ES2911075T3 - Constructos de administración para transcitosis y métodos relacionados - Google Patents
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Abstract
Un constructo de administración que comprende un portador acoplado a una IL-22 humana, en donde el portador consiste de una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 7 o 9.
Description
DESCRIPCIÓN
Constructos de administración para transcitosis y métodos relacionados
ANTECEDENTES
El epitelio intestinal ha frustrado los esfuerzos para administrar por vía oral moléculas terapéuticas grandes, como las proteínas, porque las proteínas no pueden difundirse a través de la barrera epitelial intacta o atravesar la barrera a través de las uniones estrechas. Una vez captada por una célula epitelial, una proteína terapéutica puede introducirse en la vía de tráfico lisosomal destructiva o puede liberarse de nuevo en la luz intestinal. Esta incapacidad para transportarse fácilmente a través del epitelio intestinal puede ser un factor limitante en el desarrollo de formulaciones orales comercialmente viables, particularmente para tratamientos basados en polipéptidos.
La administración parenteral, como la administración intravenosa o subcutánea, puede ser una solución, pero estas vías de administración a menudo pueden crear efectos secundarios considerables, disminuir la eficacia terapéutica y reducir la comodidad del paciente, lo que puede afectar negativamente al cumplimiento. Hay una necesidad de composiciones y métodos mejorados para transportar agentes terapéuticos a través de un epitelio, por ejemplo, un epitelio intestinal.
Además, la purificación y el replegado de polipéptidos biológicamente activos para obtener polipéptidos estables, biológicamente activos y plegados correctamente con altos rendimientos y bajos niveles de endotoxinas todavía se considera uno de los aspectos más desafiantes para una producción rentable y eficiente en recursos de agentes terapéuticos biológicos (por ejemplo, polipéptidos). Por tanto, también hay una necesidad de métodos mejorados para la producción (fermentación, replegado, purificación y formulación) de tales moléculas biológicamente activas. La WO2015/171965 divulga moléculas de fusión derivadas de toxina cholix para administración oral de carga biológicamente activa. Hsu et al (Cancer Res Proceedings, AACR 107° Annual Meeting, vol 60, 15 de julio de 2000, p3701-3705) analizan la vacunación contra la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) usando repeticiones de GnRH conjugadas con el dominio de unión al receptor tóxico. La WO2019/173787 divulga constructos de administración derivados de toxinas para administración oral.
SUMARIO
La invención proporciona un constructo de administración que comprende un portador acoplado a una IL-22 humana, en donde el portador consiste de una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ Id NO: 7 o 9. La invención también proporciona un constructo de administración que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15 o la SEQ ID NO: 17, o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 15 o la SEQ ID NO: 17. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos tiene por lo menos un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 15 o la SEQ ID NO: 17.
En algunos casos, la IL-22 humana consiste de una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11. En algunos casos, el portador se acopla covalentemente o no covalentemente a la IL-22. En algunos casos, el portador se acopla covalentemente a la iL-22 a través de un espaciador. En algunos casos, el espaciador consiste de una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 13. En algunos casos, el constructo de administración consiste de una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17.
En algunas realizaciones, los constructos de administración de la invención son para su uso en un método para tratar una enfermedad inflamatoria en un sujeto, el método comprendiendo administrar al sujeto una cantidad eficaz de un constructo de administración descrito en la presente (por ejemplo, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17). En algunos casos, la enfermedad inflamatoria es hepatitis, obesidad, enfermedad del hígado graso, inflamación del hígado o pancreatitis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, reservoritis, proctitis, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de injerto contra huésped, artritis reumatoide o psoriasis. En algunos casos, la enfermedad es la enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa.
En algunas realizaciones, tras el contacto con una célula, el portador promueve la endocitosis o la transcitosis del constructo de administración. En algunas realizaciones, tras el contacto con la célula, el portador promueve la transcitosis del constructo de administración. En algunas realizaciones, la célula es una célula epitelial intestinal. En algunas realizaciones, la célula epitelial intestinal es una célula epitelial intestinal polarizada. El portador es una variante truncada de un polipéptido de cholix de origen natural o no natural. En algunas partes de la divulgación, IL-22 tiene por lo menos un 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 10, 11 o 12.
En algunas realizaciones, el portador, por sí mismo, tiene un primer punto isoeléctrico (pl) y la IL-22, por sí misma, tiene un segundo punto isoeléctrico, en donde el primer punto isoeléctrico es por lo menos 1 unidad de pH, por lo menos 1,5 unidades de pH., por lo menos 1,7 unidades de pH, o por lo menos 2 unidades de pH por debajo del segundo punto isoeléctrico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el portador tiene un pl de entre 4,8 y 5,4,
entre 4,9 y 5,3, entre 5,0 y 5,2, como un pI de aproximadamente 5,1. En algunas realizaciones, el pI de la IL-22 está entre aproximadamente 6,8 y 7,4, como entre aproximadamente 6,9 y 7,3, entre aproximadamente 7,0 y 7,2, como aproximadamente 7,1. En algunas realizaciones, los constructos de administración se obtienen mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente.
Los constructos de administración de la invención pueden producirse mediante métodos de replegado de un constructo de administración, el método comprendiendo: (i) poner en contacto los cuerpos de inclusión que comprenden el constructo de administración con una solución de solubilización que comprende un agente caotrópico para producir un constructo de administración soluble; (iii) poner en contacto el constructo de administración con una solución de replegado, en donde la solución de replegado comprende: arginina (de 0,75 M a 1,25 M); glicerol (del 2% al 20% v/v); cisteína (de 0,5 mM a 10 mm); y cistamina (de 0,2 mM a 10 mM); en donde la solución de replegado tiene un pH de entre 7,5 y 8,5.
En algunas realizaciones, la arginina está presente en la solución de replegado a una concentración de entre 0,9 M y 1,1 M; el glicerol está presente en la solución de replegado a una concentración de entre el 7% y el 13% (p/p); la cisteína está presente en la solución de replegado a una concentración de entre 1,5 mM y 6 mM; la cistamina está presente en la solución de replegado a una concentración de entre 0,6 mM y 3 mM; y la solución de replegado tiene un pH de entre 7,8 y 8,2.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las características novedosas de la divulgación se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente divulgación con referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la divulgación, y cuyos dibujos acompañantes:
La FIG. 1 muestra esquemáticamente una configuración que comprende una cámara apical por encima de una monocapa de células epiteliales y una cámara basal por debajo de dicha monocapa de células epiteliales. Para la permeabilidad apical a basolateral, se aplicaron artículos de prueba (por ejemplo, constructos de administración, cargas útiles, etc.) al lado apical (A) y se determinó la cantidad de material permeado (por ejemplo, transcitado) en el lado basolateral (B).
La FIG. 2 muestra que un constructo de administración (SEQ ID NO: 15), que incluye un portador (SEQ ID NO: 7) acoplado a una iL-22 (SEQ ID NO: 11) a través de un espaciador (SEQ ID NO: 13), transportó la carga útil de IL-22 a través de monocapas de células epiteliales intestinales Caco-2, polarizadas, intactas de una manera dependiente del tiempo (la cantidad de proteína en el sitio basolateral se midió 15, 30 y 45 minutos después de que el constructo de administración se aplicara a la membrana basal de la monocapa como se ha descrito anteriormente en la FIG. 1). Los datos muestran además que cuando el constructo de administración con un portador de la SEQ ID NO: 7 e IL-22 (SEQ ID NO: 11) se aplica a las células epiteliales Caco-2, cruzaron la monocapa de células epiteliales Caco-2 aproximadamente 2-3 veces más de IL-22 en comparación con cuando una IL-22 (SEQ ID NO: 12) no estaba acoplada a un portador.
La FIG. 3 muestra que un constructo de administración (SEQ ID NO: 15) dio como resultado que la IL-22 (SEQ ID NO: 11) fuese transportada a través de monocapas de células epiteliales intestinales SMI-100 intactas y polarizadas de una manera dependiente del tiempo (la cantidad de proteína en la cámara basolateral se midió a los 15, 30 y 45 minutos después de que se hubiese aplicado el constructo de administración a la membrana basal de la monocapa). Los datos muestran además que cuando el constructo de administración que incluye el portador con SEQ iD NO: 7 acoplado a IL-22 (SEQ ID NO: 11) se aplica a las células epiteliales SMI-100, cruzan la monocapa de células epiteliales SMI-100 aproximadamente 2-3 veces más IL-22 en comparación con cuando una IL-22 (SEQ ID NO: 12) no estaba acoplada a un portador.
La FIG. 4 demuestra que un constructo de administración (SEQ ID NO: 15) que incluye un portador (SEQ ID NO: 7) acoplado a una IL-22 (SEQ ID NO: 11) a través de un espaciador (SEQ iD NO: 13) da como resultado que IL-22 sea transportada en cantidades significativas a través de un epitelio intestinal intacto y polarizado in vivo. El sitio apical del epitelio intestinal está resaltado por la flecha blanca N° 1. La lamina propria se abrevia como "1.p." La membrana basal externa del epitelio polarizado está resaltada por la flecha blanca N° 2. La localización de IL-22 se indica con la flecha blanca N° 3).
La FIG. 5A demuestra la fosforilación de STAT3 en células B FL83 murinas en función de la concentración de agonista (en pM), donde el agonista es IL-22 humana recombinante (rhIL-22, SEQ ID NO: 12) o IL-22 murina recombinante (rmIL-22; MAVLQKSMSFSLMGTLAASCLLLIALWAQE ANALPVNTRCKLEVSNFQQPYIVNRTFMLAKEASLADNNTDVR-LIGEKLFRGVSAKDQCYLMK QVLNFTLEDVLLPQSDRFQPYMQEVVPFL TKLSNQLSSCHISGDDQNIQKNVR-RLKETVKKLGES GEIKAIGELDLLFMSLRNACV (SEQ ID NO: 30)). Los datos muestran que rhIL-22 y rmIL-22 indujeron la fosforilación de STAT3 de manera dependiente de la concentración, lo que demuestra que la proteína IL-22 humana puede unirse e inducir la transducción de señales a través de los receptores de IL-22 de ratón con tanta eficacia como la IL-22 de ratón.
La FIG. 5B demuestra que rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) y rmIL-22 también indujeron la fosforilación de STAT3 en células murinas Hepa1-6.
La FIG. 6A demuestra que rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) y rmIL-22 indujeron la fosforilación de STAT5 en células B FL83 murinas de una manera dependiente de la dosis, lo que demuestra que la proteína IL-22 humana puede unirse e inducir la transducción de señales a través de receptores de IL-22 de ratón con tanta eficacia como la IL-22 de ratón.
La FIG. 6B demuestra que rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) y rmIL-22 también indujeron la fosforilación de STAT5 en células murinas Hepa1-6.
La FIG. 7A muestra una descripción general de un diseño de estudio in vivo y un cronograma para comparar la administración peroral (p.o.) del constructo de administración con la SEQ ID NO: 15 a dos niveles de dosis una vez al día, 1 mg/kg y 30 mg/kg, y una administración una vez al día (intraperitoneal (i,p,)) de rhIL-22 a 4 mg/kg. El estudio in vivo se realizó en ratones C57BL/6 hembra alimentados con comida normal, de 8 a 10 semanas de edad, ~23 g. La colitis se indujo químicamente con dextrano sulfato de sodio (DSS) al 2,5% en agua para beber, ad libitum. Los criterios de valoración del estudio incluyeron el cambio porcentual en el peso corporal, el índice de actividad de la enfermedad, la longitud y el peso del colon y la histopatología.
La FIG. 7B muestra las características de los grupos experimentales y de control usados en el estudio descrito en la FIG. 7A.
La FIG. 8A muestra el porcentaje (%) de cambio en el peso corporal de los animales en el día 10 del estudio en relación con el día 0 de los varios grupos experimentales y de control. El cambio de peso corporal de referencia (día 0 frente a 10) por rhIL-22 con la SEQ ID NO: 12 o el constructo de administración con la SeQ ID NO: 15 con respecto al vehículo no fue significativo según se evaluó por ANOVA de 1 vía. El control de modelo positivo (ciclosporina) CsA fue significativamente diferente con respecto al vehículo según se evaluó mediante un ANOVA de 1 vía.
La FIG. 8B muestra el cambio en el peso corporal de los animales experimentales y de control durante los primeros 10 días de estudio. El peso corporal medio del grupo CsA durante el período de estudio mejoró significativamente con respecto al control de vehículo del día 6 al día 10 según se evaluó mediante ANOVA de 2 vías (*, **, ***) el peso corporal de rhIL-22 (i.p.) mejoró significativamente con respecto al control de vehículo en el día 10 según se evaluó por ANOVA de 2 vías (*), * p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
La FIG. 9 muestra los resultados de los experimentos ELISA en plasma para determinar los niveles en plasma de IL-22. Los resultados muestran que las concentraciones en plasma de rhIL-22 tendieron a aumentar los niveles en plasma después de la administración por alimentación forzosa oral de dosis de 1 y 30 mg/kg de la estructura de administración con la SEQ ID NO: 15 de manera dependiente de la dosis (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001, Media SEM, n = 2 no tratado, 5 vehículo, 5 CsA, 10 otros)
La FIG. 10A muestra una descripción general de un estudio in vivo de dosis única diseñado para identificar biomarcadores de acoplamiento al objetivo después de una dosificación individual (dosificación aguda) de rhIL-22 en ratones sanos CD-1.
La FIG. 10B muestra una descripción general de un estudio in vivo de dosis múltiples (dosificación subcrónica) diseñado para identificar biomarcadores de acoplamiento al objetivo después de dosis individuales y múltiples de rhIL-22 en ratones CD-1 sanos.
La FIG. 11A muestra que la administración aguda y subcrónica de rhIL-22 aumenta la concentración de IL-22 consistentemente.
La FIG. 11B muestra algunos parámetros farmacocinéticos medidos durante los experimentos de dosificación aguda y subcrónica descritos en la FIG. 11A.
La FIG. 12A muestra la concentración de proteína C reactiva murina (mCRP) circulante inducida en respuesta a 1 día después de la dosificación aguda de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) y después de 5 días de dosificación subcrónica de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12). Los resultados muestran un aumento dependiente del tiempo en la mCRP circulante en ambos grupos de estudio.
La FIG. 12B muestra el cambio de veces de la concentración de mCRP en plasma 1 día después de la dosificación aguda de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
La FIG. 12C muestra el cambio de veces de la concentración de mCRP en plasma después de 5 días de dosificación subcrónica de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
La FIG. 13A muestra la concentración de proteína A amiloide sérica murina (mSAA) circulante inducida en respuesta a 1 día después de la dosificación aguda de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) y después de 5 días de dosificación subcrónica de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12). Los resultados muestran un aumento dependiente del tiempo en la mSAA circulante en ambos grupos de estudio, con concentraciones de picos en plasma aproximadas aproximadamente 8 horas después de la administración.
La FIG. 13B muestra el cambio de veces de la concentración de mSAA en plasma 1 día después de la dosificación aguda de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
La FIG. 13C muestra el cambio de veces de la concentración de mSAA en plasma después de 5 días de dosificación subcrónica de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
La FIG. 14A muestra la proteína 3pp derivada de los islotes (Reg3(6(6) de regeneración circulante inducida en respuesta a 1 día después de la dosificación aguda de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) y después de 5 días de dosificación subcrónica de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
La FIG. 14B muestra el cambio de veces de la concentración en plasma de Reg3(6(6 1 día después de la dosificación aguda de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
La FIG. 14C muestra el cambio de veces de la concentración en plasma de Reg3(6(6 después de 5 días de dosificación subcrónica de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
La FIG. 15 ilustra un diagrama de flujo que muestra cómo la capacidad de fabricación mejorada puede permitir la traducción clínica.
La FIG. 16 ilustra que la SEQ ID NO: 15 es una proteína de fusión heteróloga que comprende un dominio portador (SEQ ID NO: 7) enlazado a través de un espaciador (SEQ ID NO: 13) a la interleucina-22 (IL-22, SEQ ID NO: 11). Las proteínas de fusión heterólogas pueden secuestrarse en cuerpos de inclusión (IB) de E. coli y, por lo tanto, requieren replegado y/o purificación.
La FIG. 17 ilustra un diagrama de flujo que resume el replegado, la purificación y la formulación de las proteínas de fusión heterólogas descritas en la presente, como, por ejemplo, las SEQ ID NO: 14-21, y proteínas de fusión que comprenden un portador de la SEQ ID NO: 1-9, 22 o 23.
La FIG. 18 ilustra la optimización iterativa para la eficiencia de replegado mejorada del constructo de la SEQ ID NO: 15.
La FIG.19 es una cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) que muestra la señal de la proteína replegada optimizada (SEQ ID NO: 15) y los agregados de proteínas que tienen masas moleculares más altas y, por tanto, tiempos de retención más bajos.
La FIG. 20 ilustra una SDS-PAGE ejemplar de la proteína replegada inicial y optimizada (SEQID NO: 15).
Las FIGS. 21A-21B ilustran una cromatografía de exclusión por tamaño después de una primera purificación en columna de la SEQ ID NO: 15 usando resina de intercambio aniónico NH2-750F. La FIG. 21a ilustra una cromatografía de exclusión por tamaño después de una primera purificación en columna de la SEQ ID NO: 15 usando resina de intercambio aniónico NH2-750F con un volumen de columna de 10 ml y una altura de lecho de 20 cm. La FIG. 21B ilustra una cromatografía de exclusión por tamaño después de una primera purificación en columna de la SEQ ID NO: 15 utilizando resina de intercambio aniónico NH2-750F con un volumen de columna de 4,6 l y una altura de lecho de 30 cm.
Las FIGS. 22A-22B ilustran una cromatografía de exclusión por tamaño después de una segunda purificación en columna de la SEQ ID NO: 15 usando resina de hidroxiapatita CaPure®. La FIG. 22A ilustra una cromatografía de exclusión por tamaño después de una segunda purificación en columna de la SEQ ID NO: 15 usando resina de hidroxiapatita Ca++Pure con un volumen de columna de 5 ml, una altura de lecho de 10 cm y un gradiente del 0-25% B, 25° C. La FIG. 22B ilustra una cromatografía de exclusión por tamaño después de una segunda purificación en columna de la SEQ ID NO: 15 usando resina de hidroxiapatita CaPure® con un volumen de columna de 800 ml, una altura de lecho de 21 cm y un gradiente del 0-25% B, 25CV. Para cada figura una SDS-PAGE correspondiente de muestras de las diferentes fracciones eluidas de la resina CaPure®.
Las FIGS. 23A-23B ilustran un cromatógrafo de cromatografía líquida-espectrofotometría de masas (LC-MS) después de la purificación de proteínas de fusión heterólogas. La f Ig .23A ilustra un cromatógrafo LC-MS de la SeQ ID NO: 17. El pico 1 ilustra la SEQ ID NO: 17 replegada correctamente. La FIG. 23B ilustra un cromatógrafo LC-MS de la SEQ ID NO: 15. El pico 1 ilustra la SeQ ID NO: 15 replegada corregida. El pico 2 ilustra la SEQ ID NO: 15 con la metionina terminal escindida (ilustrada por la SEQ iD NO: 20). El pico 3 ilustra la SEQ ID NO: 15 con la metionina terminal escindida (se ilustra mediante la SEQ ID NO: 20) y la acetilación del aminoácido N-terminal resultante.
La FIG. 24 ilustra la descripción general del estudio del EJEMPLO 16 para evaluar el transporte del constructo de administración que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 15 a través del epitelio intestinal y hacia la circulación después de la administración oral (abreviada en la presente como P.O.) del constructo.
Las FIGS. 25A-25B ilustran gráficos que muestran la concentración en plasma de IL-22 en función del tiempo después de la administración del constructo de administración de la SEQ ID NO: 15. La FIG. 25A ilustra la concentración en plasma total de IL-22 en función del tiempo después de la administración del constructo de administración de la SEQ ID NO: 15. La FIG. 25B ilustra la concentración en plasma de IL-22BP en función del tiempo después de la administración del constructo de administración de la SEQ ID NO: 15.
La FIG. 26A (vehículo) y la FIG. 26B (SEQ ID NO: 15) son gráficos que muestran la concentración en plasma de IL-22 en función del tiempo para ratones individuales.
Las FIGS. 27A-27D ilustran que la longitud del espaciador y el acoplamiento de la carga útil al extremo N- o C-terminal de un portador no afectan significativamente a la actividad biológica de la carga útil. La FIG. 27A ilustra que la longitud de varios espaciadores de aminoácidos no afectó a la inducción de la dimerización del receptor de IL-22. La FIG. 27B ilustra que el acoplamiento de la carga útil de IL-22 al extremo N- o C-terminal de un portador no afectó a la inducción de la dimerización de IL-22. La FIG. 27C ilustra que la longitud de varios espaciadores de aminoácidos no afectó a la inducción de la activación de pSTAT3. La FIG. 27D ilustra que el acoplamiento de la carga útil de IL-22 al extremo N- o C-terminal de un portador no afectó a la inducción de la activación de pSTAT3.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Los siguientes términos se analizan para ilustrar los significados de los términos como se usan en esta memoria descriptiva, además de la comprensión de estos términos por los expertos en la técnica. Como se usa en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Se observa además que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, se pretende que esta declaración sirva como base antecedente para el uso de terminología exclusiva como "únicamente", "solo" y similares en relación con la enumeración de los elementos de las reivindicaciones o el uso de una limitación "negativa".
Ciertos intervalos o números se presentan en la presente con valores numéricos precedidos por el término "aproximadamente". El término "aproximadamente" como se usa en la presente significa más o menos el 1%, 2%, 3%, 4% o 5% del número al que se refiere el término. Como se usan en la presente, los términos "sujeto" e "individuo" se usan indistintamente y pueden ser cualquier animal, incluyendo mamíferos (por ejemplo, un animal humano o no humano).
Como se usa en la presente, los términos "tratar", "tratando" o "tratamiento" y otros equivalentes gramaticales incluyen aliviar, reducir o mejorar uno o más síntomas de una enfermedad o afección, mejorar, prevenir o reducir la apariencia, gravedad o frecuencia de uno o más síntomas adicionales de una enfermedad o afección, mejorar o prevenir las causas subyacentes de uno o más síntomas de una enfermedad o afección, inhibir la enfermedad o afección como, por ejemplo, detener el desarrollo de la enfermedad o afección, aliviar la enfermedad o afección, provocar la regresión de la enfermedad o afección, aliviar una afección causada por la enfermedad o afección, o inhibir los síntomas de la enfermedad o afección ya sea profiláctica y/o terapéuticamente.
Como se describe en la presente, el término "porcentaje (%) de identidad de secuencia" y los términos relacionados con el mismo, en el contexto de las secuencias de aminoácidos, es el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en una secuencia seleccionada, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el porcentaje de identidad de secuencia máximo, y no considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento con el propósito de determinar el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos puede lograrse de varias maneras que están dentro del conocimiento en la técnica, por ejemplo, usando software informático disponible públicamente como software Clustal Omega, BLAST, BLAST-2, ALIGn , ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se están comparando.
Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los péptidos también incluyen esencialmente cualquier poliaminoácido que incluye, pero no se limita a, miméticos de péptidos como aminoácidos unidos por un enlace éter en lugar de un enlace amida.
Cargas útiles y constructos de administración
En la presente se proporcionan constructos de administración capaces de transportar IL-22 a través de células epiteliales (por ejemplo, células epiteliales intestinales polarizadas) y en la lamina propria a través de transcitosis. El portador puede ser capaz de transportar la IL-22 a través de células epiteliales polarizadas (por ejemplo, células epiteliales intestinales polarizadas) usando vías de tráfico endógenas. La utilización de vías de tráfico endógenas, en contraposición al uso de la difusión pasiva, puede permitir que el portador transporte la carga útil heteróloga de manera rápida y eficiente a través de las células epiteliales sin alterar la función de barrera de estas células o la actividad biológica de la carga útil heteróloga.
El portador puede derivar de un polipéptido Cholix secretado por Vibrio Cholerae. El portador derivado de un polipéptido Cholix puede ser de origen natural o no natural. Por ejemplo, un polipéptido Cholix de origen no natural puede consistir de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 (un ejemplo de Cholix1-634) (TABLA 1). El portador derivado de un polipéptido Cholix puede ser una variante truncada y/o mutada de un polipéptido derivado de Cholix. Un portador de la presente puede comprender una sustitución V1L. Dicho de otra manera, en algunas realizaciones, el portador relacionado con cholix tiene un aminoácido de leucina en la posición "1". (La posición 1 se refiere al primer aminoácido de las variantes que no tienen una metionina N-terminal o la segunda posición en las variantes que incluyen una metionina N-terminal. En otras palabras, al determinar la longitud de un portador, se ignora una metionina N-terminal, si la hay). En algunas realizaciones, los portadores que comprenden la sustitución de V1L experimentan una escisión reducida o eliminada del aminoácido N-terminal. En algunas realizaciones, los portadores que comprenden la sustitución de V1L experimentan una acetilación reducida o eliminada del aminoácido N-terminal. Un portador proporcionado en la presente puede tener una actividad de ribosilación de ADP reducida (por ejemplo, por lo menos un 50% reducida) o suprimida (por ejemplo, ribosilación del factor de elongación 2) con respecto a una variante de Cholix de origen natural. En algunas realizaciones, el portador puede comprender una metionina N-terminal. En otras realizaciones, no hay metionina N-terminal.
La interleucina 22 (IL-22) es una interleucina 22 humana. La IL-22 humana puede tener la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10 (IL-221-179) o la SEQ ID NO: 11 (IL-2234-179). Una IL-22 en la presente puede incluir además una metionina en su extremo N-terminal, por ejemplo, cuando dicha proteína IL-22 se expresa en bacterias. En un caso, una IL-22 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 12 (M+IL-2234-179). Una IL-22 en la presente puede incluir además una metionina en su extremo N-terminal, por ejemplo, cuando dicha proteína IL-22 se expresa en bacterias. En un caso, una IL-22 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SeQ ID NO: 12 (M+IL-2234-179). La IL-22 puede comprender, consistir esencialmente de, o consistir de la SEQ
ID NO: 10, o una secuencia de aminoácidos que tenga por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%% de identidad de secuencia con la misma o fragmento de la misma. La IL-22 puede comprender, consistir esencialmente de, o consistir de la SEQ ID NO: 11 (IL-2234-179), que es una forma secretada de IL-22, o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la misma o fragmento de la misma. Una IL-22 puede incluir una metionina en su extremo N-terminal, por ejemplo, cuando dicha proteína IL-22 se expresa en bacterias. Tal IL-22 puede consistir, consistir esencialmente de, o comprender una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 12 (M+lL-2234-179).
Tal como se hace referencia en la presente, "transcitosis" se refiere al tráfico de la molécula de fusión a través de una célula epitelial polarizada. Dicho tráfico permite la liberación de la carga biológicamente activa desde la membrana basolateral de la célula epitelial polarizada. El proceso de transcitosis puede implicar interacciones del portador con uno o más receptores y/o proteínas en las superficies apicales y/o basales, así como dentro de una célula del epitelio (por ejemplo, una célula epitelial intestinal polarizada). El portador puede ser capaz de transportar la IL-22 a través de un epitelio sin alterar el epitelio, el portador y/o la función biológica y/o terapéutica de la IL-22.
Un portador puede acoplarse a IL-22 covalente o no covalentemente y directa o indirectamente. La IL-22 puede acoplarse directamente al extremo N-terminal o al extremo C-terminal del portador. En los casos en los que el soporte se acopla covalentemente a la IL-22, el portador puede acoplarse a IL-22 a través de un espaciador (también denominado referido en la presente como conector). El espaciador puede comprender por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o más residuos de aminoácidos. Los residuos de aminoácidos espaciadores pueden ser, por ejemplo, glicina, serina y/o triptófano. Un espaciador puede ser un espaciador escindible o no escindible. Un espaciador escindible puede ser escindible por una enzima o de manera dependiente del pH.
Los ejemplos de espaciadores contemplados en la presente incluyen secuencias de oligopéptidos como S, (GS)x, (GGS)x, (GGGS)x (SEQ ID NO: 27), (GGGGS)x (SEQ ID NO: 28) o (GGGGGS) x (SEQ ID NO: 29), donde x = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15. En algunos casos, un espaciador consiste de, consiste esencialmente de, o comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 13 ((G4S)3). (GGGGSGGGGSGGGGS). En algunos casos, un espaciador consiste, consiste esencialmente de, o comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 31 ((G4S)5). (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGGSGGGGS). En algunos casos, un constructo de administración comprende una carga útil terapéutica y un portador que no están enlazados covalentemente (por ejemplo, a través de interacciones iónicas, interacciones de van der Waals, interacciones n-n, etc.). Un portador puede comprender además una o más características, elementos, aminoácidos, o modificaciones en su extremo N-terminal y/o extremo C-terminal. Por ejemplo, algunas realizaciones incluyen una metionina N-terminal en el extremo N-terminal del portador. También pueden estar presentes otras modificaciones (por ejemplo, acetilación), incluyendo modificaciones para la expresión en un sistema heterólogo.
Un constructo de administración en la presente puede tener una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15 o 17 (ejemplos de M+Cholix1-266-(G4S)3-IL-2234-179) (TABLA 1). Tales constructos de administración ejemplares transportan IL-22 a través de células epiteliales intestinales polarizadas intactas y hacia la lamina propria.
Un esquema del portador, espaciador y carga útil de una proteína de fusión de origen no natural que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15 se ilustra en FIG. 16.
La TABLA 1 muestra secuencias de aminoácidos ejemplares de moléculas biológicamente activas usadas en combinación con los métodos divulgados en la presente.
TABLA 1-Secuencias de aminoácidos ejemplares
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
continuación
continuación
continuación
continuación
(continuación)
(continuación)
En algunas realizaciones, los constructos de administración de la invención pueden formularse como una composición farmacéutica, por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende un constructo de administración de la invención y uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. En algunos casos, el constructo de administración consiste de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15. En algunos casos, el constructo de administración consiste de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 17. Tales composiciones farmacéuticas pueden formularse para la administración a un sujeto. En algunos casos, se formula una composición farmacéutica para administración oral a un sujeto.
Una composición farmacéutica que comprende un constructo de administración puede administrarse a un sujeto (por ejemplo, un humano) con necesidad de ello para tratar una enfermedad. Las enfermedades que pueden tratarse usando los constructos de administración de esta invención incluyen enfermedades autoinmunes y enfermedades inflamatorias. En algunos casos, la enfermedad es una lesión de las células epiteliales o un daño de las membranas de las células epiteliales (por ejemplo, en el tubo gastrointestinal). En algunos casos, la enfermedad es hepatitis, obesidad, enfermedad del hígado graso, inflamación del hígado o pancreatitis, enfermedad de Crohn (por ejemplo, enfermedad de Crohn fistulizante), colitis ulcerosa (por ejemplo, de leve a moderada o de moderada a grave), reservoritis, proctitis, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de injerto contra huésped, artritis reumatoide o psoriasis.
Métodos de purificación y composiciones
La presente divulgación contempla métodos para obtener los constructos de administración de la invención. Las ventajas de los métodos y composiciones descritos en la presente incluyen mantener una alta pureza y actividad biológica de los polipéptidos o proteínas purificados.
Las ventajas específicas de los métodos divulgados en la presente incluyen: a) alta actividad biológica de los constructos de administración debido al plegamiento correcto usando tampones de plegamiento desarrollados específicamente; b) alta pureza química de los constructos de administración purificados junto con baja toxicidad; c) alto rendimiento de recuperación del material sometido a purificación; d) la reproducibilidad de los resultados permite una producción y un suministro fiables; e) capacidad de fabricación y ampliación a escala a escala de varios gramos y varios kilogramos para aplicaciones clínicas y comerciales; f) el uso sostenible de materiales y recursos proporciona un método de purificación rentable y logísticamente eficaz para moléculas clínicamente relevantes. Además, los métodos de fabricación mejorados pueden aumentar la velocidad a la que pueden desarrollarse estas proteínas purificadas para uso terapéutico (FIG. 22).
En la FIG. 17 se muestra un proceso ejemplar para la purificación de los constructos de administración descritos en la presente, que ilustra adicionalmente la pureza ejemplar y las cantidades de recuperación para el constructo de administración en cada etapa del proceso de purificación.
Como se usa en la presente, "pureza" indica un nivel de proteína deseada (por ejemplo, constructo de administración) o forma deseada de la proteína (por ejemplo, un monómero del constructo de administración, un constructo de administración plegado corregido o una combinación de los mismos) en una composición que también puede comprender proteínas no deseadas o formas no deseadas de la proteína (por ejemplo, un agregado del constructo de administración, una proteína plegada incorrectamente o una combinación de los mismos). El nivel puede representarse mediante un porcentaje (%) de la proteína deseada o la forma deseada de la proteína. Por ejemplo, la pureza puede ser mayor del 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99%, o puede ser del 100%. El término "purificado" puede usarse para indicar una composición que ha experimentado un aumento en la pureza. Un aumento en la pureza puede deberse a los procedimientos de purificación descritos en la presente, como cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de hidroxiapatita, cromatografía de intercambio catiónico o una combinación de las mismas.
En algunos casos, los métodos y composiciones de la presente divulgación comprenden el uso de por lo menos dos columnas de cromatografía que se realizan en tándem, seguido de un paso de concentración/intercambio de tampón (ultrafiltración/diafiltración (UF/DF) para concentrar e intercambio de tampón de la solución). Las columnas de cromatografía pueden ser sistemas de cromatografía de baja presión, como la columna AKTA Avant 150 o una columna AKTA Pilot de General Electric (GE). En algunos casos, por lo menos una columna contiene una resina de intercambio aniónico (por ejemplo, resina NH2-750F) y por lo menos una columna contiene una hidroxiapatiteresina (por ejemplo, resina CaPure®). En algunos casos, se usa por lo menos una columna que contiene la resina de intercambio aniónico para el paso de captura, mientras que por lo menos una columna que contiene la resina de hidroxiapatita se usa para el paso de pulido. En algunos casos, en lugar de (o además de) la columna de hidroxiapatita, puede usarse una columna de intercambio catiónico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la columna de intercambio catiónico con una resina de polimetacrilato funcionalizada con sulfato, como TOYOPEARL Sulfate-650F. La pureza de la proteína solubilizada puede aumentar del 44% al 47% después de la UF/DF a del 93% al 97% después de la cromatografía de intercambio aniónico hasta por lo menos el 99% después de la cromatografía de hidroxiapatita. La recuperación de la proteína solubilizada puede aumentar del 70% al 73% tras la cromatografía de intercambio aniónico hasta por lo menos el 97% tras la cromatografía de
hidroxiapatita.
Aislamiento de constructos de administración de cuerpos de inclusión
En algunas realizaciones, los constructos de administración que se van a purificar se aíslan a partir de los cuerpos de inclusión (IB). Los IB, como se describen en la presente, pueden ser agregados nucleares o citoplasmáticos de sustancias estables, como proteínas y polipéptidos. En algunas realizaciones, los cuerpos de inclusión doblemente lavados (DWIB) que comprenden el constructo de administración de la fermentación se resuspenden en un sistema de tampón específico (ver EJEMPLO 6).
En algunos casos, la concentración de DWIB es de aproximadamente 0,5 g de DWIB/100 ml de tampón a aproximadamente 5 g de DWIB/10 ml de tampón. En algunos casos, la concentración de DWIB es de aproximadamente 2 g de DWIB/50 ml de tampón a aproximadamente 5 g de DWIB/50 ml de tampón. En algunos casos, la concentración de DWIB es de aproximadamente 1 g de DWIB/20 ml de tampón a aproximadamente 1 g de DWIB/10 ml de tampón. En algunos casos, la concentración de DWIB es de por lo menos 1 g de DWIB/100 ml de tampón. En algunos casos, la concentración de DWIB es de por lo menos 1 g de DWIB/10 ml de tampón.
El sistema tampón para la resuspensión puede comprender una variedad de ingredientes y agentes tampón. En algunos casos, el sistema tampón para la resuspensión comprende guanidina/HCl (Gu-HCl) a una concentración de por lo menos 1 M, por lo menos 2 M, por lo menos 4 M, por lo menos 6 M, por lo menos 8 M. En algunos casos, la concentración de Gu-HCl es de aproximadamente 4 M a aproximadamente 8 M. En algunos casos, el sistema tampón para la resuspensión comprende tampón Tris, en donde la concentración de Tris es de por lo menos 5 mM, por lo menos 10 mM, en por lo menos 20 mM, por lo menos 50 mM o por lo menos 100 mM. En algunos casos, el tampón Tris tiene una concentración de aproximadamente 40 mM a aproximadamente 60 mM. El tampón Tris puede ser Tris-HCl. El Tris-HCl puede tener un pH de 8,0 a 8,5. El Tris-HCl puede tener un pH de 8,2. En algunos casos, el sistema tampón para la resuspensión comprende ditiotreitol (DTT). El DTT puede tener una concentración de por lo menos 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM o 70 mM. El DDT puede tener una concentración de 7 mM a 11 mM, de 8 mM a 10 mM o de 9 mM a 10 mM. En algunos casos, el sistema tampón para la resuspensión comprende ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). El EDTA puede tener una concentración de por lo menos 1 mM, 1,5 mM, 2 mM o 2,5 mM. El EDTA puede tener una concentración de 1 mM a 2,5 mM o de 1,9 mM a 2,1 mM. En algunas realizaciones, el sistema tampón para la resuspensión comprende, consiste esencialmente de, o consiste de un tampón Tris, Gu-HCl y DTT. El sistema tampón usado para la resuspensión puede tener un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 10. En algunos casos, el sistema tampón tiene un pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5. En algunos casos, el pH del sistema tampón es de por lo menos 7. En algunos casos, el pH del sistema tampón es de por lo menos 8. En algunos casos, el pH del sistema tampón es de por lo menos 8,5.
Reducción de constructos de administración solubilizados
Puede añadirse un agente reductor a la solución de resuspensión. El agente reductor puede ser ditiotreitol (DTT). La cantidad de agente reductor usado puede depender del volumen de la solución de resuspensión y del constructo de administración presente en esa solución. En algunos casos, la cantidad de agente reductor usado es de aproximadamente 0,025 mM a aproximadamente 50 mM, de 0,5 mM a 30 mM, de 1 mM a 10 mM. En algunos casos, la cantidad de agente reductor usado es por lo menos (o entre) 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM o 10 mM.
La solución de constructos de administración solubilizados puede incubarse a varias temperaturas que varían de aproximadamente 2° C a aproximadamente 40° C. En algunos casos, la solución de proteínas puede incubarse a temperatura ambiente (TA). La incubación puede realizarse mientras se agita la solución. La solución puede agitarse en una placa de agitación magnética y luego centrifugarse. La centrifugación puede realizarse a de aproximadamente 1.000 xg a aproximadamente 20.000 xg. En algunos casos, la centrifugación se realiza a 15.970 xg durante 90 minutos a 4° C. El tiempo de incubación puede variar de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 180 minutos, dependiendo de la concentración de los ingredientes, la concentración del constructo de administración.
La concentración de proteína en varias soluciones a lo largo de los métodos y procedimientos como se describe en la presente puede realizarse usando el ensayo de Bradford. La concentración del constructo de administración solubilizado puede ser de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml. En algunos casos, la concentración final del constructo de administración solubilizado puede ser de aproximadamente 3 mg/ml a aproximadamente 30 mg/ml. En algunos casos, la concentración final del constructo de administración solubilizado puede ser de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. En algunos casos, la concentración final del constructo de administración solubilizado puede ser de por lo menos 15 mg/ml.
Repliegue de constructos de administración
Los constructos de administración pueden ejercer su actividad biológica debido a su estructura tridimensional o plegado específicos. Por lo tanto, el replegado de estos polipéptidos puede ser importante en el desarrollo de estos polipéptidos para aplicaciones farmacéuticas. El replegado deseable de un constructo de administración de la invención puede comprender el replegado del portador o la IL-22 en una estructura terciaria similar a una estructura terciaria de un portador homólogo de origen natural o una secuencia de IL-22 o una estructura terciaria que dé como resultado el mantenimiento de la actividad deseada del portador (por ejemplo, transcitosis del constructo de administración) e IL-22. Los métodos descritos en la presente pueden comprender el replegado del constructo de administración solubilizado para producir un constructo de administración replegado. El replegado puede producirse antes de realizar la cromatografía de intercambio aniónica.
Los constructos de administración pueden añadirse a una solución de replegado, también denominada solución tampón de replegado. La cantidad de proteína solubilizada usada puede ser de 0,1 mg/ml a 1 mg/ml, de 1 mg/ml a 100 mg/ml, de 1 mg/ml a 50 mg/ml, de 1 mg/ml a 10 mg/ml, de 5 mg/ml a 20 mg/ml, o de aproximadamente 15 mg/ml. La cantidad de proteína solubilizada puede ser de por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mg/ml. La cantidad de proteína solubilizada puede no ser mayor de 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/ml. La solución de replegado puede tener un pH de entre 7,5 y 8,5, o de aproximadamente 7,0.
La solución tampón de replegado puede comprender un aminoácido, un poliol, una sal, un azúcar, un reactivo redox, un caotropo o una combinación de los mismos. El aminoácido puede ser prolina, glicina, arginina o alanina. El poliol puede ser glicerol. La sal puede ser cloruro de sodio (NaCl), cloruro de potasio (KCl) o cloruro de magnesio (MgCL). El azúcar puede ser glucosa o sacarosa. El reactivo redox puede ser cisteína, cistamina, glutatión, ditiotreitol (DTT) o sulfato de cobre (CuSO4). En algunas realizaciones, el tampón de replegado comprende Tris-base, Arginina-HCl, urea, EDTA, glicerol, L-cisteína, cistamina-2HC1, DTT, Gu-HCl o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el tampón de replegado comprende, consiste esencialmente de, o consiste de Tris pH 8,5, arginina, glicerol, cisteína y cistamina. Las concentraciones de tampón Tris pueden variar de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 200 mM, con un pH que varía de aproximadamente 6 a aproximadamente 9. Las concentraciones de arginina-HCl pueden variar de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 1,5 M, de aproximadamente 0,75 M a aproximadamente 1,25 M, o de aproximadamente 0,75 M a aproximadamente 1,25 M. o aproximadamente 1,0 M. Las concentraciones de urea pueden variar de aproximadamente 0,5 M a 1,5 M. Las concentraciones de EDTA pueden variar de 1 mM a 3 mM. Las concentraciones de glicerol pueden variar de aproximadamente el 2% v/v a aproximadamente el 20% v/v, de aproximadamente el 8% v/v a aproximadamente el 12% v/v o aproximadamente el 10% v/v. Las concentraciones de cisteína pueden ser de 1 mM a 5 mM, de 2 mM a 4 mM, o de aproximadamente 3 mM. La cisteína puede ser L-cisteína. Las concentraciones de cistamina pueden variar de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 5 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 4 mM, o de aproximadamente 3 mM. La cistamina puede ser cistamina-2HCl. Las concentraciones de DTT pueden variar de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 1 mM. Las concentraciones de Gu-HCl pueden variar de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 500 mM. El tampón de replegado puede comprender, consistir esencialmente de, o consistir de Tris, L-arginina, urea, EDTA, cisteína y cistamina. El tampón de replegado puede comprender, consistir esencialmente de o consistir de Tris 100 mM pH 8,5, arginina 1 M, glicerol al 10% (v/v), L-cisteína 3 mM y cistamina-2HCl 1 mM. El constructo de administración solubilizado puede añadirse al tampón de replegado para producir una mezcla de replegado. La concentración del constructo de administración, después de la adición a la mezcla de replegado, puede ser de aproximadamente 0,1 mg/ml a 1,0 mg/ml, de 0,5 mg/ml a 1,5 mg/ml, de 0,75 mg/ml a 1,25 mg/ml, o de aproximadamente 1 mg/ml. La concentración del constructo de administración en la mezcla de replegado puede ser menor de 0,5 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,7 mg/ml, 0,8 mg/ml, 0,9 mg/ml o 1,0 mg/ml.
En varias realizaciones, se usa un volumen de aproximadamente 100 ml a aproximadamente 10.000 l de tampón de replegado. En algunos casos, el volumen es de aproximadamente 50 ml a aproximadamente 1500 l. En algunos casos, el volumen es de aproximadamente 10 l a aproximadamente 300 l. En algunos casos, el volumen es de por lo menos 200 l.
La solución de replegado puede tener una cierta temperatura. Por ejemplo, la solución de replegado puede preenfriarse a aproximadamente 2-12° C. En algunos casos, la solución de replegado se enfría previamente a por lo menos aproximadamente 3° C. Este proceso de replegado puede optimizarse dependiendo de la proteína usada y la aplicación (FIG. 18).
En algunas realizaciones de la presente divulgación, la mezcla de replegado se incuba durante un cierto período de tiempo. En algunos casos, el proceso puede durar aproximadamente una hora, dos horas, cuatro horas, cinco horas o 20 horas. En algunos casos, el proceso de replegado tarda entre 15 y 25 horas. En algunos casos, una bomba peristáltica se ajusta a un cierto caudal dependiendo de la constitución de la solución (por ejemplo, concentración o volumen) para administrar el material solubilizado en la solución de replegado. En algunos casos, una bomba peristáltica se ajusta a un caudal de 60-80 ml/min. El proceso de optimización utilizó un diseño de experimentos (DOE) de 15 matrices diferentes, 12 variables y 200 reacciones de replegado. Las decisiones se
tomaban mediante un proceso de eliminación.
En varias realizaciones, puede realizarse un análisis cuantitativo para determinar la cantidad o el porcentaje de proteína plegada correctamente en la solución que comprende los constructos de administración replegados. En algunos casos, se realiza SEC-HPLC para determinar la cantidad de constructo de administración correctamente plegada presente en las muestras replegadas.
La pureza del constructo de administración replegado puede ser del 45% al 65%, del 40% al 60% o del 45% al 55%. La pureza del constructo de administración replegado puede ser de por lo menos el 40%, 45%, 50% o 55%.
Filtración de flujo tangencial (TFF) de constructos de administración de IL-22 solubilizados
En varias realizaciones, el replegado de proteínas se realiza en combinación con o antes de los sistemas de filtración de flujo tangencial (TFF) (por ejemplo, Millipore) y sistemas de ultrafiltración/diafiltración (UF/DF) con ciertos puntos de corte de peso molecular (MWCO).
La mezcla de replegado de proteínas puede ser procesada posteriormente por TFF para concentrar e intercambiar tampón de la solución. En algunos casos, el proceso se realiza por ultrafiltración/diafiltración (UF/DF). Durante la ultrafiltración, la solución puede concentrarse de 8 a 12 veces, o aproximadamente 10 veces. La ultrafiltración puede ir seguida de un intercambio de tampón de 5 veces durante la diafiltración con un tampón de diafiltración. La UF/DF puede comprender el uso de filtros Millipore Ultracell Pellican3 MWCO de 10-20 kDa, con casetes de láminas planas TFF de 1-2 m2. Los parámetros específicos (es decir, TMP) pueden variar dependiendo de las características moleculares de la proteína. El tampón de diafiltración puede comprender Tris-base 10-25 mM a un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 8,5, y NaCl de 50-200 mM. Los parámetros específicos pueden variarse dependiendo de las características moleculares de la proteína. El volumen final al final del proceso de UF/DF puede ser de aproximadamente 5 l a aproximadamente 100 l. En algunos casos, el volumen final varía de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 l. En algunos casos, el volumen final varía de aproximadamente 80 ml a aproximadamente 10 l.
La filtración posterior puede llevarse a cabo usando un sistema de filtración de flujo. En algunos casos, el sistema de filtración de flujo es un sistema de filtro AkroPac y una bomba peristáltica y tubo Cole-Parmer. Puede realizarse el ensayo de Bradford para determinar la concentración de proteína, el rendimiento y la recuperación del paso.
En varias realizaciones, puede realizarse un análisis cuantitativo para determinar la cantidad o el porcentaje de la proteína plegada correctamente en las soluciones de muestra. En algunos casos, se realiza SEC-HPLC para determinar la cantidad del constructo de administración correctamente plegado presente en las muestras replegadas y de UF/DF.
La pureza de una solución que comprende el constructo de administración replegado después de la UF/DF puede ser del 35% al 55%, del 40% al 50%, del 43% al 47% o de aproximadamente el 45%. La pureza de una solución que comprende el constructo de administración replegado después de la UF/DF puede ser de por lo menos el 35%, 40% o 45%. La recuperación del constructo de administración replegado y solubilizado después de la UF/DF puede ser del 87% al 97%, del 90% al 94%, del 92% al 93% o de aproximadamente el 92,5%. (También pueden usarse otros sistemas de concentración y de intercambio de tampón).
Purificación y recuperación de constructos de administración
Como se ha descrito anteriormente, el uso de dos métodos de cromatografía en tándem, como una cromatografía de intercambio aniónico y una cromatografía de hidroxiapatita (o, alternativamente, una cromatografía de intercambio catiónico), puede dar como resultado una mayor pureza y recuperación del constructo de administración, como los constructos de administración de IL-22 descritos en la presente, de la solución. En varias realizaciones de la presente divulgación, las especificaciones cromatográficas (por ejemplo, tipo de columna, resina, caudal, sistemas tampón, gradiente y conductividad) se determinan y optimizan dependiendo de varios parámetros, por ejemplo, la proteína a purificar. Pueden usarse una variedad de columnas de purificación para la purificación de proteínas como se describe en la presente.
Cromatografía de intercambio aniónico
Los métodos descritos en la presente pueden comprender realizar una cromatografía de intercambio aniónico (AEX) en una mezcla que comprende el constructo de administración. La mezcla puede ser una solución que comprenda el constructo de administración replegado. La realización de cromatografía de intercambio aniónico puede producir una primera fracción que comprende el constructo de administración.
Pueden usarse una variedad de resinas en combinación con los métodos y composiciones de la presente
divulgación. En algunos casos, la resina comprende perlas de polimetilacrilato funcionalizadas con amina. En algunos casos, se usa la resina de intercambio aniónico NH2-750F para la purificación de proteínas. Puede llenarse con la resina una columna con una altura de lecho de por lo menos 15 cm, 20 cm, 25 cm o 30 cm. Una columna con una altura de lecho de 10 a 50 cm puede llenarse con resina de una manera que garantice un volumen de columna que pueda facilitar una capacidad de unión dinámica adecuada (por ejemplo, >20 g/l) para permitir la producción de la cantidad deseada de proteína. En algunos casos, la capacidad de unión dinámica de la columna es de 5 g/l a 100 g/l, de 20 g/l a aproximadamente 50 g/l, de 15 g/l a 30 g/l, o de 20 g/l a 25 g/l.
Los sistemas tampón usados para la elución (por ejemplo, elución en gradiente) en la cromatografía de intercambio aniónico pueden comprender una, dos, tres o cuatro soluciones tampón diferentes (por ejemplo, tampones A a D). En algunas realizaciones, se usan dos tampones en la cromatografía de intercambio aniónico y a las que se hace referencia en la presente como Tampón A y Tampón B. En algunos casos, una solución tampón comprende Tris (por ejemplo, 10-50 mM, pH 7-9), y/ o NaCl (por ejemplo, 0,1-5 M). En algunos casos, la solución tampón comprende además glicerol. En algunas realizaciones, la o las soluciones tampón usadas en la cromatografía de intercambio aniónico, como por ejemplo el Tampón A o el Tampón B, comprende, consiste esencialmente de o consiste de Tris pH 7,5 y NaCl y, opcionalmente, glicerol.
El Tampón A puede comprender Tris de 10 mM a 30 mM, de 15 mM a 25 mM, de 19 mM a 21 mM o aproximadamente 20 mM, pH 7,5. El Tampón A puede comprender de 0,25 M a 0,95 M, de 0,35 M a 0,75 M, de 0,45 M a 0,55 M, aproximadamente 0,5 M, de 0,65 M a 0,75 M o aproximadamente 0,7 M de NaCl. El Tampón B puede comprender de 10 mM a 30 mM, de 15 mM a 25 mM, de 19 mM a 21 mM o aproximadamente 20 mM de Tris pH 7,5. El Tampón B puede comprender de 1 M a 3 M, de 1,5 M a 2,5 M, de 1,9 M a 2,1 M o aproximadamente 2 M de NaCl. El Tampón A puede comprender además del 8% al 12%, del 9% al 11% o aproximadamente el 10% (v/v) de glicerol. El Tampón B puede comprender además del 8% al 12%, del 9% al 11% o aproximadamente el 10% (v/v) de glicerol.
Para la cromatografía de intercambio aniónico de la SEQ ID NO: 15, el Tampón A puede comprender Tris 20 mM pH 7,5 y NaCl 0,5 M y el tampón B puede comprender Tris 20 mM pH 7,5 y NaCl 2,0 M (TABLA 4). Para la cromatografía de intercambio aniónico de la SEQ ID NO: 17, el Tampón A puede comprender Tris 20 mM pH 7,5 y NaCl 0,5 M y el Tampón B puede comprender Tris 20 mM pH 7,5 y NaCl 2,0 M. Para la cromatografía de intercambio aniónico de la SEQ ID NO: 14, el Tampón A puede comprender Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 0,7 M y glicerol al 10% (v/v), y el Tampón B puede comprender Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 2,0 M, y 10% (v/v) de glicerol (TABLA 5).
En algunas realizaciones, se añade un cierto volumen de solución salina a la solución de proteína. En algunos casos, se añade a la solución de proteína una solución de NaCl con una concentración que varía de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5 M.
Las soluciones de proteínas pueden cargarse en la columna de tal manera que se pueda observar un caudal específico y un tiempo de residencia de columna específico para garantizar la interacción apropiada de la proteína y la fase sólida (por ejemplo, resina). En algunos casos, el caudal se controla de tal manera que el tiempo de residencia de columna sea de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 6 minutos, o de aproximadamente 5 minutos. El tiempo de residencia de columna puede ser de por lo menos 30 segundos o 1, 2, 3, 4 o 5 minutos. El tiempo de residencia de columna no puede ser mayor de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 minutos. El flujo continuo puede recogerse y analizarse para determinar si hay proteína no unida, lo que se considera una pérdida. Para el análisis y la purificación de proteínas, se determina la absorbancia a aproximadamente 280 nm para la concentración de proteínas y SEC-HPLC para la pureza de proteínas.
En algunas realizaciones, se combina un porcentaje (por ejemplo, 0-100%) o caudal (por ejemplo, 1-10 ml/min) de un primer tampón con un segundo tampón para lograr un caudal final específico (por ejemplo, 1-10 ml/min) del sistema de purificación de columna. Por ejemplo, se realiza un gradiente lineal de 20 volúmenes de columna (CV) del 0,0-62,5% B (100-37,5% A), seguido de un gradiente escalonado hasta el 100% B (0% A) para 5 CV adicionales para la purificación de proteínas. En algunos casos, puede realizarse un gradiente del 0-75% B (100-25% A) 40 CV, Paso 100% B, 10 CV como gradiente de elución que indica un 91-93% de proteína pura y una recuperación del >90%.
La pureza del constructo de administración en la primera fracción puede ser del 90% al 99% o del 91% al 95%. La pureza del constructo de administración solubilizado en la primera fracción puede ser de por lo menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94% o 95%. La recuperación del constructo de administración solubilizado en la primera fracción puede ser del 61% al 81%, del 66% al 76% o del 71% al 72%.
Cromatografía de intercambio catiónico o cromatografía de hidroxiapatita
Los métodos descritos en la presente pueden comprender además someter la primera fracción obtenida después de la cromatografía de intercambio aniónico a una resina de intercambio catiónico para obtener una segunda fracción que comprende el constructo de administración. La resina de intercambio catiónico puede ser una resina de metacrilato funcionalizada con sulfato. La resina de intercambio catiónico puede ser una resina
TOYOPEARL® Sulfate-650Fresin.
Los métodos descritos en la presente pueden comprender adicional o alternativamente someter la primera fracción obtenida después de la cromatografía de intercambio aniónico a una resina de hidroxiapatita para obtener una segunda fracción que comprende el constructo de administración. La resina de hidroxiapatita puede ser una resina de intercambio catiónico que comprende además una afinidad de calcio. La resina de hidroxiaptita puede comprender fosfato de calcio. La resina de hidroxiaptita puede comprender una fórmula química de: Cai0(PO4)6(OH)2. La resina de hidroxiaptita puede comprender un tamaño de partícula de 30 pm a 50 pm, de 35 pm a 45 pm, o de aproximadamente 39 pm. La resina de hidroxiapaptita puede ser la resina CaPure®.
Las ventajas de la resina CaPure® pueden incluir a) tolerancia a la sal, lo que permite la adsorción de proteínas a alta conductividad en soluciones acuosas; b) no se requiere preparación de proteínas antes de la carga; c) resulta en una alta recuperación (>90%); d) alta capacidad de unión (>20 mg/ml de resina); e) aumenta la pureza mediante la eliminación de impurezas de bajo peso molecular (LMW); y f) asegura la depuración de endotoxinas (<1,0 UE/mg).
La resina de intercambio catiónico o resina de hidroxiapatita puede usarse para empaquetar una columna cromatográfica. La columna puede comprender una altura de lecho de 10 cm a 50 cm, o de aproximadamente 20 cm. La columna puede comprender una altura de lecho de por lo menos 10 cm, 15 cm, 20 cm, 25 cm o 30 cm. La columna puede comprender una altura de lecho de no más de 20 cm, 30 cm, 40 cm o 50 cm. En algunos casos, la resina de modo mixto de hidroxiapatita CaPure(R) se usa para empaquetar una columna con una altura de lecho de 10-50 cm, asegurando un volumen de columna que facilita una capacidad de unión dinámica de un máximo de 10 100 g/l para permitir la producción de la cantidad deseada de proteína.
Los sistemas tampón usados para la elución (por ejemplo, elución en gradiente) en la cromatografía de hidroxiapatita pueden comprender una, dos, tres o cuatro soluciones tampón diferentes (por ejemplo, Tampones A a D). En algunas realizaciones, se usan dos tampones en la cromatografía de hidroxiapatita y a los que se hace referencia en la presente como Tampón A y Tampón B. En algunos casos, una solución tampón comprende Tris (por ejemplo, 10-50 mM, pH 7-9), y/o NaCl (por ejemplo, 0,1-5 M). En algunos casos, la solución tampón comprende además glicerol. En algunas realizaciones, una primera solución tampón usada en la cromatografía de hidroxiapatita, como por ejemplo el Tampón A, comprende, consiste esencialmente de, o consiste de Tris pH 7,5, NaCl y CaCh. En algunas realizaciones, una segunda solución tampón usada en la cromatografía de hidroxiapatita, como por ejemplo el Tampón B, comprende, consiste esencialmente de, o consiste de fosfato de sodio pH 7,0, NaCl y CaCh.
El Tampón A puede comprender Tris de 10 mM a 30 mM, de 15 mM a 25 mM, de 19 mM a 21 mM o aproximadamente 20 mM, pH 7,5. El Tampón A puede comprender de 80 mM a 120 mM, de 90 mM a 110 mM o aproximadamente 100 mM de NaCl. El Tampón A puede comprender de 0,5 mM a 1,5 mM, de 0,75 mM a 1,25 mM, de 0,9 mM a 1,1 mM o aproximadamente 1 mM de CaCh. El tampón B puede comprender de 150 mM a 250 mM, de 175 mM a 225 mM, de 190 mM a 210 mM o aproximadamente 200 mM de fosfato de sodio pH 7,0. El Tampón B puede comprender de 50 mM a 150 mM, de 75 mM a 125 mM, de 90 mM a 110 mM o aproximadamente 100 mM de NaCl. El tampón B puede comprender de 0,5 mM a 1,5 mM, de 0,75 mM a 1,25 mM, de 0,9 mM a 1,1 mM o aproximadamente 1 mM de CaCl2.
Para la cromatografía de hidroxiapatita de la SEQ ID NO: 15, el Tampón A puede comprender Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 100 mM y CaCh 1 mM y el Tampón B puede comprender fosfato de sodio 200 mM pH 7,0, NaCl 100 mM y CaCh 1 mM (TABLA 6). Para la cromatografía de hidroxiapatita de la SEQ ID NO: 17, el Tampón A puede comprender Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 100 mM y CaCh 1 mM y el tampón B puede comprender fosfato de sodio 200 mM pH 7,0, NaCl 100 mM y CaCh 1 mM. Para la cromatografía de hidroxiapatita de la SeQ ID NO: 14, el Tampón A puede comprender Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 100 mM y CaCh 1 mM y el Tampón B puede comprender fosfato de sodio 200 mM pH 7,0, NaCl 100 mM y CaCh 1 mM (TABLA 7).
La pureza de la proteína solubilizada tras el uso de resina de intercambio catiónico o resina de hidroxiapatita puede ser del 99% al 100%. La pureza de la proteína solubilizada después del uso de resina de hidroxiapatita puede ser de por lo menos el 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. La recuperación de la proteína solubilizada tras el uso de la resina de hidroxiapatita puede ser del 85% al 100%, del 96% al 99% o del 97% al 98%. La resina de hidroxiapatita puede ser CaPure®.
Las fracciones recogidas durante la cromatografía en columna que contienen el compuesto purificado pueden concentrarse y formularse para su administración usando intercambio de tampón o diafiltración. Por ejemplo, las fracciones recogidas durante CaPure® pueden concentrarse y formularse usando un sistema TFF (por ejemplo, Pall Corporation) para concentrar la proteína. La proteína puede concentrarse hasta una concentración final de 20 mg/ml seguido de un intercambio de tampón de 5 veces. El proceso de filtración puede realizarse usando ultrafiltración/diafiltración (UF/DF) y filtros con MWCO Millipore Pellican3 de 10 kDa, casetes de láminas planas de TFF de 0,114 m2. El MWCO del sistema de filtración puede variar dependiendo de la proteína (por ejemplo, peso molecular) a purificar. El tampón de diafiltración puede consistir de fosfato de sodio 10-20 mM a un pH de
aproximadamente 7,0, NaCI 50-100 mM. Las SEQ ID NO: 14-21 formuladas puede filtrarse posteriormente usando un sistema de filtración de flujo que emplea un filtro AkroPac de 0,8/0,2 um y una bomba peristáltica y tubo Cole-Parmer. La proteína purificada y formulada puede almacenarse en alícuotas a -80° C hasta su uso posterior.
En realizaciones específicas, las proteínas analizadas por SEC-HPLC pueden mostrar una pureza superior al 97% (típicamente >98%) usando la columna TSKgel GW3000SWXL, 5 pm, 7,8 mm ID x 30,0 cm L (Tosoh Bioscience, 8541).
Análisis de proteínas
Las muestras de diferentes fracciones pueden analizarse mediante SDS-PAGE usando el sistema de imagenología Bio-Rad ChemiDoc™ MP, y las fracciones recogidas durante la cromatografía en columna pueden analizarse para determinar el contenido de proteína usando Thermo Fisher Nanodrop One™. Las técnicas generales para la detección o el análisis de proteínas incluyen electroforesis en gel, microscopía de fluorescencia, electroforesis capilar, espectrometría de masas, ensayo de cambio de movilidad electroforético o resonancia magnética nuclear.
Usos terapéuticos
En varias realizaciones de la presente invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden los constructos de administración de la invención para su uso en el tratamiento y/o prevención de enfermedades inflamatorias. Estas composiciones farmacéuticas pueden formularse para administración oral. Las "enfermedades inflamatorias" pueden incluir todas las enfermedades asociadas con inflamación aguda o crónica. La inflamación aguda es la respuesta inicial del organismo a los estímulos nocivos y resulta de un movimiento aumentado de plasma y leucocitos (como, por ejemplo, granulocitos) desde la sangre hacia los tejidos lesionados. Una serie de eventos bioquímicos propagan y maduran la respuesta inflamatoria, implicando al sistema vascular local, el sistema inmunitario y varias células dentro del tejido lesionado. La inflamación prolongada se conoce como inflamación crónica, lo que lleva a un cambio progresivo en el tipo de células presentes en el sitio de la inflamación y se caracteriza por la destrucción y curación simultáneas del tejido del proceso inflamatorio. Las enfermedades inflamatorias pueden ser provocadas, por ejemplo, por quemaduras, irritantes químicos, congelación, toxinas, infecciones por patógenos, lesiones físicas, reacciones inmunitarias debidas a hipersensibilidad, radiación ionizante o cuerpos extraños, como por ejemplo astillas, suciedad y desechos. En algunas realizaciones, la enfermedad inflamatoria es lesión de células epiteliales, hepatitis, obesidad, enfermedad del hígado graso, inflamación del hígado, pancreatitis, enfermedad de Crohn, enfermedad de Crohn fistulizante, colitis ulcerosa, colitis ulcerosa de leve a moderada, colitis ulcerosa de moderada a grave, reservoritis, proctitis, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de injerto contra huésped, artritis reumatoide o psoriasis.
EJEMPLOS
Estos ejemplos se proporcionan únicamente con propósitos ilustrativos y no para limitar el alcance de las reivindicaciones proporcionadas en la presente.
EJEMPLO 1
Expresión de un constructo de administración
En este ejemplo, se describe de manera general la preparación de un constructo de administración como una sola secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia portadora derivada de Cholix, una secuencia espaciadora y una carga útil terapéutica.
Primero, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un constructo de administración de la SEQ ID NO: 15 se amplificó mediante PCR, incorporando pares de enzimas de restricción de sitios Ndel y EcoRI, PstI y PstI, Agel y EcoRI, o PstI y EcoRI en dos extremos de los productos de PCR. Después de la digestión con enzimas de restricción, los productos de PCR se clonaron en un plásmido apropiado para la expresión celular, que se digirió con los pares de enzimas de restricción correspondientes. El plásmido codificó un constructo de administración que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15.
El constructo de administración se expresó de la siguiente manera: se transformaron células competentes de E. coli BL21(DE3) pLysS (Novagen, Madison, WI) usando un método estándar de choque térmico en presencia del plásmido apropiado para generar células de expresión del constructo de administración, seleccionadas en medios que contienen ampicilina, y se aisló y cultivó en caldo Luria-Bertani (Difco; Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.) con antibiótico, luego se indujo la expresión de proteínas mediante la adición de isopropil-D-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM en OD 0,6. Dos horas después de la inducción con IPTG, las células se recogieron por centrifugación a 5000 rpm durante 10 min. Los cuerpos de inclusión se aislaron después de la lisis celular y se lavaron dos veces con agua en una proporción de 1 g/10 ml. El sedimento de la lisis celular se volvió a suspender
con agua seguido de una hora de centrifugación a 10.000 rpm a 4° C. Luego, este lavado se repitió una vez. Los IB doblemente lavados (DWIB) del mismo se solubilizaron en un tampón que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 8,2), HCl de guanidina 6 M y ditiotreitol (DTT) 10 mM. Luego, el material solubilizado se diluyó en un tampón de replegado que contenía Tris 0,1 M (pH = 8,5 a 4° C), L-arginina 1,0 M, glicerol al 10%, L-cisteína 3 mM, cistamina-2HCl 1 mM. La proteína replegada con la SEQ ID NO: 15 se purificó por cromatografía de intercambio aniónico (intercambio aniónico Q sepharose) y cromatografía de filtración en gel Superdex 200 (Amersham Biosciences, Inc., Suecia). La pureza de la proteína se evaluó mediante SDS-PAGE y HPLC analítica (Agilent, Inc. Palo Alto, California).
Se evaluó el constructo de administración para verificar el plegamiento apropiado con respecto a su tamaño molecular anticipado. Después de la inducción, la proteína expresada se recogió de los cuerpos de inclusión. Usando los cuerpos de inclusión, se verificó el grado de expresión del constructo de administración mediante electroforesis en gel y se comparó el peso molecular aparente con la masa calculada.
Los resultados demostraron una producción estable y eficiente de un constructo de administración funcional con alto rendimiento y pureza.
EJEMPLO 2
Modelo in vitro que evalúa el transporte de carga útil a través de monocapas de células epiteliales
Este ejemplo demuestra un modelo in vitro diseñado para evaluar las propiedades de transporte de cargas útiles o constructos de administración descritos en la presente.
La FIG. 1 muestra esquemáticamente una configuración que comprende una cámara apical por encima de la monocapa de células epiteliales y una cámara basal por debajo de dicha monocapa de células epiteliales.
Para la permeabilidad apical a basolateral, se añadieron artículos de prueba (por ejemplo, constructo de administración, carga útil, etc.) al lado apical (A) y se determinó la cantidad de permeación en el lado basolateral (B). Para la permeabilidad basolateral a apical, se añadieron artículos de prueba al lado basolateral (B) y se determinó la cantidad de permeabilidad en el lado apical (A).
Los datos pueden expresarse como permeabilidad (Papp) de acuerdo con la siguiente ecuación: Papp = (dQ/dt)/(C0* A). Q/dt es una tasa de permeación, C0 es la concentración inicial del artículo de prueba y A es el área de la monocapa. Puede calcularse una relación de transporte de salida (Re) de acuerdo con la siguiente ecuación: (Re) = Papp(BA)/Papp(AB). Re >2 puede indicar un sustrato potencial para P-gp u otros transportadores de eflujo activos.
Pueden usarse células SMI-100 o Caco-2 para evaluar la función de transcitosis de un portador o un constructo de administración in vitro.
Para las células Caco-2, se realizó un ensayo ELISA para evaluar la capacidad de un portador o constructo de administración para moverse a través de las monocapas de células Caco-2 mediante transcitosis. Las células Caco-2 (ATCC HTB-37™) se mantuvieron en CO2 al 5% a 37° C en medio completo: medio de Eagle modificado por Dulbecco F12 (DMEM F12) suplementado con suero bovino fetal al 10%, glutamina 2,5 mM, 100 U de penicilina/ml y 100 ug de estreptomicina/ml (Gibco BRL, Grand Island, NY). Las células se alimentaron cada 2 a 3 días con este medio (designado medio completo) y se pasaron cada de 5 a 7 días. Para los ensayos, las células se sembraron en placas de 24 o 96 pocillos y se cultivaron hasta la confluencia.
Las células Caco-2 se cultivaron como monocapas confluentes en soportes transwell de membrana de policarbonato de 0,4-^m de tamaño de poro recubiertos de colágeno (Corning-Costar, Cambridge, MA) y se usaron 18-25 días después de alcanzar una resistencia eléctrica transepitelial (TER) de >250 Q cm2 medido usando un voltímetro de palillo Millicell-ERS® (Millipore). El transporte de apical a basolateral (A^B) de un portador o constructo de administración a través de esta monocapa se determinó midiendo la cantidad de proteína transportada en ciertos puntos temporales (por ejemplo, 15, 30 y 45 minutos) después de 4,7 nM, 23,6 nM y 236 nM de la aplicación apical de constructo de administración a 37° C. Se usaron mediciones de TER y el grado de dextrano fluorescente de 10 kDa (medido usando un protocolo de exclusión por tamaño de HPLC) para verificar las propiedades de barrera de la monocapa durante el curso del estudio. La extensión del transporte del constructo de administración (por ejemplo, SEQ ID NO: 15) se determinó por titulación de los medios recogidos en el ensayo de citotoxicidad basado en células. El constructo de administración transportado se midió mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) uszando anticuerpos (por ejemplo, antiportador o anticarga útil, como un anticuerpos anti-IL-22) para la captura y detención.
Se permitió que las monocapas confluentes de tejidos del intestino delgado humano (SMI-100, MatTek Corporation; Ashland, MA, USA) establecidas en insertos de cultivo celular se estabilizaran durante 24 h a 37° C antes de su uso. Se consideró que solo los insertos que tenían una resistencia eléctrica transepitelial (TEER) de
>400 Q^cm2 tenían suficiente integridad de monocapa para su uso en estudios. Se realizó una verificación secundaria de la integridad de la monocapa evaluando la supresión del transporte de dextrano de 70 kD. Las cámaras se lavaron una vez con tampón de transporte (PBS). Las moléculas de prueba, preparadas a una concentración de 20 pg/ml, se aplicaron a la superficie apical de los insertos en volúmenes de 100 pl. Se reemplazaron volúmenes basolaterales de 500 pl de PBS en cada punto temporal para los estudios de transporte. Cada condición experimental se realizó por triplicado.
EJEMPLO 3
Transporte mediado por portadores de IL-22 a través de células epiteliales intestinales polarizadas
Este ejemplo demuestra que un portador (SEQ ID NO: 7) puede transportar una carga útil de IL-22 (SEQ ID NO: 11) a través de células epiteliales intestinales polarizadas in vitro. Este ejemplo demuestra además que el portador con la SEQ ID NO: 7 puede transportar la carga útil de IL-22 biológicamente activa a través de las células epiteliales intestinales polarizadas y a la lamina propria in vivo.
El transporte del constructo de administración (SEQ ID NO: 15) a través de monocapas de células Caco-2 y tejido epitelial del intestino delgado (también referido en la presente como SMI-100) se probó aplicando el constructo de administración a la membrana apical de las células epiteliales, de acuerdo con el EJEMPLO 2 y como se ilustra en la FIG. 1 para el transporte de apical (A) a basal (B). Los experimentos se realizaron por duplicado y se recogieron muestras de la cámara basolateral a los 15, 30 y 45 minutos después de la aplicación apical para determinar la cantidad de proteína transportada. La cantidad de proteína transcitada se midió usando ensayos ELISA como se describe en el EJEMPLO 2.
Los datos en la FIG. 2 y la FIG. 3 muestran que un portador (SEQ ID NO: 7) cuando se acopla a IL-22 (SEQ ID NO: 11) dio como resultado el transporte de la carga útil de IL-22 a través de monocapas de Caco-2 (FIG.
2) y SMI-100 (FIG. 3) de una manera dependiente del tiempo, y que el constructo de administración dio como resultado que cruzase las células epiteliales aproximadamente 2-3 veces más IL-22 en comparación con una IL-22 (SEQ ID NO: 12, M+ IL-2234'179) solo que no estaba acoplado a un portador.
Para los experimentos in vivo, se probó la transcitosis usando ratas Wistar macho. Se alojaron 3-5 ratas Wistar macho por jaula con un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h y pesaban aproximadamente 225-275 g (aproximadamente 6-8 semanas de edad) cuando se colocaron en el estudio. Los experimentos se realizaron durante la fase de luz usando un protocolo de no recuperación que usa anestesia continua con isoflurano. Se realizó una incisión abdominal de 4-5 cm en la línea media que expuso las regiones del yeyuno medio. Se prepararon soluciones madre a 3,86 x 10-5 M de constructo de administración (SEQ ID NO: 15) en solución salina tamponada con fosfato (PBS), administrándose 50 pl (por rata de 250 g) mediante inyección intraluminal (ILI) usando una aguja de calibre 29. Luego, se marcó el mesenterio del lugar de la inyección con un marcador permanente. Al finalizar el estudio, se aisló y procesó para evaluación microscópica una región de 3-5 mm que capturó el segmento de intestino marcado.
Los resultados de la actividad de transcitosis del constructo de administración (SEQ ID NO: 15) se muestran en la FIG. 4, demostrando que cantidades significativas de carga útil de IL-22 (SEQ ID NO: 11) cruzaron un epitelio intestinal intacto y polarizado in vivo cuando se proporcionó como parte de un constructo de administración que incluye un portador derivado de cholix (SEQ ID NO: 7) acoplado a IL-22. Esta imagen de microscopía muestra el transporte de la carga útil de IL-22 (SEQ ID NO: 11) desde el sitio apical del epitelio intestinal (resaltado por las flechas blancas N° 1) hasta el sitio basal de las células epiteliales (resaltado por la flecha blanca N° 2) y en la lamina propria (abreviada como "1.p.") después de la aplicación luminal del constructo de administración de la SEQ ID NO: 15 al yeyuno de ratas Wistar. La imagen muestra además que la IL-22 interactuó y se unió en gran medida a los receptores de IL-22 localizados en las células dentro de la lamina propria y en la membrana basal externa del epitelio polarizado (resaltado por las flechas blancas N° 3). La localización de IL-22 está indicada por las flechas blancas N°2 y N°3.
EJEMPLO 4
La IL-22 humana recombinante se une a los receptores murinos de IL-22
Este ejemplo demuestra que la IL-22 humana recombinante (rhIL-22, SEQ ID NO: 12) se une a los receptores de IL-22 murinos de una manera dependiente de la dosis comparable a la IL-22 murina recombinante (rmIL-22).
La FIG. 5A demuestra la fosforilación de STAT3 en células B FL83 murinas en función de la concentración de agonista (en pM), en donde el agonista es rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) o rmIL-22. Los datos muestran que rhIL-22 y rmIL-22 indujeron la fosforilación de STAT3 de manera dependiente de la concentración, lo que demuestra que la proteína IL-22 humana puede unirse e inducir la transducción de señales a través de los receptores de IL-22 de
ratón con tanta eficacia como la IL-22 de ratón.
La FIG. 5B demuestra que rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) y rmIL-22 también indujeron la fosforilación de STAT3 en células murinas Hepa1-6.
La FIG. 6A demuestra que rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) y rmIL-22 indujeron la fosforilación de STAT5 en células B FL83 murinas de una manera dependiente de la dosis, lo que demuestra que la proteína IL-22 humana puede unirse e inducir la transducción de señales a través de receptores de IL-22 de ratón con una eficacia comparable a la de la IL-22 de ratón.
La FIG. 6B demuestra que rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) y rmIL-22 también indujeron la fosforilación de STAT5 en células murinas Hepa1-6 pero será necesario realizar un intervalo de dosis adicional en los experimentos de seguimiento.
Estos datos proporcionan una fuerte evidencia de que rhIL-22 (por ejemplo, como se usa en los constructos de administración con las SEQ ID NO: 10 u 11) es capaz de activar STAT3 y STAT5 en células murinas, proporcionando por tanto una justificación para usar tales constructos de administración en modelos murinos para evaluar la actividad y función de IL-22.
EJEMPLO 5
Eficacia in vivo del constructo de administración con la SEQ ID NO: 15 en el modelo de colitis
Este ejemplo demuestra la eficacia in vivo del constructo de administración con SEQ ID NO: 15 que comprende el portador derivado de Cholix de la SEQ ID NO: 7 acoplado a una IL-22 con SEQ ID NO: 11 a través de un conector con SEQ ID NO: 13 en comparación a IL-22 sola (SEQ ID NO: 12) en un modelo de ratón de dextrano sulfato de sodio (DSS).
La FIG. 7A muestra una descripción general de un diseño de estudio in vivo y un cronograma para comparar la administración peroral (p.o.) del constructo de administración de la SEQ ID NO: 15 a dos niveles de dosis una vez al día, 1 mg/kg y 30 mg/kg, y administración una vez al día (intraperitoneal (i.p.)) de rhIL-22 a 4 mg/kg. El estudio in vivo se realizó en ratones C57BL/6 hembra alimentados con comida normal, de 8 a 10 semanas de edad, ~23 g. La colitis se indujo químicamente con dextrano sulfato de sodio (DSS) al 2,5% en agua para beber, ad libitum. Los criterios de valoración del estudio incluyeron el cambio porcentual en el peso corporal, el índice de actividad de la enfermedad, la longitud y el peso del colon y la histopatología.
La FIG. 7B muestra las características de los grupos experimentales y de control usados en el estudio descrito en la FIG. 7A.
La FIG. 8A muestra el porcentaje (%) de cambio en el peso corporal de los animales en el día 10 del estudio con respecto al día 0 de los varios grupos experimentales y de control. El cambio de peso corporal inicial (día 0 frente a 10) por rhIL-22 con SEQ ID NO: 12 o el constructo de administración con SEQ ID NO: 15 con respecto al vehículo no fue significativo según se evaluó por ANOVA de 1 vía. El control de modelo positivo (ciclosporina) CsA fue significativamente diferente con respecto al vehículo según se evaluó mediante un ANOVA de 1 vía.
La FIG. 8B muestra el cambio en el peso corporal de los animales experimentales y de control durante los primeros 10 días de estudio. El peso corporal medio del grupo CsA durante el período de estudio mejoró significativamente con respecto al control de vehículo del día 6 al día 10 según se evaluó mediante ANOVA de 2 vías (*, **, ***) rhIL-22 (i.p.) el peso corporal mejoró significativamente con respecto al control de vehículo en el día 10 según se evaluó por a No VA de 2 vías (*), *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
La FIG. 9 muestra los resultados de los experimentos ELISA en plasma para determinar los niveles en plasma de IL-22. Los resultados muestran que las concentraciones en plasma de rhIL-22 tendieron a aumentar los niveles en plasma después de la administración forzada oral de dosis de 1 y 30 mg/kg del constructo de administración con SEQ ID NO: 15 de manera dependiente de la dosis (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001, Media SEM, n = 2 No tratado, 5 Vehículo, 5 CsA, 10 otros).
Estos datos muestran que el constructo de administración con SEQ ID NO: 15 indujo una tendencia dependiente de la dosis hacia la mejora del peso corporal después de la administración por administración forzada oral. La IL-22 se midió en niveles aumentados en plasma después de la administración forzada oral de dosis de 1 y 30 mg/kg del constructo de administración con SEQ ID NO: 15 de una manera dependiente de la dosis. Estos datos sugieren que el constructo de administración administrado por vía oral con SEQ ID NO: 15 es capaz de reducir los síntomas de colitis en un modelo de ratón DSS comparable a la rhIL-22 administrada i.p.
Además, se evaluaron biomarcadores para el constructo de administración administrable por vía oral con
SEQ ID NO: 15 mediante la administración de rhIL-22 a ratones CD-1 como se describe a continuación.
La FIG. 10A muestra una descripción general de un estudio in vivo de dosis individual diseñado para identificar biomarcadores de acoplamiento al objetivo después de una dosis individual (dosis aguda) de rhIL-22 en ratones sanos CD-1.
La FIG. 10B muestra una descripción general de un estudio in vivo de dosis múltiples (dosificación subcrónica) diseñado para identificar biomarcadores de acoplamiento al objetivo después de dosis individuales y múltiples de rhIL-22 en ratones sanos CD-1.
La FIG. 11A muestra que la administración aguda y subcrónica de rhIL-22 aumenta la concentración de IL-22 consistentemente.
La FIG. 11B muestra algunos parámetros farmacocinéticos medidos durante los experimentos de dosificación aguda y subcrónica descritos en la FIG. 11A.
La FIG. 12A muestra la concentración de proteína C reactiva murina (mCRP) circulante inducida en respuesta a 1 día después de la dosificación aguda de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) y después de 5 días de dosificación subcrónica de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12). Los resultados muestran un aumento dependiente del tiempo en la mCRP circulante en ambos grupos de estudio.
La FIG. 12B muestra el cambio de veces de la concentración de mCRP en plasma 1 día después de la dosificación aguda de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
La FIG. 12C muestra el cambio de veces de la concentración de mCRP en plasma después de 5 días de dosificación subcrónica de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
La FIG. 13A muestra la concentración de proteína A amiloide en suero murina (mSAA) circulante inducida en respuesta a 1 día después de la dosificación aguda de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) y después de 5 días de dosificación subcrónica de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12). Los resultados muestran un aumento dependiente del tiempo en la mSAA circulante en ambos grupos de estudio, con concentraciones en plasma máximas aproximadas aproximadamente 8 horas después de la administración.
La FIG. 13B muestra el cambio de veces de la concentración de mSAA en plasma 1 día después de la dosificación aguda de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
La FIG. 13C muestra el cambio de veces de la concentración de mSAA en plasma después de 5 días de dosificación subcrónica de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
La FIG. 14A muestra la proteína 3pp (derivada de los islotes regeneradores Reg3(6(6) circulante inducida en respuesta a 1 día después de la dosificación aguda de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) y después de 5 días de dosificación subcrónica de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
La FIG. 14B muestra el cambio de veces de la concentración en plasma de Reg3(6(61 día después de la dosificación aguda de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
La FIG. 14C muestra el cambio de veces de la concentración de Reg3(6(6 en plasma después de 5 días de dosificación subcrónica de rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
Estos resultados demuestran que tres biomarcadores potenciales de IL-22 PD de acoplamiento al objetivo: proteína C reactiva (CRP), proteína amiloide en suero A (SAA) y proteína 3pp derivada de islotes regeneradores (Reg3 ¡5p) que pueden usarse en estudios que evalúan la farmacodinámica (PD) de constructos de administración como aquellos con las SEQ ID NO: 15 o 17.
EJEMPLO 6
Solubilización de proteínas
Se volvieron a suspender 627 g de cuerpos de inclusión lavados dos veces (DWIB) de la fermentación de la SEQ ID NO: 15 en 4500 ml de guanidina/HCl 8 M (Gu-HCl) y Tris 50 mM, pH 8,0. Posteriormente, se añadió Tris 50 mM pH 8,5 hasta completar el volumen a 6,0 l. La solución se agitó suavemente en una placa de agitación y se añadieron 9,225 g del agente reductor de ditiotreitol (DTT). La solución de proteína solubilizada final (SEQ ID NO: 15) de 6 l consistía de Gu-HCl 6 M, Tris 50 mM pH 8,0, dTt 10 mM y ~1 g de DWIB/10 ml de tampón. La solución de proteína solubilizada (SEQ ID NO: 15) se incubó a temperatura ambiente (Ta) mientras se agitaba en una placa de agitación magnética y luego se centrifugó a 15970 x g durante 90 minutos a 4° C. El sobrenadante que
comprende la proteína solubilizada se transfirió cuidadosamente a un nuevo recipiente con un volumen total de 5520 ml. La determinación de la concentración de proteína se realizó mediante el ensayo de Bradford y se determinó a 15 mg/ml.
Los datos demuestran que la solubilización de proteínas se puede realizar usando el procedimiento anterior.
EJEMPLO 7
Replegado de proteínas
Este ejemplo demuestra el replegado de proteínas como parte del proceso de purificación como se describe en el diagrama de flujo de FIG. 17.
Se investigó, desarrolló y optimizó cuidadosamente una solución de replegado (FIG. 18). El proceso de optimización utilizó un diseño de experimentos (DOE) de 15 matrices diferentes, 12 variables y 200 reacciones de replegado. Las decisiones se tomaban mediante un proceso de eliminación. La mezcla de replegado inicial (que contiene la solución de replegado inicial y la proteína solubilizada replegada (SEQ ID NO: 15)) se presenta en la TABLA 2. Una mezcla de replegado optimizada (que contiene la solución de replegado optimizada y la proteína solubilizada replegada (SEQ ID NO: 15)) se presenta en la TABLA 3.
TABLA 2 - M z l r l ini i l
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La solución de replegado de 105 l se incubó a 4° C durante 16 horas y luego se filtró a través de un filtro de flujo (AkroPac de Pall Corporation o Sartopore 2XLG de Sartorius) usando una membrana de 0,8/0,2 um y una bomba peristáltica y tubo Cole-Parmer.
La proteína solubilizada (SEQ ID NO: 15) (105 g) del EJEMPLO 6 se añadió a 100 l de una solución de replegado optimizada enfriada previamente a 4° C.
Este proceso se programó a una hora usando una bomba peristáltica Cole-Parmer ajustada a 73 ml/min. Este proceso se llevó a cabo en una cámara frigorífica a 4° C.
La solución tampón de replegado optimizada produjo una mayor cantidad de la SEQ ID NO: 15 con respecto a los agregados de la SEQ ID NO: 15 (FIGS. 19-20). El uso de la solución de replegado inicial produjo aproximadamente el 10%-15% de la SEQ ID NO: 15 replegada correctamente. El uso de la solución de replegado optimizado produjo aproximadamente el 45%-55% de la SEQ ID NO: 15 replegada correctamente.
EJEMPLO 8
Concentración de proteínas e intercambio de tampón por TFF UF/DF
Este ejemplo demuestra la concentración de proteínas y el intercambio de tampón usando filtración de flujo tangencial (TFF) basada en principios de ultrafiltración/diafiltración (UF/DF).
La proteína replegada (por ejemplo, de la SEQ ID NO: 15) se procesó mediante el sistema TFF (Millipore) para concentrarla 10 veces y cambiar el tampón 5 veces. El proceso se realizó por ultrafiltración/diafiltración (UF/DF)
usando cuatro casetes de lámina plana de TFF de 1,14 m2 MWCO Millipore Ultracell Pellican3 de 10 kDa. El tampón de diafiltración consistía en Tris-base 20 mM pH 7,5 y NaCl 100 mM. El volumen final al final del proceso de UF/DF fue de 10 l. Este material se filtró posteriormente usando un sistema de filtración de flujo empleando un filtro AkroPac de 0,8/0,2 um de Pall Corporation y una bomba peristáltica y tubo Cole-Parmer. Se realizó el ensayo de Bradford para determinar la concentración de proteína, el rendimiento y el paso de recuperación. En este punto, se realizó una SEC-HPLC cuantitativa para determinar la cantidad de proteína correctamente plegada con SEQ ID NO: 15 presente en las muestras replegadas y de UF/DF. Se usó un BSA comercialmente disponible de una concentración conocida como estándar de referencia a partir del cual se generó la curva estándar para el ensayo de Bradford. Se usaron el sistema HPLC Agilent 1100 y columnas TSKgel SuperSW3000, 4 pm, 4,6 mm DI x 30,0 cm L (Tosoh Bioscience, 18675). En base a este ensayo cuantitativo, se determinó la eficiencia de replegado.
Los datos muestran que el replegado de proteínas puede realizarse mediante intercambio de tampón y TFF UF/DF.
EJEMPLO 9
Cromatografía de proteínas con la resina NH2-750F® de pasos de captura
Este ejemplo demuestra los pasos de captura en la cromatografía de intercambio aniónico de proteínas usando la resina n H 2-750F®.
Para la cromatografía de proteínas se usaron los sistemas de FPLC AKTA Avant 150 o AKTA Pilot de General Electric (GE). Se usó la resina de intercambio aniónico Tosoh NH2-750F® para empaquetar una columna con una altura de lecho mínima de por lo menos 20 cm y asegurando un volumen de columna que facilitaría una capacidad de unión dinámica de 20-25 g/l. Se usó un tampón de acetato de sodio 20 mM, pH 4,5 o citrato de sodio 20 mM, pH 4,5 para empaquetar la columna. Los tampones usados fueron los siguientes: tampón A: Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 0,5 M; tampón B: Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 2,0 M. Luego, la columna NH2-750F se limpió con una solución de NaOH 0,5 M con un tiempo de contacto de 30 minutos y luego se equilibró con el tampón A durante por lo menos 3 volúmenes de columna (CV), o hasta que el pH y la conductividad alcanzaron líneas estables en los valores esperados (pH 7,5-pH 7,7, ~49 mS/cm /- 1 mS/cm).
Antes de cargarla en la columna, la solución de proteína UF/DF (SEQ ID NO: 15) se suplementó con NaCl 0,4 M añadiendo una solución madre 5 M y se midió la conductividad para garantizar una conductividad de 49 mS/cm /- 2 mS/cm. La solución de proteína (SEQ ID NO: 15) se cargó en la columna con un caudal de un mínimo de 5 minutos de tiempo de residencia en la columna y se recogió el flujo continuo. La columna se lavó con 3 CV de tampón A o hasta que la absorbancia volvió a 280 nm y se mantuvo estable en el valor de referencia, cerca de 0,0 mAU a 280 nm. En este punto, se realizó un gradiente lineal de 20 CV del 0,0-62,5% de B, seguido de un gradiente escalonado hasta el 100% de B para 5 CV adicionales. Las fracciones se recogieron en todo momento y sus volúmenes no eran mayores de 0,5 del volumen de la columna. Las muestras de diferentes fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE usando el sistema de imagenología Bio-Rad ChemiDoc™ MP, y las fracciones que contenían más del 90% de la SEQ ID NO: 15 se agruparon y designaron como grupo NH2-750F. La concentración de proteína del grupo NH2-750F se midió usando Thermo Fisher Nanodrop One™, leyendo la absorbancia a 280 nm (A280) considerando un coeficiente de extinción de 1,22 para la SEQ ID NO: 15 y una relación 260/280 nm <0,6. El grupo NH2-750F contiene aproximadamente 1,0 M de NaCl.
En la FIG. 21A se muestra un cromatograma de ejemplo después de la purificación con NH2-750F de la SEQ ID NO: 15 para una altura de lecho de 20 cm y un volumen de columna de 10 ml y en la FIG. 21B para una altura de lecho de 30 cm y un volumen de columna de 4,6L.
En la TABLA 4 se muestra un resumen de la purificación de NH2-750F para la SEQ ID NO: 15 y en la TABLA 5 para la SEQ ID NO: 14, que generalmente se produjo, replegó y purificó de manera análoga a la SEQ ID NO: 15.
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TABLA - R m n l rifi i n E ID N : 14 NH2-7 F
EJEMPLO 10
Cromatografía de proteínas usando el procedimiento CaPure®
Este ejemplo demuestra un paso de purificación de pulido en la cromatografía de proteínas usando el procedimiento CaPure®.
Para la cromatografía de proteínas de la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 14 se usaron los sistemas de FPLC AKTA Avant 150 o AKTA Pilot de General Electric (GE). Se usó la resina de modo mixto de hidroxiapatita Tosoh CaPure® para empaquetar una columna para cada una de la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 14 con una altura de lecho mínimo de por lo menos 10 cm y asegurando un volumen de columna que facilitaría una capacidad de unión dinámica de un máximo de 20 g/l. Los tampones usados fueron los siguientes para la SEQ ID NO: 15: tampón A: Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 100 mM y CaCb 1 mM; tampón B: fosfato sódico 200 mM pH 7,0, NaCl 100 mM y CaCl21 mM. Para la SEQ ID NO: 14 los tampones usados fueron los siguientes: tampón A: Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 100 mM y CaCb 1 mM; tampón B: fosfato sódico 200 mM pH 7,0, NaCl 100 mM y CaCb 1 mM. Luego cada columna CaPure® se limpió con 0,5 M de NaOH con un tiempo de contacto de 30 minutos o más, y luego se equilibró con el tampón A durante por lo menos 3 volúmenes de columna (CV), o hasta que el pH y la conductividad alcanzaron líneas estables en los valores esperados (pH 7,5- pH 7,7, ~11 mS/cm /- 1 mS/cm). No hubo necesidad de tratar el grupo NH2-750F antes de cargarlo en la columna. Esto redujo significativamente la pérdida de proteínas, el tiempo y los recursos. El grupo NH2-750F se cargó en la columna con un caudal de un mínimo de 5 minutos de tiempo de residencia en la columna y se recogió el flujo continuo. La columna se lavó con 3 CV de tampón A o hasta que la absorbancia volvió a 280 nm y se mantuvo estable en el valor de referencia, cerca de 0,0 mAu. En este punto, se realizó un gradiente lineal de 25 Cv del 0-25% de B, seguido de un gradiente escalonado al 100% de B para 5 CV adicionales. Las fracciones se recogieron en todo momento y sus volúmenes variaron entre 0,36 y 1,43 del volumen de la columna, dependiendo del perfil de elución. Se analizaron las muestras de diferentes fracciones mediante SDS-PAGE usando el sistema de imagenología ChemiDoc™ MP, y las fracciones que contenían más del 95% de la SEQ ID NO: 15 o la SEQ ID NO: 14 se agruparon y designaron como grupo CaPure. La concentración de proteína del grupo CaPure se midió usando Thermo Fisher Nanodrop One™, leyendo la absorbancia a 280 nm (A280) considerando un coeficiente de extinción de 1,22 para la SEQ ID NO: 15 y una relación 260/280 nm <0,6.
En la FIG. 22A se muestra un cromatograma de ejemplo después de la purificación con CaPure® de la SEQ ID NO: 15 para una altura de lecho de 10 cm y un volumen de columna de 5 ml y en la FIG. 22B para una altura de lecho de 21 cm y un volumen de columna de 800 ml.
En la TABLA 6 se meustra un resumen de la purificación por CaPure® para la SEQ ID NO: 15 y en la TABLA 7 para la SEQ ID NO: 14.
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EJEMPLO 11
Concentración de proteínas por TFF UF/DF
Este ejemplo demuestra la formulación de proteínas mediante procedimientos de TFF UF/DF.
El grupo CaPure® se concentró mediante un sistema TFF (Pall Corporation) hasta una concentración final de 20 mg/ml, seguido de un intercambio de tampón de 5 veces. El proceso se realizó por ultrafiltración/diafiltración (UF/DF) utilizando tres casetes de lámina plana de TFF de 0,114 m2 MWCO Millipore Pellican3 de 10 kDa,. El tampón de diafiltración consistía de fosfato sódico 10 mM pH 7,0, NaCl 100 mM. La SEQ ID NO: 15 formulada se filtró posteriormente usando un sistema de filtración de flujo que empleaba un filtro AkroPac de 0,8/0,2 um de Pall Corporation y bomba peristáltica y tubo Cole-Parmer. Luego la SEQ ID NO: 15 formulada se almacenó en alícuotas a -80° C y se realizaron los análisis posteriores para garantizar su calidad biofísica: (1) Concentración de proteína (por ejemplo, SEQ ID NO: 15) a 20 mg/ml midiendo la absorbancia a 280 nm con una relación 260/280 <0,6 usando Thermo Fisher Nanodrop One™ y considerando un coeficiente de extinción de proteínas de 1,22; (2) niveles de endotoxina LAL por debajo de 1,0 Eu/mg medidos por el equipo de Charles River Laboratories; (3) Pureza por SEC-HPLC por encima del 97% de pureza (típicamente >98%) usando la columna TSKgel GW3000SWXL, 5 pm, 7,8 mm DI x 30,0 cm L (Tosoh Bioscience, 8541) (4) análisis de SDS-PAGE usando el gel Bio-Rad aparato y su sistema de imagenología ChemiDoc™ MP asociado.
EJEMPLO 12
Evaluación de la actividad in vivo de moléculas de fusión purificadas
Este ejemplo demuestra métodos para verificar el plegamiento apropiado de las moléculas de fusión con respecto a su capacidad para transportar una carga biológicamente activa a través de un epitelio intacto.
La proteína de fusión con SEQ ID NO: 15 se expresa por E. coli y se recoge de los cuerpos de inclusión y se pliega usando un sistema de tampón de intercambio aleatorio como se describe en el EJEMPLO 8 anterior. El material resultante se purifica de acuerdo con los métodos descritos en el EJEMPLO 9 y el EJEMPLO 10, y como se resume, por ejemplo, en las TABLAS 4-7, dependiendo de las características moleculares de la molécula de fusión. La preparación tiene una pureza de proteína del ~98% en base a SDS PAGE. Las células epiteliales se tratan con la molécula de fusión que tiene la SEQ ID NO: 15 a concentraciones de 25 nM y 250 nM. En comparación con las células emparejadas no tratadas, las células tratadas con la SEQ ID NO: 15 producen una disminución dependiente de la dosis en el número de células según se evaluó por citometría de flujo de células vivas/muertas). Los valores representan n = 4 ± desviación estándar.
EJEMPLO 13
Aumento a escala de la purificación de proteínas de fusión
Este ejemplo demuestra un aumento de escala de un método de purificación usando la proteína de fusión de la SEQ ID NO: 15 (FIGS.7A y 7B).
La proteína de fusión con la SEQ ID NO: 15 se purificó en dos escalas diferentes.
La primera purificación se realizó usando una columna de cromatografía con un volumen de 10 ml empaquetada con resina NH2-750F® y los siguientes parámetros: Altura del lecho: 20 cm, Tiempo de residencia: 5 min (caudal: 2 ml/min), tampón A: Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 0,5 M, tampón B: Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 2 M, y usando el siguiente gradiente: 0,0-62,5% de B para 20 volúmenes de columna (CV). La proteína de fusión con la SEQ ID NO: 15 se obtuvo con una pureza de 93-96%, una recuperación de >71% y niveles de endotoxina
<1,0 UE/mg.
La segunda purificación se llevó a cabo usando una columna de cromatografía con un volumen de 4,6 l empaquetada con resina NH2-750F® y los siguientes parámetros: Altura del lecho: 30 cm, Tiempo de residencia: 11,55 min (caudal: 400 ml/min), tampón A: Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 0,5 M, tampón B: Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 2 M, y usando el siguiente gradiente: 0,0-62,5% de B para 20 volúmenes de columna (CV). La proteína de fusión con la SEQ ID NO: 15 se obtuvo con una pureza del 93-96%, una recuperación de >71% y niveles de endotoxina <1,0 EU/mg.
EJEMPLO 14
Consistencia entre las recuperaciones de los pasos del proceso
El proceso de purificación se llevó a cabo para purificar la proteína de fusión de la SEQ ID NO: 15 cuatro veces (lotes 1-4), y se evaluó la recuperación de esta proteína de fusión después de cada etapa del proceso de purificación (TABLA 8). Hubo un alto grado de consistencia en la recuperación de la proteína de fusión entre estas réplicas.
TABLA 8. Recuperación de la proteína de fusión de la SEQ ID NO: 15 en 4 procesos de purificación re licados
Estos datos demuestran que los métodos y composiciones de la presente divulgación permitieron la producción y purificación de proteína de fusión terapéutica a gran escala, y que los métodos y composiciones divulgados en la presente proporcionaron una alta consistencia durante el aumento de escala.
EJEMPLO 15
Comparación de la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 17
Se realizó cromatografía líquida-espectrofotometría de masas (LC-MS) en composiciones purificadas que representan la SEQ ID NO: 15 y la SeQ ID NO: 17, y los resultados se representan en la FIG. 23B y la FIG. 23a , respectivamente. La composición de la SEQ ID NO: 17 se produjo, replegó y purificó de manera análoga a la descrita anteriormente en relación con la composición de la SEQ ID NO: 15.
EJEMPLO 16
Evaluación in vivo de constructos de administración
Este ejemplo describe una evaluación in vivo de un constructo de administración que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 15 en comparación con el portador.
La FIG. 24 muestra una descripción general del estudio (dosis individual) para evaluar el transporte del constructo de administración que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 15 a través del epitelio intestinal y hacia la circulación después de la administración oral (abreviada en la presente como P.O.) del constructo. Los animales usados en estos experimentos fueron ratones macho CD-1 sin ayuno. Un criterio de valoración principal del estudio fue la exposición plasmática total a IL-22, y un criterio de valoración secundario fueron los biomarcadores plasmáticos, incluida la proteína de unión a IL-22 (por ejemplo, IL-22BP).
TABLA 9 proporciona detalles referentes a la configuración experimental, incluyendo información referente al constructo de administración líquido (no formulado) y el portador. TABLA 9 - Configuración experimental del estudio in vivo
Claims (16)
1. Un constructo de administración que comprende un portador acoplado a una IL-22 humana, en donde el portador consiste de una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 7 o 9.
2. El constructo de administración de la reivindicación 1, en donde la IL-22 humana consiste de una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11.
3. El constructo de administración de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el portador se acopla covalentemente o no covalente a la IL-22 humana.
4. El constructo de administración de la reivindicación 3, en donde el portador se acopla covalentemente a la IL-22 humana a través de un espaciador.
5. El constructo de administración de la reivindicación 4, en donde el espaciador consiste de una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 13
6. El constructo de administración de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el constructo de administración consiste de una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15 o 17.
7. El constructo de administración de la reivindicación 6, en donde el constructo de administración consiste de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15.
8. El constructo de administración de la reivindicación 6, en donde el constructo de administración consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.
9. El constructo de administración de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para su uso en un método para tratar una enfermedad inflamatoria en un sujeto, el método comprendiendo administrar al sujeto una cantidad eficaz de un constructo de administración de cualquiera de las reivindicaciones 1-8.
10. El constructo de administración de la reivindicación 9, en donde la enfermedad inflamatoria es hepatitis, obesidad, enfermedad del hígado graso, inflamación del hígado o pancreatitis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, reservoritis, proctitis, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de injerto contra huésped, artritis reumatoide o psoriasis.
11. El constructo de administración de la reivindicación 10, en donde la enfermedad inflamatoria es la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa.
12. El constructo de administración de la reivindicación 11, en donde la enfermedad inflamatoria es la enfermedad de Crohn.
13. El constructo de administración de la reivindicación 11, en donde la enfermedad inflamatoria es colitis ulcerosa.
14. El constructo de administración de la reivindicación 10, en donde la enfermedad es artritis reumatoide.
15. Un constructo de administración que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15 o la SEQ ID NO: 17, o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 15 o la SEQ ID NO: 17.
16. El constructo de administración de la reivindicación 15, en donde la secuencia de aminoácidos tiene por lo menos un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 15 o la SEQ ID NO: 17.
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Family Cites Families (43)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US4892827A (en) | 1986-09-24 | 1990-01-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects |
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ATE412009T1 (de) * | 2000-08-24 | 2008-11-15 | Genentech Inc | Methode zur inhibierung von il-22 induziertem pap1 |
DE60139959D1 (de) | 2000-11-27 | 2009-10-29 | Powderject Vaccines Inc | Nukleinsäureadjuvantien |
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DK1450855T3 (da) | 2001-05-23 | 2010-01-11 | Duotol Ab | Undertrykkelse af allergiske reaktioner ved hjælp af transdermal indgivelse af allergener i forbindelse med eller konjugeret til toxin-underenheder eller fragmenter deraf |
MXPA05013881A (es) * | 2003-06-23 | 2008-02-13 | Genetics Inst Llc | Anticuerpos contra interleucina-22 y usos de los mismos. |
EP1522585A1 (en) | 2003-10-09 | 2005-04-13 | Plant Research International B.V. | Chimeric carrier molecules for the production of mucosal vaccines |
WO2006135428A2 (en) | 2004-10-04 | 2006-12-21 | Trinity Biosystems, Inc. | Methods and compositions for inducing an immune response against multiple antigens |
JP2008515808A (ja) | 2004-10-04 | 2008-05-15 | トリニティ バイオシステムズ インコーポレーテッド | 針不用の高分子送達のための方法及び組成物 |
CA2631981A1 (en) | 2005-12-05 | 2007-06-14 | Trinity Biosystems, Inc. | Methods and compositions for needleless delivery of binding partners |
WO2008011157A2 (en) * | 2006-07-20 | 2008-01-24 | The General Hospital Corporation | Methods, compositions, and kits for the selective activation of protoxins through combinatorial targeting |
US20090092660A1 (en) | 2006-08-09 | 2009-04-09 | Trinity Biosystems, Inc. | Methods and compositions for needleless delivery of particles |
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CN101361968B (zh) | 2007-08-06 | 2011-08-03 | 健能隆医药技术(上海)有限公司 | 白介素-22在治疗脂肪肝中的应用 |
US20110250199A1 (en) | 2008-06-04 | 2011-10-13 | The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Department.... | Immunotoxins and uses thereof |
KR20170091801A (ko) | 2008-10-02 | 2017-08-09 | 압테보 리서치 앤드 디벨롭먼트 엘엘씨 | Cd86 길항제 다중-표적 결합 단백질 |
KR101741859B1 (ko) * | 2009-06-22 | 2017-06-15 | 암젠 인크 | 화학적으로 조절된 산화환원 상태를 사용한 단백질의 재폴딩 |
CA2768598A1 (en) | 2009-07-22 | 2011-01-27 | Cenix Bioscience Gmbh | Delivery system and conjugates for compound delivery via naturally occurring intracellular transport routes |
WO2011031441A1 (en) | 2009-08-28 | 2011-03-17 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Therapy with a chimeric molecule and a pro-apoptotic agent |
JP6133208B2 (ja) | 2010-09-15 | 2017-05-24 | マースニー, ランドル, ジェイMRSNY, Randall, J | 細菌毒素由来輸送配列を使用する生物活性剤の送達の系および方法 |
CA2825023A1 (en) | 2011-01-26 | 2012-08-02 | Cenix Bioscience Gmbh | Delivery system and conjugates for compound delivery via naturally occurring intracellular transport routes |
CA3070695C (en) | 2011-06-29 | 2024-01-23 | Rani Therapeutics, Llc | Therapeutic agent preparations for delivery into a lumen of the intestinal tract using a swallowable drug delivery device |
ES2676023T3 (es) * | 2013-03-15 | 2018-07-16 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Polipéptidos de IL-22 y proteínas de fusión de IL-22 Fc y métodos de uso |
CN104623637A (zh) | 2013-11-07 | 2015-05-20 | 健能隆医药技术(上海)有限公司 | Il-22二聚体在制备静脉注射药物中的应用 |
US20160287670A1 (en) | 2013-11-07 | 2016-10-06 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Methods of use for il-22 in the treatment of gastrointestinal graft vs. host disease |
EP3080149A1 (en) | 2013-12-13 | 2016-10-19 | Sanofi | Dual glp-1/glucagon receptor agonists |
SG11201604710XA (en) | 2014-01-09 | 2016-07-28 | Sanofi Sa | Stabilized pharmaceutical formulations of insulin analogues and/or insulin derivatives |
CA2948346C (en) | 2014-05-07 | 2023-06-27 | Applied Molecular Transport Llc | Cholix toxin-derived fusion molecules for oral delivery of biologically active cargo |
WO2016064817A1 (en) | 2014-10-22 | 2016-04-28 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders |
US20170362291A1 (en) * | 2014-12-23 | 2017-12-21 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of Improving Yield in Recombinant Protein Production |
EP3192805A1 (en) | 2016-01-15 | 2017-07-19 | Humanitas Mirasole S.p.A. | Inhibitors of t cell activation or stimulation and uses thereof |
US10335459B2 (en) | 2016-06-22 | 2019-07-02 | Alkermes, Inc. | Compositions for modulating IL-10 immunostimulatory and anti-inflammatory properties |
CA3046023A1 (en) | 2016-12-14 | 2018-06-21 | Progenity, Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunosuppressant |
WO2018112264A1 (en) | 2016-12-14 | 2018-06-21 | Progenity Inc. | Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a chemokine/chemokine receptor inhibitor |
PT3762009T (pt) * | 2018-03-08 | 2022-08-22 | Applied Molecular Transport Inc | Construções de administração derivadas de toxinas para administração oral |
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