CN116133676A - Il-2序列及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及式(I)的Ala‑SEQ A‑Cys*‑SEQ B的IL‑2蛋白序列，其中SEQ A与SEQ ID NO：1具有至少94％的序列同一性；SEQ B与SEQ ID NO：2具有至少94％的序列同一性；Ala是丙氨酸残基；Cys*是半胱氨酸残基；还涉及其缀合物及其在治疗癌症中的用途。

Description

IL-2序列及其用途
本发明涉及式(I)的Ala-SEQ A-Cys*-SEQ B的IL-2蛋白序列，其中SEQ A与SEQ IDNO：1具有至少94％的序列同一性；SEQ B与SEQ ID NO：2具有至少94％的序列同一性；Ala是丙氨酸残基；Cys*是半胱氨酸残基；还涉及其缀合物及其在治疗细胞增殖疾病中的用途。
在健康人中，免疫系统通常可以区分健康细胞和癌细胞。一旦确定一个特定的细胞为癌细胞，免疫系统通常会将其消除。然而，当免疫系统因急性或慢性缺陷而受到损害或不堪重负时，由于受损的免疫系统无法区分并消除癌细胞，就会出现癌症。在患有癌症的病人中，给病人服用免疫调节蛋白可以帮助激活病人的免疫系统，使免疫系统消除癌细胞的能力得到加强。在患有病毒感染的病人身上，给病人服用免疫调节蛋白可以帮助激活病人的免疫系统，从而提高免疫系统消除病毒感染的能力。同样，即使是健康的病人，也可以通过添加这种免疫调节蛋白来增强对疫苗的免疫反应。
白细胞介素-2(IL-2)就是用于治疗某些癌症患者的这样一种免疫调节蛋白。IL-2在免疫效应细胞的生成、分化、存活和内稳态方面起着核心作用。IL-2由激活的CD4+辅助T细胞合成，通过不同的受体相互作用，IL-2可以调节免疫反应，使其走向免疫或耐受。
IL-2通过与IL-2受体(IL-2R)结合发挥作用。α-(CD25)、β-(CD122)和共同的γ-(γc，CD132)亚基的结合导致了三聚体的高亲和力IL-2R。二聚体的中等亲和力IL-2Rβγ由β-和γ-亚基组成，与IL-2结合的亲和力低50倍。CD25不是IL-2信号传导的必要条件，但能赋予三聚体受体高亲和力的结合，而β-和γ-亚基介导信号转导。IL-2Rβγ在NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、γδT细胞和静息的CD4+和CD8+T细胞上表达，而IL-2Rαβγ在活化的T细胞和NK细胞上被暂时诱导，并在T调节细胞以及2型先天淋巴细胞(ILC2s)、嗜酸性粒细胞和内皮细胞上组成性表达。IL-2扩大和激活先天性和适应性效应细胞的能力是其抗肿瘤活性的基础。
在病人身上，IL-2可以刺激抗肿瘤疗效，其特点是在以大剂量给药时(即，在人体中以600000-720000IU/kg体重，每天三次，每个周期最多14个剂量)，细胞毒性的淋巴细胞增加，包括效应性T和NK细胞。据推测，在这种治疗过程中，所有的T细胞在大剂量给药后都会受到IL-2的刺激，当治疗周期结束时，以及在任何一个单独的剂量后的时间点和在某些时候IL-2水平下降时，IL-2将成为限制性的，表达IL-2Rαβγ的T调节(Treg)细胞将超过表达IL-2Rβγ的效应T细胞，争夺剩余的野生型IL-2。
然而，IL-2的抗肿瘤免疫因严重的心血管、肺部、肝脏、胃肠道、神经系统和血液学副作用而受到剂量限制，因此只能在专业医疗中心给病人使用。许多这些不良事件的特点是血管渗漏综合征(VLS)，也被称为毛细血管渗漏综合征。引起VLS的机制有几种建议，其中许多涉及野生型IL-2和表达IL-2Rαβγ的细胞如ILC2s、嗜酸性粒细胞和内皮细胞之间的相互作用。
效应性CD4+T细胞、CD8+T细胞、γδT细胞，特别是Vγ9Vδ2 T细胞和NK细胞，它们显著增强抗肿瘤免疫反应，优先表达IL-2Rβγ形式。因此，施用与IL-2Rβγ结合并作为其激动剂的化合物可望增强针对肿瘤的免疫反应(例如，通过增加CD4+T细胞、CD8+T细胞、γδT细胞，特别是Vγ9Vδ2T细胞和NK细胞的增殖和活性的作用)。
因此，施用IL-2Rβγ选择性激动剂(具有减少或不与IL-2Rα结合、或增强与IL-2Rβγ结合的特点)对患有某些癌症的病人是有益的，因为这样做有望减少全身性血管泄漏的副作用，如肺水肿，提供一个改善的治疗窗口。
合成这种偏向性(biased)IL-2，即优先与IL-2Rβγ结合的IL-2蛋白的一种方法是突变某个参与与IL-2Rα结合的氨基酸，例如用半胱氨酸取代它。该半胱氨酸可以任选地用来与某些部分缀合，这可以进一步增强不与IL-2Rα结合的偏向。
然而，制造带有额外的半胱氨酸的蛋白质，如IL-2，可能会有问题，因为这种蛋白质可能有聚集的倾向，而且可能很难或不能确保这种蛋白质以足够的质量和足够的数量进行正确的复性。
因此，本发明的一个目标是至少部分地克服上述的缺点。
这一目标是通过式(I)的IL-2蛋白序列实现的Ala-SEQ A-Cys*-SEQ B  (I)，
其中
SEQ A与SEQ ID NO：1具有至少94％的序列同一性。
SEQ B与SEQ ID NO：2具有至少94％的序列同一性。
Ala是一个丙氨酸残基；以及
Cys*是一个半胱氨酸残基。
令人惊讶的是，与没有N端丙氨酸的相应IL-2序列相比，当这种IL-2蛋白在例如哺乳动物表达系统或酵母表达系统中作为可溶性蛋白表达时，添加N端丙氨酸残基可显著提高产率。标有星号的半胱氨酸可以是自由半胱氨酸，即硫醇不是二硫键的一部分，或者它可以通过二硫桥与含硫醇的化合物如半胱氨酸缀合。
这种式(I)的IL-2可以是一种有偏向性的IL-2。
在本发明中，术语的使用具有如下含义。
通常，术语″白细胞介素-2″或″IL-2″是指所有IL-2蛋白，优选来自哺乳动物物种，更优选来自灵长类物种，最优选来自人类，以及它们的变体、类似物、正交物、同源物和衍生物及其片段，其特征是在淋巴细胞生成、生存和稳态中发挥核心作用，还包括IL-2的天然发生的变体，例如剪接变体或等位基因变体。在本发明中，术语″白细胞介素-2″和″IL-2″是指具有式(I)序列的蛋白质。
如本文所用，术语″偏向性(biased)IL-2″是指一种修饰的IL-2，其中所述偏向性IL-2对IL-2Rα的KD与所述偏向性IL-2对IL-2Rβ的KD的比率大于SEQ ID NO：15的阿地白介素(aldesleukin)对IL-2Rα的KD与阿地白介素对IL-2Rβ的KD的比率。这可通过下式描述：
Figure BDA0004113465820000031
其中
Figure BDA0004113465820000032
Figure BDA0004113465820000033
目
″KD偏向性IL2对IL-2Rα″是偏向性IL-2对IL-2Rα的KD，
″KD偏向性IL-2对IL-2Rβ″是偏向性IL-2对IL-2Rβ的KD，
″KD阿地白介素对IL-2Rα″是指阿地白介素对IL-2Rα的KD，和
″KD阿地白介素对IL-2Rβ″是指阿地白介素对IL-2Rβ的KD。
阿地白介素(Aldesleukin)(SEQ ID NO：15)具有以下序列：
Figure BDA0004113465820000041
确定偏向性IL-2对IL-2Rα的KD、偏向性IL-2对IL-2Rβ的KD、阿地白介素对IL-2Ra的KD和阿地白介素对IL-2Rβ的KD所需的结合亲和力/动力学可使用表面等离子体共振(SPR)进行评估，在Biacore仪器(GE Healthcare)上测量，具体如下：在CM5(或C1或CM4)芯片上用抗人Fc抗体共价包被来制备人Fc捕获表面，或使用蛋白质A芯片。接下来，IL-2Rβ-Fc或IL2-Rα-Fc被固定在芯片上。为了测量亲和力/动力学常数，从例如1nM和2μM之间或30nM和500nM的IL-2化合物开始连续稀释被分析物。分析物分别暴露在用受体修饰的芯片上一段适当的时间，如1-30分钟，例如可以是2分钟或3分钟，然后再洗去一段适当的时间，如2-60分钟，例如可以是10分钟。将系列稀释液产生的结合曲线用1∶1动力学模型进行拟合，从而将观察到的反应单位(R)与结合和解离速率常数(ka和kd)关联起来：
Figure BDA0004113465820000042
其中
t是时间；
C是被分析物的浓度；以及
Rmax是表面的最大结合能力。
如果通过动力学1∶1模型来确定，则解离速率和结合速率的比率提供了平衡解离常数KD。
或者，将系列稀释液产生的结合曲线用1∶1稳态相互作用模型拟合，该模型从稳态结合水平(Req)相对于分析物浓度(C)的作图中计算出1∶1相互作用的KD：
Figure BDA0004113465820000043
其中
Req是稳态结合水平。
C是被分析物的浓度；以及
Rmax是表面的最大结合能力。
可以理解，并不是每一种计算方法都可能适用于每一个偏向性IL-2分子。例如，如果反应速度太快，可能无法使用1∶1动力学模型，而可以使用1∶1稳态相互作用模型。例如，如果没有得到平衡，可能就不能使用1∶1的相互作用模型，而可以使用1∶1的动力学模型。
如本文所用，术语″亲和力″是指一个分子(例如受体)的单一结合位点与其结合伙伴(例如配体)之间的非共价相互作用之和的强度。除非另有说明，本文所用的″亲和力″是指内在的结合亲和力，它反映了结合对的成员之间(例如受体和配体之间)1∶1的相互作用。分子X对其伙伴Y的亲和力一般可由平衡解离常数(KD)表示，它是在平衡状态下测量的解离和结合速率常数(分别为kd和ka)的比率。因此，只要所述速率常数的比率保持不变，相等的亲和力可以包括不同的速率常数。亲和力可以通过本领域已知的既定方法测量，包括本文所述的方法。
如本文所用，术语″IL-2受体的α亚基″和″IL-2Rα″是指人CD25。
如本文所用，术语″IL-2受体的β亚基″和″IL-2Rβ″是指人CD122。
如本文所用，术语″IL-2受体的γ亚基″和″IL-2Rγ″是指人CD132。
本文所用的术语″模式识别受体激动剂″(″PRRA″)是指与一个或多个免疫细胞相关受体结合并激活的分子，该受体识别病原体相关的分子模式(PAMP)或损伤相关的分子模式(DAMP)，导致免疫细胞激活和/或病原体或损伤诱发的炎症反应。模式识别受体通常由先天免疫系统的细胞表达，如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞(DC)、中性粒细胞和上皮细胞，以及由适应性免疫系统的细胞表达。
本文所用的术语″细胞毒剂″和″化学治疗剂″是同义的，指的是对细胞有毒性的化合物，它们阻止细胞复制或生长，导致细胞破坏/死亡。细胞毒剂的例子包括化学治疗剂和毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶促活性毒素，包括其合成类似物和衍生物。
本文所用的术语″免疫检查点抑制剂″和″免疫检查点拮抗剂″是同义的，指的是干扰细胞膜表达的受体的功能或抑制配体通过结合细胞膜表达的受体而诱导的信号传导，所述受体在激活后抑制炎症免疫细胞的功能。此类化合物例如可以是生物制品，如抗体、抗体片段、亲和体(affibodies)、亲和素(affilins)、affimers、affitins、α单克隆抗体(alphamabs)、α-抗体(alphabodies)、抗运载蛋白(anticalins)、高亲和性多聚体(avimers)、DARPins、
Figure BDA0004113465820000051
Kunitz结构域肽、单体(monobodies)、nanoCLAMPs、环肽、多肽、仅重链抗体、VHH抗体或
Figure BDA0004113465820000052
单链可变片段(scFvs)、这些受体的天然或修饰的配体或结合伙伴或小分子抑制剂。
本文所用术语″免疫激活激动剂″是指直接或间接地激活细胞膜表达的检查点受体的化合物。
本文所用的术语″免疫激活受体激动剂″是指在激活或共刺激性受体激活时刺激免疫细胞功能的化合物。这种刺激性受体的例子包括CD3亚基CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ(CD247)，T细胞受体(TCR)亚基TCRα、TCRβ、TCRγ和TCR8，B细胞受体(BCR)链或信号转导单元CD79a或CD79b、CD2、CD4、CD8、CD16、CD32a、CD64、CD27、CD28、CD134(OX40)、CD137(41BB)、CD244(2B4)、CD278(ICOS)、CD357(GITR)、CRACC(CS1)、LFA-1、NKG2D、NKG2C、NKp30，NKp46，NKp44，NKp80，NTB-A，激活的短形式KIR(KIR2DS1，KIR2DS2，KIR2DS3，KIR2DS4，KIR2DS5，KIR3DS1)，CD40，SIRP-β，Dectin-1，Dectin-2，TREM1，TREM2，ILT1，ILT6，ILT7，ILT8，LIR-6，MDL1和其他免疫受体，它们利用基于免疫酪氨酸受体的激活模式(ITAM)或通过PI3K、JAK/STAT、MyD88、IRF、NFKB或JNK/AP1途径诱导信号。许多的多特异性药物是免疫激活受体激动剂的类型。
本文所用的术语″多特异性″和″多特异性药物″是指同时与两个或多个不同的抗原结合，并能以靶标依赖性的方式介导拮抗、激动或特异性抗原结合活性的化合物。在这里，″同时″一词并不是指时间或空间上的依赖性，而是指单个的多特异性药物能够在相同或不同的位置，在相同或不同的时间点结合两种或更多种抗原。
本文所用的术语″抗体-药物缀合物″(ADC)是指通常由与生物活性的细胞毒性载荷、放疗或其他药物连接的抗体组成的化合物，旨在将细胞毒性剂输送到肿瘤环境。ADC对减轻肿瘤负担特别有效，而且没有明显的全身性毒性，并可起到改善检查点抑制剂抗体诱导的免疫反应的效果。
本文所用的术语″抗体-佐剂缀合物″(AAC)是指由直接或通过接头(linker)与生物活性佐剂连接的抗体组成的化合物。
如本文所用，术语″佐剂″指的是增强机体对抗原的免疫反应的物质。
本文所用的术语″boltbody″是指一种抗体-佐剂缀合物，包括：(a)一个抗体分子，包含(i)一个抗原结合结构域和(ii)一个Fc结构域；(b)一个佐剂分子；和(c)一个包含乙二醇基或甘氨酸残基的接头，其中每个佐剂分子通过接头与抗体分子共价结合，该接头可以是可裂解的或不可裂解的。
本文所用的术语″放射性核素″是指发出电离辐射导致细胞破坏/死亡的放射性同位素。与肿瘤靶向载体缀合的放射性核素被称为″靶向放射性核素疗法″。
本文所用的术语″DNA损伤修复抑制剂″是指针对DNA损伤修复元件的药物，例如针对CHK1、CHK2、ATM、ATR和PARP。由于现有的突变或通路改变，某些癌症更容易针对这些通路易感，如BRCA1突变的病人或同源重组通路缺陷的病人由于合成致死性的概念而对PARP抑制剂易感。
本文所用的术语″肿瘤代谢抑制剂″是指干扰在肿瘤环境中表达的一种或多种酶的功能的化合物，所述酶产生可能抑制免疫细胞功能的代谢中间物。
本文所用的术语″蛋白激酶抑制剂″是指抑制一种或多种蛋白激酶的活性的化合物。蛋白激酶是使蛋白质磷酸化的酶，它由此可以调节蛋白质的功能。可以理解，一种蛋白激酶抑制剂可以靶向一种以上的激酶，本文所用的蛋白激酶抑制剂的任何分类都是指主要或最有特征的目标。
本文所用的术语″趋化因子受体和趋化物(chemoattractant)受体激动剂″是指激活趋化因子或趋化物受体的化合物，这些受体是G-蛋白缀合受体或G-蛋白缀合类受体的一个子集，在多种细胞上表达，主要参与控制细胞运动(趋化作用或化学促活作用)。这些受体也可能参与非细胞迁移过程，如血管生成、细胞成熟或炎症。
本文所用的术语″细胞因子受体激动剂″是指控制免疫细胞激活和增殖的可溶性蛋白质。细胞因子包括例如干扰素、白细胞介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子。
本文所用的术语″死亡受体激动剂″是指能够通过一个或多个死亡受体，如DR4(TRAIL-R1)或DR5(TRAIL-R2)诱导促凋亡信号的分子。死亡受体激动剂可选自抗体、死亡配体、细胞因子、表达死亡受体激动剂的载体、肽、小分子激动剂、表达死亡受体激动剂的细胞(例如干细胞)和诱导死亡配体表达的药物。
本文所用的术语″抗原呈递细胞″或″APC″是指一种细胞，如巨噬细胞、B细胞或树突状细胞，它通过MHC II类分子向CD4 T细胞上的T细胞受体呈递经过处理的抗原肽。本领域技术人员可以通过使用表型技术(如流式细胞仪)来鉴定APC。用于鉴定APC的表型标记因物种和组织而异，但可包括骨髓或树突状细胞表面标志物(例如CD11b、CD11c、CD14、CD16、CD33、CD34、CD68、CD206、MHC-II、CD163、Ly6C、Ly6G、GR-1、F4/80)或B细胞表面标志物(例如CD19、CD20、B220)。
本文所用的术语″MHCII″是指一类主要组织相容性复合体(MHC)分子，通常只存在于抗原呈递细胞，如骨髓细胞、树突状细胞和B细胞。MHCII将经过处理的抗原肽提呈给CD4T细胞上的T细胞受体。MHCII的表达可以由本领域的技术人员使用蛋白质表达分析技术(如流式细胞仪)来测量。MHCII表达的变化可以通过在感兴趣的特定细胞亚群中分析MHCII的中位荧光强度信号或MHCII阳性细胞百分比的变化来确定。
本文所用的术语″T细胞″是指一类免疫细胞，在适应性免疫反应中起着核心作用。T细胞与其他免疫细胞的区别在于其细胞表面存在αβ或γδT细胞受体(TCR)。T细胞还表达CD3，一种对TCR信号传递至关重要的蛋白质复合物。αβT细胞可分为CD4、CD8或CD4/CD8双阴性亚群。由于CD4+和CD8+T细胞上的CD4和CD8的表面密度很高，通常可以单独使用CD4和CD8分别来识别CD4+和CD8+T细胞。γδT细胞配备有一个由γ链和δ链组成的TCR，与αβTCR一样，它是识别抗原和细胞激活的核心。这种TCR也被用来区分γδT细胞的不同亚群，即Vδ1和Vδ2。Vδ1 T细胞是少数(＜5％)和异质性的γδT细胞群体，具有抗炎和促炎功能。Vδ2 T细胞是单一的相对同质的Vγ9V52(Vδ2)T细胞群，占循环中γδT细胞的约95％。由于其TCR和其他先天免疫受体的独特特性，Vδ2 T细胞被赋予了强大的抗肿瘤特性，可被用于免疫治疗。通过TCR识别由MHC分子呈现的同源抗原而激活后，T细胞可以成熟和分裂以产生效应或记忆T细胞。记忆性T细胞是T细胞的一个亚群，它们以前曾遇到并对其同源抗原作出反应。这种T细胞可以识别致病性抗原，例如来自细菌或病毒的抗原，以及癌症相关的抗原。本领域技术人员可以通过使用表型技术(如流式细胞术)来识别T细胞。用于识别T细胞的表型标志物在哺乳动物中一般是保守的，包括CD3、TCRα、TCRβ、TCRδ、CD4和CD8。用于识别记忆性T细胞的表型标志物可因物种和组织而异，但可包括细胞表面标志物，如CD45RO、LY6C、CD44和CD95。
本文所用的术语″表位扩散″是指表位特异性的多样化，从最初的集中、主导性表位特异性免疫反应，到同一蛋白质(分子内扩散)或其他蛋白质(分子间扩散)上的次要和/或隐性表位。
本文所用的术语″目标肿瘤″是指手术标本中最广泛的肿瘤区域，即最大的结节。
如本文所用，关于将第一部分连接在第二部分上的术语″可逆的″、″可逆地″、″可降解的″或″可降解地″是指连接所述第一和第二部分的连接物在生理条件下是可裂解的，生理条件是pH7.4、37℃的水缓冲液，半衰期从一小时到三个月，例如从一小时到两个月，从三小时到一个月，从12小时到三周或从24小时到两周。裂解可以是酶促的或非酶促的，在某些实施方案中是非酶促的。因此，关于第一部分与第二部分的连接，术语″稳定″或″永久″是指连接所述第一和第二部分的连接物在生理条件下的半衰期超过三个月。
如本文所用，术语″修饰性部分″在某些实施方案中是指取代基或聚合物部分。
如本文所用，术语″二硫化物桥接″是指在二硫化物桥的两个硫原子之间插入一个部分。这是通过使用一种试剂来实现的，该试剂具有在两个硫醇反应性官能团之间的所述部分，并使每个硫醇反应性官能团与二硫桥的一个硫原子反应，从而使该部分在先进行还原二硫键后插入所述硫原子之间。如果多肽或蛋白质中存在一个以上的二硫桥，二硫桥可以在一个二硫桥的硫原子之间插入，也可以在不同二硫桥的硫原子之间插入。这种二硫桥可以是天然存在于肽或蛋白质中的，也可以是人工引入的，例如通过用半胱氨酸部分替换现有的氨基酸部分或向肽或蛋白质中添加半胱氨酸部分而引入。
如本文所用，术语″试剂″是指一种化合物，它包括至少一个官能团，用于与另一种化合物或药物的官能团反应。可以理解，包含一个官能团(例如伯胺或仲胺或羟基官能团)的药物也是一种试剂。
如本文所用，术语″部分(moiety)″是指分子的一部分，它与相应的试剂相比缺少一个或多个原子。例如，如果式″HX-H″的试剂与另一试剂反应并成为反应产物的一部分，则反应产物的相应分子具有″H-X-″或″-X-″的结构，而每个″-″表示与另一个部分的连接。因此，药物部分从可逆连接中释放出来作为药物。
可以理解，如果提供了一组原子的序列或化学结构，该组原子连接到两个部分上或中断(interrupting)一个部分，所述序列或化学结构可以以任何方向连接到所述两个部分上，除非另有明确说明。例如，一个部分″-C(O)N(R1)-″可以作为″-C(O)N(R1)-″或作为″-N(R1)C(O)-″连接到两个部分或中断一个部分。同样地，一个部分
Figure BDA0004113465820000091
可以以下述形式连接到两个部分上或者中断一个部分，
Figure BDA0004113465820000092
本文使用的术语″取代″是指一个分子或部分中的一个或多个H原子被不同的原子或一组原子所取代，这些原子或原子组被称为″取代基″。
如本文所用，术语″取代基″在某些实施方案中是指选自下述的基团：卤素、-CN、-COORx1、-ORx1、-C(O)Rx1、-C(O)N(Rx1Rx1a)、-S(O)2N(Rx1Rx1a)、-S(O)N(Rx1Rx1a)、-S(O)2Rx1、-S(O)Rx1、-N(Rx1)S(O)2N(Rx1aRx1b)、-SRx1、-N(Rx1Rx1a)、-NO2、-OC(O)Rx1、-N(Rx1)C(O)Rx1a、-N(Rx1)S(O)2Rx1a、-N(Rx1)S(O)Rx1a、-N(Rx1)C(O)ORx1a、-N(Rx1)C(O)N(Rx1aRx1b)、-OC(O)N(Rx1Rx1a)、-T0、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基；其中的-T0、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选地被一个或多个相同或不同的Rx2取代，并且其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选地被一个或多个选自下述的基团所中断：-T0-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Rx3)-、-S(O)2N(Rx3)-、-S(O)N(Rx3)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Rx3)S(O)2N(Rx3a)-、-S-、-N(Rx3)-、-OC(ORx3)(Rx3a)-、-N(Rx3)C(O)N(Rx3a)-和-OC(O)N(Rx3)-；
-Rx1、-Rx1a、-Rx1b彼此独立地选自-H、-T0、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基，其中-T0、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选地被一个或多个相同或不同的-Rx2取代，其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选地被一个或多个选自下述的基团所中断：-T0、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Rx3)-、-S(O)2N(Rx3)-、-S(O)N(Rx3)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Rx3)S(O)2N(Rx3a)-、-S-、-N(Rx3)-、-OC(ORx3)(Rx3a)-、-N(Rx3)C(O)N(Rx3a)-、和-OC(O)N(Rx3)-；
每个T0独立地选自由以下组成的组：苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢萘基、C3-10环烷基、3-10元杂环基和8-11元杂双环基；其中每个T0独立地被一个或多个相同或不同的-Rx2任选取代；
每个-Rx2独立地选自下述基团：卤素、-CN、氧代(＝O)、-COORx4、-ORx4、-C(O)Rx4、-C(O)N(RxxRx4a)、-S(O)2N(Rx4Rx4a)、-S(O)N(Rx4Rx4a)、-S(O)2Rx4、-S(O)Rx4、-N(Rx4)S(O)2N(Rx4aRx4b)、-SRx4、-N(Rx4Rx4a)、-NO2、-OC(O)Rx4、-N(Rx4)C(O)Rx4a、-N(Rx4)S(O)2Rx4a、-N(Rx4)S(O)Rx4a、-N(Rx4)C(O)ORx4a、-N(Rx4)C(O)N(Rx4aRx4b)、-OC(O)N(Rx4Rx4a)和C1-6烷基；其中C1-6烷基任选地被一个或多个相同或不同的卤素取代；
每个-Rx3、-Rx3a、-Rx4、-Rx4a、-Rx4b独立地选自由H和C1-6烷基组成的组；其中C1-6烷基任选地被一个或多个相同或不同的卤素取代。
在某些实施方案中，一个任选取代的分子中最多有6个H原子被取代基独立替换，例如5个H原子被取代基独立替换，4个H原子被取代基独立替换，3个H原子被取代基独立替换，2个H原子被取代基独立替换，或者1个H原子被取代基替换。
如本文所用，术语″脂肪酸″是指具有脂肪族尾部的饱和或不饱和单羧酸，它可以包括4至28个碳原子。脂肪酸可以是饱和的或不饱和的，直链的或支链的。术语″脂肪酸变体″是指一种修饰的脂肪酸，其中某些碳原子可以被其他原子或原子组所取代，并且可以被取代。
本文所用的术语″肽″是指由肽(酰胺)键连接的至少2个和最多且包括50个氨基酸单体部分的链。术语″肽″还包括拟肽，如D-肽、肽样物或β-肽，并覆盖具有最多且包括50个单体部分的拟肽。
如本文所用，术语″蛋白质″是指通过肽链连接的由50个以上的氨基酸单体部分(也可称为″氨基酸残基″)组成的链，其中在某些实施方案中，通过肽键连接的氨基酸单体不超过12000个，例如不超过10000个氨基酸单体部分、不超过8000个氨基酸单体部分、不超过5000个氨基酸单体部分或不超过2000个氨基酸单体部分。
本文所用的术语″约″与一个数值结合，用于表示一个范围，该范围是从所述数值加上和减去不超过所述数值的25％且包括端值，在某些实施方案中是加上和减去不超过所述数值的20％，在某些实施方案中是加上和减去不超过所述数值的10％。例如，短语″约200″是指从200+/-25％的范围，即从150到250的范围且包括端值；在某些实施方案中，200+/-20％，即从160到240的范围且包括端值；以及在某些实施方案中，200+/-10％的范围，即从180到220且包括端值。可以理解，作为″约50％″的百分比并不意味着″50％+/-25％″，即从25到75％且包括端值，而是″约50％″意味着从37.5到62.5％且包括端值，即50这个数值的加减25％。
如本文所用，术语″聚合物″是指由重复的结构单元即单体组成的部分，它们通过化学键以线性、环状、支链、交联或树状方式或其组合连接，可以是合成的或生物来源的或两者的组合。可以理解，聚合物也可以包括一个或多个其他化学基团和/或例如一个或多个部分。同样，可以理解，肽或蛋白质也是一种聚合物，即使各个氨基酸残基的侧链可能不同。在某些实施方案中，可溶性聚合物的分子量至少为0.5kDa，例如，分子量至少为1kDa，分子量至少为2kDa，分子量至少为3kDa或分子量至少为5kDa。如果该聚合物是可溶的，在某些实施方案中，它的分子量最多为1000kDa，例如最多为750kDa，例如最多为500kDa，例如最多为300kDa，例如最多为200kDa，例如最多为100kDa。可以理解，对于不溶性聚合物如水凝胶，可以不提供有意义的分子量范围。
如本文所用，术语″聚合的″是指包含一种或多种聚合物或聚合物部分的试剂或部分。聚合物试剂或部分还可以任选包括一个或多个其他的部分，在某些实施方案中，这些部分选自以下：
·C1-50烷基、C2-50烯基、C2-50炔基、C3-10环烷基、3至10元杂环基、8至11元杂双环基、苯基、萘基、茚基、茚满基和四氢萘基；以及
·选自以下的连接物
Figure BDA0004113465820000121
其中
虚线表示与所述部分或试剂的其余部分的连接，以及
-R和-Ra相互独立地选自H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2，2-二甲基丙基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基和3，3-二甲基丙基组成的组。
本领域技术人员了解到，从聚合反应中获得的聚合产物并不都具有相同的分子量，而是呈现出分子量分布。因此，本文所用的分子量范围、分子量、聚合物中的单体数量范围和聚合物中的单体数量，指的是单体的数均分子量和数量平均值，即指聚合物或聚合部分的分子量的算术平均值和聚合物或聚合部分的单体数量的算术平均值。
因此，在包含″x″个单体单元的聚合部分中，″x″的任何整数都对应于单体的算术平均数。为″x″给出的任何整数范围提供了单体的算术平均数所在的整数范围。给出″x″的整数为″约x″意味着单体的算术平均数位于x+/-25％的整数范围内，优选x+/-20％，更优选x+/-10％。
如本文所用，术语″数均分子量″是指各个聚合物的分子量的普通算术平均值。
如本文所用，与部分或试剂有关的术语″基于PEG的″或″PEG基的″是指所述部分或试剂包括PEG。在某些实施方案中，基于PEG的部分或试剂包括至少10％(w/w)PEG，例如至少20％(w/w)PEG，例如至少30％(w/w)PEG，例如至少40％(w/w)PEG，例如至少50％(w/w)，例如至少60(w/w)PEG，例如至少70％(w/w)PEG，例如至少80％(w/w)PEG，例如至少90％(w/w)PEG，例如至少95％。基于PEG的部分或试剂的剩余重量百分比为其他部分，在某些实施方案中，所述其他部分选自下列部分和连接物：
·C1-50烷基、C2-50烯基、C2-50炔基、C3-10环烷基、3至10元杂环基、8至11元杂双环基、苯基、萘基、茚基、茚满基和四氢萘基；以及
·选自以下的连接物
Figure BDA0004113465820000131
其中
虚线表示与所述部分或试剂的其余部分的连接，以及
-R和-Ra相互独立地选自H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2，2-二甲基丙基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基和3，3-二甲基丙基组成的组。
术语″基于透明质酸的″或″透明质酸基的″被相应地使用。
如本文所用，术语″基于PEG的包含至少X％的PEG″对于一个部分或试剂而言，是指所述部分或试剂包含至少X％(w/w)的乙二醇单元(-CH2CH2O-)，其中乙二醇单元可以按块排列、交替排列或可以在部分或试剂内随机分布，在某些实施方案中，所述部分或试剂的所有乙二醇单元都存在于一个块中；基于PEG的部分或试剂的其余重量百分比为其他部分，在某些实施方案中，这些部分选自下列部分和连接体：
·C1-50烷基、C2-50烯基、C2-50炔基、C3-10环烷基、3至10元杂环基、8至11元杂双环基、苯基、萘基、茚基、茚满基和四氢萘基；以及
·选自以下的连接物
Figure BDA0004113465820000141
其中
虚线表示与所述部分或试剂的其余部分的连接，以及
-R和-Ra相互独立地选自H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2，2-二甲基丙基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基和3，3-二甲基丙基组成的组。
术语″基于透明质酸的包含至少X％的透明质酸″也相应地被使用。
如本文所用，术语″水凝胶″是指由均聚物或共聚物组成的亲水或两亲聚合物网络，其由于存在疏水相互作用、氢键、离子相互作用和/或共价化学交联而不溶解。在某些实施方案中，水凝胶由于存在共价化学交联而不溶。一般来说，交联提供了网络结构和物理完整性。
术语″中断″是指在两个碳原子之间插入一个部分，或者如果插入是在该部分的一端，则在一个碳原子或杂原子和一个氢原子之间。
如本文所用，术语″C1-4烷基″单独或组合使用时是指具有1至4个碳原子的直链或支链烷基部分。如果存在于分子的末端，直链或支链的C1-4烷基的例子是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。当一个分子的两个部分由C1-4烷基连接时，那么这种C1-4烷基的例子是-CH2-、-CH2CH2-、-CH(CH3)-、-CH2CH2CH2-、-CH(C2H5)-、-C(CH3)2-。C1-4烷基碳的每个氢任选地被上述定义的取代基取代。任选地，C1-4烷基可被一个或多个如下定义的部分中断。
如本文所用，术语″C1-6烷基″单独或组合使用时是指具有1至6个碳原子的直链或支链烷基部分。如果存在于分子的末端，直链和支链的C1-6烷基的例子是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2，2-二甲基丙基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基和3，3-二甲基丙基。当一个分子的两个部分由C1-6烷基连接时，那么这种C1-6烷基的例子是-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2-CH2-CH2-、-CH(C2H5)-和-C(CH3)2-。C1-6碳的每个氢原子任选地被上述定义的取代基所取代。任选地，C1-6烷基可以被一个或多个如下定义的部分所中断。
因此，″C1-10烷基″、″C1-20烷基″或″C1-50烷基″是指分别具有1至10、1至20或1至50个碳原子的烷基链，其中C1-10、C1-20或C1-50碳的每个氢原子任选地被上述定义的取代基取代。任选地，C1-10或C1-50烷基可以被一个或多个如下定义的部分中断。
如本文所用，术语″C2-6烯基″单独或组合使用时是指包含至少一个碳-碳双键的具有2至6个碳原子的直链或支链烃基。如果存在于分子的末端，例子有-CH＝CH2、-CH＝CH-CH3、-CH2-CH＝CH2、-CH＝CHCH2-CH3和-CH＝CH-CH＝CH2。当一个分子的两个部分由C2-6烯基连接时，那么这种C2-6烯基的一个例子是-CH＝CH-。C2-6烯基部分的每个氢原子可以任选地被上述定义的取代基所取代。任选地，C2-6烯基可以被一个或多个如下定义的部分所中断。
因此，术语″C2-10烯基″、″C2-20烯基″或″C2-50烯基″单独或组合使用时是指包含至少一个碳-碳双键的直链或支链烃部分，具有2至10、2至20或2至50个碳原子。C2-10烯基、C2-20烯基或C2-50烯基的每个氢原子任选地被上述定义的取代基取代。任选地，C2-10烯基、C2-20烯基或C2-50烯基可以被一个或多个如下定义的部分中断。
如本文所用，术语″C2-6炔基″单独或组合使用时是指包含至少一个碳-碳三键的具有2至6个碳原子的直链或支链烃部分。如果存在于分子的末端，例子有：-C≡CH、-CH2-C≡CH、-CH2-CH2C≡CH和-CH2-C≡C-CH3。当一个分子的两个部分由炔烃基团连接时，那么一个例子就是-C≡C-。C2-6炔基的每个氢原子任选地被上述定义的取代基所取代。任选地，可以出现一个或多个双键。任选地，C2-6炔基可以被一个或多个如下定义的部分中断。
因此，如本文所用，术语″C2-10炔基″、″C2-20炔基″和″C2-50炔基″单独或组合使用时是指包含至少一个碳-碳三键的直链或支链烃基，分别具有2至10、2至20或2至50个碳原子。C2-10炔基、C2-20炔基或C2-50炔基的每个氢原子任选地被上述定义的取代基取代。任选地，可以出现一个或多个双键。任选地，C2-10炔基、C2-20炔基或C2-50炔基可被一个或多个如下定义的部分中断。
如上所述，C1-4烷基、C1-6烷基、C1-10烷基、C1-20烷基、C1-50烷基、C2-6烯基、C2-10烯基、C2-20烯基、C2-50烯基、C2-6炔基、C2-10炔基、C2-20烯基或C2-50炔基任选地被一个或多个部分中断，这些部分优选选自以下：
Figure BDA0004113465820000161
其中
虚线表示连接到所述部分或试剂的其余部分；以及
-R和-Ra相互独立地选自-H和甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基组成的组。
如本文所用，术语″C3-10环烷基″是指具有3至10个碳原子的环状烷基链，可以是饱和或不饱和的，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、环庚基、环辛基、环壬基或环癸基。C3-10环烷基碳的每个氢原子可被上述定义的取代基取代。术语″C3-10环烷基″还包括桥接的双环，如降莰烷或降冰片烯。
术语″8-30元碳多环基″或″8-30元碳多环″是指具有8-30个环原子的两个或多个环的环状部分，其中两个相邻的环至少共享一个环原子，并且可以包含最多数量的双键(完全饱和、部分饱和或不饱和的芳香或非芳香环)。优选地，8-30元的碳多环是指由两个、三个、四个或五个环组成的环状部分，更优选由两个、三个或四个环组成。
如本文所用，术语″3-10元杂环基″或″3-10元杂环″是指具有3、4、5、6、7、8、9或10个环原子的环，其可包含最多数量的双键(完全饱和、部分饱和或不饱和的芳香族或非芳香族环)，其中至少一个环原子且至多4个环原子被选自硫(包括-S(O)-、-S(O)2-)、氧和氮(包括＝N(O)-)组成的组的杂原子替换，并且其中该环通过一个碳或氮原子与分子的其余部分连接。3-10元杂环的例子包括但不限于氮杂环丙烷、氧杂环丙烷、硫杂环丙烷、氮杂环丁烯、氧杂环丁烯、硫杂环丁烯、氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、呋喃、噻吩、吡咯、吡咯啉、咪唑、咪唑啉、吡唑、吡唑啉、噁唑、噁唑啉、异噁唑、异噁唑啉、噻唑、噻唑啉、异噻唑、异噻唑啉、噻二唑、噻二唑啉、四氢呋喃、四氢噻吩、吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、噻二唑烷、砜类、吡喃、二氢吡喃、四氢吡喃、咪唑烷、吡啶、哒嗪、吡嗪、嘧啶、哌嗪、哌啶、吗啉、四唑、三唑、三唑烷、四唑烷、二氮杂环庚烷、氮杂卓和高哌嗪。3-10元杂环基或3-10元杂环基的每个氢原子可以被下面定义的取代基所取代。
如本文所用，术语″8-11元杂双环基″或″8-11元杂双环″是指具有8至11个环原子的由两个环组成的杂环部分，其中至少有一个环原子为两个环所共有，并且可以包含最多的双键数量(完全饱和、部分饱和或不饱和的芳香族或非芳香族环)，其中至少一个环原子且至多6个环原子被选自硫(包括-S(O)-，-S(O)2-)、氧和氮(包括＝N(O)-)的杂原子替换，并且该环通过一个碳原子或氮原子与分子的其余部分相连。8-11元杂双环的例子有吲哚、吲哚啉、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并噁唑、苯并异噁唑、苯并噻唑、苯并异噻唑、苯并咪唑、苯并咪唑啉、喹啉、喹唑啉。二氢喹唑啉、喹啉、二氢喹啉、四氢喹啉、十氢喹啉、异喹啉、十氢异喹啉、四氢异喹啉、二氢异喹啉、苯并氮杂卓、嘌呤和蝶啶。术语8-11元杂双环也包括两个环的螺环结构，如1，4-二氧杂-8-氮杂环[4.5]癸烷，或桥接的杂环，如8-氮杂环[3.2.1]辛烷。8-11元杂双环基或8-11元杂双环碳的每个氢原子可以被下面定义的取代基所取代。
同样，术语″8-30元杂多环基″或″8-30元杂多环″是指具有8-30个环原子的由两个以上环组成的杂环基团，优选3、4或5个环，其中两个相邻的环至少共享一个环原子，并且可以包含最多的双键(完全饱和、部分饱和或不饱和的芳香族或非芳香族环)，其中至少一个环原子且至多10个环原子被选自硫(包括-S(O)-，S(O)2-)、氧和氮(包括＝N(O)-)的杂原子所替换，并且该环通过一个碳或氮原子与分子的其余部分连接。
可以理解，短语″一对Rx/Ry与它们所连接的原子一起形成C3-10环烷基或3-10元杂环基″与以下结构的部分有关
Figure BDA0004113465820000171
意味着Rx和Ry构成以下结构。
Figure BDA0004113465820000172
其中R是C3-10环烷基或3至10元杂环基。
还可以理解，短语″一对Rx/Ry与它们所连接的原子一起形成一个环A″与以下结构的部分有关
Figure BDA0004113465820000181
意味着Rx和Ry构成以下结构：
Figure BDA0004113465820000182
如本文所用，″卤素″是指氟、氯、溴或碘。通常优选的是，卤素是氟或氯。
如本文所用，术语″官能团″是指可以与其他原子团反应的原子团。例如，示例性的官能团有：羧酸(-(C＝O)OH)、伯胺或仲胺(-NH2、-NH-)、马来酰亚胺、硫醇(-SH)、磺酸(-(O＝S＝O)OH)、碳酸酯、氨基甲酸酯(-O(C＝O)N＜)、羟基(-OH)、醛(-(C＝O)H)，酮(-(C＝O))，肼(＞N-N＜)、异氰酸酯、异硫氰酸酯、磷酸(-O(P＝O)OHOH)、膦酸(-O(P＝O)OHH)、卤代乙酰基、卤代烷基、丙烯酰、芳基氟化物、羟胺、二硫化物、磺酰胺、硫酸、乙烯基砜、乙烯基酮、重氮烷、环氧乙烷和氮杂环丁烷。
如果本发明的IL-2蛋白或缀合物包括一个或多个酸性或碱性基团，本发明还包括其相应的药学或毒理学上可接受的盐，特别是其药学上可利用的盐。因此，根据本发明，包括酸性基团的IL-2蛋白或缀合物可以作为例如碱金属盐、碱土金属盐或铵盐使用。这种盐的更精确的例子包括钠盐、钾盐、钙盐、镁盐或与氨或有机胺例如乙胺、乙醇胺、三乙醇胺或氨基酸的盐。本发明的IL-2蛋白或缀合物包括一个或多个碱性基团，即可以质子化的基团，可以以其与无机或有机酸的加成盐的形式存在并根据本发明使用。合适的酸的例子包括氯化氢、溴化氢、磷酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘二磺酸、草酸、乙酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、甲酸。丙酸、特戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富马酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡萄糖酸、抗坏血酸、异烟酸、柠檬酸、己二酸，以及本领域技术人员已知的其他酸。对于本领域技术人员来说，将碱性基团转化为阳离子的进一步方法是已知的，如胺基的烷基化导致带正电荷的铵基和盐的适当的抗衡离子。如果本发明的IL-2蛋白或缀合物同时包括酸性和碱性基团，那么本发明除了提到的盐的形式外，还包括内盐或内铵盐类(兼性离子)。各盐可以通过惯常的方法获得，这些方法是本领域技术人员已知的，例如通过将这些前药与有机或无机酸或碱在溶剂或分散剂中接触，或通过阴离子交换或阳离子交换与其他盐接触。本发明还包括本发明的IL-2蛋白或缀合物的所有这类盐，所述盐类由于生理相容性低，不直接适合用于制药，但可以例如作为化学反应的中间体或用于制备药学上可接受的盐类。
术语″药学上可接受的″是指对病人施用时不会造成伤害的物质，优选指经监管机构，如EMA(欧洲)和/或FDA(美国)和/或任何其他国家监管机构批准用于动物，例如用于人类。
如本文所用，术语″赋形剂″指的是稀释剂、辅助剂或载体，它们与治疗剂如药物或前药一起给药。这类药用赋形剂可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，包括但不限于花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物被口服时，水是一种优选的赋形剂。当药物组合物进行静脉注射时，盐水和葡萄糖水是优选的赋形剂。盐水和葡萄糖水溶液优选作为注射液的液体赋形剂。合适的药用辅料包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、干脱脂牛奶、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，该药物组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂、pH值缓冲剂，例如，乙酸盐、琥珀酸盐、tris、碳酸盐、磷酸盐。HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)，或者可以含有洗涤剂，如吐温、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯胺、CHAPS、Igepal，或氨基酸，如甘氨酸、赖氨酸或组氨酸。这些药物组合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等形式。药物组合物可以配制成栓剂，使用传统的粘合剂和辅料，如甘油三酯。口服制剂可包括标准辅料，如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这种组合物将包含治疗有效量的药物或生物活性分子，以及适量的赋形剂，以便为病人提供适当的给药形式。制剂应适合给药方式。
一般来说，术语″包括″或″包含″也包括″由…组成″。
式(I)的SEQ A与SEQ ID NO：1具有至少94％的序列同一性。SEQ ID NO：1具有以下序列：
Figure BDA0004113465820000191
式(I)的SEQ B与SEQ ID NO：2具有至少94％的序列同一性。SEQ ID NO：2具有以下序列：
Figure BDA0004113465820000192
除非另有说明，本文给出的所有氨基酸位置分别以SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2为基础。
在某些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，SEQ A包括两个氨基酸的变化。在某些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比，序列SEQ A包括一个氨基酸变化。这种氨基酸变化可以是氨基酸的缺失、氨基酸的增加或一个氨基酸与另一个氨基酸的交换，即突变。这种突变也可以是将一种蛋白源性氨基酸交换为一种非蛋白源性氨基酸，或交换为一种蛋白源性氨基酸的D-立体异构体。
在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：1的序列，包括K34位的一个氨基酸变化。在某些实施方案中，这种氨基酸变化是用另一种氨基酸替换一种氨基酸(在此为赖氨酸)，在某些实施方案中，所述另一种氨基酸选自由丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸组成的组。在某些实施方案中，所述K34位置的氨基酸变化选自K34A(SEQ ID NO：3)、K34C(SEQ ID NO：4)、K34G(SEQ ID NO：5)、K34S(SEQID NO：6)、K34T(SEQ ID NO：7)、K34Q(SEQ ID NO：8)、K34E(SEQ ID NO：9)、K34N(SEQ IDNO：l 0)和K34D(SEQ ID NO：11)组成的组。因此，在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：3的序列：PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPALT。在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ IDNO：4的序列：PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPCLT。在某些实施方案中，SEQ A具有SEQID NO：5的序列：PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPGLT。在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：6的序列：PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPSLT。在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：7的序列：PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPTLT。在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：8的序列：PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPQLT。在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：9的序列：PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPELT。在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：10的序列：PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPNLT。在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：11的序列：PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPDLT。在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：1的序列。
令人惊讶的发现，在SEQ A的K34位引入一个氨基酸变化，改善了式(I)的IL-2蛋白的溶解度和再折叠。
在某些实施方案中，与SEQ ID NO：2相比，SEQ B包括1至5个氨基酸的变化。在某些实施方案中，与SEQ ID NO：2相比，SEQ B包括1至4个氨基酸的变化。在某些实施方案中，与SEQ ID NO：2相比，SEQ B包括五个氨基酸变化。在某些实施方案中，与SEQ ID NO：2相比，SEQ B包括四个氨基酸的变化。在某些实施方案中，SEQ B与SEQ ID NO：2相比包括三个氨基酸的变化。在某些实施方案中，SEQ B与SEQ ID NO：2相比包括两个氨基酸变化。在某些实施方案中，SEQ B与SEQ ID NO：2相比包括一个氨基酸变化。在某些实施方案中，SEQ B与SEQID NO：2相比不包含任何氨基酸变化。这种氨基酸变化可以是氨基酸的缺失、氨基酸的增加或一个氨基酸与另一个氨基酸的交换，即突变。这种突变也可以是将一个蛋白源性氨基酸交换为一个非蛋白源性氨基酸，或交换为蛋白源性氨基酸的D-立体异构体。
在某些实施方案中，所述1至4个氨基酸变化用选自丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸和天冬酰胺组成的组的氨基酸替换一个氨基酸。在某些实施方案中，所述1至4个氨基酸的变化用丙氨酸替换了一个氨基酸。在某些实施方案中，所述1至4个氨基酸的变化用半胱氨酸替换了一个氨基酸。在某些实施方案中，所述1至4个氨基酸的变化用甘氨酸替换了一个氨基酸。在某些实施方案中，所述1至4个氨基酸的变化用丝氨酸替换了一个氨基酸。在某些实施方案中，所述1至4个氨基酸的变化用苏氨酸替换了一个氨基酸。在某些实施方案中，所述1至4个氨基酸的变化用谷氨酰胺替换了一个氨基酸。在某些实施方案中，所述1至4个氨基酸的变化用谷氨酸替换了一个氨基酸。在某些实施方案中，所述1至4个氨基酸的变化用天冬酰胺替换了一个氨基酸。
在某些实施方案中，所述1至4个氨基酸变化选自发生在SEQ ID NO：2的M1、T3、F4、K5、F6、Y7、E24、E30、L34和C87的位置的氨基酸变化。在某些实施方案中，所述1至4个氨基酸的变化之一发生在SEQ ID NO：2的M1位置。在某些实施方案中，所述1至4个氨基酸的变化之一发生在SEQ ID NO：2的T3位置。在某些实施方案中，所述的1-4个氨基酸变化之一发生在SEQ ID NO：2的F4位置。在某些实施方案中，所述1至4个氨基酸的变化之一发生在SEQ IDNO：2的K5位置。在某些实施方案中，所述1至4个氨基酸的变化之一发生在SEQ ID NO：2的F6位置。在某些实施方案中，所述1至4个氨基酸的变化之一发生在SEQ ID NO：2的Y7位置。在某些实施方案中，所述1至4个氨基酸的变化之一发生在SEQ ID NO：2的E24位置。在某些实施方案中，所述1至4个氨基酸的变化之一发生在SEQ ID NO：2的E30位置。在某些实施方案中，所述1至4个氨基酸的变化之一发生在SEQ ID NO：2的L34位置。在某些实施方案中，所述1至4个氨基酸的变化之一发生在SEQ ID NO：2的C87位置。
在某些实施方案中，所述1至4个氨基酸的变化选自基于SEQ ID NO：2序列的以下变化：
M1A，M1C，M1G，M1S，M1T，M1Q，M1E，M1N，T3A，T3C，T3G，T3S，T3Q，T3E，T3N，F4A，F4C，F4G，F4S，F4T，F4Q，F4E，F4N，K5A，K5C，K5G，K5S，K5T，K5Q，K5E，K5N，F6A，F6C，F6G，F6S，F6T，F6Q，F6E，F6N，Y7A，Y7C，Y7G，Y7S，Y7T，Y7Q，Y7E，Y7N，E24A，E24C，E24G，E24S，E24T，E24Q，E24N，E30A，E30C，E30G，E30S，E30T，E30Q，E24N，L34A，L34C，L34G，L34S，L34T，L34Q，L34E，L34N，C87A，C87G，C87S，C87T，C87Q，C87E和C87N。可以理解，术语″M1A″意味着第1位的甲硫氨酸被丙氨酸取代，其他术语也相应地使用。在某些实施方案中，SEQ B包括M1A突变。在某些实施方案中，SEQ B包括M1C突变。在某些实施方案中，SEQ B包括M1G突变。在某些实施方案中，SEQ B包括M1S突变。在某些实施方案中，SEQ B包括M1T突变。在某些实施方案中，SEQB包括M1Q突变。在某些实施方案中，SEQ B包括M1E突变。在某些实施方案中，SEQ B包括M1N突变。在某些实施方案中，SEQ B包括T3A突变。在某些实施方案中，SEQ B包括T3C突变。在某些实施方案中，SEQ B包括T3G突变。在某些实施方案中，SEQ B包括T3S突变。在某些实施方案中，SEQ B包括T3Q突变。在某些实施方案中，SEQ B包括T3E突变。在某些实施方案中，SEQB包括T3N突变。在某些实施方案中，SEQ B包括F4A突变。在某些实施方案中，SEQ B包括F4C突变。在某些实施方案中，SEQ B包括F4G突变。在某些实施方案中，SEQ B包括F4S突变。在某些实施方案中，SEQ B包括F4T突变。在某些实施方案中，SEQ B包括F4Q突变。在某些实施方案中，SEQ B包括F4E突变。在某些实施方案中，SEQ B包括F4N突变。在某些实施方案中，SEQB包括K5A突变。在某些实施方案中，SEQ B包括K5C突变。在某些实施方案中，SEQ B包括K5G突变。在某些实施方案中，SEQ B包括K5S突变。在某些实施方案中，SEQ B包括K5T突变。在某些实施方案中，SEQ B包括K5Q突变。在某些实施方案中，SEQ B包括K5E突变。在某些实施方案中，SEQ B包括K5N突变。在某些实施方案中，SEQ B包括F6A突变。在某些实施方案中，SEQB包括F6C突变。在某些实施方案中，SEQ B包括F6G突变。在某些实施方案中，SEQ B包括F5S突变。在某些实施方案中，SEQ B包括F6T突变。在某些实施方案中，SEQ B包括F6Q突变。在某些实施方案中，SEQ B包括F6E突变。在某些实施方案中，SEQ B包括F6N突变。在某些实施方案中，SEQ B包括Y7A突变。在某些实施方案中，SEQ B包括Y7C突变。在某些实施方案中，SEQB包括Y7G突变。在某些实施方案中，SEQ B包括Y7S突变。在某些实施方案中，SEQ B包括Y7T突变。在某些实施方案中，SEQ B包括Y7Q突变。在某些实施方案中，SEQ B包括Y7E突变。在某些实施方案中，SEQ B包括Y7N突变。在某些实施方案中，SEQ B包括E24A突变。在某些实施方案中，SEQ B包括E24C突变。在某些实施方案中，SEQ B包括E24G突变。在某些实施方案中，SEQ B包括E24S突变。在某些实施方案中，SEQ B包括E24T突变。在某些实施方案中，SEQ B包括E24Q突变。在某些实施方案中，SEQ B包括E24N突变。在某些实施方案中，SEQ B包括E30A突变。在某些实施方案中，SEQ B包括E30C突变。在某些实施方案中，SEQ B包括E30G突变。在某些实施方案中，SEQ B包括E30S突变。在某些实施方案中，SEQ B包括E30T突变。在某些实施方案中，SEQ B包括E30Q突变。在某些实施方案中，SEQ B包括E30N突变。在某些实施方案中，SEQ B包括L34A突变。在某些实施方案中，SEQ B包括L34C突变。在某些实施方案中，SEQB包括L34G突变。在某些实施方案中，SEQ B包括L34S突变。在某些实施方案中，SEQ B包括L34T突变。在某些实施方案中，SEQ B包括L34Q突变。在某些实施方案中，SEQ B包括L34E突变。在某些实施方案中，SEQ B包括L34N突变。在某些实施方案中，SEQ B包括C87A突变。在某些实施方案中，SEQ B包括C87G突变。在某些实施方案中，SEQ B包括C87S突变。在某些实施方案中，SEQ B包括C87T突变。在某些实施方案中，SEQ B包括C87Q突变。在某些实施方案中，SEQ B包括C87E突变。在某些实施方案中，SEQ B包括C87N突变。
在某些实施方案中，SEQ B具有SEQ ID NO：2的序列。在某些实施方案中，SEQ B具有SEQ ID NO：12的序列。
在某些实施方案中，SEQ B具有SEQ ID NO：12的序列：
Figure BDA0004113465820000231
在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：1的序列，SEQ B具有SEQ ID NO：2的序列。因此，式(I)的IL-2蛋白具有SEQ ID NO：13的序列：
Figure BDA0004113465820000232
在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：1的序列，SEQ B具有SEQ ID NO：12的序列。因此，式(I)的IL-2蛋白具有SEQ ID NO：14的序列：
Figure BDA0004113465820000233
在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：3的序列，SEQ B具有SEQ ID NO：2的序列。因此，式(I)的IL-2蛋白具有SEQ ID NO：22的序列：
Figure BDA0004113465820000241
在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：3的序列，SEQ B具有SEQ ID NO：12的序列。因此，式(I)的IL-2蛋白具有SEQ ID NO：23的序列：
Figure BDA0004113465820000242
在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：4的序列，SEQ B具有SEQ ID NO：2的序列。因此，式(I)的IL-2蛋白具有SEQ ID NO：24的序列：
Figure BDA0004113465820000243
在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：4的序列，SEQ B具有SEQ ID NO：12的序列。因此，式(I)的IL-2蛋白具有SEQ ID NO：25的序列：
Figure BDA0004113465820000244
在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：5的序列，SEQ B具有SEQ ID NO：2的序列。因此，式(I)的IL-2蛋白具有SEQ ID NO：26的序列：
Figure BDA0004113465820000245
在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：5的序列，SEQ B具有SEQ ID NO：12的序列。因此，式(I)的IL-2蛋白具有SEQ ID NO：27的序列：
Figure BDA0004113465820000246
在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：6的序列，SEQ B具有SEQ ID NO：2的序列。因此，式(I)的IL-2蛋白具有SEQ ID NO：28的序列：
Figure BDA0004113465820000251
在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：6的序列，SEQ B具有SEQ ID NO：12的序列。因此，式(I)的IL-2蛋白具有SEQ ID NO：29的序列：
Figure BDA0004113465820000252
在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：7的序列，SEQ B具有SEQ ID NO：2的序列。因此，式(I)的IL-2蛋白具有SEQ ID NO：30的序列：
Figure BDA0004113465820000253
在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：7的序列，SEQ B具有SEQ ID NO：12的序列。因此，式(I)的IL-2蛋白具有SEQ ID NO：31的序列：
Figure BDA0004113465820000254
在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：8的序列，SEQ B具有SEQ ID NO：2的序列。因此，式(I)的IL-2蛋白具有SEQ ID NO：32的序列：
Figure BDA0004113465820000255
在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：8的序列，SEQ B具有SEQ ID NO：12的序列。因此，式(I)的IL-2蛋白具有SEQ ID NO：33的序列：
Figure BDA0004113465820000256
在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：9的序列，SEQ B具有SEQ ID NO：2的序列。因此，式(I)的IL-2蛋白具有SEQ ID NO：34的序列：
Figure BDA0004113465820000261
在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：9的序列，SEQ B具有SEQ ID NO：12的序列。因此，式(I)的IL-2蛋白具有SEQ ID NO：35的序列：
Figure BDA0004113465820000262
在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：10的序列，SEQ B具有SEQ ID NO：2的序列。因此，式(I)的IL-2蛋白具有SEQ ID NO：36的序列：
Figure BDA0004113465820000263
在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：10的序列，SEQ B具有SEQ ID NO：12的序列。因此，式(I)的IL-2蛋白具有SEQ ID NO：37的序列：
Figure BDA0004113465820000264
在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：11的序列，SEQ B具有SEQ ID NO：2的序列。因此，式(I)的IL-2蛋白具有SEQ ID NO：38的序列：
Figure BDA0004113465820000265
在某些实施方案中，SEQ A具有SEQ ID NO：11的序列，SEQ B具有SEQ ID NO：12的序列。因此，式(I)的IL-2蛋白具有SEQ ID NO：39的序列：
Figure BDA0004113465820000271
在另一个方面，本发明涉及编码式(I)的IL-2蛋白的寡核苷酸序列。这种寡核苷酸序列可以选自由DNA、RNA和cDNA序列组成的组。在某些实施方案中，该寡核苷酸序列是一个DNA序列。在某些实施方案中，该寡核苷酸序列是一个RNA序列。在某些实施方案中，该寡核苷酸序列是cDNA序列。在某些实施方案中，编码式(I)的IL-2蛋白的寡核苷酸是用于在原核系统、真核系统或无细胞系统中表达。在某些实施方案中，编码式(I)的IL-2蛋白的寡核苷酸序列是用于在原核系统中表达。在某些实施方案中，编码式(I)的IL-2蛋白的寡核苷酸序列用于在真核生物系统中表达。在某些实施方案中，编码式(I)的IL-2蛋白的寡核苷酸序列是用于在无细胞系统中表达。
在某些实施方案中，编码式(I)的IL-2蛋白的寡核苷酸序列用于在原核系统中表达，例如选自大肠杆菌；芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌；棒状杆菌，如谷氨酸棒状杆菌；和荧光假单胞菌组成的组的细菌系统。在某些实施方案中，这种寡核苷酸是质粒形式的DNA序列。
在某些实施方案中，编码式(I)的IL-2蛋白的寡核苷酸序列用于在真核系统中表达，例如选自以下的真核系统：酵母菌，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichiapastoris)；丝状真菌，如曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)或嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)；杆状病毒感染的细胞，例如杆状病毒感染的昆虫细胞，如Sf9、Sf21、Hi-5菌株，或杆状病毒感染的哺乳动物细胞，如HeLa、人胚胎肾细胞HEK293或中国仓鼠卵巢细胞(CHO)；哺乳动物系统，如小鼠骨髓瘤淋巴细胞(如NS0细胞)、小鼠成纤维细胞(如NIH3T3细胞)、CHO细胞，以及全人细胞，如HEK 293细胞、人胚胎视网膜细胞(如Crucell′s Per.C6)和人羊膜细胞(如Glycotope和CEVEC)；以及非裂解的昆虫细胞表达系统，如Sf9、Sf21、Hi-5、Schneider 2细胞或Schneider 3细胞。在某些实施方案中，编码式(I)的IL-2蛋白的寡核苷酸序列是用于在哺乳动物系统中表达。在某些实施方案中，编码式(I)的IL-2蛋白的寡核苷酸序列具有SEQ ID NO：17的序列。在某些实施方案中，这种寡核苷酸是质粒形式的DNA序列。在某些实施方案中，质粒具有SEQ ID NO：20的序列。
在另一个方面，本发明涉及一种表达式(I)的重组IL-2蛋白的方法，所述方法包括：a)培养表达一种或多种编码式(I)的IL-2蛋白的基因的宿主细胞；和b)将所述感兴趣的重组IL-2蛋白从宿主细胞培养物中分离。
在某些实施方案中，宿主细胞是原核细胞，如细菌细胞。在某些实施方案中，宿主细胞选自大肠杆菌；芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌；棒状杆菌，如谷氨酸棒状杆菌；和荧光假单胞菌组成的组。在某些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌。在某些实施方案中，宿主细胞是芽孢杆菌。在某些实施方案中，宿主细胞是棒状杆菌。在某些实施方案中，宿主细胞是荧光假单胞菌。
在某些实施方案中，宿主细胞是真核细胞。在某些实施方案中，宿主细胞选自以下：酵母菌，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)；丝状真菌，如曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)或嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)；杆状病毒感染的细胞，如杆状病毒感染的昆虫细胞，如Sf9、Sf21、Hi-5菌株，或杆状病毒感染的哺乳动物细胞，如HeLa、人胚胎肾细胞HEK293或中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。哺乳动物系统，如小鼠骨髓瘤淋巴细胞(如NS0细胞)、小鼠成纤维细胞(如NIH3T3细胞)、CHO细胞，以及全人细胞，如HEK 293细胞、人胚胎视网膜细胞(如Crucell′s Per.C6)和人羊膜细胞(如Glycotope和CEVEC)；以及非裂解的昆虫细胞表达系统，如Sf9、Sf21、Hi-5、Schneider 2细胞或Schneider 3细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是酵母细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是酿酒酵母细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是毕赤酵母(Pichiapastoris)细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是丝状真菌的细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是曲霉菌的细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是木霉属的细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是杆状病毒感染的细胞，例如杆状病毒感染的昆虫细胞或杆状病毒感染的哺乳动物细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是杆状病毒感染的Sf9细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是被杆状病毒感染的Sf21细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是杆状病毒感染的Hi-5菌株的细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是杆状病毒感染的HeLa细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是被杆状病毒感染的人类肾脏细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是杆状病毒感染的Sf9细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是杆状病毒感染的CHO细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是小鼠骨髓瘤淋巴细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是小鼠成纤维细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是CHO细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是HEK 293细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是人胚胎视网膜细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是人羊膜细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是小鼠成纤维细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是非裂解的昆虫细胞表达系统。在某些实施方案中，宿主细胞是Sf9细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是Sf21细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是Hi-5细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是Schneider 2细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是Schneider 3细胞。
可以理解，基于所使用的宿主细胞，式(I)的IL-2蛋白可以包括翻译后修饰，如糖基化，特别是O-连接和N-连接糖基化。即使没有明确提及，但可以理解，式(I)的IL-2蛋白可以包括这样的翻译后修饰，这样的修饰的IL-2蛋白也包括在本发明中。这种翻译后修饰的一个例子是当式(I)的IL-2蛋白在CHO细胞中表达时，SEQ ID NO：1的第2位苏氨酸的O-连接糖基化。O-连接糖例如可以是N1(NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)GalNAc-ol)或N2(NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)(NeuAc(a2-6))GalNAc-ol)，其中NeuAc是N-乙酰神经氨酸(唾液酸)，Gal是半乳糖，GalNac-ol是乙酰半乳糖胺醇(Acetylgalactosaminitol)。在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白可以包括至少一个O型连接的N1聚糖，至少一个O型连接的N2聚糖，至少一个O型连接的N1和至少一个O型连接的N2聚糖的组合，或者可以是非糖基化的。在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白包括至少一个，例如一个O-连接的N1聚糖。在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白包括至少一个，例如一个O-连接的N2聚糖。在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白包括至少一个，例如一个O-连接的N1聚糖和至少一个，例如一个O-连接的N2聚糖的组合。在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白是非糖基化的。N1和N2聚糖的比例例如可以是1∶1。
在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白在真核细胞，如CHO细胞中表达，并且至少80％的对应于氨基酸1至8的N端是O-糖基化的。在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白在真核细胞，如CHO细胞中表达，并且至少90％的对应于氨基酸1至8的N端是O-糖基化的。
令人惊讶的发现，使用真核表达系统如CHO细胞，可使式(I)的IL-2蛋白的溶解度和分泌量得到改善。已发现，在CHO细胞中的表达导致式(I)的IL-2蛋白的N端(氨基酸1至8)有效地进行O-糖基化。这种O-糖基化可通过防止蛋白质聚集和确保适当的分泌而对溶解性和分泌产生积极影响。
在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白主要以不溶性形式表达，例如在包涵体中。在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白被表达为可溶性蛋白。将式(I)的IL-2蛋白表达为可溶性蛋白，其优点是不需要复性步骤。这种可溶性蛋白可以保留在细胞内，也可以排泄到培养基中，或者在革兰氏阴性菌的情况下，排泄到外周空间中。
无论是选择基于包涵体的策略还是可溶性分泌策略，蛋白质序列中存在一个自由的、未配对的半胱氨酸都给重组生产带来挑战。
因此，在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白是在包涵体中生产的。这样的表达方法进一步包括溶解不溶性蛋白的步骤和体外再折叠的步骤。为了在再折叠过程中实现正确的二硫桥形成，通常从没有任何现有二硫桥的溶解的未折叠蛋白开始是有益的。因此，在某些实施方案中，该方法进一步涉及在溶解过程中加入还原剂。
在对含有游离半胱氨酸的蛋白质进行再折叠的过程中，一个典型的挑战是在预定的一对半胱氨酸之间实现正确的二硫桥形成，同时保持游离的未配对半胱氨酸处于游离、还原的状态。
在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白是通过分泌可溶性IL-2蛋白产生的。当以可溶的、分泌的形式表达含有游离的、未配对的半胱氨酸的蛋白质时，所得到的分泌的正确折叠的单体蛋白质往往带有额外的含硫醇的化合物，如半胱氨酸，通过二硫桥与其游离的未配对的半胱氨酸相连接，也称为″半胱氨酸封盖(capping)″。因此，在通过分泌合成可溶性形式的式(I)的IL-2蛋白的方法中，有一个步骤是任选地对游离半胱氨酸进行封盖。半胱氨酸封盖可以在感兴趣的蛋白质分泌后在细胞外进行，用来自培养基的含硫醇的化合物，如半胱氨酸、胱氨酸或谷胱甘肽，作为二硫桥的底物。或者，它可以在细胞内进行，在这种情况下，用于封盖的含硫醇的化合物，如半胱氨酸，来自细胞的代谢，例如来自氨基酸代谢。
作为一种副产品，感兴趣的蛋白质中的游离半胱氨酸可能会发生反应，在分子间形成二硫桥，从而形成感兴趣的蛋白质的二聚体。通过优化细胞培养条件，例如通过改变培养基中胱氨酸(半胱氨酸的氧化二聚体形式)的浓度，可以增加被含硫醇的化合物(如半胱氨酸)封盖的正确折叠的单体的数量。也可以通过改变培养基中谷胱甘肽的浓度，获得用谷胱甘肽而不是半胱氨酸封盖的游离半胱氨酸。因此，在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白用半胱氨酸封盖。在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白是用谷胱甘肽封盖的。
在表达含有游离半胱氨酸的蛋白质时，往往会产生二硫键连接的高分子量聚集体和多聚体。此外，在非预期的半胱氨酸对(分子间和分子内)之间可能发生不正确的二硫键形成，即二硫键的″错配″。在分泌过程中，可以通过以下方式减少二硫桥的错配和聚集体和多聚体的形成，例如优化用于指导分泌的前导序列或信号序列，或选择完全不同的前导序列，增加折叠伴侣和蛋白质二硫键异构酶的表达，表达来自其他生物的折叠伴侣和蛋白质二硫键异构酶，表达合成的折叠伴侣和蛋白质二硫键异构酶，改变温度，在培养基中添加短链脂肪酸补充剂，或在培养基中添加抗氧化剂。
上述对含有游离半胱氨酸的蛋白质的分泌的挑战往往导致正确折叠的半胱氨酸封盖的单体蛋白质分泌到培养基中的产量很低。
提高感兴趣的分泌蛋白产量的方法之一是改进裂解引导蛋白分泌的信号序列或前导序列的机制。正确加工信号序列或前导序列是分泌途径中的一个关键步骤，因为它释放了成熟分泌蛋白的N端，通常是实现高效分泌的必要条件。信号或前导序列的不完全裂解通常会导致蛋白质在细胞内的积累，但在某些情况下，不完全加工的产品也可能被分泌出来。
在大多数表达系统中，分泌是由分泌信号肽引导的，该信号肽与要分泌的蛋白的N端融合，并在分泌前或与分泌一起被宿主细胞的特定加工酶裂解掉。因此，式(I)的IL-2蛋白在某些实施方案中与分泌信号肽一起表达，该信号肽在分泌前或与分泌一起被宿主细胞的特定加工酶裂解掉。
在哺乳动物表达系统中，信号肽在某些实施方案中是任何天然分泌的蛋白质的信号肽。在某些实施方案中，用于哺乳动物表达系统的信号肽在某些实施方案中因此是天然分泌的蛋白质的信号肽。在某些实施方案中，用于哺乳动物表达系统的信号肽是在电脑中设计的非天然合成信号序列，或在实验中发现的可有效引导分泌的信号。
在大肠杆菌中，引导蛋白质向外周分泌的信号序列可以是任何天然分泌到外周的细菌的信号肽。在某些实施方案中，用于在大肠杆菌中表达式(I)的IL-2蛋白的信号肽选自包括phoA、dsbA、gllI、mal、OmpA、OmpC、OmpT、pelB、torA、torT、EOX、STII、SfmC、lamB、MglB、MmAp和tolB的组。在某些实施方案中，信号肽是在电脑中设计的非天然序列，或在实验中发现的能有效引导分泌的非天然序列。
在酵母表达系统中，如酿酒酵母或毕赤酵母，引导表达的前导序列可以包括一个信号序列和一个前肽，其中信号序列引导蛋白质分泌到ER，并在运输到ER时被切掉，而前肽在分泌到生长基之前在高尔基体中被Kex2酶切掉。前导序列可以是天然分泌的酶或信息素的前导序列。在某些实施方案中，用于在酵母表达系统中表达的式(I)的IL-2蛋白的前导序列因此选自包括酿酒酵母交配因子Alpha前导序列、SUC2前导序列和VOA1前导序列的组。在某些实施方案中，前导序列来自另一种酵母或丝状真菌的分泌蛋白，或者它可以是在电脑中设计的非天然前导序列，或者它可以是实验发现的有效引导折叠和分泌的前导序列。前导序列也可以通过实验从一个大型的前导序列库中识别出来，例如，包括许多随机氨基酸替换的组合的库。
宿主细胞的内源性加工酶对信号或前导序列的正确裂解取决于紧随裂解位点的氨基酸序列，这些氨基酸构成了成熟加工和分泌的重组蛋白的N端。除了感兴趣的蛋白质的特定N端氨基酸序列外，N端在感兴趣的折叠蛋白质中的可及性可能影响信号序列或前导序列的加工效率。例如，埋藏的N端可能无法被加工蛋白酶接触到，因此对分泌策略来说是有问题的。
使用建立在现有实验数据上的预测模型，可以计算出信号肽酶复合体裂解某种氨基酸序列的概率。这样的工具可以在网上找到，使本领域的技术人员可以预测信号肽在真核生物和细菌中正确加工的可能性。在酵母表达系统中，前导序列通常包括信号序列和前肽，前者由ER中的信号肽酶复合体裂解，后者由高尔基体中的Kex2弗林蛋白酶裂解。Kex2的识别位点，即KR，在整个酵母物种的Kex2底物中是非常保守的。众所周知，带负电荷的氨基酸在Kex2底物的P1′、P2′和P4′位置上占多数。然而，Kex2的潜在裂解作用通常需要在实验中逐一检查。
本领域的普通技术人员知道，信号序列或前导序列的正确加工是有效分泌正确折叠和可溶的蛋白所需的几个特征之一。重要特征的例子是足够的转录和翻译率，共翻译或翻译后转位入ER，折叠和在ER中形成正确的二硫桥，以及向细胞外的囊泡运输。因此，对任何计算机辅助的分泌效率预测的实验验证是非常重要的。
众所周知，不正确折叠或聚集的蛋白质在细胞内的积累可能会对宿主细胞的生理产生负面影响，可能会诱发应激反应，导致生长速度和细胞活力下降。因此，通过改善信号或前导序列的加工来避免细胞内的积累，可能会导致生长速率、细胞密度和细胞物质生产力的提高，对感兴趣的蛋白质的整体生产力有积极的贡献。此外，一个更适合的细胞系更有可能在不同规模和培养条件下表现稳健，并更好地应对过程中的干扰。此外，本领域技术人员普遍认为，具有正常生长速率和细胞适应性的细胞系比因转基因表达的影响(如细胞内的产物积累)而导致生长率和细胞适应性降低的细胞系具有更低的不稳定性风险。对于转基因表达导致生长速度降低的细胞系来说，发生降低转基因表达的事件(如基因沉默事件、突变、或通过直接重复的重组使转基因环出(looping out))会导致竞争性生长优势。表达减少的细胞将迅速超过群体中仍然高水平表达转基因的其他细胞，导致不稳定的表达表型。
在某些实施方案中，表达编码式(I)的IL-2蛋白的一个或多个基因的宿主细胞可在其基因组中包含编码式(I)的IL-2蛋白的所述一个或多个基因。
在另一个方面，本发明涉及一种包含一个或多个式(I)的IL-2蛋白的缀合物。
在某些实施方案中，所述缀合物包括与式(I)的IL-2蛋白中标有星号的半胱氨酸缀合的Mmod部分。任选地，额外的Mmod部分可以在其他位置与式(I)的IL-2蛋白结合，这些额外的Mmod部分可以相同或不同。这种额外的Mmod部分的连接可以是在IL-2蛋白的N端、C端、氨基酸侧链或内部位置。在某些实施方案中，这种额外的Mmod部分的连接是在式(I)的IL-2蛋白的N端。在某些实施方案中，这种额外的Mmod部分是在式(I)的IL-2蛋白的C端连接。在某些实施方案中，这种额外的Mmod部分的连接是在IL-2分子的内部部位，例如在式(I)的IL-2蛋白的氨基酸侧链处。如果多于一个额外的Mmod部分连接到式(I)的IL-2蛋白上，则可在选自N端、C端和内部位点组成的组中的任何连接位点组合上发生连接。Mmod的实施方案如本文其他地方所述。任选地，一个或多个基团-L1-L2-Z可与Mmod部分缀合，其中-L1-、-L2-和Z如本文其他地方所定义。在某些实施方案中，一个或多个-L1-L2-Z与Mmod部分缀合，后者与式(I)中标有星号的半胱氨酸缀合。
Mmod的具体实施方案如本文其他地方所述。
在某些实施方案中，该缀合物是式(Ia)或(Ib)的IL-2缀合物或其药学上可接受的盐
Figure BDA0004113465820000331
其中
-D包括式(I)的IL-2蛋白；
-L1-是一个与D共价和可逆地连接的接头分子；
-L2-是一个化学键或者是一个间隔基部分；
-Z是一个聚合物部分或一个取代的脂肪酸部分；
x是一个整数，选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16；以及
y是一个选自2、3、4和5组成的组的整数。
在某些实施方案中，式(Ia)和(Ib)的缀合物释放出式(I)的偏向性IL-2部分或偏向性IL-2蛋白，其中比率偏向性IL-2与比率阿地白介素的比例大于1，优选大于2，优选大于3，优选大于4，甚至更优选大于5。在某些实施方案中，比率偏向性IL-2与比率阿地白介素的比例大于10、大于20、大于50、大于70、大于100或大于150。
在某些实施方案中，式(Ia)或(Ib)的-D包括与式(I)的IL-2蛋白中标有星号的半胱氨酸残基的硫醇缀合的修饰的Mmod部分。在某些实施方案中，这种Mmod部分与式(I)的IL-2蛋白中标有星号的半胱氨酸残基的硫醇稳定地结合。任选地，-D可包括一个或多个与-D稳定缀合的进一步的Mmod部分，其可以是相同或不同的Mmod部分。任选地，一个或多个进一步的-L1-L2-Z部分与Mmod缀合。
在一个实施方案中，Mmod是一个取代基。优选的，这种取代基的分子量在15Da至1kDa之间。
所述Mmod部分在一个实施方案中可以以二硫桥的形式引入，例如在两个半胱氨酸残基的硫醇基团之间形成的二硫桥，其中一个是式(I)中带星号的半胱氨酸。二硫桥的另一个半胱氨酸残基可以是一个天然存在的半胱氨酸残基。在某些实施方案中，所述另一个半胱氨酸不是天然存在的，而是被添加到或插入到式(I)的IL-2蛋白中，或取代式(I)的IL-2蛋白的天然存在的氨基酸残基。获得这种二硫桥的方法在Jones等人(J.Am.Chem.Soc.，2012，134(3)，pp 1847-1852)、WO2011/018611、WO2011/018612和WO2011/018613中公开。
在另一个实施方案中，Mmod是聚合物部分。这种聚合物部分可以包括线性、支链或多臂聚合物。在一个实施方案中，该聚合物是一种线性聚合物。在另一个实施方案中，该聚合物是一种支链聚合物。在某些实施方案中，这种支链聚合物有一个、两个、三个、四个或五个分支点。从每个分支点可以伸出两个、三个或四个聚合物臂。在另一个实施方案中，该聚合物是多臂聚合物。这种多臂聚合物可以有3、4、5、6、7或8个聚合物臂。
如果Mmod是一种聚合物部分，在某些实施方案中，这种聚合物部分的分子量从0.5kDa到1000kDa，例如从1kDa到1000kDa，例如从2kDa到500kDa，从3kDa到200kDa，从5kDa到120kDa或从7到40kDa。在一个实施方案中，这种聚合物的分子量约为0.5kDa。在一个实施方案中，这种聚合物的分子量约为1kDa。在一个实施方案中，这种聚合物的分子量约为2kDa。在一个实施方案中，这种聚合物的分子量约为3kDa。在一个实施方案中，这种聚合物的分子量约为4kDa。在一个实施方案中，这种聚合物的分子量约为5kDa。在一个实施方案中，这种聚合物的分子量约为7.5kDa。在另一个实施方案中，这种聚合物部分的分子量约为10kDa。在另一个实施方案中，这种聚合物部分的分子量约为15kDa。在另一个实施方案中，所述聚合物部分的分子量约为20kDa。在另一个实施方案中，所述聚合物部分的分子量约为30kDa。在另一个实施方案中，所述聚合物部分的分子量约为40kDa。在另一个实施方案中，所述聚合物部分的分子量约为50kDa。在另一个实施方案中，所述聚合物部分的分子量约为70kDa。在另一个实施方案中，所述聚合物部分的分子量约为80kDa。在另一个实施方案中，所述聚合物部分的分子量约为90kDa。在另一个实施方案中，这种聚合物部分的分子量约为100kDa。在一个实施方案中，这种聚合物的分子量为0.5kDa。在一个实施方案中，这种聚合物的分子量为1kDa。在一个实施方案中，这种聚合物的分子量为2kDa。在一个实施方案中，这种聚合物的分子量为3kDa。在一个实施方案中，这种聚合物的分子量为4kDa。在一个实施方案中，这种聚合物的分子量为5kDa。在一个实施方案中，这种聚合物的分子量为7.5kDa。在另一个实施方案中，这种聚合物的分子量为10kDa。在另一个实施方案中，这种聚合物部分的分子量为15kDa。在另一个实施方案中，所述聚合物部分的分子量为20kDa。在另一个实施方案中，所述聚合物部分的分子量为30kDa。在另一个实施方案中，所述聚合物部分的分子量为40kDa。在另一个实施方案中，所述聚合物部分的分子量为50kDa。在另一个实施方案中，所述聚合物部分的分子量为70kDa。在另一个实施方案中，所述聚合物部分的分子量为80kDa。在另一个实施方案中，所述聚合物部分的分子量为90kDa。在另一个实施方案中，这种聚合物部分的分子量为100kDa。
如果Mmod是一个聚合物部分，在某些实施方案中，这种聚合物部分包括选自以下的聚合物：2-甲基丙烯酰基-氧乙基磷酰胆碱、聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸酯)、聚(丙烯酰胺)、聚(烷氧基)聚合物、聚(酰胺)、聚(酰胺-胺)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(天冬酰胺)、聚(丁酸)、聚(乙醇酸)、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚(己内酯)、聚(碳酸酯)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(二甲基丙烯酰胺)、聚酯、聚乙烯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚(磷酸乙酯)、聚(乙基噁唑啉)、聚(乙醇酸)、聚(羟乙基丙烯酸酯)、聚(羟乙基噁唑啉)、聚(羟甲基丙烯酸酯)、聚(羟丙基甲基丙烯酰胺)、聚(羟丙基甲基丙烯酸酯)、聚(羟丙基噁唑啉)、聚(亚氨基碳酸酯)、聚(乳酸)、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚(甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(甲基噁唑啉)、聚(有机磷腈)、聚(原酸酯)、聚(噁唑啉)、聚(丙二醇)、聚(硅氧烷)、聚氨酯、聚(乙烯醇)、聚(乙烯胺)、聚(乙烯基甲基醚)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、硅酮、纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲壳素、壳聚糖、右旋糖苷、糊精、明胶、透明质酸及其衍生物、官能化透明质酸、海藻酸盐、甘露聚糖、果胶、鼠李半乳糖、淀粉、羟烷基淀粉、羟乙基淀粉和其他基于碳水化合物的聚合物、木聚糖及其共聚物。
在一个实施方案中，Mmod是一种基于PEG的聚合物。
在另一个实施方案中，Mmod是一种基于透明质酸的聚合物。
在另一个实施方案中，Mmod包括多肽或蛋白部分，它可以与式(I)的IL-2蛋白化学缀合。在某些实施方案中，这种多肽或蛋白质Mmod部分不是IL-2的片段或IL-2部分。
以肽或蛋白质部分形式存在的Mmod，可以是合成的或天然的蛋白质分子或其部分或变体。示例性的多肽和蛋白质包括白蛋白；抗体结构域，如免疫球蛋白的Fc结构域或抗原结合结构域；CTP和CD25；每一种都可以是其天然存在的形式或其变体或片段。
Mmod与式(I)的IL-2蛋白可以通过稳定的连接物连接。在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白与Mmod部分之间的连接是通过酰胺。在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白和Mmod部分之间的连接是通过下述基团
Figure BDA0004113465820000351
本发明的缀合物可包括与式(I)的IL-2蛋白中标有星号的半胱氨酸缀合的Mmod部分，并可任选地包括与式(I)的IL-2蛋白缀合的一个或多个额外的Mmod部分。
这种一个或多个额外的Mmod部分的连接可以是在IL-2蛋白的蛋白或非蛋白的氨基酸残基上。在某些实施方案中，这种一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在蛋白质氨基酸上。这种蛋白质氨基酸残基在某些实施方案中选自包括半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和精氨酸的组。在某些实施方案中，这种一个或多个额外的Mmod部分发生在非蛋白氨基酸上。在这种情况下，可以理解为这种非蛋白氨基酸残基被人工地引入到式(I)的IL-2蛋白中。这种非蛋白氨基酸残基可以是任何非蛋白的氨基酸残基，其具有可用于将Mmod与式(I)的IL-2蛋白结合的官能团。在某些实施方案中，这种非蛋白氨基酸在其侧链中包括一个选自以下组的官能团：羰基；羰基衍生物，如类羰基、标记的羰基和被保护的羰基；叠氮；肟；以及羟胺。
在某些实施方案中，所述非蛋白氨基酸是WO2006/069246A2中描述的非蛋白氨基酸，该非蛋白氨基酸通过参考纳入本文。在某些实施方案中，该非蛋白氨基酸具有如WO2006/069246A2中[00265]至[00283]中的式(I)、[00284]中的式(XXX)、[00285]中的式(XXX-A)、[00286]中的式(XXX-B)、[00287]中的式(XXXI)、[00288]中的式(XXXI-A)、[00289]中的式(XXXI-B)、[00290]中的式(XXXII)、[00291]中的式(XXXII-A)、在[00292]中的式(XXXII-B)、[00293]中的式(XXXX)、[00294]中的式(XXXXI)、在被误标的段落[0100](即[00294]和[00295]之间的段落)中的式(XXXXII)、[00295]和[00296]中的式(XXXXIII)、[00302]至[00305]中的式(XIV)、[00306]和[00307]中的式(XV)、[00310]至[00312]中的式(XI)、[00313]中的式(XII)、[00314]和[00315]中的式(XII)、[00316]中的式(XIV)、[00317]中的式(XVI)、[00318]和[00319]中的式(XVI)、[00320]和[00321]中的式(XVIII)或[00530]中的式(XXIX)所述的结构，其非蛋白氨基酸通过参考纳入本文件。
在某些实施方案中，这种一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在式(I)的IL-2部分的赖氨酸残基上。在某些实施方案中，这种一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在式(I)的IL-2部分的苏氨酸残基上。在某些实施方案中，这种一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在式(I)的IL-2部分的丝氨酸残基上。在某些实施方案中，这种一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在式(I)的IL-2部分的酪氨酸残基上。在某些实施方案中，这种一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在式(I)的IL-2部分的组氨酸残基上。在某些实施方案中，这种一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在式(I)的IL-2部分的色氨酸残基上。在某些实施方案中，这种一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在式(I)的IL-2部分的天冬氨酸残基上。在某些实施方案中，这种一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在式(I)的IL-2部分的谷氨酸残基上。在某些实施方案中，这种一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在式(I)的IL-2部分的精氨酸残基上。在某些实施方案中，这种一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在式(I)的IL-2部分的半胱氨酸残基上，而不是标有星号的那个。在某些实施方案中，这种一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在式(I)的IL-2部分的甲硫氨酸残基上。在某些实施方案中，这种一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在式(I)的IL-2部分的谷氨酰胺残基上。
可以理解，在某些实施方案中，本发明的缀合物可以有这样一个或多个额外的Mmod部分，其连接到不止一种的氨基酸残基类型，例如连接到一个额外的半胱氨酸和一个赖氨酸。
在某些实施方案中，这种一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在已知参与与IL-2Rα结合的式(I)的IL-2蛋白的氨基酸位置。因此，在某些实施方案中，至少一个所述一个或多个额外的Mmod部分的连接，导致式(I)的IL-2蛋白与IL-2Rαβ的亲和力比阿地白介素降低，即导致IL-2部分的偏向。在某些实施方案中，至少一个所述一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在选自下组的位置：SEQ ID NO：1的K34、SEQ ID NO：2的M1、SEQ ID NO：2的T3、SEQID NO：2的F4、SEQ ID NO：2的K5、SEQ ID NO：2的F6、SEQ ID NO：2的Y7、SEQ ID NO：2的E24、SEQ ID NO：2的E30、SEQ ID NO：2的L34、SEQ ID NO：12的M1、SEQ ID NO：12的T3、SEQ IDNO：12的F4、SEQ ID NO：12的K5、SEQ ID NO：12的F6、SEQ ID NO：12的Y7、SEQ ID NO：12的E24、SEQ ID NO：12的E30和SEQ ID NO.12的L34。在某些实施方案中，至少一个所述一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在选自SEQ ID NO：2的F4、SEQ ID NO：2的Y7、SEQ ID NO：2的E24、SEQ ID NO：2的E30和SEQ ID NO：2的L34的位置。在某些实施方案中，至少一个所述一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在选自SEQ ID NO：12的F4、SEQ ID NO：12的Y7、SEQID NO：12的E24、SEQ ID NO：12的E30和SEQ ID NO：12的L34的位置。在某些实施方案中，至少一个所述一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在SEQ ID NO：1的K34处。在某些实施方案中，至少一个所述一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在SEQ ID NO：2的M1处。在某些实施方案中，至少一个所述一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在SEQ ID NO：2的T3处。在某些实施方案中，至少一个所述一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在SEQ ID NO：2的F4处。在某些实施方案中，至少一个所述一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在SEQ IDNO：2的K5处。在某些实施方案中，至少一个所述一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在SEQ ID NO：2的F6处。在某些实施方案中，至少一个所述一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在SEQ ID NO：2的Y7处。在某些实施方案中，至少一个所述一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在SEQ ID NO：2的E24处。在某些实施方案中，至少一个所述一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在SEQ ID NO：2的E30处。在某些实施方案中，至少一个所述一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在SEQ ID NO：2的L34处。在某些实施方案中，至少一个所述一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在SEQ ID NO：12的M1处。在某些实施方案中，至少一个所述一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在SEQ ID NO：12的T3处。在某些实施方案中，至少一个所述一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在SEQ ID NO：12的F4。在某些实施方案中，至少一个所述一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在SEQ ID NO：12的K5处。在某些实施方案中，至少一个所述一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在SEQ ID NO：12的F6处。在某些实施方案中，至少一个所述一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在SEQ ID NO：12的Y7处。在某些实施方案中，至少一个所述一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在SEQ ID NO：12的E24处。在某些实施方案中，至少一个所述一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在SEQID NO：12的E30处。在某些实施方案中，至少一个所述一个或多个额外的Mmod部分的连接发生在SEQ ID NO：12的L34处。
在某些实施方案中，Mmod为式(A-1)。
Figure BDA0004113465820000381
其中
FG是一种连接。
SP是一种间隔基部分；以及
POL是一种聚合物。
在某些实施方案中，式(A-1)的-FG-为式(FG-1a)。
Figure BDA0004113465820000382
其中
标有星号的虚线表示与式(I)中标有星号的半胱氨酸的硫的连接，未标的虚线表示连接-SP-。
在某些实施方案中，式(A-1)的-FG-为式(FG-1b)。
Figure BDA0004113465820000383
其中
标有星号的虚线表示与式(I)中标有星号的半胱氨酸的硫的连接，
未标记的虚线表示连接到-SP-；和
a1选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。
在某些实施方案中，式(FG-1b)的a1为1至8的整数。在某些实施方案中，式(FG-1b)的a1为1至6的整数。在某些实施方案中，式(FG-1b)的a1是1至4的整数。在某些实施方案中，式(FG-1b)的a1是1。在某些实施方案中，式(FG-1b)的a1是2。在某些实施方案中，式(FG-1b)的al是3。在某些实施方案中，式(FG-1b)的a1是4。在某些实施方案中，式(FG-1b)的a1是5。在某些实施方案中，式(FG-1b)的a1是6。
在某些实施方案中，式(A-1)的-FG-为式(FG-lc)。
Figure BDA0004113465820000391
其中
标有星号的虚线表示与式(I)中标有星号的半胱氨酸的硫的连接，
未标记的虚线表示连接到-SP-；以及
a2是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。
在某些实施方案中，式(FG-1c)的a2为1至8的整数。在某些实施方案中，式(FG-1c)的a2是1至6的整数。在某些实施方案中，式(FG-1c)的a2是1至4的整数。在某些实施方案中，式(FG-1c)的a2是1。在某些实施方案中，式(FG-1c)的a2是2。在某些实施方案中，式(FG-1c)的a2是3。在某些实施方案中，式(FG-1c)的a2是4。在某些实施方案中，式(FG-1c)的a2是5。在某些实施方案中，式(FG-lc)的a2是6。
在某些实施方案中，Mmod通过所述半胱氨酸的硫醇与马来酰亚胺官能团的反应，与式(I)中标有星号的半胱氨酸残基缀合，导致按照结构FG-1a的连接。所产生的硫代琥珀酰亚胺环可能会发生逆向迈克尔反应，这可能会导致释放Mmod。这种反应可以通过将包含这种硫代琥珀酰亚胺或其衍生物的化合物(如溴化硫代琥珀酰亚胺)置于导致水解的条件下使五元环打开，从而最小化或避免。由此产生的线性硫醚明显更稳定，这降低了Mmod的释放风险。虽然硫代琥珀酰亚胺的水解在酸性pH值下发生得很慢，但在中性或碱性pH值和温度升高时，水解速度明显加快。人们发现，在升高的pH值和升高的温度下孵育数小时，会产生如式(FG-1d)和(FG-1e)所示的连接，从而导致Mmod与式(I)中标有星号的半胱氨酸残基的稳定连接。
在某些实施方案中，包含Mmod部分的缀合物在升高的pH值(如pH9)和升高的温度(如25℃)培养数小时，如至少10小时或至少12小时。
因此，在某些实施方案中，式(A-1)的-FG-为式(FG-1d)。
Figure BDA0004113465820000401
其中，标有星号的虚线表示与式(I)中标有星号的半胱氨酸的硫的连接，未标记的虚线表示连接到-SP-。
因此，在某些实施方案中，式(A-1)的-FG-为式(FG-1e)。
Figure BDA0004113465820000402
其中，标有星号的虚线表示与式(I)中标有星号的半胱氨酸的硫的连接，未标记的虚线表示连接到-SP-。
在某些实施方案中，式(A-1)的-SP-选自包括C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基的组。其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或多个相同或不同的R9取代，并且其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或多个选自以下的基团中断：-T-、C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(R10)-、-S(O)2N(R10)-、-S(O)N(R10)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(R10)S(O)2N(R10a)-、-S-、-N(R10)-、OC(OR10)(R10a)、-N(R10)C(O)N(R10a)-和OC(O)N(R10)。
每个T独立地选自由以下组成的组：苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢萘基、C3-10环烷基、3-10元杂环基、8-11元杂二环基、8-30元碳多环基和8-30元杂多环基；其中每个T独立地任选被一个或多个相同或不同的R9取代。
每个R9独立地选自包括卤素、-CN、氧代(＝O)、-COOR11、-OR11、-C(O)R11、-C(O)N(R11R11a)、-S(O)2N(R11R11a)、-S(O)N(R11R11a)、-S(O)2R11、-S(O)R11、-N(R11)S(O)2N(R11aR11b)、-SR11、-N(R11R11a)、-NO2、-OC(O)R11、-N(R11)C(O)R11a、-N(R11)S(O)2R11a、-N(R11)S(O)R11a、-N(R11)C(O)OR11a、-N(R11)C(O)N(R11aR11b)、-OC(O)N(R11R11a)和C1-6烷基；其中C1-6烷基可任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；和
每个-R10、-R10a、-R11、-R11a和-R11b独立地选自由-H和C1-6烷基组成的组，其中C1-6烷基可任选被一个或多个相同或不同的卤素取代。
在某些实施方案中，式(A-1)的-SP-是C1-20烷基，该C1-20烷基任选被一个或多个R9取代，且该C1-20烷基任选被一个或多个选自以下的基团中断：-O-、-C(O)N(R10)-、-S(O)2-、-S(O)-、-S-、-N(R10)-、-OC(OR10)(R10a)、-N(R10)C(O)N(R10a)-和-OC(O)N(R10)；其中每个-R9选自C1-6烷基组成的组；每个R10和R10a独立选自-H和C1-6烷基组成的组。
在某些实施方案中，式(A-1)的-SP-是C1-10烷基，该C1-10烷基任选被一个或多个-R9取代，且该C1-10烷基任选被一个或多个选自一下的基团中断：-O-、-C(O)N(R10)-、-S(O)2-、-S(O)-、-S-、-N(R10)-、-OC(OR10)(R10a)、-N(R10)C(O)N(R10a)-和-OC(O)N(R10)；其中每个-R9选自C1-6烷基组成的组；每个R10和R10a独立选自-H和C1-6烷基组成的组。
在某些实施方案中，式(A-1)的-POL是一种PEG基聚合物。在某些实施方案中，-POL是式(A-1i)
Figure BDA0004113465820000411
其中
虚线表示连接在-SP-上。
m是0或1。
p是从12到22700的整数；以及
q选自1、2、3、4、5和6组成的组。
在某些实施方案中，式(A-1i)的m是0。在某些实施方案中，式(A-1i)的m是1。
在某些实施方案中，式(A-1i)的p是23至227000的整数，例如45至11300，或69至4540，或114至2700。在某些实施方案中，式(A-1i)的p约为12。在某些实施方案中，式(A-1i)的p约为23。在某些实施方案中，式(A-1i)的p约为46。在某些实施方案中，式(A-1i)的p约为68。在某些实施方案中，式(A-1i)的p约为90。在某些实施方案中，式(A-1i)的p约为112。在某些实施方案中，式(A-1i)的p约为170。在某些实施方案中，式(A-1i)的p约为227。在某些实施方案中，式(A-1i)的p约为340。在某些实施方案中，式(A-1i)的p约为450。在某些实施方案中，式(A-1i)的p约为680。在某些实施方案中，式(A-1i)的p约为900。在某些实施方案中，式(A-1i)的p约为1130。在某些实施方案中，式(A-1i)的p约为1350。在某些实施方案中，式(A-1i)的p约为1590。在某些实施方案中，式(A-1i)的p约为1800。在某些实施方案中，式(A-1i)的p约为2045。在某些实施方案中，式(A-1i)的p约为2275。
在某些实施方案中，式(A-1i)的q是1。在某些实施方案中，式(A-1i)的q是2。在某些实施方案中，式(A-1i)的q是3。在某些实施方案中，式(A-1i)的q是4。在某些实施方案中，式(A-1i)的q是5。在某些实施方案中，式(A-1i)的q是6。
在某些实施方案中，式(A-1)的-POL为式(A-1ii)
Figure BDA0004113465820000421
其中
虚线表示连接在-SP-上。
FG是一个官能团。
m是0或1。
p是从12到22700的整数；以及
q选自1、2、3、4、5和6组成的组。
如果式(A-1)的Mmod部分要与其它部分缀合，例如与一个或多个部分-L1-L2-Z缀合，如果部分-POL以一个官能团结尾则是有利的。可以理解，如果-POL是式(A-1ii)，该化合物是一种试剂，并且在这种一个或多个部分，例如一个或多个部分-L1-L2-Z与所述试剂的官能团缀合后，FG不再存在，而是已经与一个或多个其他部分的试剂形式中存在的合适官能团形成连接。
还可以理解，也可以为要与Mmod缀合的部分的其他连接点(如分子-L1-L2-Z)提供可能。
在某些实施方案中，式(A-1ii)的m为0。在某些实施方案中，式(A-1ii)的m为1。
在某些实施方案中，式(A-1ii)的p是23至227000的整数，例如45至11300，或69至4540，或114至2700。在某些实施方案中，式(A-1ii)的p约为12。在某些实施方案中，式(A-lii)的p约为23。在某些实施方案中，式(A-1ii)的p约为46。在某些实施方案中，式(A-1ii)的p约为68。在某些实施方案中，式(A-1ii)的p约为90。在某些实施方案中，式(A-1ii)的p约为112。在某些实施方案中，式(A-1ii)的p约为170。在某些实施方案中，式(A-1ii)的p约为227。在某些实施方案中，式(A-1ii)的p约为340。在某些实施方案中，式(A-lii)的p约为450。在某些实施方案中，式(A-1ii)的p约为680。在某些实施方案中，式(A-1ii)的p约为900。在某些实施方案中，式(A-1ii)的p约为1130。在某些实施方案中，式(A-1ii)的p约为1350。在某些实施方案中，式(A-1ii)的p约为1590。在某些实施方案中，式(A-1ii)的p约为1800。在某些实施方案中，式(A-1ii)的p约为2045。在某些实施方案中，式(A-1ii)的p约为2275。
在某些实施方案中，式(A-1ii)的q是1，在某些实施方案中，式(A-1ii)的q是2。在某些实施方案中，式(A-1ii)的q是3。在某些实施方案中，式(A-1ii)的q是4。在某些实施方案中，式(A-1ii)的q是5。在某些实施方案中，式(A-1ii)的q是6。
如果其它部分，例如部分-L1-L2-Z通过式(A-1)的部分-POL与Mmod缀合，部分-POL可以是式(A-1iii)、(A-1iv)、(A-1v)或(A-1vi)。
Figure BDA0004113465820000431
其中
标有星号的虚线表示与其它部分连接，例如连接到部分-L1-L2-Z；
未标记的虚线表示连接到-SP-；以及
m、p和q用作式(A-1i)中所定义。
在某些实施方案中，其它部分(例如部分-L1-L2-Z)通过式(A-1)的部分-POL与Mmod缀合，产生式(A-1iii)的部分-POL。在某些实施方案中，其它部分(例如部分-L1-L2-Z)通过式(A-1)的部分-POL与Mmod缀合，产生式(A-liv)的部分-POL。在某些实施方案中，其它部分(例如部分-L1-L2-Z)通过式(A-1)的部分-POL与Mmod缀合，产生式(A-1v)的部分-POL。在某些实施方案中，其它部分(例如部分-L1-L2-Z)通过式(A-1)的部分-POL与Mmod缀合，产生式(A-1vi)的部分-POL。
在某些实施方案中，式(A-1)的-POL是一种基于透明质酸的聚合物。
在某些实施方案中，Mmod为式(A-1a)。
Figure BDA0004113465820000432
其中
标有星号的虚线表示与式(I)中标有星号的半胱氨酸的硫的连接，
b1是选自下组的整数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20，
b2是选自下组的整数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20；以及
b3是12到22700的整数。
在某些实施方案中，式(A-1a)的b1为1至8的整数。在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是1至6的整数。在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是1至4的整数。在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是1。在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是2。在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是3。在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是4。在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是5。在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是6。
在某些实施方案中，式(A-1a)的b2为1至8的整数。在某些实施方案中，式(A-1a)的b2是1至6的整数。在某些实施方案中，式(A-1a)的b2是1至4的整数。在某些实施方案中，式(A-1a)的b2是1。在某些实施方案中，式(A-1a)的b2是2。在某些实施方案中，式(A-1a)的b2是3。在某些实施方案中，式(A-1a)的b2是4。在某些实施方案中，式(A-1a)的b2是5。在某些实施方案中，式(A-1a)的b2是6。
在某些实施方案中，式(A-1a)的b3是23至227000的整数，例如45至11300，或69至4540，或114至2700。在某些实施方案中，式(A-1a)的b3约为12。在某些实施方案中，式(A-1a)的b3约为23。在某些实施方案中，式(A-1a)的b3约为46。在某些实施方案中，式(A-1a)的b3约为68。在某些实施方案中，式(A-1a)的b3约为90。在某些实施方案中，式(A-1a)的b3约为112。在某些实施方案中，式(A-1a)的b3约为170。在某些实施方案中，式(A-1a)的b3约为227。在某些实施方案中，式(A-1a)的b3约为340。在某些实施方案中，式(A-1a)的b3约为450。在某些实施方案中，式(A-1a)的b3是约680。在某些实施方案中，式(A-1a)的b3约为900。在某些实施方案中，式(A-1a)的b3约为1130。在某些实施方案中，式(A-1a)的b3约为1350。在某些实施方案中，式(A-1a)的b3约为1590。在某些实施方案中，式(A-1a)的b3约为1800。在某些实施方案中，式(A-1a)的b3约为2045。在某些实施方案中，式(A-1a)的b3约为2275。
在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是3且式(A-1a)的b3约为12。在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是3，而式(A-1a)的b3约为23。在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是3且式(A-1a)的b3约为46。在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是3，而式(A-1a)的b3约为68。在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是3且式(A-1a)的b3约为90。在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是3且式(A-1a)的b3约为112。在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是3且式(A-1a)的b3是约170。在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是3且式(A-1a)的b3约为227。在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是3且式(A-1a)的b3约为340。在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是3，而式(A-1a)的b3约为450。
在某些实施方案中，式(A-1a)的b1为2，式(A-1a)的b2为2且式(A-1a)的b3约为12。在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是2且式(A-1a)的b3约为23。在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是2且式(A-1a)的b3约为46。在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是2且式(A-1a)的b3约为68。在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是2且式(A-1a)的b3约为90。在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是2且式(A-1a)的b3约为112。在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是2且式(A-1a)的b3约为170。在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是2且式(A-1a)的b3约为227。在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是2且式(A-1a)的b3约为340。在某些实施方案中，式(A-1a)的b1是2，式(A-1a)的b2是2且式(A-1a)的b3约为450。
在某些实施方案中，Mmod为式(A-1b)。
Figure BDA0004113465820000451
其中
标有星号的虚线表示与式(I)中标有星号的半胱氨酸的硫的连接，
c1是选自下组的整数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20，
c2是选自下组的整数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20；以及
c3是12到22700的整数。
在某些实施方案中，式(A-1b)的c1为1至8的整数。在某些实施方案中，式(A-1b)的c1是1至6的整数。在某些实施方案中，式(A-1b)的c1是1至4的整数。在某些实施方案中，式(A-1b)的c1是1。在某些实施方案中，式(A-1b)的c1是2。在某些实施方案中，式(A-1b)的c1是3。在某些实施方案中，式(A-1b)的c1是4。在某些实施方案中，式(A-1b)的c1是5。在某些实施方案中，式(A-1b)的c1是6。
在某些实施方案中，式(A-1b)的c2为1至8的整数。在某些实施方案中，式(A-1b)的c2是1至6的整数。在某些实施方案中，式(A-1b)的c2是1至4的整数。在某些实施方案中，式(A-1b)的c2是1。在某些实施方案中，式(A-1b)的c2是2。在某些实施方案中，式(A-1b)的c2是3。在某些实施方案中，式(A-1b)的c2是4。在某些实施方案中，式(A-1b)的c2是5。在某些实施方案中，式(A-1b)的c2是6。
在某些实施方案中，式(A-1b)的c3是23至227000的整数，例如45至11300，或69至4540，或114至2700。在某些实施方案中，式(A-1b)的c3约为12。在某些实施方案中，式(A-1b)的c3约为23。在某些实施方案中，式(A-1b)的c3约为46。在某些实施方案中，式(A-1b)的c3约为68。在某些实施方案中，式(A-1b)的c3约为90。在某些实施方案中，式(A-1b)的c3约为112。在某些实施方案中，式(A-1b)的c3约为170。在某些实施方案中，式(A-1b)的c3约为227。在某些实施方案中，式(A-1b)的c3约为340。在某些实施方案中，式(A-1b)的c3约为450。在某些实施方案中，式(A-1b)的c3约为680。在某些实施方案中，式(A-1b)的c3约为900。在某些实施方案中，式(A-1b)的c3约为1130。在某些实施方案中，式(A-1b)的c3约为1350。在某些实施方案中，式(A-1b)的c3约为1590。在某些实施方案中，式(A-1b)的c3约为1800。在某些实施方案中，式(A-1b)的c3约为2045。在某些实施方案中，式(A-1b)的c3约为2275。
在某些实施方案中，式(A-1b)的c1为2，式(A-1b)的c2为3且式(A-1b)的c3约为12。在某些实施方案中，式(A-1b)的c1为2，式(A-1b)的c2为3，式(A-1b)的c3约为23。在某些实施方案中，式(A-1b)的c1为2，式(A-1b)的c2为3且式(A-1b)的c3约为46。在某些实施方案中，式(A-1b)的c1为2，式(A-1b)的c2为3且式(A-1b)的c3约为68。在某些实施方案中，式(A-1b)的c1为2，式(A-1b)的c2为3且式(A-1b)的c3约为90。在某些实施方案中，式(A-1b)的cl为2，式(A-1b)的c2为3且式(A-1b)的c3约为112。在某些实施方案中，式(A-1b)的c1为2，式(A-1b)的c2为3，式(A-1b)的c3约为170。在某些实施方案中，式(A-1b)的c1为2，式(A-1b)的c2为3且式(A-1b)的c3约为227。在某些实施方案中，式(A-1b)的c1为2，式(A-1b)的c2为3且式(A-1b)的c3约为340。在某些实施方案中，式(A-1b)的c1为2，式(A-1b)的c2为3且式(A-1b)的c3约为450。
在某些实施方案中，式(A-1b)的b1为2，式(A-1b)的b2为2且式(A-1b)的b3约为12。在某些实施方案中，式(A-1b)的b1是2，式(A-1b)的b2是2和式(A-1b)的b3约为23。在某些实施方案中，式(A-1b)的b1是2，式(A-1b)的b2是2和式(A-1b)的b3约为46。在某些实施方案中，式(A-1b)的b1是2，式(A-1b)的b2是2且式(A-1b)的b3约为68。在某些实施方案中，式(A-1b)的b1是2，式(A-1b)的b2是2和式(A-1b)的b3约为90。在某些实施方案中，式(A-1b)的b1是2，式(A-1b)的b2是2且式(A-1b)的b3约为112。在某些实施方案中，式(A-1b)的b1是2，式(A-1b)的b2是2且式(A-1b)的b3约为170。在某些实施方案中，式(A-1b)的b1是2，式(A-1b)的b2是2且式(A-1b)的b3约为227。在某些实施方案中，式(A-1b)的b1是2，式(A-1b)的b2是2且式(A-1b)的b3约为340。在某些实施方案中，式(A-1b)的b1是2，式(A-1b)的b2是2且式(A-1b)的b3约为450。
在某些实施方案中，Mmod为式(A-1c)。
Figure BDA0004113465820000471
其中
标有星号的虚线表示与式(I)中标有星号的半胱氨酸的硫的连接，
d1是选自下组的整数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20，
d2是一个整数，选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18。19和20；以及
d3是12到22700的整数。
在某些实施方案中，式(A-1c)的d1为1至8的整数。在某些实施方案中，式(A-1c)的d1是1至6的整数。在某些实施方案中，式(A-lc)的d1是l至4的整数。在某些实施方案中，式(A-1c)的d1是1。在某些实施方案中，式(A-lc)的d1是2。在某些实施方案中，式(A-1c)的d1是3。在某些实施方案中，式(A-1c)的d1是4。在某些实施方案中，式(A-1c)的d1是5。在某些实施方案中，式(A-1c)的d1是6。
在某些实施方案中，式(A-1c)的d2为1至8的整数。在某些实施方案中，式(A-1c)的d2是1至6的整数。在某些实施方案中，式(A-1c)的d2是1至4的整数。在某些实施方案中，式(A-1c)的d2是1。在某些实施方案中，式(A-1c)的d2是2。在某些实施方案中，式(A-1c)的d2是3。在某些实施方案中，式(A-1c)的d2是4。在某些实施方案中，式(A-1c)的d2是5。在某些实施方案中，式(A-1c)的d2是6。
在某些实施方案中，式(A-1c)的d3是23至227000的整数，例如45至11300，或69至4540，114至2700或160至900。在某些实施方案中，式(A-1c)的d3约为12。在某些实施方案中，式(A-1c)的d3约为23。在某些实施方案中，式(A-1c)的d3约为46。在某些实施方案中，式(A-1c)的d3约为68。在某些实施方案中，式(A-1c)的d3约为90。在某些实施方案中，式(A-1c)的d3约为112。在某些实施方案中，式(A-1c)的d3约为170。在某些实施方案中，式(A-1c)的d3约为227。在某些实施方案中，式(A-1c)的d3约为340。在某些实施方案中，式(A-1c)的d3约为450。在某些实施方案中，式(A-1c)的d3约为680。在某些实施方案中，式(A-1c)的d3约为900。在某些实施方案中，式(A-1c)的d3约为1130。在某些实施方案中，式(A-1c)的d3约为1350。在某些实施方案中，式(A-1c)的d3约为1590。在某些实施方案中，式(A-1c)的d3约为1800。在某些实施方案中，式(A-1c)的d3约为2045。在某些实施方案中，式(A-1c)的d3约为2275。
在某些实施方案中，式(A-1c)的d1为2，式(A-1c)的d2为3且式(A-1cd)的d3约为12。在某些实施方案中，式(A-1c)的d1为2，式(A-1c)的d2为3且式(A-1c)的d3约为23。在某些实施方案中，式(A-1c)的d1为2，式(A-1c)的d2为3且式(A-1c)的d3约为46。在某些实施方案中，式(A-1c)的d1为2，式(A-1c)的d2为3且式(A-1c)的d3约为68。在某些实施方案中，式(A-1c)的d1为2，式(A-1c)的d2为3且式(A-1c)的d3约为90。在某些实施方案中，式(A-1c)的d1为2，式(A-1c)的d2为3且式(A-1c)的d3约为112。在某些实施方案中，式(A-1c)的d1为2，式(A-1c)的d2为3且式(A-1c)的d3约为170。在某些实施方案中，式(A-1c)的d1为2，式(A-1c)的d2为3且式(A-1c)的d3约为227。在某些实施方案中，式(A-1c)的d1为2，式(A-1c)的d2为3且式(A-1c)的d3约为340。在某些实施方案中，式(A-1c)的d1为2，式(A-1c)的d2为3且式(A-1c)的d3约为450。
在某些实施方案中，式(A-1c)的b1为2，式(A-1c)的b2为2且式(A-1c)的b3约为12。在某些实施方案中，式(A-1c)的b1为2，式(A-1c)的b2为2且式(A-1c)的b3约为23。在某些实施方案中，式(A-1c)的b1是2，式(A-1c)的b2是2且式(A-1c)的b3约为46。在某些实施方案中，式(A-1c)的b1是2，式(A-1c)的b2是2且式(A-1c)的b3约为68。在某些实施方案中，式(A-1c)的b1是2，式(A-1c)的b2是2且式(A-1c)的b3约为90。在某些实施方案中，式(A-1c)的b1为2，式(A-1c)的b2为2且式(A-1c)的b3约为112。在某些实施方案中，式(A-1c)的b1是2，式(A-1c)的b2是2且式(A-1c)的b3约为170。在某些实施方案中，式(A-1c)的b1是2，式(A-1c)的b2是2且式(A-1c)的b3约为227。在某些实施方案中，式(A-1c)的b1为2，式(A-1c)的b2为2且式(A-1c)的b3约为340。在某些实施方案中，式(A-1c)的b1是2，式(A-1c)的b2是2且式(A-1c)的b3约为450。
在某些实施方案中，Mmod为式(A-1d)。
Figure BDA0004113465820000491
其中
标有星号的虚线表示与式(I)中标有星号的半胱氨酸的硫的连接，
b1是选自下组的整数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20，
b2是选自下组的整数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20；以及
b3是从12到22700的整数。
在某些实施方案中，式(A-1d)的b1为1至8的整数。在某些实施方案中，式(A-1d)的b1是1至6的整数。在某些实施方案中，式(A-1d)的b1是1至4的整数。在某些实施方案中，式(A-1d)的b1是1。在某些实施方案中，式(A-1d)的b1是2。在某些实施方案中，式(A-1d)的b1是3。在某些实施方案中，式(A-1d)的b1是4。在某些实施方案中，式(A-1d)的b1是5。在某些实施方案中，式(A-1d)的b1是6。
在某些实施方案中，式(A-1d)的b2为1至8的整数。在某些实施方案中，式(A-1d)的b2是1至6的整数。在某些实施方案中，式(A-1d)的b2是1至4的整数。在某些实施方案中，式(A-1d)的b2是1。在某些实施方案中，式(A-1d)的b2是2。在某些实施方案中，式(A-1d)的b2是3。在某些实施方案中，式(A-1d)的b2是4。在某些实施方案中，式(A-1d)的b2是5。在某些实施方案中，式(A-1d)的b2是6。
在某些实施方案中，式(A-1d)的b3是23至227000的整数，例如45至11300，或69至4540，或114至2700。在某些实施方案中，式(A-1d)的b3约为12。在某些实施方案中，式(A-1d)的b3约为23。在某些实施方案中，式(A-1d)的b3约为46。在某些实施方案中，式(A-1d)的b3约为68。在某些实施方案中，式(A-1d)的b3约为90。在某些实施方案中，式(A-1d)的b3约为112。在某些实施方案中，式(A-1d)的b3约为170。在某些实施方案中，式(A-1d)的b3约为227。在某些实施方案中，式(A-1d)的b3约为340。在某些实施方案中，式(A-1d)的b3约为450。在某些实施方案中，式(A-1d)的b3约为680。在某些实施方案中，式(A-1d)的b3约为900。在某些实施方案中，式(A-1d)的b3约为1130。在某些实施方案中，式(A-1d)的b3约为1350。在某些实施方案中，式(A-1d)的b3约为1590。在某些实施方案中，式(A-1d)的b3约为1800。在某些实施方案中，式(A-1d)的b3约为2045。在某些实施方案中，式(A-1d)的b3约为2275。
在某些实施方案中，式(A-1d)的b1为2，式(A-1d)的b2为3且式(A-1d)的b3约为12。在某些实施方案中，式(A-1d)的b1为2，式(A-1d)的b2为3且式(A-1d)的b3约为23。在某些实施方案中，式(A-1d)的b1为2，式(A-1d)的b2为3且式(A-1d)的b3约为46。在某些实施方案中，式(A-1d)的b1是2，式(A-1d)的b2是3且式(A-1d)的b3约为68。在某些实施方案中，式(A-1d)的b1为2，式(A-1d)的b2为3且式(A-1d)的b3约为90。在某些实施方案中，式(A-1d)的b1为2，式(A-1d)的b2为3且式(A-1d)的b3约为112。在某些实施方案中，式(A-1d)的b1为2，式(A-1d)的b2为3且式(A-1d)的b3约为170。在某些实施方案中，式(A-1d)的b1为2，式(A-1d)的b2为3且式(A-1d)的b3约为227。在某些实施方案中，式(A-1d)的b1为2，式(A-1d)的b2为3且式(A-1d)的b3约为340。在某些实施方案中，式(A-1d)的b1是2，式(A-1d)的b2是3且式(A-1d)的b3约为450。
在某些实施方案中，式(A-1d)的b1为2，式(A-1d)的b2为2且式(A-1d)的b3约为12。在某些实施方案中，式(A-1d)的b1是2，式(A-1d)的b2是2且式(A-1d)的b3约为23。在某些实施方案中，式(A-1d)的b1是2，式(A-1d)的b2是2且式(A-1d)的b3约为46。在某些实施方案中，式(A-1d)的b1是2，式(A-1d)的b2是2且式(A-1d)的b3约为68。在某些实施方案中，式(A-1d)的b1是2，式(A-1d)的b2是2且式(A-1d)的b3约为90。在某些实施方案中，式(A-1d)的b1是2，式(A-1d)的b2是2且式(A-1d)的b3约为112。在某些实施方案中，式(A-1d)的b1是2，式(A-1d)的b2是2且式(A-1d)的b3约为170。在某些实施方案中，式(A-1d)的b1是2，式(A-1d)的b2是2且式(A-1d)的b3约为227。在某些实施方案中，式(A-1d)的b1是2，式(A-1d)的b2是2且式(A-1d)的b3约为340。在某些实施方案中，式(A-1d)的b1是2，式(A-1d)的b2是2且式(A-1d)的b3约为450。
在某些实施方案中，Mmod为式(A-1e)。
Figure BDA0004113465820000501
其中
标有星号的虚线表示与式(I)中标有星号的半胱氨酸的硫的连接，
b1是选自下组的整数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20，
b2是选自下组的整数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20；以及
b3是从12到22700的整数。
在某些实施方案中，式(A-1e)的b1为1至8的整数。在某些实施方案中，式(A-1e)的b1是1至6的整数。在某些实施方案中，式(A-1e)的b1是1至4的整数。在某些实施方案中，式(A-1e)的b1是1。在某些实施方案中，式(A-1e)的b1是2。在某些实施方案中，式(A-1e)的b1是3。在某些实施方案中，式(A-1e)的b1是4。在某些实施方案中，式(A-1e)的b1是5。在某些实施方案中，式(A-1e)的b1是6。
在某些实施方案中，式(A-1e)的b2为1至8的整数。在某些实施方案中，式(A-1e)的b2是1至6的整数。在某些实施方案中，式(A-1e)的b2是1至4的整数。在某些实施方案中，式(A-1e)的b2是1。在某些实施方案中，式(A-1e)的b2是2。在某些实施方案中，式(A-1e)的b2是3。在某些实施方案中，式(A-1e)的b2是4。在某些实施方案中，式(A-1e)的b2是5。在某些实施方案中，式(A-1e)的b2是6。
在某些实施方案中，式(A-1e)的b3是23至227000的整数，例如45至11300，或69至4540，或114至2700。在某些实施方案中，式(A-1e)的b3约为12。在某些实施方案中，式(A-1e)的b3约为23。在某些实施方案中，式(A-1e)的b3约为46。在某些实施方案中，式(A-1e)的b3约为68。在某些实施方案中，式(A-1e)的b3约为90。在某些实施方案中，式(A-1e)的b3约为112。在某些实施方案中，式(A-1e)的b3约为170。在某些实施方案中，式(A-1e)的b3约为227。在某些实施方案中，式(A-1e)的b3约为340。在某些实施方案中，式(A-1e)的b3约为450。在某些实施方案中，式(A-1e)的b3约为680。在某些实施方案中，式(A-1e)的b3约为900。在某些实施方案中，式(A-1e)的b3约为1130。在某些实施方案中，式(A-1e)的b3约为1350。在某些实施方案中，式(A-1e)的b3约为1590。在某些实施方案中，式(A-1e)的b3约为1800。在某些实施方案中，式(A-1e)的b3约为2045。在某些实施方案中，式(A-1e)的b3约为2275。
在某些实施方案中，式(A-1e)的b1为2，式(A-1e)的b2为3且式(A-1e)的b3约为12。在某些实施方案中，式(A-1e)的b1为2，式(A-1e)的b2为3且式(A-1e)的b3约为23。在某些实施方案中，式(A-1e)的b1为2，式(A-1e)的b2为3且式(A-1e)的b3约为46。在某些实施方案中，式(A-1e)的b1为2，式(A-1e)的b2为3且式(A-1e)的b3约为68。在某些实施方案中，式(A-1e)的b1为2，式(A-1e)的b2为3且式(A-1e)的b3约为90。在某些实施方案中，式(A-1e)的b1为2，式(A-1e)的b2为3且式(A-1e)的b3约为112。在某些实施方案中，式(A-1e)的b1为2，式(A-1e)的b2为3且式(A-1e)的b3约为170。在某些实施方案中，式(A-1e)的b1为2，式(A-1e)的b2为3且式(A-1e)的b3约为227。在某些实施方案中，式(A-1e)的b1为2，式(A-1e)的b2为3且式(A-1e)的b3约为340。在某些实施方案中，式(A-1e)的b1为2，式(A-1e)的b2为3且式(A-1e)的b3约为450。
在某些实施方案中，式(A-1e)的b1为2，式(A-1e)的b2为2且式(A-1e)的b3约为12。在某些实施方案中，式(A-1e)的b1为2，式(A-1e)的b2为2且式(A-1e)的b3约为23。在某些实施方案中，式(A-1e)的b1是2，式(A-1e)的b2是2且式(A-1e)的b3约为46。在某些实施方案中，式(A-1e)的b1是2，式(A-1e)的b2是2且式(A-1e)的b3约为68。在某些实施方案中，式(A-1e)的b1是2，式(A-1e)的b2是2且式(A-1e)的b3约为90。在某些实施方案中，式(A-1e)的b1为2，式(A-1e)的b2为2且式(A-1e)的b3约为112。在某些实施方案中，式(A-1e)的b1是2，式(A-1e)的b2是2且式(A-1e)的b3约为170。在某些实施方案中，式(A-1e)的b1是2，式(A-1e)的b2是2且式(A-1e)的b3约为227。在某些实施方案中，式(A-1e)的b1是2，式(A-1e)的b2是2且式(A-1e)的b3约为340。在某些实施方案中，式(A-1e)的b1是2，式(A-1e)的b2是2且式(A-1e)的b3约为450。
在多个IL-2缀合物中，Mmod部分是以包括式(A-1d)和(A-1e)的部分的混合物形式存在。这意味着一定比例的IL-2缀合物与式(A-1d)的Mmod部分缀合，且一定比例的IL-2缀合物与式(A-1e)的Mmod部分缀合。任选地，一定比例的IL-2缀合物与式(A-1a)的Mmod部分缀合。可以理解，在所述IL-2缀合物中，没有发生硫代琥珀酰亚胺环的水解。所述多种IL-2缀合物可以存在于例如包含该IL-2缀合物的药物组合物中。
在多个IL-2缀合物中，Mmod部分在某些实施方案中以混合物的形式存在，其中至少70％的Mmod部分为式(A-1d)和(A-1e)。在多个IL-2缀合物中，Mmod部分在某些实施方案中以混合物形式存在，其中至少80％的Mmod部分是式(A-1d)和(A-1e)。在多个IL-2缀合物中，Mmod部分在某些实施方案中以混合物的形式存在，其中至少90％的Mmod部分为式(A-1d)和(A-1e)。
在多个IL-2缀合物中，Mmod部分以包括式(A1-a)、(A-1d)和(A-1e)的部分的混合物存在。在多个IL-2缀合物中，Mmod部分以包括式(A1-a)、(A-1d)和(A-1e)的部分的混合物形式存在，其中至少70％的Mmod为式(A-1d)和(A-1e)。在多个IL-2缀合物中，Mmod部分以包含式(A1-a)、(A-1d)和(A-1e)的部分的混合物形式存在，其中至少80％的Mmod为式(A-1d)和(A-1e)。在多个IL-2缀合物中，Mmod部分以包括式(A1-a)、(A-1d)和(A-1e)的部分的混合物形式存在，其中至少90％的Mmod是式(A-1d)和(A-1e)。
式(Ia)或(Ib)的IL-2缀合物包括至少一个共价和可逆连接的聚合物部分和/或取代的脂肪酸部分-Z。
添加这种至少一个共价和可逆连接的聚合物部分和/或取代的脂肪酸部分，可使式(I)的IL-2部分的循环半衰期延长，超过任选存在的Mmod部分且其可逆连接可确保足够的药物活性。
在一个实施方案中，IL-2缀合物为式(Ia)，包括一个部分-Z，它是一种取代的脂肪酸或聚合物部分。在一个实施方案中，-Z是一种取代的脂肪酸。在另一个实施方案中，Z是一种聚合物部分。
在另一个实施方案中，IL-2缀合物为式(Ib)，包括两个部分-Z，它们可以是相同或不同的。在一个实施方案中，两个部分-Z都是取代的脂肪酸，可以是相同的或不同的。在另一个实施方案中，两个部分-Z都是聚合物部分，可以是相同的或不同的。在另一个实施方案中，一个部分-Z是取代的脂肪酸，另一个部分-Z是聚合物部分。
在另一个实施方案中，IL-2缀合物为式(Ib)，包括三个部分-Z，它们可以是相同或不同的。在一个实施方案中，所有三个部分-Z都是取代的脂肪酸，它们可以是相同的或不同的。在另一个实施方案中，所有三个部分-Z都是聚合物部分，可以是相同的或不同的。在另一个实施方案中，一个或两个部分-Z是取代的脂肪酸，其余部分-Z是聚合物部分。
在另一个实施方案中，IL-2缀合物为式(Ib)，包括四个部分-Z，它们可以是相同或不同的。在一个实施方案中，所有四个部分-Z都是取代的脂肪酸，可以是相同的或不同的。在另一个实施方案中，所有四个部分-Z都是聚合物部分，可以是相同的或不同的。在另一个实施方案中，一个、两个或三个部分-Z是取代的脂肪酸，其余部分-Z是聚合物部分。
如果式(Ia)或(Ib)的-Z是取代的脂肪酸部分，其优选是WO 2005/027978 A2和WO2014/060512 A1中公开的取代的脂肪酸部分，这两个文件在此作为参考。
如果式(Ia)或(Ib)的-Z是聚合物部分，这种聚合物部分在某些实施方案中具有从1kDa到1000kDa的分子量，例如从2kDa到500kDa，从3kDa到200kDa，从5kDa到120kDa，从10kDa到100kDa或从15kDa到80kDa。在一个实施方案中，-Z是一种分子量约为2kDa的聚合物部分。在另一个实施方案中，-Z是一种分子量约为5kDa的聚合物部分。在另一个实施方案中，-Z是一种分子量约为10kDa的聚合物部分。在另一个实施方案中，-Z是一种分子量约为15kDa的聚合物部分。在另一个实施方案中，-Z是一种分子量约为20kDa的聚合物部分。在另一个实施方案中，-Z是一种分子量约为30kDa的聚合物部分。在另一个实施方案中，-Z是一种分子量约为40kDa的聚合物部分。在另一个实施方案中，-Z是一种分子量约为50kDa的聚合物部分。在另一个实施方案中，-Z是一种分子量约为60kDa的聚合物部分。在另一个实施方案中，-Z是一种分子量约为70kDa的聚合物部分。在另一个实施方案中，-Z是一种分子量约为80kDa的聚合物部分。在另一个实施方案中，-Z是一种分子量约为90kDa的聚合物部分。在另一个实施方案中，-Z是一种分子量约为100kDa的聚合物部分。在一个实施方案中，-Z是一种分子量为2kDa的聚合物部分。在另一个实施方案中，-Z是一种分子量为5kDa的聚合物部分。在另一个实施方案中，-Z是分子量为10kDa的聚合物部分。在另一个实施方案中，-Z是一种分子量为15kDa的聚合物部分。在另一个实施方案中，-Z是一种分子量为20kDa的聚合物部分。在另一个实施方案中，-Z是一种分子量为30kDa的聚合物部分。在另一个实施方案中，-Z是一种分子量为40kDa的聚合物部分。在另一个实施方案中，-Z是一种分子量为50kDa的聚合物部分。在另一个实施方案中，-Z是一种分子量为60kDa的聚合物部分。在另一个实施方案中，-Z是一种分子量为70kDa的聚合物部分。在另一个实施方案中，-Z是一种分子量为80kDa的聚合物部分。在另一个实施方案中，-Z是一种分子量为90kDa的聚合物部分。在另一个实施方案中，-Z是一种分子量为100kDa的聚合物部分。
在某些实施方案中，式(Ia)或(Ib)的-Z是一种聚合物部分，包括选自下组的聚合物：2-甲基丙烯酰基-氧乙基磷酰胆碱、聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸酯)、聚(丙烯酰胺)、聚(烷氧基)聚合物、聚(酰胺)、聚(酰胺-胺)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(天冬酰胺)、聚(丁酸)、聚(乙醇酸)、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚己内酯、聚碳酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚二甲基丙烯酰胺、聚酯、聚乙烯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚(磷酸乙酯)、聚(乙基噁唑啉)、聚(乙醇酸)、聚(羟乙基丙烯酸酯)、聚(羟乙基噁唑啉)、聚(羟甲基丙烯酸酯)、聚(羟丙基甲基丙烯酰胺)、聚(羟丙基甲基丙烯酸酯)、聚(羟丙基噁唑啉)、聚(亚氨基碳酸酯)、聚(乳酸)、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚(甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(甲基噁唑啉)、聚(有机磷腈)、聚(原酸酯)、聚(噁唑啉)、聚(丙二醇)、聚(硅氧烷)、聚氨酯、聚(乙烯醇)、聚(乙烯胺)、聚(乙烯基甲基醚)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、硅酮、纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲壳素、壳聚糖、右旋糖苷、糊精、明胶、透明质酸及其衍生物、官能化透明质酸、海藻酸盐、甘露聚糖、果胶、鼠李半乳糖、淀粉、羟烷基淀粉、羟乙基淀粉和其他碳水化合物基聚合物、木聚糖及其共聚物。
在一个实施方案中，式(Ia)或(Ib)的-Z是肽或蛋白部分。优选地，这种肽或蛋白部分不是IL-2部分或其片段。所述肽或蛋白部分-Z可以通过-L1-L2-与D化学缀合，或者可以通过可逆接头部分-L1-与D翻译性融合，在这种情况下，-L1-是肽或蛋白部分，且-L2-优选是化学键。在一个实施方案中，这种肽或蛋白部分-Z通过-L1-L2-与D化学缀合。在另一个实施方案中，这种肽或蛋白部分-Z通过可逆接头部分-L1-与D翻译性融合，在这种情况下，-L1-是肽或蛋白部分，-L2-优选是化学键。可以理解，这种肽或蛋白质的可逆接头部分-L1-是可酶促或非酶促降解的。为了便于酶促降解，-L1-可以包含一个蛋白酶识别位点。
如果式(Ia)或(Ib)的-Z是肽或蛋白质部分，在某些实施方案中，其选自：包括US2012/0035101 A1中所述的绒毛膜促性腺激素的羧基端肽的部分，这些部分在此被纳入参考；白蛋白部分；无规卷曲(random coil)蛋白部分和Fc融合蛋白部分的组。
在某些实施方案中，式(Ia)或(Ib)的-Z包括一个无规卷曲的肽或蛋白质部分。
在某些实施方案中，这种无规卷曲肽或蛋白质部分包括至少25个氨基酸残基和最多2000个氨基酸，如30个氨基酸至1500个氨基酸残基或50至500个氨基酸残基。
在某些实施方案中，式(Ia)或(Ib)的-Z包括无规卷曲蛋白部分，其中形成所述无规卷曲蛋白部分的氨基酸总数的至少80％，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％是选自丙氨酸和脯氨酸。在某些实施方案中，这种无规卷曲蛋白部分的氨基酸残基总数的至少10％，但少于75％，例如少于65％，是脯氨酸残基。在某些实施方案中，所述无规卷曲蛋白部分如WO 2011/144756 A1中所述，该文件在此通过引用全部纳入。在某些实施方案中，-Z包括至少一个选自下组的部分：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：61，如WO2011/144756中公开的。包含这种由丙氨酸和脯氨酸组成的无规卷曲蛋白的部分在此被称为″PA″或″PA部分″。
因此，在一个实施方案中，式(Ia)或(Ib)的-Z包括一个PA部分。
在某些实施方案中，式(Ia)或(Ib)的-Z包括无规卷曲蛋白部分，其中形成所述无规卷曲蛋白部分的氨基酸总数的至少80％，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％是选自丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸。在某些实施方案中，这种无规卷曲蛋白部分的氨基酸残基总数的至少4％，但少于40％是脯氨酸残基。在某些实施方案中，所述无规卷曲蛋白部分如WO 2008/155134 A1所述，该文件在此通过参考而纳入。在某些实施方案中，-Z包括至少一个选自下组的部分：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：46、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：56，如WO 2008/155134A1中所公开。包含这种由丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸组成的无规卷曲蛋白部分的部分在此被称为″PAS″或″PAS部分″。
因此，在一个实施方案中，式(Ia)或(Ib)的-Z包括一个PAS部分。
在某些实施方案中，式(Ia)或(Ib)的Z包括无规卷曲蛋白部分，其中形成所述无规卷曲蛋白部分的氨基酸总数的至少80％，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸和脯氨酸。在某些实施方案中，所述无规卷曲蛋白部分如WO 2010/091122 A1中所述，该文件在此通过参考而纳入。在某些实施方案中，-Z包括至少一个选自下组的部分：SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：184；SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：189、SEQID NO：190、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：200、SEQID NO：201、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：210、SEQ ID NO：211、SEQID NO：212、SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：214、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：216、SEQ ID NO：217、SEQ ID NO：218、SEQ ID NO：219、SEQ ID NO：220、SEQ ID NO：221、SEQ ID NO：759、SEQID NO：760、SEQ ID NO：761、SEQ ID NO：762、SEQ ID NO：763、SEQ ID NO：764、SEQ ID NO：765、SEQ ID NO：766、SEQ ID NO：767、SEQ ID NO：768、SEQ ID NO：769、SEQ ID NO：770、SEQID NO：771、SEQ ID NO：772、SEQ ID NO：773、SEQ ID NO：774、SEQ ID NO：775、SEQ ID NO：776、SEQ ID NO：777、SEQ ID NO：778、SEQ ID NO：779、SEQ ID NO：1715、SEQ ID NO：1716、SEQ ID NO：1718、SEQ ID NO：1719、SEQ ID NO：1720、SEQ ID NO：1721和SEQ ID NO：1722，如WO2010/091122A1中公开的。包含这种由丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸和脯氨酸组成的无规卷曲蛋白部分的部分在此被称为″XTEN″或″XTEN部分″。
因此，在某些实施方案中，式(Ia)或(Ib)的-Z包括一个XTEN部分。
在某些实施方案中，式(Ia)或(Ib)的-Z是一种基于透明质酸的聚合物。
在某些实施方案中，式(Ia)或(Ib)的-Z是PEG基的部分，如线性、支化或多臂PEG的部分。在某些实施方案中，-Z是支化的PEG基部分，例如具有一个、两个、三个、四个、五个或六个分支点的支化PEG基部分。在某些实施方案中，-Z是具有一个、两个或三个分支点的支化PEG基部分。在某些实施方案中，-Z是具有一个分支点的支化PEG基部分。在某些实施方案中，-Z是具有两个分支点的支化PEG基部分。在某些实施方案中，-Z是具有三个分支点的支化PEG基部分。
每个分支点可以独立地选自-N＜、-CH＜和＞C＜组成的组。
在某些实施方案中，式(Ia)或(Ib)的-Z包括一个式(A)的部分
Figure BDA0004113465820000571
其中
-Bp1＜、-Bp2＜、-Bp3＜相互独立地选自-N＜和-C(R8)＜组成的组；
-R8选自-H、C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基组成的组；
-P1、-P2、-P3、-P4相互独立地是包含至少40％的PEG的PEG基链，且其分子量为3至40kDa；
-C1、-C2相互独立地选自下组：C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基。其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基可任选被一个或多个-R9所取代，这些基团相同或不同，并且其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基可任选被一个或多个选自下组的基团中断：-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(R10)-、-S(O)2N(R10)-、-S(O)N(R10)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(R10)S(O)2N(R10a)-、-S-、-N(R10)-、-OC(OR10)(R10a)-、-N(R10)C(O)N(R10a)-和-OC(O)N(R10)；
每个T独立地选自由以下组成的组：苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢萘基、C3-10环烷基、3-10元杂环基、8-11元杂二环基、8-30元碳多环基和8-30元杂多环基；其中每个T独立任选地被一个或多个相同或不同的-R9取代。
每个-R9独立地选自下组：卤素、-CN、氧代(＝O)、COOR11、-OR11、-C(O)R11、-C(O)N(R11R11a)、-S(O)2N(R11R11a)、-S(O)N(R11R11a)、-S(O)2R11、-S(O)R11、-N(R11)S(O)2N(R11aR11b)、-SR11、-N(R11R11a)、-NO2、-OC(O)R11、-N(R11)C(O)R11a、-N(R11)S(O)2R11a、-N(R11)S(O)R11a、-N(R11)C(O)OR11a、-N(R11)C(O)N(R11aR11b)、-OC(O)N(R11R11a)，以及C1-6烷基；其中C1-6烷基可任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；以及
每个-R10、-R10a、R11、R11a和R11b独立地选自由H和C1-6烷基组成的组，其中C1-6烷基可任选被一个或多个相同或不同的卤素取代。
在某些实施方案中，式(A)的-p1、-P2、-P3、-P4相互独立地是包含至少50％的PEG的PEG基链，其分子量范围为3至40kDa。在某些实施方案中，-P1、-P2、-P3、-P4相互独立地是包含至少60％的PEG的PEG基链，其分子量范围为3至40kDa。在某些实施方案中，-P1、-P2、-P3、-P4相互独立地是包含至少70％的PEG的PEG基链，其分子量范围为3至40kDa。在某些实施方案中，-P1、-P2、-P3、-P4相互独立地是包含至少80％的PEG的PEG基链，其分子量范围为3至40kDa。
在某些实施方案中，式(A)的部分-P1、P2、-P3和-P4的分子量相互独立地在5至30kDa之间，例如5至25kDa或8至20kDa。在某些实施方案中，部分-P1、P2、-P3和-P4的分子量可以是约5kDa。在某些实施方案中，部分-P1、P2、-P3和-P4的分子量可以是约7kDa。在某些实施方案中，部分-P1、P2、-P3和-P4的分子量可以是约10kDa。在某些实施方案中，部分-P1、P2、-P3和-P4的分子量可以是约12kDa。在某些实施方案中，部分-P1、P2、-P3和-P4的分子量可以是约15kDa。在某些实施方案中，部分-P1、P2、-P3和-P4的分子量可以是约20kDa。在某些实施方案中，部分-P1、P2、-P3和-P4的分子量可以是约25kDa。在某些实施方案中，部分-P1、P2、-P3和-P4的分子量可以是约30kDa。在某些实施方案中，部分-P1、P2、-P3和-P4的分子量可以是7kDa。在某些实施方案中，部分-P1、P2、-P3和-P4的分子量可以是10kDa。在某些实施方案中，部分-P1、P2、-P3和-P4的分子量可以是12kDa。在某些实施方案中，部分-P1、P2、-P3和-P4的分子量可以是15kDa。在某些实施方案中，部分-P1、P2、-P3和-P4的分子量可以是20kDa。在某些实施方案中，部分-P1、P2、-P3和-P4的分子量可以是25kDa。在某些实施方案中，部分-P1、P2、-P3和-P4的分子量可以是30kDa。
在某些实施方案中，式(A)的-P1、P2、-P3和-P4具有相同的结构。
在某些实施方案中式(A)的BP1为-N＜。
在某些实施方案中，式(A)的Bp2和BP2具有相同的结构。在某些实施方案中，式(A)的Bp2和Bp2都是-CH＜。
在某些实施方案中式(A)的-C1-和-C2-具有相同的结构。在某些实施方案中，式(A)的-C1-和-C2-是被一个或多个选自-O-、-C(O)N(R10)-和3-10元杂环基的基团中断的C1-50烷基；其中3-10元杂环基被至少一个氧代(＝O)所取代。
在某些实施方案中，式(A)的-C1-和-C2-为式(A-a)
Figure BDA0004113465820000581
其中
标有星号的虚线表示连接于BP1；
无标记的虚线表示分别连接于BP2或BP3；
q1选自1、2、3、4、5、6、7和8组成的组；
q2选自1、2、3、4和5组成的组；
q3选自1、2、3、4、5、6、7和8组成的组；以及
q4选自1、2和3组成的组。
在某些实施方案中，式(A-a)的q1选自4、5、6、7和8组成的组。在某些实施方案中，式(A-a)的q1选自由5、6和7组成的组。在某些实施方案中，式(A-a)的q1是1。在某些实施方案中，式(A-a)的q1是2。在某些实施方案中，式(A-a)的q1是3。在某些实施方案中，式(A-a)的q1是4。在某些实施方案中，式(A-a)的q1是5。在某些实施方案中，式(A-a)的q1是6。在某些实施方案中，式(A-a)的q1是7。在某些实施方案中，式(A-a)的q1是8。
在某些实施方案中，式(A-a)的q2选自1、2和3组成的组。在某些实施方案中，式(A-a)的q2是1。在某些实施方案中，式(A-a)的q2是2。在某些实施方案中，式(A-a)的q2是3。在某些实施方案中，式(A-a)的q2是4。在某些实施方案中，式(A-a)的q2是5。
在某些实施方案中，式(A-a)的q3选自2、3、4和5组成的组。在某些实施方案中，式(A-a)的q3选自由2、3和4组成的组。在某些实施方案中，式(A-a)的q3是1。在某些实施方案中，式(A-a)的q3是2。在某些实施方案中，式(A-a)的q3是3。在某些实施方案中，式(A-a)的q3是4。在某些实施方案中，式(A-a)的q3是5。在某些实施方案中，式(A-a)的q3是6。在某些实施方案中，式(A-a)的q3是7。在某些实施方案中，式(A-a)的q3是8。
在某些实施方案中，式(A-a)的q4是1。在某些实施方案中，式(A-a)的q4是2。在某些实施方案中，式(A-a)的q4是3。
在某些实施方案中，式(A)的-P1、P2、-P3和-P4是相互独立的式(A-b)
Figure BDA0004113465820000591
其中
虚线表示与-Z的其余部分的连接；
m是0或1；
p是70至900之间的整数；以及
q选自1、2、3、4、5和6组成的组。
在某些实施方案中，式(A-b)的m是0。在某些实施方案中，式(A-b)的m是1。
在某些实施方案中，式(A-b)的p为115至680的整数。在某些实施方案中，式(A-b)的p是从115到560的整数。在某些实施方案中，式(A-b)的p是185至450的整数。在某些实施方案中，式(A-b)的p约为115。在某些实施方案中，式(A-b)的p约为160。在某些实施方案中，式(A-b)的p约为225。在某些实施方案中，式(A-b)的p约为270。在某些实施方案中，式(A-b)的p约为340。在某些实施方案中，式(A-b)的p约为450。在某些实施方案中，式(A-b)的p约为560。
在某些实施方案中，式(A-b)的q是1。在某些实施方案中，式(A-b)的q是2。在某些实施方案中，式(A-b)的q是3。在某些实施方案中，式(A-b)的q是4。在某些实施方案中，式(A-b)的q是5。在某些实施方案中，式(A-b)的q是6。
在某些实施方案中，式(Ia)或(Ib)的-Z包括式(A-c)的部分：
Figure BDA0004113465820000601
其中
p1、p2、p3、p4相互独立地是70至900的整数。
在某些实施方案中，式(A-c)的p1为115至680的整数。在某些实施方案中，式(A-c)的p1是一个从115到560的整数。在某些实施方案中，式(A-c)的p1是一个从185到450的整数。在某些实施方案中，式(A-c)的p1是一个从220到240的整数。在某些实施方案中，式(A-c)的p1是约115。在某些实施方案中，式(A-c)的p1是约160。在某些实施方案中，式(A-c)的p1是约225。在某些实施方案中，式(A-c)的p1是约270。在某些实施方案中，式(A-c)的p1是约340。在某些实施方案中，式(A-c)的p1是约450。在某些实施方案中，式(A-c)的p1是约560。
在某些实施方案中，式(A-c)的p2为115至680的整数。在某些实施方案中，式(A-c)的p2是一个从115到560的整数。在某些实施方案中，式(A-c)的p2是一个从185到450的整数。在某些实施方案中，式(A-c)的p2是一个从220到240的整数。在某些实施方案中，式(A-c)的p2是约115。在某些实施方案中，式(A-c)的p2是约160。在某些实施方案中，式(A-c)的p2是约225。在某些实施方案中，式(A-c)的p2是约270。在某些实施方案中，式(A-c)的p2是约340。在某些实施方案中，式(A-c)的p2是约450。在某些实施方案中，式(A-c)的p2是约560。
在某些实施方案中，式(A-c)的p3为115至680的整数。在某些实施方案中，式(A-c)的p3是115至560的整数。在某些实施方案中，式(A-c)的p3是185至450的整数。在某些实施方案中，式(A-c)的p3是220至240的整数。在某些实施方案中，式(A-c)的p3是约115。在某些实施方案中，式(A-c)的p3是约160。在某些实施方案中，式(A-c)的P3是约225。在某些实施方案中，式(A-c)的p3是约270。在某些实施方案中，式(A-c)的P3是约340。在某些实施方案中，式(A-c)的P3是约450。在某些实施方案中，式(A-c)的p3是约560。
在某些实施方案中，式(A-c)的p4为115至680的整数。在某些实施方案中，式(A-c)的p4是一个从115到560的整数。在某些实施方案中，式(A-c)的p4是一个从185到450的整数。在某些实施方案中，式(A-c)的p4是一个从220到240的整数。在某些实施方案中，式(A-c)的p4是约115。在某些实施方案中，式(A-c)的p4是约160。在某些实施方案中，式(A-c)的p4是约225。在某些实施方案中，式(A-c)的p4是约270。在某些实施方案中，式(A-c)的p4是约340。在某些实施方案中，式(A-c)的p4是约450。在某些实施方案中，式(A-c)的p4是约560。
在某些实施方案中，式(A-c)的p1、p2、p3和p4是相同的。在某些实施方案中，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在一个实施方案中，式(Ia)或(Ib)的-Z是WO 2012/02047 A1中公开的一个部分，该文件在此作为参考纳入。
在另一个实施方案中，式(Ia)或(Ib)的-Z是WO 2013/024048 A1中公开的一个部分，该文件在此作为参考纳入。
在某些实施方案中，包含一个或多个式(I)的IL-2蛋白或其药学上可接受的盐的缀合物包括多个部分-D，其是所述式(I)的IL-2蛋白，通过至少一个部分-L1-L2-与至少一个部分Z′缀合，其中一个部分-L1通过可逆连接与-D缀合，且其中一个部分-L2与Z′缀合，其中-L1-和-L2-如式(Ia)和(Ib)所定义，且其中Z′为水不溶性水凝胶。
在某些实施方案中，这种水凝胶Z′包括选自2-甲基丙烯酰基-氧乙基磷酰胆碱、聚(丙烯酸)、聚(丙烯酸酯)、聚(丙烯酰胺)、聚(烷氧基)聚合物、聚(酰胺)、聚(酰胺-胺)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(天冬酰胺)、聚(丁酸)、聚(乙醇酸)、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚己内酯、聚碳酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚二甲基丙烯酰胺、聚酯、聚乙烯、聚亚烷基二醇(如聚乙二醇和聚丙二醇)、聚环氧乙烷、聚(磷酸乙酯)、聚(乙基噁唑啉)、聚(乙醇酸)、聚(羟乙基丙烯酸酯)、聚(羟乙基噁唑啉)、聚(羟甲基丙烯酸酯)、聚(羟丙基甲基丙烯酰胺)、聚(羟丙基甲基丙烯酸酯)、聚(羟丙基噁唑啉)、聚(亚氨基碳酸酯)、聚(乳酸)、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚(甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(甲基噁唑啉)、聚(有机磷腈)、聚(原酸酯)、聚(噁唑啉)、聚(丙二醇)、聚(硅氧烷)、聚氨酯、聚(乙烯醇)、聚(乙烯胺)、聚(乙烯基甲基醚)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、硅酮、纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲壳素、壳聚糖、右旋糖苷、糊精、明胶、透明质酸及其衍生物、官能化透明质酸、甘露聚糖、果胶、鼠李半乳糖、淀粉、羟烷基淀粉、羟乙基淀粉和其他碳水化合物基聚合物、木聚糖及其共聚物。
在某些实施方案中，Z′是一种聚(亚烷基二醇)基或基于透明质酸的水凝胶。
在某些实施方案中，Z′是一种聚丙二醇基的水凝胶。
在某些实施方案中，Z′是一种PEG基的水凝胶。
在某些实施方案中，Z′是WO2011/012715A1或WO2O14/056926A1中公开的PEG基的水凝胶，这两个文件在此作为参考纳入。
在某些实施方案中，Z′是一种基于透明质酸的水凝胶。
在某些实施方案中，Z′是WO2018/175788A1中公开的基于透明质酸的水凝胶，该文件在此作为参考纳入。
在某些实施方案中，Z′是WO2013/036847 A1中公开的水凝胶。特别是，在某些实施方案中，Z′是通过一种方法生产的水凝胶，该方法包括使至少第一反应性聚合物与可裂解交联剂化合物反应的步骤，其中所述可裂解交联剂化合物包含与第一反应性聚合物反应的第一官能团-Y1，并进一步包含在生理条件下通过消除而裂解的部分，其中所述部分包含与第二反应性聚合物反应的第二官能团-Y2。在某些实施方案中，该可裂解交联剂化合物为式(PL-1)
Figure BDA0004113465820000621
其中
m是0或1；
-X包含一个能够与反应性聚合物连接的官能团，该官能团在生理条件下可被消除，以及所述第二官能团-Y2；
-R1、-R2和-R5中的至少一个包含所述第一官能团-Y1，其能够与聚合物连接；
-R1和-R2中的一个且仅一个选自-H、烷基、芳基烷基和杂芳基烷基组成的组；
任选地，-R1和-R2可以连接起来形成一个3-8元的环；
-R1和-R2中的至少一个或两个都独立地选自由-CN、-NO2、芳基、杂芳基、烯基、炔基、-COR3、-SOR3、-SO2R3和-SR4组成的组；
-R3选自由-H、烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、-OR9和-NR9 2组成的组；
-R4选自烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基和杂芳基烷基组成的组；
每个-R5独立地选自-H、烷基、烯基烷基、炔基烷基、(OCH2CH2)pO-烷基(p为1至1000的整数)、芳基、芳基烷基、杂芳基和杂芳基烷基组成的组；
每个-R9独立地选自-H和烷基组成的组，或者两个-R9与它们所连接的氮一起构成一个杂环；
并且其中式(PL-1)的部分可任选进一步被取代。
以下段落更详细地描述了这种水凝胶。
在某些实施方案中，式(PL-1)的-X选自由琥珀酰亚胺碳酸盐、硫代琥珀酰亚胺碳酸盐卤化物、硫醚、酯类、硝酸苯碳酸盐、氯甲酸酯、氟甲酸酯、任选取代的酚类和式(PL-2)组成的组。
Figure BDA0004113465820000631
其中
虚线表示与式(PL-1)的其余部分相连；
-T*-选自由-O-、-S-和-NR6-组成的组；
z是一个整数，选自1、2、3、4、5和6组成的组。
-X′-不存在或选自由-OR7和-SR7组成的组；
-Y2是一个能够与反应性聚合物连接的官能团；
-R6选自-H、烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基和杂芳基烷基组成的组；以及
-R7选自由亚烷基、亚苯基和(OCH2CH2)p组成的组，其中p为1至1000的整数。
在某些实施方案中，式(PL-1)的-X包括活性碳酸盐，如琥珀酰亚胺碳酸盐、磺基琥珀酰亚胺碳酸盐或硝酸苯碳酸盐。在某些实施方案中，式(PL-1)的-X包括羰基卤化物，如O(C＝O)Cl或O(C＝O)F。在某些实施方案中，式(PL-1)的-X具有式(PL-2)。在某些实施方案中，式(PL-1)的-X是-OR7或-SR7，其中-R7是任选取代的亚烷基、任选取代的亚苯基或(OCH2CH2)p，其中p是1至1000。
在某些实施方案中，式(PL-2)的p是1至100的整数。在某些实施方案中，式(PL-2)的p是1至10的整数。
在某些实施方案中，式(PL-1)的-Y1和式(PL-2)的-Y2独立地包括-N3、-NH2、-NH-CO2 t Bu、-SH、-St Bu、马来酰亚胺、-CO2H、-CO2 t Bu、1，3-二烯、环戊二烯、呋喃、炔、环辛炔、丙烯酸酯或丙烯酰胺，其中-tBu是叔丁基，并且其中当-Y1或-Y2中的一个包含N3时，另一个不包含炔或环辛炔。当-Y1或-y2中的一个包含-SH时，另一个不包含马来酰亚胺、丙烯酸酯或丙烯酰胺；当-Y1或-Y2中的一个包含-NH2时，另一个不包含-CO2H；当-Y1或-Y2中的一个包含1，3-二烯或环戊二烯时，另一个不包含呋喃。
在某些实施方案中，可裂解交联剂化合物为式(PL-3)。
Figure BDA0004113465820000641
其中
m是0或1；
n是选自1至1000的整数；
s是0、1或2；
t选自2、4、8、16和32组成的组；
-W-选自-O(C＝O)O-、-O(C＝O)NH-、-O(C＝O)S-、-O(C＝O)NR6CH2 O-和-O(C＝O)NR6S-组成的组；
-Q是一个具有价位＝t的核心基团；其连接了可裂解交联化合物的多个臂；
其中t是一个选自2、4、8、16和32的整数，以及
其中-R1、-R2和-R5如式(PL-1)所定义。
在某些实施方案中，式(PL-3)的t为2。在某些实施方案中，式(PL-3)的t为4。在某些实施方案中，式(PL-3)的t为8。在某些实施方案中，式(PL-3)的t为16。在某些实施方案中，式(PL-3)的t为32。
在某些实施方案中，式(PL-3)的-Q具有选自以下组的结构
Figure BDA0004113465820000651
Figure BDA0004113465820000652
其中虚线表示与可裂解交联剂化合物的剩余部分的连接。
在某些实施方案中，式(PL-3)的-Q具有(PL-3-i)的结构。在某些实施方案中，式(PL-3)的-Q具有(PL-3-ii)的结构。在某些实施方案中，式(PL-3)的-Q具有(PL-3-iii)的结构。
在某些实施方案中，可裂解交联剂化合物为式(PL-3)，其中m为0，n约为100，s为0，t为4，-W-为-O(C＝O)NH-，Q具有(PL-3i)的结构，-R2是-H，一个-R5是H且另一个-R5是-(CH2)5N3，以及-R1是(4-氯苯基)SO2，被-SO2、吗啉基-SO2或-CN取代的苯基。
在某些实施方案中，式(PL-3)的-Y1包括-N3、-NH2、-NH-CO2 tBu、-SH、-St Bu、马来酰亚胺、-CO2H、-CO2 t Bu、1，3-二烯、环戊二烯、呋喃、炔、环辛炔、丙烯酸酯或丙烯酰胺，其中-tBu是叔丁基。
在某些实施方案中，式(PL-1)或(PL-3)的每个-Y1和式(PL-2)的-Y2独立地包括-N3、-NH2、-NH-CO2 tBu、-SH、-StBu、马来酰亚胺、-CO2 H、-CO2 t Bu、1，3-二烯、环戊二烯、呋喃、炔、环辛炔、丙烯酸酯或丙烯酰胺。
在某些实施方案中，-Y1和-Y2中的一个是叠氮化物，另一个是选自乙炔、环辛炔和马来酰亚胺组成的反应性官能团。在某些实施方案中，-Y1和-Y2中的一个是硫醇，另一个是选自马来酰亚胺、丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙烯基砜、乙烯基磺酰胺和卤代碳酰组成的反应性官能团。在某些实施方案中，-Y1和-Y2中的一个是胺，另一个是选自羧酸和活性羧酸的选择性反应性官能团。在某些实施方案中，-Y1和-Y2之一是马来酰亚胺，另一个是选自1，3-二烯、环戊二烯和呋喃的选择性反应性官能团。
在某些实施方案中，第一和任何第二聚合物选自包括均聚或共聚的聚乙二醇、聚丙二醇、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚甲基丙烯酸酯、聚磷腈、聚丙交酯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇酯、聚乙烯亚胺、琼脂糖、糊精、明胶、胶原蛋白、聚赖氨酸、壳聚糖、藻酸盐、透明质酸、果胶和卡拉胶，其要么包含适当的活性官能团，要么为公式[Y3-(CH2)s(CH2CH2O)n]tQ，其中-Y3是一个活性官能团，s是0、1或2，n是选自10至1000的整数，-Q是具有价位t的核心基团，t是选自2、4、8、16和32组的整数。
在某些实施方案中，第一种聚合物包括多臂聚合物。在某些实施方案中，第一种聚合物包含至少三个臂。在某些实施方案中，第一种聚合物包含至少四个臂。在某些实施方案中，第一种聚合物包含至少五个臂。在某些实施方案中，第一种聚合物包含至少六个臂。在某些实施方案中，第一种聚合物包含至少七个臂。在某些实施方案中，第一种聚合物包含至少八个臂。
在某些实施方案中，第二种聚合物包含多臂聚合物。在某些实施方案中，第二种聚合物包含至少三个臂。在某些实施方案中，第二种聚合物包含至少四个臂。在某些实施方案中，第二种聚合物包含至少五个臂。在某些实施方案中，第二种聚合物包含至少六个臂。在某些实施方案中，第二种聚合物包含至少七个臂。在某些实施方案中，第二种聚合物包含至少八个臂。
在某些实施方案中，第一种聚合物包括一种2臂聚乙二醇聚合物。在某些实施方案中，第一种聚合物包括一种4臂聚乙二醇聚合物。在某些实施方案中，第一种聚合物包括8臂聚乙二醇聚合物。在某些实施方案中，第一种聚合物包括16臂的聚乙二醇聚合物。在某些实施方案中，第一种聚合物包括32臂的聚乙二醇聚合物。
在某些实施方案中，第二种聚合物包括一种2臂聚乙二醇聚合物。在某些实施方案中，第二种聚合物包括一种4臂聚乙二醇聚合物。在某些实施方案中，第二种聚合物包括8臂聚乙二醇聚合物。在某些实施方案中，第二种聚合物包括16臂的聚乙二醇聚合物。在某些实施方案中，第二种聚合物包括一种32臂的聚乙二醇聚合物。
在某些实施方案中，第一和第二反应性聚合物与所述可裂解交联剂化合物依次或同时反应。
在某些实施方案中，第一和第二官能团是相同的。
只有在式(PL-1)、(PL-2)和(PL-3)的范围内使用的术语才有以下含义。
术语″能够在生理条件下通过消除而裂解的部分″是指包含基团H-C-(CH＝CH)m-C-X′的结构，其中m为0或1，且X′为离去基团，其中如上所述消除反应去除HX′元素的速度可以使反应的半衰期在pH和温度的生理条件下为1到10,000小时。优选的是，在pH值和温度的生理条件下，反应的半衰期在1至5,000小时之间，更优选的是在1至1,000小时之间。所谓pH值和温度的生理条件是指pH值在7到8之间，温度在30到40摄氏度之间。
术语″反应性聚合物和反应性低聚物″是指包含对其他官能团具有反应性的官能团的聚合物或低聚物，最优选是在与肽、蛋白质和其他生物大分子的稳定性要求相适应的温和条件下。在反应性聚合物中发现的合适的官能团包括马来酰亚胺、硫醇或被保护的硫醇、醇、丙烯酸酯、丙烯酰胺、胺或被保护的胺、羧酸或被保护的羧酸、叠氮化物、包括环烯烃的炔类、包括环戊二烯和呋喃的1，3-二烯、α-卤代烃以及N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基磺基琥珀酰亚胺或硝苯酯或碳酸酯。
术语″能够与反应性聚合物连接的官能团″是指能够与反应性聚合物的相应官能团反应，从而与聚合物形成共价键的官能团。能够与反应性聚合物连接的合适官能团包括马来酰亚胺、硫醇或被保护的硫醇、丙烯酸酯、丙烯酰胺、胺或被保护的胺、羧酸或被保护的羧酸、叠氮化物、包括环炔的炔烃、包括环戊二烯和呋喃的1，3-二烯、α-卤代烃，以及N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基磺基琥珀酰亚胺或硝苯酯或碳酸酯。
术语″取代的″是指包含一个或多个取代基以代替一个或多个氢原子的烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基。取代基团一般可选自卤素，包括-F、-CI、-Br和-I；低级烷基，包括直链、支链和环状；低级卤代烷基，包括氟代烷基、氯代烷基、溴代烷基和碘代烷基；-OH；低级烷氧基，包括直链、支链和环状。-SH；低级烷硫基，包括直链、支链和环状；氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硅烷基，包括烷基硅烷基、烷氧基硅烷基和芳基硅烷基；硝基；氰基；羰基；羧酸、羧酸酯、羧酸酰胺；氨基羰基；氨基乙酰基；氨基甲酸酯；脲；硫代氨基甲酸酯；硫脲；酮；砜；磺酰胺；芳基包括苯基、萘基和蒽基；杂芳基包括5元杂芳基，包括吡咯、咪唑、呋喃、噻吩、噁唑、噻唑、异噁唑、异噻唑、噻二唑、三唑、噁二唑和四唑，6元杂环芳基，包括吡啶、嘧啶、吡嗪，以及稠合杂环芳基，包括苯并呋喃、苯并噻吩、苯并噁唑、苯并咪唑、吲哚、苯并噻唑、苯并异噁唑和苯并异噻唑。
-R1和-R2的特性可通过任选添加供电子或吸电子取代基来调节。术语″供电子基团″是指导致R1R2CH酸度降低的取代基；供电子基团通常与负的Hammettσ或Taftσ*常数有关，是物理有机化学领域中众所周知的。(Hammett常数指的是芳基/杂芳基取代基，Taft常数指的是非芳香族部分上的取代基)。合适的供电子取代基的例子包括低级烷基、低级烷氧基、低级烷硫基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基和硅烷基。
术语″吸电子基团″是指导致R1R2CH基团酸度增加的取代基；吸电子基团通常与正的Hammettσ或Taftσ*常数有关，是物理有机化学领域中众所周知的。合适的吸电子取代基的例子包括卤素、二氟甲基、三氟甲基、硝基、氰基、C(＝O)-Rx，其中-Rx是H、低级烷基、低级烷氧基或氨基，或S(O)mRY，其中m是1或2，RY是低级烷基、芳族或杂芳基。正如本领域所熟知的，取代基的电子影响可能取决于取代基的位置。例如，在芳环的邻位或对位上的烷氧基取代基是供电子的，并以负的Hammettσ常数为特征，而在芳环的间位上的烷氧基取代基是吸电子的，以正的Hammettσ常数为特征。
术语″烷基″、″烯基″和″炔基″包括1至8个碳或1至6个碳或1至4个碳的直链、支链或环状烃基，其中烷基是饱和烃，烯基包括一个或多个碳-碳双键，炔基包括一个或多个碳-碳叁键。除非另有规定，这些都含有1至6个碳原子。
术语″芳基″包括6至18个碳，优选6至10个碳的芳香烃基，包括例如苯基、萘基和蒽基等基团。″杂芳基″包括由3至15个碳组成的、含有至少一个N、O或S原子的芳香环，优选3至7个碳，含有至少一个N、O或S原子，包括例如吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、喹啉基、吲哚基、茚基等。
术语″卤素″包括氟、氯、溴和碘。
术语″马来酰亚胺″是指下式的基团
Figure BDA0004113465820000681
在某些实施方案中，Z′是WO2020/206358 A1中公开的水凝胶。特别是在某些实施方案中，Z′是一种水凝胶，其生产方法包括以下步骤：
(a)提供包括多臂聚合物-p2的第一种预聚物，其中所述第一种预聚物为式(PL-4)
Figure BDA0004113465820000691
其中
n是选自0、1、2、3、4、5和6的整数；
r是大于2的整数；
-Y是用于连接所述第一预聚物和第二预聚物的反应性官能团；
-R1和-R2独立地是吸电子基团、烷基或-H，并且其中-R1和-R2中至少有一个是吸电子基团；
每个-R4都独立地是C1-C3烷基，或者两个-R4与它们所连接的碳原子一起形成一个3至6元的环；
W不存在或者是
Figure BDA0004113465820000692
其中，标有星号的虚线表示与-NH-的连接，且未标记的虚线表示与-P2的连接；
x、y和z各自独立地是选自0、1、2、3、4、5和6的整数；
-B′是-NH2、-ONH2、酮、醛、-SH、-OH、-CO2H、羧酰胺基，或包含环辛炔或二环壬炔的基团；以及
-C*是羧酰胺、硫醚、硫代琥珀酰亚胺、三唑或肟。
(b)提供包含多臂聚合物-p1的第二种预聚物，其中每个臂由一个与步骤(a)的-Y反应的反应性官能团-Y″终止。
(c)将步骤(a)和(b)的两种预聚物在条件下混合，其中-Y和-Y″反应形成一个连接-Y*；以及任选地
(d)分离产生的水凝胶。
因此，-Z′是一种可从上述方法中获得的水凝胶。在某些实施方案中，由前述方法产生的水凝胶是可降解的。
在某些实施方案中，-Y和-Y″在步骤(c)下发生反应，形成不溶性水凝胶基质，包括式(PL-4′)的交联：
Figure BDA0004113465820000701
其中，n、r、-P1、-Y*-、-R4、-R1、-R2、-W-和-P2如上所定义。
在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的n为选自1、2、3、4、5和6的整数。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的n是选自1、2和3的整数。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的n是选自0、1、2和3的整数。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的n为1。在某些实施方案中，式(PL-4)的n为2。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的n为3。
在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的多臂-P2是一种r臂聚合物，其中r是选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的整数。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的r是选自2、3、4、5、6、7和8的整数。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的r是选自2、4、6和8的整数。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的r是2。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的r是4。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的r是6。
在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-p2的分子量至少为1kDa。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-P2的分子量为1至100kDa。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-p2，其分子量为1至80kDa。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-p2，其分子量为1至60kDa。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-P2，其分子量为1至40kDa。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-p2，其分子量为1至20kDa。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-p2，其分子量为1至10kDa。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-P2，其分子量为1至5kDa。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-P2，其分子量约为20kDa。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-P2的分子量约为40kDa。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-p2的分子量约为60kDa。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-P2的分子量约为80kDa。
在某些实施方案中，步骤(b)的多臂聚合物-P1是一种r臂聚合物，其中r是选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的整数。在某些实施方案中，步骤(b)的多臂-P1是一种r臂聚合物，其中r是选自2、3、4、5、6、7和8的整数。在某些实施方案中，步骤(b)的多臂-P1是一种r臂聚合物，其中r是选自2、4、6和8的整数。在某些实施方案中，步骤(b)的多臂-P1是一种r臂聚合物，其中r为2。在某些实施方案中，步骤(b)的多臂-P1是一种r臂聚合物，其中r为4。在某些实施方案中，步骤(b)的多臂P1是一种r臂聚合物，其中r为6。在某些实施方案中，步骤(b)的多臂P1-是一种r臂聚合物，其中r为8。
在某些实施方案中，步骤(b)的-p1，其分子量至少为1kDa。在某些实施方案中，步骤(b)的多臂聚合物-P1的分子量为1至100kDa。在某些实施方案中，步骤(b)的多臂聚合物-P1的分子量为1至80kDa。在某些实施方案中，步骤(b)的多臂聚合物-p1的分子量为1至60kDa。在某些实施方案中，步骤(b)的多臂聚合物-p1的分子量为1至40kDa。在某些实施方案中，步骤(b)的多臂聚合物-P1的分子量为1至20kDa。在某些实施方案中，步骤(b)的多臂聚合物-p1的分子量为1至10kDa。在某些实施方案中，步骤(b)的多臂聚合物-p1的分子量为1至5kDa。在某些实施方案中，步骤(b)的多臂聚合物-P1，其分子量约为20kDa。在某些实施方案中，步骤(b)的多臂聚合物-P1的分子量约为40kDa。在某些实施方案中，步骤(b)的多臂聚合物-P1的分子量约为60kDa。在某些实施方案中，步骤(b)的多臂聚合物-P1，其分子量约为80kDa。
在某些实施方案中，步骤(b)的-P1和式(PL-4)或(PL-4′)的-P2包括聚(乙二醇)(PEG)、聚(环氧乙烷)(PEO)、聚(乙烯亚胺)(PEI)、右旋糖苷、透明质酸或其共聚物。在某些实施方案中，步骤(b)的-P1和式(PL-4)或(PL-4′)的-P2是PEG基聚合物。在某些实施方案中，步骤(b)的-P1和式(PL-4)或(PL-4′)的-p2是基于透明质酸聚合物。
在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-R1和-R2独立地是吸电子基团、烷基或-H，其中-R1和-R2中至少有一个是吸电子基团。
在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-R1和-R2的吸电子基团是-CN、-NO2、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、-COR3、-SOR3或-SO2R3，其中-R3是-H、任选取代的烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳基烷基、-OR8或-NR8 2，其中每个-R8独立地为-H或任选取代的烷基，或者两个-R8基团与它们所连接的氮一起构成杂环；或SR9，其中-R9是任选取代的烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳基烷基。
在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-R1和-R2的吸电子基团是-CN。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-R1和-R2的吸电子基团是-NO2。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-R1和-R2的吸电子基团是含有6至10个碳的任选取代的芳基。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)中的-R1和-R2的吸电子基团是任选取代的苯基、萘基或蒽基。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-R1和-R2的吸电子基团是任选取代的杂芳基，其包括3至7个碳原子并含有至少一个N、O或S原子。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-R1和-R2的吸电子基团是任选取代的吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、喹啉基、吲哚基或茚基。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-R1和-R2的吸电子基团是含有2至20个碳原子的任选取代的烯基。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-R1和-R2的吸电子基团是含有2至20个碳原子的任选取代的炔烃。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-R1和-R2的吸电子基团是-COR3、-SOR3或-SO2R3，其中-R3是-H、含有1至20个碳原子的任选取代的烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳基烷基、-OR8或-NR8 2，其中每个-R8独立为-H或含有1至20个碳原子的任选取代的烷基，或两个-R8基团与它们所连接的氮一起形成杂环。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-R1和-R2的吸电子基团是-SR9，其中-R9是含有1至20个碳原子的任选取代的烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳基烷基。在某些实施方案中，-R1和-R2中至少有一个是-CN或-SO2R3。
在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-R1和-R2中至少有一个是-CN、-SOR3或-SO2R3。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-R1和-R2中至少有一个是-CN或-SO2R3。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-R1和-R2中至少有一个是-CN或-SO2R3，其中-R3是任选取代的烷基、任选取代的芳基或-NR8 2。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的-R1和-R2中至少有一个是-CN、-SO2N(CH3)2、-SO2CH3、被-SO2取代的苯基、被-SO2和-Cl取代的苯基、-SO2N(CH2CH2)2O、-SO2CH(CH3)2、-SO2N(CH3)(CH3)或-SO2N(CH2CH2OCH3)2。
在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)中的每个-R4独立地为C1-C3烷基，或合在一起可形成3至6元的环。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的每个-R4独立地为C1-C3烷基。在某些实施方案中，式(PL-4)或(PL-4′)的两个-R4都是甲基。
在某些实施方案中，-Y和-Y″独立地选自由胺、氨基氧基、酮、醛、马来酰亚胺、硫醇、醇、叠氮、1，2，4，6-四嗪基、反式环辛烯基、二环壬炔基、环辛炔基和其被保护的变体组成的组。
在某些实施方案中，Y和Y′可以相互反应，如以选择性的方式。例如，当-Y是胺时，-Y″是羧酸、活性酯或活性碳酸酯，以产生一个剩余的连接官能团-Y*-，该官能团是酰胺或氨基甲酸酯。又如，当-Y为叠氮化物时，-Y″为炔基、二环壬炔基或环辛炔基，产生的剩余连接官能团-Y*-为1，2，3-三唑。再比如，当-Y是-NH2O时，-Y″是酮或醛，得到的残余连接官能团-Y*-是肟。再比如，当-Y是-SH时，-Y″是马来酰亚胺或卤代羰基，产生的剩余连接官能团-Y*-是硫代琥珀酰亚胺基或硫醚。同样，-Y和-Y″的这些作用可以颠倒过来，产生相反方向的-Y*-。
在某些实施方案中，-Y*-包括酰胺、肟、1，2，3-三唑、硫醚、硫代琥珀酰亚胺或醚。在某些实施方案中，-Y*-是-L2-。
这些缀合反应可以在本领域已知的条件下进行，例如，当-Y是叠氮化物且-Y″是环辛炔时，缀合反应在任何溶剂中发生，其中两种成分显示出足够的溶解度，尽管已知水溶液显示出更有利的反应速率。当在适当的溶剂中混合时，当-Y和-Y″是叠氮/环辛炔时，通常是在pH值为2至7的水性缓冲液中，或当-Y和-Y″是活性酯和胺时，在pH值为6至9的缓冲液中，-Y和-Y″基团反应形成不溶性水凝胶基质，其包括式(PL-4′)的交链。这一过程可以在本体相(bulkphase)中进行，也可以在有机/水混合体系中的乳化条件下进行，以便形成适合注射的微粒子悬浮液，如微球。
在某些实施方案中，包含水凝胶Z′的缀合物是通过包括以下步骤的方法生产的
(a)提供式(PL-4)的第一种预聚物
(b)使式(PL-4)的预聚物与式(PL-5)的接头-药物反应
Figure BDA0004113465820000731
其中
n、R1、R2、R4和-Y如式(PL-4)中定义；
-D是一个药物部分；
当-D是通过胺连接的药物部分时，-X-不存在，或当-D-是通过苯酚、醇、硫醇、噻吩、咪唑或非碱性胺连接的药物部分时，-X-是-N(R6)CH2；其中-R6是任选取代的C1-C6烷基，任选取代的芳基，或任选取代的杂芳基；
从而使式(PL-5)的-Y与式(PL-4)的-B′反应；
(c)提供包括多臂聚合物-P1的第二种预聚物，其中每个臂由与步骤(a)的-Y反应的反应性官能团-Y″终止，其中-P1的实施方案如上所述；
(d)将步骤(a)和(b)的两种预聚物在条件下混合，其中-Y和-Y″反应形成剩余的连接官能团-Y*；以及任选地
(e)分离产生的水凝胶。
在某些实施方案中，通过一种方法获得缀合物，该方法包括使水凝胶Z′与式(PL-5)的接头-药物反应的步骤，其中水凝胶Z′上的-B′与式(PL-5)的-Y反应。
只有在式(PL-4)、(PL-4′)和(PL-5)的范围内，使用的术语才有以下含义。
术语″烷基″是指1至20、1至12、1至8、1至6或1至4个碳原子的直链、支链或环状饱和烃基。在某些情况下，烷基是直链或支链的。直链或支链烷基的例子包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基和正癸基。在某些实施方案中，烷基是环状的。环状烷基的例子包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊二烯基和环己基。
术语″烷氧基″是指与氧结合的烷基，包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基、环丙氧基和环丁氧基。
术语″烯基″是指具有碳-碳双键和2至20、2至12、2至8、2至6或2至4个碳原子的非芳香族不饱和烃。
术语″炔烃″是指具有碳-碳叁键和2至20、2至12、2至8、2至6或2至4个碳原子的非芳香族不饱和烃。
术语″芳基″是指6至18个碳，优选6至10个碳的芳香烃基，包括例如苯基、萘基和蒽基等基团。术语″杂芳基″是指包含3至15个碳且包含至少一个N、O或S原子的芳香环，优选3至7个碳且包含至少一个N、O或S原子的芳香环，包括例如吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、喹啉基、吲哚基和茚基。
在某些实施方案中，烯基、炔基、芳基或杂芳基部分可以通过烷基连接与分子的其余部分偶联。在这些情况下，该取代基将被称为烯基烷基、炔基烷基、芳基烷基或杂芳基烷基，表明在烯基、炔基、芳基或杂芳基部分和烯基、炔基、芳基或杂芳基所偶联的分子之间有一个亚烷基部分。
术语″卤素″或″卤代″是指溴、氟、氯和碘。
术语″杂环″或″杂环基″是指包含至少一个N、O或S原子的3至15元芳族或非芳族环。例子包括哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基、吡咯烷基和四氢呋喃基，以及上文为″杂芳基″一词提供的示例性基团。在某些实施方案中，杂环或杂环基是非芳香族。在某些实施方案中，杂环或杂环基是芳香族的。
术语″任选取代″是指一个基团可以是未取代的或被一次或多次(例如，1、2、3、4或5次)取代的取代基，这些取代基可以是相同或不同的。取代基的例子包括烷基、烯基、炔基、卤素、-CN、-ORaa、-SRaa、-NRaaRbb、-NO2、-C＝NH(ORaa)、-C(O)Raa、-OC(O)Raa、-C(O)ORaa、-C(O)NRaaRbb、-OC(O)NRaaRbb、-NRaaC(O)Rbb、-NRaaC(O)ORbb、-S(O)Raa、-S(O)2Raa、-NRaaS(O)Rbb、-C(O)NRaaS(O)Rbb、-NRaaS(O)2Rbb、-C(O)NRaaS(O)2Rbb、-S(O)NRaaRbb、-S(O)2NRaaRbb、-P(O)(ORaa)(ORbb)、杂环基、杂芳基或芳基，其中烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、杂芳基和芳基各自独立地被-Rcc取代，其中-Raa和-Rbb各自独立地是-H、烷基、烯基、炔基、杂环基、杂芳基或芳基，或-Raa和-Rbb与它们所连接的氮原子一起形成杂环基，该杂环基任选被烷基、烯基、炔基、卤素、羟基、烷氧基或-CN取代，并且其中：-Rcc各自独立地是烷基、烯基、炔基、卤素、杂环基、杂芳基、芳基、-CN或NO2。
一个部分-L1-可以通过式(I)的IL-2部分，特别是通过所述IL-2部分的一个氨基酸残基，或通过存在于-D中的修饰性Mmod部分连接到-D。在一个实施方案中，-L1-通过IL-2部分，特别是通过IL-2部分的一个氨基酸残基连接到-D。在另一个实施方案中，-L1-通过存在于-D中的修饰性Mmod部分与-D相连。可以理解的是，一个或多个部分-L1-可以与Mmod部分相连。在某些实施方案中，IL-2缀合物可以包括与式(I)的IL-2部分的一个氨基酸残基连接的部分-L1，并可以包括与Mmod部分连接的部分-L1-。
在一个实施方案中，存在于IL-2缀合物中的所有部分-L1-都与-D的一个氨基酸残基相连。
如果-L1-连接到IL-2分子的氨基酸残基上，这种氨基酸残基可以是-D的蛋白或非蛋白氨基酸残基。在某些实施方案中，-L1-连接到非蛋白氨基酸残基上。在某些实施方案中，-L1连接到蛋白氨基酸残基上。如果连接发生在蛋白氨基酸残基上，所述蛋白氨基酸残基在某些实施方案中选自包括半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和精氨酸的组。在某些实施方案中，这种蛋白氨基酸残基选自半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸组成的组。
在某些实施方案中，-L1-与-D的半胱氨酸残基相连。在某些实施方案中，-L1-与-D的组氨酸残基相连。在某些实施方案中，-L1-与赖氨酸残基相连。在某些实施方案中，-L1-连接到一个色氨酸残基上。在某些实施方案中，-L1-与丝氨酸残基相连。在某些实施方案中，-L1-与苏氨酸残基相连。在某些实施方案中，-L1-与酪氨酸残基相连。在某些实施方案中，-L1-与天冬氨酸残基相连。在某些实施方案中，-L1-与谷氨酸残基相连。在某些实施方案中，-L1-与精氨酸残基相连。
在某些实施方案中，至少一个分子-L1-与-D的一个氨基酸残基相连，一个或多个额外的分子-L1-与-D中存在的修饰性分子相连。
该分子-L1-可以通过任何类型的连接与-D连接，只要它是可逆的。在某些实施方案中，-L1-通过选自酰胺、酯、氨基甲酸酯、乙缩醛、缩醛胺、亚胺、肟、腙、二硫化物和酰基胍的连接与-D相连。在某些实施方案中，-L1-通过选自酰胺、酯、氨基甲酸酯和酰基胍的连接与-D相连。可以理解的是，这些连接本身可能是不可逆的，但可逆性可能是-L1-中存在的某些原子组或部分的作用。
在某些实施方案中，-L1-通过酯连接与-D相连。在某些实施方案中，-L1-通过氨基甲酸酯连接与-D相连。在某些实施方案中，-L1-通过酰基胍与-D相连。在某些实施方案中，-L1-通过酰胺连接与-D相连。
在某些实施方案中，-L1-通过-D的赖氨酸残基侧链或N-末端的胺官能团的氮与-D连接。在某些实施方案中，-L1-通过-D的赖氨酸残基的侧链或N-末端的胺官能团的氮与-D连接，并且-D和-L1-之间形成的连接是氨基甲酸酯。
在某些实施方案中，-L1-通过-D的赖氨酸残基侧链的胺官能团的氮与-D连接。在某些实施方案中，-L1-通过-D的一个赖氨酸残基侧链的胺官能团的氮与-D连接，并且-D和-L1-之间形成的连接是氨基甲酸酯。
在某些实施方案中，-L1-通过-D的N-末端的胺官能团的氮与-D连接。在某些实施方案中，-L1-通过-D的N-末端的胺官能团的氮与-D连接，并且D和-L1-之间形成的连接是氨基甲酸酯。
在某些实施方案中，-L1-具有WO 2009/095479 A2中公开的结构。因此，在某些实施方案中，该部分-L1-为式(II)：
Figure BDA0004113465820000761
其中，虚线表示通过形成酰胺键与-D的氮的连接；
-X-是-C(R4R4a)-；-N(R4)-；-O-；-C(R4R4a)-C(R5R5a)-；-C(R5R5a)-C(R4R4a)-；-C(R4R4a)-N(R6)-；-N(R6)-C(R4R4a)；-C(R4R4a)-O-；-O-C(R4R4a)-；或-C(R7R7a)-；
X1是C；或S(O)；
-X2-是-C(R8R8a)-；或-C(R8R8a)-C(R9R9a)-；
＝X3是＝O；＝S；或＝N-CN；
-R1、-R1a、-R2、-R2a、-R4、-R4a、-R5、-R5a、-R6、-R8、-R8a、-R9、-R9a独立地选自-H；和C1-6烷基；
-R3、-R3a独立地选自-H；和C1-6烷基，条件是在-R3、R3a中的一个或两者都不是-H的情况下，它们通过一个SP3-杂化的碳原子与它们所连接的N连接。
-R7是-N(R10R10a)；或-NR10-(C＝O)-R11；
-R7a、-R10、-R10a、-R11相互独立地为-H；或C1-6烷基；
任选地，一对或多对-R1a/-R4a、-R1a/-R5a、-R1a/-R7a、-R4a/-R5a、-R8a/-R9a形成化学键；
任选地，一对或多对-R1/-R1a、-R2/-R2a、-R4/-R4a、-R5/-R5a、-R8/-R8a、-R9/-R9a与它们所连接的原子一起形成C3-10环烷基；或3至10元杂环基；
任选地，一对或多对-R1/-R4、-R1/-R5、-R1/-R6、-R1/-R7a、-R4/-R5、-R4/-R6、-R8/-R9、-R2/-R3与它们所连接的原子一起形成环A；
任选地，R3/R3a与它们所连接的氮原子一起形成一个3-10元的杂环；
A选自下组：苯基；萘基；茚基；茚满基；四氢萘基；C3-10环烷基；3-10元杂环基；和8-11元杂二环基；和
其中-L1-被至少一个-L2-Z取代，并且其中-L1-可任选地被进一步取代，条件是式(II)中标有星号的氢没有被-L2-Z或取代基取代。
优选地，式(II)的-L1-被一个部分-L2-Z所取代。
在一个实施方案中，式(II)的-L1-没有进一步被取代。
可以理解的是，如果将式(II)的-R3/-R3a与它们所连接的氮原子一起形成3至10元杂环，则只能形成所述3至10元杂环，其中直接连接到氮的原子是SP3-杂化碳原子。换句话说，由-R3/-R3a与它们所连接的氮原子一起形成的这种3-10元杂环具有以下结构：
Figure BDA0004113465820000771
其中
虚线表示与-L1-的其余部分相连；
该环包括3至10个原子，其中至少有一个氮原子；以及
R#和R##代表一个SP3-杂化的碳原子。
也可以理解为，3-10元杂环可以被进一步取代。
由式(II)的-R3/-R3a与它们所连接的氮原子一起形成的合适的3至10元杂环的示例性实施方案如下：
Figure BDA0004113465820000781
其中
虚线表示连接到分子的其他部分；以及
-R选自-H和C1-6烷基。
式(II)的-L1-任选进一步被取代。一般来说，只要不影响裂解原理，任何取代基都可以使用，即式(II)中标有星号的氢不被取代，并且式(II)的以下部分中的氮
Figure BDA0004113465820000782
仍然是伯胺、仲胺或叔胺的一部分，即-R3和-R3a相互独立地是-H或通过SP3-杂化的碳原子与-N＜连接。
在某些实施方案中，与式(II)的-L1-相连的-D的氮是胺官能团的氮，其可以是伯胺、仲胺或叔胺。在某些实施方案中，与式(II)的-L1-相连的-D的氮是胺官能团的氮，其是伯胺或仲胺。在某些实施方案中，与式(II)的-L1-相连的-D的氮是伯胺官能团的氮。在某些实施方案中，与式(II)的-L1-相连的-D的氮是伯胺官能团的氮。如果式(II)的-L1-与-D缀合，其中-D是蛋白质或肽类药物部分，在某些实施方案中，胺官能团可以是N-末端胺官能团或赖氨酸侧链的胺官能团。如果式(II)的-L1-与-D缀合，其中-D是蛋白质或肽类药物分子，则胺官能团在某些实施方案中可以是赖氨酸侧链的胺官能团。
在一个实施方案中，式(II)的-R1或-R1a被-L2-Z或-L2-Z′所取代。在另一个实施方案中，式(II)的-R2或-R2a被-L2-Z或L2-Z′取代。在另一个实施方案中，式(II)的-R3或-R3a被-L2-Z或-L2-Z′取代。在另一个实施方案中，式(II)的-R4被-L2-Z或-L2-Z′取代。在另一个实施方案中，式(II)的-R5或-R5a被-L2-Z或-L2-Z′取代。在另一个实施方案中，式(II)的-R6被-L2-Z或-L2-Z′取代。在另一个实施方案中，式(II)的-R7或-R7a被-L2-Z或-L2-Z′取代。在另一个实施方案中，式(II)的-R8或-R8a被-L2-Z或-L2-Z′取代。在另一个实施方案中，式(II)的-R9或-R9a被-L2-Z或-L2-Z′取代。
在某些实施方案中，-L1-具有如WO2016/020373A1中公开的结构。因此，在某些实施方案中，部分-L1-为式(III)：
Figure BDA0004113465820000791
其中
虚线表示通过形成酰胺或酯连接分别与-D的伯胺或仲胺或羟基连接；
-R1、-R1a、-R2、-R2a、-R3和R3a相互独立地选自-H、-C(R8R8aR8b)、-C(＝O)R8、-C≡N、-C(＝NR8)R8a、-CR8(＝CR8aR8b)、-C≡CR8和-T-；
-R4、-R5和-R5a相互独立地选自由-H、-C(R9R9aR9b)和-T；
a1和a2相互独立地是0或1；
-R6、-R6a、-R7、-R7a、-R8、-R8a、-R8b、-R9、-R9a、-R9b各自独立地选自-H、卤素、-CN、-COOR10、-OR10、-C(O)R10、-C(O)N(R10R10a)、-S(O)2N(R10R10a)、-S(O)N(R10R10a)、-S(O)2R10、-S(O)R10、-N(R10)S(O)2N(R10aR10b)、-SR10、-N(R10R10a)、-NO2、-OC(O)R10、-N(R10)C(O)R10a、-N(R10)S(O)2R10a、-N(R10)S(O)R10a、-N(R10)C(O)OR10a、-N(R10)C(O)N(R10aR10b)、-OC(O)N(R10R10a)、-T-、C1-20烷基、C2-20烯基和C2-20炔基。其中，-T、C1-20烷基、C2-20烯基和C2-20炔基任选被一个或多个相同或不同的-R11取代，并且其中C1-20烷基、C2-20烯基和C2-20炔基可任选被一个或多个选自以下的基团所中断：-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(R12)-、-S(O)2N(R12)-、-S(O)N(R12)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(R12)S(O)2N(R12a)-、-S-、-N(R12)-、-OC(OR12)(R12a)-、-N(R12)C(O)N(R12a)-和-OC(O)N(R12)；
-R10、-R10a、-R10b各自独立地选自-H、-T、C1-20烷基、C2-20烯基和C2-20炔基。其中，-T、C1-20烷基、C2-20烯基和C2-20炔基可任选被一个或多个相同或不同的-R11所取代，并且其中C1-20烷基、C2-20烯基和C2-20炔基可任选被一个或多个选自以下的基团所中断：-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(R12)-、-S(O)2N(R12)-、-S(O)N(R12)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(R12)S(O)2N(R12a)-、-S-、-N(R12)-、-OC(OR12)(R12a)-、-N(R12)C(O)N(R12a)-和-OC(O)N(R12)-；
T各自相互独立地选自下组：苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢萘基、C3-10环烷基、3-10元杂环基和8-11元杂二环基；其中T各自独立地被一个或多个相同或不同的-R11取代；
-R11各自相互独立地选自卤素、-CN、氧代(＝O)、-COOR13、-OR13、-C(O)R13、-C(O)N(R13R13a)、-S(O)2N(R13R13a)、-S(O)N(R13R13a)、-S(O)2R13、-S(O)R13、-N(R13)S(O)2N(R13aR13b)、-SR13、-N(R13R13a)、-NO2、-OC(O)R13、-N(R13)C(O)R13a、-N(R13)S(O)2R13a、-N(R13)S(O)R13a、-N(R13)C(O)OR13a、-N(R13)C(O)N(R13aR13b)、-OC(O)N(R13R13a)，以及C1-6烷基；其中C1-6烷基可任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；
-R12、-R12a、-R13、-R13a、-R13b各自独立地选自由-H和C1-6烷基组成的组；其中C1-6烷基可任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；
任选地，-R1/-R1a、-R2/-R2a、-R3/-R3a、-R6/-R6a、-R7/-R7中的一对或多对与它们所连接的原子一起形成C3-10环烷基或3-10元杂环基；
任选地，一对或多对-R1/-R2、-R1/-R3、-R1/-R4、-R1/-R5、-R1/-R6、-R1/-R7、-R2/-R3、-R2/-R4、-R2/-R5、-R2/-R6、-R2/-R7、-R3/-R4、-R3/-R5、-R3/-R6、-R3/-R7、-R4/-R5、-R4/-R6、-R4/-R7、-R5/-R6、-R5/-R7、-R6/-R7与它们所连接的原子共同形成一个环A；
A选自下组：苯基；萘基；茚基；茚满基；四氢萘基；C3-10环烷基；3-10元杂环基；和8-11元杂二环基。
其中-L1-被至少一个-L2-Z所取代，且-L1-可任选进一步被取代。
式(III)的-L1-的任选进一步取代基优选如上所述。
优选的是式(III)的-L1-被一个部分-L2-Z所取代。
在一个实施方案中，式(III)的-L1-没有进一步被取代。
在另一个实施方案中，-L1-具有EP1536334B1、WO2009/009712A1、WO2008/034122A1、WO2009/143412A2、WO2011/082368A2和US8618124B2中公开的结构，这些文件在此作为参考。
在某些实施方案中，-L1-具有US894640582和US875419082中公开的结构。因此，在某些实施方案中，-L1-为式(IV)：
Figure BDA0004113465820000811
其中
虚线表示通过选自-OH、-SH和-NH2的-D的官能团与-D相连；
m是0或1；
-R1和-R2中的至少一个或两个是/相互独立地选自下组：-CN、-NO2、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、-C(O)R3、-S(O)R3、-S(O)2R3和-SR4；
-R1和-R2中的一个且仅一个选自-H、任选取代的烷基、任选取代的芳基烷基和任选取代的杂芳基烷基；
-R3选自由-H、任选取代的烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳基烷基、-OR9和-N(R9)2组成的组；
-R4选自由任选取代的烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳基烷基组成的组；
-R5各自独立地选自-H、任选取代的烷基、任选取代的烯基烷基、任选取代的炔基烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳基烷基组成的组；
-R9选自由-H和可选取代的烷基组成的组；
-Y-不存在，且-X-是-O-或-S-；或
-Y-是-N(Q)CH2-，且-X-是-O-；
Q选自任选取代的烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基和任选取代的杂芳基烷基组成的组；
任选的，-R1和-R2可以连接起来形成一个3至8元的环；以及
任选的，两个-R9与它们所连接的氮一起形成一个杂环。
其中-L1-被-L2-Z所取代，并且其中-L1-可任选进一步被取代。
仅在式(IV)的范围内，所用术语具有以下含义。
本文所用的术语″烷基″包括1至8个碳原子的直链、支链或环状饱和烃基，或在一些实施方案中为1至6个或1至4个碳原子。
术语″烷氧基″包括与氧结合的烷基，包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基、环丙氧基、环丁氧基等。
术语″烯基″包括具有碳-碳双键的非芳香族不饱和烃。
术语″炔烃″包括具有碳-碳叁键的非芳香族不饱和烃。
术语″芳基″包括6至18个碳，优选6至10个碳的芳香烃基，包括例如苯基、萘基和蒽基。术语″杂芳基″包括由3至15个碳组成的、含有至少一个N、O或S原子的芳香环，优选3至7个碳，含有至少一个N、O或S原子，包括例如吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、喹啉基、吲哚基、茚基等。
在某些情况下，烯基、炔基、芳基或杂芳基部分可以通过一个亚烷基连接与分子的其余部分偶联。在这些情况下，该取代基将被称为烯基烷基、炔基烷基、芳基烷基或杂芳基烷基，表明在烯基、炔基、芳基或杂芳基部分和烯基、炔基、芳基或杂芳基所偶联的分子之间有一个亚烷基部分。
术语″卤素″包括溴、氟、氯和碘。
术语″杂环″是指包含3至7个碳原子和至少一个N、O或S原子的4至8元芳族或非芳族环。例如，哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基、吡咯烷基和四氢呋喃基，以及上文为术语″杂芳基″提供的示例性基团。
当一个环系统被任选取代时，合适的取代基选自烷基、烯基、炔基或另外的环，各自任选进一步被取代。任何基团(包括上述基团)上的任选取代基包括卤素、硝基、氰基、-OR、-SR、-NR2、-OCOR、-NRCOR、-COOR、-CONR2、-SOR、-SO2R、-SONR2、-SO2NR2，其中R各自独立地是烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基，或两个R基团与它们所连接的原子一起形成一个环。
优选地，式(IV)的-L1-被一个部分-L2-Z所取代。
在某些实施方案中，-L1-具有如WO2013/036857A1中公开的结构。因此，在某些实施方案中，-L1-为式(V)：
Figure BDA0004113465820000821
其中
虚线表示通过-D的一个胺官能团与-D相连。
-R1选自任选取代的C1-C6直链、支链或环状烷基；任选取代的芳基；任选取代的杂芳基；烷氧基；和-NR5 2；
-R2选自-H；任选取代的C1-C6烷基；任选取代的芳基；以及任选取代的杂芳基；
-R3选自-H；任选取代的C1-C6烷基；任选取代的芳基；以及任选取代的杂芳基；
-R4选自-H；任选取代的C1-C6烷基；任选取代的芳基；以及任选取代的杂芳基；
-R5各自相互独立地选自-H；任选取代的C1-C6烷基；任选取代的芳基；和任选取代的杂芳基；或者当两个-R5合在一起时可以是环烷基或环杂烷基；
其中-L1-被-L2-Z所取代，并且其中-L1-可任选进一步被取代。
仅在式(V)的范围内，所用术语具有以下含义。
″烷基″、″烯基″和″炔基″包括1-8个碳或1-6个碳或1-4个碳的直链、支链或环状烃基，其中烷基是饱和烃，烯基包括一个或多个碳-碳双键，炔基包括一个或多个碳-碳叁键。除非另有规定，这些都含有1-6个C。
″芳基″包括6-18个碳，优选6-10个碳的芳香烃基，包括例如苯基、萘基和蒽基的基团。″杂芳基″包括包含3-15个碳的芳香环，含有至少一个N、O或S原子，优选3-7个碳原子，包括例如吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、喹啉基、吲哚基、茚基等。
术语″取代的″是指包含一个或多个取代基以取代一个或多个氢原子的烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基。取代基团一般可选自卤素，包括-F、-CI、-Br和-I；低级烷基，包括直链、支链和环状；低级卤代烷基，包括氟代烷基、氯代烷基、溴代烷基和碘代烷基；-OH；低级烷氧基，包括直链、支链和环状。-SH；低级烷硫基，包括直链、支链和环状；氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硅烷基，包括烷基硅烷基、烷氧基硅烷基和芳基硅烷基；硝基；氰基；羰基；羧酸、羧酸酯、羧酸酰胺；氨基羰基；氨基乙酰基；氨基甲酸酯；脲；硫代氨基甲酸酯；硫脲；酮；砜；磺酰胺；芳基包括苯基、萘基和蒽基；杂芳基包括5元杂芳基，包括吡咯、咪唑、呋喃、噻吩、噁唑、噻唑、异噁唑、异噻唑、噻二唑、三唑、噁二唑和四唑，6元杂环芳基，包括吡啶、嘧啶、吡嗪，以及稠合杂环芳基，包括苯并呋喃、苯并噻吩、苯并噁唑、苯并咪唑、吲哚、苯并噻唑、苯并异噁唑和苯并异噻唑。
在某些实施方案中，式(V)的-L1-被一个部分-L2-Z所取代。
在某些实施方案中，-L1-具有US7585837B2中公开的结构。因此，在某些实施方案中，-L1-为式(VI)：
Figure BDA0004113465820000841
其中
虚线表示通过-D的一个胺官能团与-D相连；
R1和R2独立地选自氢、烷基、烷氧基、烷氧基烷基、芳基、烷芳基、芳烷基、卤素、硝基、-SO3H、-SO2NHR5、氨基、铵、羧基、PO3H2和OPO3H2；
R3、R4和R5独立地选自氢、烷基和芳基；
其中-L1-被-L2-Z所取代，并且其中-L1-可任选进一步被取代。
式(VI)的合适取代基是烷基(如C1-6烷基)、烯基(如C2-6烯基)、炔基(如C2-6炔基)、芳基(如苯基)、杂烷基、杂烯基、杂炔基、杂芳基(如芳香族4至7元杂环)或卤素部分。
仅在式(VI)的范围内，所用术语具有以下含义。
术语″烷基″、″烷氧基″、″烷氧基烷基″、″芳基″、″烷芳基″和″芳烷基″是指1-8个，优选1-4个碳原子的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基和丁基，以及6-10个碳原子的芳基，例如苯基和萘基。术语″卤素″包括溴、氟、氯和碘。
在某些实施方案中，式(VI)的-L1-被一个部分-L2-Z所取代。
在某些实施方案中，-L1-具有如WO2002/089789A1中公开的结构。因此，在某些实施方案中，-L1-为式(VII)：
Figure BDA0004113465820000842
其中
虚线表示通过-D的一个胺官能团与-D相连；
Y1和Y2独立地为O、S或NR7；
R2、R3、R4、R5、R6和R7独立地选自氢、C1-6烷基、C3-12支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6杂烷氧基；
Ar是一个部分，当包含在式(VII)中时，形成一个多取代的芳香烃或一个多取代的杂环基；
X是化学键或主动运输到靶细胞的部分，一个疏水性部分，或其组合，
y为0或1；
其中-L1-被-L2-Z所取代，并且其中-L1-可任选进一步被取代。
仅在公式(VII)的上下文中，所使用的术语具有以下含义。
术语″烷基″应理解为包括例如直链、支链、取代的C1-12烷基，包括烷氧基、C3-8环烷基或取代的环烷基等。
术语″取代″应理解为包括添加或用一个或多个不同的原子代替官能团或化合物中包含的一个或多个原子。
被取代的烷基包括羧基烷基、氨基烷基、二烷基氨基、羟基烷基和巯基烷基；被取代的环烷基包括例如4-氯环己基等部分；芳基包括例如萘基等部分；取代的芳基包括例如3-溴苯基等部分。芳烷基包括例如甲苯基的部分；杂烷基包括例如乙基噻吩的部分；取代的杂烷基包括例如3-甲氧基噻吩的部分；烷氧基包括例如甲氧基的部分；以及苯氧基包括例如3-硝基苯氧基的部分。卤素应理解为包括氟、氯、碘和溴。
在某些实施方案中，式(VII)的-L1-被一个部分-L2-Z所取代。
在某些实施方案中，-L1-包括式(VIII)的子结构
Figure BDA0004113465820000851
其中
标有星号的虚线表示通过形成酰胺键连接到-D的一个氮上；
未标记的虚线表示与-L1-的剩余部分的连接；以及
其中-L1-被-L2-Z所取代，并且其中-L1-可任选进一步被取代。
在某些实施方案中，式(VIII)的-L1-被一个部分-L2-z所取代。
在某些实施方案中，式(VIII)的-L1-没有进一步被取代。
在某些实施方案中，-L1-包括式(IX)的子结构
Figure BDA0004113465820000861
其中
标有星号的虚线表示通过形成氨基甲酸酯键连接到-D的一个氮；
未标记的虚线表示与-L1-的剩余部分的连接；以及
其中-L1-被-L2-Z所取代，并且其中-L1-可任选进一步被取代。
在某些实施方案中，式(IX)的-L1-被一个部分-L2-Z所取代。
在某些实施方案中，式(IX)的-L1-没有被进一步取代。
在某些实施方案中，-L1-为式(IX-a)：
Figure BDA0004113465820000862
其中
标有星号的虚线表示与-D的氮的连接，未标的虚线表示与-L2-Z的连接；
n是0、1、2、3或4；
＝Y1选自＝O和＝S；
-Y2选自-O-和-S-；
-Y3选自-O-和-S-；
-Y4-选自-O-、-NR5-和-C(R6R6a)-；
＝Y5选自＝O和＝S；
-R3、-R5、-R6、-R6a相互独立地选自-H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2，2-二甲基丙基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基和3，3-二甲基丙基；
-R4选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2，2-二甲基丙基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基和3，3-二甲基丙基；
-W-选自C1-20烷基，其任选被一个或多个选自以下的基团中断：C3-10环烷基、8至30元的碳多环基、3至10元的杂环基、-C(O)N(R7)-、-O-、-S-和-N(R7)-；
-Nu选自-N(R7R7a)、-N(R7OH)、-N(R7)-N(R7aR7b)、-S(R7)、-COOH、
Figure BDA0004113465820000871
-Ar-选自以下基团
Figure BDA0004113465820000872
其中
虚线表示与-L1-的其余部分的连接，
-Z1-选自-O-、-S-和-N(R7)-，并且
-Z2-是-N(R7)-；并且
-R7、-R7a、-R7b相互独立地选自-H、C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基；
其中，-L1-可任选进一步被取代。
在某些实施方案中，-L1-为式(IX-a)，其中标有星号的虚线表示与-D的赖氨酸侧链或N-末端的胺的氮的连接。
在某些实施方案中，-L1-为式(IX-a)，其中标有星号的虚线表示与-D的赖氨酸侧链的胺的氮连接。
在某些实施方案中，-L1-为式(IX-a)，其中标有星号的虚线表示与-D的N-末端的胺的氮的连接。
在某些实施方案中，式(IX-a)的-L1-没有被进一步取代。
在某些实施方案中，-L1-为式(IX-b)：
Figure BDA0004113465820000881
其中
标有星号的虚线表示与-D的氮的连接，且未标记的虚线表示与-L2-Z的连接；
n是0、1、2、3或4；
＝Y1，选自＝O和＝S；
-Y2-，选自-O-和-S-；
-Y3-，选自-O-和-S-；
-Y4-选自-O-、-NR5-和-C(R6R6a)-；
＝Y5选自＝O和＝S；
-R2、-R3、-R5、-R6、-R6a相互独立地选自一H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2，2-二甲基丙基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基和3，3-二甲基丙基；
-R4选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2，2-二甲基丙基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基和3，3-二甲基丙基；
-W-选自C1-20烷基，其可任选被一个或多个选自以下的基团中断：C3-10环烷基、8至30元碳多环基、3至10元的杂环基、-C(O)-、-C(O)N(R7)-、-O-、-S-和-N(R7)-；
-Nu是一种亲核物，选自-N(R7R7a)、-N(R7OH)、-N(R7)-N(R7aR7b)、-S(R7)、-COOH、
Figure BDA0004113465820000891
Ar选自下组
Figure BDA0004113465820000892
其中
虚线表示与-L1-的其余部分的连接，
-Z1-选自-O-、-S-和-N(R7)-，并且
-Z2-是-N(R7)-；并且
-R7、-R7a、-R7b相互独立地选自-H、-C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基；
其中，-L1-可任选进一步被取代。
在某些实施方案中，-L1-为式(IX-b)，其中标有星号的虚线表示与-D的赖氨酸侧链或N-末端的胺的氮的连接。
在某些实施方案中，-L1-为式(IX-b)，其中标有星号的虚线表示与-D的赖氨酸侧链的胺的氮的连接。
在某些实施方案中，-L1-为式(IX-b)，其中标有星号的虚线表示与-D的N-末端胺的氮的连接。
在某些实施方案中，式(IX-b)的-L1-，没有被进一步取代。
在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的＝Y1是＝O。
在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-Y2-是-O-。
在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-Y3-是-O-。
在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-Y4-是-NR5-。
在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的＝Y5是＝O。
在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的n为0或1。在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的n为0。在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的n为1。
在某些实施方案中，式(IX-b)的-R2选自-H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。在某些实施方案中，式(IX-b)的-R2选自-H、甲基、乙基、正丙基和异丙基。在某些实施方案中，式(IX-b)的-R2选自-H、甲基和乙基。在某些实施方案中，式(IX-b)的-R2是-H。
在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R3选自-H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R3选自-H、甲基、乙基、正丙基和异丙基。在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R3选自-H、甲基和乙基。在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R3是-H。
在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R4各自独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R4选自甲基、乙基、正丙基和异丙基。在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R4选自甲基和乙基。
在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R5选自-H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R5选自-H、甲基、乙基、正丙基和异丙基。在某些实施方案中，式(IX-a)和(IXb)的-R5选自甲基和乙基。在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R5是甲基。
在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R6和-R6a独立地选自-H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R6和-R6a独立地选自-H、甲基、乙基、正丙基和异丙基。在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R6和-R6a独立地选自-H、甲基和乙基。在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R6和-R6a均为-H。
在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的Ar是苯基。在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的Ar是
Figure BDA0004113465820000911
其中虚线表示与式(IX-a)和(IX-b)的剩余部分的连接。
在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)中的W是C1-20烷基，其任选被C3-10环烷基、-C(O)-、-C(O)N(R7)-、-O-、-S-和-N(R7)-中断。在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的W是C1-10烷基，其任选被C3-10环烷基、-C(O)-、-C(O)N(R7)-、-O-、-S-和-N(R7)-中断。在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的w是C1-6烷基，其任选被C3-10环烷基、-C(O)-、-C(O)N(R7)-、-O-、-S-和-N(R7)-中断。在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的W是
Figure BDA0004113465820000912
其中
虚线分别表示与式(IX-a)或(IX-b)的剩余部分的连接。
在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-Nu是-N(R7R7a)。
在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R7、-R7a和-R7b相互独立地选自-H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R7、-R7a和-R7b相互独立地选自-H、甲基、乙基、正丙基和异丙基。在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R7、-R7a和-R7b相互独立地选自甲基或乙基。在某些实施方案中，式(IX-a)和(IX-b)的-R7、-R7a和-R7b均为甲基。
在某些实施方案中，-L1-为式(IX-c)
Figure BDA0004113465820000921
其中
标有星号的虚线表示与-D的氮的连接；
未标记的虚线表示与-L2-Z的连接；以及
s1是一个整数，选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
在某些实施方案中，-L1-为式(IX-c)，其中标有星号的虚线表示与-D的赖氨酸侧链或N-末端的胺的氮连接。
在某些实施方案中，-L1-为式(IX-c)，其中标有星号的虚线表示与-D的赖氨酸侧链的胺的氮连接。
在某些实施方案中，-L1-为式(IX-c)，其中标有星号的虚线表示与-D的N-末端的胺的氮连接。
在某些实施方案中，式(IX-c)的s1是选自1、2、3、4和5的整数。在某些实施方案中，式(IX-c)的s1是1。在某些实施方案中，式(IX-c)的s1是2。在某些实施方案中，式(IX-c)的s1是3。在某些实施方案中，式(IX-c)的s1是4。在某些实施方案中，式(IX-c)的s1是5。
在某些实施方案中，-L1-为式(IX-d)
Figure BDA0004113465820000922
其中
标有星号的虚线表示与-D的氮的连接；以及
未标记的虚线表示与-L2-Z连接。
在某些实施方案中，-L1-为式(IX-d)，其中标有星号的虚线表示与-D的赖氨酸侧链或N-末端的胺的氮连接。
在某些实施方案中，-L1-为式(IX-d)，其中标有星号的虚线表示与-D的赖氨酸侧链的胺的氮连接。
在某些实施方案中，-L1-为式(IX-d)，其中标有星号的虚线表示与-D的N-末端的胺的氮连接。
在某些实施方案中，-L1-具有如WO2020/206358 A1中所公开的结构。因此，在某些实施方案中，-L1-的部分为式(X)：
Figure BDA0004113465820000931
其中
未标记的虚线表示与-D连接；
标有星号的虚线表示与-L2-Z或-L2-Z’连接；
n是一个整数，选自0、1、2、3、4、5和6；
-R1和-R2独立地是吸电子基团、烷基或-H，并且其中-R1或-R2中至少有一个是吸电子基团；
-R4各自独立的是C1-C3烷基，或者两个-R4与它们所连接的碳原子一起形成一个3至6元环；以及
当-D是通过胺连接的药物部分时，-Y-不存在；或者当-D是通过酚、醇、硫醇、噻吩、咪唑或非碱性胺连接的药物部分时，-Y-是-N(R6)CH2；其中-R6是任选取代的C1-C6烷基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基。
在某些实施方案中，式(X)的n是选自1、2、3、4、5和6的整数。在某些实施方案中，式(X)的n是选自1、2和3的整数。在某些实施方案中，式(X)的n是选自0、1、2和3的整数。在某些实施方案中，式(X)的n是1。在某些实施方案中，式(X)的n是2。在某些实施方案中，式(X)的n是3。
在某些实施方案中，式(X)的-R1和-R2的吸电子基团选自下组：-CN；-NO2；任选取代的芳基；任选取代的杂芳基；任选取代的烯基；任选取代的炔基；-COR3、-SOR3或-SO2R3，其中-R3是-H、任选取代的烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳基烷基、-OR8或NR8 2，其中-R8各自独立的是-H或任选取代的烷基，或两个-R8基团与它们所连接的氮一起形成杂环；或-SR9，其中-R9是任选取代的烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳基烷基。
在某些实施方案中，式(X)的-R1和-R2的吸电子基团是-CN。在某些实施方案中，式(X)中的-R1和-R2的吸电子基团是-NO2。在某些实施方案中，式(X)中的-R1和-R2的吸电子基团是包含6至10个碳的任选取代的芳基。在某些实施方案中，式(X)中的-R1和-R2的吸电子基团是任选取代的苯基、萘基或蒽基。在某些实施方案中，式(X)的-R1和-R2的吸电子基团是任选取代的杂芳基，其包含3至7个碳并包含至少一个N、O或S原子。在某些实施方案中，式(X)的-R1和-R2的吸电子基团是任选取代的吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、喹啉基、吲哚基或茚基。在某些实施方案中，式(X)的-R1和-R2的吸电子基团是包含2至20个碳原子的任选取代的烯基。在某些实施方案中，式(X)的-R1和-R2的吸电子基团是含有2至20个碳原子的任选取代的炔烃。在某些实施方案中，式(X)的-R1和-R2的吸电子基团是-COR3、-SOR3或-SO2R3，其中-R3是-H、包含1至20个碳原子的任选取代的烷基、任选取代的芳基，任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基、任选取代的杂芳基烷基、-OR8或-NR8 2，其中-R8各自独立地是-H或包含1至20个碳原子的任选取代的烷基，或者两个-R8基团与它们所连接的氮一起形成杂环。在某些实施方案中，式(X)的-R1和-R2的吸电子基团是-SR9，其中-R9是包含1至20个碳原子的任选取代的烷基、任选取代的芳基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基或任选取代的杂芳基烷基。
在某些实施方案中，式(X)的-R1或-R2中的至少一个是-CN、-SOR3或-SO2R3。在某些实施方案中，式(X)的-R1和-R2中的至少一个是-CN或-SO2R3。在某些实施方案中，式(X)的-R1和-R2中的至少一个是-CN或-SO2R3，其中-R3是任选取代的烷基、任选取代的芳基，或-NR8 2。在某些实施方案中，式(X)的-R1和-R2中的至少一个是-CN、-SO2N(CH3)2、-SO2CH3、用-SO2取代的苯基、用-SO2和C1取代的苯基、-SO2N(CH2CH2)2O、-SO2CH(CH3)2、-SO2N(CH3)(CH2CH3)或-SO2N(CH2CH2OCH3)2。
在某些实施方案中，式(X)中的-R4各自独立地是C1-C3烷基。在某些实施方案中，-R4都是甲基。
在某些实施方案中，式(X)的-y-不存在。在某些实施方案中，式(X)的-y-是-N(R6)CH2。
在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为1，-R1为-CN，-R2为-H，且-R4为-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为1，-R1为SO2CH3，-R2为-H，且-R4为-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为1，-R1为-SO2N(CH2CH2)2CHCH3，-R2为-H，且-R4为-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为1，-R1为被-SO2取代的苯基，-R2为-H，且-R4为-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为1，-R1是被-SO2和-Cl取代的苯基，-R2是-H，且-R4是-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为1，-R1为-SO2N(CH2CH2)2O，-R2为-H，且-R4为-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为1，-R1为-SO2CH(CH3)2，-R2为-H，且-R4为-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为1，-R1为-SO2N(CH3)(CH2CH3)，-R2为-H，且-R4为-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为1，-R1为-SO2N(CH2CH2OCH3)2，-R2为-H，且-R4为-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为1，-R1是被-SO2和-CH3取代的苯基，-R2是-H，且-R4是-CH3。
在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为2，-R1为-CN，-R2为-H，且-R4为-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为2，-R1为-SO2N(CH3)2，-R2为-H，且-R4为-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为2，-R1为-SO2CH3，-R2为-H，且-R4为-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为2，-R1为-SO2N(CH2CH2)2CHCH3，-R2为-H，且-R4为-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为2，-R1是被-SO2取代的苯基，-R2是-H，且-R4是-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为2，-R1为被SO2和Cl取代的苯基，-R2为-H，且-R4为-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为2，-R1是-SO2N(CH2CH2)2O，-R2是-H，且-R4是-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为2，-R1为-SO2CH(CH3)2，-R2为-H，且-R4为-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为2，-R1为-SO2N(CH3)(CH2CH3)，-R2为-H，且-R4为-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为2，-R1为-SO2N(CH2CH2OCH3)2，-R2为-H，且-R4为-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为2，-R1是被-SO2和-CH3取代的苯基，-R2是-H，且-R4是-CH3。
在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为3，-R1为-CN，-R2为-H，且-R4为-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为3，-R1为-SO2N(CH3)2，-R2为-H，且-R4为-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为3，-R1为SO2CH3，-R2为-H，且-R4为-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为3，-R1为-SO2N(CH2CH2)2CHCH3，-R2为-H，且-R4为-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为3，-R1是被-SO2取代的苯基，-R2是-H，并且-R4是-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为3，-R1是被-SO2和-Cl取代的苯基，-R2是-H，且-R4是-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为3，-R1为-SO2N(CH2CH2)2O，-R2为-H，且-R4为-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为3，-R1为-SO2CH(CH3)2，-R2为-H，且-R4为-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为3，-R1为-SO2N(CH3)(CH2CH3)，-R2为-H，且-R4为-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为3，-R1为-SO2N(CH2CH2OCH3)2，-R2为-H，且-R4为-CH3。在某些实施方案中，-L1-为式(X)，其中n为3，-R1为被-SO2和-CH3取代的苯基，-R2为-H，且-R4为-CH3。
只有在式(X)的范围内，所使用的术语才有以下含义。
术语″烷基″是指1至20、1至12、1至8、1至6或1至4个碳原子的直链、支链或环状饱和烃基。在某些实施方案中，烷基是直链或支链的。直链或支链烷基的例子包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基和正癸基。在某些情况下，烷基是环状的。环状烷基的例子包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊二烯基和环己基。
术语″烷氧基″是指与氧结合的烷基，包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基、环丙氧基和环丁氧基。
术语″烯基″是指具有碳-碳双键和2至20、2至12、2至8、2至6或2至4个碳原子的非芳香族不饱和烃。
术语″炔烃″是指具有碳-碳叁键和2至20、2至12、2至8、2至6或2至4个碳原子的非芳香族不饱和烃。
术语″芳基″是指6至18个碳，优选6至10个碳的芳香烃基，包括例如苯基、萘基和蒽基。术语″杂芳基″是指包含3至15个碳且包含至少一个N、O或S原子的芳香环，优选3至7个碳且包含至少一个N、O或S原子，包括例如吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、喹啉基、吲哚基和茚基。
在某些实施方案中，烯基、炔基、芳基或杂芳基部分可以通过烷基连接与分子的其余部分相偶联。在这些情况下，该取代基将被称为烯基烷基、炔基烷基、芳基烷基或杂芳基烷基，表明在烯基、炔基、芳基或杂芳基和烯基、炔基、芳基或杂芳基所连接的分子之间有一个亚烷基部分。
术语″卤素″或″卤代″是指溴、氟、氯和碘。
术语″杂环″或″杂环基″是指包含至少一个N、O或S原子的3至15元芳香族或非芳香族环。例子包括哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基、吡咯烷和四氢呋喃基，以及上文为术语″杂芳基″提供的示例性基团。在某些实施方案中，杂环或杂环基是非芳香族。在某些实施方案中，杂环或杂环基是芳香族的。
术语″任选取代″是指一个基团可以是未取代的或被一次或多次(例如，1、2、3、4或5次)取代的取代基，这些取代基可以是相同的或不同的。取代基的例子包括烷基、烯基、炔基、卤素、-CN、-ORaa、-SRaa、-NRaaRbb、-NO2、-C＝NH(ORaa)、-C(O)Raa、-OC(O)Raa、-C(O)ORaa、-C(O)NRaaRbb、-OC(O)NRaaRbb、-NRaaC(O)Rbb、-NRaaC(O)ORbb、-S(O)Raa、-S(O)2Raa、-NRaaS(O)Rbb、-C(O)NRaaS(O)Rbb、-NRaaS(O)2Rbb、-C(O)NRaaS(O)2Rbb、-S(O)NRaaRbb、-S(O)2NRaaRbb、-P(O)(ORaa)(ORbb)、杂环基、杂芳基或芳基，其中烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、杂芳基和芳基各自独立地被-Rcc取代，其中-Raa和-Rbb各自独立地是-H、烷基、烯基、炔基、杂环基、杂芳基或芳基，或-Raa和-Rbb与它们连接的氮原子一起形成杂环基，该杂环基可任选被烷基、烯基、炔基、卤素、羟基、烷氧基或-CN取代，且其中-Rcc各自独立地是烷基、烯基、炔基、卤素、杂环基、杂芳基、芳基、-CN或-NO2。
在某些实施方案中，-L2-是一个化学键。在某些实施方案中，-L2是一个间隔基部分。
在某些实施方案中，-L2-选自-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry1)-、-S(O)2N(Ry1)-、-S(O)N(Ry1)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry1)S(O)2N(Ry1a)-、-S-、-N(Ry1)-、-OC(ORy1)(Ry1a)-、-N(Ry1)C(O)N(Ry1a)-、-OC(O)N(Ry1)-、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基；其中-T-、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基可以任选被一个或多个相同或不同的-Ry2所取代，并且其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基可任选被一个或多个选自以下的基团中断：-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry3)-、-S(O)2N(Ry3)-、-S(O)N(Ry3)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry3)S(O)2N(Ry3a)-、-S-、-N(Ry3)-、-OC(ORy3)(Ry3a)-、-N(Ry3)C(O)N(Ry3a)-和-OC(O)N(Ry3)-；
-Ry1和-Ry1a相互独立地选自-H、-T、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基。其中-T、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基可任选被一个或多个相同或不同的-Ry2取代，并且其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基可任选被一个或多个选自以下的基团中断：-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry4)-、-S(O)2N(Ry4)-、-S(O)N(Ry4)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry4)S(O)2N(Ry4a)-、-S-、-N(Ry4)-、-OC(ORy4)(Ry4a)-、-N(Ry4)C(O)N(Ry4a)-和-OC(O)N(Ry4)-；
T各自独立地选自下组：苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢萘基、C3-10环烷基、3-10元杂环基、8-11元杂二环基、8-30元碳多环基和8-30元杂多环基；其中T各自独立地被一个或多个相同或不同的-Ry2取代。
-Ry2各自独立地选自下组：卤素、-CN、氧代(＝O)、-COORy5、-ORy5、-C(O)Ry5、-C(O)N(Ry5Ry5a)、-S(O)2N(Ry5Ry5a)、-S(O)N(Ry5Ry5a)、-S(O)2Ry5、-S(O)Ry5、-N(Ry5)S(O)2N(Ry5aRy5b)、-SRy5、-N(Ry5Ry5a)、-NO2、-OC(O)Ry5、-N(Ry5)C(O)Ry5a、-N(Ry5)S(O)2Ry5a、-N(Ry5)S(O)Ry5a、-N(Ry5)C(O)ORy5a、-N(Ry5)C(O)N(Ry5aRy5b)、-OC(O)N(Ry5Ry5a)和C1-6烷基；其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；和
-Ry3、-Ry3a、-Ry4、-Ry4a、-Ry5、-Ry5a和-Ry5b各自独立地选自-H和C1-6烷基，其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代。
在某些实施方案中，-L2-选自-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry1)-、-S(O)2N(Ry1)-、-S(O)N(Ry1)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry1)S(O)2N(Ry1a)-、-S-、-N(Ry1)-、-OC(ORy1)(Ry1a)-、-N(Ry1)C(O)N(Ry1a)-、-OC(O)N(Ry1)-、C1-s0烷基、C2-50烯基和C2-50炔基。其中-T-、C1-20烷基、C2-20烯基和C2-20炔基任选被一个或多个相同或不同的-Ry2取代，并且其中C1-20烷基、C2-20烯基和C2-20炔基任选被一个或多个选自以下的基团中断：-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry3)-、-S(O)2N(Ry3)-、-S(O)N(Ry3)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry3)S(O)2N(Ry3a)-、-S-、-N(Ry3)-、-OC(ORy3)(Ry3ａ)-、-N(Ry3)C(O)N(Ry3a)-和-OC(O)N(Ry3)-；
-Ry1和-Ry1a相互独立地选自-H、-T、C1-10烷基、C2-10烯基和C2-10炔基。其中-T、C1-10烷基、C2-10烯基和C2-10炔基任选被一个或多个相同或不同的-Ry2取代，并且其中C1-10烷基、C2-10烯基和C2-10炔基任选被一个或多个选自以下的基团中断：-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry4)-、-S(O)2N(Ry4)-、-S(O)N(Ry4)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry4)S(O)2N(Ry4a)-、-S-、-N(Ry4)-、-OC(ORy4)(Ry4a)-、-N(Ry4)C(O)N(Ry4a)-和-OC(O)N(Ry4)-；
T各自独立地选自下组：苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢萘基、C3-10环烷基、3-10元杂环基、8-11元杂二环基、8-30元碳多环基和8-30元杂多环基；其中T各自独立地被一个或多个相同或不同的-Ry2取代；
-Ry2选自卤素、-CN、氧代(＝O)、-COORy5、-ORy5、-C(O)Ry5、-C(O)N(Ry5Ry5a)、-S(O)2N(Ry5Ry5a)、-S(O)N(Ry5Ry5a)、-S(O)2Ry5、-S(O)Ry5、-N(Ry5)S(O)2N(Ry5aRy5b)、-SRy5、-N(Ry5Ry5a)、-NO2、-OC(O)Ry5、-N(Ry5)C(O)Ry5a、-N(Ry5)S(O)2Ry5a、-N(Ry5)S(O)Ry5a、-N(Ry5)C(O)ORy5a、-N(Ry5)C(O)N(Ry5aRy5b)、-OC(O)N(Ry5Ry5a)和C1-6烷基；其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；以及
-Ry3、-Ry3a、-Ry4、-Ry4a、-Ry5、-Ry5a和-Ry5b各自相互独立地选自-H和C1-6烷基；其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同卤素取代。
在某些实施方案中，-L2-选自-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry1)-、-S(O)2N(Ry1)-、-S(O)N(Ry1)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry1)S(O)2N(Ry1a)-、-S-、-N(Ry1)-、-OC(ORy1)(Ry1x)-、-N(Ry1)C(O)N(Ry1x)-、-OC(O)N(Ry1)-、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基。其中-T-、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或多个相同或不同的Ry2取代，并且其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选被一个或多个选自以下的基团中断：-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry3)-、-S(O)2N(Ry3)-、-S(O)N(Ry3)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry3)S(O)2N(Ry3a)-、-S-、-N(Ry3)-、-OC(ORy3)(Ry3a)-、-N(Ry3)C(O)N(Ry3a)-和-OC(O)N(Ry3)-；
-Ry1和-Ry1a独立地选自-H、-T、C1-10烷基、C2-10烯基和C2-10炔基；
T各自独立地选自下组：苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢萘基、C3-10环烷基、3-10元杂环基、8-11元杂二环基、8-30元碳多环基和8-30元杂多环基；
-Ry2各自独立地选自卤素和C1-6烷基；以及
-Ry3、-Ry3a、-Ry4、-Ry4a、-Ry5、-Ry5a和-Ry5b各自相互独立地选自H和C1-6烷基；其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代。
在某些实施方案中，-L2-是C1-20烷基链，其任选被一个或多个独立选自-O-、-T-和-C(O)N(Ry1)-的基团中断；并且该C1-20烷基链任选被一个或多个独立选自-OH、-T和-C(O)N(Ry6Ry6a)的基团取代。其中-Ry1、-Ry6、-Ry6a独立地选自H和C1-4烷基，并且其中T选自苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢萘基、C3-10环烷基、3至10元杂环基、8至11元杂二环基、8至30元碳多环基和8至30元杂多环基。
在某些实施方案中，-L2-的分子量在14g/mol至750g/mol之间。
在某些实施方案中，-L2-包含一个选自下组的部分
Figure BDA0004113465820000991
Figure BDA0004113465820001001
其中
虚线表示分别与-L1-、-L2-的剩余部分或与-Z相连；以及
-R和-Ra相互独立地选自-H、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基。
在某些实施方案中，-L2-为式(IX-e)
Figure BDA0004113465820001002
其中
标有星号的虚线表示与-L1-连接；
未标记的虚线表示与-Z连接；以及
s2是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的整数。
在某些实施方案中，式(IX-e)的s2是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的整数。在某些实施方案中，式(IX-e)的s2是选自1、2、3、4、5、6、7和8的整数。在某些实施方案中，式(IX-e)的s2为1。在某些实施方案中，式(IX-e)的s2为2。在某些实施方案中，式(IX-e)的s2为3。在某些实施方案中，式(IX-e)的s2为4。在某些实施方案中，式(IX-e)的s2为5。在某些实施方案中，式(IX-e)的s2为6。在某些实施方案中，式(IX-e)的s2为7。在某些实施方案中，式(IX-e)的s2为8。
在某些实施方案中，分子-L1-L2为式(IX-f)：
Figure BDA0004113465820001011
其中
标有星号的虚线表示与-D的氮连接；
未标记的虚线表示与-Z的连接；
s1是一个整数，选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；以及
s2是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的整数。
在某些实施方案中，-L1-L2为式(IX-f)，其中标有星号的虚线表示与-D的赖氨酸侧链或N-末端的胺的氮连接。
在某些实施方案中，-L1-L2为式(IX-f)，其中标有星号的虚线表示与-D的赖氨酸侧链的胺的氮连接。
在某些实施方案中，-L1-L2为式(IX-f)，其中标有星号的虚线表示与-D的N-末端胺的氮连接。
因此，在式(IX-f)化合物中形成的部分-L1-和-D之间的连接是氨基甲酸酯。
在某些实施方案中，式(IX-f)的s1是选自1、2、3、4和5的整数。在某些实施方案中，式(IX-f)的s1是1。在某些实施方案中，式(IX-f)的s1是2。在某些实施方案中，式(IX-f)的s1是3。在某些实施方案中，式(IX-f)的s1是4。在某些实施方案中，式(IX-f)的s1是5。
在某些实施方案中，式(IX-f)的s2是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的整数。在某些实施方案中，式(IX-f)的s2是选自1、2、3、4、5、6、7和8的整数。在某些实施方案中，式(IX-f)的s2为1。在某些实施方案中，式(IX-f)的s2为2。在某些实施方案中，式(IX-f)的s2为3。在某些实施方案中，式(IX-f)的s2为4。在某些实施方案中，式(IX-f)的s2为5。在某些实施方案中，式(IX-f)的s2为6。在某些实施方案中，式(IX-f)的s2为7。在某些实施方案中，式(IX-f)的s2为8。
在某些实施方案中，式(IX-f)的s1是3，且式(IX-f)的s2是3。
在一个实施方案中，IL-2缀合物为式(Ia)。在某些实施方案中，x是1。在某些实施方案中，x是2。在某些实施方案中，x是3。在某些实施方案中，x是4。
在某些实施方案中，IL-2缀合物为式(Ib)。在某些实施方案中，y是2。在某些实施方案中，y是3。在某些实施方案中，y是4。
在某些实施方案中，部分-L1-L2-Z为式(XI)
Figure BDA0004113465820001021
其中，虚线表示与-D的氮连接；
s1是一个整数，选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
s2是一个整数，选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20；以及
p1、p2、p3、p4相互独立地是70至900的整数。
在某些实施方案中，-L1-L2-Z为式(XI)，其中虚线表示与-D的赖氨酸侧链或N-末端的胺的氮连接。
在某些实施方案中，-L1-L2-Z为式(XI)，其中虚线表示与-D的赖氨酸侧链的胺的氮连接。
在某些实施方案中，-L1-L2-Z为式(XI)，其中虚线表示与-D的N-末端的胺的氮连接。
因此，在式(XI)化合物中形成的部分-L1-和-D之间的连接是氨基甲酸酯。
在某些实施方案中，式(XI)的s1是选自1、2、3、4和5的整数。在某些实施方案中，式(XI)的s1为1。在某些实施方案中，式(XI)的s1为2。在某些实施方案中，式(XI)的s1为3。在某些实施方案中，式(XI)的s1为4。在某些实施方案中，式(XI)的s1为5。
在某些实施方案中，式(XI)的s2是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的整数。在某些实施方案中，式(XI)的s2是选自1、2、3、4、5、6、7和8的整数。在某些实施方案中，式(XI)的s2为1。在某些实施方案中，式(XI)的s2为2。在某些实施方案中，式(XI)的s2为3。在某些实施方案中，式(XI)的s2为4。在某些实施方案中，式(XI)的s2为5。在某些实施方案中，式(XI)的s2为6。在某些实施方案中，式(XI)的s2为7。在某些实施方案中，式(XI)的s2为8。
在某些实施方案中，式(XI)的s1是3，且式(xI)的s2是3。
在某些实施方案中，式(XI)的p1为115至680的整数。在某些实施方案中，式(XI)的p1是一个从115到560的整数。在某些实施方案中，式(XI)的p1是185至450的整数。在某些实施方案中，式(XI)的p1是一个从220到240的整数。在某些实施方案中，式(XI)的p1是约115。在某些实施方案中，式(XI)的p1是约160。在某些实施方案中，式(XI)的p1是约225。在某些实施方案中，式(XI)的p1是约270。在某些实施方案中，式(XI)的p1是约340。在某些实施方案中，式(XI)的p1是约450。在某些实施方案中，式(XI)的p1是约560。
在某些实施方案中，式(XI)的p2为115至680的整数。在某些实施方案中，式(XI)的p2是一个从115到560的整数。在某些实施方案中，式(XI)的p2是185至450的整数。在某些实施方案中，式(XI)的p2是从220到240的整数。在某些实施方案中，式(XI)的p2是约115。在某些实施方案中，式(XI)的p2是约160。在某些实施方案中，式(XI)的p2是约225。在某些实施方案中，式(XI)的p2是约270。在某些实施方案中，式(XI)的p2是约340。在某些实施方案中，式(XI)的p2是约450。在某些实施方案中，式(XI)的p2是约560。
在某些实施方案中，式(XI)的p3为115至680的整数。在某些实施方案中，式(XI)的p3是115至560的整数。在某些实施方案中，式(XI)的p3是185至450的整数。在某些实施方案中，式(XI)的p3是从220到240的整数。在某些实施方案中，式(XI)的p3是约115。在某些实施方案中，式(XI)的p3是约160。在某些实施方案中，式(XI)的p3是约225。在某些实施方案中，式(XI)的p3是约270。在某些实施方案中，式(XI)的p3是约340。在某些实施方案中，式(XI)的p3是约450。在某些实施方案中，式(XI)的p3是约560。
在某些实施方案中，式(XI)的p4为115至680的整数。在某些实施方案中，式(XI)的p4是115至560的整数。在某些实施方案中，式(XI)的p4是一个185到450的整数。在某些实施方案中，式(XI)的p4是220到240的整数。在某些实施方案中，式(XI)的p4是约115。在某些实施方案中，式(XI)的p4是约160。在某些实施方案中，式(XI)的p4是约225。在某些实施方案中，式(XI)的p4是约270。在某些实施方案中，式(XI)的p4是约340。在某些实施方案中，式(XI)的p4是约450。在某些实施方案中，式(XI)的p4约为560。
在某些实施方案中，式(XI)的p1、p2、p3和p4是相同的。在某些实施方案中，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，部分-L1-L2-Z为式(XI-a)
Figure BDA0004113465820001041
其中，虚线表示与-D的氮连接；以及
p1、p2、p3、p4相互独立地是70至900的整数。
在某些实施方案中，-L1-L2-Z为式(XI-a)，其中虚线表示与-D的赖氨酸侧链或N-末端的胺的氮连接。
在某些实施方案中，-L1-L2-Z为式(XI-a)，其中虚线表示与-D的赖氨酸侧链的胺的氮连接。
在某些实施方案中，-L1-L2-Z为式(XI-a)，其中虚线表示与-D的N-末端胺的氮连接。
因此，在式(XI-a)化合物中形成的部分-L1-和-D之间的连接是氨基甲酸酯。
在某些实施方案中，式(XI-a)的p1是从115到680的整数。在某些实施方案中，式(XI-a)的p1是从115到560的整数。在某些实施方案中，式(XI-a)的p1是从185到450的整数。在某些实施方案中，式(XI-a)的p1是从220到240的整数。在某些实施方案中，式(XI-a)的p1是约115。在某些实施方案中，式(XI-a)的p1是约160。在某些实施方案中，式(XI-a)的p1是约225。在某些实施方案中，式(XI-a)的p1是约270。在某些实施方案中，式(XI-a)的p1是约340。在某些实施方案中，式(XI-a)的p1是约450。在某些实施方案中，式(XI-a)的p1是约560。
在某些实施方案中，式(XI-a)的p2是从115到680的整数。在某些实施方案中，式(XI-a)的p2是从115到560的整数。在某些实施方案中，式(XI-a)的p2是从185到450的整数。在某些实施方案中，式(XI-a)的p2是从220到240的整数。在某些实施方案中，式(XI-a)的p2是约115。在某些实施方案中，式(XI-a)的p2是约160。在某些实施方案中，式(XI-a)的p2是约225。在某些实施方案中，式(XI-a)的p2是约270。在某些实施方案中，式(XI-a)的p2是约340。在某些实施方案中，式(XI-a)的p2是约450。在某些实施方案中，式(XI-a)的p2是约560。
在某些实施方案中，式(XI-a)的p3是从115到680的整数。在某些实施方案中，式(XI-a)的p3是从115到560的整数。在某些实施方案中，式(XI-a)的P3是从185到450的整数。在某些实施方案中，式(XI-a)的p3是从220到240的整数。在某些实施方案中，式(XI-a)的p3是约115。在某些实施方案中，式(XI-a)的p3是约160。在某些实施方案中，式(XI-a)的P3是约225。在某些实施方案中，式(XI-a)的P3是约270。在某些实施方案中，式(XI-a)的P3是约340。在某些实施方案中，式(XI-a)的P3是约450。在某些实施方案中，式(XI-a)的P3是约560。
在某些实施方案中，式(XI-a)的p4是从115到680的整数。在某些实施方案中，式(XI-a)的p4是从115到560的整数。在某些实施方案中，式(XI-a)的p4是从185到450的整数。在某些实施方案中，式(XI-a)的p4是从220到240的整数。在某些实施方案中，式(XI-a)的p4是约115。在某些实施方案中，式(XI-a)的p4是约160。在某些实施方案中，式(XI-a)的p4是约225。在某些实施方案中，式(XI-a)的p4是约270。在某些实施方案中，式(XI-a)的p4是约340。在某些实施方案中，式(XI-a)的p4是约450。在某些实施方案中，式(XI-a)的p4是约560。
在某些实施方案中，式(XI-a)的p1、p2、p3和p4是相同的。在某些实施方案中，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包括SEQ ID NO：14的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端伯胺或赖氨酸侧链残基的氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包括SEQ ID NO：14的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包括SEQ ID NO：14的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包括SEQ ID NO：14的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，b3是约100至125的整数，并且IL-2部分的式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端伯胺或赖氨酸侧链残基的氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包括SEQ ID NO：14的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包括SEQ ID NO：14的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：14的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：14的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：14的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：14的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：13的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：13的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包括SEQ ID NO：13的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包括SEQ ID NO：13的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包括SEQ ID NO：13的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包括SEQ ID NO：13的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个包含SEQ ID NO：13的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：13的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)分子与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个包含SEQ ID NO：13的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：13的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：22的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：22的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：22的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：22的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：22的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：22的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：22的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：22的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：22的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：22的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：23的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：23的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：23的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：23的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：23的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：23的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：23的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：23的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，包含SEQ ID NO：23的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：23的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：24的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：24的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：24的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：24的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：24的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：24的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：24的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：24的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：24的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：24的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包括SEQ ID NO：25的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包括SEQ ID NO：25的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包括SEQ ID NO：25的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包括SEQ ID NO：25的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包括SEQ ID NO：25的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包括SEQ ID NO：25的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：25的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：25的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：25的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：25的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：26的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：26的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：26的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：26的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：26的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：26的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：26，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包括SEQ ID NO：26的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：26，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：26的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：27的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：27的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：27的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：27的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：27的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：27的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：27，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：27的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
·至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：27的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
·至少一个包含SEQ ID NO：27的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：28的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：28的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：28的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：28的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：28的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：28的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：28的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：28，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：28的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：28，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：29的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：29的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：29的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：29的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：29的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：29的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：29的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：29的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：29的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：29的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：30的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：30的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：30的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：30的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：30的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：30的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：30的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：30的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：30的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：30的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：31的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：31的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：31的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：31的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：31的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：31的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：31的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：31的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：31的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：31的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：32的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：32的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：32的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：32的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：32的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：32的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：32，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：32的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：32，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：32的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：33的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：33的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：33的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：33的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：33的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：33的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个包含SEQ ID NO：33的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端伯胺的氮或赖氨酸侧链残基缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：33的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个包含SEQ ID NO：33的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：33的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：34的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：34的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：34的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：34的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：34的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：34的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：34，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：34的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：34，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：34的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：35的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：35的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：35的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：35的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：35的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包括SEQ ID NO：35的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：35的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：35的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：35的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：35的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：36的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：36的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：36的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：36的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：36的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：36的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：36，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：36，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：36，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：36，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：37的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：37的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：37的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：37的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：37的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：37的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：37，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：37，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：37，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：37，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，pl、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：38的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：38的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：38的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：38的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：38的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：38的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：38，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：38的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：38，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：38的IL-2部分的缀合物，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：39的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：39的IL-2部分，其中式(A-1a)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：39的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：39的IL-2部分，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：39的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是2，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包含SEQ ID NO：39的IL-2部分，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1是2，b2是3，且b3是约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。在某些实施方案中，b3约为112。在某些实施方案中，式(XI-a)的部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：39，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：39，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位的半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为2，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
在某些实施方案中，IL-2缀合物以混合物的形式存在，其中该混合物包括
(i)至少一个缀合物，其包含SEQ ID NO：39，其中式(A-1d)的Mmod部分与第38位半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间；和
(ii)至少一个包含SEQ ID NO：39，其中式(A-1e)的Mmod部分与第38位半胱氨酸的硫缀合，其中b1为2，b2为3，且b3为约100至125的整数，并且在IL-2部分式(XI-a)的部分与IL-2部分的N-末端或赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合，p1、p2、p3和p4在220至240之间。
在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的p1、p2、p3和p4约为112。在某些实施方案中，该混合物的每个缀合物中的式(XI-a)部分与IL-2部分的赖氨酸侧链残基的伯胺氮缀合。
本发明的另一方面是一种药物组合物，其包括至少一种式(I)的IL-2蛋白或至少一种包含本文所述的至少一种式(I)的IL-2蛋白的IL-2缀合物和至少一种赋形剂。在某些实施方案中，该药物组合物具有从pH3到pH8(且包含)的pH值范围。
在某些实施方案中，该药物组合物是一种液体制剂。在某些实施方案中，该药物组合物是一种干燥制剂。
该液体或干燥的药物组合物包含至少一种赋形剂。用于胃肠外制剂的赋形剂可分为，例如，缓冲剂、等渗性调节剂、防腐剂、稳定剂、抗吸附剂、氧化保护剂、粘附剂/粘度增强剂或其他辅助剂。然而，在某些情况下，一种赋形剂可能具有双重或三重功能。在某些实施方案中，本发明的药物组合物中包含的至少一种赋形剂选自包括以下的组
(i)缓冲剂：生理上可容忍的缓冲剂，以保持pH值在所需范围内，如磷酸钠、碳酸氢盐、琥珀酸盐、组氨酸盐、柠檬酸盐和乙酸盐、硫酸盐、硝酸盐、氯化物、丙酮酸盐；也可使用抗酸剂，如Mg(OH)2或ZnC03；
(ii)等渗性调节剂：使因注射部位的渗透压差异而导致的细胞损伤带来的疼痛最小化；
甘油和氯化钠就是例子；有效浓度可通过渗透压测定法确定，使用血清假设的渗透压为285-315mOsmol/kg；
(iii)防腐剂和/或抗菌剂：多剂量胃肠外制剂需要添加足够浓度的防腐剂，以尽量减少病人在注射时被感染的风险，且相应的监管要求已经确立；典型的防腐剂包括间甲酚、苯酚、羟苯甲酯、羟苯乙酯、羟苯丙酯、羟苯丁酯、氯丁醇、苯甲醇、硝酸苯汞、硫柳汞、山梨酸、山梨酸钾、苯甲酸、氯甲酚和苯扎氯铵；
(iv)稳定剂：稳定作用是通过加强蛋白质的稳定力，破坏变性状态的稳定，或通过辅料与蛋白质直接结合来实现；稳定剂可以是氨基酸，如丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸；糖类，如葡萄糖、蔗糖、海藻糖；多元醇，如甘油、甘露醇、山梨醇；盐类，如磷酸钾、硫酸钠；螯合剂，如EDTA、六磷酸盐；配体，如二价金属离子(锌、钙等)、其他盐类或有机分子，如酚类衍生物；此外，还可使用低聚物或聚合物，如环糊精、葡聚糖、树状聚物、PEG或PVP或鱼精蛋白或HSA；
(v)抗吸附剂：主要使用离子型或非离子型表面活性剂或其他蛋白质或可溶性聚合物来包覆或竞争性地吸附在制剂容器的内表面；例如泊洛沙姆(Pluronic F-68)、PEG十二烷基醚(Brij 35)、聚山梨酯20和80、葡聚糖、聚乙二醇、PEG-聚组氨酸、BSA和HSA以及明胶；赋形剂的选择浓度和类型取决于要避免的影响，但通常在界面上形成单层的表面活性剂，正好高于CMC值。
(vi)氧化保护剂：抗氧化剂，如抗坏血酸、依克多因(ectoine)、甲硫氨酸、谷胱甘肽、一硫代甘油、桑色素、聚乙烯亚胺(PEI)、没食子酸丙酯和维生素E；也可使用螯合剂，如柠檬酸、EDTA、六磷酸盐和巯基乙酸；
(vii)增粘剂或粘度增加剂：延缓颗粒在小瓶和注射器中的沉淀，用于促进颗粒的混合和再悬浮，使混悬液更容易注射(即注射器活塞上的力较小)；适当的增粘剂或粘度增加剂是，例如，卡波姆增粘剂，如Carbopol 940、Carbopol Ultrez 10，纤维素衍生物，如羟丙基甲基纤维素(hypromellose，HPMC)或二乙胺基乙基纤维素(DEAE或DEAE-C)，胶体硅酸镁(Veegum)或硅酸钠、羟基磷灰石凝胶、磷酸三钙凝胶、黄原胶、卡拉胶如Satia胶UTC30、脂肪族聚羟基酸，如聚(D，L-或L-乳酸)(PLA)和聚(乙醇酸)(PGA)及其共聚物(PLGA)，D，L-丙交酯、乙交酯和己内酯的三元共聚物、泊洛沙姆、亲水的聚氧乙烯嵌段和疏水的聚氧丙烯嵌段组成的聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯的三嵌段(如
Figure BDA0004113465820001441
)、聚醚酯共聚物，如聚对苯二甲酸乙二醇酯/聚对苯二甲酸丁二醇酯共聚物、乙酸蔗糖异丁酸酯(SAIB)、葡聚糖或其衍生物、葡聚糖和PEG的组合、聚二甲基硅氧烷、胶原蛋白、壳聚糖、聚乙烯醇(PVA)及其衍生物、聚烷基酰亚胺、聚(丙烯酰胺-二烯丙基二甲基铵共聚物(DADMA))、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、糖胺聚糖(GAGs)，如硫酸皮肤素、硫酸软骨素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素、透明质酸、由疏水性的A嵌段构成的ABA三嵌段或AB嵌段共聚物，如聚乳酸(PLA)或聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)，以及亲水性的B嵌段，如聚乙二醇(PEG)或聚乙烯吡咯烷酮；这种嵌段共聚物以及上述泊洛沙姆可表现出反向的热凝胶行为(在室温下呈流体状态，以便于施用，而在注射后体温下呈高于溶胶-凝胶转化温度的凝胶状态)；
(viii)铺展剂或扩散剂：通过水解间质空间中细胞外基质中的成分来改变结缔组织的渗透性，例如但不限于透明质酸，一种在结缔组织细胞间空间发现的多糖；铺展剂例如但不限于透明质酸酶，可暂时降低细胞外基质的粘度，促进注射药物的扩散；和
(ix)其他辅助剂：如润湿剂、粘度调节剂、抗生素、透明质酸酶；酸和碱例如盐酸和氢氧化钠是制备过程中调整pH值所必需的辅助剂。
另一个方面涉及式(I)的IL-2蛋白、包含至少一种式(I)的IL-2蛋白的IL-2缀合物或包含至少一种式(I)的IL-2蛋白的药物组合物或至少一种包含至少一种式(I)的IL-2蛋白的IL-2缀合物作为药物使用。
另一个方面涉及式(I)的IL-2蛋白，含有至少一种式(I)的IL-2蛋白的IL-2缀合物或至少一种式(I)的IL-2蛋白或含有至少一种式(I)的IL-2蛋白的至少一种IL-2缀合物的药物组合物，其用于治疗可以用IL-2治疗的疾病。
另一个方面涉及式(I)的IL-2蛋白，含有至少一种式(I)的IL-2蛋白的IL-2缀合物或至少一种式(I)的IL-2蛋白或含有至少一种式(I)的IL-2蛋白的至少一种IL-2缀合物的药物组合物，用于制备治疗可使用IL-2治疗的疾病的药物。
另一个方面涉及一种治疗、控制、延迟或预防需要治疗一种或多种可用IL-2治疗的疾病的哺乳动物患者(优选人类患者)的方法，包括步骤：向所述需要治疗的患者施用治疗有效量的式(I)的IL-2蛋白、含有至少一种式(I)的IL-2蛋白的IL-2缀合物或至少一种式(I)的IL-2蛋白或含有至少一种式(I)的IL-2蛋白的至少一种IL-2缀合物的药物组合物。
在某些实施方案中，可以用IL-2治疗的疾病是癌症。这种癌症可以选自液体肿瘤、固体肿瘤和淋巴瘤。
液体淋巴瘤可能是白血病或骨髓类肿瘤，如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、毛细胞白血病、淋巴细胞白血病、骨髓类白血病、浆细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生性肿瘤(MPN)、MPN后AML、MDS后AML、del(5q)相关的高风险MDS或AML、爆破期慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、慢性骨髓增生性疾病、浆细胞肿瘤和瓦尔登斯特罗姆巨球蛋白血症。
固体肿瘤或淋巴瘤选自下组：唇癌和口腔癌、口癌、肝癌/肝细胞癌、原发性肝癌、肺癌、淋巴瘤、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、皮肤癌、眼内黑色素瘤、转移性鳞状颈癌症伴隐匿原发灶、儿童多发性内分泌肿瘤综合症、蕈样真菌病、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口咽癌、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、肾上腺皮质癌、艾滋病相关恶性肿瘤、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、脑和神经系统癌、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、胃肠道类肿瘤、癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、胆囊癌、胃癌、妊娠滋养细胞瘤、头颈癌、下咽癌、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、肾癌/肾细胞癌、喉癌、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、肾盂输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、唾液腺癌、肉瘤、塞扎里综合征、小肠癌、泌尿生殖系统癌症、恶性胸腺瘤、甲状腺癌、威尔姆斯瘤、胆管癌，以及它们相关的早期异常细胞生长阶段，如发育异常、腺瘤和原位癌。
在某些实施方案中，该癌症是肝癌/肝细胞癌。在某些实施方案中，该癌症是肺癌。在某些实施方案中，该癌症是淋巴瘤。在某些实施方案中，该癌症是恶性胸腺瘤。在某些实施方案中，该癌症是皮肤癌。在某些实施方案中，该癌症是一种隐匿性原发的转移性鳞状颈癌。在某些实施方案中，该癌症是一种神经母细胞瘤。在某些实施方案中，该癌症是一种卵巢癌。在某些实施方案中，该癌症是胰腺癌。在某些实施方案中，该癌症是胆管癌。在某些实施方案中，该癌症是膀胱癌。在某些实施方案中，该癌症是脑和神经系统癌症。在某些实施方案中，该癌症是乳腺癌。在某些实施方案中，癌症是胃肠道类癌。在某些实施方案中，该癌症是一种癌瘤。在某些实施方案中，该癌症是结直肠癌。在某些实施方案中，该癌症是肝外胆管癌。在某些实施方案中，该癌症是胆囊癌。在某些实施方案中，该癌症是胃癌。在某些实施方案中，该癌症是头颈部癌症。在某些实施方案中，该癌症是肾癌/肾细胞癌。在某些实施方案中，该癌症是前列腺癌。在某些实施方案中，该癌症是一种肉瘤。在某些实施方案中，该癌症是小肠癌。在某些实施方案中，该癌症是一种泌尿生殖系统癌症。
肺癌的例子有非小细胞肺癌和小细胞肺癌。在某些实施方案中，癌症是非小细胞肺癌。在某些实施方案中，该癌症是小细胞肺癌。
淋巴瘤的例子有艾滋病相关淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、妊娠期霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、妊娠期非霍奇金淋巴瘤和血管免疫细胞淋巴瘤。
皮肤癌的例子是黑色素瘤和梅克尔细胞癌。在某些实施方案中，癌症是一种皮肤癌。在某些实施方案中，该癌症是梅克尔细胞癌。
例如，卵巢癌可以是上皮癌、生殖细胞肿瘤或低恶性潜在肿瘤。在某些实施方案中，癌症是一种上皮性癌症。在某些实施方案中，该癌症是生殖细胞肿瘤。在某些情况下，癌症是一种低恶性潜在肿瘤。
胰腺癌例如可以是外分泌肿瘤/腺癌、胰腺内分泌肿瘤(PET)或神经内分泌肿瘤(NET)。在某些实施方案中，该癌症是外分泌肿瘤/腺癌。在某些实施方案中，该肿瘤是胰腺内分泌肿瘤。在某些实施方案中，该癌症是一种神经内分泌肿瘤。
脑和神经系统癌症的例子是髓母细胞瘤，如儿童髓母细胞瘤、星形细胞瘤、室管膜瘤、神经外胚层肿瘤、许旺细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤和神经胶质瘤。在某些实施方案中，该癌症是髓母细胞瘤。在某些实施方案中，该癌症是儿童髓样细胞瘤。在某些实施方案中，该癌症是星形细胞瘤。在某些实施方案中，该癌症是室管膜瘤。在某些实施方案中，该癌症是神经外胚层肿瘤。在某些实施方案中，该肿瘤是许旺细胞瘤。在某些实施方案中，癌症是脑膜瘤。在某些实施方案中，该癌症是垂体腺瘤。在某些实施方案中，该癌症是神经胶质瘤。
星形细胞瘤可选自包括巨细胞胶质母细胞瘤、胶质母细胞瘤、继发性胶质母细胞瘤、原发性成人胶质母细胞瘤、原发性小儿胶质母细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突胶质细胞瘤、无弹性少突胶质细胞瘤、少突胶质细胞瘤。少突胶质细胞瘤、非弹性少突胶质细胞瘤、少突胶质细胞瘤、非弹性少突胶质细胞瘤、非弹性星形细胞瘤、柔毛星形细胞瘤、亚独立巨细胞星形细胞瘤、弥漫性星形细胞瘤、多形性黄质细胞瘤和小脑星形细胞瘤。
神经外胚层肿瘤的例子是松果体原发性神经外胚层瘤和脑膜上原发性神经外胚层瘤。
室管膜瘤可选自室管膜下瘤、室管膜瘤、粘液乳头状室管膜瘤和间变性室管膜瘤。
脑膜瘤可能是非典型脑膜瘤或退行性脑膜瘤。
神经胶质瘤可选自包括多形性胶质细胞瘤、副神经节瘤、幕上原始神经外胚叶瘤(sPNET)、脑干胶质瘤、儿童脑干胶质瘤、下丘脑和视觉通路胶质瘤、儿童下丘脑和视觉通路胶质瘤和恶性神经胶质瘤的组。
乳腺癌的例子有怀孕期间的乳腺癌、三阴性乳腺癌、原位导管癌(DCIS)、侵袭性导管癌(IDC)、乳腺管状癌、乳腺髓状癌、乳腺粘液癌。乳房乳头状癌、乳房楔形癌、浸润性小叶癌(ILC)、炎症性乳腺癌、小叶原位癌(LCIS)、男性乳腺癌、乳头的佩吉特氏病、乳房的植皮瘤和转移性乳腺癌。在某些实施方案中，该癌症是怀孕期间的乳腺癌。在某些实施方案中，该癌症是三阴性乳腺癌。在某些实施方案中，该癌症是原位导管癌。在某些实施方案中，该癌症是侵袭性导管癌。在某些实施方案中，该癌症是乳腺管状癌。在某些实施方案中，该癌症是乳腺髓样癌。在某些实施方案中，癌症是乳腺粘液性癌。在某些实施方案中，癌症是乳腺乳头状癌。在某些实施方案中，该癌症是乳腺楔形癌。在某些实施方案中，该癌症是浸润性小叶癌。在某些实施方案中，该癌症是炎症性乳腺癌。在某些实施例中，该癌症是小叶原位癌。在某些实施方案中，该癌症是男性乳腺癌。在某些实施方案中，癌症是乳头的佩吉特氏病。在某些实施方案中，该癌症是乳腺的植物性肿瘤。在某些实施方案中，该癌症是转移性乳腺癌。
癌症的例子有神经内分泌癌、肾上腺皮质癌和胰岛细胞癌。在某些情况下，癌症是神经内分泌癌。在某些实施方案中，该癌症是肾上腺皮质癌。在某些实施方案中，该癌症是胰岛细胞癌。
大肠癌的例子是结肠癌和直肠癌。在某些情况下，癌症是结肠癌。在某些情况下，癌症是直肠癌。
肉瘤可选自卡波西肉瘤、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、软组织肉瘤、尤文氏肿瘤/肉瘤家族、横纹肌肉瘤、腱鞘透明细胞肉瘤、中央软骨肉瘤、中央和骨膜软骨瘤、纤维肉瘤和子宫肉瘤。在某些实施方案中，癌症可以是卡波西肉瘤。在某些实施方案中，该癌症可以是骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤。在某些实施方案中，癌症可以是一种软组织肉瘤。在某些实施方案中，癌症可以是尤文氏家族的肿瘤/肉瘤。在某些实施方案中，该癌症可以是横纹肌肉瘤。在某些实施方案中，该癌症可以是腱鞘透明细胞肉瘤。在某些实施方案中，癌症可以是中央软骨肉瘤。在某些实施方案中，癌症可以是中央和骨膜软骨瘤。在某些实施方案中，该癌症可以是纤维肉瘤。在某些实施方案中，该癌症可以是子宫肉瘤。
泌尿生殖系统癌症的例子是睾丸癌、尿道癌、阴道癌、宫颈癌、阴茎癌和外阴癌。在某些情况下，癌症可以是睾丸癌。在某些情况下，癌症可以是尿道癌。在某些实施方案中，该癌症可以是阴道癌。在某些实施方案中，该癌症可以是宫颈癌。在某些实施方案中，该癌症可以是阴茎癌。在某些实施方案中，该癌症可以是阴道癌。
令人惊讶的是，本发明的IL-2在食蟹猴中导致了γδT细胞比基线更强的扩增，其剂量为最小化的嗜酸性粒细胞扩增，这导致耐受性良好。
在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白、IL-2缀合物或本发明的药物组合物导致γδT细胞的扩增，比基线至少增加100倍。在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白、IL-2缀合物或本发明的药物组合物导致γδT细胞的扩增，比基线至少增加150倍。在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白、IL-2缀合物或本发明的药物组合物使γδT细胞比基线至少扩大200倍。在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白、IL-2缀合物或本发明的药物组合物导致γδT细胞比基线至少扩大300倍。在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白、IL-2缀合物或本发明的药物组合物导致γδT细胞比基线至少扩大350倍。
在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白、IL-2缀合物或本发明的药物组合物导致γ9δ2 T细胞比基线至少扩大100倍。在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白、IL-2缀合物或本发明的药物组合物导致γ9δ2 T细胞比基线至少扩大150倍。在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白、IL-2缀合物或本发明的药物组合物导致γ9δ2 T细胞比基线至少扩大200倍。在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白、IL-2缀合物或本发明的药物组合物导致γ9δ2 T细胞比基线至少扩大300倍。在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白、IL-2缀合物或本发明的药物组合物导致γ9δ2 T细胞比基线至少扩大350倍。
在某些实施方案中，用式(I)的IL-2蛋白、IL-2缀合物或本发明的药物组合物的治疗可以在手术切除肿瘤或放射治疗之前、同时或之后开始。此外，这种治疗任选与至少一种其他癌症治疗方法相结合，如全身免疫治疗或局部肿瘤内免疫治疗或淋巴结内免疫治疗。至少一种癌症治疗方法，如全身免疫治疗的例子，如本文其他地方提供的一种或多种其他药物，在某些实施方案中可存在于本发明的药物组合物中。在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白、IL-2缀合物或本发明的药物组合物在与至少一种全身免疫疗法或局部肿瘤内免疫疗法或淋巴结内免疫疗法结合之前、同时或之后，在放疗或手术切除注射的肿瘤之前系统地给药。在某些实施方案中，本发明的式(I)的IL-2蛋白、IL-2缀合物或药物组合物在与至少一种全身免疫疗法或局部肿瘤内免疫疗法或淋巴结内免疫疗法结合之前、同时或之后，在放疗或手术切除注射肿瘤之前进行瘤内给药。在某些实施方案中，本发明的缀合物、其药学上可接受的盐或药物组合物在放疗或手术切除肿瘤后，在与至少一种全身免疫疗法或局部肿瘤内免疫疗法或淋巴结内免疫疗法结合之前、同时或之后进行瘤内给药。在某些实施方案中，本发明的式(I)的IL-2蛋白、IL-2缀合物或药物组合物在手术切除肿瘤或放疗之前、同时或之后被施用于肿瘤引流淋巴结中。在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白、IL-2缀合物或本发明的药物组合物在与至少一种全身免疫疗法或局部肿瘤内免疫疗法或淋巴结内免疫疗法结合之前、同时或之后，，并在手术切除肿瘤或放疗之前、同时或之后，进入肿瘤引流淋巴结中。在某些实施方案中，本发明的式(I)的IL-2蛋白、IL-2缀合物或药物组合物在原发肿瘤的手术切除或放疗之前或之后，被施用于肿瘤内的转移性肿瘤。在某些实施方案中，将式(I)的IL-2蛋白、IL-2缀合物或本发明的药物组合物瘤内给药，这些肿瘤可能在与至少一种全身免疫疗法或局部肿瘤内免疫疗法或淋巴结内免疫疗法结合之前、同时或之后出现，并且在原发肿瘤的手术切除或放射疗法之前、同时或之后出现。在某些实施方案中，在手术切除肿瘤或放疗之前，至少进行一种全身性治疗，然后对式(I)的IL-2蛋白、IL-2缀合物或本发明的药物组合物进行全身性给药或肿瘤内给药或淋巴结内给药。在某些实施方案中，首先对式(I)的IL-2蛋白、IL-2缀合物或本发明的药物组合物进行肿瘤内给药，随后与至少一种全身治疗或局部肿瘤内免疫治疗或淋巴结内免疫治疗相结合进行后续治疗。在某些实施方案中，在手术切除肿瘤之前，先施用至少一种全身治疗，然后全身施用式(I)的IL-2蛋白、IL-2缀合物或本发明的药物组合物，或向引流淋巴结或手术后的肿瘤床施用，或在未被手术切除的肿瘤中通过肿瘤内施用。
在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白、IL-2缀合物或本发明的药物组合物会引起表位扩散。表位扩散是有利的，因为它可能导致更强或更全面的免疫反应。特别是，表位扩散的产生和新激活的T细胞对具有不同特异性的新表位的扩增可能有助于产生重要的临床效益。例如，转移性病变可能与目标肿瘤共享一些表位，但在基因上仍与目标肿瘤不同，因此表位扩散可能有助于根除远处的转移瘤，这是基于目标肿瘤和转移瘤之间共享的初始免疫反应，然后扩散到远处转移瘤的独特表位，帮助免疫系统清除这些转移瘤。如果是癌症患者，则表位扩散与效力提高有关(Clin Cancer Res 2020；26：4442-7)。
在某些实施方案中，本发明的式(I)的IL-2蛋白、IL-2缀合物或药物组合物是在给予一种或多种其他药物之前、同时或之后给予患者的，所述一种或多种其他药物在某些实施方案中选自由模式识别受体激动剂(PRRA)组成的组。细胞毒/化疗药物、免疫检查点抑制剂或拮抗剂、免疫检查点激动剂、免疫激活受体激动剂、多特异性药物、抗体-药物缀合物(ADC)、抗体-佐剂缀合物(AAC)、放射性核素或定向放射性核素治疗剂、DNA损伤修复抑制剂、肿瘤代谢抑制剂、模式识别受体激动剂、蛋白激酶抑制剂。趋化因子和趋化物受体激动剂、趋化因子或趋化因子受体拮抗剂、细胞因子受体激动剂、死亡受体激动剂、CD47或SIRPα拮抗剂、溶瘤药物、信号转换蛋白、表观遗传修饰剂、肿瘤肽或肿瘤疫苗、热休克蛋白(HSP)抑制剂、蛋白裂解酶、泛素和蛋白酶体抑制剂、粘附分子拮抗剂。激素，包括激素肽和合成激素，以及采用细胞疗法，如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)疗法、嵌合抗原受体(CAR)疗法、T细胞疗法、自然杀伤(NK)细胞疗法、CAR-T疗法、CAR-NK疗法、CAR-γ8疗法、CAR-巨噬细胞疗法，或任何其他采用转基因或未经转基因的免疫细胞类型的细胞疗法。
所述一种或多种其他药物既可以是游离的或未修改的形式，也可以是缓释化合物的形式，即以一定的半衰期释放药物的形式，如半衰期为6小时至6个月。
PRRA可选自Toll样受体(TLR)激动剂、NOD样受体激动剂(NLR)、RIG-I样受体激动剂、细胞膜DNA传感器激动剂、STING激动剂和芳烃受体激动剂(AhR)组成的组。
在某些实施方案中，PRRA是Toll样受体激动剂，例如选自以下一组的Toll样受体激动剂：TLR1/2的激动剂，例如肽聚糖、脂蛋白、Pam3CSK4、Amplivant、SLP-AMPLIVANT、HESPECTA、ISA101和ISA201。TLR2的激动剂，如LAM-MS、LPS-PG、LTA-BS、LTA-SA、PGN-BS、PGN-EB、PGN-EK、PGN-SA、CL429、FSL-1、Pam2CSK4、Pam3CSK4、Zymosan、CBLB612、SV-283、ISA204、SMP105、单核细胞增生利斯特菌；TLR3的激动剂，如聚(A.U)、poly(I：C)(poly-ICLC)、rintatolimod、apoxxim、IPH3102、poly-ICR、PRV300、RGCL2、RGIC。1，Riboxxim(RGC100、RGIC100)、Riboxxol(RGIC50))、合成天然或修饰的双链RNA、合成天然或修饰的核酸低聚物和Riboxxon。TLR4的激动剂，如脂多糖(LPS)、新受体-3、葡萄糖脂质佐剂(GLA)、GLA-SE、G100、GLA-AF、临床中心参考内毒素(CCRE)、单磷脂A。草MATA MPL、PEPA10、ONT-10(PET-脂质A，oncothyreon)、G-305、ALD046、CRX527、CRX675(RC527、RC590)、GSK1795091、OM197MPAC、OM294DP、肿瘤靶向TLR4激动剂，以及SAR439794。TLR2/4的激动剂，如脂质A、OM174和PGN007；TLR5的激动剂，如flagellin、entolimod、mobilan、protean CBLB501。TLR6/2的激动剂，如二酰化脂蛋白、二酰化脂肽、FSL-1、MALP-2和CBLB613。TLR7的激动剂，如CL264、CL307、咪喹莫特(R837)、TMX-101、TMX-201、TMX-202、TMX302、gardiquimod、S-27609、851、UC-IV150、852A(3M-001，PF-04878691)，洛索里宾，聚脲酸，GSK2245035，GS-9620，RO6864018(ANA773，RG7795)，RO7020531，异托里宾，AN0331，ANA245。ANA971，ANA975，DSP0509，DSP3025(AZD8848)，GS986，MBS2，MBS5，RG7863(RO6870868)，sotirimod，SZU101，合成天然或改性单链RNA，合成核酸，合成天然或改性核酸寡聚物，肿瘤靶向TLR7激动剂，和TQA3334；TLR8的激动剂，如ssPolyUridine、ssRNA40、TL8-506、XG-1-236、VTX-2337(motolimod)、VTX-1463、VTX378、VTX763、DN1508052、SBT6050、合成的天然或改良的单链RNA、合成的核酸、合成的天然或改良的核酸寡聚物、肿瘤靶向TLR8激动剂和GS9688。TLR7/8的激动剂，如TransConTM TLR7/8激动剂、CL075、CL097、poly(dT)、瑞喹莫德(R-848、VML600、S28463)、MEDI9197(3M-052)、NKTR262、DV1001、IMO4200、IPH3201。合成天然或修饰的单链RNA、合成核酸、合成核酸低聚物、BDC-1001、其他肿瘤靶向TLR7/8激动剂和VTX1463。TLR9的激动剂，如CpG DNA、CpG ODN、lefitolimod(MGN1703)、SD-101、QbG10、CYT003、CYT003-QbG10、DUK-CpG-001。CPG-7909(PF-3512676)，GNKG168，EMD 1201081，IMO-2125，IMO-2055，CpG10104，AZD1419，AST008，IMO2134，MGN1706，IRS 954，1018ISS，actilon(CPG10101)，ATP00001，AVE0675，AVE7279，CMP001，DIMS0001，DIMS9022，DIMS9054，DIMS9059，DV230，DV281，EnanDIM，heplisav(V270)，kappaproct(DIMS0150)，NJP834，NPI503，SAR21609，合成天然或改性核酸寡聚物和tolamba，和TLR7/9的激动剂，如DV1179。
在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是TLR1/2的激动剂。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是TLR2的激动剂。在某些实施方案中，该一种或多种其他药物是TLR3的激动剂。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是TLR4的激动剂。在某些实施方案中，该一种或多种其他药物是TLR2/4的激动剂。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是TLR5的激动剂。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是TLR6/2的激动剂。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是TLR7的激动剂。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是TLR8的激动剂。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是TLR7/8的激动剂。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是TLR9的激动剂。
CpG ODN的例子有ODN 1585、ODN 2216、ODN 2336、ODN 1668、ODN 1826、ODN 2006、ODN 2007、ODN BW006、ODN D-SL01、ODN 2395、ODN M362和ODN D-SL03。
在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是瑞喹莫德。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是咪喹莫特。
在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是游离形式的瑞喹莫德。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是包含聚合物的缀合物，其中一个或多个式(A-i)的部分缀合
Figure BDA0004113465820001521
其中
虚线表示与聚合物的连接；以及
n是一个整数，选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
在某些实施方案中，与式(A-i)的一个或多个部分缀合的聚合物是水溶性聚合物。在某些实施方案中，这种水溶性聚合物是基于PEG的或基于透明质酸的聚合物。在某些实施方案中，该聚合物是一种基于PEG聚合物。在某些实施方案中，该聚合物是一种水凝胶，如基于PEG或基于透明质酸的水凝胶。在某些实施方案中，该水凝胶是一种基于PEG的水凝胶。在某些实施方案中，式(A-i)的n是1。在某些实施方案中，式(A-i)的n是2。在某些实施方案中，式(A-i)的n是3。在某些方案中，式(A-i)的n是4。
在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是包含基于PEG的水凝胶的缀合物，其中式(A-i)的多种部分与其缀合，其中式(A-i)中的n为2。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是来自WO2020/141221A1的化合物12或14，如分别在第217和219页所示，其在此通过参考纳入。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是来自WO2020/141221A1的化合物12，如第217页所示。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是WO2020/141221A1中的化合物14，如第219页所示。化合物12和14可以按WO2020/141221A1中公开的方法合成。
在某些实施方案中，PRRA是一种NOD样受体激动剂。如果一种或多种其他药物是NOD样受体激动剂，这种NOD样受体激动剂可选自NOD1激动剂，如C12-iE-DAP、C14-Tri-LAN-Gly、iE-DAP、iE-Lys和Tri-DAP；以及NOD2激动剂，如L18-MDP、MDP、M-TriLYS、莫拉丁酯和N-羟乙酰基-MDP。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是NOD1激动剂。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是NOD2激动剂。
在某些实施方案中，PRRA是一种RIG-I样受体激动剂。如果一种或多种其他药物是RIG-I样受体激动剂，这种RIG-I样受体激动剂可以选自3p-hpRNA、5'ppp-dsRNA、5’ppp RNA(M8)、5’OH RNA with kink(CBS-13-BPS)、5’Ppp SLR、KIN100、KIN 101、KIN1000、KIN1400、KIN1408、KIN1409、KIN1148、KIN131A、多聚(dA∶dT)、SB9200、RGT100和hiltonol。
在某些实施方案中，PRRA是一种细胞溶质DNA传感器激动剂。如果一种或多种其他药物是细胞溶质DNA传感器激动剂，这种细胞溶质DNA传感器激动剂可选自cGAS激动剂、dsDNA-EC、G3-YSD、HSV-60、ISD、ODN TTAGGG(A151)、多聚(dG∶dC)和VACV-70。
在某些实施方案中，PRRA是一种STING激动剂。如果一种或多种其他药物是STING激动剂，这种STING激动剂可选自MK-1454、ADU-S100(MIW815)、2’3’-cGAMP、3’3’-cGAMP、环式-
-AMP、环式-二-GMP、cAIMP(CL592)、cAIMP二氟(CL614)、cAIM(PS)2二氟(Rp/Sp)(CL656)、2’2’-cGAMP、2’3’-cGAM(PS)2(Rp/Sp)、氟化3’3’-cGAM、氟化环式-二-AMP、2’3`-环式--AMP、2’3’-环式--AM(PS)2(Rp，Rp)、氟化环式-二-GMP、2’3’-环式-二-GMP、环式--IMP、环式-二-UMP和DMXAA(vadimezan，ASA404)。在某些实施方案中，该一种或多种其他药物是MK-1454。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是ADU-S100(MIW815)。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是2′3′-cGAMP。
在某些实施方案中，PRRA是一种芳烃受体激动剂。如果一种或多种其他药物是芳烃受体(AhR)激动剂，这种AhR激动剂可以选自FICZ、ITE和L-犬尿氨酸。
在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是一种细胞毒/化疗剂。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是一种免疫检查点抑制剂或拮抗剂。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是一种免疫激活受体激动剂。在某些实施方案中，该一种或多种其他药物是一种多特异性药物。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是一种抗体-药物缀合物(ADC)。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是一种抗体-佐剂缀合物(AAC)。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是一种放射性核素或靶向放射性核素治疗剂。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是DNA损伤修复抑制剂。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是肿瘤代谢抑制剂。在某些实施方案中，该一种或多种其他药物是模式识别受体激动剂。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是蛋白激酶抑制剂。在某些实施方案中，该一种或多种其他药物是趋化因子和化学引诱物受体激动剂。在某些实施方案中，该一种或多种其他药物是趋化因子或趋化因子受体拮抗剂。在某些实施方案中，该一种或多种其他药物是细胞因子受体激动剂。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是死亡受体激动剂。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是CD47拮抗剂。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是SIRPα拮抗剂。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是一种溶瘤药物。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是一种信号转换蛋白。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是一种表观遗传修饰剂。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是肿瘤肽或肿瘤疫苗。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是一种热休克蛋白(HSP)抑制剂。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是一种蛋白水解酶。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是泛素和蛋白酶体抑制剂。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是一种粘附分子拮抗剂。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是一种激素，包括激素肽和合成激素。
细胞毒剂或化疗剂可选自以下：烷化剂、蒽环类药物、吡咯二氮杂环类药物、氮芥、铂剂、抗代谢剂、抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂、细胞毒性抗生素类、澳瑞他汀类、烯二炔类、lexitropsins、多卡米星类、环丙基吡咯并吲哚类、嘌呤霉素、多拉司他汀类、美坦辛衍生物、烷基磺酸盐类、三氮烯类和哌嗪。
烷化剂可选自以下：氮芥，如甲氧苄啶、环磷酰胺、美法仑、氯霉素、伊磷酰胺和布苏芬；亚硝基脲类，如N-亚硝基-N-甲基脲、卡莫司汀、洛莫司汀、塞莫司汀、福特莫司汀和链霉素。四嗪类药物，如达卡巴嗪、米托洛米德和替莫洛米德；乙烯胺类药物，如阿特拉坦；阿齐里德类药物，如硫替帕、丝裂霉素和迪亚兹醌；顺铂及其衍生物，如顺铂、卡铂、奥沙利铂；以及非经典烷化剂，如丙卡巴嗪和六甲基甲胺。
抗代谢物可选自以下：抗胆碱酯类，如甲氨蝶呤和培美曲塞；氟嘧啶类，如氟尿嘧啶和卡培他滨。脱氧核苷类似物，如阿糖胞苷、吉西他滨、地西他滨、阿扎胞苷、氟达拉滨、奈拉滨、克拉霉素、氯法拉滨和喷司他丁；以及硫嘌呤，如硫鸟嘌呤和巯基嘌呤。
抗微管剂可选自长春花生物碱，如长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛和长春氟宁；紫杉烷类药物，如紫杉醇和多西他赛；鬼臼毒素和衍生物，如鬼臼毒素、依托泊苷和替尼泊苷；均二苯乙烯苯酚和衍生物，如zybrestat(CA4P)；和BNC105组成的组。
拓扑异构酶抑制剂可选自拓扑异构酶I抑制剂，如伊立替康、拓扑替康和喜树碱；以及拓扑异构酶II抑制剂，如依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌、替尼泊苷、新生霉素、默巴隆和阿克拉比星。
在某些实施方案中，该一种或多种其他药物是多柔比星。
细胞毒性抗生素可选自包括蒽环类药物，如多柔比星、达诺比星、表柔比星和伊达鲁比星；吡拉比星、阿克拉比星、博莱霉素、丝裂霉素C、丝裂霉素、放线菌素、达托霉素、阿霉素、丝裂霉素和替拉帕胺。
澳瑞他汀可以选自由单甲基澳瑞他汀E(MMAE)和单甲基澳瑞他汀F(MMAF)组成的组。
烯二炔类药物可以选自新卡西诺丁、利达霉素(C-1027)、卡利卡霉素、埃斯培拉霉素、达那米星和戈尔高霉素A。
美坦辛衍生物可选自安沙美辛、mertansine(emtansine，DM1)和ravtansine(soravtansine，DM4)。
免疫检查点抑制剂或拮抗剂可选自由CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)的抑制剂，如伊匹单抗(ipilimumab)，tremelimumab，MK-1308，FPT155，PRS010，BMS-986249，BPI-002，CBT509，JS007，ONC392，TE1254，IBＩ310，BR02001，CG0161，KN044，PBＩ5D3H5，BCD145，ADU1604，AGEN1884，AGEN118l，CSl002和CP675206；PD-1(程序性死亡1)的抑制剂，如pembrolizumab、nivolumab、pidilizumab、AMP-224、BMS-936559、cemiplimab和PDR001；PD-L1(程序性细胞死亡蛋白1)的抑制剂，如MDX-1105、MEDI4736、阿特珠单抗、阿维单抗、BMS-936559和duvalumab；PD-L2(程序性死亡配体2)的抑制剂；KIR(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)的抑制剂，如lirlumab(IPH2102)和IPH2101；B7-H3的抑制剂，如MGA271；B7-H4的抑制剂，如FPA150；BTLA(B和T淋巴细胞衰减剂)的抑制剂；LAG3(淋巴细胞激活基因3)的抑制剂，如IMP21(依替拉莫德α)、relatlimab、MK-4280、AVA017、B1754111、ENUM006、GSK2831781、INCAGN2385、LAG3Ig、LAG525、REGN3767、Sym016、Sym022、TSR033、TSR075和XmAb22841；TIM-3(T细胞免疫球蛋白和含粘蛋白域-3)的抑制剂，如LY3321367、MBG453和TSR-022；VISTA(T细胞活化的V域Ig抑制剂)的抑制剂，如JNJ-61610588；ILT2/LILRB1(Ig样转录物2/白细胞Ig样受体1)的抑制剂；ILT3/LILRB4(Ig样转录物3/白细胞Ig样受体4)的抑制剂；ILT4/LILRB2(Ig样转录物4/白细胞Ig样受体2)的抑制剂，如MK-4830；TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)的抑制剂，如MK-7684、PTZ-201、RG6058和COM902；NKG2A的抑制剂，如IPH-2201；和PVRIG的抑制剂，如COM701。
CTLA-4抑制剂的一个例子是抗-CTLA4缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述缀合物包含多个抗-CTLA4部分-DcTLA4通过至少一个部分-L1-L2共价缀合到聚合物部分Z，其中-L1-与-DCTLA4共价且可逆地缀合，-L2-与Z共价缀合，其中-L1-是接头部分，-L2-是化学键或间隔基部分，其中部分-L1-、-L2-和Z如本文其他地方对本发明的缀合物所描述。在某些实施方案中-DCTLA4选自包括野生型Fc抗-CTLA4抗体、Fc增强的效应器功能/FcγR结合的抗-CTLA4抗体、在肿瘤微环境中具有条件活性的抗-CTLA4抗体、抗CTLA4小分子、CTLA4拮抗剂融合蛋白、抗-CTLA4抗运载蛋白、抗-CTLA4纳米抗体和基于抗体、scFVs或其他形式的抗-CTLA4多特异生物制剂。在某些实施方案中，-DCTLA4是伊匹单抗(ipilimumab)。在某些实施方案中，DCTLA4是替西木单抗(tremelimumab)。在某些实施方案中，抗-CTLA4缀合物具有以下结构：
Figure BDA0004113465820001561
其中
标有星号的虚线表示与-DCTLA4的胺官能团的氮连接，特别是与伊匹单抗(ipilimumab)的胺官能团的氮连接；以及
未标记的虚线表示与Z的连接，如水凝胶，特别是交联的透明质酸水凝胶。
可以理解的是，如果Z是水凝胶，例如交联透明质酸水凝胶，那么众多的部分-DCTLA4-L1-L2与Z连接。
在某些实施方案中，-DCTLA4特别是伊匹单抗(ipilimumab)的胺官能团的氮是赖氨酸残基的胺。在某些实施方案中，-DCTLA4特别是伊匹单抗(ipilimumab)的胺官能团的氮是N-末端胺。
在某些实施方案中，该一种或多种其他药物是上述CTLA4的抑制剂。
在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是PD-1或PD-L1的抑制剂。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是PD-1的抑制剂。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是PD-L1的抑制剂。在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是帕博利珠单抗(pembrolizumab)。
免疫激活受体激动剂可选自下组：CD27的激动剂，如重组CD70，如HERA-CD27L和伐立鲁单抗(varlilumab)(CDX-1127)；CD28激动剂，如重组CD80、重组CD86、TGN1412和FPT155；CD40激动剂，如重组CD40L、CP-870，893、达西组单抗(dacetuzumab)(SGN-40)、ChiLob 7/4、ADC-1013和CDX1140；4-1BB(CD137)激动剂，如重组4-1BBL、乌瑞芦单抗(urelumab)、乌托鲁单抗(utomilumab)和ATOR-1017；OX40激动剂，如重组OX40L、MEDI0562、GSK3174998、MOXR0916和PF-04548600；GITR激动剂，如重组GITRL、TRX518、MEDI1873、INCAGN01876、MK-1248、MK-4166、GWN323和BMS-986156；和ICOS激动剂，如重组ICOSL、JTX-2011和GSK3359609。
多特异性药物可选自生物制剂和小分子免疫检查点抑制剂。生物制剂的例子是多特异性免疫检查点抑制剂，例如CD137/HER2多特异性药物、PD-(L)1/LAG3拮抗剂(例如FS118、MGD013)、CTLA4/LAG3拮抗剂(例如XmAb22841)和CTLA4/PD-(L)1拮抗剂(例如XmAb20717、MGD019)；多特异性免疫激活受体激动剂、免疫细胞因子和多特异性免疫检查点激动剂。这种多特异性免疫检查点激动剂可选自包括Ig超家族激动剂，如ALPN-202、FPT155、TGN1412、GSK3359609、JTX-2011；TNF超家族激动剂，如FAP-4-1BBL(RG7826)、OX40-41BB(FS120)ATOR-1015、ATOR-1144、ALG.APV-527、脂质运载白蛋/PRS-343、PRS344/ONC0055、FAP-CD40 DARPin、MP0310DARPin、FAP-0X40 DARPin、EGFR-CD40 DARPin、EGFR41BB/CD137DARPin、EGFR-0X40/DARFPin、HER2-CD40 DARPin、HER2-41BB/CD137DARPin、HER2-0X40 DARPin、FIBRONECTIN ED-B-CD40 DARPin、FIBRONECTIN ED-B-41BB/CD137和FIBRONECTIN ED-B-0X40 DARPin；CD3多特异性激动剂，如博纳吐单抗(blinatumomab)、索利托单抗(solitomab)、MEDI-565、厄妥索单抗(ertumaxomab)、抗HER2/CD3、1Fab-immunoblobulin G TDB、GBR 1302、MGD009、MGD007、EGFRBi、EGFR-CD Probody、RG7802、PF-06863135、PF-06671008、AMG212/BAY2010112、CD3-5T4、XmAb14045、XmAb13676、XmAb18087、S80880、REGN1979、REGN5458、REGN4018、RG6026、莫妥珠单抗(Mosunetuzumab)、EM801、ERY974、RG6194、AMG420、AMG330、AMG 212、AMG 596、AMG 160、AMG 427、AMG 562、AMG673、AMG 701、AMG 757、AFM13、AMF24、AFM26、AFM11.TNB-486、TNB-383B、GEN3013、JNJ-63709178、JNJ-63898081、JNJ-64007957、JNJ-64407564、JNJ-67571244、AMV564、APVO414(MOR209、ES414)、APVO436、HPN424、HPN536、HPN217、HPN 328和其他多特异性CD3激动剂或T细胞受体(TCR)激动剂，包括靶向T细胞对肿瘤细胞抗原或病毒抗原或表达细胞活性的γδTCR激动剂；自然杀伤(NK)细胞受体多特异性激动剂，靶向激活的NK受体和目标肿瘤细胞抗原，如NKG2D多特异性激动剂、NKp30多特异性激动剂、NKp44多特异性激动剂、NKp46多特异性激动剂、NKp80多特异性激动剂、NKG2C多特异性激动剂、2B4(CD244)多特异性激动剂、CD32a多特异性激动剂、CD64多特异性激动剂、与肿瘤抗原以及激活受体如NKG2D或NKp30或上述其他NK受体结合以及与Fc受体如TriNKeTs结合的多特异性激动剂，以及CD16多特异性激动剂，如1633BiKE、161533TriKE、OXS-3550、OXS-C3550、AFM13和AFM24；以及其他能够结合目标抗原以及Fc受体(如CD16、CD32a、CD64)的治疗性抗体。
免疫激活受体激动剂的其他例子包括Dectin激动剂(Imprime PGG)、重组的NKG2D配体、γδTCR信号的配体或修饰剂，如抗BTN3A1 mAbs或抗BTN2A1 mAbs或Vγ9/Vδ2 TCR激活配体，如磷酸抗原和焦磷酸抗原，或增加内源性Vγ9/Vδ2配体的试剂，如双磷酸盐，如帕米膦酸钠和唑来膦酸钠。
小分子免疫检查点抑制剂的一个例子是CA-327(TIM3/PD-L1拮抗剂)。
该抗体-药物缀合物可选自包括靶向造血性癌症的ADC，如吉妥珠单抗奥佐米星、brentuximab vedotin、inotuzumab ozogamicin、SAR3419、BT062、SGN-CD19A、IMGN529、MDX-1203、polatuzumab vedotin(RG7596)、pinatuzumab vedotin(RG7593)、RG7598、milatuzumab-doxorubicin和OXS-1550；以及靶向实体瘤抗原的ADC，如曲妥珠单抗emtansine、glembatumomab vedotin、SAR56658、AMG-172、AMG-595、BAY-94-9343、BIIB015、vorsetuzumab mafodotin(SGN-75)、ABT-414、ASG-5ME、enfortumab vedotin(ASG-22ME)、ASG-16M8F、IMGN853、indusatumab vedotin(MLN-0264)、vadortuzumab vedotin(RG7450)、sofituzumab vedotin(RG7458)、lifastuzumab vedotin(RG7599)、RG7600、DEDN6526A(RG7636)、PSMA TTC、来自Progenics制药公司的1095、lorvotuzumab mertansine、lorvotuzumab emtansine、IMMU-130、sacituzumab govitecan(IMMU-132)，PF-06263507和MEDI0641。
抗体-佐剂缀合物可以是boltbody，如WO2018112108A1和WO2018009916A1中描述的boltbody。在某些实施方案中，boltbody选自BDC-1001和BDC-2034。在某些实施方案中，boltbody是BDC-1001。在某些实施方案中，boltbody是BDC-2034。
在某些实施方案中，boltbody具有式(BT-I)的结构
Figure BDA0004113465820001581
其中Ab是抗体部分；
A是抗体部分中未修改的氨基酸侧链或抗体部分中修改的氨基酸侧链；
Z是连接部分；
Adj是佐剂部分；以及
r是选自1至10的整数。
可以理解的是，式(BT-I)的部分Ab的r个氨基酸侧链与部分Adj-Z相连。
在某些实施方案中，式(BT-I)的A包含抗体部分中的一个氨基酸侧链，该侧链包含一个胺官能团。
在某些实施方案中，boltbody的结构为式(BT-II)
Figure BDA0004113465820001591
其中
Ab是一个抗体部分；
Figure BDA0004113465820001592
代表Ab的赖氨酸残基的侧链，其中未标记的虚线表示连接到Z，标记星号的虚线表示连接到赖氨酸残基的α碳；
Adj是佐剂部分；
r是选自1至10的整数；
且Z是一个具有乙二醇基团或甘氨酸残基的二价连接部分。
可以理解的是，式(BT-II)的部分
Figure BDA0004113465820001593
与式(BT-I)的A相对应。同样，可以理解的是，式(BT-II)的部分Ab的r个赖氨酸侧链部分与部分AdjZ相连。
在某些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)中的Z通过酰胺键、C-N单键、C-O单键或C-C单键与Adj结合，并通过酰胺键或C-N单键与Ab结合。
在某些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)的Z与Adj的氮基和Ab的氮基结合。在这样的实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)的Z通过酰胺键、C-N单键或其组合与相邻的氮基结合。
在一些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)的Z包含一个PEG部分。
在某些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)的Z包含至少2个乙二醇基团，如至少3个乙二醇基团，至少4个乙二醇基团，至少5个乙二醇基团，至少6个乙二醇基团，至少7个乙二醇基团，至少8个乙二醇基团，至少9个乙二醇基团，至少10个乙二醇基团，至少11个乙二醇基团，至少12个乙二醇基团，至少13个乙二醇基团，至少14个乙二醇基团，至少15个乙二醇基团，至少16个乙二醇基团，至少17个乙二醇基团，至少18个乙二醇基团，至少19个乙二醇基团，至少20个乙二醇基团，至少21个乙二醇基团，至少22个乙二醇基团，至少23个乙二醇基团，至少24个乙二醇基团，或至少25个乙二醇基团。
在某些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)的Z包含2个乙二醇基团、3个乙二醇基团、4个乙二醇基团、5个乙二醇基团、6个乙二醇基团、8个乙二醇基团、12个乙二醇基团、24个乙二醇基团或25个乙二醇基团。
在某些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)的Z包含一个甘氨酸残基。
在某些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)的Z包含至少2个甘氨酸残基，例如至少3个甘氨酸残基，至少4个甘氨酸残基，至少5个甘氨酸残基，至少6个甘氨酸残基，至少7个甘氨酸残基，至少8个甘氨酸残基，至少9个甘氨酸残基，至少10个甘氨酸复合物，至少11个甘氨酸复合物，至少12个甘氨酸复合物，至少13个甘氨酸残基，至少14个甘氨酸残基，至少15个甘氨酸残基，至少16个甘氨酸残基，至少17个甘氨酸残基，至少18个甘氨酸残基，至少19个甘氨酸残基，至少20个甘氨酸残基，至少21个甘氨酸残基，至少22个甘氨酸残基，至少23个甘氨酸残基，至少24个甘氨酸残基，或至少25个甘氨酸残基。
在某些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)的Z包含2个甘氨酸残基、3个甘氨酸残基、4个甘氨酸残基、5个甘氨酸残基、6个甘氨酸残基、8个甘氨酸残基、12个甘氨酸残基、24个甘氨酸残基、或25个甘氨酸残基。
在某些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)的Z进一步包含一个二价环己基
在某些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)中的Ab包括一个抗体结合域，其与选自以下的抗原结合：CDH1、CD19、CD20、CD29、CD30、CD38、CD40、CD47、CEA、EpCAM、MUC1、MUC16、EGFR、VEGF、HER2、SLAMF7、PDGFRa、gp75、CTLA4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、B7-H4、KIR、TNFRSF4、OX40L、IDO-1、IDO-2、CEACAM1、BTLA、TIM3、A2Ar、VISTA、CLEC4C(BDCA-2、DLEC、CD303、CLECSF7)、CLEC4D(MCL、CLECSF8)、CLEC4E(Mincle)、CLEC6A(Dectin-2)、CLEC5A(MDL-1、CLECSF5)、CLEC1B(CLEC-2)、CLEC9A(DNGR-1)和CLEC7A(Dectin-1)。
在某些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)的Ab包含与HER2结合的抗体结合域。在某些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)中的Ab包含与EGFR结合的抗体结合域。在某些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)的Ab包含与CCR8结合的抗体结合域。在某些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)的Ab包含与PD-L1结合的抗体结合域。在某些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)的Ab包含与CEA结合的抗体结合域。
在某些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)的Ab包含选自以下的抗体：帕博利珠单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、阿特珠单抗、阿维单抗、伊匹单抗(ipilimumab)、obinutuzumab、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、帕妥珠单抗、贝伐珠单抗、daratumumab、依那西普、olaratumab、elotuzumab、margetuximab及其生物仿制药。
在某些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)的Ab包括曲妥珠单抗。在某些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)的Ab包括帕博利珠单抗(pembrolizumab)。在某些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)中的Ab包括纳武单抗(nivolumab)。
在某些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)中的Adj包含PRRA。
在某些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)中的Adj是选自toll样受体(TLR)激动剂、c型凝集素受体(CLR)激动剂、NOD样受体(NLR)激动剂、Rig-I样受体(RLR)激动剂、干扰素刺激剂(STING)激动剂及其组合的PRRA。
在某些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)中的Adj是TLR激动剂，例如选自以下的TLR激动剂：TLR1激动剂、TLR2激动剂、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR9激动剂、TLR10激动剂、TLR11激动剂及其组合。
在某些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)中的Adj是选自CL264、CL401、CL413、CL419、CL553、CL572、Pam3CSK4和Pam2CSK4的TLR激动剂。
在某些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)中的Adj选自下组
Figure BDA0004113465820001611
Figure BDA0004113465820001621
以及
Figure BDA0004113465820001622
其中
-J各自独立地选自-H、-OR4和R4；
-R4各自独立地选自-H、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基和杂芳基烷基，其包含1、2、3、4、5、6、7或8个碳单元；
-Q-不存在或选自包含1、2、3、4、5、6、7或8个碳单元的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基和杂芳基烷基；以及
虚线表示与Z连接。
在某些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)中的Adj为式
Figure BDA0004113465820001623
其中
-J各自独立地选自-H、-OR4或-R4；
-R4各自独立地选自包含1、2、3、4、5、6、7或8个碳单元的-H、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基和杂芳基烷基；
-U-各自独立地是-CH-或-N-，其中至少一个-U-是-N-；
t各自独立地是选自1、2和3的整数；
-Q-不存在或选自包含1、2、3、4、5、6、7或8个碳单元的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基和杂芳基烷基，以及
虚线表示与Z连接。
在某些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)中的Adj选自下式
Figure BDA0004113465820001631
Figure BDA0004113465820001632
以及
Figure BDA0004113465820001633
其中，虚线表示与Z的连接。
在某些实施方案中，式(BT-I)和(BT-II)中的Adj选自WO2018112108A1的[118]至[136]段中公开的佐剂部分。
在某些实施方案中，boltbody包含一个以上不同的佐剂部分。
在某些实施方案中，该boltbody具有式(BT-VI)的结构
Figure BDA0004113465820001641
其中
Ab是一个抗体部分。
Figure BDA0004113465820001642
代表Ab的赖氨酸残基的侧链，其中未标记的虚线表示连接到Z，标记星号的虚线表示连接到赖氨酸残基的α碳；
r是选自1至10的整数；以及
Z是包含至少一个乙二醇基团或至少一个甘氨酸残基的二价连接部分。
在某些实施方案中，式(BT-VI)的Z与式(BT-I)和(BTII)的定义一样。
在某些实施方案中，boltbody具有式(BT-VII)的结构
Figure BDA0004113465820001643
其中
Ab是包含(i)抗原结合域和(ii)Fc域的抗体部分；
Adj是式(BT-IVb)的佐剂部分
Figure BDA0004113465820001651
其中
-R4选自包含1至8个碳的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基和杂芳基烷基；
-J各自是-H；
-U-各自是-N-；
t各自是2；
-Q-不存在；
虚线表示与G1连接；
-G1-是键；
a是选自1至40的整数；以及
r是选自1到10的整数。
在某些实施方案中，boltbody具有式(BT-VII)的结构
Figure BDA0004113465820001652
其中
Ab是曲妥珠单抗；
Adj是式(BT-IVb)的佐剂部分
Figure BDA0004113465820001661
其中
-R4是丁基；
-J各自是-H；
-U-各自是-N-；
t各自是2；
-Q-不存在；
虚线表示与-G1-连接；
-G1-是键；
a是选自1至40的整数；以及
r是选自1至4的整数。
在某些实施方案中，boltbody的结构为式(BT-VIII)
Figure BDA0004113465820001671
其中
r是选自1至10的整数；
n是选自约2至约25的整数；以及
Ab是抗体部分。
在某些实施方案中，式(BT-VIII)的r是l。在某些实施方案中，式(BT-VIII)的r是2。在某些实施方案中，式(BT-VIII)的r是3。在某些实施方案中，式(BT-VIII)的r是4。
在某些实施方案中，式(BT-VIII)的n是选自6、7、8、9、10、11和12的整数。在某些实施方案中，式(BT-VIII)的n是选自8、9、10、11和12的整数。在某些实施方案中，式(BT-VIII)的n是10。
在某些实施方案中，式(BT-VIII)的Ab包含与HER2、EGFR、PD-L1或CEA结合的抗原结合域。在某些实施方案中，式(BT-VIII)的抗体部分包括结合HER2的抗原结合域。在某些实施方案中，式(BT-VIII)的Ab包括结合EGFR的抗原结合域。在某些实施方案中，式(BT-VIII)的Ab包括结合PD-L1的抗原结合域。在某些实施方案中，式(BT-VIII)的Ab包括与CEA结合的抗原结合域。
只有在式(BT-IIIa)、(BT-IIIb)、(BT-IIIc)、(BT-IIId)、(BT-IVa)和(BT-IVb)的范围内，使用的术语才有以下含义：
术语″烷基″是指具有所示碳原子数的直链或支链、饱和脂肪族基团。烷基可包含任何数量的碳，如C1-2、C1-3、C1-4、C1-5、C1-6、C1-7、C1-8、C1-9、C1-10、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C3-4、C3-5、C3-6、C4-5、C4-6和C5-6。例如，C1-6烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基。烷基还可包括具有多达30个碳原子的烷基，如庚基、辛基、壬基、癸基。烷基可以是被取代的或未被取代的。″被取代的烷基″可以被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、氧代(＝O)、烷基氨基、氨基、酰基、硝基、氰基和烷氧基的基团取代。
术语″芳基″是指具有任何适当数量的环原子和任何适当数量的环的芳香族环系统。芳基可以包含任何适当数量的环原子，如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个环原子，以及6至10、6至12或6至14个环成员。芳基可以是单环的，也可以稠合成双环或三环基团，或者通过一个键连接成双芳基。代表性的芳基包括苯基、萘基和联苯基。其他芳基包括苄基，具有一个亚甲基连接基团。一些芳基有6至12个环成员，如苯基、萘基或联苯基。其他芳基有6至10个环成员，如苯基或萘基。
术语″碳环″是指含有3至12个环原子或所示原子数的饱和或部分不饱和、单环、稠合双环或桥连多环的环组件。碳环可包含任何数量的碳，如C3-6、C4-6、C5-6、C3-8、C4-8、C5-8、C6-8、C3-9、C3-10、C3-11和C3-50。饱和单环碳环包括，例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环辛基。饱和的双环和多环碳环包括，例如，降冰片烷、[2.2.2]双环辛烷、十氢萘和金刚烷。碳环基团也可以是部分不饱和的，环中有一个或多个双键或叁键。部分不饱和的代表性碳环基团包括但不限于环丁烯、环戊烯、环己烯、环己二烯(1，3-和l，4-异构体)、环庚烯、环庚二烯、环辛烯、环辛二烯(1，3-、1，4-和1，5-异构体)、降冰片烯和降冰片二烯。
术语″杂烷基″是指一个烷基，其中一个或多个碳原子被选自N、O和S的杂原子任选独立地代替。
术语″杂环″是指杂环烷基和杂芳基。″杂芳基″本身或作为另一个取代基的一部分，是指含有5至16个环原子的单环或稠合的双环或三环芳香环组合，其中1至5个环原子是杂原子，如N、O或S。另外的杂原子也可能是有用的，如B、Al、Si和P。杂原子可以被氧化，形成例如，如-S(O)-和-S(O)2-的部分。杂芳基可以包含任何数量的环原子，如3至6、4至6、5至6、3至8、4至8、5至8、6至8、3至9、3至10、3至11或3至12的环成员。任何合适数量的杂原子都可以包含在杂芳基中，例如1、2、3、4或5，或者1至2、1至3、l至4、l至5、2至3、2至4、2至5、3至4或3至5。杂芳基可以包括例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、四唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1，2，3-、1，2，4-和1，3，5异构体)、噻吩、呋喃、噻唑、异噻唑、噁唑和异噁唑。杂芳基也可以与芳香环系统(如苯环)稠合形成成员，如苯并吡咯，如吲哚和异吲哚；苯并吡啶，如喹啉和异喹啉；苯并吡嗪(喹喔啉)；苯并嘧啶(喹唑啉)；苯并哒嗪，如酞嗪和噌啉；苯并噻吩和苯并呋喃。其他杂芳基包括由键连接的杂芳基环，如双吡啶。杂芳基可以是被取代的或未被取代的。″被取代的杂芳基″基团可以被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、氧代(＝O)、烷基氨基、氨基、酰基、硝基、氰基和烷氧基的基团取代。杂芳基可以通过环上的任何位置连接。例如，吡咯包括1-、2-和3-吡咯，吡啶包括2-、3-和4-吡啶，咪唑包括1-、2-、4-和5-咪唑，吡唑包括1-、3-、4-和5-吡唑，三唑包括1-、4-和5-三唑，四唑包括1-和5-四唑，嘧啶包括2-、4-、5-和6-嘧啶，哒嗪包括3-和4-哒嗪，1，2，3-三嗪包括4-和5-三嗪，1，2，4-三嗪包括3-、5-和6-三嗪，1，3，5-三嗪包括2-三嗪，噻吩包括2-和3-噻吩，呋喃包括2-和3-呋喃，噻唑包括2-、4-和5-噻唑，异噻唑包括3-、4-和5-异噻唑，噁唑包括2-、4-和5-噁唑，异噁唑包括3-、4-和5-异噁唑，吲哚例如1-、2-和3-吲哚，异吲哚例如1-和2-异吲哚，喹啉例如2-、3-和4-喹啉，异喹啉例如1-、3-和4-异喹啉，喹唑啉例如2-和4-喹唑啉，噌啉例如3-和4-噌啉，苯并噻吩例如2-和3-苯并噻吩，以及苯并呋喃例如2-和3-苯并呋喃。
术语″杂环烷基″本身或作为另一个取代基的一部分，是指具有3至12个环成员和1至4个N、O和S杂原子的饱和环系统。其他杂原子也可能是有用的，如B、Al、Si和P。杂原子可以被氧化以形成部分，如-S(O)-和-S(O)2-。杂环烷基可以包含任何数量的环原子，例如，3至6、4至6、5至6、3至8、4至8、5至8、6至8、3至9、3至10、3至11或3至12个环成员。任何合适数量的杂原子都可以包含在杂环烷基中，例如1、2、3或4，或1至2、1至3、1至4、2至3、2至4或3至4。杂环烷基可以包括例如氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、环己亚胺、环庚亚胺、奎宁环、吡唑烷、咪唑烷、哌嗪(1，2-、1，3-和1，4-异构体)、环氧乙烷、氧杂环丁烷、四氢呋喃、环氧乙烷(四氢吡喃)、氧杂环庚、硫杂环丙烷、硫杂环丁烷、硫杂环戊烷(四氢噻吩)、硫杂环己烷(四氢噻喃)、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、二氧戊烷、二硫戊环、吗啉、硫代吗啉、二噁烷或二噻烷。杂环烷基也可以与芳香族或非芳香族环系统稠合，形成成员，如吲哚啉。杂环烷基可以是未被取代的或被取代的。″被取代的杂环烷基″可以被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、氧代(＝O)、烷基氨基、氨基、酰基、硝基、氰基和烷氧基的基团取代。杂环烷基可以通过环上的任何位置连接。例如，氮丙啶可以是1-或2-氮丙啶，氮杂环丁烷可以是1-或2-氮杂环丁烷，吡咯烷可以是1-、2-或3-吡咯烷，哌啶可以是1-、2-、3-或4-哌啶，吡唑烷可以是1-、2-、3-或4-吡唑烷，咪唑烷可以是1-、2-、3-或4-咪唑烷，哌嗪可以是1、2-。3-或4-哌嗪，四氢呋喃可以是1-或2-四氢呋喃，噁唑烷可以是2-、3-、4-或5-噁唑烷，异噁唑烷可以是2-、3-、4-或5-异噁唑烷，噻唑烷可以是2-、3-、4-或5-噻唑烷，异噻唑烷可以是2-、3-、4-或5-异噻唑烷，而吗啉可以是2-、3-或4-吗啉。
术语″芳基烷基″指的是烷基的任何芳基衍生物。在某些实施方案中，一个或多个芳基部分可以通过一个烷基连接与分子的其余部分相偶联。在这些情况下，该取代基将被称为芳基烷基，表明在芳基部分和芳基所偶联的分子之间有一个亚烷基部分。代表性的芳基烷基包括苯基甲基、苯基乙基、苯基丙基、苯基异丙基、苯基丁基、苯基仲丁基、苯基叔丁基、苯基戊基、苯基异戊基、苯基己基、萘基甲基、萘基乙基、萘基丙基、萘基异丙基、萘基丁基、萘基异丁基、萘基仲丁基、萘基叔丁基、萘基戊基、萘基异戊基、萘基己基、联苯甲基、联苯乙基、联苯丙基、联苯异丙基、联苯丁基、联苯异丁基、联苯仲丁基、联苯叔丁基、联苯戊基、联苯异戊基以及联苯己基，
术语″杂芳基烷基″是指一个芳基烷基，其中一个或多个碳原子被选自N、O和S的杂原子任选独立地代替。
在某些实施方案中，所述一种或多种其他药物是放射性核素，其中可选自下组：β-发射体，例如177镥、166钬、186铼、188铼、67铜、149钷、199金、77溴、153钐、105铑、89锶、90钇、131碘。α-发射体，如213铋、223镭、225锕、211砹；以及奥格电子发射体，如77溴、111铟、123碘和125碘。
靶向放射性核素治疗剂可选自以下一组：zevalin(90Y-替伊莫单抗tiuxetan)、bexxar(131I-托西莫单抗)、oncolym(131I-Lym 1)、lymphocide(90Y-依帕珠单抗)、cotara(131I-chTNT-1/B)、labetuzumab(90Yor131I-CEA)、theragyn(90Y-pemtumomab)、licartin(131I-metuximab)、radretumab(131I-L19)PAM4(90Y-clivatuzumab tetraxetan)、xofigo(223Ra dichloride)、lutathera(177Lu-DOTA-Tyr3-Octreotate)和131I-MIBG。
DNA损伤修复抑制剂可选自聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂，如奥拉帕里、鲁卡帕里、尼拉帕里、维利帕里、CEP 9722和E7016；CHK1/CHK2双重抑制剂，如AZD7762、V158411、CBP501和XL844；CHK1选择性抑制剂，如PF477736、MK8776/SCH900776、CCT244747、CCT245737、LY2603618、LY2606368/prexasertib、AB-IsoG、ARRY575、AZD7762、CBP93872、ESP01、GDC0425、SAR020106、SRA737、V158411和VER250840；CHK2抑制剂，例如CCT241533和PV1019；ATM抑制剂，如AZD0156、AZD1390、KU55933、M3541和SX-RDS1；ATR抑制剂，如AZD6738、BAY1895344、M4344和M6620(VX-970)；以及DNA-PK抑制剂，如M3814。
肿瘤代谢抑制剂可选自腺苷途径的抑制剂、色氨酸代谢的抑制剂和精氨酸途径的抑制剂。
腺苷途径的抑制剂的例子是A2AR(腺苷A2A受体)的抑制剂，如ATL-444、伊曲茶碱(KW-6002)、MSX-3、preladenant(SCH-420，814)、SCH-58261、SCH412，348、SCH-442，416、ST-1535、咖啡因、VER-6623、VER-6947、VER-7835、vipadenant(BIIB-014)、ZM-241，385、PBF-509和V81444；CD73的抑制剂，如IPH53和SRF373；以及CD39的抑制剂，如IPH52。
羟色胺代谢抑制剂的例子是IDO的抑制剂，如indoximod(NLG8189)、epacadostat、navoximod、BMS-986205和MK-7162；TDO的抑制剂，如680C91；以及IDO/TDO双重抑制剂。
精氨酸途径的抑制剂的例子是精氨酸酶的抑制剂，如INCB001158。
蛋白激酶抑制剂可选自受体酪氨酸激酶抑制剂、细胞内激酶抑制剂、细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂、磷酸肌肽-3激酶抑制剂、丝裂原激活蛋白激酶抑制剂、核因子κ-β激酶(IKK)抑制剂和Wee-1抑制剂。
受体酪氨酸激酶抑制剂的例子有EGF受体抑制剂，如阿法替尼、西妥昔单抗、厄洛替尼、吉非替尼、培妥珠单抗和麦妥昔单抗；VEGF受体抑制剂，如axitinib、lenvatinib、pegaptanib和linifanib(ABT-869)；C-KIT受体抑制剂，如CDX0158(KTN0158)；ERBB2(HER2)抑制剂，如赫赛汀(曲妥珠单抗)；ERBB3受体抑制剂，如CDX3379(MEDI3379、KTN3379)和AZD8931(sapitinib)；FGF受体抑制剂，如erdafitinib；AXL受体抑制剂，如BGB324(BGB324、R 428、R428、bemcentinib)和SLC391；以及MET受体抑制剂，如CGEN241。
细胞内激酶抑制剂的例子有布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)抑制剂，如ibrutinib、acalabrutinib、GS-4059、spebrutinib、BGB-3111、HM71224、zanubrutinib、ARQ531、BI-BTK1和vecabrutinib；脾脏酪氨酸激酶抑制剂，如fostamatinib；Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂，如伊马替尼和尼洛替尼；Janus激酶抑制剂，如芦可替尼、tofacitinib和fedratinib；以及多特异性酪氨酸激酶抑制剂，如bosutinib、crizotinib、卡博替尼、dasatinib、entrectinib、lapatinib、mubritinib、pazopanib、索拉非尼、suitinib、SU6656和vandetanib。
酪氨酸激酶抑制剂的一个例子是酪氨酸激酶抑制剂(″TKI″)缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述缀合物包含多个TKI部分-DTKI，其通过至少一个部分-L1-L2-共价缀合到聚合物部分Z，其中-L1-与DTKI共价且可逆地缀合，-L2-与Z共价缀合，且其中-L1-是接头部分，-L2-是化学键或间隔基部分，其中部分-L1-、-L2-和Z如本文中其他地方对本发明的缀合物所描述。在某些实施方案中，-DTKI选自受体酪氨酸激酶抑制剂、细胞内激酶抑制剂、细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂、磷酸肌肽-3激酶(PI3K)抑制剂、有丝分裂原活化蛋白激酶抑制剂、核因子κ-β激酶(IKK)抑制剂和Wee-1抑制剂。在某些实施方案中，-DTKI是axitinib。在某些实施方案中，-DTKI是仑伐替尼。在某些实施方案中，-DTKI是pegaptanib。在某些实施方案中，-DTKI是linifanib。
细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的例子是ribociclib、palbociclib、abemaciclib、trilaciclib、purvalanol A、olomucine II和MK-7965。
磷脂酰肌醇-3-激酶抑制剂的例子有IPI549、GDc-0326、pictilisib、serabelisib、IC-87114、AMG319、seletalisib、idealisib和CUDC907。
有丝分裂原活化蛋白激酶抑制剂的例子是Ras/法尼基转移酶抑制剂，如tipirafinib和LB42708；Raf抑制剂，如regorafenib、encorafenib、vemurafenib、dabrafenib、索拉非尼、PLX-4720、GDC-0879、AZ628、lifirafenib、PLX7904和RO5126766；MEK抑制剂，如cobimetinib、trametinib、binimetinib、selumetinib、pimasertib、refametinib和PD0325901；ERK抑制剂，如MK-8353、GDC-0994、ulixertinib和SCH772984。
核因子κ-β激酶(IKK)抑制剂的例子是BPI-003和AS602868。
Wee-1抑制剂的一个例子是adavosertib。
趋化因子受体和化学引诱物受体激动剂可选自CXC趋化因子受体、CC趋化因子受体、C趋化因子受体、CX3C趋化因子受体和化学引诱物受体。
CXC趋化因子受体可选自下组：CXCR1激动剂，如重组CXCL8和重组CXCL6；CXCR2激动剂，如重组CXCL8、重组CXCL1、重组CXCL2、重组CXCL3、重组CXCL5、重组CXCL6、MGTA145和SB251353；CXCR3激动剂，如重组CXCL9、重组CXCL10、重组CXCL11和重组CXCL4；CXCR4激动剂，如重组CXCL12、ATI2341、CTCE0214、CTCE0324和NNZ4921；CXCR5激动剂，如重组CXCL13；CXCR6激动剂，如重组CXCL16；和CXCL7激动剂，如重组CXCL11。
CC趋化因子受体可选自下组：CCR1激动剂，如重组CCL3、ECI301、重组CCL4、重组CCL5、重组CCL6、重组CCL8、重组CCL9/10、重组CCL14、重组CCL15、重组CCL16、重组CCL23、PB103、PB105和MPIF1；CCR2激动剂，如重组CCL2、重组CCL8、重组CCL16、PB103和PB105；CCR3激动剂，如重组CCL11、重组CCL26、重组CCL7、重组CCL13、重组CCL15、重组CCL24、重组CCL5、重组CCL28和重组CCL18；CCR4激动剂，如重组CCL3、ECI301、重组CCL5、重组CCL17和重组CCL22；CCR5激动剂，如重组CCL3、ECI301、重组CCL5、重组CCL8、重组CCL11、重组CCL13、重组CCL14、重组CCL16、PB103和PB105；CCR6激动剂，如重组CCL20；CCR7激动剂，如重组CCL19和重组CCL21；CCR8激动剂，如重组CCL1、重组CCL16、PB103和PB105；CCR9激动剂，如重组CCL25；CCR10激动剂，如重组CCL27和重组CCL28；和CCR11激动剂，如重组CCL19、重组CCL21和重组CCL25。
C趋化因子受体可以是XCR1激动剂，如重组XCL1或重组XCL2。
CX3C趋化因子受体可以是CX3CR1激动剂，如重组的CX3CL1。
化学引诱物受体可选自下组：甲酰肽受体激动剂，如N-甲酰肽、N-甲酰甲硫氨酸-亮氨酰-苯丙氨酸、恩夫韦肽、T21/DP107、膜联蛋白A1、Ac2-26和Ac9-25；C5a受体激动剂；和趋化因子样受体1激动剂，如Chemerin。
趋化因子拮抗剂可选自下组：CXCL趋化因子的抑制剂，如UNBS5162；CXCL8的抑制剂，如BMS986253和PA620；CXCL10的抑制剂，如TM110、埃迪鲁单抗(eldelumab)和NI0801；CXCL12的抑制剂，如NOX-A12和JVS100；CXCL13的抑制剂，如VX5；CCL2的抑制剂，如PA508、ABN912、AF2838、BN83250、BN83470、C243、CGEN54、CNT0888、NOXE36、VT224和SSR150106。CCL5的抑制剂，如HGS1025和N10701；CCL2/CCL5的抑制剂，如BKTP46；CCL5/FMLP受体的抑制剂，如RAP160；CCL11的抑制剂，如柏替木单抗(bertilimumab)和RAP701；CCL5/CXCL4的抑制剂，如CT2008和CT2009；CCL20的抑制剂，如GSK3050002；和CX3CL1的抑制剂，如奎莫利单抗(quetmolimab)。
趋化因子受体拮抗剂可选自下组：CXCR1的抑制剂，如瑞帕利辛、CCX832、FX68和KB03；CXCR2的抑制剂，如AZD5069、AZD5122、AZD8309、GSK1325756、GSK1325756H、PS291822、SB332235和SB656933。CXCR1/CXCR2的抑制剂，如DFl970、DF2156A、DF2162、DF2755A、瑞帕利辛、SX576、SX682、PACG31P、AZD4721和PA401；CXCR3的抑制剂；CXCR4的抑制剂，如BL8040；CXCR4/E-选择素的抑制剂，如GMI1359；CXCR6的抑制剂，如CCX5224；CCR1的抑制剂，如AZD4818、BAY865047、BMS817399、CCX354、CCX634、CCX9588、CP481715、MLN3701、MLN3897、PS031291、PS375179和PS386113；CCR2的抑制剂，如AZD2423、BL2030、BMS741672、CCX140、CCX598、CCX872、CCX915、CNTX6970、1NCB3284、1NCB3344、INCB8696、JNJ17166864、JNJ27141491、MK0812、OPLCCL2LPM、PF4136309、serocion、STIB0201、STIB0211、STIB022l、STIB0232、STIB0234、TAK202、TPI526；CCR2/CCR5的抑制剂，如PF04634817、RAP103和TBR652；CCR2/CCR5/CCR8的抑制剂，如RAP310；CCR3的抑制剂，如ASM8、AXP1275、BMS639623、CM101、DPC168、GW766994、GW824575、MT0814、OPLCCL11LPM和QAP642；CCR4的抑制剂，如AT008、AZD2098、CCX6239、FLX193、FLX475、GBV3019、GSK2239633、IC487892和莫格利珠单抗(poteligeo)；CCR5的抑制剂，如5P12-RANTES、AZD5672、AZD8566、CMPD167、ESN196、GSK706769、GW873140、HGS004、INCB15050、INCB9471、L872、杀微生物剂、PF232798、PRO140、RAP101、SAR113244、SCH350634、SCH351125、SCH417690、马拉维若、TAK779、TBR220、TD0232和VX286。CCR5/CXCR4的抑制剂，如AMD887、ND401和SP01A。CCR6的抑制剂，如CCX507、CCX9664和STIB100X；CCR6的抑制剂，如CCX025、CCX507、CCX807、eut22、MLN3126、POL7085、traficet-EN；CXCR3的抑制剂，如AMG487、AT010、STIA120X；CXCR4的抑制剂，如AD114、AD214、ALX0651、ALX40-4C、AMD070、AT007、AT009、BKT170、BMS936564、celixafor、CTCE9908、GBV4086、GSK812397、KRH2731，KRH3140、LY2510924、LY2624587、mozobil、OPLCXCL12LPM、PF06747143、POL6326、Q122、revixil、TG0054、USL311、X4P001和X4P002；以及CXCR7的抑制剂，如CCX650和CCX662。
细胞因子受体激动剂可选自包括编码IL-2、IL-15、IL-7、IL-10、IL-12、IL-21、IFNαIL-17、IFNβ、IFNγ、IL-18、IL-27、TNFα、GM-CSF、FLT3L、LTα、LTβ和TRAIL以及重组蛋白基因的mRNA、DNA或质粒，如IL-2/IL-15β/γ受体的激动剂、IL-10受体的激动剂、IL-12受体的激动剂、IL-18受体的激动剂、IL-21受体的激动剂、IL-7受体的激动剂、IFNα/β受体的激动剂、IFNγ受体的激动剂、FLT3受体的激动剂、GM-CSF受体的激动剂、LTα受体的激动剂、LTβ受体的激动剂和TNFα受体的激动剂。
IL-10受体激动剂的例子有AG011、dekavil、EG10、IL10Nanocap、Ilodecakin、AM0010、tenovil和VT310 VIRON。
IL-12受体激动剂的例子是重组IL-12p70、重组IL-12p35、AM0012、AS1409、dodekin、HemaMax、LipoVIL12、MSB0010360N、Ad-RTS-hIL-12、tavokinogenetelseplasmid、exoIL-12和NHS-IL12。
IL-18受体激动剂的例子是SB485232。
IL-21受体激动剂的例子是BMS982470(得尼考新)。
IL-7受体激动剂的例子是CYT107、CYT99007和GX-17。
FLT3R激动剂的例子是CDX-301。
TNFα受体激动剂的例子是L19-TNFα、aurimune、beromun、BreMel/TNFα、fibromun、refhot和TNFPEG20。
死亡受体激动剂可选自TRAILR1/DR4激动剂，例如AMG951(杜拉乐明)、APG350、APG880、HGSETR1(马帕木单抗)和SL231；以及TRAILR2/DR5激动剂，例如AMG655、DS8273、HGSETR2(来沙木单抗)、HGSTR2J、IDD004/GEN1029、INBRX109、LBY135、MEDI3039、PRO95780、RG7386和TAS266。
CD47拮抗剂可选自ALX148、CC-90002、Hu5F9G4、SRF231、T1061、TTI-621、TTI-622、AO176、IBI188、IMC002、重组SIRPα和LYN00301。
SIRPα拮抗剂的例子是FSI89或重组CD47。
溶瘤药物的例子是CAVATAK、BCG、mobilan、TG4010、Pexa-Vec(JX-594)、JX-900、JX-929和JX-970。
信号转换蛋白的例子是Fn14-TRAIL(KAHR101)、CD80-Fc(FTP155)、CTLA4-FasL(KAHR102)、PD1-41BBL(DSP105)、PD-L1-41BB(PRS-344、NM21-1480、FS222)、PD1-CD70(DSP106)和SIRPα-41BBL(DSP 107)。
表观遗传修饰物可选自DNA甲基转移酶抑制剂、赖氨酸特异性去甲基化酶1抑制剂、Zeste同系物2抑制剂、溴结构域和末端外基序(BET)蛋白抑制剂如GSK525762，以及组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂如beleodaq、SNDX275和CKD-M808。
肿瘤肽/疫苗的例子是NY-ESO、WT1、MART-1、IO102和PF-06753512、使用患者衍生肿瘤序列或新抗原的个性化癌症疫苗。
热休克蛋白(HSP)抑制剂的例子是HSP90抑制剂，例如PF-04929113(SNX-5422)。
蛋白水解酶的例子是重组透明质酸酶，例如rHuPH20和PEGPH20。
泛素和蛋白酶体抑制剂可选自泛素特异性蛋白酶(USP)抑制剂，如P005091；20S蛋白酶体抑制剂，如bortezimib、carfilzomib、ixazomib、oprosomib、delanzomib和celastrol；以及免疫蛋白酶抑制剂如ONX-0914。
粘附分子拮抗剂可选自β2-整合素拮抗剂和选择素拮抗剂。
激素可以选自激素受体激动剂和激素受体拮抗剂。
激素受体激动剂的例子是生长抑素受体激动剂，如生长抑素、兰瑞肽、奥曲肽、FX125L、FX141L和FX87L。
激素受体拮抗剂的例子是抗雄激素、抗雌激素和抗孕激素。抗雄激素的例子是甾体类抗雄激素，如醋酸环丙孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、螺内酯、奥森多龙和醋酸奥沙特龙。非甾体类抗雄激素，如氟他胺、比卡鲁胺、尼鲁米特、topilutamide、enzalutamide和apalutamide；雄激素合成抑制剂，如酮康唑、阿比特龙醋酸盐、seviteronel、氨鲁米特、非那雄胺、度他雄胺、爱普列特和alfatradiol。抗雌激素的例子有选择性雌激素受体调节剂(SERMs)，如他莫昔芬、氯米芬、法瑞司特和雷洛昔芬；ER沉默拮抗剂和选择性雌激素受体降解剂(SERD)，如氟维司群。芳香酶抑制剂，如阿那曲唑、来曲唑、依西美坦、伏洛唑、福美坦和法卓唑；以及抗促性腺激素，如睾酮、孕激素和GnRH类似物。抗孕激素的例子有米非司酮、利洛普司酮和奥那普司酮。
细胞疗法的例子包括CAR疗法，如tisagenlecleucel、axicabtagene ciloleucel、bb21217、LCAR-B38M、JCARH125、MCARH171、JNJ-4528、idecabtagene vicleucel(bb2121)、SCRI-CAR19x22；靶向肿瘤抗原的CAR疗法，如靶向CD19表达细胞的CAR疗法、靶向CD22表达细胞的CAR疗法、靶向BCMA表达细胞的CAR疗法、靶向HER2表达细胞的CAR疗法、靶向CD138表达细胞的CAR疗法、靶向CD133表达细胞的CAR疗法、靶向BCMA表达细胞的CAR疗法、靶向CEA表达细胞的CAR疗法、靶向Claudin18.2表达细胞的CAR疗法、靶向EGFR表达细胞的CAR疗法、靶向EGFRvIII表达细胞的CAR疗法、靶向Eph2A表达细胞的CAR疗法、靶向EpCAM表达细胞的CAR疗法、靶向GD2表达细胞的CAR疗法、靶向GPC3表达细胞的CAR疗法、靶向MSLN表达细胞的CAR疗法、靶向5T4表达细胞的CAR疗法、靶向LMP1表达细胞的CAR疗法、靶向PD-L1表达细胞的CAR疗法、靶向PSMA表达细胞的CAR疗法、靶向FRα表达细胞的CAR疗法、以及靶向MUC1表达细胞的CAR疗法。细胞疗法的例子包括TIL疗法、NK疗法、细胞因子诱导的记忆NK细胞疗法、用体外扩增细胞的NK细胞疗法。细胞疗法的例子包括用αβ或γδT细胞进行治疗，这些细胞可能被工程化为表达肿瘤抗原或肿瘤新抗原特异性T细胞受体，或在肿瘤抗原或肿瘤新抗原的背景下被扩增。
在某些实施方案中，式(I)的IL-2蛋白、IL-2缀合物或本发明的药物组合物与一种或多种其他药物一起引起表位扩散。表位扩散具有本文其他地方所述的优点。在某些实施方案中，所述其他药物是包含聚合物的缀合物，其中一个或多个式(A-i)的部分，如本文其他地方所述。
在某些实施方案中，患者是哺乳动物患者，如人类患者。
式(I)的IL-2蛋白、IL-2缀合物或本文所述的药物组合物的施用可通过外部应用、注射或输注进行，包括关节内、关节周围、皮内、皮下、肌肉内、静脉内、骨内、腹膜内、鞘内、囊内、眶内、玻璃体内、鼓室内、膀胱内、心内、经气管、表皮下、囊膜下、蛛网膜下、脊柱内、脑室内、胸骨内注射和输注，经由允许将本发明或类似物递送至脑组织或脑液(例如Ommaya贮库)的植入装置直接递送至脑，直接脑室内注射或输注，注射或输注入脑或脑相关区域，注射至脉络膜下空间，眶后注射和眼部滴注，优选通过皮下注射。在某些实施方案中，通过皮下注射施用。
在某些实施方案中，本发明的IL-2缀合物包括在哺乳动物系统中表达的式(I)的IL-2蛋白。
在某些实施方案中，包含在哺乳动物表达系统中表达的式(I)的IL-2蛋白的本发明的IL-2缀合物，在向食蟹猴施用后可表现出释放的IL-2蛋白在体内的药代动力学半衰期比相应的IL-2缀合物长至少1.1倍的时间(如至少1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍或2倍)，该缀合物包含具有式(I)的IL-2蛋白序列而没有N-末端丙氨酸的IL-2蛋白，其中没有N-末端丙氨酸的IL-2蛋白是在大肠杆菌表达系统中表达。
在某些实施方案中，包含在哺乳动物表达系统中表达的式(I)的IL-2蛋白的本发明的IL-2缀合物，在向食蟹猴施用后可表现出IL-2缀合物在体内的循环半衰期比相应的IL-2缀合物长至少1.1倍的时间，如至少1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍或2倍，该缀合物包含具有式(I)的IL-2蛋白序列而没有N-末端丙氨酸的IL-2蛋白，其中没有N-末端丙氨酸的IL-2蛋白在大肠杆菌表达系统中表达。
在某些实施方案中，与施用相应的包含具有式(I)的IL-2蛋白序列且没有N-末端丙氨酸的IL-2蛋白的IL-2缀合物相比，本发明的IL-2缀合物包含在哺乳动物表达系统中表达的式(I)的IL-2蛋白，在向食蟹猴施用后表现出至少一种选自下组的细胞类型的峰值或曲线下面积(AUC)值至少1.1倍的提高(例如至少1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍或2倍)：CD8+T细胞、记忆型(CD28+CD95+)CD8+T细胞、NK细胞、γδT细胞、CD8+T细胞内Ki67+细胞的百分比、记忆型(CD28+CD95+)CD8+T细胞内Ki67+细胞的百分比、NK细胞内Ki67+细胞的百分比和γδT细胞内Ki67+细胞的百分比，其中没有N-末端丙氨酸的IL-2蛋白是在大肠杆菌表达系统中表达。
在另一个方面，本发明涉及式(I-i)的IL-2蛋白序列
SEQ A-Cys*-SEQ B  (I-i)，
其中
SEQ A与SEQ ID NO：1有至少94％的序列同一性；
SEQ B与SEQ ID NO：2有至少94％的序列同一性；
Cys*是半胱氨酸残基。
SEQ A和SEQ B的具体实施方案与式(I)的IL-2蛋白公开的一样。
在某些实施方案中，式(I-i)的IL-2蛋白具有SEQ ID NO：21的序列。
在另一个方面，本发明涉及编码式(I-i)的IL-2蛋白的寡核苷酸序列。这种寡核苷酸的具体实施方案如本文其他地方对编码式(I)的IL-2蛋白的寡核苷酸的描述。
在另一个方面，本发明涉及一种包含一个或多个式(I-i)的IL-2蛋白的缀合物。这种包含一种或多种式(I-i)的IL-2蛋白的缀合物的具体实施方案如本文其他地方对包含一种或多种式(I)的IL-2蛋白的缀合物的描述。
在另一个方面，本发明涉及一种药物组合物，其包括至少一种式(I-i)的IL-2蛋白或至少一种包含一种或多种该式(I-i)的IL-2蛋白的IL-2缀合物和至少一种赋形剂。这种药物组合物的具体实施方案如本文其他地方所述，该药物组合物包含至少一种式(I)的IL-2蛋白或至少一种包含一种或多种式(I)的IL-2蛋白的IL-2缀合物。
另一个方面涉及式(I-i)的IL-2蛋白、包含至少一种式(I-i)的IL-2蛋白的IL-2缀合物或包含这种IL-2蛋白或IL-2缀合物的作为药物使用的药物组合物。
另一个方面涉及式(I-i)的IL-2蛋白，包含至少一种式(I-i)的IL-2蛋白的IL-2缀合物或包含这种IL-2蛋白或IL-2缀合物的药物组合物，其用于治疗可以用IL-2治疗的疾病。可以用IL-2治疗的疾病的具体实施方案如本文其他地方所述。
另一个方面涉及式(I-i)的IL-2蛋白，包含至少一种式(I-i)的IL-2蛋白的IL-2缀合物或包含这种IL-2蛋白或IL-2缀合物的药物组合物，其用于制备治疗可使用IL-2治疗的疾病的药物。可以用IL-2治疗的疾病的具体实施方案如本文其他地方所述。
另一个方面涉及在需要一种或多种可以用IL-2治疗的疾病治疗的哺乳动物患者(优选人类患者)中，治疗、控制、延迟或预防的方法，该方法包括向所述需要治疗的患者施用治疗有效量的式(I-i)的IL-2蛋白、包含至少一种式(I-i)的IL-2蛋白的IL-2缀合物或包含此类IL-2蛋白或IL-2缀合物的药物组合物的步骤。可以用IL-2治疗的疾病的具体实施方案如本文其他地方所述。
在某些实施方案中，式(I-i)的IL-2蛋白、包含至少一种式(I-i)的IL-2蛋白的IL-2缀合物或包含此类IL-2蛋白或IL-2缀合物的药物组合物在一种或多种其他药物的施用之前、同时或之后向患者施用。所述一种或多种其他药物的具体实施方案如本文其他地方所述。在某些实施方案中，IL-2具有SEQ ID NO：21的序列，而要给病人服用的一种其他药物是包含聚合物的缀合物，其中一个或多个式(A-i)的部分与其缀合，如本文其他地方所述。
在另一个方面，本发明涉及式(I-ii)的IL-2蛋白序列
X-SEQ A-Cys*-SEQ B  (I-ii）。
其中
SEQ A与SEQ ID NO：1有至少94％的序列同一性；
SEQ B与SEQ ID NO：2有至少94％的序列同一性；
X是选自精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸的氨基酸残基；以及
Cys*是一个半胱氨酸残基。
SEQ A和SEQ B的具体实施方案与式(I)的IL-2蛋白公开的一样。
在某些实施方案中，式(I-ii)的X是一个精氨酸残基。在某些实施方案中，式(I-ii)的X是天冬酰胺残基。在某些实施方案中，式(I-ii)的X是天冬氨酸残基。在某些实施方案中，式(I-ii)的X是半胱氨酸残基。在某些实施方案中，式(I-ii)的X是谷氨酰胺残基。在某些实施方案中，式(I-ii)的X是谷氨酸残基。在某些实施方案中，式(I-ii)的X是甘氨酸残基。在某些实施方案中，式(I-ii)的X是组氨酸残基。在某些实施方案中，式(I-ii)的X是异亮氨酸残基。在某些实施方案中，式(I-ii)的X是亮氨酸残基。在某些实施方案中，式(I-ii)的X是赖氨酸残基。在某些实施方案中，式(I-ii)的X是甲硫氨酸残基。在某些实施方案中，式(I-ii)的X是苯丙氨酸残基。在某些实施方案中，式(I-ii)的X是丝氨酸残基。在某些实施方案中，式(I-ii)的X是苏氨酸残基。在某些实施方案中，式(I-ii)的X是色氨酸残基。在某些实施方案中，式(I-ii)的X是酪氨酸残基。在某些实施方案中，式(I-ii)的X是缬氨酸残基。
在另一个方面，本发明涉及编码式(I-ii）的IL-2蛋白的寡核苷酸序列。这种寡核苷酸的具体实施方案与本文其他地方描述的编码式(I)的IL-2蛋白的寡核苷酸一样，不同的是式(I)的IL-2蛋白被式(I-ii）的IL-2蛋白代替。
在另一个方面，本发明涉及包含一个或多个式(I-ii)IL-2蛋白的缀合物。这种包含一种或多种式(I-ii)的IL-2蛋白的缀合物的具体实施方案与本文其他地方描述的包含一种或多种式(I)的IL-2蛋白的缀合物相同，不同的是式(I)的IL-2蛋白被式(I-ii)的IL-2蛋白代替。
在另一个方面，本发明涉及一种药物组合物，包括至少一种式(I-ii）的IL-2蛋白或至少一种包含一种或多种这样的式(I-ii）的IL-2蛋白的IL-2缀合物和至少一种赋形剂。这种药物组合物的具体实施方案与本文其他地方描述的药物组合物一样，包括至少一种式(I)的IL-2蛋白或至少一种包括一种或多种式(I)的IL-2蛋白的IL-2缀合物，不同的是式(I)的IL-2蛋白被式(I-ii)的IL-2蛋白代替。
另一个方面涉及式(I-ii)的IL-2蛋白，包含至少一种式(I-ii)的IL-2蛋白的IL-2缀合物或包含这种IL-2蛋白或IL-2缀合物的作为药物使用的药物组合物。
另一个方面涉及式(I-ii)的IL-2蛋白，包含至少一种式(I-ii)的IL-2蛋白的IL-2缀合物或包含这种IL-2蛋白或IL-2缀合物的药物组合物，用于治疗可以用IL-2治疗的疾病。可以用IL-2治疗的疾病的具体实施方案如本文其他地方所述。
另一个方面涉及式(I-ii)的IL-2蛋白，包含至少一种式(I-ii)的IL-2蛋白的IL-2缀合物或包含这种IL-2蛋白或IL-2缀合物的药物组合物，用于制备治疗可以用IL-2治疗的疾病的药物。可以用IL-2治疗的疾病的具体实施方案如本文其他地方所述。
另一个方面涉及在需要一种或多种可以用IL-2治疗的疾病治疗的哺乳动物患者(优选人类患者)中，治疗、控制、延迟或预防的方法，该方法包括向所述需要治疗的患者施用治疗有效量的式(I-ii)IL-2蛋白、包含至少一种式(I-ii)IL-2蛋白的IL-2缀合物或包含此类IL-2蛋白或IL-2缀合物的药物组合物的步骤。可以用IL-2治疗的疾病的具体实施方案如本文其他地方所述。
在某些实施方案中，式(I-ii)的IL-2蛋白、包含至少一种式(I-ii)的IL-2蛋白的IL-2缀合物或包含这种IL-2蛋白或IL-2缀合物的药物组合物在一种或多种其他药物的给药之前、同时或之后被给予患者。所述一种或多种其他药物的具体实施方案如本文其他地方所述。
材料和方法
材料
除另有说明外，所有的材料都是市售的。
蛋白质溶液的浓度测定是在Tecan Infinite M200上进行的，使用的是UV-cuvette micro(neoLAB)，条件如下：路径长度1em；吸光波长280nm；吸光波长带宽5nm；参考波长338nm；参考波长带宽25nm；闪烁次数25。浓度的计算是基于计算出的蛋白质分子量，不考虑糖基化或PEG化，并根据序列计算出消光系数。
5kDa PEG马来酰亚胺购自NOF Europe(Sunbright ME-050MA，CAS 883993-35-9，NOF Europe N.V.，Grobbendonk，比利时)，其结构为
Figure BDA0004113465820001801
其中n为100至125范围内的整数，平均分子量为5kDa。
5kDa PEG马来酰亚胺购自Jenkem Technology(M-Mal-5000，Jenkem TechnologyCo.，Beijing，China)，其结构为
Figure BDA0004113465820001802
其中n为100至125范围内的整数，平均分子量为5kDa。
10kDa PEG马来酰亚胺购自NOF Europe(Sunbright ME-100MA，CAS 883993-35-9，NOF Europe N.V.，Grobbendonk，比利时)，其结构为
Figure BDA0004113465820001803
其中n为200至250范围内的整数，平均分子量为10kDa。
30kDa PEG马来酰亚胺购自NOF Europe(Sunbright ME-300MA，CAS 883993-35-9，NOF Europe N.V.，Grobbendonk，比利时)，其结构为
Figure BDA0004113465820001811
其中n是650至700范围内的整数，平均分子量为30kDa。
实施例
实施例1：IL-2突变蛋白M1和Ala-M1在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达
编码IL-2突变蛋白M1(SEQ ID NO：16)和IL-2突变蛋白Ala-M1(SEQ ID NO：17)的DNA序列是通过氨基酸序列(M1＝不含N端丙氨酸的参考材料，SEQ ID NO：18；Ala-M1，SEQID NO：14)反译得到的。DNA序列是根据反翻译的氨基酸序列生成的，随后经过密码子优化，在毕赤酵母(Komagataellaphaffii)中表达。编码M1和Ala-M1的DNA是定制合成和克隆的。在这些克隆载体中，编码M1和Ala-M1的DNA序列两边是BspQ1限制性位点。
该表达载体含有G1-3启动子(葡萄糖诱导型)，AOX1 TT整合位点(单拷贝)，α交配因子信号序列(αMF)，仅用于克隆的lacZ片段，以及ZeocinTM抗性。为了在毕赤酵母中表达M1，将表达载体中含有αMF前导序列的线性约4440bp BspQI片段与克隆载体中的线性399bpBspQI消化片段连接，构建质粒pCSP1007(SEQ ID NO：19)。为了在毕赤酵母中表达Ala-M1，同样通过将表达载体的约4440bp BspQI片段与来自克隆载体的线性402bp BspQI消化片段连接构建质粒pCKP1036(SEQ ID NO：20)。随后，用连接混合物转化化学感受态的DH10B细胞。在质粒纯化和限制性消化分析后，通过测序确认了新生成的质粒中的感兴趣的基因，并用线性化的质粒pCSP1007或pCKP1036转化菌株LP2(CBS7435)，进行后续的多拷贝筛选。
用AscI对质粒pCSP1007和pCKP1036进行线性化处理后，用线性化的质粒转化LP2菌株，并将其接种到含有不同浓度ZeocinTM(Invitrogen)(500和1000μg/mL)的琼脂板上。在30℃下培养48小时后，每个宿主/质粒整合的11-12个克隆被挑选出来，并在含有100微克/毫升ZeocinTM的原始培养皿上进行菌种筛选，随后在24孔板上进行表达筛选。表达实验是在含有复合培养基的24孔板(GE Healthcare Life sciences)中进行的。将主培养物(2毫升)在30℃的YPG(酵母蛋白胨甘油)中接种到起始OD600为4，过夜培养。随后，将培养物在25℃和260转/分摇动下培养，并通过葡萄糖限制诱导48小时。
通过SDS PAGE和考马斯染色来检测培养上清液中的产物。SDS-PAGE是在还原条件下进行的。使用预制的Criterion 12％Bis-Tris SDS凝胶(Bio-Rad)和MES缓冲液(Bio-Rad)。样品与NuPAGE4x LDS加载缓冲液(Invitrogen)混合，在95℃下孵育5分钟。每个泳道加载20μL样品(30μL培养上清液，加上10μL 4x LDS加载缓冲液)。作为分子量标准，加载Mark12(Invitrogen)。作为参考，加载了从Abcam购买的2μg重组IL-2。用GelCode蓝色染色试剂(Thermo Scientific)染色1-2小时，并用水脱染过夜，使分离的蛋白质可视化。
产品的检测也是通过蛋白质印迹进行的。为此，SDS-PAGE是在还原条件下进行的。使用预制的Criterion 12％Bis-Tris SDS凝胶(Bio-Rad)和MES缓冲液(Bio-Rad)。样品与NuPAGE 4x LDS加载缓冲液混合，还原条件下(Invitrogen)，并在95℃孵育5分钟。每个泳道加载20μL样品(30μL培养上清液，加上10μL 4x LDS加载缓冲液)。作为分子量标准，加载SuperSignal增强分子量蛋白梯度(Thermo Scientific)。作为参考，加载从Abcam购买的0.5μg重组IL-2。电泳在200V电压下进行了约60分钟。使用Turboblot(Bio-Rad)将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜(Bio-Rad)，在25V电压下进行7分钟。随后，将蛋白质印迹在封闭缓冲液(TBS+5％奶粉(Merck))中孵育1小时。随后，将膜在一抗溶液(TBST+1.5％奶粉+0.1-0.2ug/ml兔抗IL-2抗体(AbCam))中孵育1小时。用MQ水洗3次、每次5分钟后，用二抗溶液(TBST+1.5％奶粉+1∶1000抗兔IgG-HRP(AbCam))孵育60分钟。洗涤后(在TBST中洗涤4次，每次5分钟)，然后用Lumi-Light底物溶液(罗氏LumiLight试剂盒)处理印迹，并用GeneGnome成像系统进行分析。
结果：在测试的M1克隆中，用SDS-PAGE/考马斯染色法可以确定培养上清液中没有或只有极少量的分泌的M1产物。使用抗IL-2的抗体对选定的样品进行蛋白质印迹分析，证实了M1产物在培养上清液中的存在。然而，在预期的分子量处只能检测到一个非常弱的条带，而除了弱的降解条带外，还可以看到明显的产品聚集。
与M1不同的是，含有Ala-M1的样本的蛋白质印迹显示了一条预期大小的条带，证实了Ala-M1的表达和分泌。还检测到一条表明二聚体形成的弱带。
实施例2：IL-2突变蛋白M1和IL-2突变蛋白Ala-M1在CHO中的表达
CHO K1宿主细胞在瞬时转染产品之前，在含有4mM谷氨酰胺(J.T Baker)和1％HT补充剂(Invitrogen)的CD CHO培养基(Invitrogen)中培养到PDL 30-100。CHO K1宿主细胞在WAVE袋中培养(36.5℃，pH 6.9-7.2，DO 40-100％)。
M1(SEQ ID NO：18)和Ala-M1(SEQ ID NO：14)的氨基酸序列经过反翻译和密码子优化，以便在CHO细胞中表达，每个序列与两个不同的N端分泌信号序列S1(SEQ ID NO：47)和S2(SEQ ID NO：48)结合。编码S1-M1、S2-M1、S1-Ala-M1和S2-Ala-M1的DNA序列被定制合成并克隆到人类巨细胞病毒(CMV)启动子下游的表达载体中。除了CMV启动子，该表达载体还含有胸苷激酶聚腺苷酸化信号(TK pA)、pUC复制原点和氨苄青霉素(bla)抗性基因。使用NucleoBondXtra Maxi Kit(Macherey Nagel)从Top10大肠杆菌细胞中最大限度地制备所得到的质粒(P1代表S1-M1，P2代表S2-M1，P3代表S1-Ala-M1，P4代表S2-Ala-M1)，以便在CHOK1细胞中瞬时表达。
瞬时转染是在摇瓶中进行的，将CHO K1宿主细胞与聚乙烯亚胺和质粒DNA混合。将6毫克DNA转染到每个1L细胞中，细胞数约为16x106/ml，DNA和PEI的质量比为1∶3。CHO K1宿主细胞在转染前96小时用CD CHO培养基灌注到WAVE袋中培养。使用Vi-CELL(BeckmanCoulter)对细胞密度进行计数。用BM003H培养基(WuXi Biologics)以1∶1的比例稀释固定体积的宿主细胞培养物。在转染前，通过预热的新鲜BM017H培养基将细胞密度调整到大约18x106cells/mi。稀释后的宿主细胞在使用前在摇床中培养(36.5℃，85％湿度，6％CO2，120rpm)。
将转染的细胞培养物放在Kuhner摇床中，在36.5℃，85％的湿度，6％的CO2，120rpm下培养4小时。加入补充剂，然后将转染的细胞培养物放在Kuhner摇床中，在31℃，85％湿度，6％CO2，120rpm下培养14天。根据细胞活力和VCD的情况，在转染后的第4天、第7天和第11天添加补充剂。在培养物中加入葡萄糖以保持葡萄糖水平＞2g/L。培养物在第14天或细胞存活率低于60％时收获。
通过蛋白质印迹检测产物。在转染后第14天收获培养物。将0.5毫升的细胞培养液在12,000g下离心30分钟，上清液保留用于蛋白质印迹分析。收集细胞沉淀并重新悬浮到0.5毫升PBS中，然后在4℃下用超声处理打碎。超声处理液以12,000g离心30分钟。收集超声处理液和离心分离的上清液用于蛋白质印迹分析。
将1μL细胞培养基上清液(CMS)、细胞超声裂解上清液(CLS)和细胞超声裂解总物质(CLT)的样品加入10μL2X还原LDS样品缓冲液(Invitrogen)。将还原后的混合物在95℃下加热5分钟。所有被还原的样品被加载到预制的NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上。SDS-PAGE在180V的恒定电压下运行40分钟。样品从SDS-PAGE转移到PVDF膜上。转移过程在25V和1.3A下进行7分钟。PVDF膜用封闭缓冲液(Bio-Rad)孵育30分钟。封闭处理后，PVDF膜在室温下与一抗(在鸡体内产生的抗IL-2抗体，Sigma)孵育2小时。用TBST清洗PVDF膜3次，每次5分钟。之后，将PVDF膜与二抗(山羊抗鸡IgY(H+L)二抗，HRP，Invitrogen)在室温下孵育2小时。用TBST清洗PVDF膜3次，每次5分钟。ECL底物溶液A和B(Bio-Rad公司)混合后加入到PVDF膜上，孵育2分钟。用Chemi DOC MP成像系统(Bio-Rad)对PVDF膜进行分析。
对转染了S1-M1 P1和S2-M1 P2的细胞的培养上清液样品进行蛋白质印迹分析，发现预期大小的IL-2产物几乎检测不到，而在转染了S1-Ala-M1 P3和S2-Ala-M1 P4的细胞上清液中检测到了预期大小的清晰产物带。对于所有的样品，都观察到了双IL-2产物带，正如预期的非糖基化和O-糖基化产物一样。定量上清液中分泌产物的浓度，S1-M1 P1和S2-M1P2约为6毫克/升，S1-Ala-M1 P3为76毫克/升，S2-Ala-M1 P4为148毫克/升。
对裂解细胞的还原样品进行的蛋白质印迹分析显示，所有样品都有一条预期大小的清晰条带。细胞裂解样品中的产品浓度被定量为：Sl-M1 P1为153mg/L，S1-Ala-M1 P3为161mg/L，S2-Ala-M1 P4为209mg/L。因此，S1-M1 P1的分泌产物占总产物的比例(分泌产物/[分泌产物+细胞内产物])约为4％，S1-Ala-M1 P3为32％，S2-Ala-M1 P4为41％)。
实施例3：培养液上清的纯化
培养物在第14天通过8000g离心40分钟进行收获。过滤后的上清液被纯化，以进一步确定IL-2突变蛋白Ala-M1的特征。上清液被浓缩并装入Superdex 75预处理柱(GEHealthcare Life Sciences，现在的Cytiva)，在25mM Tris，200mM NaCl pH 8.0中平衡。流分通过SDS-PAGE分析，含有目标蛋白的流分被汇集。进一步的纯化是在SP Sepharose HP柱(GE Healthcare Life Sciences，现在的Cytiva)上进行阳离子交换色谱，在25mM乙酸钠pH5.5中平衡。在加载之前，蛋白质池的pH值被调整到5.5并用水稀释。通过线性盐梯度洗脱完成。通过SDS-PAGE分析流分，将含有目标蛋白的流分汇集起来，得到纯化的IL-2突变蛋白Ala-M1 1(SEQ ID NO：14，有一个额外的半胱氨酸或谷胱甘肽通过二硫桥与位置38的半胱氨酸的巯基相连)。
实施例4：IL-2突变蛋白Ala-M1聚合物前药5的制备
45mL纯化的IL-2突变蛋白Ala-M1 1(SEQ ID NO：14)，在25mM乙酸钠，200mM氯化钠，pH 5.5中配制成0.2mg/mL，与13.5mL 0.5M磷酸钠pH 7.4混合，在Amicon Ultra-15，Ultracel 3K离心过滤器(Merck Millipore)中浓缩到3.1mL，其中1为2.5mg/ml。将9.1毫克TCEP溶解在635μL PBS pH7.4中，得到50毫摩尔的溶液。没有对pH值进行调整。将37μL TCEP溶液加入浓缩的蛋白质溶液中。样品在环境温度下孵育30分钟。随后，507μL 5mM 5kDaPEG-马来酰亚胺(Sunbright ME-050MA，CAS 883993-35-9，NOF Europe N.V.，Grobbendonk，比利时)在环境温度下孵育30分钟后，通过分析型尺寸排阻色谱确认缀合物的形成。使用配备HiPrep脱盐26/10柱的Aekta系统将缀合混合物的缓冲液交换为100mM硼酸盐，pH9.0。将样品在25℃下孵育过夜，得到未纯化的IL-2突变蛋白缀合物Ala-M1-5kDaPEG 3。然后用Amicon Ultra-15，Ultracel 3K离心过滤器(Merck Millipore)将反应混合物浓缩至5.2mg/mL。将0.109克40kDa mPEG-接头试剂(可按照专利WO2009/133137实施例7中对化合物17ca的描述，使用该专利中的化合物16c和1A进行合成)溶于1.26毫升冷水，得到2.1*10-3mol/L的储备溶液。该溶液被储存在冰上。通过加入100mM硼酸盐，pH9.0，将1.34mL蛋白质溶液稀释到4mg/mL，然后加入873μL冷却的40kDa mPEG-接头试剂储备溶液(相对于蛋白质来说相当于4摩尔当量)。
将缀合混合物置于14℃的水浴中2小时。加入872μL水和3.488μL 200mM乙酸钠，将pH值调整为3.6，在25℃孵育过夜后，使用连接到Aekta系统的HiScreen Capto MMC ImpRes柱(柱子尺寸：0.77x10cm)从反应混合物中分离出带有单个40kDa mPEG接头的缀合物(单缀合物)。流速为1.2mL/min，采用线性梯度，从10mM琥珀酸pH 5.5到80％的10mM琥珀酸，1MNaCl，pH 5.5，共12个柱体积。通过分析型尺寸排阻色谱确定在梯度过程中主要含有单缀合物洗脱液的峰。通过加入10mM琥珀酸，1M氯化钠，pH5.5，将该流分的盐含量调整为150mM氯化钠，然后在Amicon Ultra-15，Ultracel 10K过滤器(Merck Millipore)中浓缩至2.48mL。将浓缩的溶液(2.48毫升)用130μL10mM琥珀酸，150mM氯化钠，1％吐温20，pH5.5和165μL10mM琥珀酸，150mM氯化钠，0.05％吐温20，pH5.5稀释到最终浓度为1毫克/毫升1当量(基于蛋白质的分子量，不考虑糖基化)，以产生化合物5，其结构如下
Figure BDA0004113465820001851
其中，虚线表示连接到3的N端或赖氨酸侧链的伯胺的氮，每个n是200至250的整数。
实施例5：IL-2突变蛋白Ala-M1聚合物前药6的制备
12毫升纯化的IL-2突变蛋白Ala-M11(SEQ ID NO：14)在20mM磷酸钠、140mM氯化钠、pH7.4中配制成2.5mg/mL，作为起始蛋白溶液。将15.3毫克TCEP-HCl溶解在1068μL PBSpH 7.4中，得到50mM的溶液。没有对pH值进行调整。将93.3μL的TCEP溶液加入到浓缩的蛋白质溶液中。样品在环境温度下孵育30分钟。随后，1123μL 5mM 5kDa PEG马来酰亚胺(M-Mal-5000，Jenkem Technology Co，北京，中国)的PBS pH7.4(3摩尔当量)溶液加入到反应溶液中。在环境温度下孵育30分钟后，通过分析型尺寸排阻色谱确认了缀合物的形成。使用配备HiPrep脱盐26/10柱的Aekta系统将缀合混合物的缓冲液交换为100mM硼酸盐，pH9.0。将样品在25℃下孵育过夜，得到未纯化的IL-2突变蛋白缀合物Ala-M1-5kDa PEG 4。然后用Amicon Ultra-15，Ultracel 3K离心过滤器(Merck Millipore)将反应混合物浓缩至4.4mg/mL。将0.307克40kDa mPEG-接头试剂(可按照专利WO2009/133137实施例7中对化合物17ca的描述，使用该专利中的化合物16c和1A进行合成)溶于3.55毫升冷水，得到2.1*10- 3mol/L的储备溶液。该溶液被储存在冰上。通过加入100mM硼酸盐pH9.0，将5.8mL蛋白质溶液稀释到4mg/mL，然后加入3.21mL冷却的40kDa mPEG-接头试剂储备溶液(相对于蛋白质来说相当于4摩尔当量)。
将缀合混合物置于14℃的水浴中2小时。加入3.21mL水和12.83mL 200mM醋酸钠pH3.6，将pH值变为4。在25℃孵育过夜后，使用连接到Aekta系统的HiScreen Capto MMCImpRes柱(柱子尺寸：0.77x10cm)从反应混合物中分离出带有单个40kDa mPEG接头的缀合物(单缀合物)。流速为1.2mL/min，采用线性梯度，从10mM琥珀酸pH 5.0到80％的10mM琥珀酸，1M NaCl，pH 5.0，共12个柱体积。通过分析型尺寸排阻色谱确定在梯度过程中主要含有单缀合物洗脱液的峰。通过加入10mM琥珀酸，1M氯化钠，pH5.0，将该流分的盐含量调整为150mM氯化钠，然后在Amicon Ultra-15，Ultracel 10K过滤器(Merck Millipore)中浓缩至3.64mL。将浓缩的溶液(3.64mL)用192μL的10mM琥珀酸，150mM氯化钠，1％吐温20，pH5.0和3.59mL的10mM琥珀酸，150mM氯化钠，0.05％吐温20，pH5.0稀释到最终浓度为1mg/mL 1当量(基于蛋白质的分子量，不考虑糖基化)，以产生化合物6，其结构如下
Figure BDA0004113465820001871
其中，虚线表示与4的N端伯胺或赖氨酸侧链的氮连接，每个n是200至250的整数。
实施例6：制备IL-2突变蛋白缀合物AIa-M1-5kDa PEG 3
化合物3产生于IL-2突变蛋白Ala-M1聚合物前药5的纯化过程。在Capto MMCImpRes树脂上分离化合物5时，收集了含有3的后期洗脱峰。收集的流分用10mM琥珀酸pH5.0稀释，以降低电导率至约14mS/cm，并在配备HiScreen Capto Blue柱的
Figure BDA0004113465820001872
系统上进一步纯化，使用缓冲液A(20mM磷酸钠，pH7.5)，缓冲液B(20mM磷酸钠，1M氯化钠，pH7.5)和在6个柱体积中从0到50％缓冲液B的梯度。使用Amicon Ultra离心装置(3kDa MWCO)收集并浓缩主峰。使用
Figure BDA0004113465820001873
系统和HiPrep 26/10柱，将浓缩溶液的缓冲液交换到10mM Hepes，150mMNaCl，3mM EDTA，0.05％聚山梨酯20，pH 7.4，并将浓度调整到0.25mg/mL，得到化合物3。
实施例7：制备IL-2突变蛋白缀合物Ala-M1-5kDa PEG 3
在与5kDa PEG马来酰亚胺缀合并在pH 9.0下孵育过夜后，按照实施例4中IL-2突变蛋白Ala-M1聚合物前药5的纯化方法，纯化化合物3。在25℃和pH9.0下孵育过夜后的反应液被加载到AIEX Poros GoPure XQ 5mL柱子上，使用缓冲液A(20mM Tris，pH8.5)和缓冲液B(20mM Tris，1M NaCl，pH8.5)，在11个柱体积中应用从0到30％缓冲液B的线性梯度。收集含有3的流分，并通过使用
Figure BDA0004113465820001874
系统上的HiPrep 26/10柱将其缓冲液交换到10mM Hepes，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％聚山梨酯20，pH 7.4。缓冲液交换的蛋白质被调整到0.25毫克/毫升，并进行无菌过滤，得到化合物3。
实施例8：制备IL-2突变蛋白Ala-M1聚合物前药释放混合物7
用205μL 50mM硼酸盐pH10.0稀释250μL 5的pH值，使之转变为pH9.0。将样品在37℃的培养箱中培养24小时。孵育后，使用AcquityUPLC Peptide BEH C18柱(Waters，
Figure BDA0004113465820001882
2.1x50mm，1.7μm)在1260Infinity II系统(Agilent Technologies)上用RP-HPLC测定释放的Ala-M1-5kDa PEG 3的百分比。柱温保持在30℃，流量设置为0.25mL/min。紫外检测在215纳米处进行。在相同的RP-HPLC条件下，在0.25-2μg IL2的范围内，对照纯化的3的校准曲线，测定释放的3的含量。IL-2突变蛋白Ala-M1聚合物前药释放混合物7未经纯化就使用，因此主要含有Ala-M1-5kDa PEG 3和裂解的40kDa mPEG-接头以及少量的残留5。
实施例9：制备IL-2突变蛋白缀合物Ala-M1-10kDa PEG14
2.0mL在20mM磷酸钠、140mM氯化钠、pH7.4中配制的2.3mg/mL的1首先用盐酸TCEP(Sigma-Aldrich，CAS 51805-45-9，目录号：75259-10G，储备液：50mM在PBS中，pH7.4)以最终浓度为0.4mM TCEP在室温下脱保护30分钟。随后通过加入10kDa mPEG-Mal(NOF，Sunbright ME-100MA，储备液：5mM，PBS，pH 7.4)以相对于蛋白质的三倍摩尔过量进行缀合，并在室温下孵育10分钟。在使用配备有三根串联的HiTrap脱盐柱(GE Healthcare，每根5毫升)的
Figure BDA0004113465820001881
系统将缓冲液交换到0.1M硼酸盐，pH值9后，将收集的蛋白部分在25℃下孵育约18小时，以实现硫代琥珀酰亚胺环的水解，产生14。用去离子水稀释六倍后，用配备有Poros XQ柱(Thermo Scientific，5毫升)的
Figure BDA0004113465820001883
系统和盐梯度从20mM TRIS，pH 8.5到20mMTRIS，300mM NaCl，pH 8.5的11个柱体积，以1.67毫升/分钟的流速和每毫升树脂约0.5毫克的蛋白质负荷，对14进行AIEX纯化。然后用配备HiPrep 26/10脱盐柱(GE Healthcare，53mL)的
Figure BDA0004113465820001884
系统将收集的14的流分的缓冲液交换到10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％Tween 20，pH 7.4，之后使用离心过滤器(Amicon Ultra-15，Merck，Ultracel-3k)浓缩到0.26mg/mL 1当量(基于蛋白质的分子量，不考虑糖基化)，无菌过滤后(0.22μm，PVDF)储存在-80℃。
实施例10：制备IL-2突变蛋白缀合物Ala-M1-30kDa PEG15
首先将配制在20mM磷酸钠、140mM氯化钠、pH7.4中2.2mL的1用盐酸TCEP(Sigma-Aldrich，订货号：75259-10G，储备液：50mM，PBS，pH7.4)在终浓度为0.4mM的TCEP中脱保护30分钟。随后通过加入30kDa mPEG-Mal(NOF，Sunbright ME-300MA，储备液：5mM，在PBS中，pH 7.4)以相对于蛋白质的三倍摩尔过量进行缀合，在室温下孵育10分钟。在使用配备有三根串联的HiTrap脱盐柱(GE Healthcare，每根5毫升)的
Figure BDA0004113465820001885
系统将缓冲液交换到0.1M硼酸盐，pH9后，将收集的蛋白部分在25℃下温育20小时以实现硫代琥珀酰亚胺环的水解，得到15。用去离子水稀释六倍后，用配备有Poros XQ柱(Thermo Scientific，5mL)的
Figure BDA0004113465820001891
系统和11个柱体积的盐梯度从20mM TRIS，pH 8.5到20mM TRIS，300mM NaCl，pH 8.5，流速为1.67mL/min，蛋白质载量约为0.5mg/mL树脂，从而通过AIEX净化15。然后用配备HiPrep 26/10脱盐柱(GE Healthcare，53mL)的
Figure BDA0004113465820001892
系统将收集的15流分的缓冲液交换到10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％Tween 20，pH 7.4，之后使用离心过滤器(Amicon Ultra-15，Merck，Ultracel-10k)浓缩到0.26mg/mL 1当量(基于蛋白质的分子量，不考虑糖基化)，无菌过滤后(0.22μm，PVDF)储存在-80℃。
实施例11：用于受体结合研究的阿地白介素11的制备
将1毫升的2毫克/毫升的重组人白细胞介素-2 11(阿地白介素，AkronBiotechnology，AK9993-CSTM，批号15104181285)(SEQ ID NO：15)在环境温度下放置，直到白色沉淀物完全消失。加入4mL甲醇，然后用手轻轻摇动。之后，向溶液中加入1毫升的氯仿，然后进行涡旋，直到只有一个相可见。最后，加入3毫升的水，并将样品彻底涡旋。离心(6分钟，9384rcf)后，在不干扰中间相的情况下，去除上层有机相。加入3mL甲醇，涡旋样品，离心(3分钟，9384rcf)。然后小心地除去上清液，用氮气稍稍干燥蛋白颗粒。加入500μL 50mM醋酸，pH3.0，得到3mg/mL的蛋白质溶液，通过280纳米的光度测量，使用0.614mL.mg-1·cm-1的消光系数。然后用50mM醋酸，pH3稀释453μL上述溶液至2mg/mL。在与140mM HEPES，300mM氯化钠，6mM EDTA-Na2，0.1％Tween-20，pH 8.2以1∶1的重量比混合并随后无菌过滤(0.22μm，PVDF)后，得到11，并进一步用于受体结合研究。
实施例12：装载瑞喹莫德(resiquimod)的水凝胶8的制备
化合物8按WO2020/141221(实施例5，参看化合物12c)所述制备，得到在PTP缓冲液中的悬浮液，瑞喹莫德含量为2673微克当量/mL。
实施例13：制备IL-2突变蛋白M1聚合物前药10
将45.2毫升IL-2突变蛋白M1(SEQ ID NO：18)2在10mM磷酸钠、145mM氯化钠、10％甘油、pH7.4中配制成1.84毫克/毫升，与13.6毫升0.5M磷酸钠、pH7.4混合。将23.2毫克TCEP溶解在1619μL pH7.4的PBS中，得到50mM的溶液。没有对pH值进行调整。710μL TCEP溶液被加入到浓缩的蛋白质溶液中。样品在环境温度下孵育30分钟。随后，将5527μL 5mM 5kDaPEG马来酰亚胺(Sunbright ME-050MA，CAS 883993-35-9，NOF Europe N.V.，Grobbendonk，Belgium)在PBS，pH 7.4中的溶液(5摩尔当量)加入反应溶液中。在环境温度下孵育约20分钟后，通过分析型尺寸排阻色谱确认缀合物的形成。使用配备HiPrep脱盐26/10柱的Aekta系统，将缀合混合物的缓冲液交换为100mM硼酸盐，pH9.0。样品在25℃下孵育过夜，得到未纯化的IL-2突变蛋白缀合物M1-5kDa PEG 9。然后使用Amicon Ultra-15，Ultracel 3K离心过滤器(Merck Millipore)将反应混合物浓缩至5.3mg/mL。将0.847克40kDa mPEG-接头试剂(可按照专利WO2009/133137实施例7中对化合物17ca的描述，使用该专利中的化合物16c和1A进行合成)溶于9.746毫升冷水，得到2.1*10-3mol/L的储备溶液。该溶液被储存在冰上。通过加入100mM硼酸盐，pH9.0，将12.87mL蛋白质溶液稀释到4mg/mL，然后加入8477μL冷却的40kDa mPEG-接头试剂储备溶液(相对于蛋白质而言，相当于4摩尔当量)。将缀合混合物放置在14℃水浴中2小时。加入8.4mL水和33.5mL 200mM醋酸钠，pH3.6，使pH值转为4。在25℃孵育过夜后，使用连接到Aekta系统的HiScreen Capto MMCImpRes(柱子尺寸：0.77x10cm)从反应混合物中分离出带有单个40kDa mPEG接头的缀合物(单缀合物)。流速为1.2mL/min，采用线性梯度，从10mM琥珀酸，pH 5.5到80％的10mM琥珀酸，1M NaCl，pH 5.5，共12个柱体积。进行了三次纯化运行。通过分析型尺寸排阻色谱确定了在梯度过程中主要含有单缀合物洗脱液的峰。通过加入10mM琥珀酸，1M氯化钠，pH5.5，将该流分的盐含量调整到150mM氯化钠，然后在Amicon Ultra-15，Ultracel 10K过滤器(Merck Millipore)中将该流分浓缩到8.1mL。用425μL 10mM琥珀酸、150mM氯化钠、1％吐温20、pH5.5和14.36mL10mM琥珀酸、150mM氯化钠、0.05％吐温20、pH5.5稀释浓缩液，最终浓度为1mg/mL IL-2突变蛋白M12当量(基于蛋白质的分子量)，以产生化合物10，其结构如下
Figure BDA0004113465820001901
其中，虚线表示连接到9的赖氨酸侧链的氮，每个n是200至250的整数。
实施例14：IL-2突变蛋白Ala-M1聚合物前药5或6在食蟹猴(Cynomolgusmacaques)(Cyno)中的药效学作用
进行了两项研究，以测量阿地白介素(Prometheus，国家药品代码65483011607)(SEQ ID NO：15)11或5对食蟹猴的药效学作用。在第一项研究中，四个体重在7.77-10.6公斤(平均9.2公斤)的食蟹猴在第1-5天被静脉注射五次连续的0.4毫克剂量的11(平均的毫克/公斤：0.044)。在第二项研究中，四只体重在2.46-3.69公斤(平均3.13公斤)之间的食蟹猴被单次静脉注射0.1毫克/公斤(n＝2)或0.3毫克/公斤(n＝2)的5治疗。所有动物在研究前都接受了椅子训练。在这两项研究中，在治疗前后的不同时间点，按规定采集外周血样，并对淋巴细胞计数、嗜酸性粒细胞计数和细胞因子进行分析。对于用5治疗的动物，进行了额外的流式细胞仪实验。为了测量(绝对)淋巴细胞数和嗜酸性粒细胞数，用血液分析仪处理全血。对于IL-5和IL-6细胞因子的测量，血清由全血加工，并通过ELISA或MSD进行分析。对于流式细胞仪的测量(免疫分型、IPT、FACS)，将食蟹猴全血收集在EDTA抗凝剂中，并在室温下保存，直到处理用于流式细胞仪。裂解血液，用标准方法对样品进行细胞外表面标志物和细胞内表型和系谱标志物的染色。使用以下表型对细胞群进行分析，并对增殖标志物Ki67阳性的细胞百分比进行门控。
表1：通过流式细胞仪分析的细胞表型。
Figure BDA0004113465820001911
以下试剂被用于流式细胞仪分析(见表2)。
表2：用于流式细胞仪的抗体概述。
Figure BDA0004113465820001912
Figure BDA0004113465820001921
对表1中列出的群体分析每个群体中Ki67+细胞的百分比。表1中列出的群体通过将每个时间点的淋巴细胞计数乘以流式细胞仪分析的淋巴细胞门内该细胞类型的频率来分析细胞计数。倍数变化的测量是通过测量给定时间点与第4天用药前基线时间点的细胞计数的比率来进行的。CD8/Treg比率、NK/Treg比率和γδT细胞/Treg比率是通过使用流式细胞仪分析的淋巴细胞门内在给定时间点的每种细胞的频率来计算。
淋巴细胞和嗜酸性粒细胞计数：用化合物11治疗的猴子在第8天和第10天的淋巴细胞计数分别平均增加2.77倍和2.79倍，而在第8天和第10天的嗜酸性粒细胞计数分别平均增加6.92倍和5.94倍(表3)。
用0.1mg/kg 5治疗的猴子在第8天和第10天的淋巴细胞计数分别平均增加3.62倍和2.53倍，而在第8天和第10天的嗜酸性粒细胞计数分别平均增加1.13倍和1.39倍(表4)。
用0.3mg/kg 5治疗的猴子显示出淋巴细胞计数的大幅增加，第8天和第10天的淋巴细胞计数分别平均增加27.4倍和10.82倍，同时显示出嗜酸性细胞没有显著增加。第10天嗜酸性粒细胞计数平均增加1.32倍，第8天在0.3毫克/公斤治疗的动物外周血样的血液学分析中没有发现嗜酸性粒细胞(表4)。
表3：接受11治疗的食蟹猴的外周血淋巴细胞和嗜酸粒细胞计数。
Figure BDA0004113465820001931
表4：经5治疗的食蟹猴的外周血淋巴细胞和嗜酸粒细胞计数。
Figure BDA0004113465820001932
细胞因子结果：用11治疗的猴子表明，所有动物的IL-5都明显大幅增加，血清中IL-5的平均峰值为117.78pg/ml(表5)。相比之下，用0.1或0.3mg/kg 5治疗的猴子显示出IL-5的最小增加。在四只测试的动物中，有三只在分析的时间点上检测不到血清IL-5，而在第四只动物中，在研究第5天看到6.41pg/ml的值(表6)。用11治疗的猴子表明，所有动物的IL-6都明显大幅增加，血清中IL-6的平均峰值为58.66pg/ml(表5)。相比之下，用0.1或0.3mg/kg 5治疗的猴子显示出IL-6的少量增加。在四只测试的动物中，有两只在分析的时间点上没有检测到血清IL-6，而在四只动物中的另两只，在单一的时间点上，即用药后6小时，看到了5.26和3.44pg/ml的值(表6)。
表5：接受11治疗的食蟹猴的外周血中IL-5和IL-6细胞因子水平
Figure BDA0004113465820001941
LLOQ(IL-15)＝0.260pg/ml)；LLOQ(IL-6)＝0.178pg/ml
表6：接受5治疗的食蟹猴外周血中的IL-5和IL-6细胞因子水平
Figure BDA0004113465820001942
Figure BDA0004113465820001951
LLOQ(IL-5)＝2.44pg/ml；LLOQ(IL-6)＝2.44pg/ml
流式细胞仪结果：
这里描述的数据是对外部的CRO收集的流式细胞仪原始数据的内部门控分析，是在收到CRO的最终数据之前的初步分析。用0.1mg/kg 5治疗的猴子显示出NK细胞内增殖性Ki67+细胞的百分比有非常强劲的增长，在第6天和第10天分别观察到平均96.8％和91.4％(表7)。同样，用0.1mg/kg5治疗的猴子显示，CD8 T细胞内增殖性Ki67+细胞的百分比强劲增长，在第6天和第10天分别观察到平均68.3％和49.2％(表7)。此外，用0.1mg/kg 5治疗的猴子显示，γδT细胞内增殖性Ki67+细胞的百分比强劲增长，在第6天和第10天分别观察到平均95.5％和89.5％(表7)。
用0.3mg/kg 5治疗的猴子表明，NK细胞内增殖性Ki67+细胞的百分比有非常强劲的增长，在第6天和第10天分别观察到平均98.7％和90.7％(表7)。同样，用0.3mg/kg 5治疗的猴子显示，CD8 T细胞内增殖性Ki67+细胞的百分比有非常强劲的增长，在第6天和第10天分别观察到平均91.1％和71.3％(表7)。此外，用0.3mg/kg 5治疗的猴子显示，γδT细胞内增殖性Ki67+细胞的百分比有非常强劲的增长，在第6天和第10天分别观察到平均99.5％和95.3％(表7)。
表7：接受5治疗的食蟹猴的外周血Ki67+NK细胞、CD8 T细胞和γδT细胞的百分比
Figure BDA0004113465820001952
Figure BDA0004113465820001961
用0.1mg/kg 5治疗的猴子显示出NK细胞相对于基线的倍数变化的强劲增长，在第8天和第10天分别观察到平均倍数变化值为7.28和4.42(表8)。同样，用0.1mg/kg 5治疗的猴子显示出CD8 T细胞相对于基线的强劲增长，在第8天和第10天分别观察到3.78和2.26的平均倍数变化值(表8)。此外，用0.1毫克/公斤5治疗的猴子显示，γδT细胞相对于基线的倍数变化更加强劲，第8天和第10天的平均倍数变化值分别为26.47和24.94(表8)。
用0.3mg/kg 5治疗的猴子显示出NK细胞相对于基线的倍数变化的强劲增长，在第8天和第10天分别观察到平均倍数变化值为24.69和12.56(表8)。同样，用0.3mg/kg 5治疗的猴子显示出CD8 T细胞相对于基线的倍数变化的强劲增长，在第8天和第10天分别观察到平均倍数变化值为17.34和7.57(表8)。此外，用0.1mg/kg 5治疗的猴子显示了γδT细胞相对于基线的更大幅度的变化，在第8天和第10天分别观察到607.34和213.27的平均倍数变化值(表8)。
表8：经前药5治疗的食蟹猴的外周血NK细胞、CD8 T细胞和γδT细胞计数与基线相比的倍数变化
Figure BDA0004113465820001962
Figure BDA0004113465820001971
用0.1mg/kg 5治疗的猴子显示出NK细胞与Treg的比例明显增加，NK/Treg的平均比例在给药前基线(第4天)为7.10，在第8天为31.97(表9)。同样，用0.1mg/kg 5治疗的猴子显示CD8 T细胞与Treg的比例明显增加，在给药前基线的平均CD8/Treg比率为12.61，在第8天为29.23(表9)。此外，用0.1mg/kg 5治疗的猴子表明，γδT细胞与Treg的比例明显增加，给药前基线的平均γδ/Treg比例为2.24，第8天为35.23(表9)。
用0.3mg/kg 5治疗的猴子显示出NK细胞与Treg的比例明显增加，NK/Treg的平均比例在给药前基线为4.19，在第8天为28.06(表9)。同样，用0.3mg/kg 5治疗的猴子显示CD8T细胞与Treg的比例明显增加，CD8/Treg的平均比例在用药前基线为7.63，在第8天为36.35(表9)。此外，用0.3mg/kg 5治疗的猴子表明，γδT细胞与Treg的比例明显增加，给药前基线的平均γδ/Treg比值为1.90，第8天为287.33(表9)。
表9：接受5治疗的食蟹猴外周血中CD8/Treg、NK/Treg和γδ/Treg的比率
Figure BDA0004113465820001972
Figure BDA0004113465820001981
总的来说，根据公开的数据，化合物5诱导了几种预期的IL-2疗法的药理作用，并减少了食蟹猴中IL-2Rα的结合，包括CD8+T细胞和NK细胞的扩增，而嗜酸性粒细胞的扩增或IL-5的诱导最小化(Joseph等人2019年，Rafei 2020)。这是值得注意的，因为IL-5诱导的嗜酸性粒细胞扩张和激活被认为是IL-2诱导VLS等效应的主要机制(Rand 1991，Van Haelst等1991，Van Gool等2014，Abo等2019)。与历史上的比较者相比，用化合物5治疗诱发了淋巴细胞和嗜酸性粒细胞反应之间的突出窗口(即0.3mg/kg时淋巴细胞增加27.4倍，嗜酸性粒细胞增加1.32倍)。用化合物5治疗还能诱发有效的(＞200倍的扩张)γδT细胞增殖反应。
在另外的研究中，用0.7mg/kg(n＝3雄性)或0.6mg/kg(n＝3雌性)的6的单次静脉注射剂量治疗6只食蟹猴，并在治疗前后的不同时间点采集外周血样，用上述类似方法进行流式细胞仪分析。在这些实验中，使用γ9特异性抗体(Biolegend，Clone B3)测量了6对γδT细胞亚群的影响，例如有效抗肿瘤的γ9δ2 T细胞亚群。与总的γδT细胞相比，化合物6对γ9δ2 T细胞显示出类似的效果(即所有动物在第8天的平均倍数增加分别为399.87与438.56)，表明化合物6能有力地增加γ9δ2 T细胞(表10)。
表10：化合物6在第8天诱导的γ9δ2 T细胞或总γδT细胞的倍数变化。
Figure BDA0004113465820001982
Figure BDA0004113465820001991
实施例15：IL-2突变蛋白M1聚合物前药10与装载瑞喹莫德的水凝胶8组合的抗肿瘤活性。
该研究是在雌性BALB/C小鼠中进行的，在接种肿瘤的那天，小鼠的年龄为9-11周。将5x105CT26肿瘤细胞植入小鼠的右后侧。当肿瘤生长到平均肿瘤体积约为85毫米3时，将小鼠随机分到各治疗组(第0天)，并在第0天、第6天和第16天各静脉注射一次200μL的缓冲液对照，或在第0天进行一次50μL的瘤内注射8的治疗，或在第0天、第6天和第16天各静脉注射一次200μL的60μg 10和在第0天注射一次50μL的134μg 8的组合。
为了测试对受攻击(challenge)的肿瘤的免疫记忆，在最初开始用药73天后，在与原始CT26肿瘤相反的侧面接种5x105CT26肿瘤细胞，对已经完全清除结肠衍生CT26肿瘤的小鼠或肿瘤尺寸小于初始肿瘤体积的小鼠(完全反应者，CRs)进行再攻击。作为对照，也用5x105CT26肿瘤细胞接种天然的BALB/c小鼠。为了测试治疗方法对不同肿瘤的保护能力，通过在第三个不同部位接种5x105乳腺衍生的EMT6肿瘤细胞，对能够拒绝再攻击的结肠衍生CT26肿瘤的小鼠进行攻击。作为对照，天然的BALB/c小鼠也被接种了5x105EMT6肿瘤细胞。治疗开始后，通过用卡尺测量肿瘤尺寸，确定不同时间点的肿瘤体积来评估抗肿瘤疗效。肿瘤体积根据公式计算。肿瘤体积＝(L×W2)×0.5，其中L是肿瘤的长度，W是宽度(均为毫米)。一旦肿瘤大于3000毫米3，小鼠就从研究中移除。
在开始治疗原始CT26肿瘤后的第14天，虽然对照组治疗小鼠的平均肿瘤体积为1643.66毫米3，但与对照组小鼠相比，用8治疗的小鼠的平均体积(455.58毫米3，T检验p值＜0.001)在统计学上较低(表11)。同样，与对照组小鼠相比，用10和8的组合治疗小鼠的平均体积在统计学上也较低(373.46毫米3，T检验P值＜0.001)(表11)。
在第23天，用10和8的组合治疗的小鼠与单独用8治疗的小鼠(2156.90毫米3，表12)相比，其平均体积(653.10毫米3，T检验P值为0.01)在统计学上也较低，表明用10治疗可以增强其他免疫治疗剂的治疗效果，例如用8治疗。同样，到了第100天，用10和8的组合治疗的8只小鼠有6只表现出完全反应，没有检测到肿瘤，而单独用8治疗的8只小鼠只有2只表现出完全反应(表12)。
表11：治疗开始后第14天CT26原始肿瘤的肿瘤尺寸
Figure BDA0004113465820002001
表12：治疗开始后第23天CT26原始肿瘤的肿瘤尺寸和治疗开始后100天完全反应者(CR)的数量
Figure BDA0004113465820002002
在初始治疗开始73天后，用CT26在对侧腹部接种，对未接受治疗的WT天然小鼠或表现出完全反应或肿瘤小于80毫米3的小鼠，进行再攻击。在再攻击后的第21天，天然小鼠表现出明显的肿瘤生长，平均肿瘤尺寸为1320.28毫米3，而以前用8或8和10组合治疗的小鼠都拒绝了再攻击的CT26结肠衍生肿瘤细胞，表现出免疫记忆(表13)。
表13：治疗开始后第21天再攻击的CT26肿瘤的肿瘤尺寸和治疗开始后21天完全反应者(CR)的数量
Figure BDA0004113465820002011
在CT26再攻击28天后，通过在第三个不同的部位接种，对未接受治疗的WT天然小鼠或对CT26再攻击表现出完全反应的小鼠进行乳腺衍生EMT6肿瘤细胞攻击。在EMT6攻击后的第18天，未经治疗的天然小鼠表现出明显的肿瘤生长，平均肿瘤尺寸为2224.38毫米3，而先前用8治疗的小鼠表现出平均肿瘤尺寸为529.24毫米3，对EMT6肿瘤攻击没有完全反应(表14)。相比之下，以前用8和10组合治疗的小鼠表现出显著较低的平均肿瘤尺寸为12.21毫米3(T检验P值＜0.001)，并且6只小鼠中有4只对EMT6攻击有完全反应(表14)。
表14：治疗开始后第18天再攻击EMT6肿瘤的肿瘤尺寸和治疗开始后18天完全反应者(CR)的数量
Figure BDA0004113465820002012
Figure BDA0004113465820002021
实施例16：IL-2突变蛋白Ala-M1聚合物前药5在CD1远亲繁殖小鼠中的药效学效应
进行了研究以测量5在健康小鼠中的药效学效应。作为一项为期22天的重复给药研究的一部分，对CD-1小鼠静脉注射5，每周给药(共三次)。该研究包括四个剂量组(0、1.8、3.6和6.0mg/kg/周)，每周一次缓慢静脉注射5，包括通过流式细胞仪免疫分型评估淋巴细胞亚型(见表15)。5在健康的CD-1小鼠中诱导了CD8+T细胞和NK细胞的强劲扩张和激活，包括与未治疗的小鼠相比，CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率以及CD8+T细胞与Treg的比率增加。
表15：小鼠22天重复剂量毒性研究中通过流式细胞仪免疫分型评估的淋巴细胞亚群
淋巴细胞亚群 表型
T细胞总数 <![CDATA[CD45<sup>+</sup>CD3<sup>+</sup>]]>
<![CDATA[辅助性T细胞(CD4<sup>+</sup>T细胞)：]]> <![CDATA[CD45<sup>+</sup>CD3<sup>+</sup>CD4<sup>+</sup>]]>
<![CDATA[细胞毒性T细胞(CD8<sup>+</sup>T细胞)：]]> <![CDATA[CD45<sup>+</sup>CD3<sup>+</sup>CD8<sup>+</sup>]]>
T调节细胞： <![CDATA[CD45<sup>+</sup>CD3<sup>+</sup>CD4<sup>+</sup>CD25<sup>+</sup>FOXP3<sup>+</sup>]]>
自然杀伤细胞： <![CDATA[CD45<sup>+</sup>CD3<sup>-</sup>CD8<sup>+</sup>CD335<sup>+</sup>(NKp46<sup>+</sup>)CD11b<sup>+/-</sup>]]>
<![CDATA[粒酶B<sup>+</sup>NK细胞：]]> <![CDATA[CD45<sup>+</sup>CD3<sup>-</sup>CD8<sup>+</sup>CD335<sup>+</sup>(NKp46<sup>+</sup>)CD11b<sup>+/-</sup>颗粒酶B<sup>+</sup>]]>
γδT细胞： <![CDATA[CD45<sup>+</sup>CD3<sup>+</sup>γδ<sup>+</sup>CD4<sup>-</sup>CD8<sup>-</sup>]]>
<![CDATA[CD44<sup>+</sup>帮助性T细胞：]]> <![CDATA[CD45<sup>+</sup>CD3<sup>+</sup>CD4<sup>+</sup>CD44<sup>+</sup>]]>
<![CDATA[CD44<sup>+</sup>细胞毒性T细胞：]]> <![CDATA[CD45<sup>+</sup>CD3<sup>+</sup>CD8<sup>+</sup>CD44<sup>+</sup>]]>
<![CDATA[粒酶B<sup>+</sup>细胞毒性T细胞]]> <![CDATA[CD45<sup>+</sup>CD3<sup>+</sup>CD8<sup>+</sup>粒酶B<sup>+</sup>]]>
用于免疫分型分析的血样在第1天第一次用药和第15天第三次用药后的48、96和168小时收集，在第8天第二次用药后的96和168小时收集。用5治疗小鼠后，观察到CD8+T细胞的强劲扩增和激活。T细胞内的CD8+T细胞频率在5治疗后以剂量依赖的方式增加(数据未显示)，CD8+T细胞与CD4+T细胞的比率也是如此(表16)，这些比率在第二和第三服药周期后进一步增加，导致累积效应。
表16：接受5治疗的CD1小鼠中每个剂量组和性别的平均CD8/CD4比率。
Figure BDA0004113465820002031
n.d.未测定
此外，CD8+T细胞与Treg的比例也随着5的额外给药周期增加而以累积方式增加(表17)。
表17：接受5治疗的CD1小鼠中每个剂量组和性别的平均CD8/Treg比率。
Figure BDA0004113465820002032
Figure BDA0004113465820002041
n.d.未测定
最后，CD8+T细胞在5治疗后显示出增加的效应/记忆表型，在CD8+T细胞群中CD44+细胞的百分比中观察到剂量和时间依赖性的增加(表18)。值得注意的是，对照组小鼠并没有表现出这些特征的变化。对于所有这些CD8+T细胞活化的措施，雄性与雌性相比，特别是在3.6mg/kg/周时，往往看到更强的效果。
表18：在接受5治疗的CD1小鼠中，根据每个剂量组和性别的CD44+CD8 T细胞百分比。
Figure BDA0004113465820002042
Figure BDA0004113465820002051
n.d.未测定
除了对T细胞的影响外，在5治疗后，NK细胞计数/μL血的强劲增长以剂量依赖的方式被注意到(表19)。
表19：接受5治疗的CD1小鼠的NK细胞计数/μL血，根据每个剂量组和性别。
Figure BDA0004113465820002052
n.d.未测定
此外，用5治疗诱导了一个激活的NK细胞表型，这是由粒酶B+的百分比来衡量的NK细胞(表20)。值得注意的是，对照组小鼠并没有表现出这些特征的变化。
表20：在接受5治疗的CD1小鼠中，每个剂量组和性别的显示激活的粒酶B+表型的NK细胞百分比。
Figure BDA0004113465820002061
n.d.未测定
总的来说，在接受5治疗的小鼠中观察到了剂量和时间依赖性的药理变化，这些变化显示了NK细胞数量的强劲增长和CD8+T细胞与CD4+T细胞的选择性增加，以及在CD8+T细胞中诱导记忆/效应细胞表型(CD44+)。
实施例17：5和3在食蟹猴中的毒物代谢动力学
根据表21所示的给药方案，在第1天和第15天通过静脉(IV)缓慢给药给猴子注射5之后，对5和从5中释放出的3的毒代动力学进行测定。
表21：剂量水平和各剂量组的动物数量
Figure BDA0004113465820002062
Figure BDA0004113465820002071
*剂量为毫克1当量
在用药前的第1天和用药后约2、6、24、48、96、144、216和336小时(第二次剂量前)收集所有动物的血样。此外，在用药后第15天的大约2、6、24、48、96、144、216和336小时收集所有动物的血样。血液样本被处理成血浆，并对5和3进行分析。
采用夹心ELISA方法对食蟹猴肝素锂(Li-Hep)血浆中的5进行定量。在96孔板上涂有大鼠单克隆免疫球蛋白G(IgG)抗IL-2抗体。封闭平板后，将含有5的样品移入孔中，然后加入生物素化的兔单克隆IgG抗PEG抗体以结合固定的5，用链霉抗生物素蛋白标记的过氧化物酶检测复合物。在清洗以去除未结合的试剂后，通过其对底物TMB的作用来显示酶。用强酸停止反应后，颜色的强度(在450纳米处读取；校正波长为620纳米)与样品中存在的5的数量成正比。
使用涂有小鼠单克隆免疫球蛋白M(IgM)抗PEG抗体的琼脂糖珠将猴Li-Hep血浆样品中的释放的3与5分开。在分离步骤之后，用夹心ELISA法对3进行定量。在96孔板上涂有大鼠单克隆IgG抗IL-2捕获抗体。封闭板后，将含有3的样品移入孔中，然后加入生物素化的兔多克隆IgG抗IL-2检测抗体，与固定的3结合。用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)的转化来测定该缀合物与抗体-3复合物的结合。通过酸化停止反应，记录450nm处的紫外吸收。
表22和表23分别列出了猴子血浆中5和释放的3的单个和平均毒代动力学参数的概述。
5和3的平均Cmax和AUC0-336值的性别差异小于2倍。根据5和3的平均Cmax和AUC0-336值评估的暴露量，随着5的剂量水平从第1天的0.1到0.9mg/kg/次以及从第15天的0.1到0.75mg/kg/次的增加而增加。平均Cmax和AUC0-336值的增加一般与剂量成比例。猴子在0.1和0.3mg/kg/次的剂量水平上多次施用5后，没有观察到5或3的蓄积(由于第1天和第15天的剂量不同，对高剂量水平没有结论)。
表22：猴子血浆中5的单个和平均毒代动力学参数概述
Figure BDA0004113465820002072
Figure BDA0004113465820002081
注：tmax提供的是中位数值。
剂量在第1天和第15天施用
表23：猴子血浆中从5中释放出的3的单个和平均毒代动力学参数概述
Figure BDA0004113465820002082
Figure BDA0004113465820002091
注：tmax提供的是中位数值。
剂量在第1天和第15天施用
实施例18：IL-2突变蛋白缀合物Ala-M1-5kDa PEG 3和4以及IL-2突变蛋白Ala-M1聚合物前药释放混合物7在IL-2Rα和IL-2Rβ结合实验中的受体结合以及偏向性的计算
通过测试其活性成分3和4分别与IL-2R亚基的特异性结合，证明了前药5和6的作用方式。活性成分是纯化的变体3或4或IL-2突变蛋白Ala-M1聚合物前药释放混合物7中的主要成分。使用Biacore进行的结合研究是通过将3、4、7和无偏向的对照重组人IL-2、即化合物12(SEQ ID NO：45)注射到人IL-2Rα-Fc或人IL-2Rβ-Fc涂层的传感器芯片上。结果总结在表24中。3、4和7是有偏向的IL-2分子，因为与12相比，所有这些分子在高达2μM的浓度下都没有表现出与IL-2Rα的结合，但都表现出与IL-2Rβ的结合。3、4和7显示了高度相似的与IL-2Rβ的解离常数(KD约为2μM)，与12(约0.5μM)相比，解离常数略有减少(3-5倍)。
表24：与人类IL-2Rα或IL-2Rβ结合的Biacore结合结果
Figure BDA0004113465820002092
Figure BDA0004113465820002101
NA＝不适用，即由于缺乏结合，无法计算出数值。
在一个独立的测量中，阿地白介素11的受体结合与无偏向的对照重组人IL-2，即化合物12(SEQ ID NO：45)进行对比测量。阿地白介素11是根据实施例11制备的。发现化合物12和11对IL-2Rα和IL-2Rβ都有高度相当的KD值，因此对两个受体都有相当的结合亲和力。
IL-2的偏向性是根据修饰后的IL-2与阿地白介素分别与它们的IL-2Rα和IL-2Rβ结合的KD比率来定义的，如以下公式所述：
Figure BDA0004113465820002102
其中
Figure BDA0004113465820002103
Figure BDA0004113465820002104
且
″KD偏向性IL2对IL-2Rα″是偏向性IL-2对IL-2Rα的KD，
″KD偏向性IL-2对IL-2Rβ″是偏向性IL-2对IL-2Rβ的KD，
″KD阿地白介素对IL-2Rα″是指阿地白介素对IL-2Rα的KD，和
″KD阿地白介素对IL-2Rβ″是指阿地白介素对IL-2Rβ的KD。
对于IL-2Rα和IL-2Rβ的结合，KD 11＝KD 12，通过使用上述公式，计算出以下比率，并总结在表25中。
表25：不同的IL-2突变蛋白缀合物的偏向性IL-2比率与阿地白介素比率的比较。
Figure BDA0004113465820002105
Figure BDA0004113465820002111
＊由于没有与IL-2Rα结合，因此在计算时使用γ测试的最高浓度(2μM)。
实施例19：3和7在HH(一种表达IL-2Rβγ的细胞系)中的生物活性
为了证实3和7的生物活性，我们用HH细胞系进行了实验。HH细胞系是一个成熟的T细胞系，来自于一个侵袭性皮肤T细胞白血病/淋巴瘤患者的外周血(
Figure BDA0004113465820002112
 CRL-2105TM)，它被证明只表达IL-2Rβγ。在细胞因子介导的淋巴细胞如CD8+T细胞和NK细胞的激活中，最早的事件之一是Janus相关激酶介导的磷酸化和激活转录信号传导体和激活体(pSTAT5)。因此，pSTAT5被用来测量3和7与12的生物活性。3在表达IL-2Rβ/γ的HH细胞中表现出明显的生物活性(EC50：773ng/ml)，比12(EC50：233ng/ml)低大约3.5倍。此外，7诱导的生物活性(EC50：756ng/ml)与3非常相似，表明7从前药5中释放后，即使在加速(应激)条件下，也能保持生物活性。
实施例20：3和7在原代人、食蟹猴和小鼠血淋巴细胞中的生物活性
人与小鼠或人与食蟹猴之间IL-2及其受体亚基的氨基酸序列同一性，见表26。
表26：人类、小鼠和食蟹猴的IL-2和IL-2受体亚基之间的氨基酸序列同一性百分比
蛋白质 人类与小鼠的序列同一性 人类与食蟹猴的序列同一性
IL-2 63％ 96％
IL-2Rα 61％ 92％
IL-2Rβ 58％ 94％
IL-2Rγ 71％ 97％
尽管人和小鼠之间的IL-2和IL-2受体的序列同一性仅在58-71％之间，但小鼠模型已被广泛用于测试IL-2和IL-2变体的药理和抗肿瘤作用。相比之下，食蟹猴的IL-2和IL-2R序列与人有更高的同一性(92-97％，表26)。为了从实验上证明食蟹猴和小鼠是研究5的相关物种，使用3以及his-标记的哺乳动物表达的对照人IL-2，即化合物13(SEQ ID NO：46)进行PD实验，用人、食蟹猴或小鼠的血样测试生物活性。
为了评估3在人类或猴子原代细胞中的细胞特异性免疫刺激作用。用不同浓度的3或13与来自两个供体的全人或食蟹猴血液一起孵育30分钟，用流式细胞仪分析独特的细胞亚群，如主要表达IL-2Rα/β/γ的Treg以及主要表达IL-2Rβ/γ的CD8+T细胞(CD8)和NK细胞中的细胞内磷酸化STAT5(pSTAT5)水平。此外，CD8+T细胞被进一步分析为CD8+CD45RA+天然(CD8 N)以及CD8+CD45RA-记忆(CD8 M)亚群。使用不同组的小鼠特异性抗体对小鼠血液进行了类似的实验。所有亚群都分析了pSTAT5的中位荧光强度，并计算了所有细胞类型中每种化合物的EC50值。
在人类和食蟹猴中，与13相比，3对Treg的效力大大降低，而对CD8+T细胞和NK细胞的效力保持类似并略有降低。例如，在人类血液中，13显示在Treg中对pSTAT5 EC50值为0.09ng/ml，而3显示在这个群体中的EC50值高得多，为34.5ng/ml。相比之下，13在人类NK细胞中显示pSTAT5的EC50值为6.01ng/ml，而3号在这一群体中显示的EC50值为11.84ng/ml，具有可比性，但效力稍弱(表27)。
表27：人、食蟹猴和小鼠血液中pSTAT5的效力值概述
<![CDATA[EC<sub>50</sub>(ng/mL)]]> Treg CD8 NK
人类
13 0.09 25.69 6.01
3 34.50 62.15 11.84
食蟹猴
13 0.09 45.10 10.52
3 52.16 86.4 16.26
小鼠
13 0.37 24,040.56 9,694.74
3 92.24 10,297.50 3,614.68
在小鼠中，与13相比，3在小鼠Treg中的效力大大降低，而对CD8+T细胞和NK细胞的效力保持类似并略有增加(表27)。例如，在小鼠血液中，13显示在Treg中对pSTAT5 EC50值为0.37纳克/毫升，而3在这个群体中显示的EC50值高得多，为92.24纳克/毫升。相比之下，13显示pSTAT5在小鼠NK细胞中的EC50值为9,694.74纳克/毫升，而3显示这个群体的EC50值为3,614.68，具有可比性(表27)。
虽然食蟹猴的淋巴细胞亚群与人类的淋巴细胞亚群相比表现出类似的3的效力(低1.37-1.51倍的效力，表28)，但在小鼠中并非如此。值得注意的是，虽然小鼠Treg显示出与人类Treg相似的总体3的效力(即低2.67倍的效力，表28)，但与人类相比，小鼠IL-2Rβ/γ＋CD8+T细胞和NK细胞对3的敏感性明显降低(CD8+T细胞的效力低165.69倍，NK细胞的效力低305.29倍，表28)。换句话说，小鼠CD8+T细胞和NK细胞似乎需要更高剂量的3，以获得与人类对应的活性(表28)或与小鼠Treg相比对应的活性(表27)。值得注意的是，同样的一般趋势在13中也很明显。
表28：食蟹猴或小鼠淋巴细胞亚群与相应的人类亚群相比的效力损失倍数
对比人类的效力损失倍数 Treg CD8 NK
食蟹猴
13 1 1.76 1.75
3 1.51 1.39 1.37
小鼠
13 4.11 935.79 1613.10
3 2.67 165.69 305.29
在用人血进行的其他实验中，IL-2突变蛋白Ala-M1聚合物前药释放混合物7显示几乎相同的生物活性(表29)，表明7在从5释放后保持了完全的生物活性。
表29：其他人类血液实验中的pSTAT5效力值概述
<![CDATA[EC<sub>50</sub>(ng/mL)]]> Treg CD8 NK
人类
13 0.047 4.94 17.59
3 22.02 9.34 51.22
7 15.01 9.79 48.18
总的来说，这些实验表明，人类、食蟹猴和小鼠的原代细胞可以被3激活，而且对于所有三个物种来说，与13相比，3表现出大幅降低的Treg效力，这与体外看到的IL-2Rα结合的损失和所需的作用机制相一致。应当注意到，与食蟹猴或人类不同，小鼠需要相对于激活IL-2Rα表达细胞而言更高浓度的3(可能还有更高剂量的5)来激活CD8+T细胞和NK细胞。
实施例21：3、14、15在人外周血单核细胞淋巴细胞亚群中的生物活性
为了进一步了解化合物1中半胱氨酸38连接点的PEG大小的影响，进行了额外的实验，以比较在半胱氨酸38处具有5kDa(3)、10kDa(14)或30kDa(15)PEG连接的Ala-M1在低温保存的人类PBMC中的生物测定效力。如实施例20所述的类似方法，在用所述化合物刺激30分钟后，用流式细胞仪研究在不同淋巴细胞亚群中的pSTAT5诱导情况。数据总结在表30和31中，证明在IL-2Rα结合界面增加PEG的大小，特别是超过10kDa，不仅在Treg，而且在表达IL2Rβγ的细胞，如CD8+T细胞和NK细胞中减少效力。例如，15在CD8+T细胞中显示的EC50效力值比3低5.4倍(分别为802.17 vs 148.31，表30)，比对照IL-2，即化合物13低16.46倍(表31)。同样，15在NK细胞中显示出EC50效力值比3低6.77倍(分别为192.25 vs 28.41，表30)，比对照IL-2，即化合物13低14.73倍(表31)。总的来说，这些数据表明，增加IL-2Rα阻断性PEG大小超过10kDa会抑制对表达IL2Rβγ的细胞类型的效力，而较小的5kDa PEG大小可以实现IL-2Rα阻断，同时对表达IL2Rβγ的细胞保持更好的效力。
表30：3、14和15在低温保存的人类PBMC中的pSTAT5效力值概述。
<![CDATA[EC<sub>s0</sub>(ng/mL)]]> Treg CD8 NK
3 105.48 148.31 28.41
14 162.87 242.50 49.41
15 432.88 802.17 192.25
表31：与对照组IL-213相比，3、14和15在低温保存的人类PBMC中的效力损失倍数
<![CDATA[EC<sub>s0</sub>(ng/mL)]]> CD4-CD8-T细胞 CD8 NK
3 3.24 3.04 2.18
14 4.92 4.97 3.78
15 16.24 16.46 14.73
实施例22：3和4在人外周血单核细胞淋巴细胞亚群中的生物活性。
进行实验以比较1与化合物3或4所代表的5kDa PEG变体的生物测定效力。如实施例20所述的类似方法，在用所述化合物刺激30分钟后，用流式细胞仪研究不同淋巴细胞亚群中pSTAT5的诱导情况。数据总结在表32中，表明化合物3和4表现出非常相似的效力
表32：化合物3和4在低温保存的人类PBMC中的pSTAT5效力值概述。
Figure BDA0004113465820002141
例如，本实验中的化合物3和4在CD8+T细胞中显示非常相似的EC50效力值，分别为126.59和133.77。同样，本实验中的化合物3和4在NK细胞中显示非常相似的EC50效力值，分别为22.05和24.02。总的来说，这些数据显示，化合物3和4在不同的IL-2Rα/β/γ+细胞类型如Treg以及IL-2Rβ/γ+细胞类型如CD8+T细胞和NK细胞中的效力没有实质性差异。
实施例23：IL-2突变蛋白M1聚合物前药10与抗PD1或抗CTLA4免疫疗法联合使用的抗肿瘤活性。
该研究是在雌性BALB/C小鼠中进行的，在接种肿瘤的那天，小鼠的年龄为9-11周。将5x105CT26肿瘤细胞植入小鼠的右后侧。当肿瘤生长到平均肿瘤体积约为85毫米3时，将小鼠随机分到各治疗组(第0天)，在第0天、第6天和第16天静脉注射200μL缓冲液对照，在第0、3、7和10天每周两次腹腔注射10mg/kg抗mCTLA4(9D9)，为期两周，在第0、3、7和10天每周两次腹腔注射10mg/kg抗mPD1(RMP1-14)，为期两周，在第0天和第6天各静脉注射一次，第16天静脉注射一次200μL的60μg 10，或在第0天和第6天各静脉注射一次、第16天静脉注射一次200μL的60μg 10和上述的抗CTLA4或抗PD1治疗的组合。
肿瘤体积根据公式计算。肿瘤体积＝(L×W2)×0.5，其中L是肿瘤的长度，w是宽度(均为毫米)。一旦肿瘤大于3000毫米3，小鼠就被从研究中移除，研究是根据当地的动物福利准则进行的。为了比较不同组在预先规定的日期的相对肿瘤体积，使用Bartlett′s检验来检查所有组的方差同质性的假设。当Bartlett′s检验的P值≥0.05时，进行单因素方差分析以检验所有组间的总体均值是否相等。如果单因素方差分析的p值＜0.05，则进一步进行事后测试，对所有成对比较进行Tukey′s HSD(诚实显著差异)测试，对每个处理组与溶媒组的比较进行Dunnett检验。当Bartlett′s检验的P值＜0.05时，进行Kruskal-Wallis检验以检验所有组间中位数的总体相等性。如果Kruskal-Wallis检验的P值＜0.05，则通过运行Conover非参数检验对所有成对比较或对每个处理组与溶媒组的比较进行事后检验，两者均采用单步P值调整。肿瘤生长抑制(TGI)被用作抗肿瘤活性的指标，由于第0天各组间肿瘤体积的差异，根据对照组和治疗组的相对肿瘤体积计算。TGI(％)＝(1-T/C)×100％；T/C＝MTVT/MTVC，MTVT：第t天治疗组的平均肿瘤体积，MTVC：第t天对照组的平均肿瘤体积。此外，统计分析是在对照组中所有或大部分小鼠都活着的那一天收集的数据上进行。
各组第14天的TGI值总结于表33。当与缓冲液处理的动物相比，使用10、抗CTLA4单药或10和抗CTLA4的组合治疗时，肿瘤生长抑制(TGI)值分别为32.53％、51.79％和60.65％。此外，与单独使用10或抗CTLA4的治疗相比，10和抗CTLA4的组合相比缓冲液处理的动物显示出更低的平均肿瘤体积和更低的P值(表33)。同样，与缓冲液处理的动物相比，用抗PD1或抗PD1+10的组合处理的组，TGI值分别为47.21％和57.82％。总之，在第14天，数据显示与缓冲液处理的动物相比，接受CTLA4或PD1与10联合治疗的组与单独接受CTLA4或PD1的组相比，肿瘤生长抑制增加，平均肿瘤体积降低，P值降低(更显著)(表33)。
表33：10单独或与抗mCTLA4(9D9)或抗mPD1(RMP1-14)联合在CT26肿瘤小鼠中的抗肿瘤活性
Figure BDA0004113465820002161
注释：
a.平均值±SEM(N)，N为每组剩余动物数。
b.T/C＝MTVt/MTVc，MTVt：治疗组的平均肿瘤体积，MTVc：第1组缓冲液对照组的平均肿瘤体积。
c.治疗组的TGI与第1组缓冲液对照组相比。
实施例24：IL-2突变蛋白Ala-M1聚合物前药5的体外释放动力学
IL-2突变蛋白Ala-M1聚合物前药5的体外释放动力学是在pH7.4和37℃下测定的，以模拟生理pH和温度条件。为此，使用
Figure BDA0004113465820002162
系统和两个相连的HiTrap脱盐柱(Cytiva)将IL-2突变蛋白Ala-M1聚合物前药5缓冲液交换到25mM HEPES、135mM NaCl、1mM EDTA、10mM L-甲硫氨酸、2mg/mL Pluronic F-68，pH 7.4，流速为2mL/min，在280nm处进行紫外线检测。缓冲液交换后的样品在37℃的水浴中控温条件下孵育至多两周(333.5小时)。样品酸化后，在配备Acquity UPLC I-Class Plus系统(Waters)上用反相高压液相色谱法测定3的接头裂解和释放，柱子是Acquity UPLC Peptide BEH C18(
Figure BDA0004113465820002171
1.7μm，2.1mm x 50mm)。通过整合RP-HPLC色谱中IL-2突变蛋白Ala-M1聚合物前药5和释放相关物质(3和裂解的40kDamPEG-1接头物质)在215nm处的峰值，对不同时间点的释放进行量化。释放物质的百分比与孵育时间作图，并使用曲线拟合软件应用非线性单相关联拟合来确定接头裂解动力学的半衰期。在pH7.4和37℃的条件下，在体外接头的半衰期已被确定为54小时(95％置信区间＝50-58小时)。
实施例25：IL-2突变蛋白Ala-M11(SEQ ID NO：14)的O-糖基化模式
为了寻找IL-2突变蛋白Ala-M11(SEQ ID NO：14)中的O-糖基化位点，进行了肽图分析。为此，将两批IL-2突变蛋白Ala-M11(SEQ ID NO：14)用胰蛋白酶和内切蛋白酶Lys-C的混合物在pH8和37℃下消化18小时(酶与底物的比例＝1∶10)。消化后，样品用相同体积的水稀释，用Halo C18柱(先进材料技术公司，
Figure BDA0004113465820002173
2.1x100mm，2.7μm)进行反相高压液相色谱分析。流动相包括0.075％的TFA在水中的溶液(A)和0.060％的TFA在乙腈中的溶液(B)。梯度程序遵循0.5％B的起始成分，保持1分钟，在8.2分钟内增加到25.7％B，在1.3分钟内增加到33％B，在15.5分钟内增加到61％B，然后在0.2分钟内增加到99.9％B(流速＝0.5mL/min，柱温＝20.9℃)。用四极飞行时间质谱仪进行高分辨质谱鉴定肽片段。通过比较215nm处的峰值强度，确定最强的糖基化物质。
消化后的多肽片段1-8(APTSSSTK)被发现是O型糖基化的(没有发现非糖基化的APTSSSTK片段)。可能的O-糖基化是通过比较肽片段的实测质量和数据库的理论质量(GlycoMod Tool，ExPASy，Swiss Institute ofBioinformatics)来确定的。定性结果总结在表34中(只考虑生物相关的糖型进行匹配)。
表34：两批IL-2突变蛋白Ala-M11(SEQ ID NO：14)中肽片段APTSSSTK的建议糖型
Figure BDA0004113465820002172
Figure BDA0004113465820002181
两批产品中最强的糖型是(Hex)1(HexNAc)1(NeuAc)2和(Hex)1(HexNAc)1(NeuAc)1。
实施例26：IL-2突变蛋白在大肠杆菌中的表达
为了表达在K35处发生突变的IL-2变体，编码Ala-M1[SEQ ID NO：40]、Ala-M1K35E[SEQ ID NO：41]、Ala-M1 K35D[SEQ ID NO：42]、Ala-M1 K35Q[SEQ ID NO：43]和Ala-M1 K35S[SEQ ID NO：44]的DNA序列是由氨基酸序列(Ala-M1[SEQ ID NO：14]，Ala-M1 K35E[SEQ ID NO：35]，Ala-M1 K35D[SEQ ID NO：39]，Ala-M1 K35Q[SEQ ID NO：33]和Ala-M1K35S[SEQ ID NO：29])通过反向翻译和密码子优化获得，用于大肠杆菌中表达。在每个DNA序列的5′端添加一个ATG密码子，以便在大肠杆菌中进行细胞表达。合成DNA序列(GeneArt)并在IPTG诱导的Tac启动子控制下克隆到表达载体。表达载体(另外含有卡那霉素抗性基因用于选择)被转化到大肠杆菌宿主菌株BL21中，得到的菌株被用于表达Ala-M1 K35突变体。菌株在LB-Kan培养基(37℃，250rpm)中生长过夜，并将过夜的培养物接种到250mL摇瓶(37℃，250rpm)中的50mL TB-Mg-Kan培养基。当培养物的OD600达到1时，通过加入0.1mM IPTG诱导表达，并在收获前将培养物振摇5小时。
为了分析可溶性和不溶性细胞部分的产品产量，使用300μL BugBuster试剂从每个摇瓶的2x1mL培养物中提取可溶性蛋白质。将剩余的细胞沉淀溶解在300μL含DTT的样品缓冲液中，代表不溶性部分，加载后用SDS-PAGE分析这两种流分。结果显示，所有测试的IL-2变体的产物都只存在于不溶性部分。
对于再折叠实验，IL-2包涵体在增溶缓冲液(6M盐酸胍，8mM DTT，50mM Tris，pH8.5)中溶解，然后在再折叠缓冲液(1.2M尿素，500mM盐酸精氨酸，20％甘油，0.001％吐温80，12mM L-半胱氨酸，0.15mM胱胺2HCl，35mM Tris，pH 8.5)中稀释50倍进行再折叠。混合物在室温下搅拌孵育55小时。在重新折叠的时间过程中，取出样品进行RP-HPLC分析。RP-HPLC方法(Waters X-bridge BEH C18柱，
Figure BDA0004113465820002182
3.5μm，2.1x100mm。温度：40℃。流动液A：0.05％TFA in UPW，流动液B：0.05％TFA的CAN溶液。在36分钟内，线性梯度从25％到75％B。流速0.4mL/min，50μL进样量，紫外检测220nm)允许分离完全还原的IL-2起始材料和重新折叠的在R38C处有半胱氨酸封盖的单体IL-2变体。
结果显示，所有测试的变体的正确折叠单体产品的浓度随着时间的推移而增加。与Ala-M1相比，观察到Ala-M1 K35D和Ala-M1 K35E有更高的初始形成率和更高的再折叠单体产品的最终浓度。Ala-M1 K35Q和Ala-M1 K35S突变体没有显示出再折叠的改善，而是与Ala-M1相比有非常相似的形成率和再折叠单体产品的最终浓度。Ala-M1 K35D变体获得了最高的正确再折叠单体最终浓度(比Ala-M1高约1.8倍)，而Ala-M1 K35E变体的再折叠单体最终浓度比Ala-M1高约1.5倍。这里通过比较再折叠后47小时的K35变体的再折叠产物峰面积和Ala-M1的再折叠产物峰面积来估计最终浓度的倍数提高。
为了实现Ala-M1[SEQ ID NO：14]和M1[SEQ ID NO：18]在大肠杆菌中表达，Ala-M1和M1的N端与一系列细菌信号肽(dsbA，glll，mal，OmpA，OpmC，OmpT，pelB，phoA，torA，torT，EOX，STLL，SfmC，lamb，MglB，MmAp和tolB)融合。对单独的IL-2突变蛋白和与信号肽融合的氨基酸序列进行反翻译，并对得到的DNA序列进行密码子优化，以便在大肠杆菌中表达。得到的DNA序列被合成并克隆到含有卡那霉素抗性基因的表达载体中，在鼠李糖诱导的rham启动子(Atum)控制下进行选择。以这种方式构建的质粒被转化到大肠杆菌宿主菌株BL21中，所得菌株被用于小规模的表达试验。菌株在37℃的TB-Kan培养基中生长过夜，用过夜的培养物接种0.5mL TB-Mg-Kan，使其起始OD600为0.2。当培养物的OD600达到0.8时，通过加入4mM鼠李糖来诱导表达，并在离心收获前将培养物摇晃培养4小时。破坏周质空间的外膜，从细胞中提取周质蛋白，然后用剩余的细胞材料制备全细胞裂解液。总细胞裂解液被分离成可溶性和非可溶性部分。然后将总蛋白、可溶性蛋白和周质蛋白部分的样品变性，在还原条件下进行SDS-PAGE检测。在考马斯染色的凝胶上，通过全长蛋白条带相对于IL-2标准品的密度测量来估计其表达水平。样品也通过使用IL-2抗体进行蛋白质印迹分析。阳性(存在于所有分析的流分中的表达蛋白的细胞)和阴性(空表达质粒的细胞)对照组被包括在分析中以供参考。SDS-PAGE分析在M1或Ala-M1的可溶性样品或周质样品中都没有检测到IL-2产物，也没有检测到任何信号肽。对于不用信号序列表达的M1和Ala-M1，在SDS-PAGE凝胶上的总细胞裂解物部分观察到了预期大小的蛋白条带，并通过蛋白质印迹验证了产物的身份。对于用信号序列表达的M1和Ala-M1，在SDS-PAGE凝胶上的总细胞裂解物样品中观察到尺寸略有增加的蛋白条带，并通过蛋白质印迹验证了条带的身份。产物大小的轻微增加与信号肽没有被切掉是相符的。对于一些信号序列，在任何流分中都检测不到产物，包括在总的细胞裂解液中。对于M1来说，17个测试的信号肽中的7个(dsbA，torT，tolB，EOX，STLL，SfmC和MmAp)是这种情况，而对于Ala-M1，只有3个信号肽(dsbA，torT和tolB)是这种情况。
缩略语
AIEX                      阴离子交换色谱法
bp                        碱基对
CHO                       中国仓鼠卵巢
价值观                    柱体积
DNA                       脱氧核糖核酸
DO                        溶解氧
EDTA                      乙二胺四乙酸，2，2′，2″，2″′-(乙烷-1，2-二基二亚胺)四乙酸
eq                        当量
HEPES                     2-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸
六角                      六糖
HexNAc                    N-乙酰己糖
IL-2                      白细胞介素-2
MES                       4-吗啉乙磺酸
mPEG                      甲氧基聚乙二醇
NeuAc                     N-乙酰神经氨酸
NeuGc                     N-糖醇基神经氨酸
PBS                       磷酸盐缓冲盐水
P.pastoris                毕赤酵母(Pichia pastoris)
PTP                       5mM磷酸盐，90g/L海藻糖二水合物，0.2％PluronicF-68，
                          pH 7.4
PVDF                      聚偏二氟乙烯，聚(1，1-二氟乙烯)
rcf                       相对离心力
RP                        反相
RP-HPLC                   反相高效液相色谱
rt                        室温
SDS-PAGE                  十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
SEC                       尺寸排阻色谱
TBS                       Tris缓冲盐水
TCEP                      (三(2-羧乙基)膦盐酸盐)
TMB                       3，3′，5，5′-四甲基联苯胺
TRIS                      三羟甲基氨基甲烷，2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1，3-二醇
UPLC                      超效液相色谱
VCD                       活细胞密度
                         序列表
<110>  阿森迪斯药物肿瘤股份有限公司
<120>  IL-2序列及其用途
<130>  CPX72963PC
<160>  48
<170>  PatentIn 版本3.5
<210>  1
<211>  36
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  SEQ A
<400>  1
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1               5                   10                  15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
            20                  25                  30
Pro Lys Leu Thr
        35
<210>  2
<211>  95
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  SEQ B
<400>  2
Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys
1               5                   10                  15
His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu
            20                  25                  30
Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile
        35                  40                  45
Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr
    50                  55                  60
Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu
65                  70                  75                  80
Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
                85                  90                  95
<210>  3
<211>  36
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  SEQ A具有K34A突变
<400>  3
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1               5                   10                  15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
            20                  25                  30
Pro Ala Leu Thr
        35
<210>  4
<211>  36
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  SEQ A具有K34C突变
<400>  4
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1               5                   10                  15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
            20                  25                  30
Pro Cys Leu Thr
        35
<210>  5
<211>  36
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  SEQ A具有K34G突变
<400>  5
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1               5                   10                  15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
            20                  25                  30
Pro Gly Leu Thr
        35
<210>  6
<211>  36
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  SEQ A具有K34S突变
<400>  6
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1               5                   10                  15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
            20                  25                  30
Pro Ser Leu Thr
        35
<210>  7
<211>  36
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  SEQ A具有K34T突变
<400>  7
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1               5                   10                  15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
            20                  25                  30
Pro Thr Leu Thr
        35
<210>  8
<211>  36
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  SEQ A具有K34Q突变
<400>  8
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1               5                   10                  15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
            20                  25                  30
Pro Gln Leu Thr
        35
<210>  9
<211>  36
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  SEQ A具有K34E突变
<400>  9
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1               5                   10                  15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
            20                  25                  30
Pro Glu Leu Thr
        35
<210>  10
<211>  36
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  SEQ A具有K34N突变
<400>  10
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1               5                   10                  15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
            20                  25                  30
Pro Asn Leu Thr
        35
<210>  11
<211>  36
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  SEQ A具有K34D突变
<400>  11
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1               5                   10                  15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
            20                  25                  30
Pro Asp Leu Thr
        35
<210>  12
<211>  95
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  SEQ B具有C87S突变
<400>  12
Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys
1               5                   10                  15
His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu
            20                  25                  30
Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile
        35                  40                  45
Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr
    50                  55                  60
Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu
65                  70                  75                  80
Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
                85                  90                  95
<210>  13
<211>  133
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  式(I)的IL-2具有SEQ A = SEQ ID NO:1和SEQ B = SEQ ID
       NO:2
<400>  13
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Lys Leu Thr Cys Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
        35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>  14
<211>  133
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  式(I)的IL-2具有SEQ A = SEQ ID NO:1和SEQ B = SEQ ID
       NO:12
<400>  14
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Lys Leu Thr Cys Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
        35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>  15
<211>  132
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  阿地白介素
<400>  15
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1               5                   10                  15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
            20                  25                  30
Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
        35                  40                  45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
    50                  55                  60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65                  70                  75                  80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
                85                  90                  95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
            100                 105                 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
        115                 120                 125
Ser Thr Leu Thr
    130
<210>  16
<211>  402
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  DNA序列，用于编码SEQ ID NO:18的IL-2
<400>  16
cccacttctt cgtcaaccaa aaagacacaa cttcaattgg agcacttatt gctggacttg      60
cagatgatat tgaatggaat taataactac aaaaatccta agcttacttg tatgctgact     120
ttcaaatttt atatgccaaa aaaggcaact gagctaaagc atctgcaatg tttagaagag     180
gaactaaaac cattggaaga ggtattgaat ctcgctcaat ctaaaaactt tcatcttcgt     240
cctagagatt tgatttccaa catcaatgtt atcgtgctgg aattgaaggg tagcgaaaca     300
actttcatgt gcgaatacgc cgatgagaca gctactatcg tcgagttctt aaacagatgg     360
attacatttt cccagagtat tatctcaacg ttgacctaat ga                        402
<210>  17
<211>  405
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  DNA，用于编码SEQ ID NO:14的IL-2
<400>  17
gcacctacat cttcttcaac taaaaagact caattacagt tggagcatct cttgcttgat      60
ttgcaaatga ttctgaatgg tatcaacaac tataaaaatc caaagctaac ctgtatgttg     120
acgtttaagt tttacatgcc aaaaaaagca acagagctta agcacttgca atgtttggaa     180
gaggaactga aaccccttga agaggttttg aatctggctc agtccaaaaa cttccattta     240
agacctcgtg acctaatttc caacatcaat gtaatcgtct tggaattgaa gggatcagag     300
acaactttca tgtgcgaata cgctgatgag actgccacaa tagtggaatt tctgaataga     360
tggattacct tctcgcaaag cattatcagt actttaactt aatga                     405
<210>  18
<211>  132
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  SEQ ID NO:1的IL-2序列 + 半胱氨酸 + SEQ ID NO:12
<400>  18
Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu
1               5                   10                  15
Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn
            20                  25                  30
Pro Lys Leu Thr Cys Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys
        35                  40                  45
Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro
    50                  55                  60
Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg
65                  70                  75                  80
Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys
                85                  90                  95
Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr
            100                 105                 110
Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile
        115                 120                 125
Ser Thr Leu Thr
    130
<210>  19
<211>  4844
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  载体pCSP1007
<400>  19
gggccccaaa catttgctcc ccctagtctc cagggaaatg taaaatatac tgctaataga      60
aaacagtaag acgctcagtt gtcaggataa ttacgttcga ctgtagtaaa acaggaatct     120
gtattgttag aaagaacgag agttttttac ggcgccgcca tattgggccg tgtgaaaaca     180
gcttgaaacc ccactacttt caaaggttct gttgctatac acgaaccatg tttaaccaac     240
ctcgcttttg acttgactga agtcatcggt taacaatcaa gtaccctagt ctgtctgaat     300
gctcctttcc atattcagta ggtgtttctt gcacttttgc atgcactgcg gaagaattag     360
ccaatagcgc gtttcatatg cgcttttacc ccctcttttg tcaagcgcaa aatgcctgta     420
agatttggtg ggggtgtgag ccgttagctg aagtacaaca ggctaattcc ctgaaaaaac     480
tgcagctcag ggattcccac tatttggtat tctgatatgt ttttcctgat atgcatcaaa     540
actctaatct aaaacctgaa tctccgctat tttttttttt tttgatgacc ccgttttcgt     600
gacaaattaa tttccaacgg ggtcttgtcc ggataagaga attttgtttg attatccgtt     660
cggataaatg gacgcctgct ccatattttt ccggttatta ccccacctgg aagtgcccag     720
aattttccgg ggattacgga taatacggtg gtctggatta attaatacga gatctcaggg     780
attcccacta tttggtattc tgatatgttt ttcctgatat gcatcaaaac tctaatctaa     840
aacctgaatc tccgctattt tttttttttt tgatgacccc gttttcgtga caaattaatt     900
tccaacgggg tcttgtccgg ataagagaat tttgtttgat tatccgttcg gataaatgga     960
cgcctgctcc atatttttcc ggttattacc ccacctggaa gtgcccagaa ttttccgggg    1020
attacggata atacggtggt ctggattaat taatacgcca agtcttacat tttgttgcag    1080
tctcgtgcga gtatgtgcaa taataaacaa gatgagccaa tttattggat tagttgcagc    1140
ttgaccccgc catagctagg catagccaag tgctatgggt gttagatgat gcacttggat    1200
gcagtgagtt ttggagtata aaagatcctt aaaattccac ccttcctgca ggccatgaga    1260
tttccttcaa tttttactgc tgttttattc gcagcatcct ccgcattagc tgctccagtc    1320
aacactacaa cagaagatga aacggcacaa attccggctg aagctgtcat cggttactca    1380
gatttagaag gggatttcga tgttgctgtt ttgccatttt ccaacagcac aaataacggg    1440
ttattgttta taaatactac tattgccagc attgctgcta aagaagaagg ggtatctctc    1500
gagaaaagac ccacttcttc gtcaaccaaa aagacacaac ttcaattgga gcacttattg    1560
ctggacttgc agatgatatt gaatggaatt aataactaca aaaatcctaa gcttacttgt    1620
atgctgactt tcaaatttta tatgccaaaa aaggcaactg agctaaagca tctgcaatgt    1680
ttagaagagg aactaaaacc attggaagag gtattgaatc tcgctcaatc taaaaacttt    1740
catcttcgtc ctagagattt gatttccaac atcaatgtta tcgtgctgga attgaagggt    1800
agcgaaacaa ctttcatgtg cgaatacgcc gatgagacag ctactatcgt cgagttctta    1860
aacagatgga ttacattttc ccagagtatt atctcaacgt tgacctaata gcggccgcct    1920
cggccggatc cacgtccgac ggcggcccac gggtccgagg cctcggagat ccgtccccct    1980
tttcctttgt cgatatcatg taattagtta tgtcacgctt acattcacgc cctcccccca    2040
catccgctct aaccgaaaag gaaggagtta gacaacctga agtctaggtc cctatttatt    2100
tttttatagt tatgttagta ttaagaacgt tatttatatt tcaaattttt cttttttttc    2160
tgtacagacg cgtgtacgca tgtaacatta tactgaaaac cttgcttgag aaggttttgg    2220
gacgctcgaa ggctttaatt tgcaagctac cggtggtacc acacaccata gcttcaaaat    2280
gtttctactc cttttttact cttccagatt ttctcggact ccgcgcatcg ccgtaccact    2340
tcaaaacacc caagcacagc atactaaatt tcccctcttt cttcctctag ggtgtcgtta    2400
attacccgta ctaaaggttt ggaaaagaaa aaagagaccg cctcgtttct ttttcttcgt    2460
cgaaaaaggc aataaaaatt tttatcacgt ttctttttct tgaaaatttt tttttttgat    2520
ttttttctct ttcgatgacc tcccattgat atttaagtta ataaacggtc ttcaatttct    2580
caagtttcag tttcattttt cttgttctat tacaactttt tttacttctt gctcattaga    2640
aagaaagcat agcaatctaa tctaagggcg gtgttgacaa ttaatcatcg gcatagtata    2700
tcggcatagt ataatacgac aaggtgagga actaaaccat ggccaagttg accagtgccg    2760
ttccggtgct caccgcgcgc gacgtcgccg gagcggtcga gttctggacc gaccggctcg    2820
ggttctcccg ggacttcgtg gaggacgact tcgccggtgt ggtccgggac gacgtgaccc    2880
tgttcatcag cgcggtccag gaccaggtgg tgccggacaa caccctggcc tgggtgtggg    2940
tgcgcggcct ggacgagctg tacgccgagt ggtcggaggt cgtgtccacg aacttccggg    3000
acgcctccgg gccggccatg accgagatcg gcgagcagcc gtgggggcgg gagttcgccc    3060
tgcgcgaccc ggccggcaac tgcgtgcact tcgtggccga ggagcaggac tgatcagtac    3120
ttactgacaa taaaaagatt cttgttttca agaacttgtc atttgtatag tttttttata    3180
ttgtagttgt tctattttaa tcaaatgtta gcgtgattta tatttttttt cgcctcgaca    3240
tcatctgccc agatgcgaag ttaagtgcgc agaaagtaat atcatgcgtc aatcgtatgt    3300
gaatgctggt cgctatactg gtaccgagct ctgagcaaaa ggccagcaaa gggccaggaa    3360
ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca    3420
caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc    3480
gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata    3540
cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta    3600
tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca    3660
gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga    3720
cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg    3780
tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg    3840
tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg    3900
cagacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag    3960
aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg ggagctctta attaagcggc    4020
cgcagcaacg ttgtcactga agttggcatc agtatctaca aaccctacat acctcttgaa    4080
ggtccagaag gtaagcattt gcccgctcca ttcctacccg acatatccac tctacatttt    4140
atagttcaag gcaccgaaaa agttcgaaac aagaagtttg ttcctgataa caaggatttc    4200
tttattggtg ggacttcatt tactgtctcc aagaaggaca tttctgctgt cataaccgag    4260
atagtctcac agttcgagtc tactgatgac caaaagtcag agaaatttac catgaaatct    4320
cctcctccgg ttgctttagt tgggcataat ctgataggag acctcaagac actgaagaat    4380
gcgggtatca ccattcccat acttccaatc ataggatccg gcgcgccgat actcgagaat    4440
tatggcttaa tcaagtgaat acatcaaagt caaacttaaa atacattctt cgcaggcttg    4500
gcttgccaca tagttttctt cacaatgctg caaatgacgc ttattatacc cttttggcat    4560
cgttgaagct tgcacaaacg aacgtcccac ttaatcttct gtactctgaa gaggagtggg    4620
aaataccaag aaaaacatca aactcgaatg attttcccga acccctacca caagatattc    4680
atcagctgcg agataggctg atcaggagca agctcgtacg agaagaaaca aaatgacaaa    4740
aaaaatccta tactatatag gttacaaata aaaaagtatc aaaaatgaag cctgcatctc    4800
tcaggcaaat ggcattctga catcctctgc ggccgcttaa ttaa                     4844
<210>  20
<211>  4847
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  载体pCKP1036
<400>  20
gggccccaaa catttgctcc ccctagtctc cagggaaatg taaaatatac tgctaataga      60
aaacagtaag acgctcagtt gtcaggataa ttacgttcga ctgtagtaaa acaggaatct     120
gtattgttag aaagaacgag agttttttac ggcgccgcca tattgggccg tgtgaaaaca     180
gcttgaaacc ccactacttt caaaggttct gttgctatac acgaaccatg tttaaccaac     240
ctcgcttttg acttgactga agtcatcggt taacaatcaa gtaccctagt ctgtctgaat     300
gctcctttcc atattcagta ggtgtttctt gcacttttgc atgcactgcg gaagaattag     360
ccaatagcgc gtttcatatg cgcttttacc ccctcttttg tcaagcgcaa aatgcctgta     420
agatttggtg ggggtgtgag ccgttagctg aagtacaaca ggctaattcc ctgaaaaaac     480
tgcagctcag ggattcccac tatttggtat tctgatatgt ttttcctgat atgcatcaaa     540
actctaatct aaaacctgaa tctccgctat tttttttttt tttgatgacc ccgttttcgt     600
gacaaattaa tttccaacgg ggtcttgtcc ggataagaga attttgtttg attatccgtt     660
cggataaatg gacgcctgct ccatattttt ccggttatta ccccacctgg aagtgcccag     720
aattttccgg ggattacgga taatacggtg gtctggatta attaatacga gatctcaggg     780
attcccacta tttggtattc tgatatgttt ttcctgatat gcatcaaaac tctaatctaa     840
aacctgaatc tccgctattt tttttttttt tgatgacccc gttttcgtga caaattaatt     900
tccaacgggg tcttgtccgg ataagagaat tttgtttgat tatccgttcg gataaatgga     960
cgcctgctcc atatttttcc ggttattacc ccacctggaa gtgcccagaa ttttccgggg    1020
attacggata atacggtggt ctggattaat taatacgcca agtcttacat tttgttgcag    1080
tctcgtgcga gtatgtgcaa taataaacaa gatgagccaa tttattggat tagttgcagc    1140
ttgaccccgc catagctagg catagccaag tgctatgggt gttagatgat gcacttggat    1200
gcagtgagtt ttggagtata aaagatcctt aaaattccac ccttcctgca ggccatgaga    1260
tttccttcaa tttttactgc tgttttattc gcagcatcct ccgcattagc tgctccagtc    1320
aacactacaa cagaagatga aacggcacaa attccggctg aagctgtcat cggttactca    1380
gatttagaag gggatttcga tgttgctgtt ttgccatttt ccaacagcac aaataacggg    1440
ttattgttta taaatactac tattgccagc attgctgcta aagaagaagg ggtatctctc    1500
gagaaaagag cacctacatc ttcttcaact aaaaagactc aattacagtt ggagcatctc    1560
ttgcttgatt tgcaaatgat tctgaatggt atcaacaact ataaaaatcc aaagctaacc    1620
tgtatgttga cgtttaagtt ttacatgcca aaaaaagcaa cagagcttaa gcacttgcaa    1680
tgtttggaag aggaactgaa accccttgaa gaggttttga atctggctca gtccaaaaac    1740
ttccatttaa gacctcgtga cctaatttcc aacatcaatg taatcgtctt ggaattgaag    1800
ggatcagaga caactttcat gtgcgaatac gctgatgaga ctgccacaat agtggaattt    1860
ctgaatagat ggattacctt ctcgcaaagc attatcagta ctttaactta atagcggccg    1920
cctcggccgg atccacgtcc gacggcggcc cacgggtccg aggcctcgga gatccgtccc    1980
ccttttcctt tgtcgatatc atgtaattag ttatgtcacg cttacattca cgccctcccc    2040
ccacatccgc tctaaccgaa aaggaaggag ttagacaacc tgaagtctag gtccctattt    2100
atttttttat agttatgtta gtattaagaa cgttatttat atttcaaatt tttctttttt    2160
ttctgtacag acgcgtgtac gcatgtaaca ttatactgaa aaccttgctt gagaaggttt    2220
tgggacgctc gaaggcttta atttgcaagc taccggtggt accacacacc atagcttcaa    2280
aatgtttcta ctcctttttt actcttccag attttctcgg actccgcgca tcgccgtacc    2340
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cgtcgaaaaa ggcaataaaa atttttatca cgtttctttt tcttgaaaat tttttttttt    2520
gatttttttc tctttcgatg acctcccatt gatatttaag ttaataaacg gtcttcaatt    2580
tctcaagttt cagtttcatt tttcttgttc tattacaact ttttttactt cttgctcatt    2640
agaaagaaag catagcaatc taatctaagg gcggtgttga caattaatca tcggcatagt    2700
atatcggcat agtataatac gacaaggtga ggaactaaac catggccaag ttgaccagtg    2760
ccgttccggt gctcaccgcg cgcgacgtcg ccggagcggt cgagttctgg accgaccggc    2820
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ccctgttcat cagcgcggtc caggaccagg tggtgccgga caacaccctg gcctgggtgt    2940
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tacttactga caataaaaag attcttgttt tcaagaactt gtcatttgta tagttttttt    3180
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ctctcaggca aatggcattc tgacatcctc tgcggccgct taattaa                  4847
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<223>  IL-2突变蛋白
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<212>  PRT
<213>  人工序列
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<212>  PRT
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<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
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Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
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<211>  133
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  式(I)的IL-2具有SEQ A = SEQ ID NO:7和SEQ B = SEQ ID
       NO:12
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        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>  32
<211>  133
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  式(I)的IL-2具有SEQ A = SEQ ID NO:8和SEQ B = SEQ ID
       NO:2
<400>  32
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Gln Leu Thr Cys Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
        35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>  33
<211>  133
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  式(I)的IL-2具有SEQ A = SEQ ID NO:8和SEQ B = SEQ ID
       NO:12
<400>  33
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Gln Leu Thr Cys Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
        35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>  34
<211>  133
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  式(I)的IL-2具有SEQ A = SEQ ID NO:9和SEQ B = SEQ ID
       NO:2
<400>  34
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Glu Leu Thr Cys Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
        35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>  35
<211>  133
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  式(I)的IL-2具有SEQ A = SEQ ID NO:9和SEQ B = SEQ ID
       NO:12
<400>  35
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Glu Leu Thr Cys Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
        35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>  36
<211>  133
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  式(I)的IL-2具有SEQ A = SEQ ID NO:10和SEQ B = SEQ ID
       NO:2
<400>  36
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Asn Leu Thr Cys Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
        35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>  37
<211>  133
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  式(I)的IL-2具有SEQ A = SEQ ID NO:10和SEQ B = SEQ ID
       NO:12
<400>  37
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Asn Leu Thr Cys Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
        35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>  38
<211>  133
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  式(I)的IL-2具有SEQ A = SEQ ID NO:11和SEQ B = SEQ ID
       NO:2
<400>  38
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Asp Leu Thr Cys Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
        35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>  39
<211>  133
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  式(I)的IL-2具有SEQ A = SEQ ID NO:11和SEQ B = SEQ ID
       NO:12
<400>  39
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Asp Leu Thr Cys Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
        35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>  40
<211>  402
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  DNA序列，用于在大肠杆菌中编码SEQ ID NO:14
<400>  40
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt acttctggat      60
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac ctgtatgctc     120
acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa     180
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta     240
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa     300
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga     360
tggattacct tttctcaaag catcatctca acactgactt aa                        402
<210>  41
<211>  402
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  DNA序列，用于在大肠杆菌中编码SEQ ID NO:35
<400>  41
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt acttctggat      60
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccgaactcac ctgtatgctc     120
acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa     180
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta     240
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa     300
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga     360
tggattacct tttctcaaag catcatctca acactgactt aa                        402
<210>  42
<211>  402
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  DNA序列，用于在大肠杆菌中编码SEQ ID NO:39
<400>  42
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt acttctggat      60
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccgacctcac ctgtatgctc     120
acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa     180
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta     240
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa     300
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga     360
tggattacct tttctcaaag catcatctca acactgactt aa                        402
<210>  43
<211>  402
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  DNA序列，用于在大肠杆菌中编码SEQ ID NO:33
<400>  43
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt acttctggat      60
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc cccaactcac ctgtatgctc     120
acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa     180
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta     240
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa     300
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga     360
tggattacct tttctcaaag catcatctca acactgactt aa                        402
<210>  44
<211>  401
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  DNA序列，用于在大肠杆菌中编码SEQ ID NO:29
<400>  44
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt acttctggat      60
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccagcctcac ctgtatgctc     120
acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa     180
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta     240
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa     300
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga     360
tggattacct tttctcaaag catcatctca acactgactt a                         401
<210>  45
<211>  134
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  IL-2变体
<400>  45
Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
1               5                   10                  15
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
            20                  25                  30
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro
        35                  40                  45
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
    50                  55                  60
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
65                  70                  75                  80
Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
                85                  90                  95
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
            100                 105                 110
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser
        115                 120                 125
Ile Ile Ser Thr Leu Thr
    130
<210>  46
<211>  139
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  IL-2变体，具有His-tag
<400>  46
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
            20                  25                  30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
        35                  40                  45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
    50                  55                  60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
            100                 105                 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Leu Thr His His His His His His
    130                 135
<210>  47
<211>  19
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  信号肽S1
<400>  47
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1               5                   10                  15
Val Gln Cys
<210>  48
<211>  16
<212>  PRT
<213>  人工序列
<220>
<223>  信号肽S2
<400>  48
Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala
1               5                   10                  15

Claims (43)

1.包含一个或多个式(I)的IL-2蛋白的缀合物或其药学上可接受的盐
Ala-SEQ A-Cys*-SEQ B(I)，
其中
SEQA与SEQ ID NO：1具有至少94％的序列同一性；
SEQ B与SEQ ID NO：2具有至少94％的序列同一性；
Ala是丙氨酸残基；以及
Cys*是半胱氨酸残基。
2.如权利要求1所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中SEQ A选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11。
3.如权利要求1或2所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中SEQA具有SEQ ID NO：1的序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中SEQ B具有SEQID NO：2的序列。
5.如权利要求1-3中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中SEQ B具有SEQID NO：12的序列。
6.如权利要求1-5中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中IL-2蛋白是偏向性的IL-2。
7.如权利要求1-3和5-6中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中IL-2蛋白具有SEQ ID NO：14的序列。
8.如权利要求1-7中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中IL-2蛋白包含与式(I)的IL-2蛋白中用星号标记的半胱氨酸缀合的Mmod部分。
9.如权利要求1-8中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述缀合物是偏向性的IL-2。
10.如权利要求1-9中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中该缀合物是式(Ia)或(Ib)的IL-2缀合物或其药学上可接受的盐
Figure FDA0004113465810000021
其中
-D包括式(I)的IL-2蛋白；
-L1-是一个与D共价和可逆地连接的接头分子；
-L2-是一个化学键或者是一个间隔基部分；
-Z是一个聚合物部分或一个取代的脂肪酸部分；
x是一个整数，选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16；以及
y是一个选自2、3、4和5组成的组的整数。
11.如权利要求8-10中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中Mmod是聚合物部分。
12.如权利要求8-11中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中为式(A-1)
Figure FDA0004113465810000022
其中
FG是一种连接；
SP是间隔基部分；以及
POL是聚合物。
13.如权利要求8-12中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中Mmod具有0.5kDa至1000kDa范围的分子量。
14.如权利要求8-13中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中Mmod是基于PEG的聚合物。
15.如权利要求8-14中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中Mmod与IL-2蛋白通过稳定的连接物连接。
16.如权利要求8-15中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中Mmod为式(A-1a)
Figure FDA0004113465810000031
其中
标有星号的虚线表示与式(I)中标有星号的半胱氨酸的硫的连接，
b1是选自下组的整数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20，
b2是选自下组的整数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20；以及
b3是12到22700的整数。
17.如权利要求8-15中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中Mmod为式(A-1d)
Figure FDA0004113465810000032
其中
标有星号的虚线表示与式(I)中标有星号的半胱氨酸的硫的连接，
b1是选自下组的整数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20，
b2是选自下组的整数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20；以及
b3是从12到22700的整数。
18.如权利要求8-15中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中Mmod为式(A-1e)
Figure FDA0004113465810000033
其中
标有星号的虚线表示与式(I)中标有星号的半胱氨酸的硫的连接，
b1是选自下组的整数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20，
b2是选自下组的整数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20；以及
b3是从12到22700的整数。
19.如权利要求8-15中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中在多个缀合物中Mmod包括式(A-1d)和式(A-1e)的混合物。
20.如权利要求10-19中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中-Z是聚合物部分。
21.如权利要求10-20中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中-Z是具有1kDa至1000kDa范围分子量的聚合物部分。
22.如权利要求10-21中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中-Z是基于PEG的聚合物部分。
23.如权利要求10-22中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中-Z包含式(A)的部分
Figure FDA0004113465810000041
其中
-BP1＜、-BP2＜、-Bp3＜相互独立地选自-N＜和-C(R8)＜组成的组；
-R8选自-H、C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基组成的组；
-P1、-P2、-P3、-P4相互独立地是包含至少40％的PEG的PEG基链，且其分子量为3至40kDa；
-C1、-C2相互独立地选自下组：C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基。其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基可任选被一个或多个-R9所取代，这些基团相同或不同，并且其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基可任选被一个或多个选自下组的基团中断：-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(R10)-、-S(O)2N(R10)-、-S(O)N(R10)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(R10)S(O)2N(R10a)-、-S-、-N(R10)-、-OC(OR10)(R10a)-、-N(R10)C(O)N(R10a)-和-OC(O)N(R10)；
每个T独立地选自由以下组成的组：苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢萘基、C3-10环烷基、3-10元杂环基、8-11元杂二环基、8-30元碳多环基和8-30元杂多环基；其中每个T独立任选地被一个或多个相同或不同的-R9取代；
每个-R9独立地选自下组：卤素、-CN、氧代(＝O)、COOR11、-OR11、-C(O)R11、-C(O)N(R11R11a)、-S(O)2N(R11R11a)、-S(O)N(R11R11a)、-S(O)2R11、-S(O)R11、-N(R11)S(O)2N(R11aR11b)、-SR11、-N(R11R11a)、-NO2、-OC(O)R11、-N(R11)C(O)R11a、-N(R11)S(O)2R11a、-N(R11)S(O)R11a、-N(R11)C(O)OR11ａ、-N(R11)C(O)N(R11aR11b)、-OC(O)N(R11R11a)，以及C1-6烷基；其中C1-6烷基可任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；以及
每个-R10、-R10ａ、R11、R11ａ和R11b独立地选自由H和C1-6烷基组成的组，其中C1-6烷基可任选被一个或多个相同或不同的卤素取代。
24.如权利要求23所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中C1和C2为式(A-a)
Figure FDA0004113465810000051
其中
标有星号的虚线表示连接于Bp1；
无标记的虚线表示分别连接于Bp2或Bp3；
q1选自1、2、3、4、5、6、7和8组成的组；
q2选自1、2、3、4和5组成的组；
q3选自1、2、3、4、5、6、7和8组成的组；以及
q4选自1、2和3组成的组。
25.如权利要求23或24所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中P1、P２、P3和P4相互独立的是式(A-b)
Figure FDA0004113465810000052
其中
虚线表示与-Z的其余部分的连接；
m是0或1；
p是70至900之间的整数；以及
q选自1、2、3、4、5和6组成的组。
26.如权利要求23-25中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中BP1是-N＜。
27.如权利要求23-26中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中Bp2和Bp2都是-CH＜。
28.如权利要求10-27中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中-Z包含式(A-c)的部分：
Figure FDA0004113465810000061
其中
p1、p2、p3、p4相互独立地是70至900的整数。
29.如权利要求10-28中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中-L1-是式(IX-a)：
Figure FDA0004113465810000062
其中
标有星号的虚线表示与-D的氮的连接，未标的虚线表示与-L2-Z的连接；
n是0、1、2、3或4；
＝Y1选自＝O和＝S；
-Y2选自-O-和-S-；
-Y3选自-O-和-S-；
-Y4-选自-O-、-NR5-和-C(R6R6a)-；
＝Y5选自＝O和＝S；
-R3、-R5、-R6、-R6a相互独立地选自-H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2，2-二甲基丙基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基和3，3-二甲基丙基；
-R4选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2，2-二甲基丙基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基和3，3-二甲基丙基；
-W-选自C1-20烷基，其任选被一个或多个选自以下的基团中断：C3-10环烷基、8至30元的碳多环基、3至10元的杂环基、-C(O)N(R7)-、-O-、-S-和-N(R7)-；
-Nu选自-N(R7R7a)、-N(R7OH)、-N(R7)-N(R7aR7b)、-S(R7)、-COOH、
Figure FDA0004113465810000071
-Ar-选自以下基团
Figure FDA0004113465810000081
其中
虚线表示与-L1-的其余部分的连接，
-Z1-选自-O-、-S-和-N(R7)-，并且
-Z2-是-N(R7)-；并且
-R7、-R7a、-R7b相互独立地选自-H、C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基；
其中，-L1-任选地进一步被取代。
30.如权利要求10-29中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中-L1-是式(IX-c)
Figure FDA0004113465810000082
其中
标有星号的虚线表示与-D的氮的连接；
未标记的虚线表示与-L2-Z的连接；以及
s1是一个整数，选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
31.如权利要求30所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中s1是3。
32.如权利要求10-31中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中-L2-是间隔基。
33.如权利要求10-32中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中-L2-选自-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry1)-、-S(O)2N(Ry1)-、-S(O)N(Ry1)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry1)S(O)2N(Ry1a)-、-S-、-N(Ry1)-、-OC(ORy1)(Ry1a)-、-N(Ry1)C(O)N(Ry1a)-、-OC(O)N(Ry1)-、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基；其中-T-、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选地被一个或多个相同或不同的-Ry2所取代，并且其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选地被一个或多个选自以下的基团中断：-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry3)-、-S(O)2N(Ry3)-、-S(O)N(Ry3)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry3)S(O)2N(Ry3a)-、-S-、-N(Ry3)-、-OC(ORy3)(Ry3a)-、-N(Ry3)C(O)N(Ry3a)-和-OC(O)N(Ry3)-；
-Ry1和-Ry1a相互独立地选自-H、-T、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基。其中-T、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选地被一个或多个相同或不同的-Ry2取代，并且其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选地被一个或多个选自以下的基团中断：-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry4)-、-S(O)2N(Ry4)-、-S(O)N(Ry4)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry4)S(O)2N(Ry4a)-、-S-、-N(Ry4)-、-OC(ORy4)(Ry4a)-、-N(Ry4)C(O)N(Ry4a)-和-OC(O)N(Ry4)-；
T各自独立地选自下组：苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢萘基、C3-10环烷基、3-10元杂环基、8-11元杂二环基、8-30元碳多环基和8-30元杂多环基；其中T各自独立地被一个或多个相同或不同的-Ry2取代。
-Ry2各自独立地选自下组：卤素、-CN、氧代(＝O)、-COORy5、-ORy5、-C(O)Ry5、-C(O)N(Ry5Ry5a)、-S(O)2N(Ry5Ry5a)、-S(O)N(Ry5Ry5a)、-S(O)2Ry5、-S(O)Ry5、-N(Ry５)S(O)2N(Ry5aRy5b)、-SRy５、-N(Ry5Ry5a)、-NO2、-OC(O)Ry５、-N(Ry5)C(O)Ry5a、-N(Ry5)S(O)2Ry5ａ、-N(Ry5)S(O)Ry5a、-N(Ry ５)C(O)ORy5ａ、-N(Ry5)C(O)N(Ry5aRy5b)、-OC(O)N(Ry5Ry5a)和C1-6烷基；其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代；和
-Ry3、-Ry3ａ、-Ry4、-Ry4a、-Ry５、-Ry5a和-Ry5b各自独立地选自-H和C1-6烷基，其中C1-6烷基任选被一个或多个相同或不同的卤素取代。
34.如权利要求10-33中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中-L2-是C1-20烷基链，其任选被一个或多个独立选自-O-、-T-和-C(O)N(Ry1)-的基团中断；并且该C1-20烷基链任选被一个或多个独立选自-OH、-T和-C(O)N(Ry6Ry6a)的基团取代；其中-Ry1、-Ry6、-Ry6ａ独立地选自H和C1-4烷基，并且其中T选自苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢萘基、C3-10环烷基、3至10元杂环基、8至11元杂二环基、8至30元碳多环基和8至30元杂多环基。
35.如权利要求10-34中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中-L２-是式(IX-e)
Figure FDA0004113465810000101
其中
标有星号的虚线表示与-L1-连接；
未标记的虚线表示与-Z连接；以及
s2是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20的整数。
36.如权利要求35所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中s2是3。
37.包含至少一种如权利要求1-36中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐及至少一种赋形剂的药物组合物。
38.如权利要求1-36中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐或如权利要求37所述的药物组合物，其用作药物。
39.如权利要求1-36中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐或如权利要求37所述的药物组合物，其用于治疗癌症的方法。
40.如权利要求39中所述用途的缀合物或其药学上可接受的盐或药物组合物，其中癌症是选自肉瘤、脊索瘤、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、威尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸癌、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、肾细胞癌、尿路上皮癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞癌、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、急性髓性白血病和白血病。
41.如权利要求39或40中所述用途的缀合物或其药学上可接受的盐或药物组合物，其中缀合物或其药学上可接受的盐或药物组合物在一种或多种其他药物的施用之前、同时或之后向患者施用。
42.如权利要求41中所述用途的缀合物或其药学上可接受的盐或药物组合物，其中所述一种或多种其他药物选自模式识别受体激动剂(PRRA)、细胞毒/化疗药物、免疫检查点抑制剂或拮抗剂、免疫检查点激动剂、免疫激活受体激动剂、多特异性药物、抗体-药物缀合物(ADC)、抗体-佐剂缀合物(AAC)、放射性核素或定向放射性核素治疗剂、DNA损伤修复抑制剂、肿瘤代谢抑制剂、模式识别受体激动剂、蛋白激酶抑制剂、趋化因子和趋化物受体激动剂、趋化因子或趋化因子受体拮抗剂、细胞因子受体激动剂、死亡受体激动剂、CD47或SIRPα拮抗剂、溶瘤药物、信号转换蛋白、表观遗传修饰剂、肿瘤肽或肿瘤疫苗、热休克蛋白(HSP)抑制剂、蛋白裂解酶、泛素和蛋白酶体抑制剂、粘附分子拮抗剂，激素，包括激素肽和合成激素，以及采用的细胞疗法，如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)疗法、嵌合抗原受体(CAR)疗法、T细胞疗法、自然杀伤(NK)细胞疗法、CAR-T疗法、CAR-NK疗法、CAR-γδ疗法、CAR-巨噬细胞疗法，或任何其他采用基因修饰或未经基因修饰的免疫细胞类型的细胞疗法。
43.如权利要求38或39中所述用途的缀合物或其药学上可接受的盐或药物组合物，其中缀合物或其药学上可接受的盐或药物组合物导致γδT细胞比基线增加至少100倍。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW202210502A (zh) 2020-06-03 2022-03-16 丹麥商阿森迪斯腫瘤製藥有限公司 新穎il-2序列及其用途
EP4384204A1 (en) 2021-08-13 2024-06-19 Cytune Pharma Il-2/il-15rbetagamma agonist combination with antibody-drug conjugates for treating cancer
WO2023110727A2 (en) * 2021-12-13 2023-06-22 Ascendis Pharma Oncology Division A/S Novel cancer treatments with tlr7/8 agonists
CN114349843B (zh) * 2022-01-18 2024-05-14 浙江博锐生物制药有限公司 白细胞介素-2衍生物及其制备方法和应用
WO2023161371A1 (en) * 2022-02-25 2023-08-31 Danmarks Tekniske Universitet Engineered bacteria secreting cytokines for use in cancer immunotherapy

Family Cites Families (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5089261A (en) 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US6624142B2 (en) 1997-12-30 2003-09-23 Enzon, Inc. Trimethyl lock based tetrapartate prodrugs
DZ2788A1 (fr) 1998-05-15 2003-12-01 Bayer Ag Agonistes et antagonistes selectifs à IL-2.
US6689353B1 (en) 2000-06-28 2004-02-10 Bayer Pharmaceuticals Corporation Stabilized interleukin 2
EP2316490A3 (en) 2000-10-31 2012-02-01 PR Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for enhanced delivery of bioactive molecules
JP2005507870A (ja) 2001-08-13 2005-03-24 ユニバーシティ・オブ・サザン・カリフォルニア 低毒性のインターロイキン−２突然変異体
US7122189B2 (en) 2002-08-13 2006-10-17 Enzon, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers
US7332164B2 (en) 2003-03-21 2008-02-19 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Heterobifunctional polymeric bioconjugates
DK1620118T3 (da) 2003-04-08 2014-09-29 Yeda Res & Dev Reversible pegylerede lægemidler
US7690003B2 (en) 2003-08-29 2010-03-30 Fuller Jeffrey C System and method for increasing data throughput using thread scheduling
TW200526254A (en) 2003-09-19 2005-08-16 Novo Nordisk As Novel GLP-1 derivatives
US20060234205A1 (en) 2004-03-05 2006-10-19 Chiron Corporation In vitro test system for predicting patient tolerability of therapeutic agents
CA2786794C (en) 2004-03-23 2017-09-12 Complex Biosystems Gmbh Aromatic polymeric cascade prodrug linker reagent
WO2006069246A2 (en) 2004-12-22 2006-06-29 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides
US8450269B2 (en) 2006-02-03 2013-05-28 Prolor Biotech Ltd. Long-acting growth hormone and methods of producing same
CN101534643A (zh) 2006-09-15 2009-09-16 安佐制药股份有限公司 用于递送寡核苷酸的基于位阻酯的生物可降解连接体
SI2173890T1 (sl) 2007-06-21 2011-06-30 Univ Muenchen Tech Biološko aktivni proteini, ki imajo povečano in vivo in/ali in vitro stabilnost
CA2693616A1 (en) 2007-07-11 2009-01-15 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Polymeric drug delivery system containing a multi-substituted aromatic moiety
US8906847B2 (en) 2008-02-01 2014-12-09 Ascendis Pharma A/S Prodrug comprising a drug linker conjugate
JP6112766B2 (ja) 2008-04-29 2017-04-12 アセンディス ファーマ グロウス ディスオーダーズ ディヴィジョン エー／エス Ｐｅｇ化された組換えヒト成長ホルモン化合物
JP2011520983A (ja) 2008-05-23 2011-07-21 エンゾン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド オリゴヌクレオチドの送達のための細胞内遊離可能ジスルフィドリンカーを含有するポリマーシステム
WO2010085495A1 (en) 2009-01-21 2010-07-29 Amgen Inc. Compositions and methods of treating inflammatory and autoimmune diseases
MX362028B (es) 2009-02-03 2019-01-04 Amunix Pharmaceuticals Inc Polipeptidos recombinantes extendidos y composiciones que comprenden los mismos.
US8331611B2 (en) 2009-07-13 2012-12-11 Raytheon Company Overlay information over video
US20110007134A1 (en) 2009-07-13 2011-01-13 Raytheon Company Synchronizing video images and three dimensional visualization images
WO2011008613A1 (en) 2009-07-16 2011-01-20 Skyhook Wireless, Inc. Systems and methods for using a hybrid satellite and wlan positioning system
RU2554854C9 (ru) 2009-07-31 2017-02-03 Асцендис Фарма Ас Биоразлагаемые нерастворимые в воде гидрогели на основе полиэтиленгликоля
JP5954789B2 (ja) 2009-08-10 2016-07-20 ユーシーエル ビジネス パブリック リミテッド カンパニー 機能的分子の可逆的共有結合
ES2667025T3 (es) 2009-12-15 2018-05-09 Ascendis Pharma Endocrinology Division A/S Composición seca de hormona de crecimiento unida transitoriamente a un portador de polímero
CN102724967A (zh) 2009-12-31 2012-10-10 安龙制药公司 包括可释放的脲连接体的含芳香胺化合物的聚合缀合物
US9561285B2 (en) 2010-01-22 2017-02-07 Ascendis Pharma As Carrier-linked carbamate prodrug linkers
US8754190B2 (en) 2010-05-05 2014-06-17 Prolynx Llc Controlled release from macromolecular conjugates
US8946405B2 (en) 2010-05-05 2015-02-03 Prolynx Llc Controlled release from solid supports
EA024755B1 (ru) 2010-05-21 2016-10-31 ИксЭль-ПРОТЕИН ГМБХ Биосинтетические нерегулярные спиральные полипептиды пролина/аланина и их применения
JP5594791B2 (ja) 2010-06-30 2014-09-24 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 属性判定方法、属性判定装置、プログラム、記録媒体および属性判定システム
HUE054318T2 (hu) 2010-11-12 2021-08-30 Nektar Therapeutics IL-2 molekularész konjugátumai és polimer
WO2012088446A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Superagonists and antagonists of interleukin-2
EP3075745B1 (en) 2011-02-10 2018-09-05 Roche Glycart AG Mutant interleukin-2 polypeptides
AU2012296950B2 (en) 2011-08-12 2016-09-22 Ascendis Pharma A/S Polymeric hyperbranched carrier-linked prodrugs
KR102226702B1 (ko) 2011-09-07 2021-03-11 프로린크스 엘엘시 생분해성 교차결합을 가지는 하이드로젤
WO2013036857A1 (en) 2011-09-07 2013-03-14 Prolynx Llc Sulfone linkers
WO2014028748A1 (en) * 2012-08-15 2014-02-20 Irm Llc Interleukin 2 antibodies and antibody complexes
CA2884910C (en) 2012-10-11 2021-07-13 Ascendis Pharma Ophthalmology Division A/S Vegf neutralizing prodrugs for the treatment of ocular conditions
WO2014056926A1 (en) 2012-10-11 2014-04-17 Ascendis Pharma A/S Hydrogel prodrugs
EP2908845A1 (en) 2012-10-17 2015-08-26 Novo Nordisk Health Care AG Fatty acid acylated amino acids for growth hormone delivery
WO2014100014A1 (en) 2012-12-17 2014-06-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Super-2 complexes with antibody to augment il-2 therapy
ES2872848T3 (es) 2014-02-21 2021-11-02 Nektar Therapeutics India Pvt Ltd Agonistas selectivos de IL-2Rbeta en combinación con un anticuerpo anti-CTLA-4 o un anticuerpo anti-PD-1
CA2955569C (en) 2014-08-06 2023-02-14 Ascendis Pharma A/S Prodrugs comprising an aminoalkyl glycine linker
CA2968282A1 (en) 2014-11-18 2016-05-26 Thomas Kurpiers Polymeric hgh prodrugs
CA3007976C (en) 2016-01-08 2023-09-26 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Cnp prodrugs with large carrier moieties
BR112018017091A2 (pt) 2016-03-01 2019-01-02 Ascendis Pharma Bone Diseases As profármacos de pth
KR20230149857A (ko) 2016-07-07 2023-10-27 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 항체-애쥬번트 접합체
US20190224329A1 (en) 2016-09-29 2019-07-25 Ascendis Pharma Bone Diseases A/S Incremental Dose Finding in Controlled-Release PTH Compounds
CU24483B1 (es) * 2016-11-15 2020-04-02 Ct Inmunologia Molecular Método para incrementar los niveles de secreción de la interleucina-2
WO2018112108A1 (en) 2016-12-13 2018-06-21 Bolt Biotherapeutics, Inc. Antibody adjuvant conjugates
AU2018240375C1 (en) 2017-03-22 2024-02-01 Ascendis Pharma A/S Hydrogel cross-linked hyaluronic acid prodrug compositions and methods
AU2018309166B2 (en) 2017-08-03 2022-12-08 Synthorx, Inc. Cytokine conjugates for the treatment of proliferative and infectious diseases
CN111868079A (zh) * 2017-12-27 2020-10-30 协和麒麟株式会社 Il-2变体
CA3093083A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Ascendis Pharma A/S Conjugates
KR20200139730A (ko) 2018-03-28 2020-12-14 아센디스 파마 온콜로지 디비전 에이/에스 Il-2 접합체
WO2020020783A1 (en) * 2018-07-24 2020-01-30 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Il2 agonists
JP7512210B2 (ja) * 2018-09-21 2024-07-08 イノベント バイオロジックス （スウツォウ） カンパニー，リミテッド 新規インターロイキン２およびその使用
BR112021011592A2 (pt) 2019-01-04 2021-10-26 Ascendis Pharma Oncology Division A/S Conjugados de agonistas de receptor de reconhecimento de padrão
BR112021020023A2 (pt) 2019-04-05 2021-12-07 Prolynx Llc Ligantes de conjugação melhorados
JP2022533254A (ja) * 2019-05-24 2022-07-21 プロヴィヴァ セラピューティクス （ホン コン） リミテッド Ｉｌ－２組成物およびその使用方法
WO2020254607A1 (en) * 2019-06-21 2020-12-24 Ascendis Pharma Oncology Division A/S Anti-ctla4 compounds with localized pd properties
CN114524873A (zh) * 2019-12-17 2022-05-24 北京志道生物科技有限公司 白介素-2衍生物
TW202210502A (zh) 2020-06-03 2022-03-16 丹麥商阿森迪斯腫瘤製藥有限公司 新穎il-2序列及其用途
IL300668A (en) 2020-08-28 2023-04-01 Ascendis Pharma Oncology Div A/S Glycosylated IL-2 proteins and their uses

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