistindo em E, R, e K; X488 é selecionado do grupo consistindo em K, A, e E; X492 é selecionado do grupo consistindo em L e V; X495 é selecionado do grupo consistindo em A e S; X497 é selecionado do grupo consistindo em H e D; X499 é selecionado do grupo consistindo em E e S; X500 é selecionado do grupo consistindo em V e L; X501 é selecionado do grupo consistindo em A e N; X502 é selecionado do grupo consistindo em H e Y; X503 é selecionado do grupo consistindo em G e R; X505 é selecionado do grupo consistindo em A e T; X507 é selecionado do grupo consistindo em I e L; X508 é selecionado do grupo consistindo em K e Q; X509 é selecionado do grupo consistindo em E e K; X512 é selecionado do grupo consistindo em G e A; X513 é selecionado do grupo consistindo em E, D, e N; X514 é selecionado do grupo consistindo em Y, G, A, e N; X515 é selecionado do grupo consistindo em G e E; X516 é selecionado do grupo consistindo em L e G; X517 é selecionado do grupo consistindo em P e L; X519 é selecionado do grupo consistindo em R, P, e T; X520 é selecionado do grupo consistindo em A e E; X521 é selecionado do grupo consistindo em E e K; X522 é selecionado do grupo consistindo em R, Q, e K; X523 é selecionado do grupo consistindo em D, K, e E; X524 é selecionado do grupo consistindo em A, T, e S; X530 é selecionado do grupo consistindo em R e K; X533 é selecionado do grupo consistindo em I e L; X534 é selecionado do grupo consistindo em P e H; X535 é selecionado do grupo consistindo em R e Q; X544 é selecionado do grupo consistindo em T e I; X546 é selecionado do grupo consistindo em T, A, e I; X547 é selecionado do grupo consistindo em P e D; X550 é selecionado do grupo consistindo em N e K; X551 é selecionado do grupo consistindo em A e E; X552 é selecionado do grupo consistindo em E, R, e D; X553 é selecionado do grupo consistindo em E, N, e R; X554 é selecionado do grupo consistindo em H e L; X555 é selecionado do grupo consistindo em I e V;
X556 é selecionado do grupo consistindo em T e E; X557 é selecionado do grupo consistindo em Q, R, H, e D; X562 é selecionado do grupo consistindo em S e P; X573 é selecionado do grupo consistindo em P e T; X574 é selecionado do grupo consistindo em E e D; X575 é selecionado do grupo consistindo em S, A, e R; X576 é selecionado do grupo consistindo em A, E, e V; X577 é selecionado do grupo consistindo em G, E, e D; X579 é selecionado do grupo consistindo em E e S; X580 é selecionado do grupo consistindo em D e N; X583 é selecionado do grupo consistindo em V e A; X588 é selecionado do grupo consistindo em M e I; X591 é selecionado do grupo consistindo em H e Y; X592 é selecionado do grupo consistindo em A e G; X603 é selecionado do grupo consistindo em A e S; X605 é selecionado do grupo consistindo em E e A; X606 é selecionado do grupo consistindo em E, A, Q, G, V, e R; X608 é selecionado do grupo consistindo em A, P, e T; X609 é selecionado do grupo consistindo em I, T, e P; X610 é selecionado do grupo consistindo em D e A; X614 é selecionado do grupo consistindo em V e VVKEAI; X616 é selecionado do grupo consistindo em K e E; X622 é selecionado do grupo consistindo em T, A, e P; andX629 é selecionado do grupo consistindo em R, Q, e H; e X630 é selecionado do grupo consistindo em K e no aminoácido.
[0074] Em algumas realizações, a proteína de fusão de ocorrência não natural compreende ou consiste em: um veículo selecionado do grupo consistindo em qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NO: 1-9,22-23, e 26 e uma carga útil selecionada do grupo consistindo em qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NO: 10-12 e onde o veículo e a carga útil estão opcionalmente acoplados por um espaçador selecionado do grupo consistindo em qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NO: 13 e 27-29.
[0075] São também providas aqui composições farmacêuticas compreendendo um construto de liberação e um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Em alguns casos, o construto de liberação consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15. Em alguns casos, o construto de liberação consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17. Tais composições farmacêuticas podem ser formuladas para administração a um indivíduo. Em alguns casos, uma composição farmacêutica é formulada para administração oral a um indivíduo.
[0076] Uma composição farmacêutica compreendendo um construto de liberação pode ser administrada a um indivíduo (por exemplo, um humano) necessitando de tal para tratar uma doença. Doenças que podem ser tratadas pela utilização dos construtos de liberação desta descrição incluem doenças autoimunes e doença inflamatórias. Em alguns casos, a doença é uma lesão em célula epitelial ou dano nas membranas epiteliais celulares (por exemplo, no trato GI). Em alguns casos, a doença é hepatite, obesidade, doença do fígado gorduroso, inflamação do fígado ou pancreatite, doença de Crohn (por exemplo, doença de Crohn fistulizante), colite ulcerativa (por exemplo, de branda a moderada ou de moderada a severa), bolsite, proctite, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, doença do enxerto versus hospedeiro, artrite reumatoide ou psoríase. Métodos de Purificação e Composições
[0077] A presente descrição contempla métodos para a obtenção de uma proteína de fusão de ocorrência não natural purificada. A proteína de fusão de ocorrência não natural pode compreender IL-22 e um veículo e, opcionalmente, a espaçador acoplando a IL-22 ao veículo. A proteína de fusão de ocorrência não natural pode ser uma proteína compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 80%, 85%. 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência ou apresentando 100% de identidade de sequência, com uma sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOS: 14-21, 24 ou 25. As vantagens dos métodos e composições descritos aqui incluem a manutenção de uma alta pureza e alta atividade biológica dos polipeptídeos ou proteínas purificadas.
[0078] Vantagens específicas dos métodos descritos aqui incluem: a) alta atividade biológica das proteínas de fusão de ocorrência não natural devido ao dobramento correto utilizando tampões de dobramento especificamente desenvolvidos; b) alta pureza química das proteínas de fusão de ocorrência não natural purificadas em conjunto com baixa toxicidade; c) alto rendimento de recuperação do material submetido a purificação; d) a reprodutibilidade dos resultados possibilita uma produção e suprimento confiáveis; e) capacidade de manufatura e de escalonamento para escala multi-grama e multi-quilograma para aplicações clínicas e comerciais; f) uso sustentável de materiais e recursos provê um método de purificação de custo e logística efetivos para moléculas clinicamente relevantes. Adicionalmente, os métodos de manufatura aperfeiçoados podem aumentar a velocidade na qual estas proteínas purificadas podem ser desenvolvidas para uso terapêutico (FIG. 22).
[0079] Um processo exemplificativo para a purificação das proteínas de fusão de ocorrência não natural descritas aqui é mostrado na FIG. 17, a qual ilustra adicionalmente a pureza e quantidades de recuperação para a proteína de fusão de ocorrência não natural em cada estágio do processo de purificação.
[0080] Tal como utilizada aqui, “pureza” indica um nível da proteína desejada (por exemplo, proteína de fusão de ocorrência não natural) ou forma desejada da proteína (por exemplo, um monômero da proteína de fusão de ocorrência não natural, a uma proteína de fusão de ocorrência não natural corretamente dobrada ou uma combinação destas) em uma composição que pode compreender também proteínas não desejadas ou formas não desejadas da proteína (por exemplo, um agregado da proteína de fusão de ocorrência não natural, uma proteína incorretamente dobrada ou uma combinação destas). O nível pode ser representado por uma percentagem (%) da proteína desejada ou da forma desejada da proteína. Por exemplo, a pureza pode ser maior que 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% ou pode ser de 100%. O termo “purificada” pode ser utilizado para indicar uma composição que passou por um aumento em pureza. Um aumento na pureza pode ser devido aos procedimentos de purificação descritos aqui, tal como cromatografia de troca aniônica, cromatografia com hidroxiapatita, cromatografia de troca catiônica ou uma combinação destas.
[0081] Em alguns casos, os métodos e composições da presente descrição compreendem o uso de pelo menos duas colunas de cromatografia que estão colocadas em tandem, seguidas por uma etapa de troca de concentração/tampão (ultrafiltração/diafiltração (UF/DF) de maneira a concentrar e trocar o tampão da solução). As colunas de cromatografia podem ser sistemas cromatográficos de baixa pressão, tal como a coluna AKTA Avant 150 ou uma coluna AKTA Pilot da General Electric (GE). Em alguns casos, pelo menos uma coluna contém uma resina de troca aniônica (por exemplo, resina NH2-750F) e pelo menos uma coluna contém uma resina de hidroxiapatita (por exemplo, resina CaPure). Em alguns casos, pelo menos uma coluna contendo a resina de troca aniônica é utilizada para a etapa de captura, enquanto a pelo menos uma coluna contendo a resina de hidroxiapatita é utilizada para a etapa de polimento. Em alguns casos, em vez da (ou em adição a) coluna de hidroxiapatita, uma coluna de troca catiônica pode ser utilizada. Por exemplo, em algumas realizações, a coluna de troca catiônica com uma resina de polimetacrilato funcionalizada do sulfato, tal como TOYOPEARL Sulfate-650F. A pureza da proteína solubilizada pode aumentar de 44% para 47% após UF/DF de 93% para 97% após a cromatografia de troca aniônica para pelo menos 99% após a cromatografia com hidroxiapatita. A recuperação da proteína solubilizada pode aumentar de 70% para 73% após a cromatografia de troca aniônica para pelo menos 97% após a cromatografia com hidroxiapatita.
[0082] Isolamento de proteínas de fusão de ocorrência não natural a partir de corpos de inclusão
[0083] Em algumas realizações, as proteínas de fusão de ocorrência não natural a serem purificadas são isoladas a partir de corpos de inclusão (IBs). Os IBs, tais como descritos aqui, podem ser agregados nucleares ou citoplasmáticos de substâncias estáveis, tais como proteínas e polipeptídeos. Em algumas realizações, corpos de inclusão duplamente lavados (DWIB) compreendendo as proteínas de fusão de ocorrência não natural (por exemplo, SEQ ID NOs: 14-21) provenientes de fermentação são novamente suspendidos em um sistema de tampão específico (ver EXEMPLO 6).
[0084] Em alguns casos, a concentração de DWIB é de cerca de 0,5 g de DWIB/100 mL de tampão a cerca de 5 g de DWIB/10 mL de tampão. Em alguns casos, a concentração de DWIB é de cerca de 2 g de DWIB/50 mL de tampão a cerca de 5 g de DWIB/50 mL de tampão. Em alguns casos, a concentração de DWIB é de cerca de 1 g de DWIB/20 mL de tampão a cerca de 1 g de DWIB/10 mL de tampão. Em alguns casos, a concentração de DWIB é de pelo menos 1 g de DWIB/100 mL de tampão. Em alguns casos, a concentração de DWIB é de pelo menos 1 g de DWIB/10mL de tampão.
[0085] O sistema de tampão system para a ressuspensão pode compreender uma variedade de agentes e ingredientes tamponantes. Em alguns casos, o sistema de tampão para a ressuspensão compreende Guanidina/HCl (Gu-HCl) a uma concentração de pelo menos 1 M, pelo menos 2 M, pelo menos 4 M, pelo menos 6 M, pelo menos 8 M. Em alguns casos, a concentração, de Gu-HCl é de cerca de 4 M a cerca de 8 M. Em alguns casos, o sistema de tampão para ressuspensão compreende tampão Tris, onde a concentração de Tris é de pelo menos 5 mM, pelo menos 10 mM, pelo menos 20 mM, pelo menos 50 mM ou pelo menos 100 mM. Em alguns casos, o tampão Tris apresenta uma concentração de cerca de 40 mM a cerca de 60 mM. O tampão Tris pode ser Tris-HCl. O Tris-HCl pode apresentar um pH de 8,0 a 8,5. O Tris-HCl pode apresentar um pH de 8,2. Em alguns casos, o sistema de tampão para ressuspensão compreende ditiotreitol
(DTT). O DTT pode apresentar uma concentração de pelo menos 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM ou 70 mM. O DDT pode apresentar uma concentração de 7 mM a 11 mM, de 8 mM a 10 mM ou de 9 mM a 10 mM. Em alguns casos, o sistema de tampão para ressuspensão compreende ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). O EDTA pode apresentar uma concentração de pelo menos 1 mM, 1,5 mM, 2 mM ou 2,5 mM. O EDTA pode apresentar uma concentração de 1 mM a 2,5 mM ou de 1,9 mM a 2,1 mM. Em algumas realizações, o sistema de tampão para ressuspensão compreende, consiste essencialmente em ou consiste em um tampão Tris, Gu-HCl e DTT. O sistema de tampão utilizado para ressuspensão pode apresentar um pH de cerca de 6 a cerca de 10. Em alguns casos, o sistema de tampão apresenta um pH de cerca de 7,5 a cerca de 8,5. Em alguns casos, o pH do sistema de tampão é de pelo menos 7. Em alguns casos, o pH do sistema de tampão é de pelo menos 8. Em alguns casos, o pH do sistema de tampão é de pelo menos 8,5.
[0086] Redução das proteínas de fusão de ocorrência não natural solubilizadas
[0087] Um agente redutor pode ser adicionado à solução de ressuspensão. O agente redutor pode ser ditiotreitol (DTT). A quantidade de agente redutor utilizado pode depender do volume da solução de ressuspensão e da proteína de fusão presente nesta solução. Em alguns casos, a quantidade de agente redutor utilizado é de cerca de 0,025 mM a cerca de 50 mM, a 0,5 mM a 30 mM, de 1 mM a 10 mM. Em alguns casos, a quantidade de agente redutor utilizado é de pelo menos (ou entre) 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM ou 10 mM.
[0088] A solução de proteína de fusão de ocorrência não natural solubilizada (por exemplo, SEQ ID NOs: 14-21) pode ser incubada a várias temperaturas variando de cerca de 2ºC a cerca de 40ºC. Em alguns casos, a solução de proteína pode ser incubada à temperatura ambiente (TA). A incubação pode ser realizada enquanto a solução está sob agitação. A solução pode ser posta sob agitação em uma placa de agitação magnética e então centrifugada. A centrifugação pode ser realizada a cerca de 1000 xg a cerca de 20000 xg. Em alguns casos, a centrifugação é realizada a 15970 xg por 90 minutos a 4ºC. O tempo de incubação pode variar de cerca de 20 minutos a cerca de 180 minutos, dependendo da concentração dos ingredientes, da concentração da proteína de fusão (por exemplo, SEQ ID NOs: 14-21).
[0089] A concentração da proteína em várias soluções em todos os métodos e procedimentos descritos aqui pode ser realizada pela utilização do ensaio de Bradford. A concentração da proteína de fusão de ocorrência não natural solubilizada pode ser de cerca de 1 mg/mL a cerca de 50 mg/mL. Em alguns casos, a concentração final da proteína de fusão de ocorrência não natural solubilizada pode ser de cerca de 3 mg/mL a cerca de 30 mg/mL. Em alguns casos, a concentração final da proteína de fusão de ocorrência não natural solubilizada pode ser de cerca de 5 mg/mL a cerca de 20 mg/mL. Em alguns casos, a concentração final da proteína de fusão de ocorrência não natural solubilizada pode ser de pelo menos 15 mg/mL.
[0090] Redobramento das proteínas de fusão de ocorrência não natural
[0091] As proteínas de fusão de ocorrência não natural da presente descrição podem exercer sua atividade biológica devido à sua estrutura tridimensional específica ou dobramento. Desta forma, o redobramento destes polipeptídeos pode ser importante no desenvolvimento destes polipeptídeos para aplicações farmacêuticas. O redobramento desejável de uma proteína de fusão compreendendo pelo menos um veículo e uma IL-22 pode compreender o redobramento do veículo ou da IL-22 em uma estrutura terciária similar a uma estrutura terciária de um de veículo de ocorrência natural homólogo ou sequência de IL-22 ou a uma estrutura terciária que resulte na manutenção da atividade desejada do veículo (por exemplo, transcitose da proteína de fusão) e da IL-22. Os métodos descritos aqui podem compreender o redobramento da proteína de fusão de ocorrência não natural solubilizada de maneira a produzir a proteína de fusão de ocorrência não natural redobrada. O redobramento pode ocorrer antes da realização da cromatografia de troca aniônica.
[0092] A proteína solubilizada (por exemplo, SEQ ID NOs: 14-21) pode ser adicionada a uma solução de redobramento, também referida como uma solução tampão de redobramento. A quantidade de proteína solubilizada utilizada pode ser de 0,1 mg/mL a 1 mg/mL, 1 mg/mL a 100 mg/mL, de 1 mg/mL a 50 mg/mL, de 1 mg/mL a 10 mg/mL, de 5 mg/mL a 20 mg/mL ou cerca de 15 mg/mL. A quantidade de proteína solubilizada pode ser de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mg/mL. A quantidade de proteína solubilizada pode ser não mais que 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 mg/mL. A solução de redobramento pode apresentar um pH de entre 7,5 e 8,5 ou cerca de 7,0.
[0093] A solução tampão de redobramento pode compreender um aminoácido, um poliol, um sal, um açúcar, um reagente redox, a agente caotrópico ou uma combinação destes. O aminoácido pode ser prolina, glicina, arginina ou alanina. O poliol pode ser glicerol. O sal pode ser cloreto de sódio (NaCl), cloreto de potássio (KCl) ou cloreto de magnésio (MgCl2). O açúcar pode ser glicose ou sacarose. O reagente redox pode ser cisteína, cistamina, glutationa, ditiotreitol (DTT) ou sulfato de cobre (CuSO4). Em algumas realizações, o tampão de redobramento compreende Tris-base, Arginina-HCl, ureia, EDTA, glicerol, L- Cisteína, Cistamina-2HCl, DTT, Gu-HCl ou uma combinação destes. Em algumas realizações, o tampão de redobramento compreende, consiste essencialmente em ou consiste em Tris a pH 8,5, arginina glicerol, cisteína e cistamina. As concentrações do tampão Tris podem variar de cerca de 20 mM a cerca de 200 mM com o pH variando de cerca de 6 a cerca de 9. As concentrações de Arginina-HCl podem variar de cerca de 0,1 M a cerca de 1,5 M, de cerca de 0,75 M a 1,25 M ou cerca de 1,0 M. As concentrações de ureia podem variar de cerca de 0,5 M a 1,5 M. As concentrações de EDTA podem variar de 1 mM a 3 mM. As concentrações de glicerol podem variar de cerca de 2% v/v a cerca de 20% v/v, de cerca de 8% v/v a cerca de 12% v/v ou cerca de 10% v/v. As concentrações de cisteína podem ser de 1 mM a 5 mM, de 2 mM a 4 mM ou de cerca de 3 mM. A cisteína pode ser L-cisteína. As concentrações de cistamina podem variar de cerca de 0,5 mM a cerca de 5 mM, de cerca de 1 mM a cerca de
4 mM ou cerca de 3 mM. a cistamina pode ser cistamina-2HCl. As concentrações de DTT podem variar de cerca de 0,1 mM a cerca de 1 mM. As concentrações de Gu-HCl podem variar de cerca de 50 mM a cerca de 500 mM. O tampão de redobramento pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir em Tris, L-arginina, ureia, EDTA, cisteína e cistamina. O tampão de redobramento pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir em 100 mM de Tris a pH 8,5, 1 M de arginina, 10% (v/v) de glicerol, 3 mM de L-Cisteína e 1 mM de Cistamina-2HCl. A proteína de fusão de ocorrência não natural solubilizada pode ser adicionada ao tampão de redobramento para produzir uma mistura de redobramento. A concentração da proteína de fusão de ocorrência não natural, após a adição da mistura de redobramento, pode ser de cerca de 0,1 mg/mL a 1,0 mg/mL, 0,5/mL mg a 1,5 mg/mL, de 0,75 mg/mL a 1,25 mg/mL ou cerca de 1 mg/mL. A concentração da proteína de fusão de ocorrência não natural na mistura de redobramento pode ser menor que 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL ou 1,0 mg/mL.
[0094] Em várias realizações, um volume de cerca de 100 mL a cerca de 10000 L de tampão de redobramento é utilizado. Em alguns casos, o volume é de cerca de 50 mL a cerca de 1500 L. Em alguns casos, o volume é de cerca de 10 L a cerca de 300 L. Em alguns casos, o volume é de pelo menos 200 L.
[0095] A solução de redobramento pode apresentar uma certa temperatura. Por exemplo, a solução de redobramento pode ser previamente resfriada a cerca de 2- 12ºC. Em alguns casos, a solução de redobramento é resfriada previamente para pelo menos cerca de 3ºC. Este processo de redobramento pode ser otimizado dependendo da proteína utilizada e da aplicação (FIG. 18).
[0096] Em algumas realizações da presente descrição, a mistura de redobramento é incubada por um certo período de tempo. Em alguns casos, o processo pode durar cerca de uma hora, duas horas, quatro horas, cinco horas ou 20 horas. Em alguns casos, o processo de redobramento leva cerca de 15 a cerca de 25 horas. Em alguns casos, uma bomba peristáltica é ajustada para uma certa taxa de fluxo dependendo da constituição da solução (por exemplo, concentração ou volume) para aplicar o material solubilizado à solução de redobramento. Em alguns casos, uma bomba peristáltica é ajustada para uma taxa de fluxo de 60-80 ml/min. O processo de otimização utiliza um desenho de experimentos (DOE) de 15 matrizes, 12 variáveis e 200 reações de redobramento diferentes. As decisões foram tomadas por um processo de eliminação.
[0097] Em várias realizações, pode ser realizada uma análise quantitativa para se determinar a quantidade de proteína corretamente dobrada na solução compreendendo as proteínas de fusão de ocorrência não natural redobradas. Em alguns casos, SEC-HPLC é realizada para se determinar a quantidade de proteína de fusão de ocorrência não natural apropriadamente dobrada nas amostras de redobramento.
[0098] A pureza da proteína de fusão de ocorrência não natural redobrada pode ser de 45% a 65%, de 40% a 60% ou de 45% a 55%. A pureza da proteína de fusão de ocorrência não natural redobrada pode ser de pelo menos 40%, 45%, 50% ou 55%.
[0099] Filtração de fluxo tangencial (TFF) de construtos de liberação de IL- 22 solubilizados
[0100] Em várias realizações, o redobramento da proteína é realizado em combinação com ou antes dos sistemas de filtração de fluxo tangencial (TFF) (por exemplo, Millipore) e sistemas de ultrafiltração/diafiltração (UF/DF) com certos cortes de pelo molecular (MWCOs).
[0101] A mistura de redobramento de proteína pode ser subsequentemente processada por TFF de maneira a concentrar e trocar o tampão da solução. Em alguns casos, o processo é realizado por ultrafiltração/diafiltração (UF/DF). Durante a ultrafiltração, a solução pode ser concentrada de 8 vezes a 12 vezes ou cerca de 10 vezes. A ultrafiltração pode ser seguira de uma troca de 5 vezes de tampão durante a diafiltração com um tampão de diafiltração. A UF/DF pode compreender o uso de filtros MWCO Millipore Ultracell Pellican3 de 10-20 kDa, com cassetes de folha plana TFF de 1-2 m2. Os parâmetros específicos (isto é, TMP) podem ser variados dependendo das características moleculares da proteína. O tampão de diafiltração pode compreender de 10-25 mM de Tris-base a pH de cerca de 7 a cerca de 8,5 e de 50-200 mM de NaCl. Os parâmetros específicos podem ser variados dependendo c
[0102] Das características moleculares da proteína. O volume final no término do processo de UF/DF pode ser de cerca de 5 L a cerca de 100 L. Em alguns casos, o volume final varia de cerca de 10 a cerca de 50 L. Em alguns casos, o volume final varia de cerca de 80 mL a cerca de 10 L.
[0103] A filtração subsequente pode ser realizada pela utilização de um sistema de filtração em fluxo. Em alguns casos, o sistema de filtração em fluxo é um sistema de filtro AkroPac e tubulação de bomba peristáltica Cole-Parmer. O ensaio de Bradford pode ser realizado para se determinar a concentração, rendimento e etapa de recuperação da proteína.
[0104] Em várias realizações, uma análise quantitativa pode ser realizada para se determinar a quantidade ou percentagem da proteína corretamente dobrada nas soluções de amostra. Em alguns casos, uma SEC-HPLC é realizada para se determinar a quantidade da proteína de fusão de ocorrência não natural apropriadamente dobrada presente nas amostras de redobramento e UF/DF.
[0105] A pureza de uma solução compreendendo a proteína de fusão de ocorrência não natural redobrada após UF/DF pode ser de 35% a 55%, de 40% a 50%, de 43% a 47% ou de cerca de 45%. A pureza de uma solução compreendendo a proteína de fusão de ocorrência não natural redobrada após UF/DF pode ser de pelo menos 35%, 40% ou 45%. A recuperação da proteína de fusão de ocorrência não natural redobrada solubilizada após UF/DF pode ser de 87% a 97%, de 90% a 94%, de 92% a 93% ou cerca de 92,5%. (Outros sistemas de concentração e toca de tampão também podem ser utilizados).
[0106] Purificação e recuperação de proteínas de fusão de ocorrência não natural
[0107] Tal como previamente descrito, o uso de dois métodos de cromatografia em tandem, tal como uma cromatografia de troca aniônica e uma cromatografia por hidroxiapatita (ou alternativamente, cromatografia de troca catiônica), pode resultar em pureza e recuperação aumentadas da proteína de fusão de ocorrência não natural, tal como os construtos de liberação de IL-22 descritos aqui, a partir da solução. Em várias realizações da presente descrição, as especificidades da cromatografia (por exemplo, tipo de coluna, resina, taxa de fluxo, sistemas de tampão, gradiente e condutividade) são determinadas e otimizadas dependendo de vários parâmetros, por exemplo, a proteína a ser purificada. Uma variedade de colunas de purificação pode ser utilizada para a purificação de proteína como descrito aqui.
[0108] Cromatografia de troca aniônica
[0109] Os métodos descritos aqui podem compreender a realização de cromatografia de troca aniônica (AEX) em uma mistura compreendendo a proteína de fusão de ocorrência não natural. A mistura pode ser uma solução compreendendo a proteína de fusão não redobrada naturalmente. A realização de cromatografia de troca aniônica pode produzir uma primeira fração compreendendo a proteína de fusão de ocorrência não natural.
[0110] Uma variedade de resinas pode ser utilizada em combinação com os métodos e composições da presente descrição. Em alguns casos, a resina compreende esferas de polimetilacrilato funcionalizadas com amina. Em alguns casos, a resina de troca aniônica NH2-750F é utilizada para a purificação de proteína. Uma coluna com uma altura de leito de pelo menos 15 cm, 20 cm, 25 cm ou 30 cm pode ser preenchida com a resina. Uma coluna com uma altura de leito de 10 a 50 cm pode ser preenchida com resina em uma maneira para garantir um volume de coluna que pode facilitar uma capacidade de ligação dinâmica apropriada (por exemplo, > 20 g/L) de maneira a possibilitar a produção da quantidade desejada de proteína. Em alguns casos, a capacidade de ligação dinâmica da coluna é de 5 g/L a 100 g/L, de 20 g/L a cerca de 50 g/L, de 15 g/L a 30 g/L ou de 20 g/L a 25 g/L.
[0111] Os sistemas de tampão utilizados para a eluição (por exemplo, gradiente de eluição) na cromatografia de troca aniônica podem compreender uma, duas, três ou quatro soluções de tampão diferentes (por exemplo, Tampões A a D). Em algumas realizações, são utilizados dois tampões na cromatografia de troca aniônica e são referidos aqui como Tampão A e Tampão B. Em alguns casos, uma solução tampão compreende Tris (por exemplo, 10-50 mM, pH 7-9) e/ou NaCl (por exemplo, 0,1-5 M). Em alguns casos, a solução tampão compreende adicionalmente glicerol. Em algumas realizações, a(s) solução(ões) tampão utilizada(s) em cromatografia de troca aniônica, tal como, por exemplo, Tampão A ou Tampão B, compreende, consiste essencialmente em ou consiste em Tris pH 7,5 e NaCl e, opcionalmente, glicerol.
[0112] O Tampão A pode compreender de 10 mM a 30 mM, de 15 mM a 25 mM, de 19 mM a 21 mM ou cerca de 20 mM Tris pH 7,5. O Tampão A pode compreender de 0,25 M a 0,95 M, de 0,35 M a 0,75 M, de 0,45 M a 0,55 M, cerca de 0,5 M, de 0,65 M a 0,75 M ou cerca de 0,7 M NaCl. O Tampão B pode compreender de 10 mM a 30 mM, de 15 mM a 25 mM, de 19 mM a 21 mM ou cerca de 20 mM Tris pH 7,5. O Tampão B pode compreender de 1 M a 3 M, de 1,5 M a 2,5 M, de 1,9 M a 2,1 M ou cerca de 2 M de NaCl. O Tampão A pode compreender adicionalmente de 8% a 12%, de 9% a 11% ou cerca de 10% (v/v) de glicerol. O Tampão B pode compreender adicionalmente de 8% a 12%, de 9% a 11% ou cerca de 10% (v/v) de glicerol.
[0113] Para a cromatografia de troca aniônica da SEQ ID NO: 15, o Tampão A pode compreender 20 mM de Tris pH 7,5 e 0,5 M de NaCl e o Tampão B pode compreender 20 mM de Tris pH 7,5 e 2,0 M de NaCl (TABELA 4). Para a cromatografia de troca aniônica da SEQ ID NO: 17, o Tampão A pode compreender 20 mM de Tris pH 7,5 e 0,5 M de NaCl e o Tampão B pode compreender 20 mM de Tris pH 7,5 e 2,0 M de NaCl. Para a cromatografia de troca aniônica da SEQ ID NO: 14, o Tampão A pode compreender 20 mM de Tris pH 7,5, 0,7 M de NaCl e 10% (v/v) de glicerol e o Tampão B pode compreender 20 mM de Tris pH 7,5, 2,0 M de NaCl e 10% (v/v) de glicerol (TABELA 5).
[0114] Em algumas realizações, um certo volume de uma solução salina é adicionado à solução de proteína. Em alguns casos, a solução de NaCl com uma concentração variando de cerca de 0,1 a cerca de 5 M é adicionada à solução de proteína.
[0115] As soluções de proteína podem ser carregadas na coluna de tal forma que uma taxa de fluxo específica e um tempo de residência específico na coluna pode ser observado para garantir uma interação apropriada da proteína e a fase sólida (por exemplo, resina). Em alguns casos, a taxa de fluxo é controlada de tal forma que um tempo de residência na coluna é de cerca de 30 segundos a cerca de 6 minutos ou cerca de 5 minutos. O tempo de residência na coluna pode ser de pelo menos 30 segundos ou 1, 2, 3, 4 ou 5 minutos. O tempo de residência na coluna pode ser não mais que 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 minutos. O fluxo que atravessa pode ser coletado e analisado para se determinar se há proteína não ligada, o que é considerado como uma perda. Para a análise e purificação da proteína, a absorbância a cerca de 280 nm é determinada para a concentração de proteína e SEC-HPLC para a pureza da proteína.
[0116] Em algumas realizações, uma percentagem (por exemplo, 0-100%) ou taxa de fluxo (por exemplo, 1-10 mL/min) de um primeiro tampão é combinado com um segundo tampão de maneira a se obter uma taxa de fluxo final específica (por exemplo, 1-10 mL/min) do sistema de purificação em coluna. Por exemplo, um gradiente linear de 20 volumes de coluna (CV) de 0,0-62,5% B (100-37,5% A), seguido de um gradiente em etapa para 100% B (0% A) para 5 CV adicionais é realizado para a purificação da proteína. Em alguns casos, um gradiente de 0- 75% B (100-25% A) 40 CV, Etapa 100% B, 10 CV pode ser realizado como um gradiente de eluição indicando 91-93% de proteína pura e uma recuperação de > 90%.
[0117] A pureza da proteína de fusão de ocorrência não natural na primeira fração pode ser de 90% a 99% ou de 91% a 95%. A pureza da proteína de fusão de ocorrência não natural solubilizada na primeira fração pode ser de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ou 95%. A recuperação da proteína de fusão de ocorrência não natural solubilizada na primeira fração pode ser de 61% a 81%, de 66% a 76% ou de 71% a 72%.
[0118] Cromatografia de troca catiônica ou cromatografia com hidroxiapatita
[0119] Os métodos descritos aqui podem compreender adicionalmente a submissão da primeira fração obtida após a cromatografia de troca aniônica a uma resina de troca catiônica de maneira a se obter uma segunda fração compreendendo a proteína de fusão de ocorrência não natural. A resina de troca catiônica pode ser uma resina de metacrilato funcionalizada com sulfato. A resina de troca catiônica pode ser uma resina TOYOPEARL® Sulfate-650F.
[0120] Os métodos descritos aqui podem adicionalmente ou alternativamente compreender a submissão da primeira fração obtida após a cromatografia de troca aniônica a uma resina de hidroxiapatita de maneira a se obter uma segunda fração compreendendo a proteína de fusão de ocorrência não natural. A resina de hidroxiapatita pode ser uma resina de troca catiônica compreendendo adicionalmente uma afinidade por cálcio. A resina de hidroxiapatita pode compreender fosfato de cálcio. a resina de hidroxiapatita pode apresentar uma fórmula química de: Ca10(PO4)6(OH)2. A resina de hidroxiapatita pode compreender um tamanho de partícula de 30 µm a 50 µm, de 35 µm a 45 µm ou cerca de 39 µm. A resina de hidroxiapatita pode ser a resina CaPure.
[0121] As vantagens da resina CaPure podem incluir a) tolerância a sal, permitindo uma adsorção de proteína a alta condutividade em soluções aquosas; b) não há preparação das proteínas (por exemplo, proteínas de fusão tais como SEQ ID NO: 14-21) requerida antes da carga; c) resulta em alta recuperação (> 90%); d) alta capacidade de ligação (> 20 mg/mL de resina); e) aumento da pureza pela remoção de impurezas de baixo peso molecular (LMW); e f) garante a remoção de endotoxina (< 1,0 EU/mg).
[0122] A resina de troca catiônica ou resina de hidroxiapatita podem ser utilizadas para empacotar uma coluna de cromatografia. A coluna pode apresentar uma altura de leito de 10 cm a 50 cm ou cerca de 20 cm. A coluna pode compreender uma altura de leito de pelo menos 10 cm, 15 cm, 20 cm, 25 cm ou 30 cm. A coluna pode apresentar uma altura de leito de não mais que 20 cm, 30 cm, 40 cm ou 50 cm. Em alguns casos, a resina CaPure no modo misto com hidroxiapatita é utilizada para empacotar uma coluna com uma altura de leito de 10-50 cm, garantindo um volume de coluna que facilita uma capacidade de ligação dinâmica de no máximo 10-100 g/L de maneira a possibilitar a produção da quantidade desejada de proteína.
[0123] Os sistemas de tampões utilizados para a eluição (por exemplo, gradiente de eluição) em cromatografia com hidroxiapatita podem compreender uma, duas, três ou quatro soluções tampão diferentes (por exemplo, Tampões A a D). Em algumas realizações, dois tampões são utilizados na cromatografia com hidroxiapatita e são referidos aqui como Tampão A e Tampão B. Em alguns casos, uma solução tampão compreende Tris (por exemplo, 10-50 mM, pH 7-9), e/ou NaCl (por exemplo, 0,1-5 M). Em alguns casos, a solução tampão compreende adicionalmente glicerol. Em algumas realizações, uma primeira solução tampão utilizada em cromatografia com hidroxiapatita, tal como, por exemplo, o Tampão A, compreende, consiste essencialmente em ou consiste em Tris pH 7,5, NaCl e CaCl2. Em algumas realizações, uma segunda solução tampão utilizada em cromatografia com hidroxiapatita, tal como, por exemplo, o Tampão B, compreende, consiste essencialmente em ou consiste em fosfato de sódio pH 7,0, NaCl e CaCl2.
[0124] O Tampão A pode compreender de 10 mM a 30 mM, de 15 mM a 25 mM, de 19 mM a 21 mM ou cerca de 20 mM Tris pH 7,5. O Tampão A pode compreender de 80 mM a 120 mM, de 90 mM a 110 mM ou cerca de 100 mM de NaCl. O Tampão A pode compreender de 0,5 mM a 1,5 mM, de 0,75 mM a 1,25 mM, de 0,9 mM a 1,1 mM ou cerca de 1 mM de CaCl2. O Tampão B pode compreender de 150 mM a 250 mM, de 175 mM a 225 mM, de 190 mM a 210 mM ou cerca de 200 mM de fosfato de sódio pH 7,0. O Tampão B pode compreender de 50 mM a 150 mM, de 75 mM a 125 mM, de 90 mM a 110 mM ou cerca de 100 mM de NaCl. O Tampão B pode compreender de 0,5 mM a 1,5 mM, de 0,75 mM a 1,25 mM, de 0,9 mM a 1,1 mM ou cerca de 1 mM de CaCl2.
[0125] Para a cromatografia com hidroxiapatita da SEQ ID NO: 15, o Tampão A pode compreender 20 mM de Tris pH 7,5, 100 mM de NaCl, e 1 mM de CaCl2 e o Tampão B pode compreender 200 mM de fosfato de sódio pH 7,0, 100 mM de NaCl, e 1 mM de CaCl2 (TABELA 6). Para a cromatografia com hidroxiapatita da SEQ ID NO: 17, o Tampão A pode compreender 20 mM de Tris pH 7,5, 100 mM de NaCl, e 1 mM de CaCl2 e o Tampão B pode compreender 200 mM de fosfato de sódio pH 7,0, 100 mM de NaCl, e 1 mM de CaCl2. Para a cromatografia com hidroxiapatita da SEQ ID NO: 14, o Tampão A pode compreender 20 mM de Tris pH 7,5, 100 mM de NaCl e 1 mM de CaCl2 e o Tampão B pode compreender 200 mM de fosfato de sódio pH 7,0, 100 mM de NaCl e 1 mM de CaCl2 (TABELA 7).
[0126] A pureza da proteína solubilizada após o uso da resina de troca catiônica ou resina de hidroxiapatita pode ser de 99% a 100%. A pureza da proteína solubilizada após o uso da resina de hidroxiapatita pode ser de pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%. A recuperação da proteína solubilizada após o uso da resina de hidroxiapatita pode ser de 85% a 100%, de 96% a 99% ou de 97% a 98%. A resina de hidroxiapatita pode ser a CaPure.
[0127] As frações coletadas durante a cromatografia em coluna que contêm o composto purificado (por exemplo, proteína de fusão) podem ser concentradas e formuladas para administração pela utilização de troca tampão ou diafiltração. Por exemplo, as frações coletadas durante a CaPure podem ser concentradas e formuladas pela utilizado de um sistema TFF (por exemplo, Pall Corporation) para concentrar a proteína. A proteína pode ser concentrada para uma concentração final de 20 mg/mL após 5 vezes troca de tampão. O processo de filtração pode ser realizado pela utilização de ultrafiltração/diafiltração (UF/DF) e filtros com um MWCO Millipore Pellican3 de 10 kDa, cassetes de folha plana de 0,114 m2 de TFF. O MWCO do sistema de filtração pode ser variado dependendo da proteína (por exemplo, peso molecular) a ser purificada. O tampão de diafiltração pode consistir em 10-20 mM de fosfato de sódio a cerca de pH 7,0, 50-100 mM de NaCl. As SEQ ID NOS: 14-21 formuladas podem ser subsequentemente filtradas pela utilizado de um sistema de filtração em fluxo empregando um filtro AkroPac de 0,8/0,2 um e uma tubulação de bomba peristáltica a Cole-Parmer. A proteína purificada e formulada pode ser armazenada em alíquotas a -80C até o uso posterior.
[0128] Em realizações específicas, as proteínas analisadas por SEC-HPLC podem apresentar pureza acima de 97% (tipicamente > 98%) pela utilização da coluna TSKgel GW3000SWXL, 5 µm, 7,8 mm ID x 30,0 cm L (Tosoh Bioscience, 8541). Análise de Proteína
[0129] Amostras de diferentes frações podem ser analisadas por SDS-PAGE pela utilização do sistema de formação de imagem Bio-Rad ChemiDoc MP e as frações coletadas durante a cromatografia em coluna podem ser analisadas para o teor de proteína pela utilização do Thermo Fisher Nanodrop One. As técnicas gerais para a detecção ou análise de proteína incluem eletroforese em gel, microscopia de fluorescência, eletroforese por capilaridade, espectrometria de massa, ensaio de troca de mobilidade eletroforética ou ressonância magnética nuclear. Métodos de Tratamento
[0130] Em várias realizações da presente descrição, são providas composições farmacêuticas compreendendo as moléculas de fusão da descrição para uso no tratamento e/ou prevenção de doença inflamatórias. Estas composições farmacêuticas podem ser formuladas para administração oral. “Doenças inflamatórias” podem incluir todas as doenças associadas com inflamação aguda ou crônica. A inflamação aguda é a resposta inicial do corpo a estímulos prejudiciais e resulta de um movimento aumentado do plasma e leucócitos (tais como, por exemplo, granulócitos) do sangue para o tecido lesionado. Um número de eventos bioquímicos propaga e amadurece a resposta inflamatório, envolvendo o sistema vascular local, o sistema imune e várias células no tecido lesionado. Uma inflamação prolongada é referida como inflamação crônica, que leva a uma troca progressiva no tipo de células presentes no local da inflamação e é caracterizada pela destruição simultânea e cura do tecido a partir do processo inflamatório. As doenças inflamatórias podem ser causadas, por exemplo, por queimaduras, produtos químicos irritantes, queimadura por frio, toxinas, infecções por patógenos, lesão física, reações imunológicas devidas à hipersensibilidade, radiação ionizante ou corpos estranhos, tais como, por exemplo, estilhaços, sujeira e detritos. Em algumas realizações, a doença inflamatória é uma lesão de célula epitelial, hepatite, obesidade, doença do fígado gorduroso, inflamação do fígado, pancreatite, doença de Crohn, doença de Crohn fistulizante, colite ulcerativa, colite ulcerativa de branda a moderada, colite ulcerativa de moderada a severa, bolsite, proctite, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, doença do enxerto versus hospedeiro, artrite reumatoide ou psoríase.
[0131] São descritos adicionalmente aqui métodos para o tratamento de uma doença ou condição em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo da proteína de fusão de ocorrência não natural. Em algumas realizações, a doença ou condição é lesão de célula epitelial, hepatite, obesidade, doença do fígado gorduroso, inflamação do fígado, pancreatite, doença de Crohn, doença de Crohn fistulizante, colite ulcerativa, colite ulcerativa de branda a moderada, colite ulcerativa de moderada a severa, bolsite, proctite, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, doença do enxerto versus hospedeiro, artrite reumatoide ou psoríase. A proteína de fusão de ocorrência não natural pode ser administrada por via oral ao indivíduo. O indivíduo pode ser humano.
EXEMPLOS
[0132] Estes exemplos são providos com propósitos ilustrativos apenas e não para limitar o escopo das reivindicações providas em anexo. EXEMPLO 1 Expressão de um Construto de Liberação
[0133] Neste exemplo, é genericamente descrita a preparação de um construto de liberação como uma sequência de aminoácidos única compreendendo uma sequência de veículo derivada de Cholix, uma sequência espaçadora e uma carga útil terapêutica.
[0134] Primeiro, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um construto de liberação da SEQ ID NO: 15 foi amplificada por PCR, incorporando pares de enzimas de restrição dos sítios NdeI e EcoRI, PstI e PstI, AgeI e EcoRI ou PstI e EcoRI em duas extremidades dos produtos de PCR s. Após a digestão com enzima de restrição, os produtos de PCR foram clonados em um plasmídeo apropriado para expressão celular, o qual foi digerido com os correspondentes pares de enzima de restrição. O plasmídeo codificou um construto de liberação compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15.
[0135] O construto de liberação foi expresso como se segue: células competentes de E. coli BL21(DE3) pLysS (Novagen, Madison, Wis.) foram transformadas pela utilização de um método de choque térmico padrão na presença do plasmídeo apropriado de maneira a gerar células expressando o construto de liberação, selecionadas em meio contendo ampicilina e isoladas e crescidas em caldo de Luria-Bertani (Difco; Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.) com antibiótico, então induzidas para a expressão da proteína pela adição de 1 mM de isopropil- D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) a OD de 0,6. Duas horas após a indução com IPTG, as células foram colhidas por centrifugação a 5,000 rpm por 10 min. Os corpos de inclusão foram isolados após a lise celular e lavados duas vezes a uma proporção de 1 g/10 mL. O pélete da lise celular foi ressuspendido com água seguindo-se uma hora de centrifugação a 10000 rpm a 4oC. Esta lavagem foi então repetida uma vez. As IBs (DWIB) duplamente lavadas foram solubilizadas em um tampão contendo 50 mM de Tris-HCl (pH 8,2), 6 M de guanidina HCl e 10 mM de ditiotreitol (DTT). O material solubilizado foi então diluído em um tampão de redobramento contendo 0,1 M de Tris (pH = 8,5 a 4oC), 1,0 M de L- arginina, 10% de glicerol, 3 mM de L-cisteína, 1 mM de cistamina-2HCl. A proteína redobrada com SEQ ID NO: 15 foi purificada por cromatografia de troca aniônica (Q sefarose de Troca Iônica) e cromatografia em gel de filtração
Superdex 200 (Amersham Biosciences, Inc., Suécia). A pureza da proteína foi determinada por SDS-PAGE e HPLC analítica (Agilent, Inc. Palo Alto, Calif.).
[0136] O construto de liberação foi avaliado para se verificar o dobramento apropriado no que diz respeito a seu tamanho molecular antecipado. Após a indução, a proteína expressa foi coletada a partir dos corpos de inclusão. Pela utilização dos corpos de inclusão, a extensão da expressão do construto de liberação foi verificada por eletroforese em gel e o peso molecular aparente foi comparado com a massa calculada.
[0137] Os resultados demonstraram uma produção estável e eficiente de um construto de liberação funcional com altos rendimento e pureza. EXEMPLO 2 Modelo In vitro para a Avaliação do Transporte de Carga Útil através de Monocamada de Células Epiteliais
[0138] Este exemplo demonstra um modelo in vitro projetado para avaliar o transporte de cargas úteis ou construtos de liberação descritos aqui.
[0139] A FIG. 1 mostra esquematicamente uma configuração compreendendo uma câmara apical acima da monocamada de célula epitelial e uma câmara basal abaixo de tal monocamada de célula epitelial.
[0140] Para a permeabilidade apical para basolateral, artigos de teste (por exemplo, construto de liberação, carga útil etc.) foram adicionados ao lado apical (A) e a quantidade de permeação foi determinada no lado basolateral (B). Para a permeabilidade basolateral para apical, artigos de teste foram adicionados ao lado basolateral (B) e a quantidade de permeação foi determinada no lado apical (A).
[0141] Os dados podem ser expressos como permeabilidade (Papp) de acordo com a seguinte equação: Papp = (dQ/dt)/ (C0*A). Q/dt é uma taxa de permeação, C0 é a concentração inicial do artigo de teste e A é a área da monocamada. Uma proporção de transporte por efluxo (Re) pode ser calculada de acordo com a seguinte equação: (Re) = Papp(B-A)/Papp(A-B). Re >2 pode indicar um substrato potencial para P-gp ou outros transportadores por efluxo.
[0142] Células SMI-100 ou Caco-2 podem ser utilizadas para se avaliar a função de transcitose de um veículo ou construto de liberação in vitro.
[0143] Para células Caco-2, um ensaio ELISA foi realizado para a avaliação da habilidade de um veículo ou construto de liberação em se deslocar através de monocamadas de célula Caco-2 por meio de transcitose. As células Caco-2 (ATCC HTB-37™) foram mantidas em 5% de CO2 a 37°C em meio completo: meio de Eagle modificado F12 da Dulbecco (DMEM F12) suplementado com 10% de soro bovino fetal, 2,5 mM de glutamina, 100 U de penicilina/ml e 100 μg de estreptomicina/ml (Gibco BRL, Grand Island, N.Y.). As células foram alimentadas a cada 2 a 3 dias com este meio (designado como meio completo) e repicadas a cada 5 a 7 dias. Para os ensaios, as células foram semeadas em placas de 24 ou 96 poços e crescidas à confluência.
[0144] As células Caco-2 foram crescidas como monocamadas confluentes em suportes de membrana Transwell de policarbonato com tamanho de poro de 0,4 m revestidos com colágeno (Corning-Costar, Cambridge, MA) e utilizadas 18- 25 dias após atingirem uma resistência elétrica transepitelial (TER) de > 250 Ω·cm2 tal como medida pela utilização de um voltímetro de haste Millicell-ERS® (Millipore). O transporte apical para basolateral (A→B) de um veículo ou construto de liberação através destas monocamadas foi determinado pela medição da quantidade de proteína transportada em certos pontos no tempo (por exemplo, 15, 30 e 45 minutos) após 4,7 nM, 23,6 nM e 236 nM de aplicação apical do construto de liberação a 37°C. As medições de TER e a extensão da dextrana fluorescente de 10 kDa (medida pela utilização de um protocolo de HPLC por exclusão de tamanho) foram utilizadas para verificar as propriedades da barreira monocamada durante o curso do estudo. A extensão do transporte do construto de liberação (por exemplo, SEQ ID NO: 15) foi determinada por titulação do meio coletado no ensaio de citotoxicidade baseado em célula. O construto de liberação transportado foi medido pelo ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)
utilizando-se anticorpos (por exemplo, anticorpo anti-veículo ou anti-carga útil, tal como um anticorpo anti-IL-22) para a captura e detecção.
[0145] As monocamadas confluentes de tecidos intestinais humanos (SMI-100, MatTek Corporation; Ashland, MA, USA) estabelecidas em inserções de cultura celular foram deixadas estabilizar por 24 h a 37oC antes do uso. Apenas as inserções apresentando uma resistência elétrica transepitelial (TEER) de > 400 Ω • cm2 foram consideradas como apresentando integridade suficiente de monocamada para uso nos estudos. Uma verificação secundária da integridade da monocamada foi realizada pela avaliação da supressão de transporte de dextrana de 70 kD. As câmaras foram lavadas uma vez com tampão de transporte (PBS). Moléculas de teste, preparadas a uma concentração de 20 µg/mL, foram aplicadas à superfície apical das inserções em volumes de 100 µL. Os volumes basolaterais de 500 µL de PBS foram substituídos em cada ponto no tempo para estudos de transporte. Cada condição experimental foi realizada em triplicata. EXEMPLO 3 Transporte mediado por Veículo de IL-22 através de Células Epiteliais Intestinais Polarizadas
[0146] Este exemplo demonstra que um veículo (SEQ ID NO: 7) pode transportar uma carga útil de IL-22 (SEQ ID NO: 11) através de células epiteliais intestinais polarizadas in vitro. Este exemplo demonstra adicionalmente que o veículo com SEQ ID NO: 7 pode transportar carga útil de IL-22 biologicamente ativa através de células epiteliais intestinais polarizadas e para a lamina propria in vivo.
[0147] O transporte do construto de liberação (SEQ ID NO: 15) através de monocamadas de célula Caco-2 e tecido epitelial de intestino delgado (também chamadas aqui de SMI-100) foi testado pela aplicação do construto de liberação à membrana apical das células epiteliais, de acordo com o EXEMPLO 2 e como ilustrado na FIG. 1 para o transporte apical (A) para basal (B). Os experimentos foram conduzidos em duplicata e amostras da câmara basolateral foram coletadas a 15, 30, e 45 minutos após a aplicação apical de maneira a se determinar a quantidade de proteína transportada. A quantidade de proteína que sofreu transcitose foi medida pela utilização de ensaios ELISA como descrito no EXEMPLO 2.
[0148] Os dados nas FIG. 2 e FIG. 3 mostram que um veículo (SEQ ID NO: 7) quando acoplado a IL-22 (SEQ ID NO: 11) resultou no transporte da carga útil de IL-22 através tanto de monocamadas de Caco-2 (FIG. 2) quanto de SMI-100 (FIG. 3) de maneira dependente de tempo e que o construto de liberação resultou em cerca de 2-3 vezes mais IL-22 cruzando as células epiteliais em comparação com uma IL-22 (SEQ ID NO: 12, M+ IL-2234-179) sozinha que não foi acoplada a um veículo.
[0149] Para experimentos in vivo, a transcitose foi testada pela utilização de ratos Wistar machos. Os ratos Wistar machos foram alojados 3-5 por gaiola com um ciclo claro/escuro de 12/12 h e pesavam cerca de 225-275 g (aproximadamente 6-8 semanas de idade) quando colocados no estudo. Os experimentos foram conduzidos durante a fase de luz pela utilização de um protocolo de não recuperação que utiliza anestesia contínua com isoflurano. Uma incisão de 4-5 cm na linha média abdominal que expôs as regiões do jejuno médio foi realizada. Soluções estoque a 3,86×10-5 M do construto de liberação (SEQ ID NO: 15) foram preparadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS), com 50 µL (por 250 g de rato) sendo administrados por injeção intraluminal (ILI) pela utilização de uma agulha de calibre 29. O mesentério do local da injeção foi então marcado com um marcador permanente. Ao término do estudo, uma região de 3- 5 mm que capturou o segmento de intestino marcado foi isolada e processada para avaliação microscópica.
[0150] Os resultados da atividade de transcitose do construto de liberação (SEQ ID NO: 15) são mostrados na FIG. 4, demonstrando que quantidades significativas de carga útil de IL-22 (SEQ ID NO: 11) atravessaram um epitélio intestinal polarizado e intacto in vivo quando provida como parte de um construto de liberação que inclui um veículo derivado de Cholix (SEQ ID NO: 7) acoplado a IL-22. Esta imagem de microscopia mostra o transporte da carga útil de IL-22
(SEQ ID NO: 11) do local apical do epitélio intestinal (destacado pelas setas brancas #1) para o local basal das células epiteliais (destacadas pela seta branca #2) e para a lamina propria (abreviada como “l.p.”) após a aplicação luminal do construto de liberação de SEQ ID NO: 15 para o jejuno de ratos Wistar. A imagem mostra ainda que a IL-22 interagiu e se ligou em uma extensão significativa a receptores de IL-22 localizados em células dentro da lamina propria e na membrana basal externa do epitélio polarizado (destacado por setas brancas #3). A localização de IL-22 é indicada pelas setas brancas #2 e #3. EXEMPLO 4 IL-22 Recombinante Humana se liga a Receptores de IL-22 de Murino
[0151] Este exemplo demonstra que IL-22 recombinante humana (rhIL-22, SEQ ID NO: 12) se liga a receptores de IL-22 de murino em uma maneira dependente de dose comparável a IL-22 recombinante de murino (rmIL-22).
[0152] A FIG. 5A demonstra a fosforilação de STAT3 em células FL83 B de murino como função da concentração de agonista (em pM), onde o agonista é rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) ou rmIL-22. Os dados mostram que rhIL-22 e rmIL- 22 induziram a fosforilação de STAT3 em uma maneira dependente de concentração, demonstrando que a proteína IL-22 humana pode ligar e induzir transdução de sinal por meio de receptores de IL-22 de camundongo tão efetivamente quanto a IL-22 de camundongo.
[0153] A FIG. 5B demonstra que rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) e rmIL-22 também induziram a fosforilação de STAT3 em células Hepa1-6 de murino.
[0154] A FIG. 6A demonstra que rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) e rmIL-22 induziram a fosforilação de STAT5 em células FL83 B de murino em uma maneira dependente de dose, demonstrando que a proteína IL-22 humana pode ligar e induzir a transdução de sinal por meio de receptores de IL-22 de camundongo com eficácia comparável à IL-22 de camundongo.
[0155] A FIG. 6B demonstra que rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) e rmIL-22 também induziram a fosforilação de STAT5 em células Hepa1-6 de murino, no entanto uma variação de dose será necessária em experimentos de acompanhamento.
[0156] Estes dados provêm uma forte evidência de que rhIL-22 (por exemplo, tal como utilizada nos construtos de liberação com SEQ ID NOs: 10 ou 11) é capaz de ativar STAT3 e STAT5 em células de murino, provendo, desta forma, uma razão para a utilização de tais construtos de liberação em modelos de murino de maneira a se avaliar a atividade e função de IL-22. EXEMPLO 5 Eficácia In vivo dos Construto de Liberação com SEQ ID NO: 15 no Modelo de Colite
[0157] Este exemplo demonstra a eficácia in vivo do construto de liberação com SEQ ID NO: 15 compreendendo o veículo derivado de Cholix da SEQ ID NO: 7 acoplado a uma IL-22 com SEQ ID NO: 11 por meio de um ligante com SEQ ID NO: 13 em comparação com IL-22 separadamente (SEQ ID NO: 12) em um modelo de camundongo com dextrana sulfato de sódio (DSS).
[0158] A FIG. 7A mostra uma visão global de um desenho de estudo in vivo e linha no tempo para comparar a administração perioral (p.o.) do construto de liberação de SEQ ID NO: 15 em níveis de dosagem de duas doses uma vez ao dia, 1 mg/kg e 30 mg/kg e uma administração diária (intraperitoneal (i.p.)) de rhIL--22 a 4 mg/kg. O estudo in vivo foi realizado em camundongos fêmeas C57BL/6 com semanas de idade alimentadas normalmente, ~23 g. a colite foi quimicamente induzida com 2,5% de dextrana sulfato de sódio (DSS) na água de beber, ad libitum. Os pontos finais do estudo incluíram a alteração percentual no peso corporal, índice de atividade da doença, comprimento do cólon e histopatologia.
[0159] A FIG. 7B mostra as características dos grupos experimentais e de controle utilizados no estudo descrito na FIG. 7A.
[0160] A FIG. 8A mostra a alteração percentual (%) no peso corporal dos animais no dia 10 do estudo em relação ao dia 0 dos vários grupos experimentais e de controle. A linha de base (dia 0 vs. 10) a alteração de peso corporal por rhIL- 22 com SEQ ID NO: 12 ou pelo construto de liberação com SEQ ID NO: 15 em relação ao veículo não foi significativa tal como determinada por ANOVA 1-way. O CsA de modelo de controle positivo (ciclosporina) foi significativamente diferente em relação ao veículo tal como determinado por um ANOVA 1-way.
[0161] A FIG. 8B mostra a alteração em peso corporal dos animais experimentais e de controle nos primeiros 10 dias de estudo. No grupo de CsA o peso corporal médio no período de estudo foi significativamente aumentado em relação ao veículo de controle do dia 6 ao dia 10 tal como determinado por ANOVA 2-way (*, **, ***), o peso corporal com rhIL-22 (i.p.) foi significativamente aumentado em relação ao veículo de controle no dia 10 tal como determinado por ANOVA 2-way (*), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.
[0162] A FIG. 9 mostra os resultados de experimentos de ELISA em plasma para se determinar os níveis de IL-22 no plasma. Os resultados mostram que as concentrações de rhIL-22 no plasma tenderam na direção de níveis aumentados no plasma após gavagem oral de ambas as doses de 1 e 30 mg/kg do construto de liberação om SEQ ID NO: 15 em uma maneira dependente de dose (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. ****p < 0,0001; Média + SEM; n = 2 Naïve, 5 Veículo, 5 CsA, 10 outros).
[0163] Estes dados mostram que o construto de liberação com SEQ ID NO: 15 induziu uma tendência dependente de dose na direção de aumento de peso corporal após a administração via gavagem oral. A IL-22 foi medida em níveis decrescentes no plasma após gavagem oral em ambas as doses de 1 e 30 mg/kg do construto de liberação com SEQ ID NO: 15 em uma maneira dependente de dose. Estes dados sugerem que o construto de liberação administrado por via oral com a SEQ ID NO: 15 é capaz de reduzir os sintomas de colite em um modelo de camundongo DSS comparável com rhIL-22 administrada i.p..
[0164] Em adição, biomarcadores para construto de liberação administrável oralmente com SEQ ID NO: 15 foram avaliados pela administração de rhIL-22 a camundongos CD-1 tal como descrito abaixo.
[0165] A FIG. 10A mostra uma visão global de um estudo de dose única in vivo desenhado para identificar biomarcador(es) de acoplamento a alvo após dose única (dosagem aguda) de rhIL-22 em camundongos CD-1 saudáveis.
[0166] A FIG. 10B mostra uma visão global de um estudo de dose múltipla (dosagem sub-crônica) in vivo desenhado para identificar biomarcador(es) de acoplamento a alvo após doses única e múltipla de rhIL-22 em camundongos CD- 1 saudáveis.
[0167] A FIG. 11A mostra que a administração aguda e sub-crônica de rhIL-22 aumenta consistentemente a concentração de IL-22.
[0168] A FIG. 11B mostra alguns parâmetros farmacocinéticos durante os experimentos de dosagem aguda e sub-crônica descritos na FIG. 11A.
[0169] A FIG. 12A mostra a concentração de proteína reativa C de murino (mCRP) em circulação induzida em resposta a 1 dia após a dosagem aguda de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) e após 5 dias da dosagem sub-crônica de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12). Os resultados mostram um aumento dependente de tempo na mCRP em circulação em ambos os grupos de estudo.
[0170] A FIG. 12B mostra a alteração em vezes da concentração no plasma de mCRP 1 dia após dosagem aguda de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
[0171]
[0172] A FIG. 12C mostra a alteração em vezes da concentração no plasma de mCRP após 5 dias da dosagem sub-crônica de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
[0173] A FIG. 13A mostra a concentração da proteína amiloide A de murino (mSAA) em circulação induzida em resposta a 1 dia após a dosagem aguda de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) e após 5 dias da dosagem sub-crônica de rhIL-22 (SEQ
ID NO: 12). Os resultados mostram um aumento dependente de tempo na mSAA em circulação em ambos os grupos de estudo, com concentrações aproximadas de pico no plasma cerca de 8 horas após a administração.
[0174] A FIG. 13B mostra a alteração em vezes da concentração no plasma de mSAA 1 dia após a dosagem aguda de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
[0175] A FIG. 13C mostra a alteração em vezes da concentração no plasma de mSAA após 5 dias da dosagem sub-crônica de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
[0176] A FIG. 14A mostra a proteína derivada de ilhota de regeneração 3𝛽 (Reg3𝛽) em circulação induzida em resposta a 1 dia após dosagem a aguda de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) e após 5 dias da dosagem sub-crônica de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
[0177] A FIG. 14B mostra a alteração em vezes da concentração no plasma de Reg3𝛽 1 dia após a dosagem aguda de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
[0178] A FIG. 14C mostra a alteração em vezes da concentração no plasma de Reg3𝛽 após 5 dias da dosagem sub-crônica de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
[0179] Estes resultados demonstram que três biomarcadores de IL-22 são potenciais de acoplamento a alvo de PD: proteína reativa C (CRP), proteína amiloide A de soro (SAA) e proteína derivada de ilhota de regeneração 3𝛽 (Reg3𝛽) que podem ser utilizadas em estudos de farmacodinâmica (PD) dos construtos de liberação tais como os com as SEQ ID NOs: 15 ou 17. EXEMPLO 6 Solubilização de Proteína
[0180] Foram ressuspendidos 627 g de corpos de inclusão duplamente lavados (DWIB) de SEQ ID NO: 15 de fermentação em 4500 mL de Guanidina/HCl 8 M (Gu-HCl) e 50 mM de Tris pH a 8,0. Subsequentemente, 50 mM de Tris pH 8,5 foram adicionados para completar o volume para 6,0 L. A solução foi posta sob agitação gentilmente em uma placa de agitação e foram adicionados 9,225 g do agente redutor ditiotreitol (DTT). A solução final de proteína solubilizada (SEQ ID NO: 15) de 6 L consistia em 6 M de Gu-HCl, 50 mM de Tris pH 8,0, 10 mM de DTT e ~1 g de DWIB/10mL de tampão. A solução de proteína solubilizada
(SEQ ID NO: 15) foi incubada à temperatura ambiente (TA) enquanto sob agitação em uma placa de agitação magnética e então centrifugada a 15970 × g por 90 minutos a 4 ºC. O sobrenadante compreendendo a proteína solubilizada foi cuidadosamente transferida para um novo vaso com um volume total de 5520 mL. A determinação da concentração de proteína foi realizada pelo ensaio de Bradford e foi determinada a 15 mg/mL.
[0181] Os dados demonstram que a solubilização da proteína pode ser realizada pela utilização do procedimento acima. EXEMPLO 7 Redobramento da Proteína
[0182] Este exemplo demonstra o redobramento da proteína como parte do processo de purificação tal como descrito no fluxograma da FIG. 17.
[0183] Uma solução de redobramento foi cuidadosamente pesquisada, desenvolvida e otimizada (FIG. 18). O processo de otimização utilizou um desenho de experimentos (DOE) de 15 matrizes diferentes, 12 variáveis e 200 reações de redobramento. As decisões foram tomadas por um processo de eliminação. A mistura de redobramento inicial (contendo a solução de redobramento inicial e proteína redobrada solubilizada (SEQ ID NO: 15)) é apresentada na TABELA 2. Uma mistura de redobramento otimizada (contendo a solução de redobramento otimizada e a proteína solubilizada redobrada (SEQ ID NO: 15)) é apresentada na TABELA 3. TABELA 2 – Mistura de redobramento inicial 100 mM de Tris pH 8,5 (@ 4°C) 0,5 M arginina 1 M ureia 2 mM de EDTA 0,3 mM de GSH 1 mM de GSSG concentração de redobramento 0,2 mg/mL
TABELA 3 – Mistura de redobramento otimizada 100 mM de Tris pH 8,5 (@ 4°C) 1,0 M de arginina 10% de glicerol 3 mM de L-cisteína 1 mM de cistamina-2HCl concentração de redobramento > 0,1 mg/mL
[0184] Os 105 L de solução de redobramento foram incubados a 4 ºC por 16 horas e então filtrados através de um filtro de fluxo (AkroPac da Pall Corporation ou Sartopore 2XLG da Sartorius) utilizando-se uma membrana de 0,8/0,2 um e tubulação de bomba peristáltica Cole-Parmer.
[0185] A proteína solubilizada (SEQ ID NO: 15) (105 g) do EXEMPLO 6 foi adicionada a 100 L de uma solução de redobramento otimizada previamente resfriada para 4 ºC.
[0186] Este processo foi programado para uma hora pela utilização de uma bomba peristáltica Cole-Parmer a 73 ml/min. Este processo ocorreu em um ambiente frio a 4C.
[0187] A solução tampão de redobramento otimizada produziu uma grande quantidade da SEQ ID NO: 15 em relação aos agregados de SEQ ID NO: 15 (FIGS. 19-20). O uso da solução de redobramento inicial produziu cerca de 10%- 15% de SEQ ID NO: 15 corretamente redobrada. O uso da solução de redobramento otimizada produziu cerca de 45%-55% de SEQ ID NO: 15 corretamente redobrada. EXEMPLO 8 Concentração de Proteína e Troca de Tampão por TFF UF/DF
[0188] Este exemplo mostra a concentração de proteína e troca de tampão pela utilização de filtração de fluxo tangencial (TFF) com base nos princípios de ultrafiltração/diafiltração (UF/DF).
[0189] A proteína redobrada (por exemplo, da SEQ ID NO: 15) foi processada pelo sistema TFF (Millipore) para a concentrar em 10 vezes e a troca de tampão em 5 vezes. O processo foi realizado por ultrafiltração/diafiltração (UF/DF) utilizando-se quatro MWCO Millipore Ultracell Pellican3 de 10 kDa, cassetes de folha plana de TFF de 1,14 m2. O tampão de diafiltração consistiu em 20 mM de Tris-base pH 7,5 e 100 mM de NaCl. O volume final no término do processo de UF/DF foi de 10 L. Este material foi subsequentemente filtrado pela utilização de um sistema de filtração em fluxo empregando um filtro AkroPac 0,8/0,2 um da Pall Corporation e tubulação de bomba peristáltica Cole-Parmer. O ensaio de Bradford foi realizado para determinar a concentração, rendimento e quantidade de recuperação de proteína. Neste ponto, uma SEC-HPLC quantitativa foi realizada para se determinar a quantidade da proteína apropriadamente dobrada com SEQ ID NO: 15 presente nas amostras redobradas em de UF/DF. Um BSA comercialmente disponível de concentração conhecida foi utilizado como um padrão de referência do qual foi gerada a curva padrão para o ensaio de Bradford. O sistema Agilent 1100 HPLC e a coluna TSKgel SuperSW3000, 4 µm, 4,6 mm ID x 30,0 cm L (Tosoh Bioscience, 18675) foram utilizados. Com base neste ensaio quantitativo, a eficiência de redobramento foi determinada.
[0190] Os dados mostram que o redobramento da proteína pode ser realizado pela utilização de troca de tampão e TFF UF/DF. EXEMPLO 9 Cromatografia de Proteína utilizando-se a Etapa de Captura com Resina NH2-750F
[0191] Este exemplo mostra as etapas de captura em cromatografia de troca aniônica de proteína utilizando-se a resina NH2-750F.
[0192] Os sistemas AKTA Avant 150 ou AKTA Pilot FPLC da General Electric (GE) foram utilizados para a cromatografia de proteína. A resina de troca aniônica NH2-750F Tosoh foi utilizada para empacotar uma coluna com uma altura de leito mínima de pelo menos 20 cm e garantindo um volume de coluna que facilitasse uma capacidade de ligação dinâmica de 20-25 g/L. Um tampão de
20 mM de acetato de sódio, pH 4,5 ou 20 mM de citrato de sódio, pH 4,5 foi utilizado para empacotar a coluna. Os tampões utilizados eram como se segue: tampão A: 20 mM de Tris pH 7,5, 0,5 M de NaCl; tampão B: 20 mM de Tris pH 7,5, 2,0 M de NaCl. A coluna de NH2-750F foi então limpa com uma solução 0,5 M de NaOH com um tempo de contato de 30 minutos e então equilibrada com tampão A pôr pelo menos 3 volumes de coluna (CV) ou até o pH e a condutividade alcançassem linhas estáveis nos valores esperados (pH 7,5-pH 7,7, ~49 mS/cm +/- 1 mS/cm).
[0193] Antes da carga na coluna, a solução de proteína de UF/DF (SEQ ID NO: 15) foi suplementada com 0,4 M de NaCl pela adição de uma solução estoque de 5 M e a condutividade foi medida para garantir uma condutividade de 49 mS/cm +/- 2 mS/cm. A solução de proteína (SEQ ID NO: 15) foi carregada na coluna com uma taxa de fluxo de um mínimo de 5 minutos de tempo de residência na coluna e o fluxo que atravessa foi coletado. A coluna foi lavada com 3 CV do tampão A ou até que a absorbância a 280 nm retornasse e fosse estável na linha de base, próxima a 0,0 mAU a 280 nm. Neste ponto foi realizado um gradiente linear de 20 CV de 0,0-62, 5% de B, seguido de um gradiente em etapas para 100% de B para mais 5 CV. As frações foram coletadas completamente e seus volumes não eram acima de 0,5 do volume da coluna. As amostras de frações diferentes foram analisadas por SDS-PAGE pela utilização do sistema de formação de imagem Bio-Rad ChemiDoc MP e as frações contendo acima de 90% da SEQ ID NO: 15 foram reunidas e designadas como NH2-750F-pool. A concentração de proteína no NH2-750F-pool foi medida pela utilização de Thermo Fisher Nanodrop One, pela leitura da absorbância a 280 nm (A280) considerando um coeficiente de extinção de 1,22 para a SEQ ID NO: 15 e uma proporção de 260/280 nm < 0,6. O NH2-750F-pool contém aproximadamente 1,0 M de NaCl.
[0194] Um cromatograma de exemplo após a purificação com NH2-750F da SEQ ID NO: 15 é mostrado na FIG. 21A para uma altura de leito de 20 cm e um volume de coluna de 10 mL e na FIG. 21B para uma altura de leito de 30 cm e um volume de coluna de 4,6 L.
[0195] Um resumo da purificação com NH2-750F é mostrado na TABELA 4 para a SEQ ID NO: 15 e na TABELA 5 para a SEQ ID NO: 14, que foi genericamente produzida, redobrada e purificada de maneira análoga à SEQ ID NO: 15. TABELA 4 – Resumo da purificação com NH2-750F da SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 15 20 mM de Tris pH 7,5, 0,5 M Tampão A de NaCl 20 mM de Tris pH 7,5, 2,0 M Tampão B de NaCl Altura de leito Mínimo de 20 cm Tempo de residência 5,0 minutos Gradiente 0,0 - 62,5%B, 20 CV Capacidade de ligação 20-25 g/L (Quebra a 40 g/L) Pureza 93-96% Recuperação 71-76% Endotoxina < 1,0 EU/mg TABELA 5 – Resumo da purificação com NH2-750F da SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 14 20 mM de Tris pH 7,5, 0,7 M de NaCl, 10% Tampão A de glicerol 20 mM de Tris pH 7,5, 2,0 M de NaCl, 10% Tampão B de glicerol Altura de leito Mínimo de 20 cm
Tempo de residência 5,0 minutos Gradiente 0,0 - 62,5%B, 20 CV Capacidade de ligação 20-25 g/L Pureza ≥93-96% Recuperação 80-93% Endotoxina < 1,0 EU/mg EXEMPLO 10 Cromatografia de Proteína utilizando-se o Procedimento de CaPure
[0196] Este exemplo mostra uma etapa de purificação por polimento em cromatografia de proteína pela utilização do procedimento de CaPure.
[0197] Os sistemas AKTA Avant 150 ou AKTA Pilot FPLC da General Electric (GE) foram utilizados para a cromatografia de proteína para proteínas das SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 14. A resina CaPure no modo misto de Tosoh hidroxiapatita foi utilizada para empacotar uma coluna para cada uma das SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 14 com uma altura de leito mínima de pelo menos 10 cm e garantia de um volume de coluna que facilitasse uma capacidade de ligação dinâmica de no máximo 20 g/L. Os tampões utilizados foram como se segue para a SEQ ID NO: 15: tampão A: 20 mM de Tris pH 7,5, 100 mM de NaCl e 1 mM de CaCl2; tampão B: 200 mM de fosfato de sódio pH 7,0, 100 mM de NaCl e 1 mM de CaCl2. Os tampões utilizados foram como se segue para a SEQ ID NO: 14: tampão A: 20 mM de Tris pH 7,5, 100 mM de NaCl e 1 mM de CaCl2; tampão B: 200 mM de fosfato de sódio pH 7,0, 100 mM de NaCl e 1 mM de CaCl2. Cada coluna com CaPure foi então limpa com 0,5 M de NaOH com tempo de contato de 30 minutos ou mais e então equilibrada com tampão A pôr pelo menos 3 volumes de coluna (CV) ou até que o pH e a condutividade alcançassem linhas estáveis nos valores esperados (pH 7,5-pH 7,7, ~11 mS/cm +/- 1 mS/cm). Não houve necessidade de tratar o NH2-750F-pool antes da carga na coluna. Isto reduziu significativamente a perda de proteína, tempo e recursos. O NH2-750F pool foi carregado na coluna com uma taxa de fluxo de um mínimo de 5 minutos de tempo de residência na coluna e o fluxo que atravessa foi coletado. A coluna foi lavada com 3 CV do tampão A ou até que a absorbância a 280 nm retornasse e fosse estável na linha de base, próximo a 0,0 mAu. Neste ponto, foi realizado um gradiente linear de 25 CV de 0-25% de B, seguido de uma etapa de gradiente para 100% de B por mais 5 CV. As frações foram coletadas completamente e seus volumes variavam de 0,36 a 1,43 do volume de coluna, dependendo do perfil de eluição. As amostras de frações diferentes foram analisadas por SDS-PAGE utilizando-se o sistema de formação de imagem ChemiDoc MP e as frações contendo acima de 95% da SEQ ID NO: 15 ou da SEQ ID NO: 14 foram reunidas e designadas como CaPure-pool. A concentração de proteína do CaPure-pool foi medida pela utilização de Thermo Fisher Nanodrop One, pela leitura da absorbância a 280 nm (A280) considerando o coeficiente de extinção de 1,22 para a SEQ ID NO: 15 e uma proporção de 260/280 nm < 0,6.
[0198] Um cromatograma exemplificativo após a purificação com CaPure da SEQ ID NO: 15 é mostrado na FIG. 22A para uma altura de leito de 10 cm e volume de coluna de 5 mL e na FIG. 22B para uma altura de leito de 21 cm e um volume de coluna de 800 mL.
[0199] Um resumo da purificação com CaPure é mostrado na TABELA 6 para a SEQ ID NO: 15 e na TABELA 7 para a SEQ ID NO: 14. TABELA 6 – Resumo da purificação com CaPure da SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 15 Tampão A 20 mM de Tris pH 7,5, 100 mM de NaCl, 1 mM de CaCl2 200 mM de fosfato de sódio pH 7,0, 100 mM de NaCl, 1 Tampão B mM de CaCl2 Altura de leito 20 cm Tempo de residência 5,0 minutos
Gradiente 0,0 - 25%B, 25 CV Capacidade de ligação 20 g/L Pureza >98% Recuperação >92% Endotoxina < 1,0 EU/mg TABELA 7 – Resumo da purificação com CaPure da SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 14 Tampão A 20 mM de Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM de CaCl2 200 mM de fosfato de sódio pH 7,0, 100 mM de NaCl, 1 Tampão B mM de CaCl2 Altura de leito 20 cm Tempo de residência 5,0 minutos Gradiente 0,0 - 25%B, 25 CV Capacidade de ligação 20 g/L Pureza >98% Recuperação >92% Endotoxina < 1,0 EU/mg EXEMPLO 11 Concentração de Proteína por TFF UF/DF
[0200] Este exemplo mostra a formulação da proteína pelos procedimentos de TFF UF/DF.
[0201] O CaPure pool foi concentrado por um sistema TFF (Pall Corporation) para uma concentração final de 20 mg/mL seguida de 5 vezes troca de tampão. O processo foi realizado por ultrafiltração/diafiltração (UF/DF) utilizando-se três cassetes de folha plana de TFF MWCO Millipore Pellican3 de 10 kDa, 0,114 m2.
O tampão de diafiltração consistiu em 10 mM de fosfato de sódio, pH 7,0, 100 mM de NaCl. A SEQ ID NO: 15 formulada foi subsequentemente filtrada utilizando-se um sistema de filtração em fluxo empregando filtro AkroPac 0,8/0,2 um da Pall Corporation e tubulação de bomba peristáltica Cole-Parmer. A SEQ ID NO: 15 formulada foi então armazenada em alíquotas a -80C e as análises seguintes foram realizadas de maneira a garantir sua qualidade biofísica: (1) Concentração da proteína (por exemplo, SEQ ID NO: 15) a 20 mg/mL pela medição da absorbância a 280 nm com uma proporção de 260/280 < 0,6 pela utilização de Thermo Fisher Nanodrop One e considerando o coeficiente de extinção da proteína de 1,22; (2) Níveis de endotoxina LAL abaixo de 1,0 Eu/mg medidos por equipamento do Charles River Laboratories; (3) Pureza por SEC- HPLC acima de 97% (tipicamente > 98%) pela utilização de coluna TSKgel GW3000SWXL, 5 µm, 7,8 mm ID x 30,0 cm L (Tosoh Bioscience, 8541) (4) Análise de SDS-PAGE pela utilização de aparelho Bio-Rad Gel e seu sistema de formação de imagem ChemiDoc MP associado. EXEMPLO 12 Avaliação da Atividade In Vivo das Moléculas de Fusão Purificadas
[0202] Este exemplo mostra métodos para a verificação do dobramento apropriado das moléculas de fusão no que diz respeito à sua habilidade em portar uma carga biologicamente ativa através de um epitélio intacto.
[0203] A proteína de fusão com SEQ ID NO: 15 é expressa por E coli e coletada a partir de corpos de inclusão e dobrada pela utilização de um sistema de tampão de troca de transporte como descrito no EXEMPLO 8 acima. O material resultante é purificado de acordo com os métodos descritos no EXEMPLO 9 e no EXEMPLO 10 e tal como resumidos, por exemplo, na TABELAS 4-7, dependendo das características de peso molecular da molécula de fusão. A preparação apresenta uma pureza de proteína de ~98% com base em SDS PAGE. As células epiteliais são tratadas com a molécula de fusão apresentando a SEQ ID NO: 15 em concentrações de 25 nM e 250 nM. Em comparação com células correspondentes não tratadas, as células tratadas com a SEQ ID NO: 15 produzem uma redução dependente de dose no número de células tal como determinado por citometria de fluxo de células vivas/mortas). Os valores representam n = 4 ± desvio padrão. EXEMPLO 13 Aumento em escala da purificação de proteína de fusão
[0204] Este exemplo mostra um aumento em escala de um método de purificação utilizando a proteína de fusão da SEQ ID NO: 15 (FIGS. 7A e 7B).
[0205] A proteína de fusão com SEQ ID NO: 15 foi purificada em duas escalas diferentes.
[0206] A primeira purificação foi conduzida pela utilização de uma coluna de cromatografia com um volume de 10 mL empacotada com a resina NH2-750F e os seguintes parâmetros: Altura de leito: 20 cm, Tempo de residência: 5 min (taxa de fluxo: 2 mL/min), tampão A: 20 mM de Tris pH 7,5, 0,5 M de NaCl, tampão B: 20 mM de Tris pH 7,5, 2 M de NaCl, e pela utilização do seguinte gradiente: 0,0-62,5% B por 20 volumes de coluna (CVs). A proteína de fusão com SEQ ID NO: 15 foi obtida com uma pureza de 93-96%, uma recuperação de > 71% e níveis de endotoxina < 1,0 EU/mg.
[0207] A segunda purificação foi conduzida pela utilização de coluna de cromatografia com um volume de 4,6 L empacotada com a resina NH2-750F e os seguintes parâmetros: Altura de leito: 30 cm, Tempo de residência: 11,55 min (taxa de fluxo: 400 mL/min), tampão A: 20 mM de Tris pH 7,5, 0,5 M de NaCl, tampão B: 20 mM de Tris pH 7,5, 2 M de NaCl e pela utilização do seguinte gradiente: 0,0-62,5% de B por 20 volumes de coluna (CVs). A proteína de fusão com SEQ ID NO: 15 foi obtida com uma pureza de 93-96%, uma recuperação de > 71% e níveis de endotoxina < 1,0 EU/mg. EXEMPLO 14 Consistência entre as etapas do processo de recuperação
[0208] O processo de purificação foi conduzido de maneira a purificar a proteína de fusão de SEQ ID NO: 15 quatro vezes (lotes 1-4) e a recuperação desta proteína de fusão foi avaliada após cada estágio do processo de purificação (TABELA 8).
Houve um alto grau de consistência na recuperação da proteína de fusão entre estas réplicas.
TABELA 8. Recuperação da proteína de fusão de SEQ ID NO: 15 em um processo de purificação com 4 réplicas Etapa do Descrição do Média processo processo Lote 1 Lote 2 Lote 3 Lote 4 (%) UF/DF de 2 redobramento 98,60% 94% 92,40% 85% 92 3 NH2-750F 68,60% 66,30% 76% 74,50% 71,35% 4 CaPure 99% 96,40% 100% 94,80% 97,55 UF/DF de 5 formulação 97,80% 100% 98,75% 100% 99,14
[0209] Estes dados demonstram que os métodos e composições da presente descrição permitiram a produção e purificação de proteína de fusão terapêutica em larga escala e que os métodos e composições descritos aqui proveram alta consistência durante o aumento em escala.
[0210] Todos os métodos descritos e reivindicados aqui podem ser realizados e executados sem experimentação indevida à luz da presente descrição. Embora a composições e métodos desta descrição tenham siso descritos em termos de realizações preferidas, deve ser claro para os técnicos no assunto que variações podem ser aplicadas aos métodos e nas etapas ou na sequência de etapas do método descrito aqui sem se afastarem do conceito, espírito e escopo da descrição. Mais especificamente, será claro que certos agentes que são tanto quimicamente quanto fisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes descritos aqui enquanto seriam alcançados os mesmos resultados ou resultados similares. Todos os substitutos e modificações similares claros para os técnicos no assunto são considerados dentro do espírito, escopo e conceito da descrição tal como definida pelas reivindicações anexas.
EXEMPLO 15 Comparação da SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 17
[0211] Uma cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) foi realizada em composições purificadas representando as SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 17 e os resultados estão representados nas FIG. 23B e FIG. 23A, respectivamente. A composição da SEQ ID NO: 17 foi produzida, redobrada e purificada de maneira análoga à descrita em conexão com a composição da SEQ ID NO: 15. EXEMPLO 16 Avaliação In Vivo dos Construtos de Liberação
[0212] Este exemplo descreve uma avaliação in vivo de um construto de liberação apresentando a sequência da SEQ ID NO: 15 em comparação com o veículo.
[0213] A FIG. 24 mostra uma visão global de estudo (dose única) para a avaliação do transporte do construto de liberação apresentando a sequência da SEQ ID NO: 15 através do epitélio intestinal e em circulação após administração oral (abreviada aqui como P.O.) do construto. Os animais utilizados nestes experimentos foram camundongos machos CD-1 sem jejum. Um ponto final do estudo primário foi a exposição de IL-22 de plasma total e um ponto final secundário foram biomarcadores de plasma, incluindo proteína de ligação a IL- 22 (por exemplo, IL-22BP).
[0214] A TABELA 9 provê detalhes relativos à configuração experimental, incluindo informação a respeito do construto de liberação líquido (não formulado) e do veículo.
TABELA 9 – Configuração Experimental do Estudo In Vivo Pontos
N Artigo Dose no Grupo Veículo Formulação Rota (4/duas de Teste (mpk) tempo TP) (horas) PBS, pH 1 Veículo Aq. bolus na P.O. 4 1 7
SEQ ID PBS, pH 1, 2, 4, 2 NO: 15 Aq. bolus 90 P.O. 8 (4*2) 7 6 (líquida)
[0215] A TABELA 10 resume as propriedades do construto de SEQ ID NO: 15 tal como aplicado neste experimento.
TABELA 10 – Propriedades do Construto de Liberação tal como Aplicado na Forma Líquida Cmax Tmax Grupos Grupos AUC (0-6h) (pg/mL) (hr) SEQ ID NO: n/a 24488 2 58126 15 Líquida
[0216] A exposição a IL-22 de plasma total foi medida nos respectivos pontos no tempo mostrados na TABELA 9. A FIG. 25A mostra a exposição sistêmica total da exposição a IL-22 (em pg/mL) e a FIG. 25B mostra a exposição a IL- 22BP (em pg/mL) em vários pontos no tempo em que as amostras de sangue e as medições foram tomadas. As FIG. 26A – FIG. 26B mostram medições individuais e pontos de dados para cada grupo testado neste estudo.
[0217] Foi observado que o construto de liberação administrado oralmente contendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 15 proveu IL-22 no plasma.
EXEMPLO 17 O Comprimento do Espaçador e Acoplamento da Carga Útil ao Terminal N ou C de um Veículo não afeta Significativamente a Atividade Biológica da Carga Útil
[0218] Este exemplo mostra que ligantes de aminoácido de vários comprimentos e o acoplamento de uma carga útil heteróloga ao terminal N de um veículo não impacta significativamente na habilidade da carga útil em se ligar ao seu alvo quando incluídos em um construto de liberação. Os ligantes de aminoácido examinados foram a SEQ ID NO: 13 (GGGGSGGGGSGGGGS), a SEQ ID NO: 28 (GGGGS) e a SEQ ID NO: 31 (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS).
[0219] O ensaio de dimerização do receptor de IL-22 foi realizado pela semeadura de células DiscoverX HEK293 e incubação das células por 16 h (5000 células por poço) utilizando-se as concentrações mostradas do agonista (construto de liberação contendo a carga útil de IL-22). A luminescência do ponto final foi lida em uma leitora de placa utilizando o Ensaio de Dimerização PathHunter® eXpress IL22RA1/IL10RB.
[0220] A FIG. 27A mostra que o comprimento dos espaçadores de aminoácido com as SEQ ID NOs: 13, 28, e 31 não impactou na habilidade da IL-22 (SEQ ID NO: 11) quando incluídos nos construtos de liberação com SEQ ID NOs: 15, 32 e 33 de maneira a induzir a dimerização do receptor de IL-22. A indução da dimerização do receptor de IL-22 humana recombinante de controle (rhIL-22, SEQ ID NO: 12) é mostrada pela curva preta.
[0221] A FIG. 27B mostra que o acoplamento da carga útil de IL-22 (SEQ ID NO: 11) ao terminal N ou C de um veículo compreendendo os resíduos de aminoácidos 1-266 da SEQ ID NO: 1 por meio do espaçador com a SEQ ID NO: 28 não alterou significativamente a habilidade dos construtos de liberação com SEQ ID NOs: 32, 34 e 35 em induzir a dimerização do receptor de IL-22. A indução da dimerização do receptor de IL-22 humana recombinante de controle (rhIL-22) é mostrada pela curva preta.
[0222] O ensaio de ativação de pSTAT3 foi conduzido pela utilização de células Colo205 incubadas com 10 µL de agonista (o respectivo construto de liberação ou IL-22 de controle) apresentando as várias concentrações por 15 min. A extensão da ativação de pSTAT3 foi então lida pela utilização de placas MSD STAT3 (Cat. No. N450SMA-1).
[0223] A FIG. 27C mostra que o comprimento dos espaçadores de aminoácido com as SEQ ID NOs: 13, 28, e 31 não impactou na habilidade da IL-22 (SEQ ID NO: 11) quando incluídos nos construtos de liberação com as SEQ ID NOs: 15, 32, e 33 para induzir a ativação de pSTAT3. A ativação de pSTAT3 da IL-22 humana recombinante de controle (rhIL-22, SEQ ID NO: 12) é mostrada pela curva preta. A FIG. 27D mostra eu o acoplamento da carga útil de IL-22 (SEQ ID NO: 11) ao terminal N ou C de um veículo compreendendo os resíduos de aminoácidos 1- 266 da SEQ ID NO: 1 por meio de espaçador com SEQ ID NO: 28 não alterou significativamente a habilidade dos construtos de liberação com as SEQ ID NOs: 32, 34, e 35 em induzir a ativação de pSTAT3. A ativação de pSTAT3 da IL-22 humana recombinante de controle (rhIL-22) é mostrada pela curva preta.

Claims (45)

REIVINDICAÇÕES
1. Construto de liberação caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15 ou na SEQ ID NO: 17.
2. Construto de liberação de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15.
3. Construto de liberação de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17.
4. Construto de liberação caracterizado pelo fato de compreender um veículo, onde o veículo: apresenta seu terminal C em qualquer uma das posições 195 a 347; apresenta um ácido glutâmico na posição 3 uma alanina na posição 4; e é capaz de transcitose através de uma célula epitelial polarizada.
5. Construto de liberação de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato do veículo apresentar 266 aminoácidos de comprimento.
6. Construto de liberação de acordo com a reivindicação 4 ou reivindicação 5, caracterizado pelo fato do veículo consistir em uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7 ou na SEQ ID NO: 9 ou uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 90%, 95% ou 99% de identidade de sequência a estas.
7. Construto de liberação de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato do veículo consistir em uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7.
8. Construto de liberação de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato do veículo consistir na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9.
9. Construto de liberação de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, caracterizado pelo fato do veículo ser acoplado a uma carga útil.
10. Construto de liberação de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato da carga útil ser IL-22.
11. Construto de liberação de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato da IL-22 consistir em uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 11.
12. Construto de liberação de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato do veículo ser acoplado não covalentemente à IL-22.
13. Construto de liberação de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato do veículo ser acoplado covalentemente à IL-22.
14. Construto de liberação de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato do veículo ser acoplado covalentemente à IL-22 por meio de um espaçador.
15. Construto de liberação de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato do espaçador consistir em uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13.
16. Construto de liberação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de consistir em uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17.
17. Método para o tratamento de uma doença inflamatória em um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreender a administração ao indivíduo uma quantidade efetiva de um construto de liberação conforme definido em uma das reivindicações 1 a 16.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato da doença inflamatória ser hepatite, obesidade, doença do fígado gorduroso, inflamação do fígado ou pancreatite, doença de Crohn, colite ulcerativa, bursite,
proctite, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, doença do enxerto versus hospedeiro, artrite reumatoide ou psoríase.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato da doença ser a doença de Crohn ou colite ulcerativa.
20. Método para a obtenção de uma proteína de fusão de ocorrência não natural purificada, caracterizado pelo fato de compreender: a realização de cromatografia de troca aniônica em uma mistura compreendendo a proteína de fusão de ocorrência não natural de maneira a se obter uma primeira fração compreendendo a proteína de fusão de ocorrência não natural; onde a proteína de fusão de ocorrência não natural compreende IL-22 e um veículo.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato da realização da cromatografia de troca aniônica compreender a ligação da proteína de fusão de ocorrência não natural a uma resina de troca aniônica e provimento de um gradiente salino crescente para subsequente eluição da proteína de fusão de ocorrência não natural de maneira a se obter a primeira fração.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 21, caracterizado pelo fato da realização da cromatografia de troca aniônica compreender o contato da mistura com uma resina compreendendo esferas de polimetacrilato funcionalizadas em amina.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato da resina ser uma resina NH2-750F.
24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente o redobramento da proteína de fusão de ocorrência não natural antes da realização da cromatografia de troca aniônica.
25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato do redobramento da proteína de fusão de ocorrência não natural compreender o contato da proteína caotrópica solubilizada de corpos de inclusão com uma solução de redobramento, onde a solução de redobramento compreende: arginina (0,75 M a 1,25 M); glicerol (2% a 20% v/v); cisteína (0,5 mM a 10 mm); e cistamina (0,2 mM a 10 mM); onde a solução de redobramento apresenta um pH de entre 7,5 e 8,5.
26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato: da arginina estar presente na solução de redobramento a uma concentração de entre 0,9 M e 1,1 M; do glicerol estar presente na solução de redobramento a uma concentração de entre 7% e 13% (em peso); da cisteína estar presente na solução de redobramento a uma concentração de entre 1,5 mM e 6 mM; da cistamina estar presente na solução de redobramento a uma concentração de entre 0,6 mM e 3 mM; e da solução de redobramento apresentar um pH de entre 7,8 e 8,2.
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 26, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a submissão de uma amostra compreendendo a primeira fração a uma resina de hidroxiapatita para se obter uma segunda fração compreendendo a proteína de fusão de ocorrência não natural.
28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato da resina de hidroxiapatita ser uma resina de hidroxiapatita CaPure.
29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 26, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a realização de cromatografia de troca catiônica em uma amostra compreender a primeira fração.
30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato da realização da cromatografia de troca catiônica compreender o contato da amostra compreendendo a primeira fração com uma resina compreendendo esferas de polimetacrilato funcionalizadas em sulfato.
31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato da resina ser uma resina TOYOPEARL Sulfato-650F.
32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 31, caracterizado pelo fato de, pelo contato com uma célula, o veículo promover a endocitose ou transcitose da proteína de fusão de ocorrência não natural.
33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de, pelo contato com a célula, o veículo promover a transcitose da proteína de fusão de ocorrência não natural.
34. Método de acordo com a reivindicação 32 ou reivindicação 33, caracterizado pelo fato da célula ser uma célula epitelial intestinal.
35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato da célula epitelial intestinal ser uma célula epitelial intestinal polarizada.
36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 35, caracterizado pelo fato do veículo ser uma variante trincada de um polipeptídeo de Cholix de ocorrência natural ou de ocorrência não natural.
37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 36, caracterizado pelo fato do veículo apresentar pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou 100% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOS: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 22 ou 23.
38. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 37, caracterizado pelo fato da proteína de fusão de ocorrência não natural apresentar pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de qualquer uma das SEQ ID NOS: 14–21.
39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 38, caracterizado pelo fato da IL-22 apresentar pelo menos 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOS: 10, 11 ou 12.
40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 39, caracterizado pelo fato do veículo, em si, apresentar um primeiro ponto isoelétrico (pI) e a IL-22, em si, apresentar um segundo ponto isoelétrico, onde o primeiro ponto isoelétrico é de pelo menos 1 unidade de pH, pelo menos 1,5 unidades de pH, pelo menos 1,7 unidades de pH ou pelo menos 2 unidades de pH mais baixo que o segundo ponto isoelétrico.
41. Proteína de fusão de ocorrência não natural caracterizada pelo fato de ser obtida pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 20 a 41.
42. Método de redobramento de uma proteína de fusão de ocorrência não natural compreendendo um veículo e IL-22, caracterizado pelo fato de compreender: (i) o contato de corpos de inclusão compreendendo a proteína de fusão de ocorrência não natural com uma solução de solubilização compreendendo um agente caotrópico para produzir uma proteína de fusão de ocorrência não natural solúvel; (ii) o contato da proteína de fusão de ocorrência não natural com uma solução de redobramento, onde a solução de redobramento compreende: arginina (0,75 M a 1,25 M); glicerol (2% a 20% v/v); cisteína (0,5 mM a 10 mm); e cistamina (0,2 mM a 10 mM); onde a solução de redobramento apresenta um pH de entre 7,5 e 8,5.
43. Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato: da arginina estar presente na solução de redobramento a uma concentração de entre 0,9 M e 1,1 M; do glicerol estar presente na solução de redobramento a uma concentração de entre 7% e 13% (em peso); da cisteína estar presente na solução de redobramento a uma concentração de entre 1,5 mM e 6 mM;
da cistamina estar presente na solução de redobramento a uma concentração de entre 0,6 mM e 3 mM; e da solução de redobramento apresentar um pH de entre 7,8 e 8,2.
44. Construto de liberação compreendendo um polipeptídeo de Cholix acoplado a uma carga útil, caracterizado pelo fato do peptídeo de Cholix apresentar seu terminal C em qualquer uma das posições 195 a 347 e ser capaz de transcitose através de uma célula epitelial polarizada.
45. Construto de liberação de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato do polipeptídeo de Cholix ser acoplado de forma heteróloga à carga útil.
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