CN101534643A - 用于递送寡核苷酸的基于位阻酯的生物可降解连接体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于在体内递送寡核苷酸的基于位阻酯的生物可降解的连接体，以及其制备和使用方法。

Description

用于递送寡核苷酸的基于位阻酯的生物可降解连接体
相关申请的交叉引用
本申请要求2006年9月15日提交的美国临时专利申请号60/845,028的优先权，其内容在此引入作为参考。
技术领域
本发明提供用于体内递送寡核苷酸的基于酯的生物可降解的连接体(linker)。
背景技术
药物中的经典治疗干扰通常集中于与体蛋白质如受体、酶、激素等的相互作用，致力于缓解疾病起因或疾病发展的作用。在更新的治疗方法中，需要调节这种蛋白质的实际生产。通过干扰蛋白质的产生，可获得最大治疗作用同时有最小的副作用。因此这种治疗方法通常的目的是干扰或调节导致不需要的蛋白形成的基因的表达。
一种抑制特异基因表达的方法是使用寡核苷酸，尤其是与特异的靶信使RNA(mRNA)序列互补的寡核苷酸。通常，与基因转录(例如，mRNA)的产物互补的核酸序列命名为“反义”，且具有与转录物的序列相同或作为转录物产生的核酸序列命名为“有义”。参见例如，Crooke，1992，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.，32：329-376。可选择反义寡核苷酸以调节基因表达的方式杂交至基因的全部或部分。在调节转录过程中转录因子与双链DNA相互作用。寡核苷酸可作为转录因子的竞争抑制剂调节它们的作用。多个最近的报道描述了这种相互作用(参见Bielinska，A.，等人，1990，Science，250：997-1000；和Wu，H.，等人，1990，Gene 89：203-209)。
目前正在研究分子策略以下调不希望的基因表达。最近，修饰的寡核苷酸化合物的使用已成为治疗这些疾病(如病毒感染、炎症疾病和遗传疾病，且显著地为癌症)的有希望的方法。反义DNA首先被认为是直接对抗天然存在的核酸的烷基化互补的寡脱氧核苷酸(Belikova，等人，Tetrahedron Lett.37：3557-3562，1967)。Zamecnik和Stephenson首先提出合成的反义寡核苷酸用于治疗目的。(Zamecnik & Stephenson，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75：285-289；Zamecnik & Stephenson，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75：280-284)。它们报道了使用与Rous肉瘤病毒的RNA互补的寡核苷酸13-聚物抑制了病毒在细胞培养物中的生长。从那以后，公开了许多其它研究，表明反义寡核苷酸抑制病毒生长的体外功效，这些病毒例如，水泡性口炎病毒(Leonetti等人，1988，Gene，72：323)、单纯疱疹病毒(Smith等人，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83：2787)和流感病毒(Seroa；等人，1987，Nucleic AcidsRes.15：9909)。
也发现寡核苷酸尤其在诊断测试、研究试剂中有用，例如，在PCR技术中的引物和其它实验室方法中使用。可通常合成寡核苷酸以包含满足所需用途的性质。由此已将多种化学修饰引入寡聚化合物以增加它们在诊断中作为研究试剂和作为治疗实体的应用。
尽管寡核苷酸，尤其是反义寡核苷酸显示出作为治疗剂的希望，但它们对核酸酶非常敏感且在它们进入靶细胞之前和之后会快速降解，使得未修饰的反义寡核苷酸不适用于体内系统。因为负责降解的酶存在于大多数组织中，已尝试对寡核苷酸进行修饰以稳定化合物并纠正该问题。已对寡核苷酸化合物的骨架部分进行最广泛的试验修饰。大体上参见Uhlmann和Peymann，1990，Chemical Reviews 90，545-561页和本文引入的文献。在制得的许多不同骨架中，只有硫代磷酸酯显示明显的反义活性。参见例如，Padmapriya和Agrawal，1993，Bioorg.& Med.Chem.Lett.3，761。尽管将硫原子引入骨架减缓了酶降解速率，但它同时也增加了毒性。添加硫原子的另一缺点为其将骨架从非手性改变为手性并导致2n个非对映异构体。这会引起进一步的副作用。该反义寡核苷酸的其它缺点为它们会在磷酸基上带有负电荷，这抑制其通过主要为亲脂性的细胞膜的能力。细胞外剩余的化合物越长，其降解越多，导致更小活性化合物到达靶点。该反义化合物的另一缺点为寡核苷酸易于形成次级和高级溶液结构(high-order solution structures)。一旦形成这些结构，它们变为各种酶、蛋白质、RNA和DNA的结合靶点。这导致非特异性副作用，且活性化合物结合至mRNA的量减少。其它改进寡核苷酸治疗的尝试包括添加连接部分和聚乙二醇。参见例如，Kawaguchi，等人，Stability，SpecificBinding Activity，和Plasma Concentration in Mice of an OligodeoxynucleotideModified at 5’-Terminal with Poly(ethylene glycol)，Biol.Pharm.Bull.，18(3)474-476(1995)，和美国专利号4,904,582。在这些实例中，所述修饰包括使用在自然界恒定的连接部分以尝试稳定寡核苷酸，防止降解和增加细胞渗透性。然而，这些努力都没有提供任何功效。
最近，在共有的U.S.Ser.No.10/822,205中(其在此整体引入作为参考)，提供了可释放氨基的缀合寡核苷酸的聚合物。然而，更需要在血浆中以可控的方式释放寡核苷酸而不需要氨基-尾连接基。
由于目前方法中的不足，需要改进稳定性和耐核酸酶降解性，以及降低毒性和增加对寡核苷酸化合物的mRNA的亲合力。目前的寡核苷酸治疗是昂贵的。这主要是由于降解问题。因此，实际需要以防止反义寡核苷酸化合物降解，防止高级(high-order)结构的形成并同时向靶点递送足够量的活性反义寡核苷酸化合物。本发明提供了这些改进。
发明内容
在本发明一个方面，本发明提供用于体内递送多核苷酸(如寡核苷酸)的化合物，其包括式(I)的结构
Figure A200780041936D00171
其中
A为封端基团或
R1为基本上非抗原性的水溶性聚合物；
L1和L’1为独立选择的具有孤对电子的间隔基，该孤对电子位于距C(＝Y1)或C(＝Y’1)的4至10个原子处，优选距C(＝Y1)或C(＝Y’1)约4至约8个原子，且最优选约4至约5个原子处；
L2和L’2为独立选择的双官能连接基(bifunctional linker)；
Y1和Y’1独立地为O、S或NR5；
X和X’独立地为O或S；
R2、R’2、R3、R’3和R5独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、芳基氧基、C1-6杂烷氧基、杂芳基氧基、C2-6烷酰基、芳基羰基、C2-6烷氧基羰基、芳基氧基羰基、C2-6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、C2-6取代的烷酰基、取代的芳基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基、取代的芳基氧基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基和取代的芳基羰基氧基，或R2和R3一起以及R’2和R’3一起独立地形成含至少三个碳的取代的或未取代的非芳香环烃；
R4和R’4为独立选择的多核苷酸及其衍生物；
(p)和(p’)独立地为0或正整数，优选0或约1至约3的整数，更优选0或1；和
(q)和(q’)独立地为0或1，
条件是当R2为H时R3为具有至少三个碳的取代的或未取代的烃，且进一步条件是L1不同于C(R2)(R3)。
在本发明该方面的某些优选的实施方案中，所述基本上非抗原性的聚合物为聚环氧烷且更优选聚乙二醇(下文PEG)。在其它方面，PEG可在一端用CH3基封端，即mPEG，而在其它实施方案中，提供双-活化的PEGs，如相应于式的那些：
本发明的其它方面包括制备含位阻酯的缀合物的方法，以及治疗方法，该治疗方法基于向需要的患者(哺乳动物)给药有效量的含生物活性部分的缀合物。也包括向需要这种治疗的细胞递送该缀合物的方法。
本文所述的聚合物递送体系包括新的连接体，该连接体可在聚合物和生物活性部分(如寡核苷酸)之间形成可释放的键如酯键。尽管寡核苷酸的位阻酯在储存过程中是稳定的，但它可通过水解磷酸二酯或硫代磷酸酯键释放不含任何尾部分的天然寡核苷酸。此外，本发明的聚合物可通过邻位协助促进从连接基水解稳定的位阻酯键。
本文所述的基于位阻酯的聚合物运输体系的一个优点为所述聚合物递送体系具有改进的稳定性。没有与任何理论相结合，在聚合物和如寡核苷酸的部分之间的空间位阻的环境中的酯键可抑制该酯键暴露于碱性水性介质或酶，从而稳定该共价键。该聚合物体系的稳定性使得该聚合缀合物具有更长的储存寿命。该改善的稳定性增加了成本效率。
本文所述的聚合物递送体系尤其适用于寡核苷酸和相关反义、短干扰RNA(siRNA)或锁核酸(LNA)化合物。靠近与之连接的寡核苷酸的位阻酯基的存在提供改善的稳定性和耐核酸酶降解性。其也有助于降低毒性和增加与寡核苷酸化合物的mRNA的亲合力。根据本发明制备的缀合物提供了一种方式，以防止反义寡核苷酸化合物的降解，防止高级结构的形成。而且，该聚合物缀合物使得技术人员能递送足够量的活性反义寡核苷酸化合物至靶点。
本发明的连接体在所有适用于动物或人静脉内给药的水形式的缓冲液条件下稳定。本发明的连接基在血浆酶的存在下将水解以在血浆中释放完整的寡核苷酸。连接体上空间位阻的变化将改变水解速率，这在特殊递送体系中是需要的。
含位阻酯的活化的聚合物另一优点为其使得技术人员更容易地缀合所选的寡核苷酸。在PEG化(PEGylation)前没有必要用位阻酯修饰寡核苷酸或靶部分。使用原样的寡核苷酸并用活化的PEG连接体进行PEG化，该活化的PEG连接基在其上包含所需的位阻酯保护基。
另一优点为例如本发明的连接基可与任一种核苷酸(A、G、C、T、U等)缀合，然后转化为其磷酰胺(phosphoamidite)。然后该磷酰胺可在正常固体相寡核苷酸合成条件下使用以制备寡核苷酸分子。连接基和寡核苷酸之间的连接在合成和纯化所需的条件下是稳定的。
其它和进一步的优点在以下说明中是明显的。
出于本发明的目的，术语＂残基＂应理解为生物活性化合物如寡核苷酸的部分，其在化合物经历反应后保留，在该反应中前药载体部分通过例如，可用的羟基或氨基的修饰而连接，以分别形成例如，酯或酰胺基团。类似的，基本上非抗原性的聚合物(例如聚环氧烷聚合物)的残基，是在聚合物经历反应后保留的部分，在该反应中该聚合物连接至连接基、间隔基和/或生物活性化合物或其残基。
出于本发明的目的，单数或复数的使用不是为了限制涉及的物质或对象的数值。因此，除非另有所述，使用单数涉及细胞、聚合物或药物不是意味着仅治疗一个细胞、仅制备或使用一个分子和/或仅使用一个药物，且使用复数不排除使用单数物质。
除非另有限定，为了本发明目的：
术语“烷基”应理解为包括直链、支链、取代的(例如，被卤素-、烷氧基-和硝基-取代的)C1-12烷基、C3-8环烷基或取代的环烷基等；
术语“取代的”应理解为包括加入一个或多个原子，或用一个或多个不同原子替换官能团或化合物中含有的一个或多个原子；
术语“取代的烷基”包括羧基烷基、氨基烷基、二烷基氨基、羟基烷基和巯基烷基；
术语“取代的环烷基”包括如4-氯环已基的部分；芳基包括如萘基的部分；取代的芳基包括如3-溴苯基的部分；芳烷基包括如甲苯甲酰基的部分；杂烷基包括如乙基噻吩的部分；
术语“取代的杂烷基”包括如3-甲氧基-噻吩的部分；烷氧基包括如甲氧基的部分；且苯氧基包括如3-硝基苯氧基的部分；
术语“卤素”应理解为包括氟、氯、碘和溴；且
术语“足够量”和“有效量”在本发明中是指达到治疗效果的量，该效果为本领域技术人员所理解。
附图简述
图1示例性阐述实施例1-9所述的合成方法。
图2示例性阐述实施例10所述的合成方法。
图3示例性阐述实施例11-13所述的合成方法。
图4示例性阐述实施例14所述的合成方法。
发明详述
A.概述
本发明提供用于寡核苷酸体内递送的基于位阻(hingered)酯的生物可降解的连接体。因此，本发明提供有用的聚合物-连接的寡核苷酸前药，其具有许多实际用途，包括在体外和体内作为诊断和分析试剂、作为研究和调查的工具，以及作为治疗剂使用。根据上述，提供式(I)的化合物：
Figure A200780041936D00211
其中
A为封端基团或
Figure A200780041936D00212
R1为基本上非抗原性的水溶性聚合物；
L1和L’1为独立选择的具有孤对电子的间隔基，该孤对电子位于距C(＝Y1)或C(＝Y’1)的4至10个原子处，优选距C(＝Y1)或C(＝Y’1)约4至约8个原子，且最优选约4至约5个原子；
L2和L’2为独立选择的双官能连接基；
Y1和Y’1独立地为O、S或NR5；
X和X’独立地为O或S；
R2、R’2、R3、R’3和R5独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、芳基氧基、C1-6杂烷氧基、杂芳基氧基、C2-6烷酰基、芳基羰基、C2-6烷氧基羰基、芳基氧基羰基、C2-6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、C2-6取代的烷酰基、取代的芳基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基、取代的芳基氧基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基和取代的芳基羰基氧基，或R2和R3一起以及R’2和R’3一起独立地形成含至少三个碳的取代的或未取代的非芳香环烃；
R4和R’4为独立选择的多核苷酸及其衍生物；
(p)和(p’)独立地为0或正整数，优选0或约1至约3的整数，更优选0或1；和
(q)和(q’)独立地为0或1，
条件是当R2为H时，R3为具有至少三个碳的取代的或未取代的烃，且进一步条件是L1不同于C(R2)(R3)。
在本发明一些方面，本文所述的化合物包括根据式(Ia)的聚合物：
Figure A200780041936D00221
其中，(q)为1。
在本发明该方面的某些优选的实施方案中，所述基本上非抗原性的聚合物为聚环氧烷且更优选为聚乙二醇(在下文PEG)。在其它方面，所述PEG可在一个末端用CH3基团封端，即mPEG。
在其它实施方案中，提供双-活化的PEGs，如那些相应于式(II)的：
在本发明那些方面，进行取代用的取代基(其中相应于R2、R’2、R3、R’3和R5的这些部分表示为可取代的)可包括例如，酰基、氨基、酰胺基、脒、芳烷基、芳基、叠氮基、烷基巯基、芳基巯基、羰基、羧酸基(carboxylate)、氰基、酯、醚、甲酰基、卤素、杂芳基、杂环烷基、羟基、亚氨基、硝基、硫代羰基、硫代酯、硫代乙酸酯、硫代甲酸酯、烷氧基、磷酰基、膦酸基、亚膦酸基、甲硅烷基、巯基、硫酸基(sulfate)、磺酸基(sulfonate)、氨磺酰基、磺酰胺和磺酰基。
优选地，L1和L’1为具有孤对电子的独立选择的间隔基，该孤对电子位于距C(＝Y1)或C(＝Y’1)的4至8个原子处；更优选4至6个原子处；且Y和Y’1都为O。
在本发明另一方面，所述多核苷酸包括寡核苷酸，优选约2至约100的寡聚物，更优选约3至约50的寡聚物，最优选约5至约30的寡聚物。
在另一方面，A可选自H、NH2、OH、CO2H、C1-6烷氧基和C1-6烷基。在一些优选的实施方案中，A可为甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、H和OH。A更优选甲基或甲氧基。
在另一方面，本发明提供中间体以扩大(extend)多核苷酸。根据该方面，所述式(I)的化合物进一步包括N，N-四异丙基-氰基乙基磷酰胺并形成式(Ib)的化合物：
根据该方面，优选(q)为0。
B.基本上非抗原性的水溶性聚合物
本文所述的聚合物递送体系中使用的聚合物优选为水溶性聚合物，且基本上为非抗原性的，如聚环氧烷(PAO’s)。
在本发明一个方面，本文所述的化合物包括直链的、末端支链的或多臂的聚环氧烷。在一些优选的实施方案中，所述聚环氧烷包括聚乙二醇和聚丙二醇。
所述聚环氧烷的平均分子量为约2,000至约100,000道尔顿，优选约5,000至约60,000道尔顿。在一些方面，当连接蛋白质或寡核苷酸时所述聚环氧烷可为约5,000至约25,000，且优选约12,000至约20,000道尔顿，或当药物活性化合物(小分子)用于本文所述的化合物中时为约20,000至约45,000道尔顿，且优选约30,000至约40,000道尔顿。
所述聚环氧烷包括聚乙二醇和聚丙二醇。更优选地，所述聚环氧烷包括聚乙二醇(PEG)。PEG通常由以下结构所表示：
-O-(CH2CH2O)n-
其中(n)为约10至约2,300的整数，且当使用多臂聚合物时取决于聚合物臂的数。或者，本发明的聚乙二醇(PEG)残基部分可选自：
-Y71-(CH2CH2O)n-CH2CH2Y71-，
-Y71-(CH2CH2O)n-CH2C(＝Y22)-Y71-，
-Y71-C(＝Y72)-(CH2)a2-Y73-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y73-(CH2)a2-C(＝Y72)-Y71-和
-Y71-(CR71R72)a2-Y73-(CH2)b2-O-(CH2CH2O)n-(CH2)b2-Y73-(CR71R72)a2-Y71-，
其中：
Y71和Y73独立地为O、S、SO、SO2、NR73或化学键；
Y72为O、S或NR74；
R71-74独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、芳基氧基、C1-6杂烷氧基、杂芳基氧基、C2-6烷酰基、芳基羰基、C2-6烷氧基羰基、芳基氧基羰基、C2-6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、C2-6取代的烷酰基、取代的芳基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基、取代的芳基氧基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基和取代的芳基羰基氧基；
(a2)和(b2)独立地为0或正整数，优选0或约1至约6的整数，且更优选1；和
(n)为约10至约2300的整数。
支链的或U-PEG衍生物描述于美国专利5,643,575，5,919,455，6,113,906和6,566,506，且每一个的公开在此引入作为参考。这种聚合物的非限制性实例相应于具有以下结构的聚合物体系(i)-(vii)：
Figure A200780041936D00241
其中：
Y61-62独立地为O、S或NR61；
Y63为O、NR62、S、SO或SO2
(w62)、(w63)和(w64)独立地为0或正整数，优选0或约1至约3的整数；
(w61)为0或1；
mPEG为甲氧基PEG
其中PEG如上定义且聚合物部分的总分子量为约2,000至约100,000道尔顿；和
R61和R62独立地为可用于R73的相同的部分。
在另一方面，所述聚合物包括多臂PEG-OH或“星状-PEG”(star-PEG)产物，如描述于NOF Corp.Drug Delivery System catalog，Ver.8，2006年4月的那些，其公开在此引入作为参考。所述多臂聚合物缀合物包含4或更多个聚合物臂且优选4或8个聚合物臂。
为了解释而不是限制的目的，所述多臂聚乙二醇(PEG)残基可为
Figure A200780041936D00261
其中：
x为0和正整数，即约0至约28；和
n为聚合度。
在本发明一个具体实施方案中，所述多臂PEG具有以下结构：
Figure A200780041936D00262
其中n为正整数。在本发明一个优选的实施方案中，所述聚合物的总分子量为约5,000Da至约60,000Da，且优选12,000Da至40,000Da。
在另一具体实施方案中，所述多臂PEG具有以下结构：
Figure A200780041936D00263
或
Figure A200780041936D00264
其中n为正整数。在本发明一个优选的实施方案中，多臂聚合物的聚合度(n)为约28至约350以提供总分子量为约5,000Da至约60,000Da的聚合物，且优选为约65至约270以提供总分子量为12,000Da至45,000Da的聚合物。这代表聚合物链中重复单元的数量且其取决于聚合物的分子量。
该聚合物可转化为适当活化的聚合物，使用美国专利5,122,614或5,808,096中描述的活化技术。具体地，这种PEG可为下式：
Figure A200780041936D00271
或
Figure A200780041936D00272
其中：
(u’)为约4至约455的整数；且该残基的高达3个末端部分被甲基或其它低级烷基封端。
在一些优选实施方案中，所有四个PEG臂可转化为合适的活化基团，以促进与芳族基的连接。转化之前的这些化合物包括：
Figure A200780041936D00273
Figure A200780041936D00281
和
Figure A200780041936D00291
本文包括的聚合物优选在室温为水溶性的。这些聚合物的非限制性实例包括聚环氧烷均聚物，如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇(polyoxyethylenated polyols)、其共聚物和其嵌段共聚物，条件是保持嵌段共聚物的水溶性。
在另一实施方案中，作为基于PAO的聚合物的替代物，可使用一种或多种有效地非抗原性物质，如葡聚糖、聚乙烯醇、基于碳水化物的聚合物、羟丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)、聚环氧烷、和/或其共聚物。还参见共同转让(commonly-assigned)的美国专利6,153,655，其内容在此引入作为参考。本领域技术人员应理解采用与在此所述的PAO′s如PEG相同的活化类型。本领域技术人员将进一步认识到上述实例仅是解释性的，所有具有本文所述性质的聚合物质都在考虑范围内。出于本发明的目的，“基本上或有效地非抗原性的”是指本领域技术人员理解的所有物质，其为无毒的且在哺乳动物中不引发可观察到的免疫源应答。
在一些方面，可使用具有末端氨基的聚合物以制备本文所述的化合物。以高纯度制备含末端胺的聚合物的方法描述于美国专利申请11/508,507和11/537,172，其每一个的内容在此引入作为参考。例如，具有叠氮基(azides)的聚合物与基于膦的还原剂如三苯基膦或碱金属硼氢化物还原剂如NaBH4反应。或者，包括离去基团的聚合物与保护的胺盐如甲基-叔丁基亚氨基二碳酸酯的钾盐(KNMeBoc)或二-叔丁基亚氨基二碳酸酯(di-tert-butylimidodicarbonate)的钾盐(KNBoc2)反应，然后脱保护该脱保护的胺基。由这些方法形成的含末端胺的聚合物的纯度大于约95％且优选大于99％。
在其它方面，具有末端羧基的聚合物可在本文所述的聚合物递送体系中使用。以高纯度制备具有末端羧酸的聚合物的方法公开于美国专利申请11/328,662，其内容在此引入作为参考。该方法包括首先制备聚环氧烷的叔烷基酯，然后转化为其羧酸衍生物。制备PAO羧酸的方法的第一步骤包括形成中间体如聚环氧烷羧酸的叔丁基酯。该中间体通过PAO与卤代乙酸叔丁基酯在碱如叔丁醇钾的存在下反应而形成。一旦叔丁基酯中间体形成，该聚环氧烷的羧酸衍生物就容易以超过92％，优选超过97％，更优选超过99％且最优选超过99.5％的纯度而提供。
C.位阻酯(hingered ester)
出于本发明的目的，“位阻”应理解为意指或包括在C(＝Y1)周围的空间拥挤的环境。这种环境通常可通过包括大取代基(如环状或支链的部分)而制得。根据式(I)相邻于C(＝Y1)和C(＝Y’1)的CR2R3和CR’2R’3部分的每一个形成位阻酯。所述R2、R’2、R3、R’3和R5可选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、芳基氧基、C1-6杂烷氧基、杂芳基氧基、C2-6烷酰基、芳基羰基、C2-6烷氧基羰基、芳基氧基羰基、C2-6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、C2-6取代的烷酰基、取代的芳基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基、取代的芳基氧基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基和取代的芳基羰基氧基。对于R2和R3(R’2和R’3)可使用本文所述的可能基团的任一个，只要R2和R3(R’2和R’3)不同时为H。当R2和R3(R’2和R’3)之一为H，另一个包括至少三个烃。
在一个优选的实施方案中，R2、R’2、R3和R’3包括甲基、乙基和异丙基。
在另一实施方案，R2和R3一起以及R’2和R’3一起可形成含至少三个碳的取代的或未取代的非芳香环烃。
D.间隔基：L1和L’1
在本发明另一方面，连接至CR2R3和CR’2R’3部分的L1和L’1间隔基的孤对电子提供邻位帮助作用(enchimeric effects)。没有与任何理论相结合，位于距C(＝Y1)和C(＝Y’1)4至10个原子处的孤对电子促进(修改)生物活性部分、靶基团和诊断剂从本文所述的聚合物递送体系的释放速率。
在一个优选的实施方案中，L1和L’1间隔基可选自：
-NR11(CR12R13)s-，
-S(CR12R13)s-，
-O(CR12R13)s-，
-[C(＝O)]r(CR12R13)s-，
-NR11(CR12R13)sO(CR14R15)s’-，
-NR11(CR12R13)sS(CR14R15)s’-，
-NR11(CR12R13)sNR16(CR14R15)s’-，
-NR11(CR12R13O)s(CR14R15)s’-，
-O(CR12R13)sO(CR14R15)s’-，
-O(CR12R13)sS(CR14R15)s’-，
-O(CR12R13)sNR16(CR14R15)s’-，
-O(CR12R13O)s(CR14R15)s’-，
其中：
R11-R16独立地选自氢、氨基、取代的氨基、叠氮基、羧基、氰基、卤素、羟基、硝基、甲硅烷基醚、磺酰基、巯基、C1-6烷基巯基、芳基巯基、取代的芳基巯基、取代的C1-6烷硫基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、芳基氧基、C1-6杂烷氧基、杂芳基氧基、C2-6烷酰基、芳基羰基、C2-6烷氧基羰基、芳基氧基羰基、C2-6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、C2-6取代的烷酰基、取代的芳基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基、取代的芳基氧基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基、取代的和芳基羰基氧基；
(s)和(s’)独立地为0或正整数，优选约1至约4；和
(r)为0或1。
或者，L1和L’1基团可选自：
-NH-(CH2-CH2-O)q-CH2-，-C(＝O)-(CH2)p-，-NH-(CH2)p-，
-S-(CH2)p-，
-NH-(CH2)P-O-CH2-和
-NH-C(＝O)-(CH2)p-NH-C(＝O)-(CH2)q-
其中
(p)为约1至约12，优选约1至约8，更优选约2至约5的整数；和
(q)独立地为正整数，优选约1至约8，更优选约1至约4。
L1和L’1优选包括-(CH2)x21-或-(CH2)x21-W-(CH2)x22-，其中(x21)和(x22)为范围为1至7的整数，且W为O或NH。
在另一优选的实施方案中，L1-2和L’1-2间隔基的孤对电子位于距C(＝Y1)和C(＝Y’1)的4至8个原子处。更优选地，所述电子对位于距C(＝Y1)和C(＝Y’1)的4至5个原子处。
根据优选方面的优选的实施方案为-L1-C(R2)(R3)-C(＝Y1)-和-L’1-C(R’2)(R’3)-C(＝Y’1)，包括：
Figure A200780041936D00321
Figure A200780041936D00322
和
在另一方面，本文所述的聚合物递送体系包括当R2为H时R3为具有至少三个碳的取代的或未取代的烃，和L1不同于C(R2)(R3)。
E.双官能连接基
本文所述的化合物可包括双官能连接基。所述双官能连接基包括氨基酸或氨基酸衍生物。所述氨基酸可为天然存在的和非天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸的衍生物和类似物，以及各种现有技术已知的非天然存在的氨基酸(D或L)、疏水的或非疏水的，也包括在本发明的范围内。合适的非天然存在的氨基酸的非限制性实例包括，2-氨基已二酸、3-氨基已二酸、β-丙氨酸、β-氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、哌啶酸(piperidinic acid)、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2，4-氨基丁酸、锁链素、2，2-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、别-异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、N-甲基-异亮氨酸、6-N-甲基-赖氨酸、N-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。一些优选的氨基酸残基选自甘氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸和肌氨酸，且更优选为甘氨酸。
或者，L2和L’2可选自：
-[C(＝O)]v(CR22R23)t[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]v(CR22R23)t-O[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]v(CR22R23)t-NR26[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23)t[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23)tO[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23)tNR26[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23)t[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23)tO[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23)tNR26[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]v(CR22R23)tO-(CR28R29)t’[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]v(CR22R23)tNR26-(CR28R29)t’[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]v(CR22R23)tS-(CR28R29)t’[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23)tO-(CR28R29)t’[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23)tNR26-(CR28R29)t’[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23)tS-(CR28R29)t’[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23)tO-(CR28R29)t’[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23)tNR26-(CR28R29)t’[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23)tS-(CR28R29)t’[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]v(CR22R23CR28R29O)tNR26[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]v(CR22R23CR28R29O)t[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23CR28R29O)tNR26[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23CR28R29O)t[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23CR28R29O)tNR26[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23CR28R29O)t[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]v(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)t’[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)t’[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)t’[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]v(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)t’O[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]v(CR22R23)t(CR24R25CR28R29O)t’[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]v(CR22R23)t(CR24R25CR28R29O)t’NR26[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)t’O[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23)t(CR24R25CR28R29O)t’[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]vO(CR22R23)t(CR24CR25CR28R29O)t’NR26[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)t’O[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23)t(CR24R25CR28R29O)t’[C(＝O)]v’-，
-[C(＝O)]vNR21(CR22R23)t(CR24R25CR28R29O)t’NR26[C(＝O)]v’-，
Figure A200780041936D00341
其中：
R21-29独立地选自氢、C1-6烷基、C3-12支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6杂烷氧基；
(t)和(t’)独立地为0或正整数，优选0或约1至约12的整数，更优选约1至约8的整数，且最优选1或2；和
(v)和(v’)独立地为0或1。
在一个优选的实施方案中，L2和L’2可选自：
-[C(＝O)]rNH(CH2)2CH＝N-NHC(＝O)-(CH2)2-，
-[C(＝O)]rNH(CH2)2(CH2CH2O)2(CH2)2NH[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2)(CH2CH2O)2NH[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2)sNH(CH2CH2)s’[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2)sS(CH2CH2)s’[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2)(CH2CH2O)[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2)sO(CH2CH2)s’[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2O)(CH2)NH[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2O)2(CH2)[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2O)s(CH2)s’[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rNHCH2CH2NH[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2)2O[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2O)[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2O)2[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rNH(CH2)3[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rO(CH2CH2O)2(CH2)[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rO(CH2)2NH(CH2)2[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rO(CH2CH2O)2NH[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rO(CH2)2O(CH2)2[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rO(CH2)2S(CH2)2[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rO(CH2CH2)NH[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rO(CH2CH2)O[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rO(CH2)3NH[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rO(CH2)3O[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rO(CH2)3[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rCH2NHCH2[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rCH2OCH2[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rCH2SCH2[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rS(CH2)3[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]r(CH2)3[C(＝O)]r-，
Figure A200780041936D00351
和
Figure A200780041936D00352
其中(r)和(r’)独立地为0或1。
在另一实施方案中，所述双官能连接基包括：
Figure A200780041936D00361
-Val-Cit-，
-Gly-Phe-Leu-Gly-，
-Ala-Leu-Ala-Leu-，
-Phe-Lys-，
Figure A200780041936D00371
-Val-Cit-C(＝O)-CH2OCH2-C(＝O)-，
-Val-Cit-C(＝O)-CH2SCH2-C(＝O)-，和
-NHCH(CH3)-C(＝O)-NH(CH2)6-C(CH3)2-C(＝O)-
其中，
Y11-19独立地为O、S或NR48；
R31-48、R50-51和A51独立地选自氢、C1-6烷基、C3-12支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6杂烷氧基；
Ar为芳基或杂芳基部分；
L11-15为独立选择的双官能间隔基；
J3和J’3独立地选自主动运输至靶细胞的部分、疏水的部分、双官能连接部分及其组合；
(c11)、(h11)、(k11)、(111)、(m11)和(n11)为独立选择的正整数；
(a11)、(e11)、(g11)、(j11)、(o11)和(q11)独立地为0或正整数；和
(b11)、(x11)、(x’11)、(f11)、(i11)和(p11)独立地为0或1。
F.R4和R’4基团
1.离去基团
出于本发明的目的，离去基团是指能与在所需靶点(即寡核苷酸、双官能间隔基、中间体等)上的亲核物反应的基团。因此所述靶点包含用于置换的基团，例如在寡核苷酸上的OH或SH基团。
连接至位阻酯的离去基团能与所选的生物活性部分，即药物活性化合物(小分子量化合物)、寡核苷酸等共价反应。合适的离去基团包括，但不限于，卤素(Br、Cl)、活化的酯(activated esters)、环酰亚胺硫酮、N-羟基琥珀酰亚胺基、N-羟基邻苯二甲酰亚胺基、N-羟基苯并三唑基、咪唑、甲苯磺酸基(tosylate)、甲磺酸基(mesylate)、三氟乙基磺酸基(tesylate)、硝基苯磺酸基(nosylate)、C1-C6烷基氧基、C1-C6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、邻硝基苯氧基、对硝基苯氧基、五氟苯氧基、1，3，5-三氯苯氧基和1，3，5-三氟苯氧基或其它本领域技术人员熟知的合适离去基团。
特别地，本发明优选的实施方案中，所述离去基团可选自OH、甲氧基、叔丁氧基、对硝基苯氧基和N-羟基琥珀酰亚胺基。
2.多核苷酸部分
为了更全面理解本发明范围，将以下术语进行了定义。技术人员将理解，除非另有所述，术语“核酸＂或＂核苷酸＂是指脱氧核糖核酸(“DNA”)、核糖核酸、(“RNA)，无论单链或双链，以及其任何化学修饰物。“寡核苷酸”通常为相对较短的多核苷酸，例如，长度为约2至约200个核苷酸，或更优选约10至约30个核苷酸。除非另有所述，根据本发明的寡核苷酸通常为合成的核酸，且为单链的。术语“多核苷酸”和“多核酸(polynucleic acid)”也可在此同义使用。
本文使用的术语“反义”是指与特定DNA或RNA序列互补的核苷酸序列，该DNA或RNA序列编码基因产物或编码控制序列。本文使用的术语“反义链”是指“有义”链的互补核酸链。在细胞代谢的正常过程中，DNA分子的有义链为编码多肽和/或其它基因产物的链。该有义链作为模板用于合成信使RNA(“mRNA”)转录物(反义链)，该转录物又指导任何编码的基因产物的合成。反义核酸分子可通过任何本领域已知的方法制备，包括将感兴趣的基因以反方向连接至病毒启动子而合成，该启动子允许合成互补链。一旦引入细胞，该转录的链与细胞产生的天然序列结合以形成双链体。然后这些双链体阻止进一步的转录或翻译。以此方式可产生突变表型。符号“负”或(-)也是本领域已知的，是指反义链，而“正”或(+)也是本领域已知的，是指有义链。
例如，如果希望下调mRNA转录物在细胞中的表达，则将反义寡核苷酸引入细胞。一旦引入细胞中，该反义寡核苷酸通过Watson-Crick结合杂交至相应的mRNA序列，形成杂双链体。一旦双链体形成，由结合的mRNA序列编码的蛋白的翻译则被抑制。因此，反义寡核苷酸也在本领域中用作探针，例如，杂交探针，通常连接至标签或标记上，还用于为调查研究和治疗目的提供具体细胞产物或遗传调节元素的表达的精确下调。
多种多核苷酸部分可连接至本文所述的活化的聚合物。
在本发明一个方面，所述多核苷酸适于医药或诊断用途以治疗动物，例如，哺乳动物，包括人，用于需要这种治疗的症状。
在另一方面，含羟基或巯基的多核苷酸在本发明的范围中。对适用于本文的生物活性部分的种类的唯一限制为存在至少一个羟基或巯基，其可与载体部分反应和连接，且以缀合至本文所述的聚合物递送体系的形式，生物活性没有实质损失。
或者，适于掺入本发明的聚合运输缀合物化合物的母体化合物可在从连接的化合物水解释放后有活性，或水解释放后没有活性但在经历进一步化学过程/反应后变得有活性。例如，一种由聚合运输体系递送至血流的抗癌药，可保持无活性直到进入癌细胞或肿瘤细胞，然后其被癌细胞或肿瘤细胞化学活化，例如，被该细胞独有的酶反应活化。
在一个优选的实施方案中，选择用于缀合的物质为寡核苷酸，且缀合后，靶点是寡核苷酸的残基。所述寡核苷酸可选自任何已知的具有磷酸二酯骨架或硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸和寡脱氧核苷酸、锁核酸(LNA)、具有肽骨架的核酸(PNA)、三环-DNA、双链寡核苷酸(诱捕性ODN)、催化性RNA序列(RNAi)、核酶、镜相异构物(spiegelmer)和CpG寡聚物。本领域技术人员将进一步认识到上述所列仅为说明性的，且所有核酸物质都在考虑之中。
优选地，所述多核苷酸包括2至100个寡聚物寡核苷酸，更优选3至50个寡聚物且最优选10至30个寡聚物。所有其它合适大小的寡核苷酸也在考虑之中。
本文所述的化合物的多核苷酸可为单链或双链，包括磷酸二酯(phosphorodiester)骨架或硫代磷酸酯(phosphorothioate)骨架。所述＂多核苷酸＂(或“寡核苷酸”)包括寡核苷酸和寡脱氧核苷酸，包括例如，具有与Genasense(a/k/a奥利默森钠(oblimersen sodium)，由Genta Inc.，BerkeleyHeights，NJ制备)相同或基本类似核苷酸序列的寡核苷酸。Genasense为18-聚体硫代磷酸酯反义寡核苷酸，TCTCCCAGCGTGCGCCAT(SEQ ID NO：4)，其与人bcl-2mRNA的起始序列的最初六个密码子互补(人bcl-2mRNA为本技术领域已知的，且例如以SEQ ID NO：19描述于美国专利6,414,134，在此引入作为参考)。美国食品与药物管理局(FDA)在2000年8月发表GenasenseOrphan Drug status。
而且，根据本发明使用的寡核苷酸和寡脱氧核苷酸包括，但不限于，以下：
具有天然磷酸二酯骨架或硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸和寡脱氧核苷酸或任何其它修饰的骨架类似物；
LNA(锁核酸)；
PNA(具有肽骨架的核酸)；
三环-DNA；
诱捕性ODN(双链寡核苷酸)；
催化性RNA序列；
核酶；
镜相异构物(L-构象的寡核苷酸)；
CpG寡聚物等，如公开于以下文献的那些：
Tides 2002，Oligonucleotide and PeptideTechnology Conferences，2002年5月6-8日，Las Vegas，NV和
Oligonucleotide & Peptide Technologies，18th & 19th 2003年11月，Hamburg，德国，其内容在此引入作为参考。
根据本发明的寡核苷酸还可任选包括任何合适的现有技术已知的核苷酸类似物和衍生物，包括列于下表1中的那些：
Figure A200780041936D00411
本发明预期的对寡核苷酸的修饰包括，例如，将官能团或部分添加至所选的核苷酸或取代所选的核苷酸，其使得寡核苷酸共价连接至所需的聚合物，和/或将官能部分(functional moieties)(其引入另外的电荷、极化性、氢键、静电相互作用和功能性(functionality))添加至寡核苷酸或用其取代寡核苷酸。这些修饰包括，但不限于，2′-位糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、在环外胺(exocyclic amine)的修饰、4-硫尿苷的取代、5-溴或5-碘尿嘧啶的取代、骨架修饰、甲基化、碱基配对组合如异碱基(isobases)异胞苷(isocytidine)和异胍啶(isoguanidine)，及类似组合。寡核苷酸修饰还可包括3′和5′修饰如封端。示例性核苷类似物的结构如下提供。
Figure A200780041936D00421
核苷类似物的更多实例描述于Freier & Altmann；Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development，2000，3(2)，293-213，其每一个的内容在此引入作为参考。
尽管反义寡核苷酸和相关化合物被提及作为连接含位阻酯的聚合物的优选靶点，但预期R4或R’4包括已知受益于PEG或聚合物连接的所有合适的多核苷酸。
优选地，所述寡核苷酸涉及靶向的肿瘤细胞或下调肿瘤细胞对抗癌治疗剂的抗性中涉及的蛋白。例如，任何本领域已知的通过反义寡核苷酸下调用于癌症治疗的细胞蛋白，如BCL-2，可用于本发明。参见美国专利申请10/822,205，2004年4月9日提交，其内容在此引入作为参考。优选的治疗性寡核苷酸的非限制性实例包括反义HIF-1α寡核苷酸和反义存活蛋白寡核苷酸(antisense Survivin oligonucleotide)。
优选的实施方案包括：
(i)反义存活蛋白LNA(SEQ ID NO：1)
mCs-Ts-mCs-As-as-ts-cs-cs-as-ts-gs-gs-mCs-As-Gs-c；
其中大写字母代表LNA，“s”代表硫代磷酸酯骨架；
(ii)反义Bcl2 siRNA：
有义5’-GCAUGCGGCCUCUGUUUGAdTdT-3′(SEQ ID NO：2)
反义3′-dTdTCGUACGCCGGAGACAAACU-5′(SEQ ID NO：3)
其中dT代表DNA；
(iii)Genasense(硫代磷酸酯反义寡核苷酸)：(SEQ ID NO：4)
ts-cs-ts-cs-cs-cs-as-gs-cs-gs-ts-gs-cs-gs-cs-cs-cs-as-t
其中小写字母代表DNA且“s”代表硫代磷酸酯骨架；
(iv)反义HIF1αLNA
5’-sTsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3’(SEQ ID NO：5)
其中大写字母代表LNA且“s”代表硫代磷酸酯骨架。
LNA包括如下所示的2’-O，4’-C亚甲基双环核苷酸：
Figure A200780041936D00431
对存活蛋白LNA的详细描述公开于美国专利系列申请11/272,124，名称为“LNA Oligonucleotide and the Treatmemt of Cancer”和10/776,934，名称为“Oligomeric Compound for the Modulation Survivin Expression”，其每一个的内容在此引入作为参考。还参见美国专利系列申请10/407,807，名称为“Oligomeric Compound for the Modulation HIF-1 Alpha Expression”和11/271,686，名称为“Potent LNA Oligonucleotide for Inhibition of HIF-1AExpression”，其内容也在此引入作为参考。
在一个优选的实施方案中，本文所述化合物可包括用含有位阻酯(hindered ester)的(CH2)w氨基连接基在寡核苷酸的5’或3’端修饰的寡核苷酸，其中w在此为优选约1至约10的正整数，优选约6。所述聚合化合物可释放不含氨基尾的寡核苷酸。例如，所述寡核苷酸可具有以下结构：
Figure A200780041936D00441
其中w为约1至约10的正整数，优选约6。
在另一优选的实施方案中，寡核苷酸可包括(CH2)w巯基连接基((巯基寡核苷酸(thio oligonucleotides))。该巯基寡核苷酸可用于直接缀合至带正电荷肽的半胱氨酸或通过马来酰亚胺基缀合。该巯基寡核苷酸可具有以下结构：
Figure A200780041936D00442
本发明另一方面提供任选用连接至本文所述聚合物递送体系的诊断标记制备的缀合物化合物，其中该标记根据诊断或成像目的选择。因此，合适的标记通过将任何合适部分(例如，氨基酸残基)连接至任何本领域标准的放射同位素、射线不透性标记、磁共振标记或其它适用于磁共振成像的非放射性同位素标记、荧光型标记、显示可见颜色的标记和/或能在紫外线、红外线或电化学刺激下发荧光的标记而制备，以使在手术过程中成像肿瘤组织，等等。任选地，将诊断标记掺入和/或连接至缀合的治疗部分，以使得监测治疗性生物活性物质在动物或人患者中的分布。
在本发明另一方面，本发明的标记的缀合物可通过本领域已知的方法使用任何合适的标记(包括，例如、放射性同位素标记)而容易的制备。仅仅作为实例，这些包括131碘、125碘、99m锝和/或111铟以制备放射免疫-闪烁剂以用于在体内肿瘤细胞中的选择性摄取。例如，存在许多本领域已知的方法以将肽连接至Tc-99m，包括，仅仅作为实例，公开于美国专利5,328,679；5,888,474；5,997,844；和5,997,845中的那些，在此引入作为参考。
F.相应于式(I)的优选的实施方案
根据式(I)的化合物共价缀合至基本上非抗原性聚合物，例如，聚环氧烷。在特别优选的实施方案中，根据式(I)的化合物包括下式：
Figure A200780041936D00451
Figure A200780041936D00461
Figure A200780041936D00471
和
Figure A200780041936D00482
其中：
R4选自有义寡核苷酸、反义寡核苷酸、锁核酸(LNA)、短干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、适体、肽核酸(PNA)、磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)、三环-DNA、双链寡核苷酸(诱捕性ODN(decoy ODN))、催化性RNA(RNAi)、适体、镜相异构物、CpG寡聚物和其组合；
(z)为约1至约10的正整数；
(z’)为0或约1至约4的正整数；
mPEG具有式：CH3-O(CH2CH2O)n-；
PEG具有式-O(CH2CH2O)n-；且
(n)为约10至约2,300的正整数。
根据本发明优选的聚合物包括：
Figure A200780041936D00483
对于R4一个优选的实施方案包括：
(i)反义存活蛋白(survivin)LNA(SEQ ID NO：1)
mCs-Ts-mCs-As-as-ts-cs-cs-as-ts-gs-gs-mCs-As-Gs-c；
其中大写字母代表LNA，“s”代表硫代磷酸酯骨架；
(ii)反义Bcl2 siRNA：
有义5’-GCAUGCGGCCUCUGUUUGAdTdT-3′(SEQ ID NO：2)
反义3′-dTdTCGUACGCCGGAGACAAACU-5′(SEQ ID NO：3)
其中dT代表DNA；
(iii)Genasense(硫代磷酸酯反义寡核苷酸)：(SEQ ID NO：4)
ts-cs-ts-cs-cs-cs-as-gs-cs-gs-ts-gs-cs-gs-cs-cs-cs-as-t
其中小写字母代表DNA且“s”代表硫代磷酸酯骨架；
(iv)反义HIF1αLNA(SEQ ID NO：5)
5’-sTsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3’
其中大写字母代表LNA且“s”代表硫代磷酸酯骨架。
出于本发明的目的，Genasense(SEQ ID NO：4)描述为TCTCCCAGCGTGCGCCAT或5’-tscstscscscsasgscsgstsgscsgscscsast-3’。
G.制备缀合物的方法
在本发明一个方面，具有位阻酯的聚合物可通过将在末端具有OH或离去基团的聚合物与在远端具有受保护的位阻酯或位阻酸的亲核物缀合而制备。进一步脱保护和活化所得聚合物将提供本发明的化合物。本发明的末端基团可为羧酸形式，其易于与含OH或SH的部分偶连，或本发明的末端基团可为活化的形式，其在与含OH或SH的部分缀合后可被替换。
或者，含OH或SH的化合物可缀合以形成位阻酯中间体，然后其与活化的聚合物反应以形成具有位阻酯和生物活性部分的聚合缀合物。
出于说明性目的，制备含位阻酰基或酯部分的聚合缀合物的方法包括：
在足以形成式(V)化合物的条件下使式(III)的化合物与式(IV)化合物反应：
A1——R1——M1(III)
其中：
A1为封端基团或M1；
A2为封端基团或
Figure A200780041936D00502
M1为离去基团如卤素、活泼的碳酸酯(actived carbonates)、异氰酸基(isocyanate)、N-羟基琥珀酰亚胺基、甲苯磺酸基、甲磺酸基、三氟乙基磺酸基、硝基苯磺酸基、邻硝基苯氧基、咪唑和其它本领域技术人员已知的离去基团；
M2为-OH、-SH或-NHR101；
R100为OH或OR101；其中R101选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、芳基氧基、C1-6杂烷氧基、杂芳基氧基、C2-6烷酰基、芳基羰基、C2-6烷氧基羰基、芳基氧基羰基、C2-6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、C2-6取代的烷酰基、取代的芳基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基、取代的芳基氧基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基和取代的芳基羰基氧基；且
所有其它变量如上定义。
根据式(IV)的位阻酯部分与PEG或其它聚合物的连接可使用本领域普通技术人员已知的标准化学合成技术进行。活化的聚合物部分如SC-PEG、PEG-胺、PEG酸等可从商业源获得或由技术人员合成而不用过多实验。
出于本发明的目的，这种位阻酯部分的非限制性实例包括：
Figure A200780041936D00511
Figure A200780041936D00512
和
Figure A200780041936D00513
其中，(z)如上定义。
式(V)化合物可进一步在足以形成式(Ia)化合物的条件下在碱和偶联剂的存在下与含-OH或-SH的部分反应：
Figure A200780041936D00514
其中：
A3为封端基团或
Figure A200780041936D00521
和
R103选自靶向试剂、诊断剂和生物活性部分；且所有其它变量如上定义。
出于本发明的目的，R103应理解为含OH或SH的部分，其在经历与式(V)化合物反应后保留。
或者，本文所述的化合物可通过下述方法制备，包括：
在足以形成式(VIII)化合物的条件下将式(VI)化合物与式(VII)化合物反应：
A4——R1—M4(VII)
Figure A200780041936D00523
其中：
A4为封端基团或M4；
A5为封端基团或
Figure A200780041936D00524
M3为-OH、SH或-NHR105；
M4为离去基团如卤素、活泼的碳酸酯、异氰酸基、N-羟基琥珀酰亚胺基、甲苯磺酸基、甲磺酸基、三氟乙基磺酸基、硝基苯磺酸基、邻硝基苯氧基、咪唑和其它本领域技术人员已知的离去基团；
R104选自生物活性部分、靶向基团和诊断剂
R105选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、芳基氧基、C1-6杂烷氧基、杂芳基氧基、C2-6烷酰基、芳基羰基、C2-6烷氧基羰基、芳基氧基羰基、C2-6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、C2-6取代的烷酰基、取代的芳基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基、取代的芳基氧基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基和取代的芳基羰基氧基；且
所有其它变量如上定义。
含位阻酯的基团与聚合物部分的连接优选在偶联剂的存在下进行。合适的偶联剂的非限制性实例包括1，3-二异丙基碳二亚胺(DIPC)、任何合适的二烷基碳二亚胺、2-卤代-1-烷基-吡啶鎓卤化物、(Mukaiyama试剂)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、丙烷膦酸环酐(PPACA)和苯基二氯磷酸酯等，其例如从商业源如Sigma-Aldrich Chemical获得或使用已知方法合成。
优选地，所述反应在惰性溶剂如二氯甲烷、氯仿、DMF或其混合物中进行。所述反应可优选在碱的存在下进行，如二甲基氨基吡啶(DMAP)、二异丙基乙基胺、吡啶、三乙胺等，以中和任何产生的酸。所述反应可在约0℃至约22℃(室温)的温度下进行。
H.治疗方法
本发明另一方面，提供治疗哺乳动物多种医学病况的方法。该方法包括向需要这种治疗的哺乳动物给药有效量的本文所述化合物。该聚合缀合物化合物用于治疗哺乳动物中与用母体化合物治疗的疾病类似的疾病，例如，酶替代疗法、肿瘤性疾病、减少肿瘤负荷、防止赘生物转移和防止肿瘤/赘生物生长。
给药的聚合缀合物的量，将取决于其中包含的母体分子的量。通常，治疗方法中使用的聚合缀合物的量是在哺乳动物中有效达到所需治疗结果的量。通常，不同聚合缀合物化合物的剂量将依据母体化合物、聚合物分子量、体内水解速率等而稍有改变。本领域技术人员将基于临床实验和治疗效果确定所选的聚合运输缀合物的最佳剂量。实际剂量将对本领域技术人员是明显的，而不用过多的实验。
本发明的化合物可包含于一种或多种合适的药物组合物以向哺乳动物给药。所述药物组合物可为根据本领域已知方法制备的溶液、混悬液、片剂、胶囊形式等。也预期这些组合物可通过口服和/或肠胃外途径给药，这取决于技术人员的需要。例如，可使用组合物的溶液和/或悬浮液作为载体溶媒以通过任何本领域已知的方法注射或滴注该组合物，例如，通过静脉注射、肌肉注射、腹膜注射、皮下注射等。这种给药也可通过输注进入体间隙或体腔，以及通过吸入和/或鼻内途径。然而，在本发明的优选方面，所述聚合缀合物通过肠胃外向需要的哺乳动物给药。
在本发明另一方面，提供向哺乳动物细胞给药多核苷酸(寡核苷酸)，优选反义寡核苷酸的方法。该方法包括向被治疗的症状递送有效量的按本文制备的缀合物，其将取决于多核苷酸对这些症状的功效。例如，如果未缀合的寡核苷酸(例如反义BCL2寡核苷酸、反义存活蛋白寡核苷酸)对某些癌细胞或赘生性细胞具有功效，该方法将包括向对该天然寡核苷酸敏感的细胞递送含该寡核苷酸的聚合物缀合物。该递送可在体内作为合适药物组合物的部分进行或直接在体外环境向细胞递送。在一种特殊治疗中，可使用包含寡核苷酸(SEQ ID NO.1，SEQ ID NOs：2和3，以及SEQ ID NO：4)的聚合缀合物。
实施例
提供以下实施例以进一步理解本发明，但不是以任何方式限制本发明的范围。实施例中的黑体数字相应于图1-4中所示的那些。整个实施例中使用缩写，例如DCM(二氯甲烷)、DIPEA(二异丙基乙基胺)、DMAP(4-二甲基氨基吡啶)、DMF(N，N’-二甲基甲酰胺)、EDC(1-(3-二甲基氨基-丙基)-3-乙基碳二亚胺)、IPA(异丙醇)、Mmt(4-甲氧基三苯基甲基)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)、PEG(聚乙二醇)、SCA-SH(单链抗体)、SC-PEG(琥珀酰亚胺基碳酸酯聚乙二醇(succinimidyl carbonate polyethylene glycol))、TEAA(四乙基乙酸铵)、TFA(三氟乙酸)和THF(四氢呋喃)。
一般方法.所有反应在干燥氮气氛或氩气氛中进行。使用商业试剂没有进一步纯化。所有PEG化合物在使用前真空干燥或通过从甲苯共沸蒸馏。除非另有所述，使用Varian Mercury 300NMR光谱仪，且使用氘代氯仿和吡啶作为溶剂，以75.46MHz获得13C NMR谱。化学位移(δ)以距低场四甲基硅烷(TMS)的百万分率(ppm)记录。
HPLC方法.反应混合物和中间体和最终产物的纯度通过BeckmanCoulter System 
Figure A200780041936D00551
 HPLC仪器监测。其使用
Figure A200780041936D00552
 300SB C8反相柱(150×4.6mm)或Phenomenex 
Figure A200780041936D00553
 300A C18反相柱(150x4.6mm)，并具有168 Diode Array UV Detector，使用梯度为5-80％的乙腈在0.05M四乙基乙酸铵(TFAA)中的溶液，流速为1mL/分钟。)
实施例1.制备Br-HE-OEt，化合物(3)
在-78℃将丁基锂(1.6M的t-BuOH溶液，200mL)添加至异丁酸乙酯(化合物1，35g)在THF(500mL)中的溶液中，并在相同温度将溶液搅拌1小时。添加1，5-二溴戊烷(化合物7,100g)并将混合物温热至室温。混合物在室温搅拌1小时并将其倒入碳酸氢钠水溶液(500mL)中。蒸发有机层。残余物通过硅胶柱纯化，用10％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱以得到液体状所需产物(29.2g，产率36.7％)。
实施例2.制备N3-HE-OEt，化合物(4)
7-溴-2，2-二甲基庚酸乙酯(化合物3，26.5g)与叠氮化钠(13g)在DMF(500mL)中在100℃加热2小时。浓缩混合物且残余物通过硅胶柱纯化，用10％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱以得到液体状所需产物(20.5g，产率90.3％)。
实施例3.制备N3-HE-OH，化合物(5)
7-叠氮基-2，2-二甲基庚酸乙酯(化合物4，20.5g)与氢氧化钠(10g，85％)在乙醇(500mL)中加热回流2小时。浓缩混合物并添加水(400mL)。用浓盐酸将该混合物酸化至pH2并用乙酸乙酯(500mL)萃取。浓缩有机层且残余物通过硅胶柱纯化，用50％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱以得到液体状所需产物(17.1g，产率95％)。
实施例4.制备N3-HE-T，化合物(7)
将7-叠氮基-2，2-二甲基庚酸(化合物5，8g)溶于二氯甲烷(200mL)中。添加草酰氯(6.4g)且混合物回流2小时并蒸发。将残余物溶于二氯甲烷(100mlL)并添加至3’-乙酰基胸苷(化合物6，5.85g)的吡啶(100mL)溶液中。该溶液在室温搅拌24小时并将其倒入碳酸氢钠水溶液(500mL)中。将该混合物用二氯甲烷(500mL)萃取并浓缩有机层。残余物通过硅胶柱纯化，用5％甲醇的DCM溶液洗脱以得到无色固体状所需产物(5.6g，产率61％)。
实施例5.制备NH2-HE-T，化合物(8)
将5’-(7-叠氮基-2，2-二甲基庚酰基)3’-乙酰基胸苷(化合物7，4.65g)在甲醇(200mL)中在30psi在Pd/C(10％，0.5g)的存在下氢化1小时。过滤混合物并蒸发滤液以得到固体(4.4g，产率100％)。
实施例6.制备MmtNH-HE-T，化合物(9)
将5’-(7-氨基-2，2-二甲基庚酰基)3’-乙酰基胸苷(化合物8，4.4g)、三乙胺(4ml)和4-甲氧基三苯甲基氯(7.5g)在吡啶(100mL)中搅拌10小时。添加甲基胺(40％，10mL)并将溶液搅拌2小时。将该混合物倒入碳酸氢钠水溶液(500mL)中并用二氯甲烷(500ml)萃取。浓缩有机层。残余物通过硅胶柱纯化，用5％甲醇的二氯甲烷溶液洗脱以得到无色固体状所需产物(4.9g，产率71％)。
实施例7.制备MmtNH-HE-T-磷酰胺(Phosphoroamidite)，化合物(10)
将5’-(7-[(MMT-氨基)-2，2-二甲基庚酰基]胸苷(化合物9，4.9g)、N，N-四异丙基-氰基乙基磷酰胺(3g)和四唑(0.5g)在乙腈(50ml)中搅拌过夜。将该混合物倒入碳酸氢钠水溶液(500ml)中并用二氯甲烷(500ml)萃取。浓缩有机层。残余物通过硅胶柱纯化，用50％乙酸乙酯的己烷溶液洗脱以得到无色固体状所需产物(4.5g，产率71％)。
实施例8.制备NH2-HE-寡聚物，化合物(11)
将化合物10转移至Trilink Biotechnologies，CA以用作寡聚物合成中的最终单体。合成后将Mmt基团脱保护并将寡聚物通过RP-HPLC纯化，获得作为游离胺的化合物11以用于PEG缀合。寡核苷酸的序列为TCTCCCAGCGTGCGCCAT(SEQ ID NO.4)。
实施例9.制备PEG-HE-寡聚物，化合物(13)
向化合物11(10mg，1.7μmol)在PBS缓冲液(5mL，pH7.8)中的溶液中添加SC-PEG(化合物12，Mw 30kDa，520mg，17μmol)并在室温搅拌5小时。将反应混合物用水稀释至50mL并负载在Poros HQ(强阴离子交换柱)(10mm×1.5mm，柱床体积～16mL)上，该混合物用20mM的Tris-HCl缓冲液，pH7.4(缓冲液A)预平衡。将该柱用3-4倍柱体积的缓冲液A洗涤以去除过量的PEG连接基。然后该产物以流速为10mL/分钟，用梯度为0至100％的1M的NaCl在20mM的Tris-HCl缓冲液，pH7.4，缓冲液B中的溶液洗脱10分钟，然后用100％缓冲液B洗脱10分钟。洗脱的产物用HiPrep除盐柱(50mL)除去盐分并冻干以得到6mg产物。通过UV测量寡核苷酸在缀合物中的等价物(equivalent)为60％，wt/wt。
实施例10.制备PEG-连接基-HE-寡聚物化合物(15)
向化合物11(10mg，1.7μmol)在PBS缓冲液(5mL，pH7.8)中的溶液中添加PEG-连接基-NHS(化合物14，Mw 30kDa，520mg，17μmol)并在室温搅拌5小时。将反应混合物用水稀释至50mL并将其装载在Poros HQ(强阴离子交换柱)(10mm x 1.5mm，柱床体积～16mL)上，该混合物用20mM的Tris-HCl缓冲液，pH7.4(缓冲液A)预平衡。将该柱用3-4倍柱体积的缓冲液A洗涤以去除过量的PEG连接基。然后该产物以流速为10mL/分钟，用梯度为0至100％的1M的NaCl在20mM的Tris-HCl缓冲液，pH7.4(缓冲液B)中的溶液洗脱10分钟，然后用100％缓冲液B洗脱10分钟。洗脱的产物用HiPrep除盐柱(50mL)除去盐分并冻干为固体以得到5mg所需产物。通过UV测量寡核苷酸在缀合物中的等价物为50％，wt/wt。
实施例11.制备BocNH-HE-T，化合物(18)
将4-Boc-氨基-2，2-二甲基丁酸(化合物16，0.50g，2.16mmol)溶于氯仿(10mL)和DMF(5mL)的混合物中，并添加胸苷(化合物17，0.79g，3.25mmol)。将反应混合物在冰浴中冷却，并添加EDC(0.62g，3.25mmol)，然后添加DMAP(0.40g，3.25mmol)。将反应混合物搅拌温热至室温保持20小时。真空去除溶剂且将残余物悬浮于乙酸乙酯，用0.1N的HCl和盐水洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥且真空去除溶剂以得到粗油状物。通过快速柱色谱在硅胶上使用DCM/EtOAc(40:60，v/v)得到0.28g所需产物：13C NMR δ177.21，164.08，156.41，150.80，135.46，111.49，85.43，84.30，80.21，71.28，63.77，41.67，41.08，40.00，37.69，36.99，28.87，26.14，25.55，13.06。
实施例12.制备NH2-HE-T，化合物(19)
将化合物18(0.25g，0.55mmol)溶于DCM(5mL)中，且在室温通过移液管将TFA(0.25mL)添加至该溶液中。该反应混合物在室温搅拌20分钟。通过与DCM共蒸发而真空去除溶剂和TFA，以完全去除TFA并得到0.32g玻璃状固体的产物。13C NMR(CD3CN)δ 176.61，164.22，150.81，136.41，136.18，110.82，85.14，85.07，84.14，83.97，70.99，64.56，41.32，39.35，37.13，36.92，25.10，24.92，24.75，12.08，11.98。
实施例13.制备PEG-HE-T，化合物(21)
将mPEG-连接基-NHS(化合物20，Mw.20k，0.50g，0.0246mmol)和化合物19(26mg，0.0738mmol)溶于DCM(5mL)和DMF(1mL)的混合物中，且将DMAP(15mg，0.0123mmol)添加至该溶液中。反应混合物在室温搅拌2.5小时。真空去除溶剂且粗产物通过添加乙醚沉淀。过滤收集固体并从乙腈/IPA重结晶以得到0.43g纯白色固体状的产物。13C NMR δ 177.9，168.0，164.0，150.9，134.9，133.1，129.8，128.1，110.2，84.4，83.9，70.4，67.8，64.5，63.2，60.0，58.7，40.1，39.4，37.2，25.2，24.7，16.1，12.2。
实施例14.制备PEG-HE-T，化合物(23)
将mPEG-NHS(化合物22，Mw.20k，1g，0.0492mmol)和化合物19(26mg，0.1476mmol)溶于DCM(10mL)和DMF(2mL)的混合物中，且将DMAP(30mg，0.246mmol)添加至该溶液中。反应混合物在室温搅拌2.5小时。真空去除溶剂且粗产物通过添加乙醚沉淀。过滤收集固体并从乙腈/IPA重结晶以得到0.90g白色固体的产物。13C NMR δ 178.2，162.9，156.0，149.5，134.6，110.3，84.4，83.4，70.1，69.1，64.4，63.5，62.6，61.2，58.6，40.6，40.0，39.4，37.1，12.2。
实施例15.测定PEG缀合物在缓冲液和大鼠血浆中的稳定性
通过使用C8反相柱
Figure A200780041936D00581
 SB-C8)，使用由(a)0.1M乙酸三乙铵缓冲液和(b)乙腈组成的梯度流动相获得水解速率。使用1mL/分钟的流速，且监测色谱图，使用UV检测器在227nm用于监测紫杉醇和在260nm用于监测寡核苷酸。对于在缓冲液中水解，将PEG衍生物以浓度5mg/mL溶于0.1M pH7.4PBS或水中，而对于在血浆中水解，将衍生物以浓度为20mg/100μL溶于蒸馏水且将900μL大鼠血浆添加至该溶液中。将该混合物涡旋2分钟并分配于2mL玻璃小瓶中，且每个小瓶100μL等分。该溶液在37℃孵育不同的时间。以合适间隔将甲醇-乙腈(1:1，v/v，400μL)混合物添加至小瓶，且将混合物涡旋1分钟，然后通过0.45mm滤膜过滤(任选然后通过0.2mm滤膜二次过滤)。将20μL滤液的等分试样注入HPLC。基于峰面积，估算出天然化合物和PEG衍生物的量，且根据PEG衍生物的消失使用线性回归分析计算不同介质中每种化合物的半衰期。实施例中化合物的稳定性研究结果示于表1。
表1.PEG缀合物的稳定性研究结果
 
化合物 PBS中t1/2(小时) 大鼠血浆中t1/2(小时)
化合物13 >24 >24
化合物15 >24 16.0
序列表
<110>安佐制药股份有限公司(ENZON PHARMACEUTICALS，INC.)
<120>用于递送寡核苷酸的基于位阻酯的生物可降解连接体
<130>213.1236-PCT
<140>
<141>
<150>60/845,028
<151>2006-09-15
<160>5
<170>PatentIn Ver.3.3
<210>1
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)(16)
<223>硫代骨架(Thiobackbone)
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)
<223>甲基化的胞嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)
<223>LNA
<220>
<221>misc_feature
<222>(2)
<223>LNA
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(3)
<223>甲基化的胞嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)
<223>LNA
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)
<223>LNA
<220>
<221>
<222>(13)
<223>甲基化的胞嘧啶
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)
<223>LNA
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)
<223>LNA
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)
<223>LNA
<400>1
Figure A200780041936D00611
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>组合的DNA/RNA分子描述：合成寡核苷酸
<220>
<223>人工序列的描述：合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1) (19)
<223>RNA
<400>2
Figure A200780041936D00612
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>组合的DNA/RNA分子描述：合成寡核苷酸
<220>
<223>人工序列的描述：合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1) (19)
<223>RNA
<400>3
Figure A200780041936D00613
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(18)
<223>硫代骨架(Thiobackbone)
<400>4
Figure A200780041936D00614
<210>5
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1) (16)
<223>硫代骨架(Thiobackbone)
<220>
<221>misc_feature
<222>(1) (3)
<223>LNA
<220>
<221>misc_feature
<222>(13) (15)
<223>LNA
<400>5
Figure A200780041936D00621

Claims (30)

1.化合物，其包含式(I)的结构
其中
A为封端基团或
Figure A200780041936C00022
R1为基本上非抗原性的水溶性聚合物；
L1和L’1为独立选择的具有孤对电子的间隔基，该孤对电子位于距C(＝Y1)或C(＝Y’1)的4至10个原子处；
L2和L’2为独立选择的双官能连接基；
Y1和Y’1独立地为O、S或NR5；
X和X’独立地为O或S；
R2、R’2、R3、R’3和R5独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、芳基氧基、C1-6杂烷氧基、杂芳基氧基、C2-6烷酰基、芳基羰基、C2-6烷氧基羰基、芳基氧基羰基、C2-6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、C2-6取代的烷酰基、取代的芳基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基、取代的芳基氧基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基和取代的芳基羰基氧基，或R2和R3一起以及R’2和R’3一起独立地形成含至少三个碳的取代的或未取代的非芳香环烃；
R4和R’4为独立选择的多核苷酸及其衍生物；
(p)和(p’)独立地为0或正整数；和
(q)和(q’)独立地为0或1，
条件是当R2为H，R3为具有至少三个碳的取代的或未取代的烃，且进一步条件是L1不同于C(R2)(R3)。
2.权利要求1的化合物，其具有式(Ia)：
其中(q)为1。
3.权利要求1的化合物，还包括式(Ib)的化合物：
Figure A200780041936C00032
4.权利要求1的化合物，其中L1和L’1独立地选自：
-NR11(CR12R13)s-，
-S(CR12R13)s-，
-O(CR12R13)s-，
-[C(＝O)]r(CR12R13)s-，
-NR11(CR12R13)sO(CR14R15)s’-，
-NR11(CR12R13)sS(CR14R15)s’-，
-NR11(CR12R13)sNR16(CR14R15)s’-，
-NR11(CR12R13O)s(CR14R15)s’-，
-O(CR12R13)sO(CR14R15)s’-，
-O(CR12R13)sS(CR14R15)s’-，
-O(CR12R13)sNR16(CR14R15)s’-，
-O(CR12R13O)s(CR14R15)s’-，
其中：
R11-R16独立地选自氢、氨基、取代的氨基、叠氮基、羧基、氰基、卤素、羟基、硝基、甲硅烷基醚、磺酰基、巯基、C1-6烷基巯基、芳基巯基、取代的芳基巯基、取代的C1-6烷硫基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、芳基氧基、C1-6杂烷氧基、杂芳基氧基、C2-6烷酰基、芳基羰基、C2-6烷氧基羰基、芳基氧基羰基、C2-6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、C2-6取代的烷酰基、取代的芳基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基、取代的芳基氧基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基、和取代的芳基羰基氧基；
(s)和(s’)独立地为0或正整数；和
(r)为0或1。
5.权利要求1的化合物，其中L2和L’2独立地选自：
-[C(＝O)]rNH(CH2)2CH＝N-NHC(＝O)-(CH2)2-，
-[C(＝O)]rNH(CH2)2(CH2CH2O)2(CH2)2NH[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2)(CH2CH2O)2NH[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2)sNH(CH2CH2)s’[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2)sS(CH2CH2)s’[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2)(CH2CH2O)[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2)sO(CH2CH2)s’[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2O)(CH2)NH[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2O)2(CH2)[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2O)s(CH2)s’[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rNHCH2CH2NH[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2)2O[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2O)[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rNH(CH2CH2O)2[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rNH(CH2)3[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rO(CH2CH2O)2(CH2)[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rO(CH2)2NH(CH2)2[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rO(CH2CH2O)2NH[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rO(CH2)2O(CH2)2[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rO(CH2)2S(CH2)2[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rO(CH2CH2)NH[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rO(CH2CH2)O[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rO(CH2)3NH[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rO(CH2)3O[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rO(CH2)3[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rCH2NHCH2[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rCH2OCH2[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rCH2SCH2[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]rS(CH2)3[C(＝O)]r’-，
-[C(＝O)]r(CH2)3[C(＝O)]r-，
Figure A200780041936C00051
和
其中(r)和(r’)独立地为0或1。
6.权利要求1的化合物，其中L2和L’2独立地选自：
Figure A200780041936C00053
-Val-Cit-，
-Gly-Phe-Leu-Gly-，
-Ala-Leu-Ala-Leu-，
-Phe-Lys-，
Figure A200780041936C00062
-Val-Cit-C(＝O)-CH2OCH2-C(＝O)-，
-Val-Cit-C(＝O)-CH2SCH2-C(＝O)-，和
-NHCH(CH3)-C(＝O)-NH(CH2)6-C(CH3)2-C(＝O)-
其中，
Y11-19独立地为O、S或NR48；
R31-48、R50-51和A51独立地选自氢、C1-6烷基、C3-12支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6杂烷氧基；
Ar为芳基或杂芳基部分；
L11-15为独立选择的双官能间隔基；
J3和J’3独立地选自主动运输至靶细胞的部分、疏水的部分、双官能连接部分及其组合；
(c11)、(h11)、(k11)、(111)、(m11)和(n11)为独立选择的正整数；
(a11)、(e11)、(g11)、(j11)、(o11)和(q11)独立地为0或正整数；和
(b11)、(x11)、(x’11)、(f11)、(i11)和(p11)独立地为0或1。
7.权利要求1的化合物，其中L2和L’2独立地选自氨基酸、氨基酸衍生物和肽。
8.权利要求1的化合物，其中-L1-C(R2)(R3)-C(＝Y1)-和-L’1-C(R’2)(R’3)-C(＝Y’1)独立地选自：
Figure A200780041936C00071
Figure A200780041936C00072
和
Figure A200780041936C00073
9.权利要求1的化合物，其中L1和L’1独立地为-(CH2)x21-或-(CH2)x21-W-(CH2)x22-
其中
(x21)和(x22)为独立选择的范围为1至7的整数，和
W为O或NHC(O)。
10.权利要求1的化合物，其具有式(II)
Figure A200780041936C00074
11.权利要求1的化合物，其中A选自H、NH2、OH、CO2H、C1-6烷氧基和C1-6烷基。
12.权利要求1的化合物，其中R4和R’4为独立选择的寡核苷酸。
13.权利要求1的化合物，其中R4和R’4独立地选自有义寡核苷酸、反义寡核苷酸、锁核酸(LNA)、短干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、适体、肽核酸(PNA)、磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)、三环-DNA、双链寡核苷酸(诱捕性ODN)、催化性RNA(RNAi)、适体、镜相异构物、CpG寡聚物及其组合。
14.权利要求1的化合物，其中R4和R’4独立地包括核糖核酸、脱氧核糖核酸或其组合。
15.权利要求1的化合物，其中R4和R’4独立地为单链的寡核苷酸或双链核苷酸。
16.权利要求1的化合物，其中R4和R’4独立地包括磷酸二酯骨架或硫代磷酸酯骨架。
17.权利要求1的化合物，其中R1包括直链的、末端支链的或多臂的聚环氧烷。
18.权利要求17的化合物，其中所述聚环氧烷选自聚乙二醇和聚丙二醇。
19.权利要求17的化合物，其中所述聚环氧烷选自
-Y71-(CH2CH2O)n-CH2CH2Y71-，
-Y71-(CH2CH2O)n-CH2C(＝Y22)-Y71-，
-Y71-C(＝Y72)-(CH2)a2-Y73-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y73-(CH2)a2-C(＝Y72)-Y71-和
-Y71-(CR71R72)a2-Y73-(CH2)b2-O-(CH2CH2O)n-(CH2)b2-Y73-(CR71R72)a2-Y71-，
其中：
Y71和Y73独立地为O、S、SO、SO2、NR73或化学键；
Y72为O、S或NR74；
R71-74独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、芳基氧基、C1-6杂烷氧基、杂芳基氧基、C2-6烷酰基、芳基羰基、C2-6烷氧基羰基、芳基氧基羰基、C2-6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、C2-6取代的烷酰基、取代的芳基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基、取代的芳基氧基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基和取代的芳基羰基氧基；
(a2)和(b2)独立地为0或正整数；和
(n)为约10至约2300的整数。
20.权利要求17的化合物，其中所述聚环氧烷为式-O-(CH2CH2O)n-的聚乙二醇，其中(n)为约10至约2,300的整数。
21.权利要求1的化合物，其中R1的平均分子量为约2,000至约100,000道尔顿。
22.权利要求1的化合物，其中R1的平均分子量为约5,000至约60,000道尔顿。
23.权利要求1的化合物，其中R1的平均分子量为约5,000至约25,000道尔顿或约20,000至约45,000道尔顿。
24.权利要求1的化合物，其中R2、R’2、R3和R’3独立地选自甲基、乙基和异丙基。
25.权利要求1的化合物，其选自：
Figure A200780041936C00091
Figure A200780041936C00101
Figure A200780041936C00111
Figure A200780041936C00121
Figure A200780041936C00122
和
Figure A200780041936C00123
其中：
R4选自OH、离去基团、靶向基团、诊断剂和生物活性部分；
(z)为约1至约10的正整数；
(z’)为0或约1至约4的正整数；
mPEG具有式：CH3-O(CH2CH2O)n-；
PEG具有式-O(CH2CH2O)n-；和
(n)为约10至约2,300的正整数。
26.权利要求1的化合物，其中R4和R’4独立地选自SEQ ID NO：1、SEQID NOs：2和3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5。
27.权利要求1的化合物，
其中，R4选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和3、SEQ ID NO：4和SEQID NO：5。
28.制备含位阻酰基或酯部分的聚合缀合物的方法，包括：
在足以形成式(VIII)化合物的条件下，将式(VI)的化合物与式(VII)化合物反应：
Figure A200780041936C00132
A4——R1—M4        (VII)
Figure A200780041936C00133
其中
A4为封端基团或M4；
A5为封端基团或
Figure A200780041936C00134
M3为-OH、SH或-NHR105；
M4为离去基团如卤素、活泼的碳酸酯、异氰酸基、N-羟基琥珀酰亚胺基、甲苯磺酸基、甲磺酸基、三氟乙基磺酸基、硝基苯磺酸基、邻硝基苯氧基、咪唑和其它本领域技术人员已知的离去基团；
R104选自生物活性部分、靶向基团和诊断剂
R105选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、芳基氧基、C1-6杂烷氧基、杂芳基氧基、C2-6烷酰基、芳基羰基、C2-6烷氧基羰基、芳基氧基羰基、C2-6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、C2-6取代的烷酰基、取代的芳基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基、取代的芳基氧基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基和取代的芳基羰基氧基；且
所有其它变量如上定义。
29.治疗哺乳动物的方法，包括向需要的患者给药有效量的式(Ia)化合物。
30.向哺乳动物细胞给药多核苷酸的方法，包括向需要这种治疗的细胞递送有效量的式(Ia)化合物。
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