EA043603B1 - Конструкции для доставки для трансцитоза и связанные способы - Google Patents
Конструкции для доставки для трансцитоза и связанные способы Download PDFInfo
- Publication number
- EA043603B1 EA043603B1 EA202191280 EA043603B1 EA 043603 B1 EA043603 B1 EA 043603B1 EA 202191280 EA202191280 EA 202191280 EA 043603 B1 EA043603 B1 EA 043603B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- leu
- ser
- gly
- ile
- glu
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 60
- 230000031998 transcytosis Effects 0.000 title description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 146
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 146
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 65
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 58
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 57
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 43
- SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N Gly-Ser-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 29
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 23
- 101001010626 Homo sapiens Interleukin-22 Proteins 0.000 claims description 15
- YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N Ser-Gly-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 13
- YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 7
- UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims 4
- 101100505161 Caenorhabditis elegans mel-32 gene Proteins 0.000 claims 1
- RLZBLVSJDFHDBL-KBIXCLLPSA-N Glu-Ala-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O RLZBLVSJDFHDBL-KBIXCLLPSA-N 0.000 claims 1
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 claims 1
- AOILQMZPNLUXCM-AVGNSLFASA-N Val-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN AOILQMZPNLUXCM-AVGNSLFASA-N 0.000 claims 1
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 142
- 108010074109 interleukin-22 Proteins 0.000 description 101
- 102100030703 Interleukin-22 Human genes 0.000 description 97
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 93
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 85
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 60
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 58
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 53
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 49
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 47
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 46
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 46
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 46
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 46
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 39
- 102000034288 naturally occurring fusion proteins Human genes 0.000 description 34
- 108091006048 naturally occurring fusion proteins Proteins 0.000 description 34
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 33
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 32
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 32
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 32
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 25
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 25
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 24
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 24
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 24
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 23
- 230000008859 change Effects 0.000 description 23
- 108010001064 glycyl-glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 23
- 238000013060 ultrafiltration and diafiltration Methods 0.000 description 23
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 21
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 20
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 20
- HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N (2s)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N 0.000 description 19
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 19
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Natural products NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 19
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 18
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 18
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 18
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 17
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 17
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 16
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 16
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 description 15
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 13
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 12
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 12
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 12
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 12
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 11
- 238000013461 design Methods 0.000 description 11
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 11
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 11
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 11
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 11
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 10
- 108010027445 interleukin-22 receptor Proteins 0.000 description 10
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 10
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 10
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 10
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 10
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 9
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 9
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 9
- OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N cystamine Chemical compound CCSSCCN OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229940099500 cystamine Drugs 0.000 description 9
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 9
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 9
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 9
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 9
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 102000004495 STAT3 Transcription Factor Human genes 0.000 description 8
- 108010017324 STAT3 Transcription Factor Proteins 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 8
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 8
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 8
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 8
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 8
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 8
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 8
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 8
- VOUUHEHYSHWUHG-UWVGGRQHSA-N (2s)-2-[[2-[[2-[[2-[[(2s)-2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VOUUHEHYSHWUHG-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 7
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 7
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 7
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 6
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 6
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 6
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 5
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 5
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 102000001712 STAT5 Transcription Factor Human genes 0.000 description 5
- 108010029477 STAT5 Transcription Factor Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- BLFLLBZGZJTVJG-UHFFFAOYSA-N benzocaine Chemical compound CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 BLFLLBZGZJTVJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 239000012538 diafiltration buffer Substances 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 5
- MXHCPCSDRGLRER-UHFFFAOYSA-N pentaglycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O MXHCPCSDRGLRER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 description 4
- 102100032752 C-reactive protein Human genes 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- HHWQMFIGMMOVFK-WDSKDSINSA-N Gln-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O HHWQMFIGMMOVFK-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 4
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 4
- 208000002389 Pouchitis Diseases 0.000 description 4
- 206010036774 Proctitis Diseases 0.000 description 4
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 4
- 102000054727 Serum Amyloid A Human genes 0.000 description 4
- 108010076324 alanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000013400 design of experiment Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 208000010706 fatty liver disease Diseases 0.000 description 4
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 4
- 208000018191 liver inflammation Diseases 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 4
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 4
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 4
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 4
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 4
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 4
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NULDEVQACXJZLL-UHFFFAOYSA-N 2-(2-aminoethyldisulfanyl)ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCSSCCN NULDEVQACXJZLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 2-acetamido-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC(=O)NC(CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- BRCVLJZIIFBSPF-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ala-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N BRCVLJZIIFBSPF-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 102100022703 Interleukin-22 receptor subunit alpha-2 Human genes 0.000 description 3
- 101710191556 Interleukin-22 receptor subunit alpha-2 Proteins 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 3
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- -1 therapeutic antibody Proteins 0.000 description 3
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 3
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 2
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 2
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N Glu-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 2
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700012368 REG3B Proteins 0.000 description 2
- 108700028909 Serum Amyloid A Proteins 0.000 description 2
- 101710190759 Serum amyloid A protein Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 2
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 2
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 229960003589 arginine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 2
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 2
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 2
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009266 disease activity Effects 0.000 description 2
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 2
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 2
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000001799 protein solubilization Methods 0.000 description 2
- 230000007925 protein solubilization Effects 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 235000000891 standard diet Nutrition 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 1
- BUANFPRKJKJSRR-ACZMJKKPSA-N Ala-Ala-Gln Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CCC(N)=O BUANFPRKJKJSRR-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- HHRAXZAYZFFRAM-CIUDSAMLSA-N Ala-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HHRAXZAYZFFRAM-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- CYBJZLQSUJEMAS-LFSVMHDDSA-N Ala-Phe-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](C)N)O CYBJZLQSUJEMAS-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- FLYANDHDFRGGTM-PYJNHQTQSA-N Arg-Ile-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N FLYANDHDFRGGTM-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 1
- PQKSVQSMTHPRIB-ZKWXMUAHSA-N Asn-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PQKSVQSMTHPRIB-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- PDECQIHABNQRHN-GUBZILKMSA-N Asp-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O PDECQIHABNQRHN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- SPWXXPFDTMYTRI-IUKAMOBKSA-N Asp-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SPWXXPFDTMYTRI-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 229910014497 Ca10(PO4)6(OH)2 Inorganic materials 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001453550 Carige Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- WYVKPHCYMTWUCW-YUPRTTJUSA-N Cys-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O WYVKPHCYMTWUCW-YUPRTTJUSA-N 0.000 description 1
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 1
- 102100031334 Elongation factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 208000001034 Frostbite Diseases 0.000 description 1
- 102100033925 GS homeobox 1 Human genes 0.000 description 1
- BETSEXMYBWCDAE-SZMVWBNQSA-N Gln-Trp-Lys Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N BETSEXMYBWCDAE-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- OJGLIOXAKGFFDW-SRVKXCTJSA-N Glu-Arg-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N OJGLIOXAKGFFDW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N Glu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 1
- XHVONGZZVUUORG-WEDXCCLWSA-N Gly-Thr-Lys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN XHVONGZZVUUORG-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- 101001068303 Homo sapiens GS homeobox 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001003149 Homo sapiens Interleukin-10 receptor subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101001044883 Homo sapiens Interleukin-22 receptor subunit alpha-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 208000015580 Increased body weight Diseases 0.000 description 1
- 102100020788 Interleukin-10 receptor subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 102100022723 Interleukin-22 receptor subunit alpha-1 Human genes 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- NLOZZWJNIKKYSC-WDSOQIARSA-N Lys-Arg-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 NLOZZWJNIKKYSC-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- GCMWRRQAKQXDED-IUCAKERBSA-N Lys-Glu-Gly Chemical compound [NH3+]CCCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CCC([O-])=O)C(=O)NCC([O-])=O GCMWRRQAKQXDED-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- HGAJNEWOUHDUMZ-SRVKXCTJSA-N Met-Leu-Glu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O HGAJNEWOUHDUMZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- FSTWDRPCQQUJIT-NHCYSSNCSA-N Met-Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N FSTWDRPCQQUJIT-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010077519 Peptide Elongation Factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 229920002319 Poly(methyl acrylate) Polymers 0.000 description 1
- UIUWGMRJTWHIJZ-ULQDDVLXSA-N Pro-Tyr-Lys Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O UIUWGMRJTWHIJZ-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- 108010003201 RGH 0205 Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- VQBLHWSPVYYZTB-DCAQKATOSA-N Ser-Arg-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CO)N VQBLHWSPVYYZTB-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- UHBPFYOQQPFKQR-JHEQGTHGSA-N Thr-Gln-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O UHBPFYOQQPFKQR-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- CQNFRKAKGDSJFR-NUMRIWBASA-N Thr-Glu-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N)O CQNFRKAKGDSJFR-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- VTVVYQOXJCZVEB-WDCWCFNPSA-N Thr-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VTVVYQOXJCZVEB-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- CYCGARJWIQWPQM-YJRXYDGGSA-N Thr-Tyr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 CYCGARJWIQWPQM-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 1
- 102000000591 Tight Junction Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010002321 Tight Junction Proteins Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 208000037979 autoimmune inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004082 barrier epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000005889 cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000002561 chemical irritant Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003749 cleanliness Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000002337 electrophoretic mobility shift assay Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 230000004890 epithelial barrier function Effects 0.000 description 1
- 208000037888 epithelial cell injury Diseases 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000000556 factor analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 108010092114 histidylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000001630 jejunum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 230000015100 lysosomal transport Effects 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 235000020925 non fasting Nutrition 0.000 description 1
- 230000001473 noxious effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 210000001578 tight junction Anatomy 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229940045136 urea Drugs 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Description
Перекрестная ссылка на родственные заявки
Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США № 62/756889, поданной 7 ноября 2018 г., предварительной заявки на патент США № 62/888133, поданной 16 августа 2019 г., и предварительной заявки на патент США № 62/888238, поданной 16 августа, 2019 г., международной заявки № PCT/US 2019/050708, поданной 11 сентября 2019 г., и международной заявки № PCT/US 2019/021474, поданной 8 марта 2019 г., данные заявки в полном объеме включены здесь посредством ссылки.
Уровень техники
Кишечный эпителий мешает пероральному введению крупных терапевтических молекул, таких как белки, поскольку белки не могут диффундировать через неповрежденный эпителиальный барьер или преодолевать барьер через плотные соединения. Будучи захваченным эпителиальной клеткой, терапевтический белок может поступить на деструктивный лизосомальный транспортный путь или может высвобождаться обратно в просвет кишечника. Такая неспособность легко переноситься через эпителий кишечника может представлять собой ограничивающий фактор при разработке коммерчески перспективных пероральных композиций, особенно для терапевтических средств на основе полипептидов.
Парентеральное введение, такое как внутривенное или подкожное введение, может служить решением данной проблемы, но при этих путях введения часто могут возникнуть значительные побочные эффекты, снижение терапевтической эффективности и снижение удобства для пациента, что может отрицательно повлиять на соблюдение режима лечения. Существует потребность в улучшенных композициях и способах транспорта терапевтических средств через эпителий, например эпителий кишечника.
Кроме того, очистка и рефолдинг биологически активных полипептидов с целью получения правильно свернутых, биологически активных и стабильных полипептидов с высокими выходами и с низким уровнем эндотоксинов по-прежнему считается одним из наиболее сложных аспектов для экономичного и ресурсоэффективного производства биологических терапевтических средств (например, полипептидов). Таким образом, также существует потребность в усовершенствованных способах получения (ферментация, рефолдинг, очистка и формуляция) таких биологически активных молекул.
Сущность изобретения
В различных аспектах настоящее изобретение относится к конструкции для доставки, содержащей аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 17, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, 95% или 99% идентичность последовательности с ней.
В различных аспектах настоящее изобретение относится к конструкции для доставки, содержащей носитель, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 9. В некоторых случаях носитель связан с гетерологичной полезной нагрузкой. В некоторых случаях гетерологичной полезной нагрузкой является человеческий IL-22. В некоторых случаях человеческий IL22 состоит из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 11. В некоторых случаях носитель ковалентно или нековалентно связан с IL-22. В некоторых случаях носитель ковалентно связан с IL-22 через спейсер. В некоторых случаях спейсер состоит из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 13. В некоторых случаях конструкция для доставки состоит из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 17.
Настоящее изобретение относится к способу лечения воспалительного заболевания у субъекта, включающему введение субъекту эффективного количества конструкции для доставки, описанной здесь (например, SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 17). В некоторых случаях воспалительное заболевание представляет собой гепатит, ожирение, жировую болезнь печени, воспаление печени или панкреатит, болезнь Крона, язвенный колит, поухит, проктит, рассеянный склероз, системную красную волчанку, синдром трансплантат против хозяина», ревматоидный артрит или псориаз. В некоторых случаях заболевание представляет собой болезнь Крона или язвенный колит.
В данном документе, в некоторых вариантах осуществления, описаны способы получения очищенного, не встречающегося в природе слитого белка, где способ включает проведение анионообменной хроматографии на смеси, содержащей не встречающийся в природе слитый белок, с получением первой фракции, содержащей не встречающийся в природе слитый белок; где не встречающийся в природе слитый белок включает IL-22 и носитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения проведение анионообменной хроматографии включает связывание не встречающегося в природе слитого белка с анионообменной смолой и обеспечение возрастающего солевого градиента для последующего элюирования не встречающегося в природе слитого белка с получением первой фракции. В некоторых вариантах осуществления проведение анионообменной хроматографии включает контактирование смеси со смолой, содержащей гранулы полиметакрилата, функционализированного амином. В некоторых вариантах осуществления смола представляет собой смолу NH2-750F.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает рефолдинг не встречающегося в природе слитого белка перед проведением анионообменной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления рефолдинг не встречающегося в природе слитого белка включает контактирование белка, солюбилизированного хаотропным агентом из телец включения, с раствором для рефолдинга, где раствор для рефолдинга содержит: аргинин (от 0,75 М до 1,25 М); глицерин (от 2 до 20% об./об.); цисте
- 1 043603 ин (от 0,5 до 10 мМ); и цистамин (от 0,2 до 10 мМ); где раствор для рефолдинга имеет pH от 7,5 до 8,5. В некоторых вариантах осуществления аргинин присутствует в растворе для рефолдинга в концентрации от 0,9 М до 1,1 М; глицерин присутствует в растворе для рефолдинга в концентрации от 7% до 13% (мас./мас); цистеин присутствует в растворе для рефолдинга в концентрации от 1,5 до 6 мМ; цистамин присутствует в растворе для рефолдинга в концентрации от 0,6 до 3 мМ; и раствор для рефолдинга имеет pH от 7,8 до 8,2.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает подвергание образца, содержащего первую фракцию, обработке на гидроксиапатитовой смоле с получением второй фракции, содержащей не встречающийся в природе слитый белок. В некоторых вариантах осуществления гидроксиапатитовая смола представляет собой гидроксиапатитовую смолу CaPure. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает проведение катионообменной хроматографии на образце, содержащем первую фракцию. В некоторых вариантах осуществления проведение катионообменной хроматографии включает контактирование образца, содержащего первую фракцию, со смолой, содержащей гранулы полиметакрилата, функционализированного сульфатными группами. В некоторых вариантах осуществления смола представляет собой смолу TOYOPEARL Sulfate-650F.
В некоторых вариантах осуществления изобретения при контакте с клеткой носитель способствует эндоцитозу или трансцитозу неприродного слитого белка. В некоторых вариантах осуществления изобретения при контакте с клеткой носитель способствует трансцитозу неприродного слитого белка. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой эпителиальную клетку кишечника. В некоторых вариантах осуществления эпителиальная клетка кишечника представляет собой поляризованную эпителиальную клетку кишечника. В некоторых вариантах осуществления носитель представляет собой усеченный вариант встречающегося в природе или не встречающего в природе полипептида Cholix. В некоторых вариантах осуществления носитель имеет по меньшей мере 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с любой из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 22 или 23. В некоторых вариантах осуществления не встречающийся в природе слитый белок имеет по меньшей мере 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с последовательностью любой из SEQ ID NO: 14-21. В некоторых вариантах осуществления IL-22 имеет по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательности с любой из SEQ ID NO: 10, 11 или 12.
В некоторых вариантах осуществления носитель сам имеет первую изоэлектрическую точку (pI), и IL-22 сам имеет вторую изоэлектрическую точку, где первая изоэлектрическая точка по меньшей мере на 1 единицу pH, по меньшей мере на 1,5 единицы pH, по меньшей мере на 1,7 единицы pH или, по меньшей мере на 2 единицы pH ниже второй изоэлектрической точки. Например, в некоторых вариантах осуществления носитель имеет pI от 4,8 до 5,4, от 4,9 до 5,3, от 5,0 до 5,2, например pI около 5,1. В некоторых вариантах осуществления изобретения pI IL-22 составляет примерно от 6,8 до 7,4, например, примерно от 6,9 до 7,3, примерно от 7,0 до 7,2, например, примерно 7,1. В некоторых вариантах осуществления не встречающийся в природе слитый белок получают любым из способов, описанных здесь.
В некоторых вариантах осуществления здесь описаны способы рефолдинга неприродного слитого белка, содержащего носитель и IL-22, где способ включает: (i) контактирование телец включения, содержащих неприродный слитый белок, с раствором для солюбилизации, содержащем хаотропный агент, с получением растворимого не встречающегося в природе слитого белка; (iii) контактирование неприродного слитого белка с раствором для рефолдинга, где раствор для рефолдинга содержит: аргинин (от 0,75 М до 1,25 М); глицерин (от 2 до 20% об./об.); цистеин (от 0,5 мМ до 10 мМ); и цистамин (от 0,2 мМ до 10 мМ); где раствор для рефолдинга имеет pH от 7,5 до 8,5.
В некоторых вариантах осуществления аргинин присутствует в растворе для рефолдинга в концентрации от 0,9 М до 1,1 М; глицерин присутствует в растворе для рефолдинга в концентрации от 7 до 13% (мас./мас); цистеин присутствует в растворе для рефолдинга в концентрации от 1,5 до 6 мМ; цистамин присутствует в растворе для рефолдинга в концентрации от 0,6 до 3 мМ и раствор для рефолдинга имеет pH от 7,8 до 8,2.
Включение ссылок
Все публикации, патенты и заявки на патенты, упомянутые здесь, включены здесь посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент были специально и индивидуально указаны для включения посредством ссылки.
Краткое описание фигур
Новые признаки изобретения подробно изложены в прилагаемой формуле изобретения. Лучшее понимание признаков и преимуществ настоящего изобретения будет получено при обращении к следующему подробному описанию, где излагаются иллюстративные варианты осуществления, в которых используются принципы раскрытия, и прилагаемым фигурам, где:
На фиг. 1 схематически показано устройство, содержащее апикальную камеру над монослоем эпителиальных клеток и базальную камеру под монослоем таких эпителиальных клеток. Для апикальной и базолатеральной проницаемости тестируемые объекты (например, конструкции для доставки, полезные нагрузки и т. д.) наносили на апикальную (A) сторону, и количество проникающего (например, трансци
- 2 043603 тозированного) материала определяли на базолатеральной (B) стороне.
На фиг. 2 показано, что конструкция для доставки (SEQ ID NO: 15), которая включает носитель (SEQ ID NO: 7), связанный с IL-22 (SeQ ID NO: 11) через спейсер (SEQ ID NO: 13), транспортировала полезную нагрузку IL-22 через интактные монослои поляризованных эпителиальных клеток кишечника Caco-2 в зависимости от времени (количество белка на базолатеральной стороне измеряли через 15, 30 и 45 мин после того, как конструкцию для доставки наносили на базальную мембрану монослоя, как показано выше на фиг. 1). Данные также показывают, что когда конструкцию для доставки с носителем SEQ ID NO: 7 и IL-22 (SEQ ID NO: 11) наносили на эпителиальные клетки Caco-2, то примерно в 2-3 раза больше IL-22 пересекало монослой эпителиальных клеток Caco-2 по сравнению с тем, когда IL-22 (SEQ ID NO: 12) не был связан с носителем.
На фиг. 3 показано, что конструкция для доставки (SEQ ID NO: 15) приводила к транспорту IL-22 (SEQ ID NO: 11) через монослои интактных и поляризованных эпителиальных клеток кишечника SMI100 в зависимости от времени (количество белка в базолатеральной камере измеряли через 15, 30 и 45 мин после нанесения конструкции для доставки на базальную мембрану монослоя). Данные также показывают, что когда конструкцию для доставки, включающую носитель с SEQ ID NO: 7, связанный с IL-22 (SEQ ID NO: 11), наносили на эпителиальные клетки SMI-100, то примерно в 2-3 раза больше IL-22 пересекало через монослой эпителиальных клеток SMI-100 по сравнению с тем, когда IL-22 (SEQ ID NO: 12) не был связан с носителем.
На фиг. 4 показано, что конструкция для доставки (SEQ ID NO: 15), включающая носитель (SEQ ID NO: 7), связанный с IL-22 (SEQ ID NO: 11) через спейсер (SEQ ID NO: 13), приводила к транспорту IL-22 в значительных количествах через интактный и поляризованный эпителий кишечника in vivo. Апикальная сторона эпителия кишечника выделена белой стрелкой № 1. Собственная пластинка сокращенно обозначается как 1 .р. Наружная базальная мембрана поляризованного эпителия выделена белой стрелкой № 2. Локализация IL-22 показана белой стрелкой № 3).
На фиг. 5A показано фосфорилирование STAT3 в мышиных В-клетках FL83 как функция концентрации агониста (в пМ), где агонист представляет собой рекомбинантный человеческий IL-22 (rhIL-22, SEQ ID NO: 12) или рекомбинантный мышиный IL-22 (rmIL-22);
MAVLQKSMSF SLMGTL AASCLLLIALWAQE
ANALPVNTRCKLEVSNFQQPYIVNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFRGVSAKDQ CYLMKQVLNFTLEDVLLPQSDRFQPYMQEVVPFLTKLSNQLSSCHISGDDQNIQKNVRR LKETVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACV (SEQ ID NO: 30)).
Данные показывают, что rhIL-22 и rmIL-22 индуцируют фосфорилирование STAT3 в зависимости от концентрации, демонстрируя, что человеческий белок IL-22 может связываться и индуцировать передачу сигнала через рецепторы мышиного IL-22 так же эффективно, как и мышиный IL-22.
На фиг. 5B показано, что rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) и rmIL-22 также индуцировали фосфорилирование STAT3 в мышиных клетках Hepa1-6.
На фиг. 6A показано, что rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) и rmIL-22 индуцируют фосфорилирование STAT5 в мышиных В-клетках FL83 дозозависимым образом, демонстрируя, что человеческий белок IL22 может связываться и индуцировать передачу сигнала через рецепторы мышиного IL-22 так же эффективно, как и мышиный IL-22.
На фиг. 6B показано, что rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) и rmIL-22 также индуцировали фосфорилирование STAT5 в мышиных клетках Hepa1-6.
На фиг. 7A представлен дизайн и временной график исследования in vivo с целью сравнения перорального (п/о) введения конструкции для доставки с SEQ ID NO: 15 в двух дозах, 1 мг/кг и 30 мг/кг, один раз в сутки и при введении rhIL-22 внутрибрюшинно (в/б) в дозе 4 мг/кг один раз в сутки. Исследование in vivo проводили на самках мышей C57BL/6 в возрасте 8-10 недель, получавших стандартный корм, с массой тела ~ 23 г. Колит индуцировали химически с использованием 2,5% натрия декстрана сульфата (DSS) в питьевой воде, которую предоставляли животным ad libitum. Конечные точки исследования включали процентное изменение массы тела, индекса активности заболевания, длины и массы толстого кишечника, и данные гистопатологии.
На фиг. 7B показаны характеристики экспериментальной и контрольной групп, использованных в исследовании, показанном на фиг. 7A.
На фиг. 8A показано изменение массы тела животных в процентах (%) на сутки 10 исследования относительно с сутками 0 в различных опытных и контрольных группах. Изменение массы тела относительно исходного периода (сутки 0 против суток 10) для rhIL-22 с SEQ ID NO: 12 или конструкции для доставки с SEQ ID NO: 15 в сравнении с носителем не было статистически значимым при оценке однофакторным дисперсионным анализом. Положительный модельный контроль (циклоспорин) CsA достоверно отличался от носителя при оценке однофакторным дисперсионным анализом.
На фиг. 8B показано изменение массы тела опытных и контрольных животных в течение первых 10 суток исследования. Средняя масса тела в группе с CsA за период исследования была достоверно выше по сравнению с контрольным носителем в период с суток 6 по сутки 10, при оценке двухфакторным дисперсионным анализом (*, **, ***). Масса тела с rhIL-22 (в/б) была достоверно выше относительно кон- 3 043603 трольного носителя на сутки 10 при оценке двухфакторным дисперсионным анализом (*), *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
На фиг. 9 приведены результаты анализа плазмы с использованием ELISA для определения уровней IL-22 в плазме. Результаты показывают, что концентрации rhIL-22 в плазме имеют тенденцию к повышению в плазме после перорального введения доз 1 и 30 мг/кг конструкции для доставки с SEQ ID NO: 15 в зависимости от дозы (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. ****p<0,0001; среднее ± SEM; n=2 наивные, 5 носитель, 5 CsA, 10 другие).
На фиг. 10A показан дизайн исследования с введением однократной дозы in vivo, разработанный для идентификации биомаркера(ов) взаимодействия с мишенью после однократного (острого введения) rhIL-22 у здоровых мышей CD-1.
На фиг. 10B показан дизайн исследования in vivo с введением многократных доз (субхроническое введение), разработанный для идентификации биомаркера(ов) взаимодействия с мишенью после введения однократной дозы и многократных доз rhIL-22 у здоровых мышей CD-1.
На фиг. 11A показано, что острое и субхроническое введение rhIL-22 приводило к последовательному повышению концентрации IL-22.
На фиг. 11B приведены некоторые фармакокинетические параметры, определенные в экспериментах с острым и субхроническим введением, описанных на фиг. 11A.
На фиг. 12A показана ответная индуцированная концентрация циркулирующего мышиного Cреактивного белка (mCRP) на сутки 1 после острого введения rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) и через 5 суток субхронического введения rhIL-22 (SEQ ID NO: 12). Результаты показывают зависимое от времени увеличение циркулирующего mCRP в обеих опытных группах.
На фиг. 12B показано кратное изменение концентрации mCRP в плазме на 1 сутки после острого введения rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
На фиг. 12C показано кратное изменение концентрации mCRP в плазме через 5 суток субхронического введения rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
На фиг. 13A показана ответная индуцированная концентрация циркулирующего белка амилоида A (mSAA) в мышиной сыворотке на 1 сутки после однократного введения rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) и через 5 суток субхронического введения rhIL-22 (SEQ ID NO: 12). Результаты показывают зависимое от времени повышение циркулирующего mSAA в обеих опытных группах с примерными максимальными концентрациями в плазме примерно через 8 ч после введения.
На фиг. 13B показано кратное изменение концентрации mSAA в плазме на 1 сутки после острого введения rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
На фиг. 13C показывает кратное изменение концентрации mSAA в плазме через 5 суток субхронического введения rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
На фиг. 14A показана ответная индуцированная концентрация циркулирующего регенерирующего белка из островков Лангерганса 3e(Reg3β) на 1 сутки после острого введения rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) и через 5 суток субхронического введения rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
На фиг. 14B показано кратное изменение концентрации Reg3e в плазме на 1 сутки после однократного введения rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
На фиг. 14C показано кратное изменение концентрации Reg3e в плазме через 5 суток субхронического введения rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
На фиг. 15 приведена блок-схема, показывающая, как улучшенная технологичность может сделать возможным перевод в клинику.
На фиг. 16 показано, что SEQ ID NO: 15 представляет собой гетерологичный слитый белок, содержащий домен носителя (SEQ ID NO: 7), связанный через спейсер (SEQ ID NO: 13) с интерлейкином-22 (IL-22, SEQ ID NO: 11). Гетерологичные слитые белки могут быть выделены в тельцах включения (IB) E. coli и, таким образом, требуется рефолдинг и/или очистка.
На фиг. 17 приведена блок-схема, обобщающая рефолдинг, очистку и формуляцию гетерологичных слитых белков, описанных здесь, например, таких как SEQ ID NO: 14-21, и слитых белков, содержащих носитель с SEQ ID NO: 1-9, 22, или 23.
На фиг. 18 показана итеративная оптимизация с целью повышения эффективности рефолдинга конструкции SEQ ID NO: 15.
На фиг. 19 приведена хроматограмма, полученная эксклюзионной хроматографией (SEC), показывающая сигнал оптимизированного повторно свернутого белка (SEQ ID NO: 15) и белковых агрегатов, имеющих более высокие молекулярные массы и, следовательно, более низкие значения времени удерживания.
На фиг. 20 приведен типичный SDS-PAGE начального и оптимизированного повторно свернутого белка (SEQ ID NO: 15).
На фиг. 21A-21B приведена хроматограмма, полученная эксклюзионный хроматографией, после очистки SEQ ID NO: 15 на первой колонке с использованием анионообменной смолы NH2-750F. На фиг. 21A приведена хроматограмма, полученная эксклюзионный хроматографией, после очистки SEQ ID NO:
- 4 043603 на первой колонке с использованием анионообменной смолы NH2-750F с объемом колонки 10 мл и высотой слоя 20 см. На фиг. 21B приведена хроматограмма, полученная эксклюзионный хроматографией, после очистки SEQ ID NO: 15 на первой колонке с использованием анионообменной смолы NH2-750F с объемом колонки 4,6 л и высотой слоя 30 см.
На фиг. 21A-21B приведена хроматограмма, полученная эксклюзионный хроматографией, после очистки SEQ ID NO: 15 на первой колонке с использованием анионообменной смолы NH2-750F. На фиг. 21A приведена хроматограмма, полученная эксклюзионный хроматографией, после очистки SEQ ID NO: 15 на первой колонке с использованием анионообменной смолы NH2-750F с объемом колонки 10 мл и высотой слоя 20 см. На фиг. 21B приведена хроматограмма, полученная эксклюзионный хроматографией, после очистки SEQ ID NO: 15 на первой колонке с использованием анионообменной смолы NH2-750F с объемом колонки 4,6 л и высотой слоя 30 см.
На фиг. 22A-22B приведена хроматограмма, полученная эксклюзионной хроматографией, после очистки SEQ ID NO: 15 на второй колонке с использованием гидроксиапатитовой смолы CaPure®. На фиг. 22A приведена хроматограмма, полученная эксклюзионный хроматографией, после очистки SEQ ID NO: 15 на второй колонке с использованием гидроксиапатитовой смолы Ca++ Pure с объемом колонки 5 мл, высотой слоя 10 см и градиентом 0-25% B, 25C. На фиг. 22B приведена хроматограмма, полученная эксклюзионный хроматографией, после очистки SEQ ID NO: 15 на второй колонке с использованием гидроксиапатитовой смолы CaPure® с объемом колонки 800 мл, высотой слоя 21 см и градиентом 0-25% B, 25CV. Для каждой фигуры приведен соответствующий SDS-PAGE образцов из различных фракций, элюированных со смолы CaPure®.
На фиг. 23A-23B приведена хроматограмма, полученная жидкостной хроматографией-массспектрофотометрией (ЖХ-МС), после очистки гетерологичных слитых белков. На фиг. 23A приведена хроматограмма, полученная ЖХ-МС, SEQ ID NO: 17. Пик 1 соответствует правильно повторно свернутому белку SEQ ID NO: 17. На фиг. 23B приведена хроматограмма, полученная ЖХ-МС, белка SEQ ID NO: 15. Пик 1 соответствует скорректированному повторно свернутому белку SEQ ID NO: 15. Пик 2 соответствует белку SEQ ID NO: 15 с отщепленным концевым метионином (показано в SEQ ID NO: 20). Пик 3 соответствует SEQ ID NO: 15 с отщепленным концевым метионином (показано в SEQ ID NO: 20) и ацетилированием полученной N-концевой аминокислоты.
На фиг. 24 приведен дизайн исследования, использованный в примере 16, для оценки транспорта конструкции для доставки, имеющей последовательность SEQ ID NO: 15, через эпителий кишечника и в кровоток после пероральной (сокращенно обозначается здесь как P.O.) доставки конструкции.
На фиг. 25A-25B приведены графики, показывающие концентрацию IL-22 в плазме как функцию времени после введения конструкции для доставки SEQ ID NO: 15. На фиг. 25A показана общая концентрация IL-22 в плазме как функцию времени после введения конструкции для доставки SEQ ID NO: 15. На фиг. 25B показана концентрация IL-22BP в плазме как функцию времени после введения конструкции для доставки SEQ ID NO: 15.
На фиг. 26A (носитель) и фиг. 26B (SEQ ID NO: 15) представляют собой графики, показывающие концентрацию IL-22 в плазме как функцию времени у отдельных мышей.
На фиг. 27A-27D показано, что длина спейсера и соединение полезной нагрузки с N- или C-концом носителя не оказывало существенного влияния на биологическую активность полезной нагрузки. На фиг. 27A показано, что длина различных аминокислотных спейсеров не влияло на индукцию димеризации рецептора IL-22. На фиг. 27B показано, что соединение полезной нагрузки IL-22 с N- или C-концом носителя не влияло на индукцию димеризации IL-22. На фиг. 27C показано, что длина различных аминокислотных спейсеров не влияло на индукцию активации pSTAT3. На фиг. 27D показано, что соединение полезной нагрузки IL-22 с N- или C-концом носителя не влияло на индукцию активации pSTAT3.
Подробное описание изобретения
В настоящем раскрытии описаны не встречающиеся в природе слитые белки (например, конструкции для доставки, способные транспортировать одну или более гетерологичных молекул полезной нагрузки) и способы рефолдинга и очистки не встречающихся в природе слитых белков. Например, не встречающийся в природе слитый белок может представлять собой конструкцию для доставки IL-22, описанную здесь.
Представленные ниже термины приведены для иллюстрации значений терминов, используемых в данном описании, в дополнение к пониманию этих терминов специалистами в данной области техники. Как здесь используется по тексту и в прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают в себя множественные ссылки, если контекст явно не диктует иное. Кроме того, следует отметить, что формула изобретения может быть составлена таким образом, чтобы исключить любой необязательный элемент. Таким образом, данное утверждение предназначено для использования в качестве предшествующей основы для использования такой исключительной терминологии, как исключительно, только и т.п. в связи с перечислением элементов формулы изобретения или использованием отрицательного ограничения.
Некоторые диапазоны или числа представлены здесь с числовыми значениями, которым предшест- 5 043603 вует термин примерно. В рамках настоящего изобретения, термин примерно означает плюс или минус 1%, 2%, 3%, 4% или 5% от числа, к которому относится этот термин. В контексте настоящего описания термины субъект и индивидуум используются взаимозаменяемо и могут означать любое животное, включая млекопитающих (например, человека или животное, не являющееся человеком).
В рамках настоящего изобретения термины лечить, лечение или проводить лечение и другие грамматические эквиваленты включают облегчение, снижение или ослабление одного или более симптомов заболевания или патологического состояния, ослабление, предупреждение или уменьшение проявления, тяжести или частоты одного или более дополнительных симптомов заболевания или патологического состояния, облегчение или предупреждение основных причин одного или более симптомов заболевания или патологического состояния, подавление заболевания или патологического состояния, например, такое как остановка развития заболевания или патологического состояния, облегчение заболевания или патологического состояния, обеспечение регресса заболевания или патологического состояния, облегчение состояния, вызванного заболеванием или патологическим состоянием, или подавление симптомов заболевания или патологического состояния профилактически и/или терапевтически.
В рамках настоящего изобретения, термин процент (%) идентичности последовательностей и относящиеся к нему термины в контексте аминокислотных последовательностей представляют собой процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в выбранной последовательности после выравнивания последовательностей и введения гэпов, если необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательностей и без учета каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательностей. Выравнивание для определения процента идентичности аминокислотной последовательности может быть достигнуто различными способами, которые известны специалистам в данной области, например, с использованием общедоступных компьютерных программ, таких как Clustal Omega, BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 или программы Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить подходящие параметры для проведения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей.
Термины полипептид и белок используются здесь взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Пептиды также включают по существу любую полиаминокислоту, включая, не ограничиваясь этим, пептидные миметики, где аминокислоты соединены простой эфирной связью, а не амидной связью.
Полезные нагрузки и конструкции для доставки
Настоящее изобретение относится к конструкциям для доставки, способным транспортировать одну или более гетерологичных молекул полезной нагрузки (например, одну или более терапевтических нагрузок) через эпителиальные клетки (например, поляризованные эпителиальные клетки кишечника) и в собственную пластинку оболочки кишечника посредством трансцитоза. Конструкции для доставки могут содержать носитель, связанный с гетерологичной полезной нагрузкой. Конструкция для доставки может представлять собой не встречающийся в природе слитый белок. Носитель может быть способен транспортировать гетерологичную полезную нагрузку через поляризованные эпителиальные клетки (например, поляризованные эпителиальные клетки кишечника) с использованием эндогенных путей переноса. Использование эндогенных путей переноса, в отличие от использования пассивной диффузии, может позволить носителю быстро и эффективно переносить гетерологичную полезную нагрузку через эпителиальные клетки без нарушения барьерной функции данных клеток или биологической активности гетерологичной полезной нагрузки. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам очистки и рефолдинга конструкций для доставки, описанных здесь.
Носитель здесь может происходить из полипептида, секретированного бактерией. Такой носитель может происходить из полипептида, секретированного Vibrio Cholerae или Pseudomonas aeruginosa. Полипептид, секретированный Vibrio Cholerae, может представлять собой полипептид Cholix. Носитель, полученный из полипептида Cholix, может представлять собой встречающийся в природе или не встречающийся в природе. Например, не встречающийся в природе полипептид Cholix может состоять из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1 (пример Cholix1-634) (табл. 1). Носитель, полученный из полипептида Cholix, может представлять собой усеченный и/или мутированный вариант полипептида, полученного из Cholix. Например, носитель может содержать или состоять из аминокислотной последовательности с аминокислотными остатками 1-206, 1-245, 1-251, 1-266 и 1-386 из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 26. В некоторых случаях такие носители имеют аминокислотную последовательность с аминокислотными остатками 1-206, 1-245, 1-251, 1-266 и 1-386 из SEQ ID NO: 4. Мутация(и) может включать одну или более замен, делеций и/или добавлений. Например, носитель здесь может содержать замену V1L. Иными словами, в некоторых вариантах осуществления связанный с Cholix носитель имеет аминокислоту лейцин в положении 1. (Положение 1 относится к первой аминокислоте вариантов, которые не имеют N-концевого метионина, или второму положению в вариантах, которые включают N-концевой метионин. Другими словами, при определении длины носителя N-концевой метионин, если он присутствует, не учитывается). В некоторых вариантах осуществления носители, содержащие замену V1L, проявляют пониженное отщепление N-концевой аминокислоты или его отсутствие.
- 6 043603
В некоторых вариантах осуществления носители, содержащие замену V1L, проявляют пониженное ацетилирование N-концевой аминокислоты или его отсутствие. Носитель, обеспеченный здесь, может иметь сниженную (например, сниженную по меньшей мере на 50%) активность рибозилирования ADP (например, рибозилирование фактора элонгации 2) или его отсутствие по сравнению с природным вариантом Cholix. В некоторых вариантах осуществления носитель может содержать N-концевой метионин. В других вариантах осуществления N-концевой метионин отсутствует.
Усеченный носитель Cholix состоит, по существу состоит или содержит аминокислотные остатки 1386 последовательности, показанной в SEQ ID NO: 26 (формула I). Усеченный носитель Cholix состоит, по существу состоит или содержит аминокислотные остатки 1-266 последовательности, показанной в SEQ ID NO: 26 (формула I). В таких случаях носитель состоит, по существу состоит или содержит аминокислотные остатки 1-266 последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1. Таким образом, в некоторых случаях носитель состоит из указанной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2 (пример Cholix1-386) или SEQ ID NO: 3 (пример Cholix1-266). В некоторых случаях носитель имеет аминокислотную последовательность, показанную SEQ ID NO: 2, с заменой V1L. Таким образом, в некоторых случаях носитель состоит из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 4 (пример V1L-Cholix1-386) или SEQ ID NO: 5 (пример V1L Cholix1-266). Любой из этих носителей может включать одну или более аминокислот на своем N-конце для экспрессии в различных микроорганизмах (например, бактериях), например, N-концевой метионин. Такой носитель может иметь аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6-9.
Полипептид Cholix может представлять собой белок, содержащий, по существу состоящий или состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичность последовательности или 100% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, показанной в любой из SEQ ID NO: 1-9 или SEQ ID NO: 22-23. Пример полипептида Cholix представлен здесь как SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 22. В настоящем документе также предусматриваются усеченные варианты полипептида Cholix, которые способны переносить полезную нагрузку через поляризованные эпителиальные клетки (например, поляризованные эпителиальные клетки кишечника). Такие полипептиды Cholix могут быть усечены в любом из аминокислотных положений от 206 до 633 по сравнению с референсной последовательностью, например SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 22 или SEQ ID NO: 26, или аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичность последовательности с ней.
В данном документе также рассматриваются конструкции для доставки, содержащие носители, имеющие высокую идентичность последовательности с последовательностями, приведенными выше. Такая высокая идентичность последовательностей может включать по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности. Таким образом, в некоторых случаях носитель имеет идентичность последовательности по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 6-9.
Носитель, рассматриваемый здесь, может быть связан с полезной нагрузкой, такой как гетерологичная полезная нагрузка. Такая полезная нагрузка может представлять собой терапевтическую полезную нагрузку. Терапевтическая полезная нагрузка может быть цитокином, гормоном, фактором роста, терапевтическим антителом, антигеном, функциональным фрагментом любого из вышеперечисленного или любым другим белком, обладающим биологической, терапевтической активностью, или белком, в котором может быть дефицит у субъекта (например, генетический/наследственный дефицит определенного белка). Цитокины, рассматриваемые здесь, включают мономерные хемокины и интерлейкины (также сокращенно называемые здесь IL). Интерлейкин может представлять собой IL-22. Интерлейкин может быть от любого вида (например, человека или грызуна). Интерлейкин может представлять собой интерлейкин человека. Человеческий IL-22 может иметь аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 10 (IL-221-179) или SEQ ID NO: 11 (IL-2234-179). Здесь IL-22 может дополнительно включать метионин на своем N-конце, например, когда такой белок IL-22 экспрессируется в бактериях. В одном случае IL-22 имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 12 (M+IL2234-179). Здесь IL-22 может дополнительно включать метионин на своем N-конце, например, когда такой белок IL-22 экспрессируется в бактериях. В одном случае IL-22 имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 12 (M+IL-2234-179). IL-22 может содержать, состоять по существу или состоять из SEQ ID NO: 10 или аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%% идентичность последовательности с ней, или его фрагмент. IL-22 содержит, по существу состоит или состоит из SEQ ID NO: 11 (IL-2234-179), которая является секретируемой формой IL-22, или аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичность последовательности с ней или ее фрагментом. IL-22 может включать метионин на своем N-конце, например, когда такой белок IL-22 экспрессируется бактериями. Такой IL22 может состоять, по существу состоять или содержать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 12 (M+IL-2234-179).
В некоторых случаях носитель, используемый в любой из конструкций для доставки, обеспеченных здесь, может представлять собой белок или другой тип молекулы, способной переносить терапевтиче
- 7 043603 скую нагрузку через эпителий (например, поляризованный эпителий кишечника субъекта). Такой транспорт может включать трансцитоз. В рамках настоящего изобретения, трансцитоз относится к перемещению слитой молекулы через поляризованную эпителиальную клетку. Такой трафик позволяет высвобождать биологически активную нагрузку из базолатеральной мембраны поляризованной эпителиальной клетки. Процесс трансцитоза может включать взаимодействие(я) носителя с одним или более рецепторами и/или белками на апикальной и/или базальной поверхности(ях), а также внутри клетки эпителия (например, поляризованной эпителиальной клетки кишечника). Носитель может быть способен транспортировать терапевтическую нагрузку через эпителий без нарушения эпителия, носителя и/или биологической и/или терапевтической функции полезной нагрузки.
Носитель может быть ковалентно или нековалентно и прямо или опосредованно связан с терапевтической полезной нагрузкой. Терапевтическая полезная нагрузка может быть напрямую связана с Nконцом или C-концом носителя. В случаях, когда носитель ковалентно связан с полезной нагрузкой, то носитель может быть связан с такой полезной нагрузкой через спейсер (также называемый здесь линкером). Спейсер может содержать по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или более аминокислотных остатков. Аминокислотные остатки спейсера могут представлять собой, например, глицин, серии и/или триптофан. Спейсер может быть расщепляемым или нерасщепляемым. Расщепляемый спейсер может расщепляться ферментом или pH-зависимым образом.
Примеры спейсеров, обеспеченных здесь, включают олигопептидные последовательности, такие как S, (GS)x, (GGS)x, (GGGS)x (SEQ ID NO: 27), (GGGGS)x (SEQ ID NO: 28) или (GGGGGS) x (SEQ ID NO: 29), где х=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15. В некоторых случаях, спейсер состоит, по существу состоит или содержит последовательность, показанную в SEQ ID NO: 13 ((G4S)3). (GGGGSGGGGSGGGGS). В некоторых случаях спейсер состоит, по существу состоит или содержит последовательность, показанную в SEQ ID NO: 31 ((G4S)5). (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS). В некоторых случаях конструкция для доставки включает терапевтическую нагрузку и носитель, которые связаны нековалентно (например, посредством ионных взаимодействий, ван-дер-ваальсовых взаимодействий, π-π-взаимодействий и т. д.). Носитель может дополнительно включать один или более признаков, элементов, аминокислот или модификаций на своем N-конце и/или C-конце. Например, некоторые варианты осуществления включают N-концевой метионин на N-конце носителя. Также могут присутствовать другие модификации (например, ацетилирование), включая модификации для экспрессии в гетерологичной системе.
Конструкция для доставки по настоящему изобретению может иметь аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 15 или 17 (примеры M+Cholix1-266-(G4S)3-IL-2234·179) (табл. 1). Другие конструкции для доставки могут иметь аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 24 или 25 (например, при экспрессии в клетке млекопитающего, такой как клетка CHO). Такие типичные конструкции для доставки транспортируют IL-22 через интактные поляризованные эпителиальные клетки кишечника и в собственную пластинку оболочки кишечника.
В различных вариантах осуществления не встречающийся в природе слитый белок имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 14-21, 24 или 25, или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичность последовательности с ними. Схема носителя, спейсера и полезной нагрузки неприродного слитого белка, содержащего аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 15, приведена на фиг. 16.
В табл. 1 приведены примерные аминокислотные последовательности биологически активных молекул, используемых в комбинации со способами, раскрытыми здесь.
- 8 043603
Таблица 1. Примерные аминокислотные последовательности
| Группа | SEQ ID NO | Аминокислотная последовательность |
| Cholix1'634 | SEQ ID NO: 1 | VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDE GVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATR HYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAIN WLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDN QTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQ KEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQN CTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRI HF SKGNAMSAL AAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDD LSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTH HPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNND QANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEA THQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRG NNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYG LPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAE EHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMA IHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKE RKDELK |
| Cholix1'386 | SEQ ID NO: 2 | VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDE GVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATR HYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAIN WLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDN QTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQ KEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQN CTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRI HF SKGNAMSAL AAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDD LSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTH HPGLTPEQTSAGAQA |
| Cholix1'266 | SEQ ID NO: 3 | VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDE GVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATR |
- 9 043603
| HYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAIN WLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDN QTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQ KEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQN CTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRI HFSKG | ||
| (VIL)-Cholix1' 386 | SEQ ID NO: 4 | LEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDE GVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATR HYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAIN WLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDN QTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQ KEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQN CTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRI HF SKGNAMSAL AAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDD LSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTH HPGLTPEQTSAGAQA |
| (VIL)-Cholix1' 266 | SEQ ID NO: 5 | LEEALNIFDECRSPC SLTPEPGKPIQ SKLSIP SD VVLDE GVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATR HYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAIN WLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDN QTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQ KEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQN CTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRI HFSKG |
| M+Cholix1'386 | SEQ ID NO: 6 | MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLD EGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT RHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAI NWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLD NQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAA QKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQ NCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQ RIHF SKGNAMSAL AAHRVCGVPLETLARSRKPRDLT DDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQ EPE VAERL SDLRRINENNPGM VTQ VLT VARQIYND Y |
- 10 043603
| VTHHPGLTPEQTSAGAQA | ||
| M+Cholix1'266 | SEQ ID NO: 7 | MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLD EGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT RHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAI NWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLD NQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAA QKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQ NCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQ RI HF S KG |
| M+(V1L)- Cholix1'386 | SEQ ID NO: 8 | MLEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLD EGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT RHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAI NWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLD NQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAA QKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQ NCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQ RIHF SKGNAMS AL AAHRVCGVPLETLARSRKPRDLT DDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQ EPE VAERL SDLRRINENNPGM VTQ VLT VARQIYND Y VTHHPGLTPEQTSAGAQA |
| M+(V1L)- Cholix1'266 | SEQ ID NO: 9 | MLEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLD EGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT RHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAI NWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLD NQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAA QKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQ NCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQ RI HF S KG |
| IL-221'179 | SEQ ID NO: 10 | MAALQKSVSSFLMGTLATSCLLLLALLVQGGAAAPI SSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDV RLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQ VLNFTLEEVLFPQ SD RFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQ KLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI |
| IL-2234'179 | SEQ ID NO: 11 | APISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNT DVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFP |
- 11 043603
| QSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQR NVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI | ||
| M+IL-2234'179 | SEQ ID NO: 12 | MAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNN TDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFP QSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQR NVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI |
| (G4S)3 | SEQ ID NO: 13 | GGGGSGGGGSGGGGS |
| M+Cholix1'386(G4S)3-IL-2234179 | SEQ ID NO: 14 | MLEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLD EGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT RHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAI NWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLD NQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAA QKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQ NCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQ RIHF SKGNAMSAL AAHRVCGVPLETLARSRKPRDLT DDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQ EPEVAERL SDLRRINENNPGM VTQ VLT VARQIYND Y VTHHPGLTPEQTSAGAQAGGGGSGGGGSGGGGSAPI SSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDV RLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQ VLNFTLEEVLFPQ SD RFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQ KLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI |
| M+Cholix1'266(G4S)3-IL-2234‘ 179 | SEQ ID NO: 15 | MVEEALNIFDECRSPC SLTPEPGKPIQ SKLSIP SD VVLD EGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT RHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAI NWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLD NQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAA QKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQ NCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQ RIHF SKGGGGGSGGGGSGGGGS APIS SHCRLDKSNFQ QPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVS MSERCYLMKQ VLNFTLEEVLFPQ SDRFQPYMQEVVP FLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGEIKAIGELDLLFMSLRNACI |
- 12 043603
| M+(V1L)- Cholix1'386(G4S)3-IL-2234179 | SEQ ID NO: 16 | MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLD EGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT RHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAI NWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLD NQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAA QKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQ NCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQ RIHF SKGNAMSAL AAHRVCGVPLETLARSRKPRDLT DDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQ EPE VAERL SDLRRINENNPGM VTQ VLT VARQIYND Y VTHHPGLTPEQTSAGAQAGGGGSGGGGSGGGGSAPI SSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDV RLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQ VLNFTLEEVLFPQ SD RFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQ KLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI |
| M+(V1L)Cholix1'266(G4S)3-IL-2234' 179 | SEQ ID NO: 17 | MLEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLD EGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT RHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAI NWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLD NQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAA QKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQ NCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQ RIHF SKGGGGGSGGGGSGGGGS APIS SHCRLDKSNFQ QPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVS MSERC YLMKQ VLNFTLEEVLFPQ SDRFQPYMQEVVP FLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGEIKAIGELDLLFMSLRNACI |
| Cholix1'386(G4S)3-IL-2234‘ 179 | SEQ ID NO: 18 | VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDE GVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATR HYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAIN WLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDN QTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQ KEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQN CTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRI HF SKGNAMSAL AAHRVCGVPLETLARSRKPRDL TDD |
- 13 043603
| LSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTH HPGLTPEQTSAGAQAGGGGSGGGGSGGGGSAPISSH CRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIG EKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQ PYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLK DTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI | ||
| (VIL)-Cholix1' 386-(G4S)3-IL22З4-179 | SEQ ID NO: 19 | LEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDE GVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATR HYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAIN WLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDN QTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQ KEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQN CTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRI HF SKGNAMSAL AAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDD LSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTH HPGLTPEQTSAGAQAGGGGSGGGGSGGGGSAPISSH CRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIG EKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQ PYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLK DTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI |
| Cholix1'266(G4S)3-IL-2234· 179 | SEQ ID NO: 20 | VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDE GVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATR HYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAIN WLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDN QTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQ KEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQN CTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRI HF SKGGGGGSGGGGSGGGGS APIS SHCRLDKSNFQQ PYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMS ERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFL ARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGES GEIKAIGELDLLFMSLRNACI |
| (VIL)-Cholix1· | SEQ ID NO: | LEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDE |
- 14 043603
| 266-(G4S)3-IL- 2234-179 | 21 | GVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATR HYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAIN WLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDN QTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQ KEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQN CTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRI HF SKGGGGGSGGGGSGGGGS APIS SHCRLDKSNFQQ PYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMS ERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFL ARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGES GEIKAIGELDLLFMSLRNACI |
| (VIL)-Cholix1' 634 | SEQ ID NO: 22 | LEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDE GVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATR HYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAIN WLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDN QTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQ KEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQN CTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRI HF SKGNAMSAL AAHRVCGVPLETLARSRKPRDLTDD LSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQEPE VAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDYVTH HPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASNND QANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQELEA THQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVPRG NNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGEYG LPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLENAE EHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWDMA IHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPPYKE RKDELK |
| M+(V1L)- Cholix1'634 | SEQ ID NO: 23 | MLEEALNIFDECRSPC SLTPEPGKPIQ SKL SIP SD VVLD EGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT RHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAI NWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLD NQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAA QKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQ |
- 15 043603
| NCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQ RIHF SKGNAMS AL AAHRVCGVPLETLARSRKPRDLT DDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQ EPE VAERL SDLRRINENNPGM VTQ VLT V ARQIYND Y VTHHPGLTPEQTSAGAQAADILSLFCPDADKSCVASN NDQANINIESRSGRSYLPENRAVITPQGVTNWTYQEL EATHQALTREGYVFVGYHGTNHVAAQTIVNRIAPVP RGNNTENEEKWGGLYVATHAEVAHGYARIKEGTGE YGLPTRAERDARGVMLRVYIPRASLERFYRTNTPLEN AEEHITQVIGHSLPLRNEAFTGPESAGGEDETVIGWD MAIHAVAIPSTIPGNAYEELAIDEEAVAKEQSISTKPP YKERKDELK | ||
| Cholix1'266(G4S)3-IL-2234' 179 | SSEQ ID NO: 24 | VEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDE GVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATR HYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAIN WLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDN QTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQ KEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQN CTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRI HF SKGGGGGSGGGGSGGGGS APIS SHCRLDKSNFQQ PYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMS ERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFL ARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGES GEIKAIGELDLLFMSLRNACI |
| (VIL)-Cholix1' 266-(G4S)3-IL22^4-179 | SSEQ ID NO: 25 | LEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLDE GVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRATR HYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAIN WLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLDN QTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAAQ KEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQN CTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQRI HF SKGGGGGSGGGGSGGGGS APIS SHCRLDKSNFQQ PYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMS ERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFL ARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGES |
- 16043603
| M+Cholix1'266- | SEQ | ID | NO: | GEIKAIGELDLLFMSLRNACI MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLD EGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT RHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAI NWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLD NQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAA QKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQ |
| (G4S)i-IL-2234· 179 | 32 | NCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQ RIHFSKGGGGGSAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFML AKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQ VLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLST CHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELD LLFMSLRNACI MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLD EGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT RHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAI NWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLD | ||
| M+Cholix1'266(G4S)5-IL-2234' 179 | SEQ 33 | ID | NO: | NQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAA QKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQ NCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQ RIHFSKGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAPIS SHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVR LIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDR FQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQK LKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI MAPISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNN TDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFP QSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQR |
| M+ IL-2234'179 -(G4S)r Cholix1'266 | SEQ 34 | ID | NO: | NVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACIG GGGS VEEALNIFDECRSPC SLTPEPGKPIQ SKL SIP SD V VLDEGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATV RATRHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEG EFAINWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYS IDLDNQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSY KAAQKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNY |
- 17 043603
| M+Cholix1'386(G4S)rIL-2234· 179 Консенсусная последователь ность Cholix | SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 26 | ITQQNCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKP VEQRIHFSKG MVEEALNIFDECRSPCSLTPEPGKPIQSKLSIPSDVVLD EGVLYYSMTINDEQNDIKDEDKGESIITIGEFATVRAT RHYVNQDAPFGVIHLDITTENGTKTYSYNRKEGEFAI NWLVPIGEDSPASIKISVDELDQQRNIIEVPKLYSIDLD NQTLEQWKTQGNVSFSVTRPEHNIAISWPSVSYKAA QKEGSRHKRWAHWHTGLALCWLVPMDAIYNYITQQ NCTLGDNWFGGSYETVAGTPKVITVKQGIEQKPVEQ RIHF SKGN AM S ALA AHR VCG VPLETLARSRKPRDLT DDLSCAYQAQNIVSLFVATRILFSHLDSVFTLNLDEQ EPEVAERLSDLRRINENNPGMVTQVLTVARQIYNDY VTHHPGLTPEQTSAGAQAGGGGSAPISSHCRLDKSNF QQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVS MSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVP FLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGE SGEIKAIGELDLLFMSLRNACI X1-E-X3 -X4-L-X6-I-F-D-E-C-R- S-P-C-X16-L-T-P-E- X21-G-K-X24-I-Q- S-K-L-X3 0-I-P-X3 3 -D-V-V-L-D-E-GV-L-Y-Y-S-M-T-I-N-D-E-Q-N-D-I-X56-D-E-X59-K-G-ES-I-I-T-X67-G-E-F-A-T-X73-R-A-T-R-H-Y-V-X81-Q-D- A-P-F-G-V-I-X90-L-D-I-T-T-E-N-G-T-K-X101 -Y-SX104-N-R-K-X108-X109-E-F-X112-I-X114-W-L-V- X118-X119-G-E-D-S-P-A-S-I-K-I-S-X131-D-E-X134-DQ-X137-R-N-I-I-E-V-P-K-L-Y-S-I-D-L-D-N-Q-T-L-E-Q- W-X160-X161-Q-G-N-V-X166-F-X168-V-T-R-P-E-X174X175-I-A-I-S-W-P-S-V-S-Y-X186-A-A-X189-K-X191-G- X193-R-H-K-R-W-A-X200-W-X202-T-X204-X205-X206X207-X208-X209-L-X211-X212-X213 -X214-X215 -X216X217-X218-X219-X220-X221-X222-X223 -X224-C-TX227-G-X229-X230-W-X232-G-G-X235-Y-X237-T-V-AG-X242-P-X244-X245-I-X247-V-K-Q-G-X252-E-Q-KX256-V-E-Q-R-I-H-F-S-X265-X266-N-A-X269-X270X271-L-A-A-H-R-V-C-G-V-P-L-E-T-L-A-R-X288-R-K-PR-X293 -L-X295 -D-D-L-X299-C-X3 01 - Y-X3 03 - A-Q- |
- 18 043603
| X306-I-V-S-L-F-X312-A-T-R-X316-L-F-X319-H-X321-DS-X324-F-T-L-N-L-X3 3 0-ХЗ 31-Q-X3 3 3 -Р-ХЗ 3 5 - V-X3 3 7E-R-L-X341-X342-X343-R-X345-I-N-E-X349-N-P-GХЗ 5 3 - V-X3 5 5 -Q-V-L-T-X3 60-A-R-Q-I- Y-N-D-Y- V-TХЗ 71 -Н-Р-ХЗ 74-L-X3 76-P-E-Q-T-S-А-ХЗ 83 -A-Q-A-A-DI-L- S-L-X3 93 -ХЗ 94-P-D-X3 97-D-X3 99-Х400-С-V- АX404-X405-X406-D-Q-A-N-I-N-X413-E-S-R-S-G-R-S-YL-X423 -E-N-R-A-V-I-T-X431 -Q-G- V-T-N-W-T- Y-Q-E-LX443-X444-X445.H-Q-X448-L-T-X451-E-X453-Y-V-FV-G-Y-H-G-T-N-H-X465-A-A-Q-X469-I-V-N-R-I-X475P-V-P-R-G-X481-X482-T-E-X485-E-X487-X488-W-G-GX492-Y-V-X495-T-X497-A-X499-X500-X501-X502X503-Y-X505-R-X507-X508-X509-G-T-X512-X513- Х514-Х515-Х516-Х517-Т-Х519-Х520-Х521-Х522-Х523 X524-R-G-V-M-L-X530-V-Y-X533-X534-X535-A-S-L-ER-F-Y-R-X544-N-X546-X547-L-E-X550-X551-X552- X553-X554-X555-X556-X557-V-I-G-H-X562-L-P-L-R-NE-A-F-T-G-X573-X574-X575-X576-X577-G-X579-X580E-T-X583-I-G-W-D-X588-A-I-X591-X592-V-A-I-P-S-T-IP-G-N-X603-Y-X605-X606-L-X608-X609-X610-E-E-AX614-A-X616-E-Q-S-I-S-X622-K-P-P-Y-K-E-X629-X630D-E-L-K; где XI выбран из группы, состоящей из V и L; ХЗ выбран из группы, состоящей из Е и D; Х4 выбран из группы, состоящей из А и Е; Х6 выбран из группы, состоящей из N и К; XI6 выбран из группы, состоящей из S и L; Х21 выбран из группы, состоящей из Р и L; Х24 выбран из группы, состоящей из Р и Q; Х30 выбран из группы, состоящей из S и F; ХЗЗ выбран из группы, состоящей из S и G; Х56 выбран из группы, состоящей из К и Μ; Х59 выбран из группы, состоящей из D и G; Х67 выбран из группы, состоящей из I и F; Х73 выбран из группы, состоящей из V и I; Х81 выбран из группы, состоящей из N и S; Х90 выбран из группы, состоящей из Н и Ν; XI01 выбран из группы, состоящей из Т и М; XI04 выбран из группы, состоящей из Y и F; XI08 |
- 19 043603
| выбран из группы, состоящей из Е и D; XI09 выбран из группы, состоящей из G и S; XI12 выбран из группы, состоящей изАиТ;Х114 выбран из группы, состоящей из N и Η; XI18 выбран из группы, состоящей из Р и I; XI19 выбран из группы, состоящей из I и Р; XI31 выбран из группы, состоящей из V и I; XI34 выбран из группы, состоящей из L и I; XI37 выбран из группы, состоящей из Q и К; XI60 выбран из группы, состоящей из К и Е; XI61 выбран из группы, состоящей из Т и Ν; XI66 выбран из группы, состоящей из S и F; XI68 выбран из группы, состоящей из S и А; XI74 выбран из группы, состоящей из Н и Q; Х175 выбран из группы, состоящей из N, S, SIAKQS, и SIAKQSIAKQS; XI86 выбран из группы, состоящей из К и Ν; XI89 выбран из группы, состоящей из Q, Е, и Η; XI91 выбран из группы, состоящей из Е, N, и D; XI93 выбран из группы, состоящей из S и А; Х200 выбран из группы, состоящей из Н и Ν; Х202 выбран из группы, состоящей из Н, L, F, и R; Х204 выбран из группы, состоящей из G и Τ; Х205 выбран из группы, состоящей из L и S;X206 выбран из группы, состоящей из А и Р; Х207 выбран из группы, состоящей из L, Е, и К;Х208 выбран из группы, состоящей из С и V; Х209 выбран из группы, состоящей из W, V, и Τ; Х211 выбран из группы, состоящей из V и без аминокислоты; Х212 выбран из группы, состоящей из Р и без аминокислоты; Х213 выбран из группы, состоящей из Μ, I, L, и без аминокислоты; Х214 выбран из группы, состоящей из D и без аминокислоты; Х215 выбран из группы, состоящей из А и без аминокислоты; Х216 выбран из группы, состоящей из I и без аминокислоты; Х217 выбран из группы, состоящей из Y и С; Х218 выбран из группы, состоящей из N и F; Х219 выбран из группы, состоящей из Y и F; Х220 выбран из группы, состоящей из I и Е; Х221 выбран из группы, состоящей из Т и D; Х222 выбран из группы, состоящей |
- 20 043603
| из Q и Р; Х223 выбран из группы, состоящей из Q, Е, и А; Х224 выбран из группы, состоящей из N, L, и Q; Х227 выбран из группы, состоящей из L и Y; Х229 выбран из группы, состоящей из D и Е; Х230 выбран из группы, состоящей из N и D; Х232 выбран из группы, состоящей из F, Н, и Y; Х235 выбран из группы, состоящей из S и А; Х237 выбран из группы, состоящей из Е и К; Х242 выбран из группы, состоящей из Т и I; Х244 выбран из группы, состоящей из К, Е, и G; Х245 выбран из группы, состоящей из V и А; Х247 выбран из группы, состоящей из Т и Μ; Х252 выбран из группы, состоящей из I и М; Х256 выбран из группы, состоящей из Р, Т, и А; Х265 выбран из группы, состоящей из К, Q, и Ν; Х266 выбран из группы, состоящей из G и К; Х269 выбран из группы, состоящей из М и I; Х270 выбран из группы, состоящей из S и Е; Х271 выбран из группы, состоящей из А и Т; Х288 выбран из группы, состоящей из S и G; Х293 выбран из группы, состоящей из D и Y; Х295 выбран из группы, состоящей из Т, Р, и Q; Х299 выбран из группы, состоящей из S и Q; Х301 выбран из группы, состоящей из А и V; ХЗОЗ выбран из группы, состоящей из Q и N; Х306 выбран из группы, состоящей из N и Q; Х312 выбран из группы, состоящей из V и L; Х316 выбран из группы, состоящей из I и Μ; Х319 выбран из группы, состоящей из S и Т; Х321 выбран из группы, состоящей из L и I; Х324 выбран из группы, состоящей из V и I; ХЗЗО выбран из группы, состоящей из D, Е и Η; Х331 выбран из группы, состоящей из Е и G; ХЗЗЗ выбран из группы, состоящей из Е и А; Х335 выбран из группы, состоящей из Е и А; Х337 выбран из группы, состоящей из А и Т; Х341 выбран из группы, состоящей из S, D и Т; Х342 выбран из группы, состоящей из D и А; Х343 выбран из группы, состоящей из L и I; Х345 выбран из группы, состоящей из R и Q; Х349 выбран из группы, состоящей из N и D; Х353 выбран из группы, состоящей |
- 21 043603
| из М и V; ХЗ 5 5 выбран из группы, состоящей из Т и I; Х360 выбран из группы, состоящей из V и I; Х371 выбран из группы, состоящей из Н и Е; Х374 выбран из группы, состоящей из G и L; Х376 выбран из группы, состоящей из Т и I; Х383 выбран из группы, состоящей из G и S; Х393 выбран из группы, состоящей из F и L; Х394 выбран из группы, состоящей из С и Υ; Х397 выбран из группы, состоящей из А и Т; Х399 выбран из группы, состоящей из К, Е и G; Х400 выбран из группы, состоящей из S, Р и Η; Х404 выбран из группы, состоящей из S и L; Х405 выбран из группы, состоящей из Ν и D; Х406 выбран из группы, состоящей из Ν и S; Х413 выбран из группы, состоящей из I и V; Х423 выбран из группы, состоящей из Р и L; Х431 выбран из группы, состоящей из Р и Q; Х443 выбран из группы, состоящей из Е и D;X444 выбран из группы, состоящей из А и Т; Х445 выбран из группы, состоящей из Т и К; Х448 выбран из группы, состоящей из А и Т; Х451 выбран из группы, состоящей из R и Q; Х453 выбран из группы, состоящей из G и D; Х465 выбран из группы, состоящей из V и А;Х469 выбран из группы, состоящей из Т, S, и Ν; Х475 выбран из группы, состоящей из A, S, и Т; Х481 выбран из группы, состоящей из N и S; Х482 выбран из группы, состоящей из N и D; Х485 выбран из группы, состоящей из N, S и К; Х487 выбран из группы, состоящей из Е, R и К; Х488 выбран из группы, состоящей из К, А и Е; Х492 выбран из группы, состоящей из L и V; Х495 выбран из группы, состоящей из А и S; Х497 выбран из группы, состоящей из Н и D; Х499 выбран из группы, состоящей из Е и S; Х500 выбран из группы, состоящей из V и L; Х501 выбран из группы, состоящей из А и Ν; Х502 выбран из группы, состоящей из Н и Y; Х503 выбран из группы, состоящей из G и R; Х505 выбран из группы, состоящей из А и Т; Х507 выбран из группы, состоящей из I и L; Х508 выбран |
- 22 043603
| из группы, состоящей из К и Q; X509 выбран из группы, состоящей из Е и К; X512 выбран из группы, состоящей из G и A; X513 выбран из группы, состоящей из Е, D и N; Х514 выбран из группы, состоящей из Y, G, А и N; X515 выбран из группы, состоящей из G и Е; X516 выбран из группы, состоящей из L и G; X517 выбран из группы, состоящей из Р и L; X519 выбран из группы, состоящей из R, Р и Т; X520 выбран из группы, состоящей из А и Е; X521 выбран из группы, состоящей из Е и К; X522 выбран из группы, состоящей из R, Q и К; X523 выбран из группы, состоящей из D, К и Е; X524 выбран из группы, состоящей из А, Т и S; X530 выбран из группы, состоящей из R и К; X533 выбран из группы, состоящей из I и L; X534 выбран из группы, состоящей из Р и Η; X535 выбран из группы, состоящей из R и Q; X544 выбран из группы, состоящей из Т и I; X546 выбран из группы, состоящей из Т, А и I; X547 выбран из группы, состоящей из Р и D; Х550 выбран из группы, состоящей из N и К; Х551 выбран из группы, состоящей из А и Е; Х552 выбран из группы, состоящей из Е, R и D; Х553 выбран из группы, состоящей из Е, N и R; Х554 выбран из группы, состоящей из Н и L; Х555 выбран из группы, состоящей из I и V; Х556 выбран из группы, состоящей из Т и Е; Х557 выбран из группы, состоящей из Q, R, Н и D; Х562 выбран из группы, состоящей из S и Р; Х573 выбран из группы, состоящей из Р и Т; Х574 выбран из группы, состоящей из Е и D; Х575 выбран из группы, состоящей из S, А и R; Х576 выбран из группы, состоящей из А, Е, и V; Х577 выбран из группы, состоящей из G, Е, и D; Х579 выбран из группы, состоящей из Е и S; Х580 выбран из группы, состоящей из D и N; Х583 выбран из группы, состоящей из V и А; Х588 выбран из группы, состоящей из М и I; Х591 выбран из группы, состоящей из Н и Y; Х592 выбран из группы, состоящей из А и G; Х603 выбран из группы, | ||
| состоящей из А и S; Х605 выбран из группы, состоящей из Е и А; Х606 выбран из группы, состоящей из Е, A, Q, G, V и R; Х608 выбран из группы, состоящей из А, Р, и Т; Х609 выбран из группы, состоящей из I, Т и Р; Х610 выбран из группы, состоящей из D и А; Х614 выбран из группы, состоящей из V и VVKEAI; Х616 выбран из группы, состоящей из К и Е; Х622 выбран из группы, состоящей из Т, А, и Р; иХ629 выбран из группы, состоящей из R, Q, и Н; и Х630 выбран из группы, состоящей из К и без аминокислоты. |
В некоторых вариантах осуществления не встречающийся в природе слитый белок содержит или состоит из: носителя, выбранного из группы, состоящей из любой из последовательностей, показанных в SEQ ID NO: 1-9, 22-23 и 26, и полезной нагрузки, выбранной из группы, состоящей из любой из последовательностей, показанных в SEQ ID NO: 10-12, и где носитель и полезная нагрузка необязательно связаны спейсером, выбранным из группы, состоящей из любой из последовательностей, показанных в SEQ ID NO: 13 и 27-29.
Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим конструкцию для доставки и один или более фармацевтически приемлемых носителей. В некоторых случаях конструкция для доставки состоит из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 15. В некоторых случаях конструкция для доставки состоит из аминокислотной последовательности,
- 23 043603 показанной в SEQ ID NO: 17. Такие фармацевтические композиции могут быть формулированы для введения субъекту. В некоторых случаях фармацевтическая композиция формулирована для перорального введения субъекту.
Фармацевтическую композицию, содержащую конструкцию для доставки, можно вводить субъекту (например, человеку), нуждающемуся в этом, для лечения заболевания. Заболевания, которые можно лечить с использованием конструкций для доставки по настоящему изобретению, включают аутоиммунные заболевания и воспалительные заболевания. В некоторых случаях заболевание представляет собой повреждение эпителиальных клеток или повреждение мембран эпителиальных клеток (например, в желудочно-кишечном тракте). В некоторых случаях заболевание представляет собой гепатит, ожирение, жировую болезнь печени, воспаление печени или панкреатит, болезнь Крона (например, свищевую болезнь Крона), язвенный колит (например, легкой-средней степени или средней-тяжелой степени), поухит, проктит, рассеянный склероз, системную красную волчанку, синдром трансплантат против хозяина, ревматоидный артрит или псориаз.
Способы очистки и композиции
Настоящее изобретение относится к способам получения очищенного не встречающегося в природе слитого белка. Не встречающийся в природе слитый белок может содержать IL-22 и носитель и, необязательно, спейсер, связывающий IL-22 с носителем. Не встречающийся в природе слитый белок может представлять собой белок, содержащий, по существу состоящий или состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичность последовательности или 100% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 14-21, 24 или 25. Преимущества способов и композиций, описанных здесь, включают поддержание высокой чистоты и биологической активности очищенных полипептидов или белков.
Конкретные преимущества способов, раскрытых здесь, включают: a) высокую биологическую активность не встречающихся в природе слитых белков за счет правильного фолдинга с использованием специально разработанных буферов для фолдинга; b) высокую химическую чистоту очищенных не встречающихся в природе слитых белков в сочетании с низкой токсичностью; c) высокий выход материала, предназначенного для очистки; d) воспроизводимость результатов обеспечивает надежное получение и поставку; e) технологичность и масштабируемость до нескольких граммов и нескольких килограммов для клинических и коммерческих применений; f) стабильное использование материалов и ресурсов обеспечивает рентабельный и логистически эффективный способ очистки клинически значимых молекул. Кроме того, улучшенные способы получения могут увеличить скорость, с которой эти очищенные белки могут быть разработаны для терапевтического применения (фиг. 22).
Примерный процесс очистки не встречающихся в природе слитых белков, описанных здесь, показан на фиг. 17, которая дополнительно иллюстрирует примерные уровни чистоты и извлечения не встречающегося в природе слитого белка на каждой стадии процесса очистки.
В рамках настоящего изобретения, термин чистота указывает уровень желаемого белка (например, неприродного слитого белка) или желаемой формы белка (например, мономера неприродного слитого белка, скорректированного свернутого неприродного слитого белка или их комбинации) в композиции, которая также может содержать нежелательные белки или нежелательные формы белка (например, агрегат неприродного слитого белка, неправильно свернутого белка или их комбинации). Уровень может быть представлен процентным содержанием (%) желаемого белка или желаемой формы белка. Например, чистота может составлять более 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% или может составлять 100%. Термин очищенный можно использовать для обозначения композиции, чистота которой повысилась. Повышение чистоты может иметь место за счет процедур очистки, описанных здесь, таких как анионообменная хроматография, гидроксиапатитная хроматография, катионообменная хроматография или их комбинация.
В некоторых случаях способы и композиции по настоящему изобретению включают использование по меньшей мере двух хроматографических колонок, которые выполняются в тандеме, с последующей стадией концентрирования/буферного обмена (ультрафильтрация/диафильтрация (UF/DF) для концентрирования и буферного обмена раствора). Хроматографические колонки могут представлять собой системы для хроматографии низкого давления, такие как колонка AKTA Avant 150 или колонка AKTA Pilot от General Electric (GE). В некоторых случаях по меньшей мере одна колонка содержит анионообменную смолу (например, смолу NH2-750F), и по меньшей мере одна колонка содержит гидроксиапатитную смолу (например, смолу CaPure®). В некоторых случаях по меньшей мере одна колонка, содержащая анионообменную смолу, используется на стадии захвата, тогда как по меньшей мере одна колонка, содержащая гидроксиапатитную смолу, используется на стадии очистки. В некоторых случаях вместо (или в дополнении к) гидроксиапатитовой колонки можно использовать катионообменную колонку. Например, в некоторых вариантах осуществления катионообменная колонка с полиметакрилатной смолой, функционализированной сульфатными группами, такая как TOYOPEARL Sulfate-650F. Чистота солюбилизированного белка может повыситься с 44%-47% после UF/DF до 93%-97% после анионообменной хроматографии до по меньшей мере 99% после хроматографии на гидроксиапатите. Извлечение солюбилизиро- 24 043603 ванного белка может увеличиваться с 70%-73% после анионообменной хроматографии по меньшей мере до 97% после хроматографии на гидроксиапатите.
Выделение не встречающихся в природе слитых белков из телец включения
В некоторых вариантах осуществления не встречающиеся в природе слитые белки, подлежащие очистке, выделяют из телец включения (IB). IB, как здесь описано, могут представлять собой ядерные или цитоплазматические агрегаты стабильных веществ, таких как белки и полипептиды. В некоторых вариантах осуществления дважды промытые тельца включения (DWIB), содержащие неприродные слитые белки (например, SEQ ID NO: 14-21) из ферментации, ресуспендируют в конкретной буферной системе (см. пример 6).
В некоторых случаях концентрация DWIB составляет примерно от 0,5 г DWIB/100 мл буфера до примерно 5 г DWIB/10 мл буфера. В некоторых случаях концентрация DWIB составляет примерно от 2 г DWIB/50 мл буфера до примерно 5 г DWIB/50 мл буфера. В некоторых случаях концентрация DWIB составляет примерно от 1 г DWIB/20 мл буфера до примерно 1 г DWIB/10 мл буфера. В некоторых случаях концентрация DWIB составляет по меньшей мере 1 г DWIB/100 мл буфера. В некоторых случаях концентрация DWIB составляет по меньшей мере 1 г DWIB/10 мл буфера.
Буферная система для ресуспендирования может включать различные буферные агенты и ингредиенты. В некоторых случаях буферная система для ресуспендирования содержит гуанидин/HCl (Gu-HCl) в концентрации по меньшей мере 1 М по меньшей мере 2 М по меньшей мере 4 М по меньшей мере 6 М по меньшей мере 8 М. В некоторых случаях концентрация Gu-HCl составляет примерно от 4 М до примерно 8 М. В некоторых случаях буферная система для ресуспендирования включает Трис-буфер, где концентрация Трис составляет по меньшей мере 5 мМ по меньшей мере 10 мМ по меньшей мере 20 мМ по меньшей мере 50 мМ или по меньшей мере 100 мМ. В некоторых случаях Трис-буфер имеет концентрацию примерно от 40 мМ до примерно 60 мМ. Трис-буфер может представлять собой Трис-HCl. ТрисHCl может иметь pH от 8,0 до 8,5. Трис-HCl может иметь pH 8,2. В некоторых случаях буферная система для ресуспендирования включает дитиотреитол (DTT). DTT может иметь концентрацию по меньшей мере 7 мМ, 8 мМ, 9 мМ, 10 мМ, 20 мМ, 30 мМ, 40 мМ, 50 мМ, 60 мМ или 70 мМ. DTT может иметь концентрацию от 7 до 11 мМ, от 8 до 10 мМ или от 9 до 10 мМ. В некоторых случаях буферная система для ресуспендирования включает этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА). ЭДТА может иметь концентрацию по меньшей мере 1 мМ, 1,5 мМ, 2 мМ или 2,5 мМ. ЭДТА может иметь концентрацию от 1 мМ до 2,5 мМ или от 1,9 до 2,1 мМ. В некоторых вариантах осуществления буферная система для ресуспендирования содержит, по существу состоит или состоит из Трис-буфера, Gu-HCl и DTT. Буферная система, используемая для ресуспендирования, может иметь pH примерно от 6 до примерно 10. В некоторых случаях буферная система имеет pH примерно от 7,5 до примерно 8,5. В некоторых случаях pH буферной системы составляет по меньшей мере 7. В некоторых случаях pH буферной системы составляет по меньшей мере 8. В некоторых случаях pH буферной системы составляет по меньшей мере 8,5.
Восстановление солюбилизированных не встречающихся в природе слитых белков
К раствору для ресуспендирования может быть добавлен восстанавливающий агент. Восстанавливающим агентом может быть дитиотреитол (DTT). Количество используемого восстанавливающего агента может зависеть от объема раствора для ресуспендирования и слитого белка, присутствующего в этом растворе. В некоторых случаях количество используемого восстанавливающего агента составляет примерно от 0,025 мМ до примерно 50 мМ, от 0,5 до 30 мМ, от 1 до 10 мМ. В некоторых случаях количество используемого восстанавливающего агента составляет, по меньшей мере (или между) 2 мМ, 3 мМ, 4 мМ, 5 мМ, 6 мМ, 7 мМ, 8 мМ, 9 мМ или 10 мМ.
Раствор солюбилизированного неприродного слитого белка (например, SEQ ID NO: 14-21) можно инкубировать при различных температурах в диапазоне примерно от 2 до примерно 40°C. В некоторых случаях раствор белка можно инкубировать при комнатной температуре (rt). Инкубацию можно проводить при перемешивании раствора. Раствор можно перемешивать на магнитной мешалке, и затем центрифугировать. Центрифугирование можно проводить при скорости примерно от 1000х g до примерно 20000х g. В некоторых случаях центрифугирование выполняется при 15970х g в течение 90 мин при 4°C. Время инкубации может варьироваться от примерно 20 мин до примерно 180 мин, в зависимости от концентрации ингредиентов, концентрации слитого белка (например, SEQ ID NO: 14-21).
Определение концентрации белка в различных растворах во всех способах и процедурах, описанных здесь, можно выполнить с использованием анализа Брэдфорда. Концентрация солюбилизированного неприродного слитого белка может составлять примерно от 1 до примерно 50 мг/мл. В некоторых случаях конечная концентрация солюбилизированного неприродного слитого белка может составлять примерно от 3 до примерно 30 мг/ мл. В некоторых случаях конечная концентрация солюбилизированного неприродного слитого белка может составлять примерно от 5 до примерно 20 мг/мл. В некоторых случаях конечная концентрация солюбилизированного неприродного слитого белка может составлять по меньшей мере 15 мг/мл.
Рефолдинг не встречающихся в природе слитых белков
Не встречающиеся в природе слитые белки по настоящему изобретению могут проявлять свою
- 25 043603 биологическую активность за счет своей специфической трехмерной структуры или фолдинга. Следовательно, рефолдинг данных полипептидов может быть важным при разработке данных полипептидов для фармацевтического применения. Желательный рефолдинг слитого белка, содержащего по меньшей мере носитель и IL-22, может включать рефолдинг носителя или IL-22 в третичную структуру, аналогичную третичной структуре гомологичного встречающегося в природе носителя, или последовательности IL-22, или третичную структуру, которая приводит к поддержанию желаемой активности носителя (например, обеспечение трансцитоза слитого белка) и IL-22. Способы, описанные здесь, могут включать рефолдинг солюбилизированного неприродного слитого белка для получения повторно свернутого неприродного слитого белка. Рефолдинг может иметь место до проведения анионообменной хроматографии.
Солюбилизированный белок (например, SEQ ID NO: 14-21) можно добавить к раствору для рефолдинга, также называемому буферным раствором для рефолдинга. Количество используемого солюбилизированного белка может составлять от 0,1 до 1 мг/кг, от 1 до 100 мг/кг, от 1 до 50 мг/кг, от 1 до 10 мг/кг от 5 до 20 мг/кг или примерно 15 мг/кг. Количество солюбилизированного белка может составлять по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мг/кг. Количество солюбилизированного белка может составлять не более 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мг/кг. Раствор для рефолдинга может иметь pH от 7,5 до 8,5 или примерно 7,0.
Буферный раствор для рефолдинга может содержать аминокислоту, полиол, соль, сахар, окислительно-восстановительный реагент, хаотропный агент или их комбинацию. Аминокислота может представлять собой пролин, глицин, аргинин или аланин. Полиол может быть глицерином. Соль может представлять собой хлорид натрия (NaCl), хлорид калия (КС1) или хлорид магния (MgCl2). Сахар может быть глюкозой или сахарозой. Окислительно-восстановительным реагентом может быть цистеин, цистамин, глутатион, дитиотреитол (DTT) или сульфат меди (CuSO4). В некоторых вариантах осуществления буфер для рефолдинга содержит Трис-основание, аргинин-HCl, мочевину, ЭДТА, глицерин, L-цистеин, цистамин-2НС1, DTT, Gu-HCl или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления буфер для рефолдинга содержит, по существу состоит или состоит из Трис pH 8,5, аргининглицерина, цистеина и цистамина. Концентрации Трис-буфера могут составлять примерно от 20 до примерно 200 мМ с pH примерно от 6 до примерно 9. Концентрации аргинин-HCl могут варьироваться примерно от 0,1 М до примерно 1,5 М, примерно от 0,75 до 1,25 М или примерно 1,0 М. Концентрации мочевины могут находиться в диапазоне примерно от 0,5 М до 1,5 М. Концентрации ЭДТА могут находиться в диапазоне от 1 мМ до 3 мМ. Концентрации глицерина могут находиться в диапазоне примерно от 2% об./об. до примерно 20% об./об., примерно от 8% об./об. до примерно 12% об./об. или примерно 10% об./об. Концентрации цистеина могут составлять от 1 мМ до 5 мМ, от 2 до 4 мМ или примерно 3 мМ. Цистеин может представлять собой Lцистеин. Концентрации цистамина могут находиться в диапазоне примерно от 0,5 мМ до примерно 5 мМ, примерно от 1 мМ до примерно 4 мМ или примерно 3 мМ. Цистамин может представлять собой цистамин-2HCl. Концентрации DTT могут варьироваться примерно от 0,1 мМ до примерно 1 мМ. Концентрации Gu-HCl могут находиться в диапазоне примерно от 50 мМ до примерно 500 мМ. Буфер для рефолдинга может содержать, по существу состоять или состоять из Трис, L-аргинина, мочевины, ЭДТА, цистеина и цистамина. Буфер для рефолдинга может содержать, по существу состоять или состоять из 100 мМ Трис pH 8,5, 1М аргинина, 10% (об./об.) глицерина, 3 мМ L-цистеина и 1 мМ цистамин-2HCl. Солюбилизированный неприродный слитый белок может быть добавлен в буфер для рефолдинга для получения смеси для рефолдинга. Концентрация неприродного слитого белка после добавления к смеси для рефолдинга может составлять примерно от 0,1 мг/мл до 1,0 мг/мл, от 0,5/мл до 1,5 мг/мл, от 0,75 мг/мл до 1,25 мг/мл или примерно 1 мг/мл. Концентрация не встречающегося в природе слитого белка в смеси для рефолдинга может составлять менее 0,5 мг/мл, 0,6 мг/мл, 0,7 мг/мл, 0,8 мг/ мл, 0,9 мг/мл или 1,0 мг/мл.
В различных вариантах осуществления используется объем примерно от 100 мл до примерно 10000 л буфера для рефолдинга. В некоторых случаях объем составляет примерно от 50 мл до примерно 1500 л. В некоторых случаях объем составляет примерно от 10 л до примерно 300 л. В некоторых случаях объем составляет по меньшей мере 200 л.
Раствор для рефолдинга может иметь определенную температуру. Например, раствор для рефолдинга можно предварительно охладить примерно до 2-12°C. В некоторых случаях раствор для рефолдинга предварительно охлаждают по меньшей мере примерно до 3°C. Данный процесс рефолдинга можно оптимизировать в зависимости от используемого белка и области применения (фиг. 18).
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения смесь для рефолдинга инкубируют в течение определенного периода времени. В некоторых случаях процесс может занять примерно 1, 2, 4, 5 или 20 ч. В некоторых случаях процесс рефолдинга занимает от 15 до 25 ч. В некоторых случаях устанавливают перистальтический насос на определенную скорость потока в зависимости от состава раствора (например, концентрации или объема) для доставки солюбилизированного материала в раствор для рефолдинга. В некоторых случаях перистальтический насос устанавливают на скорость потока 60-80 мл/мин. В процессе оптимизации использовался дизайн эксперимента (DOE) с 15 различными матрицами, 12 переменными и 200 реакциями рефолдинга. Решения принимались методом исключения.
В различных вариантах осуществления можно провести количественный анализ для определения
- 26 043603 количества или процента правильно свернутого белка в растворе, содержащем повторно свернутые неприродные слитые белки. В некоторых случаях проводят SEC-HPLC для определения количества правильно свернутого неприродного слитого белка, присутствующего в образцах рефолдинга.
Чистота повторно свернутого неприродного слитого белка может составлять от 45 до 65%, от 40 до 60% или от 45 до 55%. Чистота подвергшегося рефолдингу неприродного слитого белка может составлять по меньшей мере 40%, 45%, 50% или 55%.
Тангенциальная поточная фильтрация (TFF) солюбилизированных конструкций для доставки IL-22
В различных вариантах осуществления рефолдинг белка выполняется в комбинации с системами тангенциальной поточной фильтрации (TFF) (например, Millipore) и системами ультрафильтрации/диафильтрации (UF/DF) с определенными порогами отсечения по молекулярной массе (MWCO) или до них.
Смесь для рефолдинга белков можно затем обработать TFF для концентрирования и буферным обменом раствора. В некоторых случаях процесс выполняется ультрафильтрацией/диафильтрацией (UF/DF). Во время ультрафильтрации раствор можно сконцентрировать в 8-12 или примерно в 10 раз. За ультрафильтрацией может следовать 5-кратный буферный обмен во время диафильтрации с буфером для диафильтрации. UF/DF может включать использование фильтров Millipore Ultracell Pellican3 с отсечением по молекулярной массе 10-20 кДа с плоскими листовыми кассетами TFF 1-2 м2. Конкретные параметры (например, TMP) могут варьироваться в зависимости от молекулярных характеристик белка. Буфер для диафильтрации может содержать от 10-25 мМ Трис-основания при pH примерно от 7 до примерно 8,5 и от 50-200 мМ NaCl. Конкретные параметры могут варьироваться в зависимости от молекулярных характеристик белка. Конечный объем в конце процесса UF/DF может составлять примерно от 5 до примерно 100 л. В некоторых случаях конечный объем колеблется примерно от 10 до примерно 50 л. В некоторых случаях конечный объем составляет примерно от 80 мл примерно до 10 л.
Последующую фильтрацию можно провести с использованием системы поточной фильтрации. В некоторых случаях система поточной фильтрации представляет собой систему фильтрации AkroPac, перистальтический насос и трубки Cole-Parmer. Можно провести анализ Брэдфорда для определения концентрации белка, выхода и стадии извлечения.
В различных вариантах осуществления может быть проведен количественный анализ для определения количества или процентного содержания правильно свернутого белка в растворах образцов. В некоторых случаях проводят SEC-HPLC для определения количества правильно свернутого неприродного слитого белка, присутствующего в образцах для рефолдинга и UF/DF.
Чистота раствора, содержащего повторно свернутый неприродный слитый белок после UF/DF, может составлять от 35 до 55%, от 40 до 50%, от 43 до 47% или примерно 45%. Чистота раствора, содержащего повторно свернутый неприродный слитый белок после UF/DF, может составлять по меньшей мере 35, 40 или 45%. Извлечение солюбилизированного, повторно свернутого не встречающегося в природе слитого белка после UF/DF может составлять от 87 до 97%, от 90 до 94%, от 92 до 93% или примерно 92,5%. (Также можно использовать другие системы концентрирования и буферного обмена).
Очистка и извлечение не встречающихся в природе слитых белков
Как описано ранее, использование двух методов хроматографии в тандеме, таких как анионообменная хроматография и хроматография на гидроксиапатите (или, альтернативно, катионообменная хроматография), может привести к повышению чистоты и извлечения не встречающегося в природе слитого белка, такого как конструкции для доставки IL-22, описанные здесь, из раствора. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения характеристики хроматографии (например, тип колонки, смола, скорость потока, буферные системы, градиент и проводимость) определяются и оптимизируются в зависимости от различных параметров, например, белка, предназначенного для очистки. Для очистки белка, как здесь описано, можно использовать различные колонки для очистки.
Анионообменная хроматография
Способы, описанные здесь, могут включать проведение анионообменной хроматографии (AEX) на смеси, содержащей не встречающийся в природе слитый белок. Смесь может представлять собой раствор, содержащий повторно свернутый неприродный слитый белок. Проведение анионообменной хроматографии может дать первую фракцию, содержащую неприродный слитый белок.
Различные смолы могут использоваться в сочетании со способами и композициями по настоящему изобретению. В некоторых случаях смола содержит гранулы полиметилакрилата, функционализированного амином. В некоторых случаях для очистки белка используют анионообменную смолу NH2-750F. Колонку с высотой слоя по меньшей мере 15, 20, 25 или 30 см можно заполнить смолой. Колонка с высотой слоя от 10 до 50 см может быть заполнена смолой таким образом, чтобы обеспечить объем колонки, который может способствовать соответствующей динамической связывающей способности (например, > 20 г/л), чтобы обеспечить получение желаемого количества белка. В некоторых случаях динамическая связывающая способность колонки составляет от 5 до 100 г/л, от 20 до примерно 50 г/л, от 15 до 30 г/л или от 20 до 25 г/л.
Буферные системы, используемые для элюирования (например, градиентного элюирования) в ани- 27 043603 онообменной хроматографии, могут включать один, два, три или четыре различных буферных раствора (например, буферы от A до D). В некоторых вариантах осуществления в анионообменной хроматографии используются два буфера, которые здесь называются буфером A и буфером B. В некоторых случаях буферный раствор содержит Трис (например, 10-50 мМ, pH 7-9) и/или NaCl (например, 0,1-5 М). В некоторых случаях буферный раствор дополнительно содержит глицерин. В некоторых вариантах осуществления буферный раствор (растворы), используемый в анионообменной хроматографии, например, такой как буфер A или буфер B, содержит, по существу состоит или состоит из Трис pH 7,5 и NaCl и, необязательно, глицерина.
Буфер A может содержать от 10 до 30 мМ, от 15 до 25 мМ, от 19 до 21 мМ или примерно 20 мМ Трис, pH 7,5. Буфер A может содержать от 0,25 до 0,95 М, от 0,35 до 0,75 М, от 0,45 до 0,55 М, примерно 0,5 М, от 0,65 до 0,75 М или примерно 0,7 М NaCl. Буфер B может содержать от 10 до 30 мМ, от 15 до 25 мМ, от 19 до 21 мМ или примерно 20 мМ Трис, pH 7,5. Буфер B может содержать от 1 до 3 М, от 1,5 до 2,5 М, от 1,9 до 2,1 М или около 2 М NaCl. Буфер A может дополнительно содержать от 8% до 12%, от 9% до 11% или примерно 10% (об./об.) глицерина. Буфер B может дополнительно содержать от 8% до 12%, от 9% до 11% или примерно 10% (об./об.) глицерина.
Для анионообменной хроматографии SEQ ID NO: 15, буфер A может содержать 20 мМ Трис pH 7,5 и 0,5 М NaCl, и буфер B может содержать 20 мМ Трис pH 7,5 и 2,0 М NaCl (табл. 4). Для анионообменной хроматографии SEQ ID NO: 17, буфер A может содержать 20 мМ Трис pH 7,5 и 0,5 М NaCl, и буфер B может содержать 20 мМ Трис pH 7,5 и 2,0 М NaCl. Для анионообменной хроматографии SEQ ID NO: 14, буфер A может содержать 20 мМ Трис pH 7,5, 0,7 М NaCl и 10% (об./об.) глицерина, и буфер B может содержать 20 мМ Трис pH 7,5, 2,0 М NaCl, и 10% (об./об.) глицерина (табл. 5).
В некоторых вариантах осуществления к раствору белка добавляют определенный объем раствора соли. В некоторых случаях к раствору белка добавляют раствор NaCl с концентрацией примерно от 0,1 до примерно 5 М.
Белковые растворы загружают на колонку таким образом, чтобы можно было поддерживать определенную скорость потока и определенное время удерживания на колонке для гарантии соответствующего взаимодействия белка и твердой фазы (например, смолы). В некоторых случаях скорость потока регулируется таким образом, чтобы время удерживания на колонке составляло примерно от 30 с до примерно 6 мин или примерно 5 мин. Время удерживания на колонке может составлять по меньшей мере 30 с или 1, 2, 3, 4 или 5 мин. Время пребывания колонки может быть не более 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мин. Вытекающий поток можно собирать и анализировать, чтобы определить, есть ли несвязанный белок, что считается потерей. Для анализа и очистки белка определяют оптическую плотность при 280 нм для концентрации белка и SEC-HPLC для определения чистоты белка.
В некоторых вариантах осуществления процентное содержание (например, 0-100%) или скорость потока (например, 1-10 мл/мин) первого буфера комбинируется со вторым буфером для достижения конкретной конечной скорости потока (например, 1-10 мл/мин) колоночной системы очистки. Например, для очистки белка используется линейный градиент 20 объемов колонки (CV) от 0,0-62,5% B (100-37,5% A) с последующим ступенчатым градиентом до 100% B (0% A) для дополнительных 5 CV. В некоторых случаях градиент 0-75% B (100-25% A) 40 CV, стадия 100% B, 10 CV может быть выполнен как градиент элюирования, указывающий на чистоту белка 91-93% и выход > 90%.
Чистота неприродного слитого белка в первой фракции может составлять от 90 до 99% или от 91 до 95%. Чистота солюбилизированного неприродного слитого белка в первой фракции может составлять по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94% или 95%. Извлечение солюбилизированного неприродного слитого белка в первой фракции может составлять от 61 до 81%, от 66 до 76% или от 71 до 72%.
Катионообменная хроматография или хроматография на гидроксиапатите
Способы, описанные здесь, могут дополнительно включать подвергание первой фракции полученной после анионообменной хроматографии, обработке на катионообменной смоле, с получением второй фракции, содержащей не встречающийся в природе слитый белок. Катионообменная смола может представлять собой метакрилатную смолу, функционализированную сульфатными группами. Катионообменная смола может быть смолой TOYOPEARL® Sulfate-650F.
Способы, описанные здесь, могут дополнительно или альтернативно включать подвергание первой фракции, полученной после анионообменной хроматографии, обработке гидроксиапатитовой смолой с получением второй фракции, содержащей неприродный слитый белок. Гидроксиапатитовая смола может быть катионообменной смолой, дополнительно включающей сродство к кальцию. Гидроксиапаптитная смола может содержать фосфат кальция. Смола на основе гидроксиапаптита может иметь химическую формулу: Ca10(PO4)6(OH)2. Гидроксиапатитная смола может иметь размер частиц от 30 до 50 мкм, от 35 до 45 мкм или примерно 39 мкм. Гидроксиапатитная смола может представлять собой смолу CaPure®.
Преимущества смолы CaPure® могут включать следующее: a) солеустойчивость, позволяющую адсорбировать белок с высокой проводимостью в водных растворах; b) не требуется подготовка белков (например, слитых белков, таких как SEQ ID NO: 14-21) перед загрузкой; c) приводит к высокому извлечению (> 90%); d) высокая связывающая способность (> 20 мг/мл смолы); e) повышает чистоту за счет
- 28 043603 удаления низкомолекулярных примесей (LMW); и f) обеспечивает клиренс эндотоксинов (<1,0 МЕ/мг).
Катионообменную смолу или гидроксиапатитовую смолу можно использовать для упаковки хроматографической колонки. Колонка может иметь высоту слоя от 10 до 50 см или примерно 20 см. Колонка может иметь высоту слоя по меньшей мере 10, 15, 20, 25 или 30 см. Колонка может иметь высоту слоя не более 20, 30, 40 или 50 см. В некоторых случаях гидроксиапатитовая смола CaPure® смешанного типа используется для заполнения колонки с высотой слоя 10-50 см, обеспечивая объем колонки, обеспечивающий динамическую связывающую способность максимум 10-100 г/л для обеспечения получения желаемого количества белка.
Буферные системы, используемые для элюирования (например, градиентного элюирования) в хроматографии на гидроксиапатите, могут включать один, два, три или четыре различных буферных раствора (например, буферы от A до D). В некоторых вариантах осуществления в хроматографии на гидроксиапатите используются два буфера, которые называются здесь буфером A и буфером B. В некоторых случаях буферный раствор содержит Трис (например, 10-50 мМ, pH 7-9) и/или NaCl (например, 0,1-5 М). В некоторых случаях буферный раствор дополнительно содержит глицерин. В некоторых вариантах осуществления первый буферный раствор, используемый в хроматографии на гидроксиапатите, например, такой как буфер A, содержит, по существу состоит или состоит из Трис pH 7,5, NaCl и CaCl2. В некоторых вариантах осуществления второй буферный раствор, используемый в хроматографии на гидроксиапатите, такой как, например, буфер B, содержит, по существу состоит или состоит из фосфата натрия с pH 7,0, NaCl и CaCl2.
Буфер A может содержать от 10 до 30 мМ, от 15 до 25 мМ, от 19 до 21 мМ или примерно 20 мМ Трис, pH 7,5. Буфер A может содержать от 80 до 120 мМ, от 90 до 110 мМ или примерно 100 мМ NaCl. Буфер A может содержать от 0,5 до 1,5 мМ, от 0,75 до 1,25 мМ, от 0,9 до 1,1 мМ или примерно 1 мМ CaCl2. Буфер B может содержать от 150 до 250 мМ, от 175 до 225 мМ, от 190 до 210 мМ или примерно 200 мМ фосфата натрия, pH 7,0. Буфер B может содержать от 50 до 150 мМ, от 75 до 125 мМ, от 90 до 110 мМ или примерно 100 мМ NaCl. Буфер B может содержать от 0,5 до 1,5 мМ, от 0,75 до 1,25 мМ, от 0,9 до 1,1 мМ или примерно 1 мМ CaCl2.
Для гидроксиапатитной хроматографии SEQ ID NO: 15, буфер A может содержать 20 мМ Трис, pH 7,5, 100 мМ NaCl и 1 мМ CaCl2, и буфер B может содержать 200 мМ фосфата натрия, pH 7,0, 100 мМ NaCl и 1 мМ CaCl2 (табл. 6). Для гидроксиапатитной хроматографии SEQ ID NO: 17, буфер A может содержать 20 мМ Трис, pH 7,5, 100 мМ NaCl и 1 мМ CaCl2, и буфер B может содержать 200 мМ фосфата натрия, pH 7,0, 100 мМ NaCl и 1 мМ CaCl2. Для гидроксиапатитной хроматографии SEQ ID NO: 14, буфер A может содержать 20 мМ Трис, pH 7,5, 100 мМ NaCl и 1 мМ CaCl2, и буфер B может содержать 200 мМ фосфата натрия, pH 7,0, 100 мМ NaCl и 1 мМ CaCl2 (табл. 7).
Чистота солюбилизированного белка после использования катионообменной смолы или гидроксиапатитовой смолы может составлять от 99 до 100%. Чистота солюбилизированного белка после использования гидроксиапатитовой смолы может составлять по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%. Извлечение солюбилизированного белка после использования гидроксиапатитовой смолы может составлять от 85 до 100%, от 96 до 99% или от 97 до 98%. Гидроксиапатитовая смола может представлять собой CaPure®.
Фракции, собранные во время колоночной хроматографии, которые содержат очищенное соединение (например, слитый белок), можно сконцентрировать и формулировать для введения с использованием буферного обмена или диафильтрации. Например, фракции, собранные во время CaPure®, можно сконцентрировать и формулировать с использованием системы TFF (например, Pall Corporation) для концентрирования белка. Белок можно сконцентрировать до конечной концентрации 20 мг/мл с последующим 5-кратным буферным обменом. Процесс фильтрации можно выполнить с использованием ультрафильтрации/диафильтрации (UF/DF) и фильтров Millipore Pellican3 с отсечением по молекулярной массе 10 кДа с плоскими листовыми кассетами TFF 0,114 м2. MWCO системы фильтрации может варьироваться в зависимости от очищаемого белка (например, молекулярной массы). Буфер для диафильтрации может состоять из 10-20 мМ фосфата натрия при pH примерно 7,0, 50-100 мМ NaCl. Формулированные SEQ ID NO: 14-21 затем можно отфильтровать с использованием системы поточной фильтрации, в которой используется фильтр AkroPac 0,8/ 0,2 мкм и перистальтический насос Cole-Parmer и трубки. Очищенный и приготовленный белок можно хранить в аликвотах при -80°C до дальнейшего использования.
В конкретных вариантах осуществления белки, анализированные с помощью SEC-HPLC, могут иметь чистоту выше 97% (обычно > 98%) с использованием колонки TSKgel GW3000SWXL, 5 мкм, 7,8 мм ID х 30,0 см L (Tosoh Bioscience, 8541).
Анализ белков
Образцы из различных фракций можно анализировать с помощью SDS-PAGE с использованием системы визуализации Bio-Rad ChemiDoc® MP, и фракции, собранные во время колоночной хроматографии, можно анализировать на содержание белка с помощью Thermo Fisher Nanodrop One®. Общие методы детектирования или анализа белков включают гель-электрофорез, флуоресцентную микроскопию, капиллярный электрофорез, масс-спектрометрию, анализ сдвига электрофоретической подвижности или
- 29 043603 ядерный магнитный резонанс.
Способы лечения
В различных вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтические композиции, содержащие слитые молекулы по настоящему изобретению, предназначены для применения в лечении и/или профилактике воспалительных заболеваний. Эти фармацевтические композиции можно формулировать для пероральной доставки. Воспалительные заболевания могут включать все заболевания, связанные с острым или хроническим воспалением. Острое воспаление представляет собой первоначальную реакцию организма на неблагоприятные стимулы, возникающую в результате повышенного притока плазмы и лейкоцитов (например, гранулоцитов) из крови в поврежденные ткани. Ряд биохимических событий способствует развитию воспалительного ответа, вовлекая местную сосудистую систему, иммунную систему и различные клетки в поврежденную ткань. Длительное воспаление называется хроническим воспалением, которое приводит к прогрессивному изменению типа клеток, присутствующих в очаге воспаления, и характеризуется одновременным разрушением и заживлением ткани от воспалительного процесса. Воспалительные заболевания могут быть вызваны, например, ожогами, химическими раздражителями, обморожением, токсинами, инфекциями, вызванными патогенами, физическими травмами, иммунными реакциями в результате гиперчувствительности, ионизирующим излучением или инородными телами, например, такими как занозы, грязь и дебрис. В некоторых вариантах осуществления воспалительное заболевание представляет собой повреждение эпителиальных клеток, гепатит, ожирение, жировую болезнь печени, воспаление печени, панкреатит, болезнь Крона, фистулизирующую форму болезни Крона, язвенный колит, язвенный колит легкой-средней степени, язвенный колит средней-тяжелой степени, поухит, проктит, рассеянный склероз, системную красную волчанку, синдром трансплантат против хозяина, ревматоидный артрит или псориаз.
Кроме того, здесь описаны способы лечения заболевания или состояния у субъекта, включающие введение субъекту не встречающегося в природе слитого белка. В некоторых вариантах осуществления заболевание или патологическое состояние представляет собой повреждение эпителиальных клеток, гепатит, ожирение, жировую болезнь печени, воспаление печени, панкреатит, болезнь Крона, фистулизирующую форму болезни Крона, язвенный колит, язвенный колит легкой-средней степени, язвенный колит средней-тяжелой степени, колит, поухит, проктит, рассеянный склероз, системная красная волчанка, синдром трансплантат против хозяина, ревматоидный артрит или псориаз. Не встречающийся в природе слитый белок можно вводить субъекту перорально. Субъект может представлять собой человека.
Примеры
Данные примеры приведены только для иллюстративных целей, и не для ограничения объема формулы изобретения, представленной здесь.
Пример 1. Экспрессия конструкции для доставки
В данном примере, в общем, описано приготовление конструкции для доставки в виде одной аминокислотной последовательности, содержащей последовательность носителя, полученную из Cholix, спейсерную последовательность и терапевтическую полезную нагрузку.
Сначала последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую конструкцию для доставки SEQ ID NO: 15, амплифицировали с использованием ПЦР, включая пары рестрикционных ферментов NdeI и EcoRI, PstI и PstI, AgeI и EcoRI или сайты PstI и EcoRI на двух концах продуктов ПЦР. После расщепления рестрикционным ферментом продукты ПЦР клонировали в подходящую плазмиду для клеточной экспрессии, которую расщепляли соответствующими парами рестрикционных ферментов. Плазмида кодировала конструкцию для доставки, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 15.
Конструкцию для доставки экспрессировали следующим образом: компетентные клетки E. coli BL21(DE3) pLysS (Novagen, Madison, Wis.) трансформировали с использованием стандартного метода теплового шока в присутствии соответствующей плазмиды для генерации клеток, экспрессирующих конструкцию для доставки, селектировали на среде, содержащей ампициллин, и выделяли и культивировали в бульоне Лурия-Бертани (Difco; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) с антибиотиком, затем индуцировали для экспрессии белка добавлением 1 мМ изопропил-О-тиогалактопиранозида (IPTG) при OD 0,6. Через 2 ч после индукции IPTG клетки собирали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин. Тельца включения выделяли после лизиса клеток и дважды промывали водой в соотношении 1 г/10 мл. Осадок после лизиса клеток ресуспендировали в воде с последующим центрифугированием в течение 1 ч при 10000 об/мин при 4°C. Затем данную промывку повторяли еще один раз. Дважды промытые IB (DWIB) солюбилизировали в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCl (pH 8,2), 6 М гуанидина HCl и 10 мМ дитиотреитола (DTT). Затем солюбилизированный материал разбавляли буфером для рефолдинга, содержащим 0,1 М Трис (pH=8,5 при 4°C), 1,0 М L-аргинина, 10% глицерина, 3 мМ L-цистеина, 1 мМ цистамина-2НС1. Белок с SEQ ID NO: 15 очищали анионообменной хроматографией (ионообменная хроматография на Q-сефарозе) и гель-фильтрационной хроматографией Superdex 200 (Amersham Biosciences, Inc., Швеция). Чистоту белка определяли с помощью SDS-PAGE и аналитической ВЭЖХ (Agilent, Inc., Palo Alto, Calif.).
Конструкцию для доставки анализировали для подтверждения правильной укладки в соответствии
- 30 043603 с предполагаемым размером молекулы. После индукции экспрессированный белок собирали из телец включения. Используя тельца включения, степень экспрессии конструкции для доставки анализировали с помощью гель-электрофореза, и кажущуюся молекулярную массу сравнивали с расчетной массой.
Результаты показали стабильное и эффективное получение функциональной конструкции для доставки с высоким выходом и чистотой.
Пример 2. Модель in vitro для оценки транспорта полезной нагрузки через монослои эпителиальных клеток
В данном примере показана модель in vitro, разработанная для оценки транспортных свойств полезных нагрузок или конструкций для доставки, описанных здесь.
На фиг. 1 схематически показано устройство, содержащее апикальную камеру над монослоем эпителиальных клеток и базальную камеру под таким монослоем эпителиальных клеток.
Для определения проникновения от апикальной стороны к базолатеральной стороне, испытуемые образцы (например, конструкция для доставки, полезная нагрузка и т.д.) наносили на апикальную (A) сторону, и степень проникновения определяли на базолатеральной (B) стороне. Для определения проникновения от базолатеральной стороны к апикальной стороне, испытуемые образцы добавляли на базолатеральную (B) сторону и определяли степень проникновения на апикальной (A) стороне.
Данные можно выразить в виде проникновения (Papp) в соответствии со следующим уравнением: Papp = (dQ/dt)/(C0*A). Q/dt представляет собой скорость проникновения, C0 представляет собой начальную концентрацию испытуемого вещества, A представляет собой площадь монослоя. Коэффициент переноса потока (Re) можно рассчитать по следующему уравнению: (Re) = Papp (B-A)/Papp (A-B). Re > 2 может указывать на потенциальный субстрат для P-gp или других активных переносчиков оттока.
Клетки SMI-100 или Caco-2 можно использовать для оценки функции трансцитоза носителя или конструкции для доставки in vitro.
Для клеток Caco-2 проводили анализ ELISA для оценки способности носителя или конструкции для доставки перемещаться через монослои клеток Caco-2 посредством трансцитоза. Клетки Caco-2 (ATCC НТВ-37™) поддерживали в 5% CO2 при 37°C в полной среде: среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко F12 (DMEM F12) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 2,5 мМ глутамина, 100 Е пенициллина/мл и 100 мкг стрептомицина/мл (Gibco BRL, Grand Island, N.Y.). Клетки подпитывали данной средой (обозначенной как полная среда) каждые 2-3 дня и пассировали каждые 5-7 суток. Для проведения анализов клетки высевали в 24- или 96-луночные планшеты и культивировали до слияния.
Клетки Caco-2 культивировали в виде конфлюэнтных монослоев на покрытых коллагеном вкладышах Transwell из поликарбонатной мембраны с размером пор 0,4 мкм (Corning-Costar, Cambridge, MA) и использовали через 18-25 суток после достижения трансэпителиального электрического сопротивления (TER) > 250 Ώсм2 при измерении с помощью вольтметра Millicell-ERS® (Millipore). Апикальнобазолатеральный (A^B) транспорт носителя или конструкции для доставки через этот монослой определяли измерением количества транспортированного белка на определенные временные точки (например, 15, 30 и 45 мин) после нанесения на апикальную сторону 4,7 нМ, 23,6 нМ и 236 нМ при 37°C. Измерения TER и степень флуоресцентного декстрана 10 кДа (измеренная с использованием протокола эксклюзионной ВЭЖХ) использовали для оценки барьерных свойств монослоя в ходе исследования. Степень транспорта конструкции для доставки (например, SEQ ID NO: 15) определяли титрованием собранной среды в клеточном анализе цитотоксичности. Транспортированную конструкцию для доставки определяли с помощью иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием антител (например, против носителя или против полезной нагрузки, таких как анти-IL-22 антитело) для захвата и детектирования.
Конфлюэнтным монослоям тканей тонкого кишечника человека (SMI-100, MatTek Corporation; Ashland, MA, USA), созданным на вкладышах для культивирования клеток, перед использованием давали стабилизироваться в течение 24 ч при 37°C. Только вкладыши, имеющие трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) > 400 'Ω см2, считались имеющими достаточную целостность монослоя для использования в исследованиях. Вторичную проверку целостности монослоя проводили оценкой подавления транспорта декстрана 70 кДа. Камеры один раз промывали буфером для транспорта (PBS). Испытуемые молекулы, приготовленные в концентрации 20 мкг/ мл, наносили на апикальную поверхность вкладышей в объеме 100 мкл. Базолатеральные объемы 500 мкл PBS отбирали на каждую временную точку для исследований транспорта. Каждое экспериментальное условие выполняли в трех повторностях.
Пример 3. Опосредованный носителем транспорт IL-22 через поляризованные эпителиальные клетки кишечника
В данном примере показано, что носитель (SEQ ID NO: 7) может транспортировать полезную нагрузку IL-22 (SEQ ID NO: 11) через поляризованные эпителиальные клетки кишечника in vitro. Данный пример дополнительно демонстрирует, что носитель с SEQ ID NO: 7 может транспортировать биологически активную полезную нагрузку IL-22 через поляризованные эпителиальные клетки кишечника и в собственную пластинку оболочки кишечника in vivo.
Транспорт конструкции для доставки (SEQ ID NO: 15) через монослои клеток Caco-2 и эпителиаль- 31 043603 ную ткань тонкого кишечника (также называемую здесь SMI-100) тестировали посредством нанесения конструкции для доставки на апикальную мембрану эпителиальных клеток, согласно примеру 2 и как показано на фиг. 1 для апикального (A) к базальному (B) транспорту. Эксперименты проводили в двух повторностях, и образцы из базолатеральной камеры собирали через 15, 30 и 45 мин после нанесения в апикальную камеру для определения количества транспортированного белка. Количество трансцитозированного белка измеряли с помощью анализов ELISA, как описано в примере 2.
Данные на фиг. 2 и 3 показывают, что носитель (SEQ ID NO: 7) при связывании с IL-22 (SEQ ID NO: 11) приводил к транспорту полезной нагрузки IL-22 как через монослои Caco-2 (фиг. 2), так и через SMI-100 (фиг. 3) в зависимости от времени, и что конструкция для доставки приводила к примерно в 2-3 раза большему количеству IL-22, перенесенному через эпителиальные клетки, по сравнению с IL-22 (SEQ ID NO: 12, M+IL-2234-179), который не был связан с носителем.
Для экспериментов in vivo трансцитоз тестировали на самцах крыс Wistar. При включении в исследование самцов крыс Wistar содержали по 3-5 особей в клетке с циклом свет/темнота 12/12 ч, и их масса тела составляла примерно 225-275 г (возраст примерно 6-8 недель). Эксперименты проводили во время световой фазы с использованием протокола без восстановления животных, в котором используется непрерывная анестезия изофлураном. Проводили разрез брюшной полости по средней линии длиной 4-5 см, обнажающий среднюю часть тощей кишки. Стоковые растворы с концентрацией 3,86x10’5 М конструкции для доставки (SEQ ID NO: 15) готовили в забуренном фосфатом физиологическом растворе (PBS), где 50 мкл (на крысу массой 250 г) вводили внутрипросветной инъекцией (ILI) с использованием иглы 29 номера. Затем место инъекции отмечали перманентным маркером. По окончании исследования область размером 3-5 мм, которая захватывала отмеченный сегмент кишечника, выделяли и обрабатывали для микроскопического анализа.
Результаты трансцитозной активности конструкции для доставки (SEQ ID NO: 15) показаны на фиг. 4, демонстрируя, что значительные количества полезной нагрузки IL-22 (SEQ ID NO: 11) пересекали интактный и поляризованный эпителий кишечника in vivo, когда она представляла собой часть конструкции для доставки, которая включает связанный носитель, полученный из Cholix (SEQ ID NO: 7), с IL-22. Данное микроскопическое изображение показывает транспорт полезной нагрузки IL-22 (SEQ ID NO: 11) от апикального участка эпителия кишечника (выделено белыми стрелками № 1) к базальному участку эпителиальных клеток (выделено белой стрелкой № 2) и в собственную пластинку (сокращенно l.p.) после введения конструкции для доставки SEQ ID NO: 15 в просвет тонкого кишечника крыс Wistar. Изображение также показывает, что IL-22 взаимодействует и связывается в значительной степени с рецепторами IL-22, расположенными на клетках внутри собственной пластинки и на внешней базальной мембране поляризованного эпителия (выделено белыми стрелками № 3). Локализация IL-22 обозначена белыми стрелками № 2 и № 3.
Пример 4. Рекомбинантный человеческий IL-22 связывается с рецепторами мышиного IL-22
В данном примере показано, что рекомбинантный человеческий IL-22 (rhIL-22, SEQ ID NO: 12) связывается с рецепторами мышиного IL-22 дозозависимым образом, сравнимым с рекомбинантным мышиным IL-22 (rmIL-22).
На фиг. 5A показано фосфорилирование STAT3 в мышиных В-клетках FL83 как функция концентрации агониста (в пМ), где агонист представляет собой rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) или rmIL-22. Данные показывают, что rhIL-22 и rmIL-22 индуцируют фосфорилирование STAT3 в зависимости от концентрации, демонстрируя, что человеческий белок IL-22 может связываться и индуцировать передачу сигнала через рецепторы мышиного IL-22 так же эффективно, как и мышиный IL-22.
На фиг. 5B показано, что rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) и rmIL-22 также индуцировали фосфорилирование STAT3 в мышиных клетках Hepa1-6.
На фиг. 6A показано, что rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) и rmIL-22 индуцируют фосфорилирование STAT5 в мышиных В-клетках FL83 дозозависимым образом, демонстрируя, что человеческий белок IL22 может связываться и индуцировать передачу сигнала через рецепторы мышиного IL-22 с эффективностью, сравнимой с мышиным IL-22.
На фиг. 6B показано, что rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) и rmIL-22 также индуцируют фосфорилирование STAT5 в мышиных клетках Hepa1-6, но в последующих экспериментах необходимо будет определить дополнительный диапазон доз.
Полученные данные являются убедительным доказательством того, что rhIL-22 (например, используемый в конструкциях для доставки с SEQ ID NO: 10 или 11) способен активировать STAT3 и STAT5 в мышиных клетках, что дает основание для применения таких конструкций для доставки на мышиных моделях для оценки активности и функции IL-22.
Пример 5. Эффективность конструкции для доставки с SEQ ID NO: 15 in vivo на модели колита
В данном примере in vivo показана эффективность конструкции для доставки с SEQ ID NO: 15, содержащей производный Cholix носитель SEQ ID NO: 7, связанный с IL-22 с SEQ ID NO: 11 через линкер с SEQ ID NO: 13, по сравнению с одним IL-22 (SEQ ID NO: 12) на мышиной модели колита, индуцированного декстрансульфатом натрия (DSS).
На фиг. 7A представлен дизайн и временной график исследования in vivo с целью сравнения перо- 32 043603 рального (п/о) введения конструкции для доставки с SEQ ID NO: 15 в двух дозах, 1 мг/кг и 30 мг/кг, один раз в сутки и при введении rhIL-22 внутрибрюшинно (в/б) в дозе 4 мг/кг один раз в сутки. Исследование in vivo проводили на самках мышей C57BL/6 в возрасте 8-10 недель, получавших стандартный корм, с массой тела примерно 23 г. Колит индуцировали химически введением 2,5% натрия декстрана сульфата (DSS) в питьевой воде ad libitum. Конечные точки исследования включали процентное изменение массы тела, индекса активности заболевания, длины и массы толстого кишечника, и также результаты гистопатологии.
На фиг. 7B показаны характеристики опытной и контрольной групп, использованных в исследовании, представленном на фиг. 7A.
На фиг. 8A показано изменение массы тела животных в процентах (%) на сутки 10 исследования относительно с сутками 0 в различных опытных и контрольных группах. Изменение массы тела относительно исходного периода (сутки 0 против суток 10) для rhIL-22 с SEQ ID NO: 12 или конструкции для доставки с SEQ ID NO: 15 в сравнении с носителем не было статистически значимым при оценке однофакторным дисперсионным анализом. Положительный модельный контроль (циклоспорин) CsA достоверно отличался от носителя при оценке однофакторным дисперсионным анализом.
На фиг. 8B показано изменение массы тела опытных и контрольных животных в течение первых 10 суток исследования. Средняя масса тела в группе CsA за период исследования была достоверно выше по сравнению с контрольным носителем в период с суток 6 по сутки 10, при оценке двухфакторным дисперсионным анализом (*, **, ***). Масса тела у мышей, получавших rhIL-22 (в/б), была достоверно выше относительно контрольного носителя на сутки 10 при оценке двухфакторным дисперсионным анализом (*), * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001.
На фиг. 9 приведены результаты анализа плазмы с использованием ELISA для определения уровней IL-22 в плазме. Результаты показывают, что концентрации rhIL-22 в плазме имели тенденцию к повышению уровней в плазме после перорального введения доз 1 и 30 мг/кг конструкции для доставки с SEQ ID NO: 15 дозозависимым образом (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001; среднее значение ± SEM; n=2 наивные, 5 носитель, 5 CsA, 10 другие).
Полученные данные показывают, что конструкция для доставки с SEQ ID NO: 15 индуцировала дозозависимую тенденцию к увеличению массы тела после введения через желудочный зонд. Повышенные уровни IL-22 в плазме имели место после перорального введения конструкции для доставки с SEQ ID NO: 15 в дозах 1 и 30 мг/кг в зависимости от дозы. На основе этих данных можно предположить, что введенная перорально конструкция для доставки с SEQ ID NO: 15 способна ослаблять симптомы колита на мышиной модели с DSS, сравнимой с внутрибрюшинным введением rhIL-22.
Кроме того, оценивали биомаркеры конструкции для пероральной доставки с SEQ ID NO: 15 введением rhIL-22 мышам CD-1, как описано ниже.
На фиг. 10A показан дизайн исследования с введением однократной дозы in vivo, разработанный для идентификации биомаркера(ов) взаимодействия с мишенью после однократного (острого введения) rhIL-22 у здоровых мышей CD-1.
На фиг. 10B показан дизайн исследования in vivo с введением многократных доз (субхроническое введение), разработанный для идентификации биомаркера(ов) взаимодействия с мишенью после однократного или многократного введения rhIL-22 у здоровых мышей CD-1.
На фиг. 11A показано, что острое и субхроническое введение rhIL-22 приводило к последовательному повышению концентрации IL-22.
На фиг. 11B приведены некоторые фармакокинетические параметры, определенные во время экспериментов с острым и субхроническим введением, описанных на фиг. 11A.
На фиг. 12A показана ответная индуцированная концентрация циркулирующего мышиного Cреактивного белка (mCRP) на сутки 1 после острого введения rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) и через 5 суток субхронического введения rhIL-22 (SEQ ID NO: 12). Результаты показывают зависимое от времени увеличение циркулирующего mCRP в обеих опытных группах.
На фиг. 12B показано кратное изменение концентрации mCRP в плазме на 1 сутки после острого введения rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
На фиг. 12C показано кратное изменение концентрации mCRP в плазме через 5 суток субхронического введения rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
На фиг. 13A показана ответная индуцированная концентрация циркулирующего белка амилоида A (mSAA) в мышиной сыворотке на 1 сутки после острого введения rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) и через 5 суток субхронического введения rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
На фиг. 13B показано кратное изменение концентрации mSAA в плазме на 1 сутки после острого введения rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
На фиг. 13C показано кратное изменение концентрации mSAA в плазме через 5 суток субхронического введения rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
На фиг. 14A показана ответная индуцированная концентрация циркулирующего регенерирующего белка из островков Лангерганса 3β (Reg3β) на 1 сутки после острого введения rhIL-22 (SEQ ID NO: 12) и
- 33 043603 через 5 суток субхронического введения rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
На фиг. 14В показано кратное изменение концентрации Reg3p в плазме на 1 сутки после острого введения rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
На фиг. 14С показано кратное изменение концентрации Reg3p в плазме через 5 суток субхронического введения rhIL-22 (SEQ ID NO: 12).
Полученные результаты показывают, что три потенциальных биомаркера PD IL-22 взаимодействия с мишенью: С-реактивный белок (CRP), сывороточный белок амилоид A (SAA) и регенерирующий белок из островков Лангерганса 3β (Reg3p), можно использовать в исследованиях для оценки фармакодинамики (PD) конструкций для доставки, таких как конструкции с SEQ ID NO: 15 или 17.
Пример 6. Солюбилизация белков
627 г дважды промытых телец включения (DWIB) из ферментации SEQ ID NO: 15 ресуспендировали в 4500 мл 8М гуанидина/HCl (Gu-HCl) и 50 мМ Трис pH при 8,0. Затем добавляли 50 мМ Трис pH 8,5 для доведения объема до 6,0 л. Раствор осторожно перемешивали на пластине смесителя и добавляли 9,225 г восстанавливающего агента дитиотреитола (DTT). Конечный раствор 6 л солюбилизированного белка (SEQ ID NO: 15) состоял из 6 М Gu-HCl, 50 мМ Трис pH 8,0, 10 мМ DTT и 1 г DWIB/10 мл буфера. Раствор солюбилизированного белка (SEQ ID NO: 15) инкубировали при комнатной температуре (rt) при перемешивании на магнитной мешалке, и затем центрифугировали при 15970х g в течение 90 мин при 4°С. Супернатант, содержащий солюбилизированный белок, осторожно переносили в новый сосуд общим объемом 5520 мл. Определение концентрации белка выполняли методом Брэдфорда и составляли 15 мг/мл.
Данные демонстрируют, что солюбилизацию белка можно проводить с использованием вышеописанной процедуры.
Пример 7. Рефолдинг белка
В данном примере показан рефолдинг белка как часть процесса очистки, как представлено на блоксхеме на фиг. 17.
Раствор для рефолдинга был тщательно исследован, разработан и оптимизирован (фиг. 18). В процессе оптимизации использовали дизайн экспериментов (DOE) с 15 различными матрицами, 12 переменными и 200 реакциями рефолдинга. Решения принимались методом исключения. Начальная смесь для рефолдинга (содержащая исходный раствор для рефолдинга и повторно свернутый солюбилизированный белок (SEQ ID NO: 15)) представлены в табл. 2. Оптимизированная смесь для рефолдинга (содержащая оптимизированный раствор для рефолдинга и повторно свернутый солюбилизированный белок (SEQ ID NO: 15)) представлены в табл. 3.
Таблица 2. Начальная смесь для рефолдинга
100 мМ Трис pH 8,5 (4°С)___________________________________________________
0,5 М аргинин___________________________________________________________
М мочевина_________________________________________________________ мМ ЭДТА________________________________________________ 0,3 мМ GSH_______________________________________________________ 1 мМ GSSG__________________________________________________ концентрация 0,2 мг/мл при рефолдинге______________________________________ _______Таблица 3. Оптимизированная смесь для рефолдинга_______
100 мМ Трис pH 8,5 (4°С)____________________________________________________
1,0 М аргинин_____________________________________________________________
10% глицерина________________________________________________________ мМ L-цистеина______________________________________________________ мМ цистамина-2НСЬ________________________________________________ концентрация >0,1 мг/мл при рефолдинге_____________________________________
Раствор для рефолдинга объемом 105 л инкубировали при 4°С в течение 16 ч, и затем фильтровали через поточный фильтр (AkroPac от Pall corporation или Sartopore 2XLG от Sartorius) с использованием мембраны 0,8/0,2 мкм и перистальтического насоса Cole-Parmer и трубок.
Солюбилизированный белок (SEQ ID NO: 15) (105 г) из примера 6 добавляли к 100 л оптимизированного раствора для рефолдинга, предварительно охлажденного до 4°С.
Этот процесс был запрограммирован на один час с использованием перистальтического насоса Cole-Parmer, установленного на 73 мл/мин. Данный процесс проводили в холодном помещении при 4°С.
Оптимизированный буферный раствор для рефолдинга дает большее количество SEQ ID NO: 15 по сравнению с агрегатами SEQ ID NO: 15 (фиг. 19-20). Использование начального повторно свернутого раствора дает примерно 10-15% правильно свернутогр белка с SEQ ID NO: 15. Использование оптимизированного раствора для рефолдинга дает примерно 45-55% правильно свернутого белка с SEQ ID NO: 15.
Пример 8. Концентрирование белка и буферный обмен с использованием TFF UF/DF
В данном примере показано концентрирование белка и буферный обмен с использованием тангенциальной поточной фильтрации (TFF), основанной на принципах ультрафильтрации/диафильтрации (UF/DF).
Повторно свернутый белок (например, SEQ ID NO: 15) был обработан системой TFF (Millipore) для его 10-кратного концентрирования и 5-кратного буферного обмена. Процесс выполняли ультрафильтра
-34043603 цией/диафильтрацией (UF/DF) с использованием четырех кассет с плоскими листами MWCO Millipore Ultracell Pellican3 с порогом отсечения 10 кДа, 1,14 м2 TFF. Буфер для диафильтрации состоял из 20 мМ Трис-основания pH 7,5 и 100 мМ NaCl. Конечный объем в конце процесса UF/DF составлял 10 л. Затем данный материал фильтровали с использованием системы поточной фильтрации с использованием фильтра AkroPac 0,8/0,2 мкм от Pall Corporation и перистальтического насоса и трубок Cole-Parmer. Для определения концентрации белка, выхода и на стадии извлечения проводили анализ Брэдфорда. На данной стадии проводили количественную SEC-HPLC для определения количества правильно свернутого белка с последовательностью SEQ ID NO: 15, присутствующего в образцах рефолдинга и UF/DF. Коммерчески доступный BSA известной концентрации использовали в качестве референсного стандарта, на основе которого строили стандартную кривую для анализа Брэдфорда. Использовали систему ВЭЖХ Agilent 1100 и колонку TSKgel SuperSW3000, 4 мкм, ID 4,6 ммх30,0 см L (Tosoh Bioscience, 18675). На основе этого количественного анализа определяли эффективность рефолдинга.
Данные показывают, что рефолдинг можно выполнить с использованием буферного обмена и TFF UF/DF.
Пример 9. Хроматография белков с использованием смолы Capture Step NH2-750F®
В данном примере показаны стадии захвата белка в анионообменной хроматографии с использованием смолы NH2-750F®.
Для хроматографии белков использовали системы AKTA Avant 150 или AKTA Pilot FPLC от General Electric (GE). Анионообменную смолу Tosoh NH2-750F® использовали для упаковки колонки с минимальной высотой слоя по меньшей мере 20 см и объемом колонки, который обеспечивал бы динамическую связывающую способность 20-25 г/л. Для заполнения колонки использовали буфер из 20 мМ ацетата натрия, pH 4,5 или 20 мМ цитрата натрия, pH 4,5. Использовали следующие буферы: буфер A: 20 мМ Трис, pH 7,5, 0,5 М NaCl; буфер B: 20 мМ Трис, pH 7,5, 2,0 М NaCl. Затем колонку с NH2-750F промывали 0,5 М раствором NaOH, время контакта составляло 30 мин, и затем уравновешивали буфером A не менее 3 объемов колонки (CV) или до тех пор, пока pH и проводимость не достигали стабильных линий при ожидаемых значениях (pH 7,5-pH 7,7, примерно 49 мСм/см ± 1 мСм/см).
Перед загрузкой на колонку в раствор белка UF/DF (SEQ ID NO: 15) добавляли 0,4 М NaCl внесением 5 М стокового раствора и измеряли проводимость для обеспечения проводимости 49 мСм/см ± 2 мСм/см. Раствор белка (SEQ ID NO: 15) загружали на колонку со скоростью потока, чтобы время удерживания на колонке составляло минимум 5 мин, и собирали остаток. Колонку промывали 3 CV буфера A или до тех пор, пока оптическая плотность при 280 нм не восстанавливалась и не стала стабильной на исходном уровне, примерно 0,0 мАЕ при 280 нм. В данный момент проводили линейный градиент 20 CV от 0,0-62,5% B с последующим ступенчатым градиентом до 100% B для дополнительных 5 CV. Собирали вытекающие фракции, и их объемы не превышали 0,5 объема колонки. Образцы из различных фракций анализировали с помощью SDS-PAGE с использованием системы визуализации Bio-Rad ChemiDoc® MP, и фракции, содержащие более 90% SEQ ID NO: 15, объединяли и обозначали как NH2-750F-пул. Концентрацию белка во фракции NH2-750F-пул измеряли с помощью Thermo Fisher Nanodrop One®, считывая оптическую плотность при 280 нм (A280) с учетом коэффициента экстинкции 1,22 для SEQ ID NO: 15 и отношения 260/280 нм <0,6. Фракция NH2-750F-пул содержит примерно 1,0 M NaCl.
Примерная хроматограмма после очистки с помощью NH2-750F SEQ ID NO: 15 приведена на фиг. 21A с высотой слоя 20 см и объемом колонки 10 мл, и фиг. 21B с высотой слоя 30 см и объемом колонки 4,6 л.
Обобщенные результаты очистки на NH2-750F приведен в табл. 4 для SEQ ID NO: 15 и в табл. 5 для SEQ ID NO: 14, которые обычно получали, подвергали рефолдингу и очищали способом, аналогичным SEQ ID NO: 15.
Таблица 4. Обобщенные результаты очистки SEQ ID NO: 15 NH2-750F
- 35 043603
Таблица 5. Обобщенные результаты очистки SEQ ID NO: 14 NH2-750F
| SEQ Ш NO: 14 | |
| Буфер A | 20 мМ Трис pH 7,5, 0,7М NaCl. 10% глицерина |
| Буфер В | 20 мМ Трис pH 7,5, 2,ОМ NaCl, 10% глицерина |
| Высота слоя | минимум 20 см |
| Время удерживания | 5,0 мин |
| Градиент | 0,0-62,5%В, 20 CV |
| Связывающая способность | 20-25 г/л |
| Чистота | > 93-96% |
| Извлечение | 80-93% |
| Эндотоксины | < 1,0МЕ/мг |
Пример 10. Хроматография белков с использованием процедуры CaPure®
В данном примере показана стадия очистки в хроматографии белков с использованием процедуры CaPure®.
Системы АКТА Avant 150 или АКТА Pilot FPLC от General Electric (GE) использовали для хроматографии белков с SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 14. Гидроксиапатитную смолу смешанного типа Tosoh CaPure® использовали для упаковки колонки для каждого белка с SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 14 с минимальной высотой слоя по меньшей мере 10 см и объемом колонки, который будет обеспечивать динамическую связывающую способность максимум 20 г/л. Используемые буферы для SEQ ID NO: 15 были следующими: буфер А: 20 мМ Трис pH 7,5, 100 мМ NaCl и 1 мМ СаС12; буфер В: 200 мМ фосфат натрия, pH 7,0, 100 мМ NaCl и 1 мМ СаС12. Используемые буферы для SEQ ID NO: 14 были следующими: буфер А: 20 мМ Трис pH 7,5, 100 мМ NaCl и 1 мМ СаС12; буфер В: 200 мМ фосфат натрия, pH 7,0, 100 мМ NaCl и 1 мМ СаС12. Затем каждую колонку CaPure® очищали 0,5 М NaOH со временем контакта 30 мин или более, и затем уравновешивали буфером А как минимум с 3 объемами колонки (CV) или до тех пор, пока pH и проводимость не достигали стабильных линий при ожидаемых значениях (pH 7,5-рН 7,7, ~11 мСм/см ± 1 мСм/см). Необходимость в обработке NH2-750F-nyn перед его загрузкой на колонку отсутствовала. Это значительно снизило потерю белка, время и ресурсы. NH2-750F-πyл загружали на колонку со скоростью потока не менее 5 мин, время удерживания на колонке составляло минимум 5 мин, и собирали вытекающий поток. Колонку промывали 3 CV буфера А или до тех пор, пока оптическая плотность при 280 нм не восстанавливалась и не становилась стабильной на исходном уровне, примерно 0,0 мА. На данной стадии проводили линейный градиент 25 CV от 0-25% В с последующим ступенчатым градиентом до 100% В для дополнительных 5 CV. Собирали вытекающие фракции, и их объемы составляли от 0,36 до 1,43 объема колонки, в зависимости от профиля элюирования. Образцы из различных фракций анализировали с помощью SDS-PAGE с использованием системы визуализации ChemiDoc® МР, и фракции, содержащие более 95% SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 14, объединяли и обозначали как CaPureпул. Концентрацию белка в CaPure-пул измеряли с помощью Thermo Fisher Nanodrop One®, считывая оптическую плотность при 280 нм (А280) с учетом коэффициента экстинкции 1,22 для SEQ ID NO: 15 и отношения 260/280 нм <0,6.
Типичная хроматограмма после очистки CaPure® SEQ ID NO: 15 приведена на фиг. 22А с высотой слоя 10 см и объемом колонки 5 мл, и на фиг. 22В с высотой слоя 21 см и объемом колонки 800 мл.
Обобщенные результаты очистки CaPure® представлены в табл. 6 для SEQ ID NO: 15 и в табл. 7 для SEQ ID NO: 14.
Таблица 6. Обобщенные результаты очистки SEQ ID NO: 15 CaPure®
| SEQIDNO: 15 | |
| Буфер А | 20 мМ Трис pH 7,5, 100 мМ NaCl, 1 мМ СаС12 |
| Буфер В | 200 мМ фосфата натрия pH 7,0, 100 мМ NaCl, 1 мМ СаС12 |
| Высота слоя | 20 см |
| Время удерживания | 5,0 мин |
| Градиент | 0,0-25%В, 25 CV |
| Связывающая способность | 20 г/л |
| Чистота | >98% |
| Извлечение | >92% |
| Эндотоксины | <1,0 МЕ/мг |
-36043603
Таблица 7. Обобщенные результаты очистки SEQ ID NO: 14 CaPure®
| SEQ Ш NO: 14 | |
| Буфер А | 20 мМ Трис pH 7,5, 100 мМ NaCl, 1 мМ СаС12 |
| Буфер В | 200 мМ фосфата натрия pH 7,0, 100 мМ NaCl, 1 мМ СаС12 |
| Высота слоя | 20 см |
| Время удерживания | 5,0 мин |
| Градиент | 0,0-25% В, 25 CV |
| Связывающая способность | 20 г/л |
| Чистота | >98% |
| Извлечение | >92% |
| Эндотоксины | <1,0 МЕ/мг |
Пример 11. Концентрирование белка с использованием TFF UF/DF
В данном примере показана формуляция белка с помощью процедур TFF UF/DF.
СаРиге®-пул концентрировали с помощью системы TFF (Pall Corporation) до конечной концентрации 20 мг/мл с последующим 5-кратным буферным обменом. Процесс выполняли ультрафильтрацией/диафильтрацией (UF/DF) с использованием трех кассет с плоскими листами MWCO Millipore РеШсапЗ с порогом отсечения 10 кДа, 0,114 м2 TFF. Буфер для диафильтрации состоял из 10 мМ фосфата натрия, pH 7,0, 100 мМ NaCl. Формулированный белок с SEQ ID NO: 15 затем фильтровали с использованием системы поточной фильтрации с использованием фильтра AkroPac 0,8/0,2 мкм от Pall Corporation и перистальтического насоса и трубки Cole-Parmer. Формулированный белок с SEQ ID NO: 15 затем хранили в аликвотах при -80°С, и проводили следующие анализы, чтобы гарантировать его биофизическое качество: (1) концентрацию белка (например, SEQ ID NO: 15) при 20 мг/мл измеряли по поглощению при 280 нм при соотношении 260/280 <0,6 с использованием Thermo Fisher Nanodrop One™ и с учетом коэффициента экстинкции белка 1,22; (2) уровни эндотоксинов по данным LAL-теста были ниже 1,0 МЕ/мг, измеренные на оборудовании Charles River Laboratories; (3) чистота по данным SEC-HPLC была выше 97% (обычно > 98%) с использованием TSKgel GW3000SWXL, 5 мкм, 7,8 мм ID х 30,0 см л колонки (Tosoh Bioscience, 8541) (4) SDS-PAGE анализ с использованием аппарата Bio-Rad gel и связанной с ним системы визуализации ChemiDoc® МР.
Пример 12. Оценка активности очищенных гибридных молекул in vivo
В данном примере показаны методы подтверждения правильного фолдинга слитых молекул в отношении их способности переносить биологически активный груз через интактный эпителий.
Слитый белок с SEQ ID NO: 15 экспрессировали в E.coli, собирали из телец включения и подвергали фолдингу с использованием буферной обменной системы, как описано в примере 8 выше. Полученный материал очищали в соответствии с методами, описанными в примере 9 и примере 10, и как обобщено, например, в табл. 4-7, в зависимости от молекулярных характеристик слитой молекулы. Препарат имеет чистоту белка >98% на основе данных SDS-PAGE. Эпителиальные клетки обрабатывали слитой молекулой, имеющей SEQ ID NO: 15, в концентрациях 25 нМ и 250 нМ. По сравнению с необработанными аналогичными клетками, обработанные SEQ ID NO: 15 клетки вызывают дозозависимое уменьшение количества клеток, что оценивали с помощью проточной цитометрии живых/мертвых клеток). Значения представляют п=4 ± стандартное отклонение.
Пример 13. Масштабирование очистки слитых белков
В данном примере показано масштабирование метода очистки с использованием слитого белка SEQ ID NO: 15 (фиг. 7Аи7В).
Слитый белок с SEQ ID NO: 15 очищали в двух разных масштабах.
Первую очистку проводили с использованием хроматографической колонки объемом 10 мл, упакованной смолой NH2-750F®, и следующих параметров: высота слоя: 20 см, время удерживания: 5 мин (скорость потока: 2 мл/мин), буфер А: 20 мМ Трис pH 7,5, 0,5 М NaCl, буфер В: 20 мМ Трис pH 7,5, 2 М NaCl и с использованием следующего градиента: 0,0-62,5% В для 20 объемов колонки (CV). Слитый белок с SEQ ID NO: 15 получали с чистотой 93-96%, степенью извлечения > 71% и уровнями эндотоксинов <1,0 МЕ/мг.
Вторую очистку проводили с использованием хроматографической колонки объемом 4,6 л, упакованной смолой NH2-750F®, и следующих параметров: высота слоя: 30 см, время удерживания: 11,55 мин (скорость потока: 400 мл/мин), буфер А: 20 мМ Трис pH 7,5, 0,5 М NaCl, буфер В: 20 мМ Трис pH 7,5, 2 М NaCl и с использованием следующего градиента: 0,0-62,5% В для 20 объемов колонки (CV). Слитый белок с SEQ ID NO: 15 получали с чистотой 93-96%, степенью извлечения > 71% и уровням эндотоксинов <1,0 МЕ/мг.
Пример 14. Воспроизводимость между процессами стадий извлечения
Процесс очистки проводили для очистки слитого белка с SEQ ID NO: 15 четыре раза (партии 1-4), и
-37043603 извлечение данного слитого белка оценивали после каждой стадии процесса очистки (табл. 8). Между этими повторами наблюдали высокую степень воспроизводимости в извлечении слитого белка.
Таблица 8. Извлечение слитого белка SEQ ID NO: 15 в 4-х повторных процессах очистки
| Стадия процесса | Описание процесса | Партия 1 | Партия 2 | Партия 3 | Партия 4 | Среднее (%) |
| 2 | Рефолдинг UF/DF | 98,60% | 94% | 92,40% | 85% | 92 |
| 3 | NH2-750F | 68,60% | 66,30% | 76% | 74,50% | 71,35% |
| 4 | CaPure | 99% | 96,40% | 100% | 94,80% | 97,55 |
| 5 | Формуляция UF/DF | 97,80% | 100% | 98,75% | 100% | 99,14 |
Полученные данные демонстрируют, что способы и композиции по настоящему изобретению позволяют производить и очищать терапевтический слитый белок в большом масштабе, и что способы и композиции, раскрытые здесь, обеспечивают высокую воспроизводимость во время масштабирования.
Все способы, раскрытые и заявленные в данном документе, можно осуществить и выполнить без излишнего экспериментирования в свете настоящего раскрытия. Несмотря на то, что композиции и способы по данному раскрытию были описаны в терминах предпочтительных вариантов осуществления, специалистам в данной области техники будет очевидно, что к способам и стадиям или в последовательности стадий описанного способа могут быть применены вариации в данном документе без отклонения от концепции, сущности и объема изобретения. Более конкретно, будет очевидно, что определенные агенты, которые являются как химически, так и физиологически близкими, могут заменить агенты, описанные здесь, и при этом могут быть достигнуты такие же или подобные результаты. Все такие аналогичные замены и модификации, очевидные для специалистов в данной области техники, считаются находящимися в пределах сущности, объема и концепции раскрытия, как определено прилагаемой формулой изобретения.
Пример 15. Сравнение SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 17
Жидкостную хроматографию-масс-спектрофотометрию (ЖХ-МС) проводили на очищенных композициях, представляющих SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 17, и результаты представлены на фиг. 23В и 23А соответственно. Композицию SEQ ID NO: 17 получали, подвергали фолдингу и очищали способом, аналогичным описанному выше для композиции SEQ ID NO: 15.
Пример 16. Оценка конструкций для доставки in vivo
В данном примере описана оценка in vivo конструкции для доставки, имеющей последовательность SEQ ID NO: 15, по сравнению с носителем.
На фиг. 24 показан дизайн исследования (с однократной дозой) для оценки транспорта конструкции для доставки, имеющей последовательность SEQ ID NO: 15, через эпителий кишечника и в кровоток после пероральной (сокращенно обозначенной здесь как P.O.) доставки конструкции. Животные, использованные в этих экспериментах, представляли собой самцов мышей CD-1 без выдерживания голодными. Первичной конечной точкой исследования была общая экспозиция IL-22 в плазме, и вторичной конечной точкой были биомаркеры плазмы, включая белок, связывающий IL-22 (например, IL-22BP).
В табл. 9 представлены детали экспериментальной схемы, включая информацию о жидкой (неформулированной) конструкции для доставки и носителя.
Таблица 9. Экспериментальная схема исследования in vivo
| Групп а | Исследуе мый объект | Носител ь | Формуляция | Доза (mpk) | Путь введе ния | и (4/ два ТР) | Временные точки (ч) |
| 1 | Носитель | PBS, pH 7 | Водный болюс | па | перор ально | 4 | 1 |
| 2 | SEQ ID NO: 15 (жидкост ь) | PBS, pH 7 | Водный болюс | 90 | перор ально | 8(4*2) | 1, 2, 4, 6 |
Таблица 10. Свойства конструкции для доставки в жидкой форме
| Г руппы | Г руппы | Стах (пг/мл) | Ттах (ч) | AUC (О-бч) |
| SEQIDNO: 15жидкость | п/а | 24488 | 2 | 58126 |
Общую экспозицию IL-22 в плазме определяли на соответствующие временные точки, показанные в табл. 9. На фиг. 25А показана общая системная экспозиция IL-22 (в пг/мл), и на фиг. 25В показана экспозиция IL-22BP (в пг/мл) на разные временные точки, когда были отобраны образцы крови и проведены измерения. На фиг. 26А-26В приведены результаты индивидуальных измерений и точки данных для каждой группы, тестированной в данном исследовании.
Было отмечено, что введенная перорально конструкция для доставки, имеющая последовательность, показанную в SEQ ID NO: 15, обеспечивала IL-22 в плазме.
-38043603
Пример 17. Длина спейсера и связывание полезной нагрузки с N- или C-концом носителя не оказывает существенного влияния на биологическую активность полезной нагрузки
В данном примере показано, что аминокислотные линкеры различной длины и связывание гетерологичной полезной нагрузки с N-концом носителя не оказывают существенного влияния на способность полезной нагрузки связываться со своей мишенью при включении в конструкцию для доставки. Исследованными аминокислотными линкерами были SEQ ID NO: 13 (GGGGSGGGGSGGGGS), SEQ ID NO: 28 (GGGGS) и SEQ ID NO: 31 (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS).
Анализ димеризации рецептора IL-22 проводили посевом клеток DiscoverX НЕК293 и инкубацией клеток в течение 16 ч (5000 клеток на лунку) с использованием указанных концентраций агониста (конструкция для доставки, содержащая полезную нагрузку IL-22). Люминесценцию в качестве конечной точки считывали на планшет-ридере с использованием анализа димеризации PathHunter® eXpress IL22RA1/IL10RB.
На фиг. 27A показано, что длина аминокислотных спейсеров с SEQ ID NO: 13, 28 и 31 не влияет на способность IL-22 (SEQ ID NO: 11) при включении в конструкции для доставки с SEQ ID NO: 15, 32 и 33 в индукции димеризации рецептора IL-22. Индукция димеризации рецептора контрольного рекомбинантного человеческого IL-22 (rhIL-22, SEQ ID NO: 12) показана черной кривой.
На фиг. 27B показано, что связывание полезной нагрузки IL-22 (SEQ ID NO: 11) с N- или C-концом носителя, содержащего аминокислотные остатки 1-266 SEQ ID NO: 1, через спейсер с SEQ ID NO: 28, существенно не изменило способность конструкций для доставки с SEQ ID NO: 32, 34 и 35 индуцировать димеризацию рецептора IL-22. Индукция димеризации рецептора контрольного рекомбинантного человеческого IL-22 (rhIL-22) показана черной кривой.
Анализ активации pSTAT3 проводили с использованием клеток Colo205, инкубированных с 10 мкл агониста (соответствующей конструкции для доставки или контрольного IL-22), имеющего различные концентрации, в течение 15 мин. Затем степень активации pSTAT3 определяли с использованием планшетов MSD STAT3 (номер по каталогу N450SMA-1).
На фиг. 27C показано, что длина аминокислотных спейсеров с SEQ ID NO: 13, 28 и 31 не влияет на способность IL-22 (SEQ ID NO: 11) при включении в конструкции для доставки с SEQ ID NO: 15, 32 и 33, индуцировать активацию pSTAT3. Активация pSTAT3 контрольного рекомбинантного человеческого IL-22 (rhIL-22, SEQ ID NO: 12) показана черной кривой.
На фиг. 27D показано, что связывание полезной нагрузки IL-22 (SEQ ID NO: 11) с N- или C-концом носителя, содержащего аминокислотные остатки 1-266 SEQ ID NO: 1, через спейсер с SEQ ID NO: 28 существенно не изменило способность конструкций для доставки с SEQ ID NO: 32, 34 и 35 индуцировать активацию pSTAT3. Активация pSTAT3 контрольного рекомбинантного человеческого IL-22 (rhIL-22) показана черной кривой.
- 39 043603
Список последовательностей <110> ЭППЛАЙД МОЛЕКЬЮЛАР ТРАНСПОРТ ИНК.
<120> КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ ДОСТАВКИ ДЛЯ ТРАНСЦИТОЗА И СВЯЗАННЫЕ СПОСОБЫ <130> 40566-716.601 <140> PCT/US2019/060356 <141> 2019-11-07 <150> PCT/US2019/050708 <151> 2019-09-11 <150> 62/888,238 <151> 2019-08-16 <150> 62/888,133 <151> 2019-08-16 <150> PCT/US2019/021474 <151> 2019-03-08 <150> 62/756,889 <151> 2018-11-07 <160>41 <170> PATENTIN VERSION 3.5 <210> 1 <211> 634 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 1
VAL GLU GLU ALA LEU ASN ILE PHE ASP GLU CYS ARG SER PRO CYS SER
5 1015
LEU THR PRO GLU PRO GLY LYS PRO ILE GLN SER LYS LEU SER ILE PRO
2530
SER ASP VAL VAL LEU ASP GLU GLY VAL LEU TYR TYR SER MET THR ILE
4045
ASN ASP GLU GLN ASN ASP ILE LYS ASP GLU ASP LYS GLY GLU SER ILE 50 5560
ILE THR ILE GLY GLU PHE ALA THR VAL ARG ALA THR ARG HIS TYR VAL
70 7580
ASN GLN ASP ALA PRO PHE GLY VAL ILE HIS LEU ASP ILE THR THR GLU
9095
ASN GLY THR LYS THR TYR SER TYR ASN ARG LYS GLU GLY GLU PHE ALA
100 105110
ILE ASN TRP LEU VAL PRO ILE GLY GLU ASP SER PRO ALA SER ILE LYS
115 120125
- 40 043603
ILE SER VAL ASP GLU LEU ASP GLN GLN ARG ASN ILE ILE GLU VAL PRO 130 135140
LYS LEU TYR SER ILE ASP LEU ASP ASN GLN THR LEU GLU GLN TRP LYS 145 150 155160
THR GLN GLY ASN VAL SER PHE SER VAL THR ARG PRO GLU HIS ASN ILE 165 170175
ALA ILE SER TRP PRO SER VAL SER TYR LYS ALA ALA GLN LYS GLU GLY 180 185190
SER ARG HIS LYS ARG TRP ALA HIS TRP HIS THR GLY LEU ALA LEU CYS 195 200205
TRP LEU VAL PRO MET ASP ALA ILE TYR ASN TYR ILE THR GLN GLN ASN 210 215220
CYS THR LEU GLY ASP ASN TRP PHE GLY GLY SER TYR GLU THR VAL ALA 225 230 235240
GLY THR PRO LYS VAL ILE THR VAL LYS GLN GLY ILE GLU GLN LYS PRO 245 250255
VAL GLU GLN ARG ILE HIS PHE SER LYS GLY ASN ALA MET SER ALA LEU 260 265270
ALA ALA HIS ARG VAL CYS GLY VAL PRO LEU GLU THR LEU ALA ARG SER 275 280285
ARG LYS PRO ARG ASP LEU THR ASP ASP LEU SER CYS ALA TYR GLN ALA 290 295300
GLN ASN ILE VAL SER LEU PHE VAL ALA THR ARG ILE LEU PHE SER HIS 305 310 315320
LEU ASP SER VAL PHE THR LEU ASN LEU ASP GLU GLN GLU PRO GLU VAL 325 330335
ALA GLU ARG LEU SER ASP LEU ARG ARG ILE ASN GLU ASN ASN PRO GLY 340 345350
MET VAL THR GLN VAL LEU THR VAL ALA ARG GLN ILE TYR ASN ASP TYR 355 360365
VAL THR HIS HIS PRO GLY LEU THR PRO GLU GLN THR SER ALA GLY ALA 370 375380
GLN ALA ALA ASP ILE LEU SER LEU PHE CYS PRO ASP ALA ASP LYS SER 385 390 395400
CYS VAL ALA SER ASN ASN ASP GLN ALA ASN ILE ASN ILE GLU SER ARG 405 410415
SER GLY ARG SER TYR LEU PRO GLU ASN ARG ALA VAL ILE THR PRO GLN 420 425430
GLY VAL THR ASN TRP THR TYR GLN GLU LEU GLU ALA THR HIS GLN ALA 435 440445
LEU THR ARG GLU GLY TYR VAL PHE VAL GLY TYR HIS GLY THR ASN HIS 450 455460
- 41 043603
VAL ALA ALA GLN THR ILE VAL ASN ARG ILE ALA PRO VAL PRO ARG GLY 465 470 475480
ASN ASN THR GLU ASN GLU GLU LYS TRP GLY GLY LEU TYR VAL ALA THR 485 490495
HIS ALA GLU VAL ALA HIS GLY TYR ALA ARG ILE LYS GLU GLY THR GLY 500 505510
GLU TYR GLY LEU PRO THR ARG ALA GLU ARG ASP ALA ARG GLY VAL MET 515 520525
LEU ARG VAL TYR ILE PRO ARG ALA SER LEU GLU ARG PHE TYR ARG THR 530 535540
ASN THR PRO LEU GLU ASN ALA GLU GLU HIS ILE THR GLN VAL ILE GLY 545 550 555560
HIS SER LEU PRO LEU ARG ASN GLU ALA PHE THR GLY PRO GLU SER ALA 565 570575
GLY GLY GLU ASP GLU THR VAL ILE GLY TRP ASP MET ALA ILE HIS ALA 580 585590
VAL ALA ILE PRO SER THR ILE PRO GLY ASN ALA TYR GLU GLU LEU ALA 595 600605
ILE ASP GLU GLU ALA VAL ALA LYS GLU GLN SER ILE SER THR LYS PRO 610 615620
PRO TYR LYS GLU ARG LYS ASP GLU LEU LYS
625630 <210>2 <211> 386 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 2
VAL GLU GLU ALA LEU ASN ILE PHE ASP GLU CYS ARG SER PRO CYS SER 1 5 1015
LEU THR PRO GLU PRO GLY LYS PRO ILE GLN SER LYS LEU SER ILE PRO 20 2530
SER ASP VAL VAL LEU ASP GLU GLY VAL LEU TYR TYR SER MET THR ILE 35 4045
ASN ASP GLU GLN ASN ASP ILE LYS ASP GLU ASP LYS GLY GLU SER ILE 50 5560
ILE THR ILE GLY GLU PHE ALA THR VAL ARG ALA THR ARG HIS TYR VAL 65 70 7580
ASN GLN ASP ALA PRO PHE GLY VAL ILE HIS LEU ASP ILE THR THR GLU 85 9095
ASN GLY THR LYS THR TYR SER TYR ASN ARG LYS GLU GLY GLU PHE ALA
- 42 043603
100 105110
ILE ASN TRP LEU VAL PRO ILE GLY GLU ASP SER PRO ALA SER ILE LYS 115 120125
ILE SER VAL ASP GLU LEU ASP GLN GLN ARG ASN ILE ILE GLU VAL PRO 130 135140
LYS LEU TYR SER ILE ASP LEU ASP ASN GLN THR LEU GLU GLN TRP LYS 145 150 155160
THR GLN GLY ASN VAL SER PHE SER VAL THR ARG PRO GLU HIS ASN ILE 165 170175
ALA ILE SER TRP PRO SER VAL SER TYR LYS ALA ALA GLN LYS GLU GLY 180 185190
SER ARG HIS LYS ARG TRP ALA HIS TRP HIS THR GLY LEU ALA LEU CYS 195 200205
TRP LEU VAL PRO MET ASP ALA ILE TYR ASN TYR ILE THR GLN GLN ASN 210 215220
CYS THR LEU GLY ASP ASN TRP PHE GLY GLY SER TYR GLU THR VAL ALA 225 230 235240
GLY THR PRO LYS VAL ILE THR VAL LYS GLN GLY ILE GLU GLN LYS PRO 245 250255
VAL GLU GLN ARG ILE HIS PHE SER LYS GLY ASN ALA MET SER ALA LEU 260 265270
ALA ALA HIS ARG VAL CYS GLY VAL PRO LEU GLU THR LEU ALA ARG SER 275 280285
ARG LYS PRO ARG ASP LEU THR ASP ASP LEU SER CYS ALA TYR GLN ALA 290 295300
GLN ASN ILE VAL SER LEU PHE VAL ALA THR ARG ILE LEU PHE SER HIS 305 310 315320
LEU ASP SER VAL PHE THR LEU ASN LEU ASP GLU GLN GLU PRO GLU VAL 325 330335
ALA GLU ARG LEU SER ASP LEU ARG ARG ILE ASN GLU ASN ASN PRO GLY 340 345350
MET VAL THR GLN VAL LEU THR VAL ALA ARG GLN ILE TYR ASN ASP TYR 355 360365
VAL THR HIS HIS PRO GLY LEU THR PRO GLU GLN THR SER ALA GLY ALA 370 375380
GLN ALA 385 <210> 3 <211> 266 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
- 43 043603 <223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ
ПОЛИПЕПТИД <400> 3
VAL GLU GLU ALA LEU ASN ILE PHE ASP GLU CYS ARG SER PRO CYS SER
5 1015
LEU THR PRO GLU PRO GLY LYS PRO ILE GLN SER LYS LEU SER ILE PRO
2530
SER ASP VAL VAL LEU ASP GLU GLY VAL LEU TYR TYR SER MET THR ILE
4045
ASN ASP GLU GLN ASN ASP ILE LYS ASP GLU ASP LYS GLY GLU SER ILE 50 5560
ILE THR ILE GLY GLU PHE ALA THR VAL ARG ALA THR ARG HIS TYR VAL
70 7580
ASN GLN ASP ALA PRO PHE GLY VAL ILE HIS LEU ASP ILE THR THR GLU 85 9095
ASN GLY THR LYS THR TYR SER TYR ASN ARG LYS GLU GLY GLU PHE ALA
100 105110
ILE ASN TRP LEU VAL PRO ILE GLY GLU ASP SER PRO ALA SER ILE LYS
115 120125
ILE SER VAL ASP GLU LEU ASP GLN GLN ARG ASN ILE ILE GLU VAL PRO
130 135140
LYS LEU TYR SER ILE ASP LEU ASP ASN GLN THR LEU GLU GLN TRP LYS
145 150 155160
THR GLN GLY ASN VAL SER PHE SER VAL THR ARG PRO GLU HIS ASN ILE
165 170175
ALA ILE SER TRP PRO SER VAL SER TYR LYS ALA ALA GLN LYS GLU GLY
180 185190
SER ARG HIS LYS ARG TRP ALA HIS TRP HIS THR GLY LEU ALA LEU CYS
195 200205
TRP LEU VAL PRO MET ASP ALA ILE TYR ASN TYR ILE THR GLN GLN ASN
210 215220
CYS THR LEU GLY ASP ASN TRP PHE GLY GLY SER TYR GLU THR VAL ALA
225 230 235240
GLY THR PRO LYS VAL ILE THR VAL LYS GLN GLY ILE GLU GLN LYS PRO
245 250255
VAL GLU GLN ARG ILE HIS PHE SER LYS GLY
260265 <210> 4 <211> 386 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ
- 44 043603
ПОЛИПЕПТИД <400> 4
LEU GLU GLU ALA LEU ASN ILE PHE ASP GLU CYS ARG SER PRO CYS SER 1 5 1015
LEU THR PRO GLU PRO GLY LYS PRO ILE GLN SER LYS LEU SER ILE PRO 20 2530
SER ASP VAL VAL LEU ASP GLU GLY VAL LEU TYR TYR SER MET THR ILE 35 4045
ASN ASP GLU GLN ASN ASP ILE LYS ASP GLU ASP LYS GLY GLU SER ILE 50 5560
ILE THR ILE GLY GLU PHE ALA THR VAL ARG ALA THR ARG HIS TYR VAL 65 70 7580
ASN GLN ASP ALA PRO PHE GLY VAL ILE HIS LEU ASP ILE THR THR GLU 85 9095
ASN GLY THR LYS THR TYR SER TYR ASN ARG LYS GLU GLY GLU PHE ALA 100 105110
ILE ASN TRP LEU VAL PRO ILE GLY GLU ASP SER PRO ALA SER ILE LYS 115 120125
ILE SER VAL ASP GLU LEU ASP GLN GLN ARG ASN ILE ILE GLU VAL PRO 130 135140
LYS LEU TYR SER ILE ASP LEU ASP ASN GLN THR LEU GLU GLN TRP LYS 145 150 155160
THR GLN GLY ASN VAL SER PHE SER VAL THR ARG PRO GLU HIS ASN ILE 165 170175
ALA ILE SER TRP PRO SER VAL SER TYR LYS ALA ALA GLN LYS GLU GLY 180 185190
SER ARG HIS LYS ARG TRP ALA HIS TRP HIS THR GLY LEU ALA LEU CYS 195 200205
TRP LEU VAL PRO MET ASP ALA ILE TYR ASN TYR ILE THR GLN GLN ASN 210 215220
CYS THR LEU GLY ASP ASN TRP PHE GLY GLY SER TYR GLU THR VAL ALA 225 230 235240
GLY THR PRO LYS VAL ILE THR VAL LYS GLN GLY ILE GLU GLN LYS PRO 245 250255
VAL GLU GLN ARG ILE HIS PHE SER LYS GLY ASN ALA MET SER ALA LEU 260 265270
ALA ALA HIS ARG VAL CYS GLY VAL PRO LEU GLU THR LEU ALA ARG SER 275 280285
ARG LYS PRO ARG ASP LEU THR ASP ASP LEU SER CYS ALA TYR GLN ALA 290 295300
GLN ASN ILE VAL SER LEU PHE VAL ALA THR ARG ILE LEU PHE SER HIS 305 310 315320
- 45 043603
LEU ASP SER VAL PHE THR LEU ASN LEU ASP GLU GLN GLU PRO GLU VAL
325 330335
ALA GLU ARG LEU SER ASP LEU ARG ARG ILE ASN GLU ASN ASN PRO GLY
340 345350
MET VAL THR GLN VAL LEU THR VAL ALA ARG GLN ILE TYR ASN ASP TYR
355 360365
VAL THR HIS HIS PRO GLY LEU THR PRO GLU GLN THR SER ALA GLY ALA
370 375380
GLN ALA
385 <210> 5 <211> 266 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 5
LEU GLU GLU ALA LEU ASN ILE PHE ASP GLU CYS ARG SER PRO CYS SER
5 1015
LEU THR PRO GLU PRO GLY LYS PRO ILE GLN SER LYS LEU SER ILE PRO
2530
SER ASP VAL VAL LEU ASP GLU GLY VAL LEU TYR TYR SER MET THR ILE
4045
ASN ASP GLU GLN ASN ASP ILE LYS ASP GLU ASP LYS GLY GLU SER ILE 50 5560
ILE THR ILE GLY GLU PHE ALA THR VAL ARG ALA THR ARG HIS TYR VAL
70 7580
ASN GLN ASP ALA PRO PHE GLY VAL ILE HIS LEU ASP ILE THR THR GLU
9095
ASN GLY THR LYS THR TYR SER TYR ASN ARG LYS GLU GLY GLU PHE ALA
100 105110
ILE ASN TRP LEU VAL PRO ILE GLY GLU ASP SER PRO ALA SER ILE LYS
115 120125
ILE SER VAL ASP GLU LEU ASP GLN GLN ARG ASN ILE ILE GLU VAL PRO
130 135140
LYS LEU TYR SER ILE ASP LEU ASP ASN GLN THR LEU GLU GLN TRP LYS
145 150 155160
THR GLN GLY ASN VAL SER PHE SER VAL THR ARG PRO GLU HIS ASN ILE
165 170175
ALA ILE SER TRP PRO SER VAL SER TYR LYS ALA ALA GLN LYS GLU GLY
180 185190
SER ARG HIS LYS ARG TRP ALA HIS TRP HIS THR GLY LEU ALA LEU CYS
- 46 043603
195 200205
TRP LEU VAL PRO MET ASP ALA ILE TYR ASN TYR ILE THR GLN GLN ASN 210 215220
CYS THR LEU GLY ASP ASN TRP PHE GLY GLY SER TYR GLU THR VAL ALA 225 230 235240
GLY THR PRO LYS VAL ILE THR VAL LYS GLN GLY ILE GLU GLN LYS PRO 245 250255
VAL GLU GLN ARG ILE HIS PHE SER LYS GLY 260265 <210> 6 <211> 387 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 6 MET VAL GLU GLU ALA LEU ASN ILE PHE ASP GLU CYS ARG SER PRO CYS 1 5 1015
SER LEU THR PRO GLU PRO GLY LYS PRO ILE GLN SER LYS LEU SER ILE 20 2530
PRO SER ASP VAL VAL LEU ASP GLU GLY VAL LEU TYR TYR SER MET THR 35 4045
ILE ASN ASP GLU GLN ASN ASP ILE LYS ASP GLU ASP LYS GLY GLU SER 50 5560
ILE ILE THR ILE GLY GLU PHE ALA THR VAL ARG ALA THR ARG HIS TYR 65 70 7580
VAL ASN GLN ASP ALA PRO PHE GLY VAL ILE HIS LEU ASP ILE THR THR 85 9095
GLU ASN GLY THR LYS THR TYR SER TYR ASN ARG LYS GLU GLY GLU PHE 100 105110
ALA ILE ASN TRP LEU VAL PRO ILE GLY GLU ASP SER PRO ALA SER ILE 115 120125
LYS ILE SER VAL ASP GLU LEU ASP GLN GLN ARG ASN ILE ILE GLU VAL 130 135140
PRO LYS LEU TYR SER ILE ASP LEU ASP ASN GLN THR LEU GLU GLN TRP 145 150 155160
LYS THR GLN GLY ASN VAL SER PHE SER VAL THR ARG PRO GLU HIS ASN 165 170175
ILE ALA ILE SER TRP PRO SER VAL SER TYR LYS ALA ALA GLN LYS GLU 180 185190
GLY SER ARG HIS LYS ARG TRP ALA HIS TRP HIS THR GLY LEU ALA LEU 195 200205
- 47 043603
CYS TRP LEU VAL PRO MET ASP ALA ILE TYR ASN TYR ILE THR GLN GLN 210 215220
ASN CYS THR LEU GLY ASP ASN TRP PHE GLY GLY SER TYR GLU THR VAL 225 230 235240
ALA GLY THR PRO LYS VAL ILE THR VAL LYS GLN GLY ILE GLU GLN LYS 245 250255
PRO VAL GLU GLN ARG ILE HIS PHE SER LYS GLY ASN ALA MET SER ALA 260 265270
LEU ALA ALA HIS ARG VAL CYS GLY VAL PRO LEU GLU THR LEU ALA ARG 275 280285
SER ARG LYS PRO ARG ASP LEU THR ASP ASP LEU SER CYS ALA TYR GLN 290 295300
ALA GLN ASN ILE VAL SER LEU PHE VAL ALA THR ARG ILE LEU PHE SER 305 310 315320
HIS LEU ASP SER VAL PHE THR LEU ASN LEU ASP GLU GLN GLU PRO GLU 325 330335
VAL ALA GLU ARG LEU SER ASP LEU ARG ARG ILE ASN GLU ASN ASN PRO 340 345350
GLY MET VAL THR GLN VAL LEU THR VAL ALA ARG GLN ILE TYR ASN ASP 355 360365
TYR VAL THR HIS HIS PRO GLY LEU THR PRO GLU GLN THR SER ALA GLY 370 375380
ALA GLN ALA 385 <210> 7 <211> 267 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 7
MET VAL GLU GLU ALA LEU ASN ILE PHE ASP GLU CYS ARG SER PRO CYS
5 1015
SER LEU THR PRO GLU PRO GLY LYS PRO ILE GLN SER LYS LEU SER ILE
2530
PRO SER ASP VAL VAL LEU ASP GLU GLY VAL LEU TYR TYR SER MET THR
4045
ILE ASN ASP GLU GLN ASN ASP ILE LYS ASP GLU ASP LYS GLY GLU SER 50 5560
ILE ILE THR ILE GLY GLU PHE ALA THR VAL ARG ALA THR ARG HIS TYR
70 7580
- 48 043603
VAL ASN GLN ASP ALA PRO PHE GLY VAL ILE HIS LEU ASP ILE THR THR 85 9095
GLU ASN GLY THR LYS THR TYR SER TYR ASN ARG LYS GLU GLY GLU PHE
100 105110
ALA ILE ASN TRP LEU VAL PRO ILE GLY GLU ASP SER PRO ALA SER ILE
115 120125
LYS ILE SER VAL ASP GLU LEU ASP GLN GLN ARG ASN ILE ILE GLU VAL
130 135140
PRO LYS LEU TYR SER ILE ASP LEU ASP ASN GLN THR LEU GLU GLN TRP
145 150 155160
LYS THR GLN GLY ASN VAL SER PHE SER VAL THR ARG PRO GLU HIS ASN
165 170175
ILE ALA ILE SER TRP PRO SER VAL SER TYR LYS ALA ALA GLN LYS GLU
180 185190
GLY SER ARG HIS LYS ARG TRP ALA HIS TRP HIS THR GLY LEU ALA LEU
195 200205
CYS TRP LEU VAL PRO MET ASP ALA ILE TYR ASN TYR ILE THR GLN GLN
210 215220
ASN CYS THR LEU GLY ASP ASN TRP PHE GLY GLY SER TYR GLU THR VAL
225 230 235240
ALA GLY THR PRO LYS VAL ILE THR VAL LYS GLN GLY ILE GLU GLN LYS
245 250255
PRO VAL GLU GLN ARG ILE HIS PHE SER LYS GLY
260265 <210> 8 <211> 387 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 8
MET LEU GLU GLU ALA LEU ASN ILE PHE ASP GLU CYS ARG SER PRO CYS
5 1015
SER LEU THR PRO GLU PRO GLY LYS PRO ILE GLN SER LYS LEU SER ILE
2530
PRO SER ASP VAL VAL LEU ASP GLU GLY VAL LEU TYR TYR SER MET THR
4045
ILE ASN ASP GLU GLN ASN ASP ILE LYS ASP GLU ASP LYS GLY GLU SER 50 5560
ILE ILE THR ILE GLY GLU PHE ALA THR VAL ARG ALA THR ARG HIS TYR
70 7580
- 49 043603
VAL ASN GLN ASP ALA PRO PHE GLY VAL ILE HIS LEU ASP ILE THR THR 85 9095
GLU ASN GLY THR LYS THR TYR SER TYR ASN ARG LYS GLU GLY GLU PHE 100 105110
ALA ILE ASN TRP LEU VAL PRO ILE GLY GLU ASP SER PRO ALA SER ILE 115 120125
LYS ILE SER VAL ASP GLU LEU ASP GLN GLN ARG ASN ILE ILE GLU VAL 130 135140
PRO LYS LEU TYR SER ILE ASP LEU ASP ASN GLN THR LEU GLU GLN TRP 145 150 155160
LYS THR GLN GLY ASN VAL SER PHE SER VAL THR ARG PRO GLU HIS ASN 165 170175
ILE ALA ILE SER TRP PRO SER VAL SER TYR LYS ALA ALA GLN LYS GLU 180 185190
GLY SER ARG HIS LYS ARG TRP ALA HIS TRP HIS THR GLY LEU ALA LEU 195 200205
CYS TRP LEU VAL PRO MET ASP ALA ILE TYR ASN TYR ILE THR GLN GLN 210 215220
ASN CYS THR LEU GLY ASP ASN TRP PHE GLY GLY SER TYR GLU THR VAL 225 230 235240
ALA GLY THR PRO LYS VAL ILE THR VAL LYS GLN GLY ILE GLU GLN LYS 245 250255
PRO VAL GLU GLN ARG ILE HIS PHE SER LYS GLY ASN ALA MET SER ALA 260 265270
LEU ALA ALA HIS ARG VAL CYS GLY VAL PRO LEU GLU THR LEU ALA ARG 275 280285
SER ARG LYS PRO ARG ASP LEU THR ASP ASP LEU SER CYS ALA TYR GLN 290 295300
ALA GLN ASN ILE VAL SER LEU PHE VAL ALA THR ARG ILE LEU PHE SER 305 310 315320
HIS LEU ASP SER VAL PHE THR LEU ASN LEU ASP GLU GLN GLU PRO GLU 325 330335
VAL ALA GLU ARG LEU SER ASP LEU ARG ARG ILE ASN GLU ASN ASN PRO 340 345350
GLY MET VAL THR GLN VAL LEU THR VAL ALA ARG GLN ILE TYR ASN ASP 355 360365
TYR VAL THR HIS HIS PRO GLY LEU THR PRO GLU GLN THR SER ALA GLY 370 375380
ALA GLN ALA 385 <210> 9
- 50 043603 <211> 267 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 9
MET LEU GLU GLU ALA LEU ASN ILE PHE ASP GLU CYS ARG SER PRO CYS
5 1015
SER LEU THR PRO GLU PRO GLY LYS PRO ILE GLN SER LYS LEU SER ILE
2530
PRO SER ASP VAL VAL LEU ASP GLU GLY VAL LEU TYR TYR SER MET THR
4045
ILE ASN ASP GLU GLN ASN ASP ILE LYS ASP GLU ASP LYS GLY GLU SER 50 5560
ILE ILE THR ILE GLY GLU PHE ALA THR VAL ARG ALA THR ARG HIS TYR
70 7580
VAL ASN GLN ASP ALA PRO PHE GLY VAL ILE HIS LEU ASP ILE THR THR
9095
GLU ASN GLY THR LYS THR TYR SER TYR ASN ARG LYS GLU GLY GLU PHE
100 105110
ALA ILE ASN TRP LEU VAL PRO ILE GLY GLU ASP SER PRO ALA SER ILE
115 120125
LYS ILE SER VAL ASP GLU LEU ASP GLN GLN ARG ASN ILE ILE GLU VAL
130 135140
PRO LYS LEU TYR SER ILE ASP LEU ASP ASN GLN THR LEU GLU GLN TRP
145 150 155160
LYS THR GLN GLY ASN VAL SER PHE SER VAL THR ARG PRO GLU HIS ASN
165 170175
ILE ALA ILE SER TRP PRO SER VAL SER TYR LYS ALA ALA GLN LYS GLU
180 185190
GLY SER ARG HIS LYS ARG TRP ALA HIS TRP HIS THR GLY LEU ALA LEU
195 200205
CYS TRP LEU VAL PRO MET ASP ALA ILE TYR ASN TYR ILE THR GLN GLN
210 215220
ASN CYS THR LEU GLY ASP ASN TRP PHE GLY GLY SER TYR GLU THR VAL
225 230 235240
ALA GLY THR PRO LYS VAL ILE THR VAL LYS GLN GLY ILE GLU GLN LYS
245 250255
PRO VAL GLU GLN ARG ILE HIS PHE SER LYS GLY
260265 <210> 10 <211> 179
- 51 043603 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
< 223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 10
MET ALA ALA LEU GLN LYS SER VAL SER SER PHE LEU MET GLY THR LEU
5 1015
ALA THR SER CYS LEU LEU LEU LEU ALA LEU LEU VAL GLN GLY GLY ALA
2530
ALA ALA PRO ILE SER SER HIS CYS ARG LEU ASP LYS SER ASN PHE GLN
4045
GLN PRO TYR ILE THR ASN ARG THR PHE MET LEU ALA LYS GLU ALA SER
5560
LEU ALA ASP ASN ASN THR ASP VAL ARG LEU ILE GLY GLU LYS LEU PHE
70 7580
HIS GLY VAL SER MET SER GLU ARG CYS TYR LEU MET LYS GLN VAL LEU
9095
ASN PHE THR LEU GLU GLU VAL LEU PHE PRO GLN SER ASP ARG PHE GLN
100 105110
PRO TYR MET GLN GLU VAL VAL PRO PHE LEU ALA ARG LEU SER ASN ARG
115 120125
LEU SER THR CYS HIS ILE GLU GLY ASP ASP LEU HIS ILE GLN ARG ASN
130 135140
VAL GLN LYS LEU LYS ASP THR VAL LYS LYS LEU GLY GLU SER GLY GLU
145 150 155160
ILE LYS ALA ILE GLY GLU LEU ASP LEU LEU PHE MET SER LEU ARG ASN
165 170175
ALA CYS ILE <210> 11 <211> 146 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
< 223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 11
ALA PRO ILE SER SER HIS CYS ARG LEU ASP LYS SER ASN PHE GLN GLN
5 1015
PRO TYR ILE THR ASN ARG THR PHE MET LEU ALA LYS GLU ALA SER LEU
2530
ALA ASP ASN ASN THR ASP VAL ARG LEU ILE GLY GLU LYS LEU PHE HIS
4045
- 52 043603
GLY VAL SER MET SER GLU ARG CYS TYR LEU MET LYS GLN VAL LEU ASN 50 5560
PHE THR LEU GLU GLU VAL LEU PHE PRO GLN SER ASP ARG PHE GLN PRO 65 70 7580
TYR MET GLN GLU VAL VAL PRO PHE LEU ALA ARG LEU SER ASN ARG LEU 85 9095
SER THR CYS HIS ILE GLU GLY ASP ASP LEU HIS ILE GLN ARG ASN VAL 100 105110
GLN LYS LEU LYS ASP THR VAL LYS LYS LEU GLY GLU SER GLY GLU ILE 115 120125
LYS ALA ILE GLY GLU LEU ASP LEU LEU PHE MET SER LEU ARG ASN ALA 130 135140
CYS ILE 145 <210> 12 <211> 147 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
< 223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 12
MET ALA PRO ILE SER SER HIS CYS ARG LEU ASP LYS SER ASN PHE GLN 1 5 1015
GLN PRO TYR ILE THR ASN ARG THR PHE MET LEU ALA LYS GLU ALA SER 20 2530
LEU ALA ASP ASN ASN THR ASP VAL ARG LEU ILE GLY GLU LYS LEU PHE 35 4045
HIS GLY VAL SER MET SER GLU ARG CYS TYR LEU MET LYS GLN VAL LEU 50 5560
ASN PHE THR LEU GLU GLU VAL LEU PHE PRO GLN SER ASP ARG PHE GLN 65 70 7580
PRO TYR MET GLN GLU VAL VAL PRO PHE LEU ALA ARG LEU SER ASN ARG 85 9095
LEU SER THR CYS HIS ILE GLU GLY ASP ASP LEU HIS ILE GLN ARG ASN 100 105110
VAL GLN LYS LEU LYS ASP THR VAL LYS LYS LEU GLY GLU SER GLY GLU 115 120125
ILE LYS ALA ILE GLY GLU LEU ASP LEU LEU PHE MET SER LEU ARG ASN
130 135140
ALA CYS ILE
145
- 53 043603 <210> 13 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
< 223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ PEPTIDE <400> 13
GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER 1 5 10 15 <210> 14 <211> 548 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
< 223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 14
MET LEU GLU GLU ALA LEU ASN ILE PHE ASP GLU CYS ARG SER PRO CYS
5 1015
SER LEU THR PRO GLU PRO GLY LYS PRO ILE GLN SER LYS LEU SER ILE
2530
PRO SER ASP VAL VAL LEU ASP GLU GLY VAL LEU TYR TYR SER MET THR
4045
ILE ASN ASP GLU GLN ASN ASP ILE LYS ASP GLU ASP LYS GLY GLU SER 50 5560
ILE ILE THR ILE GLY GLU PHE ALA THR VAL ARG ALA THR ARG HIS TYR
70 7580
VAL ASN GLN ASP ALA PRO PHE GLY VAL ILE HIS LEU ASP ILE THR THR 85 9095
GLU ASN GLY THR LYS THR TYR SER TYR ASN ARG LYS GLU GLY GLU PHE
100 105110
ALA ILE ASN TRP LEU VAL PRO ILE GLY GLU ASP SER PRO ALA SER ILE
115 120125
LYS ILE SER VAL ASP GLU LEU ASP GLN GLN ARG ASN ILE ILE GLU VAL 130 135140
PRO LYS LEU TYR SER ILE ASP LEU ASP ASN GLN THR LEU GLU GLN TRP
145 150 155160
LYS THR GLN GLY ASN VAL SER PHE SER VAL THR ARG PRO GLU HIS ASN
165 170175
ILE ALA ILE SER TRP PRO SER VAL SER TYR LYS ALA ALA GLN LYS GLU
180 185190
GLY SER ARG HIS LYS ARG TRP ALA HIS TRP HIS THR GLY LEU ALA LEU
195 200205
- 54 043603
CYS TRP LEU VAL PRO MET ASP ALA ILE TYR ASN TYR ILE THR GLN GLN 210 215220
ASN CYS THR LEU GLY ASP ASN TRP PHE GLY GLY SER TYR GLU THR VAL 225 230 235240
ALA GLY THR PRO LYS VAL ILE THR VAL LYS GLN GLY ILE GLU GLN LYS 245 250255
PRO VAL GLU GLN ARG ILE HIS PHE SER LYS GLY ASN ALA MET SER ALA 260 265270
LEU ALA ALA HIS ARG VAL CYS GLY VAL PRO LEU GLU THR LEU ALA ARG 275 280285
SER ARG LYS PRO ARG ASP LEU THR ASP ASP LEU SER CYS ALA TYR GLN 290 295300
ALA GLN ASN ILE VAL SER LEU PHE VAL ALA THR ARG ILE LEU PHE SER 305 310 315320
HIS LEU ASP SER VAL PHE THR LEU ASN LEU ASP GLU GLN GLU PRO GLU 325 330335
VAL ALA GLU ARG LEU SER ASP LEU ARG ARG ILE ASN GLU ASN ASN PRO 340 345350
GLY MET VAL THR GLN VAL LEU THR VAL ALA ARG GLN ILE TYR ASN ASP 355 360365
TYR VAL THR HIS HIS PRO GLY LEU THR PRO GLU GLN THR SER ALA GLY 370 375380
ALA GLN ALA GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY 385 390 395400
GLY SER ALA PRO ILE SER SER HIS CYS ARG LEU ASP LYS SER ASN PHE 405 410415
GLN GLN PRO TYR ILE THR ASN ARG THR PHE MET LEU ALA LYS GLU ALA 420 425430
SER LEU ALA ASP ASN ASN THR ASP VAL ARG LEU ILE GLY GLU LYS LEU 435 440445
PHE HIS GLY VAL SER MET SER GLU ARG CYS TYR LEU MET LYS GLN VAL 450 455460
LEU ASN PHE THR LEU GLU GLU VAL LEU PHE PRO GLN SER ASP ARG PHE 465 470 475480
GLN PRO TYR MET GLN GLU VAL VAL PRO PHE LEU ALA ARG LEU SER ASN 485 490495
ARG LEU SER THR CYS HIS ILE GLU GLY ASP ASP LEU HIS ILE GLN ARG 500 505510
ASN VAL GLN LYS LEU LYS ASP THR VAL LYS LYS LEU GLY GLU SER GLY 515 520525
- 55 043603
GLU ILE LYS ALA ILE GLY GLU LEU ASP LEU LEU PHE MET SER LEU ARG 530 535 540
ASN ALA CYS ILE 545 <210> 15 <211> 428 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 15
MET VAL GLU GLU ALA LEU ASN ILE PHE ASP GLU CYS ARG SER PRO CYS 1 5 1015
SER LEU THR PRO GLU PRO GLY LYS PRO ILE GLN SER LYS LEU SER ILE 20 2530
PRO SER ASP VAL VAL LEU ASP GLU GLY VAL LEU TYR TYR SER MET THR 35 4045
ILE ASN ASP GLU GLN ASN ASP ILE LYS ASP GLU ASP LYS GLY GLU SER 50 5560
ILE ILE THR ILE GLY GLU PHE ALA THR VAL ARG ALA THR ARG HIS TYR 65 70 7580
VAL ASN GLN ASP ALA PRO PHE GLY VAL ILE HIS LEU ASP ILE THR THR 85 9095
GLU ASN GLY THR LYS THR TYR SER TYR ASN ARG LYS GLU GLY GLU PHE
100 105110
ALA ILE ASN TRP LEU VAL PRO ILE GLY GLU ASP SER PRO ALA SER ILE 115 120125
LYS ILE SER VAL ASP GLU LEU ASP GLN GLN ARG ASN ILE ILE GLU VAL 130 135140
PRO LYS LEU TYR SER ILE ASP LEU ASP ASN GLN THR LEU GLU GLN TRP 145 150 155160
LYS THR GLN GLY ASN VAL SER PHE SER VAL THR ARG PRO GLU HIS ASN 165 170175
ILE ALA ILE SER TRP PRO SER VAL SER TYR LYS ALA ALA GLN LYS GLU 180 185190
GLY SER ARG HIS LYS ARG TRP ALA HIS TRP HIS THR GLY LEU ALA LEU 195 200205
CYS TRP LEU VAL PRO MET ASP ALA ILE TYR ASN TYR ILE THR GLN GLN 210 215220
ASN CYS THR LEU GLY ASP ASN TRP PHE GLY GLY SER TYR GLU THR VAL 225 230 235240
- 56 043603
ALA GLY THR PRO LYS VAL ILE THR VAL LYS GLN GLY ILE GLU GLN LYS 245 250255
PRO VAL GLU GLN ARG ILE HIS PHE SER LYS GLY GLY GLY GLY GLY SER 260 265270
GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER ALA PRO ILE SER SER HIS 275 280285
CYS ARG LEU ASP LYS SER ASN PHE GLN GLN PRO TYR ILE THR ASN ARG 290 295300
THR PHE MET LEU ALA LYS GLU ALA SER LEU ALA ASP ASN ASN THR ASP 305 310 315320
VAL ARG LEU ILE GLY GLU LYS LEU PHE HIS GLY VAL SER MET SER GLU 325 330335
ARG CYS TYR LEU MET LYS GLN VAL LEU ASN PHE THR LEU GLU GLU VAL 340 345350
LEU PHE PRO GLN SER ASP ARG PHE GLN PRO TYR MET GLN GLU VAL VAL 355 360365
PRO PHE LEU ALA ARG LEU SER ASN ARG LEU SER THR CYS HIS ILE GLU 370 375380
GLY ASP ASP LEU HIS ILE GLN ARG ASN VAL GLN LYS LEU LYS ASP THR 385 390 395400
VAL LYS LYS LEU GLY GLU SER GLY GLU ILE LYS ALA ILE GLY GLU LEU 405 410415
ASP LEU LEU PHE MET SER LEU ARG ASN ALA CYS ILE
420425 <210> 16 <211> 548 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 16
MET VAL GLU GLU ALA LEU ASN ILE PHE ASP GLU CYS ARG SER PRO CYS
5 1015
SER LEU THR PRO GLU PRO GLY LYS PRO ILE GLN SER LYS LEU SER ILE
2530
PRO SER ASP VAL VAL LEU ASP GLU GLY VAL LEU TYR TYR SER MET THR
4045
ILE ASN ASP GLU GLN ASN ASP ILE LYS ASP GLU ASP LYS GLY GLU SER 50 5560
ILE ILE THR ILE GLY GLU PHE ALA THR VAL ARG ALA THR ARG HIS TYR
70 7580
- 57 043603
VAL ASN GLN ASP ALA PRO PHE GLY VAL ILE HIS LEU ASP ILE THR THR
9095
GLU ASN GLY THR LYS THR TYR SER TYR ASN ARG LYS GLU GLY GLU PHE 100 105110
ALA ILE ASN TRP LEU VAL PRO ILE GLY GLU ASP SER PRO ALA SER ILE 115 120125
LYS ILE SER VAL ASP GLU LEU ASP GLN GLN ARG ASN ILE ILE GLU VAL 130 135140
PRO LYS LEU TYR SER ILE ASP LEU ASP ASN GLN THR LEU GLU GLN TRP 145 150 155160
LYS THR GLN GLY ASN VAL SER PHE SER VAL THR ARG PRO GLU HIS ASN 165 170175
ILE ALA ILE SER TRP PRO SER VAL SER TYR LYS ALA ALA GLN LYS GLU 180 185190
GLY SER ARG HIS LYS ARG TRP ALA HIS TRP HIS THR GLY LEU ALA LEU 195 200205
CYS TRP LEU VAL PRO MET ASP ALA ILE TYR ASN TYR ILE THR GLN GLN 210 215220
ASN CYS THR LEU GLY ASP ASN TRP PHE GLY GLY SER TYR GLU THR VAL 225 230 235240
ALA GLY THR PRO LYS VAL ILE THR VAL LYS GLN GLY ILE GLU GLN LYS 245 250255
PRO VAL GLU GLN ARG ILE HIS PHE SER LYS GLY ASN ALA MET SER ALA 260 265270
LEU ALA ALA HIS ARG VAL CYS GLY VAL PRO LEU GLU THR LEU ALA ARG 275 280285
SER ARG LYS PRO ARG ASP LEU THR ASP ASP LEU SER CYS ALA TYR GLN 290 295300
ALA GLN ASN ILE VAL SER LEU PHE VAL ALA THR ARG ILE LEU PHE SER 305 310 315320
HIS LEU ASP SER VAL PHE THR LEU ASN LEU ASP GLU GLN GLU PRO GLU 325 330335
VAL ALA GLU ARG LEU SER ASP LEU ARG ARG ILE ASN GLU ASN ASN PRO 340 345350
GLY MET VAL THR GLN VAL LEU THR VAL ALA ARG GLN ILE TYR ASN ASP 355 360365
TYR VAL THR HIS HIS PRO GLY LEU THR PRO GLU GLN THR SER ALA GLY 370 375380
ALA GLN ALA GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY 385 390 395400
- 58 043603
GLY SER ALA PRO ILE SER SER HIS CYS ARG LEU ASP LYS SER ASN PHE 405 410415
GLN GLN PRO TYR ILE THR ASN ARG THR PHE MET LEU ALA LYS GLU ALA 420 425430
SER LEU ALA ASP ASN ASN THR ASP VAL ARG LEU ILE GLY GLU LYS LEU 435 440445
PHE HIS GLY VAL SER MET SER GLU ARG CYS TYR LEU MET LYS GLN VAL 450 455460
LEU ASN PHE THR LEU GLU GLU VAL LEU PHE PRO GLN SER ASP ARG PHE 465 470 475480
GLN PRO TYR MET GLN GLU VAL VAL PRO PHE LEU ALA ARG LEU SER ASN 485 490495
ARG LEU SER THR CYS HIS ILE GLU GLY ASP ASP LEU HIS ILE GLN ARG 500 505510
ASN VAL GLN LYS LEU LYS ASP THR VAL LYS LYS LEU GLY GLU SER GLY 515 520525
GLU ILE LYS ALA ILE GLY GLU LEU ASP LEU LEU PHE MET SER LEU ARG 530 535540
ASN ALA CYS ILE 545 <210> 17 <211> 428 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 17 MET LEU GLU GLU ALA LEU ASN ILE PHE ASP GLU CYS ARG SER PRO CYS 1 5 1015
SER LEU THR PRO GLU PRO GLY LYS PRO ILE GLN SER LYS LEU SER ILE 20 2530
PRO SER ASP VAL VAL LEU ASP GLU GLY VAL LEU TYR TYR SER MET THR 35 4045
ILE ASN ASP GLU GLN ASN ASP ILE LYS ASP GLU ASP LYS GLY GLU SER 50 5560
ILE ILE THR ILE GLY GLU PHE ALA THR VAL ARG ALA THR ARG HIS TYR 65 70 7580
VAL ASN GLN ASP ALA PRO PHE GLY VAL ILE HIS LEU ASP ILE THR THR 85 9095
GLU ASN GLY THR LYS THR TYR SER TYR ASN ARG LYS GLU GLY GLU PHE 100 105110
ALA ILE ASN TRP LEU VAL PRO ILE GLY GLU ASP SER PRO ALA SER ILE 115 120125
- 59 043603
LYS ILE SER VAL ASP GLU LEU ASP GLN GLN ARG ASN ILE ILE GLU VAL 130 135140
PRO LYS LEU TYR SER ILE ASP LEU ASP ASN GLN THR LEU GLU GLN TRP 145 150 155160
LYS THR GLN GLY ASN VAL SER PHE SER VAL THR ARG PRO GLU HIS ASN 165 170175
ILE ALA ILE SER TRP PRO SER VAL SER TYR LYS ALA ALA GLN LYS GLU 180 185190
GLY SER ARG HIS LYS ARG TRP ALA HIS TRP HIS THR GLY LEU ALA LEU 195 200205
CYS TRP LEU VAL PRO MET ASP ALA ILE TYR ASN TYR ILE THR GLN GLN 210 215220
ASN CYS THR LEU GLY ASP ASN TRP PHE GLY GLY SER TYR GLU THR VAL 225 230 235240
ALA GLY THR PRO LYS VAL ILE THR VAL LYS GLN GLY ILE GLU GLN LYS 245 250255
PRO VAL GLU GLN ARG ILE HIS PHE SER LYS GLY GLY GLY GLY GLY SER 260 265270
GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER ALA PRO ILE SER SER HIS 275 280285
CYS ARG LEU ASP LYS SER ASN PHE GLN GLN PRO TYR ILE THR ASN ARG 290 295300
THR PHE MET LEU ALA LYS GLU ALA SER LEU ALA ASP ASN ASN THR ASP 305 310 315320
VAL ARG LEU ILE GLY GLU LYS LEU PHE HIS GLY VAL SER MET SER GLU 325 330335
ARG CYS TYR LEU MET LYS GLN VAL LEU ASN PHE THR LEU GLU GLU VAL 340 345350
LEU PHE PRO GLN SER ASP ARG PHE GLN PRO TYR MET GLN GLU VAL VAL 355 360365
PRO PHE LEU ALA ARG LEU SER ASN ARG LEU SER THR CYS HIS ILE GLU 370 375380
GLY ASP ASP LEU HIS ILE GLN ARG ASN VAL GLN LYS LEU LYS ASP THR 385 390 395400
VAL LYS LYS LEU GLY GLU SER GLY GLU ILE LYS ALA ILE GLY GLU LEU 405 410415
ASP LEU LEU PHE MET SER LEU ARG ASN ALA CYS ILE
420425 <210> 18 <211> 547 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
- 60 043603 <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 18
VAL GLU GLU ALA LEU ASN ILE PHE ASP GLU CYS ARG SER PRO CYS SER
5 1015
LEU THR PRO GLU PRO GLY LYS PRO ILE GLN SER LYS LEU SER ILE PRO 20 2530
SER ASP VAL VAL LEU ASP GLU GLY VAL LEU TYR TYR SER MET THR ILE 35 4045
ASN ASP GLU GLN ASN ASP ILE LYS ASP GLU ASP LYS GLY GLU SER ILE 50 5560
ILE THR ILE GLY GLU PHE ALA THR VAL ARG ALA THR ARG HIS TYR VAL 65 70 7580
ASN GLN ASP ALA PRO PHE GLY VAL ILE HIS LEU ASP ILE THR THR GLU 85 9095
ASN GLY THR LYS THR TYR SER TYR ASN ARG LYS GLU GLY GLU PHE ALA 100 105110
ILE ASN TRP LEU VAL PRO ILE GLY GLU ASP SER PRO ALA SER ILE LYS 115 120125
ILE SER VAL ASP GLU LEU ASP GLN GLN ARG ASN ILE ILE GLU VAL PRO 130 135140
LYS LEU TYR SER ILE ASP LEU ASP ASN GLN THR LEU GLU GLN TRP LYS 145 150 155160
THR GLN GLY ASN VAL SER PHE SER VAL THR ARG PRO GLU HIS ASN ILE 165 170175
ALA ILE SER TRP PRO SER VAL SER TYR LYS ALA ALA GLN LYS GLU GLY
180 185190
SER ARG HIS LYS ARG TRP ALA HIS TRP HIS THR GLY LEU ALA LEU CYS
195 200205
TRP LEU VAL PRO MET ASP ALA ILE TYR ASN TYR ILE THR GLN GLN ASN
210 215220
CYS THR LEU GLY ASP ASN TRP PHE GLY GLY SER TYR GLU THR VAL ALA
225 230 235240
GLY THR PRO LYS VAL ILE THR VAL LYS GLN GLY ILE GLU GLN LYS PRO
245 250255
VAL GLU GLN ARG ILE HIS PHE SER LYS GLY ASN ALA MET SER ALA LEU
260 265270
ALA ALA HIS ARG VAL CYS GLY VAL PRO LEU GLU THR LEU ALA ARG SER 275 280285
ARG LYS PRO ARG ASP LEU THR ASP ASP LEU SER CYS ALA TYR GLN ALA 290 295300
- 61 043603
GLN ASN ILE VAL SER LEU PHE VAL ALA THR ARG ILE LEU PHE SER HIS 305 310 315320
LEU ASP SER VAL PHE THR LEU ASN LEU ASP GLU GLN GLU PRO GLU VAL 325 330335
ALA GLU ARG LEU SER ASP LEU ARG ARG ILE ASN GLU ASN ASN PRO GLY 340 345350
MET VAL THR GLN VAL LEU THR VAL ALA ARG GLN ILE TYR ASN ASP TYR 355 360365
VAL THR HIS HIS PRO GLY LEU THR PRO GLU GLN THR SER ALA GLY ALA 370 375380
GLN ALA GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY 385 390 395400
SER ALA PRO ILE SER SER HIS CYS ARG LEU ASP LYS SER ASN PHE GLN 405 410415
GLN PRO TYR ILE THR ASN ARG THR PHE MET LEU ALA LYS GLU ALA SER 420 425430
LEU ALA ASP ASN ASN THR ASP VAL ARG LEU ILE GLY GLU LYS LEU PHE 435 440445
HIS GLY VAL SER MET SER GLU ARG CYS TYR LEU MET LYS GLN VAL LEU 450 455460
ASN PHE THR LEU GLU GLU VAL LEU PHE PRO GLN SER ASP ARG PHE GLN 465 470 475480
PRO TYR MET GLN GLU VAL VAL PRO PHE LEU ALA ARG LEU SER ASN ARG 485 490495
LEU SER THR CYS HIS ILE GLU GLY ASP ASP LEU HIS ILE GLN ARG ASN 500 505510
VAL GLN LYS LEU LYS ASP THR VAL LYS LYS LEU GLY GLU SER GLY GLU 515 520525
ILE LYS ALA ILE GLY GLU LEU ASP LEU LEU PHE MET SER LEU ARG ASN 530 535540
ALA CYS ILE 545 <210> 19 <211> 547 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 19 LEU GLU GLU ALA LEU ASN ILE PHE ASP GLU CYS ARG SER PRO CYS SER 1 5 10 15
LEU THR PRO GLU PRO GLY LYS PRO ILE GLN SER LYS LEU SER ILE PRO 20 25 30
- 62 043603
SER ASP VAL VAL LEU ASP GLU GLY VAL LEU TYR TYR SER MET THR ILE 35 4045
ASN ASP GLU GLN ASN ASP ILE LYS ASP GLU ASP LYS GLY GLU SER ILE 50 5560
ILE THR ILE GLY GLU PHE ALA THR VAL ARG ALA THR ARG HIS TYR VAL 65 70 7580
ASN GLN ASP ALA PRO PHE GLY VAL ILE HIS LEU ASP ILE THR THR GLU 85 9095
ASN GLY THR LYS THR TYR SER TYR ASN ARG LYS GLU GLY GLU PHE ALA 100 105110
ILE ASN TRP LEU VAL PRO ILE GLY GLU ASP SER PRO ALA SER ILE LYS 115 120125
ILE SER VAL ASP GLU LEU ASP GLN GLN ARG ASN ILE ILE GLU VAL PRO 130 135140
LYS LEU TYR SER ILE ASP LEU ASP ASN GLN THR LEU GLU GLN TRP LYS 145 150 155160
THR GLN GLY ASN VAL SER PHE SER VAL THR ARG PRO GLU HIS ASN ILE 165 170175
ALA ILE SER TRP PRO SER VAL SER TYR LYS ALA ALA GLN LYS GLU GLY 180 185190
SER ARG HIS LYS ARG TRP ALA HIS TRP HIS THR GLY LEU ALA LEU CYS 195 200205
TRP LEU VAL PRO MET ASP ALA ILE TYR ASN TYR ILE THR GLN GLN ASN 210 215220
CYS THR LEU GLY ASP ASN TRP PHE GLY GLY SER TYR GLU THR VAL ALA 225 230 235240
GLY THR PRO LYS VAL ILE THR VAL LYS GLN GLY ILE GLU GLN LYS PRO 245 250255
VAL GLU GLN ARG ILE HIS PHE SER LYS GLY ASN ALA MET SER ALA LEU 260 265270
ALA ALA HIS ARG VAL CYS GLY VAL PRO LEU GLU THR LEU ALA ARG SER 275 280285
ARG LYS PRO ARG ASP LEU THR ASP ASP LEU SER CYS ALA TYR GLN ALA 290 295300
GLN ASN ILE VAL SER LEU PHE VAL ALA THR ARG ILE LEU PHE SER HIS 305 310 315320
LEU ASP SER VAL PHE THR LEU ASN LEU ASP GLU GLN GLU PRO GLU VAL 325 330335
ALA GLU ARG LEU SER ASP LEU ARG ARG ILE ASN GLU ASN ASN PRO GLY 340 345350
MET VAL THR GLN VAL LEU THR VAL ALA ARG GLN ILE TYR ASN ASP TYR
- 63 043603
355 360365
VAL THR HIS HIS PRO GLY LEU THR PRO GLU GLN THR SER ALA GLY ALA 370 375380
GLN ALA GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY 385 390 395400
SER ALA PRO ILE SER SER HIS CYS ARG LEU ASP LYS SER ASN PHE GLN 405 410415
GLN PRO TYR ILE THR ASN ARG THR PHE MET LEU ALA LYS GLU ALA SER 420 425430
LEU ALA ASP ASN ASN THR ASP VAL ARG LEU ILE GLY GLU LYS LEU PHE 435 440445
HIS GLY VAL SER MET SER GLU ARG CYS TYR LEU MET LYS GLN VAL LEU 450 455460
ASN PHE THR LEU GLU GLU VAL LEU PHE PRO GLN SER ASP ARG PHE GLN 465 470 475480
PRO TYR MET GLN GLU VAL VAL PRO PHE LEU ALA ARG LEU SER ASN ARG 485 490495
LEU SER THR CYS HIS ILE GLU GLY ASP ASP LEU HIS ILE GLN ARG ASN 500 505510
VAL GLN LYS LEU LYS ASP THR VAL LYS LYS LEU GLY GLU SER GLY GLU 515 520525
ILE LYS ALA ILE GLY GLU LEU ASP LEU LEU PHE MET SER LEU ARG ASN 530 535540
ALA CYS ILE 545 <210> 20 <211> 427 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 20
VAL GLU GLU ALA LEU ASN ILE PHE ASP GLU CYS ARG SER PRO CYS SER 1 5 1015
LEU THR PRO GLU PRO GLY LYS PRO ILE GLN SER LYS LEU SER ILE PRO 20 2530
SER ASP VAL VAL LEU ASP GLU GLY VAL LEU TYR TYR SER MET THR ILE 35 4045
ASN ASP GLU GLN ASN ASP ILE LYS ASP GLU ASP LYS GLY GLU SER ILE 50 5560
ILE THR ILE GLY GLU PHE ALA THR VAL ARG ALA THR ARG HIS TYR VAL 65 70 7580
- 64 043603
ASN GLN ASP ALA PRO PHE GLY VAL ILE HIS LEU ASP ILE THR THR GLU 85 9095
ASN GLY THR LYS THR TYR SER TYR ASN ARG LYS GLU GLY GLU PHE ALA 100 105110
ILE ASN TRP LEU VAL PRO ILE GLY GLU ASP SER PRO ALA SER ILE LYS 115 120125
ILE SER VAL ASP GLU LEU ASP GLN GLN ARG ASN ILE ILE GLU VAL PRO 130 135140
LYS LEU TYR SER ILE ASP LEU ASP ASN GLN THR LEU GLU GLN TRP LYS 145 150 155160
THR GLN GLY ASN VAL SER PHE SER VAL THR ARG PRO GLU HIS ASN ILE 165 170175
ALA ILE SER TRP PRO SER VAL SER TYR LYS ALA ALA GLN LYS GLU GLY 180 185190
SER ARG HIS LYS ARG TRP ALA HIS TRP HIS THR GLY LEU ALA LEU CYS 195 200205
TRP LEU VAL PRO MET ASP ALA ILE TYR ASN TYR ILE THR GLN GLN ASN 210 215220
CYS THR LEU GLY ASP ASN TRP PHE GLY GLY SER TYR GLU THR VAL ALA 225 230 235240
GLY THR PRO LYS VAL ILE THR VAL LYS GLN GLY ILE GLU GLN LYS PRO 245 250255
VAL GLU GLN ARG ILE HIS PHE SER LYS GLY GLY GLY GLY GLY SER GLY 260 265270
GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER ALA PRO ILE SER SER HIS CYS 275 280285
ARG LEU ASP LYS SER ASN PHE GLN GLN PRO TYR ILE THR ASN ARG THR 290 295300
PHE MET LEU ALA LYS GLU ALA SER LEU ALA ASP ASN ASN THR ASP VAL 305 310 315320
ARG LEU ILE GLY GLU LYS LEU PHE HIS GLY VAL SER MET SER GLU ARG 325 330335
CYS TYR LEU MET LYS GLN VAL LEU ASN PHE THR LEU GLU GLU VAL LEU 340 345350
PHE PRO GLN SER ASP ARG PHE GLN PRO TYR MET GLN GLU VAL VAL PRO 355 360365
PHE LEU ALA ARG LEU SER ASN ARG LEU SER THR CYS HIS ILE GLU GLY 370 375380
ASP ASP LEU HIS ILE GLN ARG ASN VAL GLN LYS LEU LYS ASP THR VAL 385 390 395400
LYS LYS LEU GLY GLU SER GLY GLU ILE LYS ALA ILE GLY GLU LEU ASP
- 65 043603
405 410 415
LEU LEU PHE MET SER LEU ARG ASN ALA CYS ILE
420 425 <210> 21 <211> 427 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 21
LEU GLU GLU ALA LEU ASN ILE PHE ASP GLU CYS ARG SER PRO CYS SER
5 1015
LEU THR PRO GLU PRO GLY LYS PRO ILE GLN SER LYS LEU SER ILE PRO
2530
SER ASP VAL VAL LEU ASP GLU GLY VAL LEU TYR TYR SER MET THR ILE
4045
ASN ASP GLU GLN ASN ASP ILE LYS ASP GLU ASP LYS GLY GLU SER ILE 50 5560
ILE THR ILE GLY GLU PHE ALA THR VAL ARG ALA THR ARG HIS TYR VAL
70 7580
ASN GLN ASP ALA PRO PHE GLY VAL ILE HIS LEU ASP ILE THR THR GLU
9095
ASN GLY THR LYS THR TYR SER TYR ASN ARG LYS GLU GLY GLU PHE ALA
100 105110
ILE ASN TRP LEU VAL PRO ILE GLY GLU ASP SER PRO ALA SER ILE LYS
115 120125
ILE SER VAL ASP GLU LEU ASP GLN GLN ARG ASN ILE ILE GLU VAL PRO
130 135140
LYS LEU TYR SER ILE ASP LEU ASP ASN GLN THR LEU GLU GLN TRP LYS
145 150 155160
THR GLN GLY ASN VAL SER PHE SER VAL THR ARG PRO GLU HIS ASN ILE
165 170175
ALA ILE SER TRP PRO SER VAL SER TYR LYS ALA ALA GLN LYS GLU GLY
180 185190
SER ARG HIS LYS ARG TRP ALA HIS TRP HIS THR GLY LEU ALA LEU CYS
195 200205
TRP LEU VAL PRO MET ASP ALA ILE TYR ASN TYR ILE THR GLN GLN ASN
210 215220
CYS THR LEU GLY ASP ASN TRP PHE GLY GLY SER TYR GLU THR VAL ALA
225 230 235240
GLY THR PRO LYS VAL ILE THR VAL LYS GLN GLY ILE GLU GLN LYS PRO
245 250255
- 66 043603
VAL GLU GLN ARG ILE HIS PHE SER LYS GLY GLY GLY GLY GLY SER GLY 260 265270
GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER ALA PRO ILE SER SER HIS CYS 275 280285
ARG LEU ASP LYS SER ASN PHE GLN GLN PRO TYR ILE THR ASN ARG THR 290 295300
PHE MET LEU ALA LYS GLU ALA SER LEU ALA ASP ASN ASN THR ASP VAL 305 310 315320
ARG LEU ILE GLY GLU LYS LEU PHE HIS GLY VAL SER MET SER GLU ARG 325 330335
CYS TYR LEU MET LYS GLN VAL LEU ASN PHE THR LEU GLU GLU VAL LEU 340 345350
PHE PRO GLN SER ASP ARG PHE GLN PRO TYR MET GLN GLU VAL VAL PRO 355 360365
PHE LEU ALA ARG LEU SER ASN ARG LEU SER THR CYS HIS ILE GLU GLY 370 375380
ASP ASP LEU HIS ILE GLN ARG ASN VAL GLN LYS LEU LYS ASP THR VAL 385 390 395400
LYS LYS LEU GLY GLU SER GLY GLU ILE LYS ALA ILE GLY GLU LEU ASP 405 410415
LEU LEU PHE MET SER LEU ARG ASN ALA CYS ILE
420425 <210> 22 <211> 634 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 22
LEU GLU GLU ALA LEU ASN ILE PHE ASP GLU CYS ARG SER PRO CYS SER 1 5 1015
LEU THR PRO GLU PRO GLY LYS PRO ILE GLN SER LYS LEU SER ILE PRO 20 2530
SER ASP VAL VAL LEU ASP GLU GLY VAL LEU TYR TYR SER MET THR ILE 35 4045
ASN ASP GLU GLN ASN ASP ILE LYS ASP GLU ASP LYS GLY GLU SER ILE 50 5560
ILE THR ILE GLY GLU PHE ALA THR VAL ARG ALA THR ARG HIS TYR VAL 65 70 7580
ASN GLN ASP ALA PRO PHE GLY VAL ILE HIS LEU ASP ILE THR THR GLU 85 9095
- 67 043603
ASN GLY THR LYS THR TYR SER TYR ASN ARG LYS GLU GLY GLU PHE ALA 100 105110
ILE ASN TRP LEU VAL PRO ILE GLY GLU ASP SER PRO ALA SER ILE LYS 115 120125
ILE SER VAL ASP GLU LEU ASP GLN GLN ARG ASN ILE ILE GLU VAL PRO 130 135140
LYS LEU TYR SER ILE ASP LEU ASP ASN GLN THR LEU GLU GLN TRP LYS 145 150 155160
THR GLN GLY ASN VAL SER PHE SER VAL THR ARG PRO GLU HIS ASN ILE 165 170175
ALA ILE SER TRP PRO SER VAL SER TYR LYS ALA ALA GLN LYS GLU GLY 180 185190
SER ARG HIS LYS ARG TRP ALA HIS TRP HIS THR GLY LEU ALA LEU CYS 195 200205
TRP LEU VAL PRO MET ASP ALA ILE TYR ASN TYR ILE THR GLN GLN ASN 210 215220
CYS THR LEU GLY ASP ASN TRP PHE GLY GLY SER TYR GLU THR VAL ALA 225 230 235240
GLY THR PRO LYS VAL ILE THR VAL LYS GLN GLY ILE GLU GLN LYS PRO 245 250255
VAL GLU GLN ARG ILE HIS PHE SER LYS GLY ASN ALA MET SER ALA LEU 260 265270
ALA ALA HIS ARG VAL CYS GLY VAL PRO LEU GLU THR LEU ALA ARG SER 275 280285
ARG LYS PRO ARG ASP LEU THR ASP ASP LEU SER CYS ALA TYR GLN ALA 290 295300
GLN ASN ILE VAL SER LEU PHE VAL ALA THR ARG ILE LEU PHE SER HIS 305 310 315320
LEU ASP SER VAL PHE THR LEU ASN LEU ASP GLU GLN GLU PRO GLU VAL 325 330335
ALA GLU ARG LEU SER ASP LEU ARG ARG ILE ASN GLU ASN ASN PRO GLY 340 345350
MET VAL THR GLN VAL LEU THR VAL ALA ARG GLN ILE TYR ASN ASP TYR 355 360365
VAL THR HIS HIS PRO GLY LEU THR PRO GLU GLN THR SER ALA GLY ALA 370 375380
GLN ALA ALA ASP ILE LEU SER LEU PHE CYS PRO ASP ALA ASP LYS SER 385 390 395400
CYS VAL ALA SER ASN ASN ASP GLN ALA ASN ILE ASN ILE GLU SER ARG 405 410415
SER GLY ARG SER TYR LEU PRO GLU ASN ARG ALA VAL ILE THR PRO GLN 420 425430
- 68 043603
GLY VAL THR ASN TRP THR TYR GLN GLU LEU GLU ALA THR HIS GLN ALA
435 440445
LEU THR ARG GLU GLY TYR VAL PHE VAL GLY TYR HIS GLY THR ASN HIS
450 455460
VAL ALA ALA GLN THR ILE VAL ASN ARG ILE ALA PRO VAL PRO ARG GLY
465 470 475480
ASN ASN THR GLU ASN GLU GLU LYS TRP GLY GLY LEU TYR VAL ALA THR
485 490495
HIS ALA GLU VAL ALA HIS GLY TYR ALA ARG ILE LYS GLU GLY THR GLY
500 505510
GLU TYR GLY LEU PRO THR ARG ALA GLU ARG ASP ALA ARG GLY VAL MET
515 520525
LEU ARG VAL TYR ILE PRO ARG ALA SER LEU GLU ARG PHE TYR ARG THR
530 535540
ASN THR PRO LEU GLU ASN ALA GLU GLU HIS ILE THR GLN VAL ILE GLY 545 550 555560
HIS SER LEU PRO LEU ARG ASN GLU ALA PHE THR GLY PRO GLU SER ALA 565 570575
GLY GLY GLU ASP GLU THR VAL ILE GLY TRP ASP MET ALA ILE HIS ALA 580 585590
VAL ALA ILE PRO SER THR ILE PRO GLY ASN ALA TYR GLU GLU LEU ALA 595 600605
ILE ASP GLU GLU ALA VAL ALA LYS GLU GLN SER ILE SER THR LYS PRO 610 615620
PRO TYR LYS GLU ARG LYS ASP GLU LEU LYS
625630 <210> 23 <211> 635 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 23
MET LEU GLU GLU ALA LEU ASN ILE PHE ASP GLU CYS ARG SER PRO CYS
5 1015
SER LEU THR PRO GLU PRO GLY LYS PRO ILE GLN SER LYS LEU SER ILE
2530
PRO SER ASP VAL VAL LEU ASP GLU GLY VAL LEU TYR TYR SER MET THR
4045
ILE ASN ASP GLU GLN ASN ASP ILE LYS ASP GLU ASP LYS GLY GLU SER
5560
- 69 043603
ILE ILE THR ILE GLY GLU PHE ALA THR VAL ARG ALA THR ARG HIS TYR
70 7580
VAL ASN GLN ASP ALA PRO PHE GLY VAL ILE HIS LEU ASP ILE THR THR
9095
GLU ASN GLY THR LYS THR TYR SER TYR ASN ARG LYS GLU GLY GLU PHE
100 105110
ALA ILE ASN TRP LEU VAL PRO ILE GLY GLU ASP SER PRO ALA SER ILE
115 120125
LYS ILE SER VAL ASP GLU LEU ASP GLN GLN ARG ASN ILE ILE GLU VAL
130 135140
PRO LYS LEU TYR SER ILE ASP LEU ASP ASN GLN THR LEU GLU GLN TRP 145 150 155160
LYS THR GLN GLY ASN VAL SER PHE SER VAL THR ARG PRO GLU HIS ASN 165 170175
ILE ALA ILE SER TRP PRO SER VAL SER TYR LYS ALA ALA GLN LYS GLU 180 185190
GLY SER ARG HIS LYS ARG TRP ALA HIS TRP HIS THR GLY LEU ALA LEU 195 200205
CYS TRP LEU VAL PRO MET ASP ALA ILE TYR ASN TYR ILE THR GLN GLN 210 215220
ASN CYS THR LEU GLY ASP ASN TRP PHE GLY GLY SER TYR GLU THR VAL 225 230 235240
ALA GLY THR PRO LYS VAL ILE THR VAL LYS GLN GLY ILE GLU GLN LYS 245 250255
PRO VAL GLU GLN ARG ILE HIS PHE SER LYS GLY ASN ALA MET SER ALA 260 265270
LEU ALA ALA HIS ARG VAL CYS GLY VAL PRO LEU GLU THR LEU ALA ARG 275 280285
SER ARG LYS PRO ARG ASP LEU THR ASP ASP LEU SER CYS ALA TYR GLN 290 295300
ALA GLN ASN ILE VAL SER LEU PHE VAL ALA THR ARG ILE LEU PHE SER 305 310 315320
HIS LEU ASP SER VAL PHE THR LEU ASN LEU ASP GLU GLN GLU PRO GLU
325 330335
VAL ALA GLU ARG LEU SER ASP LEU ARG ARG ILE ASN GLU ASN ASN PRO 340 345350
GLY MET VAL THR GLN VAL LEU THR VAL ALA ARG GLN ILE TYR ASN ASP 355 360365
TYR VAL THR HIS HIS PRO GLY LEU THR PRO GLU GLN THR SER ALA GLY 370 375380
ALA GLN ALA ALA ASP ILE LEU SER LEU PHE CYS PRO ASP ALA ASP LYS
385 390 395400
- 70 043603
SER CYS VAL ALA SER ASN ASN ASP GLN ALA ASN ILE ASN ILE GLU SER 405 410415
ARG SER GLY ARG SER TYR LEU PRO GLU ASN ARG ALA VAL ILE THR PRO 420 425430
GLN GLY VAL THR ASN TRP THR TYR GLN GLU LEU GLU ALA THR HIS GLN 435 440445
ALA LEU THR ARG GLU GLY TYR VAL PHE VAL GLY TYR HIS GLY THR ASN 450 455460
HIS VAL ALA ALA GLN THR ILE VAL ASN ARG ILE ALA PRO VAL PRO ARG 465 470 475480
GLY ASN ASN THR GLU ASN GLU GLU LYS TRP GLY GLY LEU TYR VAL ALA 485 490495
THR HIS ALA GLU VAL ALA HIS GLY TYR ALA ARG ILE LYS GLU GLY THR 500 505510
GLY GLU TYR GLY LEU PRO THR ARG ALA GLU ARG ASP ALA ARG GLY VAL 515 520525
MET LEU ARG VAL TYR ILE PRO ARG ALA SER LEU GLU ARG PHE TYR ARG 530 535540
THR ASN THR PRO LEU GLU ASN ALA GLU GLU HIS ILE THR GLN VAL ILE 545 550 555560
GLY HIS SER LEU PRO LEU ARG ASN GLU ALA PHE THR GLY PRO GLU SER 565 570575
ALA GLY GLY GLU ASP GLU THR VAL ILE GLY TRP ASP MET ALA ILE HIS 580 585590
ALA VAL ALA ILE PRO SER THR ILE PRO GLY ASN ALA TYR GLU GLU LEU 595 600605
ALA ILE ASP GLU GLU ALA VAL ALA LYS GLU GLN SER ILE SER THR LYS 610 615620
PRO PRO TYR LYS GLU ARG LYS ASP GLU LEU LYS 625 630635 <210> 24 <211> 427 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 24
VAL GLU GLU ALA LEU ASN ILE PHE ASP GLU CYS ARG SER PRO CYS SER 1 5 10 15
LEU THR PRO GLU PRO GLY LYS PRO ILE GLN SER LYS LEU SER ILE PRO 20 25 30
- 71 043603
SER ASP VAL VAL LEU ASP GLU GLY VAL LEU TYR TYR SER MET THR ILE 35 4045
ASN ASP GLU GLN ASN ASP ILE LYS ASP GLU ASP LYS GLY GLU SER ILE 50 5560
ILE THR ILE GLY GLU PHE ALA THR VAL ARG ALA THR ARG HIS TYR VAL 65 70 7580
ASN GLN ASP ALA PRO PHE GLY VAL ILE HIS LEU ASP ILE THR THR GLU 85 9095
ASN GLY THR LYS THR TYR SER TYR ASN ARG LYS GLU GLY GLU PHE ALA 100 105110
ILE ASN TRP LEU VAL PRO ILE GLY GLU ASP SER PRO ALA SER ILE LYS 115 120125
ILE SER VAL ASP GLU LEU ASP GLN GLN ARG ASN ILE ILE GLU VAL PRO 130 135140
LYS LEU TYR SER ILE ASP LEU ASP ASN GLN THR LEU GLU GLN TRP LYS 145 150 155160
THR GLN GLY ASN VAL SER PHE SER VAL THR ARG PRO GLU HIS ASN ILE 165 170175
ALA ILE SER TRP PRO SER VAL SER TYR LYS ALA ALA GLN LYS GLU GLY 180 185190
SER ARG HIS LYS ARG TRP ALA HIS TRP HIS THR GLY LEU ALA LEU CYS 195 200205
TRP LEU VAL PRO MET ASP ALA ILE TYR ASN TYR ILE THR GLN GLN ASN 210 215220
CYS THR LEU GLY ASP ASN TRP PHE GLY GLY SER TYR GLU THR VAL ALA 225 230 235240
GLY THR PRO LYS VAL ILE THR VAL LYS GLN GLY ILE GLU GLN LYS PRO 245 250255
VAL GLU GLN ARG ILE HIS PHE SER LYS GLY GLY GLY GLY GLY SER GLY 260 265270
GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER ALA PRO ILE SER SER HIS CYS 275 280285
ARG LEU ASP LYS SER ASN PHE GLN GLN PRO TYR ILE THR ASN ARG THR 290 295300
PHE MET LEU ALA LYS GLU ALA SER LEU ALA ASP ASN ASN THR ASP VAL 305 310 315320
ARG LEU ILE GLY GLU LYS LEU PHE HIS GLY VAL SER MET SER GLU ARG 325 330335
CYS TYR LEU MET LYS GLN VAL LEU ASN PHE THR LEU GLU GLU VAL LEU 340 345350
PHE PRO GLN SER ASP ARG PHE GLN PRO TYR MET GLN GLU VAL VAL PRO 355 360365
- 72 043603
PHE LEU ALA ARG LEU SER ASN ARG LEU SER THR CYS HIS ILE GLU GLY 370 375380
ASP ASP LEU HIS ILE GLN ARG ASN VAL GLN LYS LEU LYS ASP THR VAL 385 390 395400
LYS LYS LEU GLY GLU SER GLY GLU ILE LYS ALA ILE GLY GLU LEU ASP 405 410415
LEU LEU PHE MET SER LEU ARG ASN ALA CYS ILE
420425 <210> 25 <211> 427 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 25
LEU GLU GLU ALA LEU ASN ILE PHE ASP GLU CYS ARG SER PRO CYS SER 1 5 1015
LEU THR PRO GLU PRO GLY LYS PRO ILE GLN SER LYS LEU SER ILE PRO 20 2530
SER ASP VAL VAL LEU ASP GLU GLY VAL LEU TYR TYR SER MET THR ILE 35 4045
ASN ASP GLU GLN ASN ASP ILE LYS ASP GLU ASP LYS GLY GLU SER ILE 50 5560
ILE THR ILE GLY GLU PHE ALA THR VAL ARG ALA THR ARG HIS TYR VAL 65 70 7580
ASN GLN ASP ALA PRO PHE GLY VAL ILE HIS LEU ASP ILE THR THR GLU 85 9095
ASN GLY THR LYS THR TYR SER TYR ASN ARG LYS GLU GLY GLU PHE ALA 100 105110
ILE ASN TRP LEU VAL PRO ILE GLY GLU ASP SER PRO ALA SER ILE LYS 115 120125
ILE SER VAL ASP GLU LEU ASP GLN GLN ARG ASN ILE ILE GLU VAL PRO 130 135140
LYS LEU TYR SER ILE ASP LEU ASP ASN GLN THR LEU GLU GLN TRP LYS 145 150 155160
THR GLN GLY ASN VAL SER PHE SER VAL THR ARG PRO GLU HIS ASN ILE 165 170175
ALA ILE SER TRP PRO SER VAL SER TYR LYS ALA ALA GLN LYS GLU GLY 180 185190
SER ARG HIS LYS ARG TRP ALA HIS TRP HIS THR GLY LEU ALA LEU CYS 195 200205
- 73 043603
TRP LEU VAL PRO MET ASP ALA ILE TYR ASN TYR ILE THR GLN GLN ASN 210 215220
CYS THR LEU GLY ASP ASN TRP PHE GLY GLY SER TYR GLU THR VAL ALA 225 230 235240
GLY THR PRO LYS VAL ILE THR VAL LYS GLN GLY ILE GLU GLN LYS PRO
245 250255
VAL GLU GLN ARG ILE HIS PHE SER LYS GLY GLY GLY GLY GLY SER GLY
260 265270
GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER ALA PRO ILE SER SER HIS CYS 275 280285
ARG LEU ASP LYS SER ASN PHE GLN GLN PRO TYR ILE THR ASN ARG THR 290 295300
PHE MET LEU ALA LYS GLU ALA SER LEU ALA ASP ASN ASN THR ASP VAL 305 310 315320
ARG LEU ILE GLY GLU LYS LEU PHE HIS GLY VAL SER MET SER GLU ARG 325 330335
CYS TYR LEU MET LYS GLN VAL LEU ASN PHE THR LEU GLU GLU VAL LEU 340 345350
PHE PRO GLN SER ASP ARG PHE GLN PRO TYR MET GLN GLU VAL VAL PRO 355 360365
PHE LEU ALA ARG LEU SER ASN ARG LEU SER THR CYS HIS ILE GLU GLY 370 375380
ASP ASP LEU HIS ILE GLN ARG ASN VAL GLN LYS LEU LYS ASP THR VAL 385 390 395400
LYS LYS LEU GLY GLU SER GLY GLU ILE LYS ALA ILE GLY GLU LEU ASP 405 410415
LEU LEU PHE MET SER LEU ARG ASN ALA CYS ILE
420425 <210> 26 <211> 649 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <220>
<221> MOD_RES <222> (1)..(1) < 223> V ИЛИ L <220>
<221> MOD_RES <222> (3)..(3) < 223> E ИЛИ D <220>
- 74 043603 < 221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> A ИЛИ E <220>
< 221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> N ИЛИ K <220>
<221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> S ИЛИ L <220>
<221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> P ИЛИ L <220>
<221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> P ИЛИ Q <220>
<221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> S ИЛИ F <220>
<221> MOD_RES <222> (33)..(33) <223> S ИЛИ G <220>
<221> MOD_RES <222> (56)..(56) <223> K ИЛИ M <220>
<221> MOD_RES <222> (59)..(59) <223> D ИЛИ G <220>
<221> MOD_RES <222> (67)..(67) <223> I ИЛИ F <220>
<221> MOD_RES <222> (73)..(73) <223> V ИЛИ I <220>
<221> MOD_RES <222> (81)..(81) <223> N ИЛИ S <220>
<221> MOD_RES <222> (90)..(90)
- 75 043603 <223> H ИЛИ N <220>
<221> MOD_RES <222> (101)..(101) <223> T ИЛИ M <220>
<221> MOD_RES <222> (104)..(104) <223> Y ИЛИ F <220>
<221> MOD_RES <222> (108)..(108) <223> E ИЛИ D <220>
<221> MOD_RES <222> (109)..(109) <223> G ИЛИ S <220>
<221> MOD_RES <222> (112)..(112) <223> A ИЛИ T <220>
<221> MOD_RES <222> (114)..(114) <223> N ИЛИ H <220>
<221> MOD_RES <222> (118)..(118) <223> P ИЛИ I <220>
<221> MOD_RES <222> (119)..(119) <223> I ИЛИ P <220>
<221> MOD_RES <222> (131)..(131) <223> V ИЛИ I <220>
<221> MOD_RES <222> (134)..(134) <223> L ИЛИ I <220>
<221> MOD_RES <222> (137)..(137) <223> Q ИЛИ K <220>
<221> MOD_RES <222> (160)..(160) < 223> K ИЛИ E
- 76 043603 <220>
<221> MOD_RES <222> (161)..(161) < 223> T ИЛИ N <220>
< 221> MOD_RES <222> (166)..(166) <223> S ИЛИ F <220>
<221> MOD_RES <222> (168)..(168) < 223> S ИЛИ A <220>
< 221> MOD_RES <222> (174)..(174) < 223> H ИЛИ Q <220>
< 221> MOD_RES <222> (175)..(185) <223> ЭТА ОБЛАСТЬ МОЖЕТ ОХВАТЫВАТЬ ОДНУ ИЗ СЛЕДУЮЩИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:
N, S, SIAKQS ИЛИ SIAKQSIAKQS <220>
<221> MOD_RES <222> (196)..(196) <223> K ИЛИ N <220>
<221> MOD_RES <222> (199)..(199) <223> Q, E ИЛИ H <220>
<221> MOD_RES <222> (201)..(201) <223> E, N ИЛИ D <220>
<221> MOD_RES <222> (203)..(203) < 223> S ИЛИ A <220>
< 221> MOD_RES <222> (210)..(210) < 223> H ИЛИ N <220>
< 221> MOD_RES <222> (212)..(212) <223> H, L, F ИЛИ R <220>
<221> MOD_RES <222> (214)..(214) <223> G ИЛИ T
- 77 043603 <220>
<221> MOD_RES <222> (215)..(215) <223> L ИЛИ S <220>
<221> MOD_RES <222> (216)..(216) <223> A ИЛИ P <220>
<221> MOD_RES <222> (217)..(217) <223> L, E ИЛИ K <220>
<221> MOD_RES <222> (218)..(218) <223> C ИЛИ V <220>
<221> MOD_RES <222> (219)..(219) <223> W, V ИЛИ T <220>
<221> MOD_RES <222> (221)..(221) <223> V ИЛИ ОТСУТСТВУЕТ <220>
<221> MOD_RES <222> (222)..(222) <223> P ИЛИ ОТСУТСТВУЕТ <220>
<221> MOD_RES <222> (223)..(223) <223> M, I, L ИЛИ ОТСУТСТВУЕТ <220>
<221> MOD_RES <222> (224)..(224) < 223> D ИЛИ ОТСУТСТВУЕТ <220>
<221> MOD_RES <222> (225)..(225) < 223> A ИЛИ ОТСУТСТВУЕТ <220>
<221> MOD_RES <222> (226)..(226) < 223> I ИЛИ ОТСУТСТВУЕТ <220>
<221> MOD_RES <222> (227)..(227) < 223> Y ИЛИ C <220>
<221> MOD_RES
- 78 043603 <222> (228)..(228) < 223> N ИЛИ F <220>
< 221> MOD_RES <222> (229)..(229) <223> Y ИЛИ F <220>
<221> MOD_RES <222> (230)..(230) < 223> I ИЛИ E <220>
<221> MOD_RES <222> (231)..(231) < 223> T ИЛИ D <220>
< 221> MOD_RES <222> (232)..(232) <223> Q ИЛИ P <220>
<221> MOD_RES <222> (233)..(233) < 223> Q, E ИЛИ A <220>
<221> MOD_RES <222> (234)..(234) < 223> N, L ИЛИ Q <220>
<221> MOD_RES <222> (237)..(237) < 223> L ИЛИ Y <220>
<221> MOD_RES <222> (239)..(239) < 223> D ИЛИ E <220>
<221> MOD_RES <222> (240)..(240) < 223> N ИЛИ D <220>
< 221> MOD_RES <222> (242)..(242) <223> F, H ИЛИ Y <220>
<221> MOD_RES <222> (245)..(245) <223> S ИЛИ A <220>
<221> MOD_RES <222> (247)..(247) <223> E ИЛИ K
- 79 043603 <220>
<221> MOD_RES <222> (252)..(252) <223> T ИЛИ I <220>
<221> MOD_RES <222> (254)..(254) <223> K, E ИЛИ G <220>
<221> MOD_RES <222> (255)..(255) < 223> V ИЛИ A <220>
<221> MOD_RES <222> (257)..(257) < 223> T ИЛИ M <220>
< 221> MOD_RES <222> (262)..(262) <223> I ИЛИ M <220>
<221> MOD_RES <222> (266)..(266) <223> P, T ИЛИ A <220>
<221> MOD_RES <222> (275)..(275) <223> K, Q ИЛИ N <220>
<221> MOD_RES <222> (276)..(276) <223> G ИЛИ K <220>
<221> MOD_RES <222> (279)..(279) <223> M ИЛИ I <220>
<221> MOD_RES <222> (280)..(280) < 223> S ИЛИ E <220>
<221> MOD_RES <222> (281)..(281) < 223> A ИЛИ T <220>
< 221> MOD_RES <222> (298)..(298) <223> S ИЛИ G <220>
- 80 043603 <221> MOD_RES <222> (303)..(303) <223> D ИЛИ Y <220>
<221> MOD_RES <222> (305)..(305) <223> T, P ИЛИ Q <220>
<221> MOD_RES <222> (309)..(309) < 223> S ИЛИ Q <220>
<221> MOD_RES <222> (311)..(311) < 223> A ИЛИ V <220>
< 221> MOD_RES <222> (313)..(313) < 223> Q ИЛИ N <220>
<221> MOD_RES <222> (316)..(316) < 223> N ИЛИ Q <220>
< 221> MOD_RES <222> (322)..(322) <223> V ИЛИ L <220>
<221> MOD_RES <222> (326)..(326) < 223> I ИЛИ M <220>
<221> MOD_RES <222> (329)..(329) < 223> S ИЛИ T <220>
< 221> MOD_RES <222> (331)..(331) <223> L ИЛИ I <220>
<221> MOD_RES <222> (334)..(334) <223> V ИЛИ I <220>
<221> MOD_RES <222> (340)..(340) <223> D, E ИЛИ H <220>
<221> MOD_RES <222> (341)..(341)
- 81 043603 < 223> E ИЛИ G <220>
<221> MOD_RES <222> (343)..(343) < 223> E ИЛИ A <220>
<221> MOD_RES <222> (345)..(345) < 223> E ИЛИ A <220>
< 221> MOD_RES <222> (347)..(347) <223> A ИЛИ T <220>
<221> MOD_RES <222> (351)..(351) <223> S, D ИЛИ T <220>
<221> MOD_RES <222> (352)..(352) < 223> D ИЛИ A <220>
<221> MOD_RES <222> (353)..(353) < 223> L ИЛИ I <220>
< 221> MOD_RES <222> (355)..(355) <223> R ИЛИ Q <220>
<221> MOD_RES <222> (359)..(359) < 223> N ИЛИ D <220>
<221> MOD_RES <222> (363)..(363) < 223> M ИЛИ V <220>
< 221> MOD_RES <222> (365)..(365) <223> T ИЛИ I <220>
<221> MOD_RES <222> (370)..(370) < 223> V ИЛИ I <220>
<221> MOD_RES <222> (381)..(381) < 223> H ИЛИ E
- 82 043603 <220>
<221> MOD_RES <222> (384)..(384) < 223> G ИЛИ L <220>
< 221> MOD_RES <222> (386)..(386) <223> T ИЛИ I <220>
<221> MOD_RES <222> (393)..(393) < 223> G ИЛИ S <220>
<221> MOD_RES <222> (403)..(403) < 223> F ИЛИ L <220>
< 221> MOD_RES <222> (404)..(404) <223> C ИЛИ Y <220>
<221> MOD_RES <222> (407)..(407) < 223> A ИЛИ T <220>
<221> MOD_RES <222> (409)..(409) < 223> K, E ИЛИ G <220>
<221> MOD_RES <222> (410)..(410) < 223> S, P ИЛИ H <220>
<221> MOD_RES <222> (414)..(414) < 223> S ИЛИ L <220>
< 221> MOD_RES <222> (415)..(415) <223> N ИЛИ D <220>
<221> MOD_RES <222> (416)..(416) <223> N ИЛИ S <220>
<221> MOD_RES <222> (423)..(423) <223> I ИЛИ V <220>
<221> MOD_RES
- 83 043603 <222> (433)..(433) <223> P ИЛИ L <220>
<221> MOD_RES <222> (441)..(441) <223> P ИЛИ Q <220>
<221> MOD_RES <222> (453)..(453) <223> E ИЛИ D <220>
<221> MOD_RES <222> (454)..(454) <223> A ИЛИ T <220>
<221> MOD_RES <222> (455)..(455) <223> T ИЛИ K <220>
<221> MOD_RES <222> (458)..(458) <223> A ИЛИ T <220>
<221> MOD_RES <222> (461)..(461) <223> R ИЛИ Q <220>
<221> MOD_RES <222> (463)..(463) <223> G ИЛИ D <220>
<221> MOD_RES <222> (475)..(475) <223> V ИЛИ A <220>
<221> MOD_RES <222> (479)..(479) <223> T, S ИЛИ N <220>
<221> MOD_RES <222> (485)..(485) <223> A, S ИЛИ T <220>
<221> MOD_RES <222> (491)..(491) <223> N ИЛИ S <220>
<221> MOD_RES <222> (492)..(492) <223> N ИЛИ D
- 84 043603 <220>
<221> MOD_RES <222> (495)..(495) < 223> N, S ИЛИ K <220>
<221> MOD_RES <222> (497)..(497) < 223> E, R ИЛИ K <220>
<221> MOD_RES <222> (498)..(498) < 223> K, A ИЛИ E <220>
<221> MOD_RES <222> (502)..(502) < 223> L ИЛИ V <220>
<221> MOD_RES <222> (505)..(505) < 223> A ИЛИ S <220>
< 221> MOD_RES <222> (507)..(507) <223> H ИЛИ D <220>
<221> MOD_RES <222> (509)..(509) <223> E ИЛИ S <220>
<221> MOD_RES <222> (510)..(510) <223> V ИЛИ L <220>
<221> MOD_RES <222> (511)..(511) < 223> A ИЛИ N <220>
<221> MOD_RES <222> (512)..(512) < 223> H ИЛИ Y <220>
< 221> MOD_RES <222> (513)..(513) <223> G ИЛИ R <220>
<221> MOD_RES <222> (515)..(515) < 223> A ИЛИ T <220>
- 85 043603 <221> MOD_RES <222> (517)..(517) < 223> I ИЛИ L <220>
< 221> MOD_RES <222> (518)..(518) <223> K ИЛИ Q <220>
<221> MOD_RES <222> (519)..(519) < 223> E ИЛИ K <220>
<221> MOD_RES <222> (522)..(522) < 223> G ИЛИ A <220>
< 221> MOD_RES <222> (523)..(523) <223> E, D ИЛИ N <220>
<221> MOD_RES <222> (524)..(524) < 223> Y, G, A ИЛИ N <220>
<221> MOD_RES <222> (525)..(525) < 223> G ИЛИ E <220>
< 221> MOD_RES <222> (526)..(526) <223> L ИЛИ G <220>
<221> MOD_RES <222> (527)..(527) <223> P ИЛИ L <220>
<221> MOD_RES <222> (529)..(529) <223> R, P ИЛИ T <220>
<221> MOD_RES <222> (530)..(530) < 223> A ИЛИ E <220>
<221> MOD_RES <222> (531)..(531) < 223> E ИЛИ K <220>
< 221> MOD_RES <222> (532)..(532)
- 86 043603 <223> R, Q ИЛИ K <220>
<221> MOD_RES <222> (533)..(533) <223> D, K ИЛИ E <220>
<221> MOD_RES <222> (534)..(534) < 223> A, T ИЛИ S <220>
<221> MOD_RES <222> (540)..(540) < 223> R ИЛИ K <220>
< 221> MOD_RES <222> (543)..(543) <223> I ИЛИ L <220>
<221> MOD_RES <222> (544)..(544) < 223> P ИЛИ H <220>
<221> MOD_RES <222> (545)..(545) < 223> R ИЛИ Q <220>
< 221> MOD_RES <222> (554)..(554) <223> T ИЛИ I <220>
<221> MOD_RES <222> (556)..(556) < 223> T, A ИЛИ I <220>
<221> MOD_RES <222> (557)..(557) < 223> P ИЛИ D <220>
<221> MOD_RES <222> (560)..(560) < 223> N ИЛИ K <220>
< 221> MOD_RES <222> (561)..(561) <223> A ИЛИ E <220>
<221> MOD_RES <222> (562)..(562) <223> E, R ИЛИ D
- 87 043603 <220>
<221> MOD_RES <222> (563)..(563) < 223> E, N ИЛИ R <220>
<221> MOD_RES <222> (564)..(564) < 223> H ИЛИ L <220>
< 221> MOD_RES <222> (565)..(565) <223> I ИЛИ V <220>
<221> MOD_RES <222> (566)..(566) <223> T ИЛИ E <220>
<221> MOD_RES <222> (567)..(567) <223> Q, R, H ИЛИ D <220>
<221> MOD_RES <222> (572)..(572) <223> S ИЛИ P <220>
<221> MOD_RES <222> (583)..(583) < 223> P ИЛИ T <220>
<221> MOD_RES <222> (584)..(584) < 223> E ИЛИ D <220>
< 221> MOD_RES <222> (585)..(585) <223> S, A ИЛИ R <220>
<221> MOD_RES <222> (586)..(586) <223> A, E ИЛИ V <220>
<221> MOD_RES <222> (587)..(587) <223> G, E ИЛИ D <220>
<221> MOD_RES <222> (589)..(589) < 223> E ИЛИ S <220>
<221> MOD_RES
- 88 043603 <222> (590)..(590) <223> D ИЛИ N <220>
<221> MOD_RES <222> (593)..(593) < 223> V ИЛИ A <220>
< 221> MOD_RES <222> (598)..(598) <223> M ИЛИ I <220>
<221> MOD_RES <222> (601)..(601) < 223> H ИЛИ Y <220>
< 221> MOD_RES <222> (602)..(602) < 223> A ИЛИ G <220>
< 221> MOD_RES <222> (613)..(613) <223> A ИЛИ S <220>
<221> MOD_RES <222> (615)..(615) < 223> E ИЛИ A <220>
< 221> MOD_RES <222> (616)..(616) < 223> E, A, Q, G, V ИЛИ R <220>
< 221> MOD_RES <222> (618)..(618) < 223> A, P ИЛИ T <220>
< 221> MOD_RES <222> (619)..(619) < 223> I, T ИЛИ P <220>
< 221> MOD_RES <222> (620)..(620) < 223> D ИЛИ A <220>
< 221> MOD_RES <222> (624)..(629) <223> ЭТА ОБЛАСТЬ МОЖЕТ ОХВАТЫВАТЬ ОДНУ ИЗ СЛЕДУЮЩИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:
V ИЛИ VVKEAI <220>
<221> MOD_RES
- 89 043603 <222> (631)..(631) <223> K ИЛИ E <220>
<221> MOD_RES <222> (637)..(637) <223> T, A ИЛИ P <220>
<221> MOD_RES <222> (644)..(644) <223> R, Q ИЛИ H <220>
<221> MOD_RES <222> (645)..(645) <223> K ИЛИ ОТСУТСТВУЕТ <220>
<223> СМ. ОПИСАНИЕ, КАК ОНО ПОДАНО, ДЛЯ ПОДРОБНОГО ОПИСАНИЯ ЗАМЕН И ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ <400> 26
XAA GLU XAA XAA LEU XAA ILE PHE ASP GLU CYS ARG SER PRO CYS XAA
5 1015
LEU THR PRO GLU XAA GLY LYS XAA ILE GLN SER LYS LEU XAA ILE PRO
2530
XAA ASP VAL VAL LEU ASP GLU GLY VAL LEU TYR TYR SER MET THR ILE
4045
ASN ASP GLU GLN ASN ASP ILE XAA ASP GLU XAA LYS GLY GLU SER ILE
5560
ILE THR XAA GLY GLU PHE ALA THR XAA ARG ALA THR ARG HIS TYR VAL
70 7580
XAA GLN ASP ALA PRO PHE GLY VAL ILE XAA LEU ASP ILE THR THR GLU
9095
ASN GLY THR LYS XAA TYR SER XAA ASN ARG LYS XAA XAA GLU PHE XAA
100 105110
ILE XAA TRP LEU VAL XAA XAA GLY GLU ASP SER PRO ALA SER ILE LYS
115 120125
ILE SER XAA ASP GLU XAA ASP GLN XAA ARG ASN ILE ILE GLU VAL PRO
130 135140
LYS LEU TYR SER ILE ASP LEU ASP ASN GLN THR LEU GLU GLN TRP XAA
145 150 155160
XAA GLN GLY ASN VAL XAA PHE XAA VAL THR ARG PRO GLU XAA XAA XAA
165 170175
XAA XAA XAA XAA XAA XAA XAA XAA XAA ILE ALA ILE SER TRP PRO SER
180 185190
VAL SER TYR XAA ALA ALA XAA LYS XAA GLY XAA ARG HIS LYS ARG TRP
195 200205
- 90 043603
ALA XAA TRP XAA THR XAA XAA XAA XAA XAA XAA LEU XAA XAA XAA XAA
210 215220
XAA XAA XAA XAA XAA XAA XAA XAA XAA XAA CYS THR XAA GLY XAA XAA
225 230 235240
TRP XAA GLY GLY XAA TYR XAA THR VAL ALA GLY XAA PRO XAA XAA ILE
245 250255
XAA VAL LYS GLN GLY XAA GLU GLN LYS XAA VAL GLU GLN ARG ILE HIS
260 265270
PHE SER XAA XAA ASN ALA XAA XAA XAA LEU ALA ALA HIS ARG VAL CYS 275 280285
GLY VAL PRO LEU GLU THR LEU ALA ARG XAA ARG LYS PRO ARG XAA LEU 290 295300
XAA ASP ASP LEU XAA CYS XAA TYR XAA ALA GLN XAA ILE VAL SER LEU 305 310 315320
PHE XAA ALA THR ARG XAA LEU PHE XAA HIS XAA ASP SER XAA PHE THR 325 330335
LEU ASN LEU XAA XAA GLN XAA PRO XAA VAL XAA GLU ARG LEU XAA XAA
340 345350
XAA ARG XAA ILE ASN GLU XAA ASN PRO GLY XAA VAL XAA GLN VAL LEU
355 360365
THR XAA ALA ARG GLN ILE TYR ASN ASP TYR VAL THR XAA HIS PRO XAA
370 375380
LEU XAA PRO GLU GLN THR SER ALA XAA ALA GLN ALA ALA ASP ILE LEU
385 390 395400
SER LEU XAA XAA PRO ASP XAA ASP XAA XAA CYS VAL ALA XAA XAA XAA
405 410415
ASP GLN ALA ASN ILE ASN XAA GLU SER ARG SER GLY ARG SER TYR LEU
420 425430
XAA GLU ASN ARG ALA VAL ILE THR XAA GLN GLY VAL THR ASN TRP THR
435 440445
TYR GLN GLU LEU XAA XAA XAA HIS GLN XAA LEU THR XAA GLU XAA TYR 450 455460
VAL PHE VAL GLY TYR HIS GLY THR ASN HIS XAA ALA ALA GLN XAA ILE 465 470 475480
VAL ASN ARG ILE XAA PRO VAL PRO ARG GLY XAA XAA THR GLU XAA GLU
485 490495
XAA XAA TRP GLY GLY XAA TYR VAL XAA THR XAA ALA XAA XAA XAA XAA
500 505510
XAA TYR XAA ARG XAA XAA XAA GLY THR XAA XAA XAA XAA XAA XAA THR 515 520525
XAA XAA XAA XAA XAA XAA ARG GLY VAL MET LEU XAA VAL TYR XAA XAA 530 535540
- 91 043603
XAA ALA SER LEU GLU ARG PHE TYR ARG XAA ASN XAA XAA LEU GLU XAA 545 550 555560
XAA XAA XAA XAA XAA XAA XAA VAL ILE GLY HIS XAA LEU PRO LEU ARG 565 570575
ASN GLU ALA PHE THR GLY XAA XAA XAA XAA XAA GLY XAA XAA GLU THR 580 585590
XAA ILE GLY TRP ASP XAA ALA ILE XAA XAA VAL ALA ILE PRO SER THR 595 600605
ILE PRO GLY ASN XAA TYR XAA XAA LEU XAA XAA XAA GLU GLU ALA XAA 610 615620
XAA XAA XAA XAA XAA ALA XAA GLU GLN SER ILE SER XAA LYS PRO PRO 625 630 635640
TYR LYS GLU XAA XAA ASP GLU LEU LYS 645 <210> 27 <211> 60 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(60) <223> ЭТА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ МОЖЕТ ОХВАТЫВАТЬЖ.Э/
1-15 GLY GLY GLY SER ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ЕДИНИЦ <400> 27 GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY SER 1 5 1015
GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY SER 20 2530
GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY SER 35 4045
GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY SER 50 5560 <210> 28 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПЕПТИД <400> 28
- 92 043603
GLY GLY GLY GLY SER <210> 29 <211> 90 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(90) <223> ЭТА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ МОЖЕТ ОХВАТЫВАТЬ 1-15 GLY GLY GLY GLY GLY SER ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ЕДИНИЦ <400> 29
GLY GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY
5 1015
GLY SER GLY GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY
2530
GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY GLY SER
4045
GLY GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY
5560
GLY SER GLY GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY
70 7580
GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY GLY SER
8590 <210> 30 <211> 179 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
< 223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 30
MET ALA VAL LEU GLN LYS SER MET SER PHE SER LEU MET GLY THR LEU
5 1015
ALA ALA SER CYS LEU LEU LEU ILE ALA LEU TRP ALA GLN GLU ALA ASN
2530
ALA LEU PRO VAL ASN THR ARG CYS LYS LEU GLU VAL SER ASN PHE GLN
4045
GLN PRO TYR ILE VAL ASN ARG THR PHE MET LEU ALA LYS GLU ALA SER 50 5560
LEU ALA ASP ASN ASN THR ASP VAL ARG LEU ILE GLY GLU LYS LEU PHE
70 7580
- 93 043603
ARG GLY VAL SER ALA LYS ASP GLN CYS TYR LEU MET LYS GLN VAL LEU 85 9095
ASN PHE THR LEU GLU ASP VAL LEU LEU PRO GLN SER ASP ARG PHE GLN 100 105110
PRO TYR MET GLN GLU VAL VAL PRO PHE LEU THR LYS LEU SER ASN GLN 115 120125
LEU SER SER CYS HIS ILE SER GLY ASP ASP GLN ASN ILE GLN LYS ASN 130 135140
VAL ARG ARG LEU LYS GLU THR VAL LYS LYS LEU GLY GLU SER GLY GLU 145 150 155160
ILE LYS ALA ILE GLY GLU LEU ASP LEU LEU PHE MET SER LEU ARG ASN 165 170175
ALA CYS VAL <210>31 <211> 25 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
< 223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПЕПТИД <400> 31
GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER GLY
5 10 15
GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER
25 <210> 32 <211> 418 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
< 223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 32
MET VAL GLU GLU ALA LEU ASN ILE PHE ASP GLU CYS ARG SER PRO CYS
5 1015
SER LEU THR PRO GLU PRO GLY LYS PRO ILE GLN SER LYS LEU SER ILE
2530
PRO SER ASP VAL VAL LEU ASP GLU GLY VAL LEU TYR TYR SER MET THR
4045
ILE ASN ASP GLU GLN ASN ASP ILE LYS ASP GLU ASP LYS GLY GLU SER 50 5560
ILE ILE THR ILE GLY GLU PHE ALA THR VAL ARG ALA THR ARG HIS TYR
70 7580
- 94 043603
VAL ASN GLN ASP ALA PRO PHE GLY VAL ILE HIS LEU ASP ILE THR THR 85 9095
GLU ASN GLY THR LYS THR TYR SER TYR ASN ARG LYS GLU GLY GLU PHE 100 105110
ALA ILE ASN TRP LEU VAL PRO ILE GLY GLU ASP SER PRO ALA SER ILE 115 120125
LYS ILE SER VAL ASP GLU LEU ASP GLN GLN ARG ASN ILE ILE GLU VAL 130 135140
PRO LYS LEU TYR SER ILE ASP LEU ASP ASN GLN THR LEU GLU GLN TRP 145 150 155160
LYS THR GLN GLY ASN VAL SER PHE SER VAL THR ARG PRO GLU HIS ASN 165 170175
ILE ALA ILE SER TRP PRO SER VAL SER TYR LYS ALA ALA GLN LYS GLU 180 185190
GLY SER ARG HIS LYS ARG TRP ALA HIS TRP HIS THR GLY LEU ALA LEU 195 200205
CYS TRP LEU VAL PRO MET ASP ALA ILE TYR ASN TYR ILE THR GLN GLN 210 215220
ASN CYS THR LEU GLY ASP ASN TRP PHE GLY GLY SER TYR GLU THR VAL 225 230 235240
ALA GLY THR PRO LYS VAL ILE THR VAL LYS GLN GLY ILE GLU GLN LYS 245 250255
PRO VAL GLU GLN ARG ILE HIS PHE SER LYS GLY GLY GLY GLY GLY SER 260 265270
ALA PRO ILE SER SER HIS CYS ARG LEU ASP LYS SER ASN PHE GLN GLN 275 280285
PRO TYR ILE THR ASN ARG THR PHE MET LEU ALA LYS GLU ALA SER LEU 290 295300
ALA ASP ASN ASN THR ASP VAL ARG LEU ILE GLY GLU LYS LEU PHE HIS 305 310 315320
GLY VAL SER MET SER GLU ARG CYS TYR LEU MET LYS GLN VAL LEU ASN 325 330335
PHE THR LEU GLU GLU VAL LEU PHE PRO GLN SER ASP ARG PHE GLN PRO 340 345350
TYR MET GLN GLU VAL VAL PRO PHE LEU ALA ARG LEU SER ASN ARG LEU 355 360365
SER THR CYS HIS ILE GLU GLY ASP ASP LEU HIS ILE GLN ARG ASN VAL 370 375380
GLN LYS LEU LYS ASP THR VAL LYS LYS LEU GLY GLU SER GLY GLU ILE 385 390 395400
LYS ALA ILE GLY GLU LEU ASP LEU LEU PHE MET SER LEU ARG ASN ALA 405 410415
- 95 043603
CYS ILE <210> 33 <211> 438 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 33
MET VAL GLU GLU ALA LEU ASN ILE PHE ASP GLU CYS ARG SER PRO CYS
5 1015
SER LEU THR PRO GLU PRO GLY LYS PRO ILE GLN SER LYS LEU SER ILE
2530
PRO SER ASP VAL VAL LEU ASP GLU GLY VAL LEU TYR TYR SER MET THR
4045
ILE ASN ASP GLU GLN ASN ASP ILE LYS ASP GLU ASP LYS GLY GLU SER 50 5560
ILE ILE THR ILE GLY GLU PHE ALA THR VAL ARG ALA THR ARG HIS TYR
70 7580
VAL ASN GLN ASP ALA PRO PHE GLY VAL ILE HIS LEU ASP ILE THR THR
9095
GLU ASN GLY THR LYS THR TYR SER TYR ASN ARG LYS GLU GLY GLU PHE
100 105110
ALA ILE ASN TRP LEU VAL PRO ILE GLY GLU ASP SER PRO ALA SER ILE
115 120125
LYS ILE SER VAL ASP GLU LEU ASP GLN GLN ARG ASN ILE ILE GLU VAL
130 135140
PRO LYS LEU TYR SER ILE ASP LEU ASP ASN GLN THR LEU GLU GLN TRP
145 150 155160
LYS THR GLN GLY ASN VAL SER PHE SER VAL THR ARG PRO GLU HIS ASN
165 170175
ILE ALA ILE SER TRP PRO SER VAL SER TYR LYS ALA ALA GLN LYS GLU
180 185190
GLY SER ARG HIS LYS ARG TRP ALA HIS TRP HIS THR GLY LEU ALA LEU
195 200205
CYS TRP LEU VAL PRO MET ASP ALA ILE TYR ASN TYR ILE THR GLN GLN
210 215220
ASN CYS THR LEU GLY ASP ASN TRP PHE GLY GLY SER TYR GLU THR VAL
225 230 235240
ALA GLY THR PRO LYS VAL ILE THR VAL LYS GLN GLY ILE GLU GLN LYS
245 250255
- 96 043603
PRO VAL GLU GLN ARG ILE HIS PHE SER LYS GLY GLY GLY GLY GLY SER 260 265270
GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER GLY 275 280285
GLY GLY GLY SER ALA PRO ILE SER SER HIS CYS ARG LEU ASP LYS SER 290 295300
ASN PHE GLN GLN PRO TYR ILE THR ASN ARG THR PHE MET LEU ALA LYS 305 310 315320
GLU ALA SER LEU ALA ASP ASN ASN THR ASP VAL ARG LEU ILE GLY GLU 325 330335
LYS LEU PHE HIS GLY VAL SER MET SER GLU ARG CYS TYR LEU MET LYS 340 345350
GLN VAL LEU ASN PHE THR LEU GLU GLU VAL LEU PHE PRO GLN SER ASP 355 360365
ARG PHE GLN PRO TYR MET GLN GLU VAL VAL PRO PHE LEU ALA ARG LEU 370 375380
SER ASN ARG LEU SER THR CYS HIS ILE GLU GLY ASP ASP LEU HIS ILE 385 390 395400
GLN ARG ASN VAL GLN LYS LEU LYS ASP THR VAL LYS LYS LEU GLY GLU 405 410415
SER GLY GLU ILE LYS ALA ILE GLY GLU LEU ASP LEU LEU PHE MET SER 420 425430
LEU ARG ASN ALA CYS ILE 435 <210> 34 <211> 418 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 34
MET ALA PRO ILE SER SER HIS CYS ARG LEU ASP LYS SER ASN PHE GLN
5 1015
GLN PRO TYR ILE THR ASN ARG THR PHE MET LEU ALA LYS GLU ALA SER
2530
LEU ALA ASP ASN ASN THR ASP VAL ARG LEU ILE GLY GLU LYS LEU PHE
4045
HIS GLY VAL SER MET SER GLU ARG CYS TYR LEU MET LYS GLN VAL LEU
5560
ASN PHE THR LEU GLU GLU VAL LEU PHE PRO GLN SER ASP ARG PHE GLN
70 7580
- 97 043603
PRO TYR MET GLN GLU VAL VAL PRO PHE LEU ALA ARG LEU SER ASN ARG 85 9095
LEU SER THR CYS HIS ILE GLU GLY ASP ASP LEU HIS ILE GLN ARG ASN 100 105110
VAL GLN LYS LEU LYS ASP THR VAL LYS LYS LEU GLY GLU SER GLY GLU 115 120125
ILE LYS ALA ILE GLY GLU LEU ASP LEU LEU PHE MET SER LEU ARG ASN 130 135140
ALA CYS ILE GLY GLY GLY GLY SER VAL GLU GLU ALA LEU ASN ILE PHE 145 150 155160
ASP GLU CYS ARG SER PRO CYS SER LEU THR PRO GLU PRO GLY LYS PRO 165 170175
ILE GLN SER LYS LEU SER ILE PRO SER ASP VAL VAL LEU ASP GLU GLY 180 185190
VAL LEU TYR TYR SER MET THR ILE ASN ASP GLU GLN ASN ASP ILE LYS 195 200205
ASP GLU ASP LYS GLY GLU SER ILE ILE THR ILE GLY GLU PHE ALA THR 210 215220
VAL ARG ALA THR ARG HIS TYR VAL ASN GLN ASP ALA PRO PHE GLY VAL 225 230 235240
ILE HIS LEU ASP ILE THR THR GLU ASN GLY THR LYS THR TYR SER TYR 245 250255
ASN ARG LYS GLU GLY GLU PHE ALA ILE ASN TRP LEU VAL PRO ILE GLY 260 265270
GLU ASP SER PRO ALA SER ILE LYS ILE SER VAL ASP GLU LEU ASP GLN 275 280285
GLN ARG ASN ILE ILE GLU VAL PRO LYS LEU TYR SER ILE ASP LEU ASP 290 295300
ASN GLN THR LEU GLU GLN TRP LYS THR GLN GLY ASN VAL SER PHE SER 305 310 315320
VAL THR ARG PRO GLU HIS ASN ILE ALA ILE SER TRP PRO SER VAL SER 325 330335
TYR LYS ALA ALA GLN LYS GLU GLY SER ARG HIS LYS ARG TRP ALA HIS 340 345350
TRP HIS THR GLY LEU ALA LEU CYS TRP LEU VAL PRO MET ASP ALA ILE 355 360365
TYR ASN TYR ILE THR GLN GLN ASN CYS THR LEU GLY ASP ASN TRP PHE 370 375380
GLY GLY SER TYR GLU THR VAL ALA GLY THR PRO LYS VAL ILE THR VAL 385 390 395400
LYS GLN GLY ILE GLU GLN LYS P
- 98 043603
O VAL GLU GLN ARG ILE HIS PHE SER
405 410 415
LYS GLY <210> 35 <211> 538 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <400> 35
MET VAL GLU GLU ALA LEU ASN ILE PHE ASP GLU CYS ARG SER PRO CYS
5 1015
SER LEU THR PRO GLU PRO GLY LYS PRO ILE GLN SER LYS LEU SER ILE
2530
PRO SER ASP VAL VAL LEU ASP GLU GLY VAL LEU TYR TYR SER MET THR
4045
ILE ASN ASP GLU GLN ASN ASP ILE LYS ASP GLU ASP LYS GLY GLU SER 50 5560
ILE ILE THR ILE GLY GLU PHE ALA THR VAL ARG ALA THR ARG HIS TYR
70 7580
VAL ASN GLN ASP ALA PRO PHE GLY VAL ILE HIS LEU ASP ILE THR THR
9095
GLU ASN GLY THR LYS THR TYR SER TYR ASN ARG LYS GLU GLY GLU PHE
100 105110
ALA ILE ASN TRP LEU VAL PRO ILE GLY GLU ASP SER PRO ALA SER ILE
115 120125
LYS ILE SER VAL ASP GLU LEU ASP GLN GLN ARG ASN ILE ILE GLU VAL
130 135140
PRO LYS LEU TYR SER ILE ASP LEU ASP ASN GLN THR LEU GLU GLN TRP
145 150 155160
LYS THR GLN GLY ASN VAL SER PHE SER VAL THR ARG PRO GLU HIS ASN
165 170175
ILE ALA ILE SER TRP PRO SER VAL SER TYR LYS ALA ALA GLN LYS GLU
180 185190
GLY SER ARG HIS LYS ARG TRP ALA HIS TRP HIS THR GLY LEU ALA LEU
195 200205
CYS TRP LEU VAL PRO MET ASP ALA ILE TYR ASN TYR ILE THR GLN GLN
210 215220
ASN CYS THR LEU GLY ASP ASN TRP PHE GLY GLY SER TYR GLU THR VAL
225 230 235240
- 99 043603
ALA GLY THR PRO LYS VAL ILE THR VAL LYS GLN GLY ILE GLU GLN LYS 245 250255
PRO VAL GLU GLN ARG ILE HIS PHE SER LYS GLY ASN ALA MET SER ALA 260 265270
LEU ALA ALA HIS ARG VAL CYS GLY VAL PRO LEU GLU THR LEU ALA ARG 275 280285
SER ARG LYS PRO ARG ASP LEU THR ASP ASP LEU SER CYS ALA TYR GLN 290 295300
ALA GLN ASN ILE VAL SER LEU PHE VAL ALA THR ARG ILE LEU PHE SER 305 310 315320
HIS LEU ASP SER VAL PHE THR LEU ASN LEU ASP GLU GLN GLU PRO GLU 325 330335
VAL ALA GLU ARG LEU SER ASP LEU ARG ARG ILE ASN GLU ASN ASN PRO 340 345350
GLY MET VAL THR GLN VAL LEU THR VAL ALA ARG GLN ILE TYR ASN ASP 355 360365
TYR VAL THR HIS HIS PRO GLY LEU THR PRO GLU GLN THR SER ALA GLY 370 375380
ALA GLN ALA GLY GLY GLY GLY SER ALA PRO ILE SER SER HIS CYS ARG 385 390 395400
LEU ASP LYS SER ASN PHE GLN GLN PRO TYR ILE THR ASN ARG THR PHE 405 410415
MET LEU ALA LYS GLU ALA SER LEU ALA ASP ASN ASN THR ASP VAL ARG 420 425430
LEU ILE GLY GLU LYS LEU PHE HIS GLY VAL SER MET SER GLU ARG CYS 435 440445
TYR LEU MET LYS GLN VAL LEU ASN PHE THR LEU GLU GLU VAL LEU PHE 450 455460
PRO GLN SER ASP ARG PHE GLN PRO TYR MET GLN GLU VAL VAL PRO PHE 465 470 475480
LEU ALA ARG LEU SER ASN ARG LEU SER THR CYS HIS ILE GLU GLY ASP 485 490495
ASP LEU HIS ILE GLN ARG ASN VAL GLN LYS LEU LYS ASP THR VAL LYS 500 505510
LYS LEU GLY GLU SER GLY GLU ILE LYS ALA ILE GLY GLU LEU ASP LEU 515 520525
LEU PHE MET SER LEU ARG ASN ALA CYS ILE
530535 <210> 36 <211> 75 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
- 100 043603 <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(75) <223> ЭТА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ МОЖЕТ ОХВАТЫВАТЬ 1-15 GLY GLY GLY GLY SER ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ЕДИНИЦ <400> 36
GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER GLY
5 1015
GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY
2530
GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY
4045
GLY SER GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY
5560
SER GLY GLY GLY GLY SER GLY GLY GLY GLY SER 65 7075 <210> 37 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
<223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПЕПТИД <400> 37
SER ILE ALA LYS GLN SER
5 <210> 38 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
< 223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПЕПТИД <400> 38
SER ILE ALA LYS GLN SER ILE ALA LYS GLN SER
5 10 <210> 39 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>
< 223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПЕПТИД
- 101 -
Claims (5)
- <400> 39VAL VAL LYS GLU ALA ILE1 5 <210> 40 <211> 30 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220>< 223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <220><221> MISC_FEATURE <222> (1)..(30) <223> ЭТА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ МОЖЕТ ОХВАТВАТЬ 1-15 GLY SER ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ЕДИНИЦ <400> 40GLY SER GLY SER GLY SER GLY SER GLY SER GLY SER GLY SER GLY SER1 5 10 15GLY SER GLY SER GLY SER GLY SER GLY SER GLY SER GLY SER20 25 30 <210> 41 <211> 45 <212> БЕЛОК <213> ИСКУССТВЕННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ <220><223> ОПИСАНИЕ ИСКУССТВЕННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: СИНТЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИПЕПТИД <220><221> MISC_FEATURE <222> (1)..(45) <223> ЭТА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ МОЖЕТ ОХВАТЫВАТЬ 1-15 GLY GLY SER ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ЕДИНИЦ <400> 41GLY GLY SER GLY GLY SER GLY GLY SER GLY GLY SER GLY GLY SER GLY1 5 1015GLY SER GLY GLY SER GLY GLY SER GLY GLY SER GLY GLY SER GLY GLY20 2530SER GLY GLY SER GLY GLY SER GLY GLY SER GLY GLY SER35 4045ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Конструкция для доставки, содержащая носитель, соединенный с IL-22 человека, где носитель состоит из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 9.
- 2. Конструкция для доставки по п.1, где IL-22 человека состоит из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 11.
- 3. Конструкция для доставки по любому из пп.1, 2, где носитель ковалентно или нековалентно связан с IL-22 человека.
- 4. Конструкция для доставки по п.3, где носитель ковалентно связан с IL-22 человека через спейсер.
- 5. Конструкция для доставки по п.4, где спейсер состоит из аминокислотной последовательности,- 102 -
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/756,889 | 2018-11-07 | ||
| USPCT/US2019/021474 | 2019-03-08 | ||
| US62/888,133 | 2019-08-16 | ||
| US62/888,238 | 2019-08-16 | ||
| USPCT/US2019/050708 | 2019-09-11 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA043603B1 true EA043603B1 (ru) | 2023-06-05 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11027020B2 (en) | Delivery constructs for transcytosis and related methods | |
| US20200140511A1 (en) | Delivery constructs for transcytosis and related methods | |
| US10988745B2 (en) | Therapeutic nuclease-albumin fusions and methods | |
| JPWO2018079702A1 (ja) | ラクトフェリン／アルブミン融合タンパク質及びその製造方法 | |
| WO2013162050A1 (ja) | ラクトフェリン融合タンパク質及びその製造方法 | |
| KR20150121715A (ko) | Ｃｓｆ１ 치료제 | |
| FR2972006A1 (fr) | Nouveaux fragments d'il-33 superactifs et leurs utilisations | |
| AU2012366182B2 (en) | Method of treating diabetes using non-glycosylated apolipoprotein A-IV | |
| JP2022095856A (ja) | 増殖分化因子１５融合タンパク質 | |
| EP4083212A1 (en) | Mutant rsv f protein and use thereof | |
| TW201825122A (zh) | 用精胺酸耗盡劑進行之組合癌症免疫療法 | |
| CN116133676A (zh) | Il-2序列及其用途 | |
| CN114341195A (zh) | 治疗性融合蛋白 | |
| EP3642338B1 (en) | Fusion protein with half-life extending polypeptide | |
| EA043603B1 (ru) | Конструкции для доставки для трансцитоза и связанные способы | |
| KR20220095204A (ko) | 혈청 알부민과 성장 호르몬의 융합 단백질을 함유하는 수성 의약 조성물 | |
| IL305625A (en) | Stable formulations of proteins based on the scaffolding region of fibronectin that bind to myostatin | |
| CN113396158A (zh) | Lpl-gpihbp1融合多肽 | |
| EP3568142B1 (en) | Therapeutic peptides that target tgf-beta interaction | |
| US20200270335A1 (en) | Dkk2 cysteine rich domain 2 containing proteins and uses thereof | |
| WO2022195629A1 (en) | Engineered arginase constructs, method of generation and uses thereof | |
| WO2022177890A1 (en) | Solid oral compositions with zinc | |
| JP2023514541A (ja) | 組換えｖｗｆの投与による重症のフォンヴィレブランド病患者における過多月経の治療 |