ES2335741T3 - Conjugados y procedimiento para su preparacion, asi como su uso para el transporte de moleculas a traves de membranas biologicas. - Google Patents

Conjugados y procedimiento para su preparacion, asi como su uso para el transporte de moleculas a traves de membranas biologicas. Download PDF

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Abstract

Uso de un radical arilo de las fórmulas F1 y F3 a F11, con **(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)** que está unido a una molécula a transportar, seleccionada de un polinucleótido, oligonucleótido o mononucleótido, para el transporte de esta molécula a través de una membrana biológica in vitro.

Description

Conjugados y procedimiento para su preparación, así como su uso para el transporte de moléculas a través de membranas biológicas.
Objeto de la presente invención es el uso de radicales arilo de las fórmulas F1 y F3 a F11, que están unidos a un polinucleótido, oligonucleótido o mononucleótido (conjugado), para el transporte de esta molécula a través de una membrana biológica in vitro, pero también para la preparación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de enfermedades que van acompañadas de la expresión o sobre-expresión de determinados genes, y/o de un agente de diagnóstico para el diagnóstico o reconocimiento temprano de enfermedades de este tipo. Objeto de la presente invención es también un procedimiento para el transporte de una molécula en una célula in vitro, en el que un radical arilo de las fórmulas F1 y F3 a F11 que está unido con una molécula a transportar, seleccionada de un polinucleótido, oligonucleótido o mononucleótido, se incuba con la célula, tras lo cual el conjugado se transporta en la célula sin que se separe el radical arilo.
Un factor limitante para el aprovechamiento terapéutico de moléculas, cuyo punto de ataque se encuentra dentro de la célula, es, a menudo, su deficiente absorción celular y distribución intracelular desfavorable. Ejemplos típicos son macromoléculas, tales como ácidos nucleicos, que se unen de un modo específico para la secuencia al ADN o ARN celular y, con ello, determinan la inhibición de la expresión de los genes. "Oligonucleótidos antisentido" son ácidos nucleicos monocatenarios cortos que se unen a un ARNm complementario a través de un apareamiento de bases de Watson-Crick, cuya traducción debe ser inhibida en la correspondiente proteína. Oligonucleótidos formadores de triplex se unen a través del denominado "apareamiento de bases de Hoogsteen" en el gran surco de la doble hélice del ADN, con formación de una hélice triple, con lo cual se inhibe de manera específica para la secuencia la transcripción de los genes. Otros oligonucleótidos de acción intracelular son, por ejemplo, los denominados oligonucleótidos "Decoy", que imitan las regiones de unión para factores de transcripción. Mediante el tratamiento con oligonucleótidos Decoy se pueden captar determinados factores de transcripción de manera específica para la secuencia y, con ello, impedir una activación de la transcripción. Se recurre a otro grupo de oligonucleótidos de acción intracelular, los quimeraplastos, para la corrección génica dirigida (Cole-Strauss et al. (1996) Science 273, 1386-1389). También para esta corrección génica es esencial la absorción del oligonucleótido quimeraplasto en la célula. Ejemplos de otros ácidos nucleicos de acción intracelular son los que interactúan con enzimas celulares, en particular con telomerasas (Norton et al. Nat. Biotechn. (1996) 14, 615). Otra clase de ácidos nucleicos, de preferencia ADN bicatenario, pueden codificiar determinadas proteínas, que son expresadas de manera intracelular en el sentido de una terapia génica.
Por ejemplo, la absorción de un oligonucléotido in vitro en una célula, p. ej. mediante simple adición del oligonucleótido al medio del cultivo celular, es un proceso relativamente ineficaz, dado que, en realidad, sólo se absorbe en la célula una pequeña parte del oligonucleótido añadido. El proceso de absorción se prolonga durante muchas horas y, la mayoría de las veces, alcanza una fase de meseta sólo al cabo de 8 a 16 horas. Se supone que los oligonucleótidos son absorbidos en un proceso a modo de endocitosis. Un problema general de la absorción a través de endocitosis consiste, sin embargo, en que una gran parte de los oligonucleótidos no se presenta libre en el citoplasma, sino encerrados en determinadas estructuras celulares, los lisosomas y endosomas. Esta distribución puntiforme, en el caso de oligonucleótidos marcados por fluorescencia, se puede observar también, realmente, por microscopía de fluorescencia. Mediante esta localización vesicular, se reduce grandemente la concentración de oligonucleótido libre que se encuentra realmente disponible para la hibridación al ARNm. Además, en función del tipo de célula y de las condiciones reinantes, el oligonucleótido absorbe solamente una determinada fracción de las células. Por lo tanto, para la aplicación eficaz de oligonuclótidos antisentido pasan a emplearse, por lo general, mezclas con reforzadores de la penetración, tales como, por ejemplo, lípidos catiónicos (Bennett et al. Mol. Pharmacol. 41 (1992) 1023).
El documento WO 95/06659 describe oligonucleótidos derivatizados con aminoalquilo con una permeabilidad celular de la membrana mejorada. El documento EP 0 962 497 describe derivados de rodamina y su uso en sistemas de diagnóstico, y Whittemore, N. A. et al. (1999) Bioconjugate Chem., 10, 261-270 describen conjugados de antraquinona-oligodesoxinucleótidos.
Una misión de la presente invención consistía en mejorar la absorción celular de moléculas, en particular de macromoléculas, tales como, por ejemplo, oligonucleótidos.
La investigación de la absorción celular de oligonucleótidos tiene lugar, por lo general, con ayuda de oligonucleótidos radiactivamente marcados o marcados por fluorescencia. El marcaje por fluorescencia de un oligonucleótido tiene lugar, por ejemplo, mediante reacción de la función amino de un oligonucleótido con isotiocianato de fluoresceína (FITC - siglas en alemán). Por ejemplo, la fluoresceína puede introducirse en el extremo 3' de un oligonucleótido a través de un portador de fases sólidas derivatizado con fluoresceína, adquirible en el comercio, o en el extremo 5' a través de un reactivo de fosfitilación de fluoresceína, adquirible en el comercio. En todos los casos, la fluoresceína unida al oligonucleótido se presenta como un elemento estructural, cargado negativamente como consecuencia de la función ácido carboxílico, que es fuertemente fluorescente.
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En contraposición a la fluoresceína, el diacetato de fluoresceína (FDA - siglas en alemán) es un colorante vital neutro, el cual, sólo después de la separación de los dos grupos éster y de la apertura del anillo de lactama, se transforma en la fluoresceína fluorescente, la cual, sin embargo en forma de la lactona, no muestra todavía fluorescencia alguna.
Es conocido que el FDA (en lo que sigue denominado también "F3"), en calidad de molécula neutra no fluorescente, es absorbido mediante difusión pasiva por las células vivas y es separado intracelularmente por esterasas en la fluoresceína fluorescente (Breeuwer et al. Appl. Environ. Microbiol. (1995) 61, 1614; Maeda et al. Cell Struct. Funct. (1982) 7, 177). Hasta ahora se han descrito solamente derivados de FDA que contienen un grupo reactivo amina, tal como, p. ej., isotiocianato; estos derivados de FDA se emplean para la tinción de proteínas intracelulares o componentes de células. Además de ello, hasta ahora no se describieron conjugados algunos de FDA con otras moléculas; de manera correspondiente, tampoco se han descrito, hasta la fecha, oligonucleótidos marcados con FDA (conjugados a base de FDA y oligonucleótido).
En el citoplasma el FDA es separado mediante esterasas; mediante un marcaje con FDA de un oligonucleótido es, por lo tanto, posible determinar la proporción de oligonucleótido "libre", es decir qué cantidad de oligonucleótido hay presente en el citoplasma -y está disponible para la hibridación - en relación con la proporción de oligonucleótido que está presente en las vesículas (oligonucleótido "capturado") - y, por lo tanto, no está disponible para la hibridación. Condicionado por el elevado número en conjunto de cargas negativas en un oligonucleótido y por el hecho de que los oligonucleótidos marcados con FDA y marcados con fluoresceína (para el caso de que el oligonucleótido sea el mismo) sólo se diferencian para una carga neta, era de esperar que los oligonucleótidos marcados con FDA y marcados con fluoresceína mostraran una absorción y distribución celular muy similar.
Sin embargo, sorprendentemente, se encontró que los oligonucleótidos marcados con FDA y marcados con fluoresceína se diferencian claramente en relación con su absorción en las células, y tanto en relación con la duración como con la eficacia de la absorción de los oligonucleótidos y, además de ello, también en relación con la localización de los oligonucleótidos absorbidos en la célula. Un oligonucleótido marcado con FDA es absorbido mucho más rápidamente por las células que el correspondiente oligonucleótido marcado con fluoresceína. Mientras que la absorción de oligonucleótidos marcados con FDA y marcados con fluoresceína requiere varias horas, los oligonucleótidos marcados con FDA, tras simple incubación, por ejemplo con células humanas, ya se pudieron detectar intracelularmente al cabo de cinco minutos. También era sorprendente que los oligonucleótidos marcados con FDA fueran absorbidos en casi todas las células (>90% de la células), mientras que la tasa de absorción en los métodos hasta ahora descritos para incorporar oligonucleótidos o polinucleótidos en las células es, por lo general, esencialmente más baja; a menudo, en ese caso se cargan con oligonucleótidos sólo aproximadamente 30 a 60% de las células. Es ventajosa también la distribución intracelular de los oligonucleótidos marcados con FDA, que es mucho más uniforme. Esta distribución más uniforme apunta a que los oligonucleótidos estén repartidos no -como se describe antes- en su gran parte en vesículas (p. ej. endosomas, lisosomas), sino en toda la célula -es decir, en el citosol y en el núcleo-; esto es un indicio de que está presente una gran proporción de oligonucleótido "libre". Solamente estos oligonucleótidos "libres" se encuentran a disposición para la unión a la diana (molécula objetivo, ácido nucleico objetivo) o como principio activo. Es también ventajoso que no se pudiera observar deterioro alguno de las células con los oligonucleótidos marcados con FDA; en contraposición con ello, el uso de reforzadores de la penetración lipocatiónicos conduce, a menudo, a deterioros de la membrana celular. Condicionado por estas propiedades inesperadas, los oligonucleótidos marcados con FDA, con respecto a los métodos hasta ahora descritos de incorporar oligonucleótidos o polinucleótidos en células, tienen la ventaja crucial de que pueden ser incorporados de manera más eficaz en las células y allí están también mejor disponibles. Condicionado por ello, los oligonucleótidos marcados con FDA presentan una actividad biológica claramente mejorada. En virtud de la actividad biológica mejorada, debe emplearse menos cantidad de oligonucleótido. Por ello, y en virtud del hecho de que un oligonucleótido marcado con FDA es absorbido en una célula de manera más eficaz -tanto cuantitativa como temporalmente- se reducen efectos secundarios (tóxicos).
Sorprendentemente, se encontró que las propiedades ventajosas no se limitan a los oligonucleótidos marcados con FDA, sino que, prácticamente, toda molécula, con ayuda de un marcaje con FDA - es decir, debido a que una molécula a transportar es acoplada o conjugada a FDA ("conjugado de FDA"), - puede ser incorporada eficazmente en una célula o puede ser transportada a través de una membrana biológica. Además, se encontró que este principio no está limitado a conjugados de FDA, sino que se extiende a todos los conjugados de ésteres arílicos que presentan una determinada estructura química. Por consiguiente, la presente invención proporciona un nuevo principio para el transporte de moléculas a través de membranas biológicas.
Son conocidos conjugados de O-acilarilo biorreversibles, que se propusieron como pro-fármacos de oligonucleótidos (lyer et al., Bioorganic & Med. Chem. Lett. 7 (1997) 871-876). Estos compuestos se asemejan -para el caso de que el radical arilo sea un anillo de 6 miembros aromático- en su estructura química a los conjugados de acuerdo con la invención. En el caso de los conjugados de O-acilarilo biorreversibles la hidrólisis del éster determina una desestabilización de la unión entre el radical arilo y el fosfotriéster del oligonucleótido, de manera que los conjugados de O-acilarilo biorreversibles se disocian en sus componentes, es decir en el oligonucleótido libre y el radical O-acilarilo. Este concepto de pro-fármaco sirve para enmascarar la carga negativa del puente fosfato internucleótido y, con ello, facilitar la absorción del oligonucleótido en la célula. En contraposición a los conjugados de acuerdo con la invención, sin embargo en el caso de estos pro-fármacos no se comprobó absorción acelerada alguna de los oligonucleótidos en las células y tampoco distribución intracelular alguna de los oligonucleótidos. Además, no se informó sobre una absorción de los oligonucleótidos en otros organismos. En contraposición a ello, en el caso de los conjugados de acuerdo con la invención se conserva el enlace covalente entre el radical arilo y el oligonucleótido en la absorción en la célula; la conservación del enlace covalente entre el radical arilo y el oligonucleótido se puede comprobar fácilmente por microscopía de fluorescencia, en la medida en que la unidad aromática, tal como, por ejemplo, en el caso de FDA, presenta una fluorescencia sólo después de la disociación del éster.
Objeto de la presente invención es el uso de un radical arilo de las fórmulas F1 y F3 a F11, con
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que está unido a una molécula a transportar, seleccionada de un polinucleótido, oligonucleótido o mononucleótido, para el transporte de esta molécula a través de una membrana biológica in vitro.
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Otro objeto de la presente invención es el uso de un radical arilo de las fórmulas F1 y F3 a F11, con
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que está unido a una molécula a transportar, seleccionada de un polinucleótido, oligonucleótido o mononucleótido, para la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades que van acompañadas de la expresión o sobre-expresión de determinados genes, y/o de un agente de diagnóstico para el diagnóstico o la detección precoz de enfermedades de este tipo.
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En una forma de realización especial, la molécula a transportar es un oligonucleótido. Un oligonucleótido puede estar constituido, por ejemplo, totalmente por los nucleótidos adenosinafosfato, guanosinafosfato, inosinafosfato, citidinafosfato, uridinafosfato y timidinafosfato. En otras formas de realización de la invención un oligonucleótido puede contener, eventualmente, una o varias modificaciones, por ejemplo modificaciones químicas. Un oligonucleótido puede presentar varias modificaciones iguales y/o diferentes.
Ejemplos de modificaciones químicas son conocidas por el experto en la materia y están descritos, por ejemplo, en E. Uhlmann y A. Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543 y "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, EE.UU. 1993yJ. Hunziker y C. Leumann "Nucleic Acid Analogs: Sythesis and Properties" in Modern Synthetic Methods (compiladores Beat Ernst y C. Leumann) editorial Helvetica Chimica Acata, Basilea, págs. 331-417.
La modificación química de un oligonucleótido puede, por ejemplo,
a)
contener el reemplazo, completo o parcial, de los puentes diéster de ácido fosfórico, por ejemplo por ésteres de O-alquilo (C_{1}-C_{21}) de fosforotioato, fosforoditioato, NR^{1}R^{1'}-fosforoamidato, boranofosfato, fosfato, ésteres de [aril (C_{6}-C_{12})-O-alquilo (C_{1}-C_{21})]fosfato, puentes de alquil (C_{1}-C_{8})-fosfonato y/o aril (C_{6}-C_{12})-fosfonato, en donde
R^{1} y R^{1'}, independientemente uno de otro, representan hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{18}), arilo (C_{6}-C_{20}), aril (C_{6}-C_{14})-alquilo (C_{1}-C_{8}), preferiblemente representa hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{8}) y/o metoxietilo, de manera particularmente preferida representa hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{4}) y/o metoxietilo o
R^{1} y R^{1'}, junto con el átomo de nitrógeno que los porta, forman un anillo heterocíclico de 5-6 miembros, que adicionalmente puede contener otro heteroátomo de la serie O, S, N;
b)
contener el reemplazo, completo o parcial, de los puentes diéster de ácido 3'- y/ó 5'-fosfórico por parte de puentes "defosfo" (descritos, por ejemplo, en Uhlmann, E. y Peyman, A. en "Methods in Molecular Biology", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, Capítulo 16, 355 y sig.), por ejemplo mediante grupos formoacetal, 3'-tioformacetal, metilhidroxilamina, oxima, metilendimetilhidrazo, dimetilensulfona y/o sililo;
c)
contener el reemplazo, completo o parcial, de la cadena principal de azúcar-fosfato, por ejemplo mediante oligómeros de "morfolino" (por ejemplo, descrito en E. P. Stirchak et al., Nucleic Acids Res. 17 (1989) 6129 y en J. Summerton y D. Weller, Antisense and Nucleic Acid Drug Dev. 7 (1997) 187-195) y/o mediante ácidos nucleicos de poliamida ("PNAs" - siglas en inglés) (por ejemplo, descrito en P. E. Nielsen et al, Bioconj. Chem. 5 (1994) 3) y/o ácidos nucleicos de ésteres de fosfomonoácidos ("PHONAs" - siglas en inglés) (descrito, por ejemplo, en Peyman et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35 (1996) 2632-2638);
d)
contener el reemplazo, completo o parcial, de las unidades de \beta-D-2'-desoxirribosa, por ejemplo mediante \alpha-D-2'-desoxirribosa, L-2'-desoxirribosa, 2'-F-2'-desoxirribosa, 2'-O-alquil (C_{1}-C_{6})-ribosa, 2'-O-alquenil (C_{2}-C_{6})-ribosa, 2'-[O-alquil (C_{1}-C_{6})-O-alquil (C_{1}-C_{6})]-ribosa, 2'-NH_{2}'-2-desoxirribosa, \beta-D-xilofuranosa, \alpha-arabinofuranosa, 2,4-didesoxi-\beta-D-eritro-hexo-piranosa, análogos de azúcares limitados conformativamente, tal como LNA (Locked nucleic acids - ácidos nucleicos bloqueados; Singh et al., Chem. Commun. 4 (1998) 455; Singh et al. Chem. Commun. 12 (1998) 1247) y análogos de azúcares carbocíclicos (descritos, por ejemplo, en Froehler, J. Am. Chem. Soc. 114 (1992) 8320) y/o análogos de azúcares de cadena abierta (descritos, por ejemplo, en Vandendriessche et al., Tetrahedron 49 (1993) 7223) y/o análogos de biciclo-azúcares (descritos, por ejemplo, en M. Tarkov et al., Helv. Chim. Acta 76 (1993) 481).
e)
contener la modificación o bien el reemplazo completo o parcial de las bases de nucleósidos naturales, por ejemplo mediante 5-(hidroximetil)uracilo, 5-aminouracilo, pseudouracilo, pseudoisocitosina, dihidrouracilo, 5-alquil (C_{1}-C_{6})-uracilo, 5-alquenil (C_{2}-C_{6})-uracilo, 5-alquinil (C_{2}-C_{6})-uracilo, 5-alquil (C_{1}-C_{6})-citosina, 5-alquenil (C_{2}-C_{6})-citosina, 5-alquinil (C_{2}-C_{6})-citosina, 5-fluorouracilo, 5-fluorocitosina, 5-clorouracilo, 5-clorocitosina, 5-bromouracilo, 5-bromocitosina o purinas 7-deaza-7-sustituidas.
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La modificación química de un oligonucleótido comprende, además, la unión de un oligonucleótido a una o varias otras moléculas que favorecen propiedades particulares del oligonucleótido, p. ej. estabilidad de nucleasa, afinidad hacia a la secuencia diana y farmacocinética, p. ej. en la hibridación del oligonucleótido modificado a la secuencia diana, atacan a ésta bajo unión y/o reticulación. Ejemplos de moléculas adicionales de este tipo son poli-lisina, intercaladores, tales como pireno, acridina, fenazina y fenantridina, compuestos fluorescentes, tales como fluoresceína, reticulantes, tales como psoraleno y azidoproflavina, moléculas lipófilas, tales como grupos alquilo (C_{12}-C_{20}), preferiblemente grupos alquilo (C_{12}-C_{20}), lípidos, tales como 1,2-di-hexadecil-rac-glicerina, esteroides, tales como colesterol o testosterona, vitaminas, tales como vitamina E, poli- u oligo-etilengilcol, diésteres de alquil (C_{12}-C_{18})-fosfato, de preferencia diésteres de alquil (C_{14}-C_{18})-fosfato y grupos O-CH_{2}-CH(OH)-O-alquilo (C_{12}-C_{18}), de preferencia grupos -O-CH_{2}-CH(OH)-O-alquilo (C_{12}-C_{16}). Estas otras moléculas pueden estar conjugadas en el extremo 5' y/o en el extremo 3' y/o dentro de la secuencia, por ejemplo en una nucleobase. Los procedimientos para la preparación de oligonucleótidos modificados de este tipo son conocidos por el experto en la materia y se describen, por ejemplo, en Uhlmann, E. & Peyman, A., Chem. Rev. 90 (1990) 543 y/o M. Manoharan en "Antisense Research and Applications", Crooke y Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, 1993, Capítulo 17, pág. 303 y sig. y/o en el documento
EP-A 0 552 766.
En otras formas de realización especiales de la invención, el oligonucleótido puede presentar inversiones 3'-3' y/ó 5'-5' en el extremo 3' y/o en el extremo 5'. Este tipo de modificación química es conocida por el experto en la materia y está descrita, por ejemplo, en M. Koga et al., J. Org. Chem. 56 (1991) 3757.
En el caso de un conjugado que se compone de uno o varios oligonucleótidos y uno o varios radicales arilo de las fórmulas F1 y F3 a F11, la unión (conjugación) de radicales arilo a un oligonucleótido puede tener lugar, por ejemplo, en el extremo 5' (A), en el extremo 3' (F), en la base heterocíclica (E y G), en el azúcar (C) o en el puente inter-nucleósidos (B) del oligonucleótido. Sin embargo, la unión puede también tener lugar, por ejemplo, a través de elementos no nucleotídicos, p. ej. el caso (D). Estos ejemplos están representados en la figura 3.
Las citadas modificaciones pueden aplicarse de manera correspondiente, naturalmente, también en polinucleótidos más largos y, en la medida en que sea adecuado, en mono- o di-nucleótidos o nucleósidos.
Los oligonucleótidos tienen, por ejemplo, una longitud de 8 a 50 nucleótidos, de preferencia 10-20 nucleótidos. Sin embargo, también son adecuados oligonucleótidos o polinucleótidos más largos, por ejemplo con una longitud de 50 a 10000 nucleótidos, de preferencia 100 a 1000 nucleótidos, los cuales, eventualmente, también puede presentarse en doble cadena.
Los oligonucleótidos pueden presentar cualquier secuencia arbitraria. En función de la diana elegida, es decir, en el caso de que la diana sea un ácido nucleico, en función de su secuencia o, en el caso de que la diana sea una proteína, en función de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica esta proteína diana, se elige o diseña la secuencia del oligonucleótido. Por ejemplo, si la diana es un virus, p. ej. CMV, HIV, HSV-1, HSV-2, virus de la influenza, VSV, virus de la hepatitis B o papilomavirus, entonces el oligonucleótido puede tener, p. ej., una de las siguientes secuencias:
a) frente a CMV
8 
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b) contra VIH, por ejemplo,
9 
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c) contra HSV-1, por ejemplo,
10 
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La diana puede ser, p. ej., una proteína, que participa en la formación del cáncer o es la responsable del desarrollo del cáncer. Ejemplos de dianas de este tipo son:
1)
Oncoproteínas nucleares tales como, por ejemplo, c-myc, N-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, PCNA, p120;
2)
Oncoproteínas citoplasmáticas/asociadas a la membrana tales como, por ejemplo, EJ-ras, c-Ha-ras, N-ras, rrg, bcl-2, cdc-2, c-raf-1, c-mos, c-src, c-abl, c-ets;
3)
Receptores celulares tales como, por ejemplo, receptor EGF, Her-2, c-erbA, receptor VEGF (KDR-1), receptores de retinoides, subunidad reguladora de la proteína quinasa, c-fms, Tie-2, c-raf-1 quinasa, PKC-alfa, proteína quinasa A (R1 alfa);
4)
Citoquinas, factores de crecimiento, matriz extracelular tales como, por ejemplo, CSF-1, IL-6, IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, bFGF, VEGF, mieloblastina, fibronectina.
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Oligonucleótidos, que pueden estar dirigidos contra dianas de este tipo pueden tener, por ejemplo, la siguiente secuencia de bases:
a) contra c-Ha-ras, por ejemplo,
11 
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b) bFGF, p. ej.,
12 
\vskip1.000000\baselineskip
c) c-myc, p. ej.
13 
\vskip1.000000\baselineskip
d) c-myb, por ejemplo,
14 
\vskip1.000000\baselineskip
e) c-fos, por ejemplo,
15 
\vskip1.000000\baselineskip
f) p120, por ejemplo,
16 
\vskip1.000000\baselineskip
g) receptor del EGF, p. ej.,
17 
\vskip1.000000\baselineskip
h) supresor tumoral p53, p. ej.,
18 
\vskip1.000000\baselineskip
i) bcl-2
19 
\newpage
k) VEGF
20 
\vskip1.000000\baselineskip
l) c-raf quinasa
22 
\vskip1.000000\baselineskip
m) PKC-alfa
23 
\vskip1.000000\baselineskip
n) proteína cinasa A
24 
\newpage
Si la diana es una integrina o un receptor de la adhesión célula-célula, tal como, p. ej., VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM o ELAM, entonces el oligonucleótido puede tener, por ejemplo, una de las siguientes secuencias:
a) VLA-4, p. ej.,
25 
\vskip1.000000\baselineskip
b) ICAM-1, por ejemplo,
26 
\vskip1.000000\baselineskip
c) ELAM-1, p. ej.,
27 
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d) Integrina alfa(V)
28 
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Si la diana es una proteína que sea la responsable de la proliferación o migración o bien que participe en este o estos procesos, tal como, por ejemplo:
1)
Proteínas de transactivadores nucleares y ciclinas tales como, por ejemplo, c-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, ciclina y cdc2-cinasa;
2)
Mitógenos o factores de crecimiento tales como, por ejemplo, PDGF, bFGF, VEGF, EGF, HB-EGF y TGF-\beta;
3)
Receptores celulares tales como, por ejemplo, receptor bFGF, receptor EGF y receptor PDGF;
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entonces el oligonucleótido puede tener, por ejemplo, una de las siguientes secuencias de bases:
a) c-myb
29 
\newpage
b) c-myc
30 
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c) cdc2-quinasa
31 
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d) PCNA (proliferating cell nuclear antigen - antígeno nuclear de células proliferantes de rata)
32 
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Si la diana es, p. ej., un receptor A1 de adenosina, receptor A3 de adenosina, receptor de bradiquinina o IL-13, es posible, por ejemplo, la secuencia de bases
33 
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Se prepararon los siguientes oligonucleótidos (5'- ->3'):
34
en donde el * indica las posiciones en las que un puente fosfodiéster ha sido reemplazado por un puente internucleósidos fosforotioato.
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Estas secuencias se transformaron en los siguientes conjugados (KO - siglas en alemán):
36
en donde
"F1 a F11" significan radicales arilo de las fórmulas F1 a F11 (p. ej. fig. 2);
"Li1" es un radical 6-aminohexilfosfato, que está unido en el extremo 5' del oligonucleótido (p. ej. figura, véase el anejo 4);
"ON1 a ON11" significan los oligonucleótidos descritos de las secuencias SEQ ID NO.1 a SEQ ID NO.11;
y "rodamina" es una marca de rodamina detectable junto a fluoresceína en el extremo 3' del oligonucleótido.
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En el caso del procedimiento para la preparación de un conjugado que contiene una molécula a transportar y al menos un radical arilo de las fórmulas F1 y F3 a F11, se prepara
a)
una molécula a transportar, la cual contiene una función reactiva en la posición en la que debe unirse el radical arilo, y
b)
el radical arilo, y
c)
la molécula a transportar se hace reaccionar con el radical arilo para formar el conjugado.
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De preferencia, la función reactiva es un grupo amino, un grupo mercapto, un grupo cloroacetilo, un grupo isocianato, un grupo isotiocianato, un grupo ácido carboxílico, un grupo N-hidroxisuccinimida o un grupo cloruro de ácido carboxílico. La reacción de la molécula a transportar con el radical arilo se lleva a cabo a un valor del pH \leq 7,5; de preferencia a un valor del pH \leq 7,3, de manera particularmente preferida a un valor del pH de 7,0 o a un valor del pH menor, por ejemplo a un valor del pH < 7, de preferencia a un valor del pH \leq 6,5. En el caso de estas reacciones de acoplamiento, todos los demás grupos reactivos deben ser protegidos, antes de la reacción, con grupos protectores conocidos por el experto en la materia.
En una forma de realización particular del procedimiento, la molécula a transportar es un polinucleótido, oligonucleótido o mononucleótido.
Los procedimientos de preparación presuponen que, en una primera etapa, se prepare la molécula a transportar. A este respecto, la invención se refiere también a procedimientos para la preparación de oligonucleótidos. Los oligonucleótidos se pueden preparar con ayuda de diferentes procedimientos químicos conocidos, por ejemplo como se describe en Eckstein, F. (1991) "Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach", IRL Press, Oxford. Los oligonucleótidos pueden prepararse también mediante procedimientos que eventualmente contienen una o más etapas enzimáticas. La preparación de conjugados de oligonucleótidos se describe, en principio, en la bibliografía (J. Goodchild, Bioconjugate Chem. 1 (1990) 165; S. Beaucage y R. lyer, Tetrahedron 49 (1993) 1925; S. Agrawal Methods in Molecular Biology Vol. 26 "Protocols for oligonucleotide Conjugates" (1994) Humana Press).
En el caso de la síntesis de los conjugados de oligonucleótidos conforme a la reivindicación 1 se ha de tener en cuenta, sin embargo, que éstos se pueden descomponer en medio alcalino. Por lo tanto, por ejemplo con ayuda de los métodos habituales, no es posible síntesis alguna de oligonucleótidos marcados con FDA en un sintetizador de oligonucleótidos, dado que los grupos éster del grupo FDA ya se habían hidrolizado en el tratamiento con amoniaco, que es necesario para separar el oligonucleótido del soporte y para separar los grupos protectores amino de las bases heterocíclicas.
Por lo tanto, el oligonucleótido se prepara primeramente en forma desprotegida como un precursor y en la última etapa se condensa con el grupo conforme a la reivindicación 1 (figura 5). El precursor del oligonucleótido posee una función reactiva o activable, la cual se derivatiza a continuación, según métodos conocidos por el experto en la materia, con un reactivo que contiene el grupo de acuerdo con la invención conforme a la reivindicación 1. Como funciones reactivas o activables entran en consideración, por ejemplo, funciones amino, mercapto, cloroacetilo, iso(tio)cianato y ácido carboxílico.
De manera particularmente fácil se pueden incorporar en los oligonucleótidos los denominados enlazadores amino con ayuda de reactivos obtenibles en el comercio. Los oligonucleótidos con aminoenlazadores se hacen reaccionar entonces, por ejemplo con agentes reactivos que contienen un grupo conforme a la reivindicación 1. Agentes reactivos de este tipo son, por ejemplo, los correspondientes isotiocianatos. El grupo conforme a la reivindicación 1 está enlazado en este caso a través de una función tiourea (anejo 4). Otros agentes reactivos son, por ejemplo, los cloruros de ácido carboxílico. Agentes reactivos suaves son, por ejemplo, las N-hidroxisuccinimidas de los correspondientes ácidos carboxílicos. Reactivos activables son, por ejemplo, correspondientes ácidos carboxílicos que se pueden acoplar con reactivos de acoplamiento de péptidos, tales como HBTU, TBTU o TOTU. En este caso, el grupo conforme a la reivindicación 1 está enlazado a través de una función amida. En principio, la introducción de los grupos de acuerdo con la invención de la reivindicación 1 puede tener lugar en posiciones arbitrarias del oligonucleótido. Se prefieren las posiciones mostradas en la figura 3.
La síntesis de los oligonucleótidos modificados tuvo lugar mediante formación de la cadena de oligonucleótidos según métodos convencionales, tal como la síntesis en fase sólida según el método de la fosforoamidita, y derivatización del extremo 5' con el modificador 5'-amino C6 adquirible en el comercio (p. ej. Firma Eurogentec, Seraing, Bélgica).
38
Después de la separación del derivado de oligonucleótido del soporte y de la desprotección de todos los grupos de protección inestables frente a bases mediante tratamiento con amoniaco, se separa el grupo monometoxitritilo mediante tratamiento con ácido acético al 80% a la temperatura ambiente. Se obtiene un oligonucleótido modificado con 5'-aminohexilfosfato. La función amino de este derivado de oligonucleótido se hace reaccionar entonces con isotiocianato de FDA en tampón bicarbonato de trietilamonio 0,2 M (tampón TBK) pH 7/DMF. Ya al cabo de aproximadamente dos a tres horas había reaccionado por completo el oligonucleótido con aminoenlazador para dar el derivado de FDA deseado (figura 4). Reacciones con isotiocianato de fluoresceína se llevan a cabo normalmente a pH 8. No obstante, a este valor del pH se hidroliza el diacetato del grupo FDA.
Naturalmente, también se pueden emplear otros reactivos de enlazador amino, tales como, por ejemplo, el modificador 5'-amino C3, el modificador 5'-amino C12, el modificador 5'-amino 5 o el modificador 5'-tiol C6 (todos ellos de la Firma Eurogentec).
Mediante el empleo de fases sólidas de modificador 3'-amino, tales como, por ejemplo, el modificador 3'-amino C3 CPG (Firma Eurogenmtec) pueden prepararse derivados de oligonucleótidos con un grupo 3'-aminoalquilo, los cuales, a continuación, se hacen reaccionar con isotiocianato de FDA. Se obtiene un derivado de oligonucleótido, el cual mantiene unido
39
el grupo de la fórmula I de acuerdo con la invención en el extremo 3'.
Para la introducción del conjugado en la base heterocíclica del nucleósido se puede emplear en la síntesis un correspondiente modificador amino C6 dT (Firma Eurogentec), el cual se deriva de timidina, en lugar de un componente normal de fosforoamidita. Al final de la síntesis de los oligonucleótidos se separa el grupo protector de trifluoroacetilo mediante tratamiento con amoniaco y la función amino libre se hace reaccionar en solución con isotiocianato de FDA.
40
De manera similar pueden introducirse los grupos de acuerdo con la invención de la reivindicación 1 en posiciones arbitrarias de los oligonucleótidos. Es fácilmente evidente que también es posible una introducción múltiple de grupos iguales o diferentes.
En el caso del uso de acuerdo con la invención, la membrana biológica es, preferiblemente, componente de una célula, una vesícula o una organela.
Objeto de la presente invención son también procedimientos para el transporte de una molécula a través de una membrana in vitro, en los que se incuba con la membrana un radical arilo, tal como se ha descrito antes, que está unido a una molécula a transportar, seleccionada de un polinucleótido, oligonucleótido o mononucleótido.
En particular, procedimientos para el transporte de una molécula en una célula in vitro, en que se incuba con la célula un radical arilo, tal como se ha descrito antes, el cual está unido a una molécula a transportar, seleccionada de un polinucleótido, oligonucleótido o mononucleótido, tras lo cual se transporta el conjugado a la célula, sin que se separe el radical arilo.
Esto concierne, en particular, a procedimientos en los cuales la célula es una célula eucariótica o una célula procariótica, por ejemplo una célula bacteriana, una célula de levadura o una célula de mamífero, de preferencia, una célula humana. En formas de realización especiales, la célula es una célula patológicamente modificada, p. ej. una célula tumoral.
La absorción celular mejorada de los conjugados se detectó no solamente en células de mamíferos, sino también para otros eucariotas e, incluso, para procariotas.
Los conjugados de acuerdo con la invención se investigaron microscópicamente en cuanto a la absorción en células vivas. Primeramente se investigaron los oligonucleótidos marcados con FDA en cuanto a la movilidad en la célula de KO_1 y KO_3. Como compuestos conocidos por el estado de la técnica se emplearon los correspondientes oligonucleótidos KO_2 y KO_4 marcados con fluoresceína. Todos los cultivos celulares animales vitales investigados absorbían KO_1 y KO_3 (conjugados de FDA) en el espacio de 5 a 10 minutos, mientras que KO_2 y KO_4 (conjugados de fluoresceína) no eran detectables en células vitales después de este tiempo (Tabla 1).
A pesar de que la absorción en bacterias y levaduras tuvo lugar de una forma mucho más lenta que en células de mamíferos, ha tenido ciertamente lugar, al cabo de dos horas, una absorción de los oligonucleótidos de acuerdo con la invención en una parte de las células, mientras que los oligonucleótidos normales marcados con fluoresceína no son absorbidos bajo estas condiciones. Es sorprendente que, en principio, todos los organismos hasta ahora investigados hayan absorbido los oligonucleótidos de acuerdo con la invención mejor que los derivados de oligonucleótidos conocidos. Los organismos comprenden, entre otros, células animales, flagelados, levaduras, hongos y bacterias
(Tabla 3).
Se demostró, además, que células cancerígenas absorben particularmente bien a los oligonucleótidos. Por lo tanto, el empleo de los oligonucleótidos de acuerdo con la invención es particularmente adecuado para la terapia de tumores. El oligonucleótido antisentido KO_1 marcado con FDA, que está dirigido contra eg5, inhibía la proliferación de células A549 ya mediante su adición al medio, mientras que el correspondiente oligonucléotido antisentido ON 1 no modificado y el oligonucleótido KO_2 marcado con fluoresceína inhibían la proliferación de células cancerígenas solamente tras la formulación con reforzadores de la penetración, tal como CellFectin.
La invención se refiere al uso de conjugados, en los cuales la molécula a transportar es un oligonucleótido, para su hibridación con ácidos nucleicos de cadena sencilla y/o de doble cadena, por ejemplo ADN (p. ej. genes, ADNc) y/o ARN (p. ej. pre-ARNm, ARNm). Estos conjugados pueden unirse también de forma específica para la secuencia a proteínas intracelulares, tales como enzimas, por ejemplo polimerasas o telomerasas, o a factores de transcripción. La invención se refiere, además, al uso de conjugados de este tipo para la modulación, así como para la inhibición total o parcial de la expresión de determinados genes diana, por ejemplo para la inhibición total o parcial de la transcripción y/o la traducción. La invención se refiere también al uso de conjugados de este tipo como oligonucleótidos antisentido, ribozimas, oligonucleótidos sentido, oligonucleótidos formadores de una hélice triple, quimeraplastos y/u oligonucleótidos Decoy. Además de ello, estos conjugados pueden utilizarse como coadyuvantes en la biología molecular.
La invención se refiere, además, al uso de los oligonucleótidos como medicamentos y/o agente de diagnóstico o al uso de los oligonucleótidos para la preparación de medicamentos y/o agentes de diagnóstico. En particular, los oligonucleótidos pueden emplearse en medicamentos destinados a la prevención y/o tratamiento de enfermedades que van acompañadas de la expresión o de una sobre-expresión de determinados genes. Además, los oligonucleótidos pueden emplearse para el diagnóstico o la detección precoz de enfermedades de este tipo. Dado que la viabilidad celular de los oligonucleótidos de acuerdo con la invención es muy buena, éstos se pueden emplear para el diagnóstico in vivo, por ejemplo para la hibridación in situ en órganos enteros o en el organismo intacto.
La invención se refiere también al uso de los oligonucleótidos para la detección, separación y amplificación de ácidos nucleicos y sus análogos. Los conjugados se adecuan, en especial, para la detección de ácidos nucleicos en células, en particular en células vivas. Estas células pueden ser de origen humano o animal. Particularmente, los conjugados se adecuan también para los organismos recogidos en la Tabla 3, en particular para la detección de organismos patógenos. Los oligonucleótidos de acuerdo con la invención pueden emplearse en variantes, técnicamente conocidas, de la amplificación de ácidos nucleicos, en particular en la LMPCR (ligation-mediated Polymerase Chain Reaction - reacción en cadena de la polimerasa mediada por ligamiento), en el "Invader Assay" (marca registrada, Third Wave Technologies, Inc., Wisconsin), en el sistema TaqMan (marca registrada) y en la detección del genotipo Multiplex. Es también ventajoso el uso de los oligonucleótidos para la amplificación de ácidos nucleicos con ayuda del Light-Cycler, el cual permite una determinación en tiempo real de la amplificación. La detección según el principio del "señalador" molecular, en los cuales el colorante de fluorescencia no fluoresce en estado no ligado, ya que es apagado por un segundo grupo en el oligómero, es otra posibilidad de uso de los oligonucleótidos de acuerdo con la invención. Por ejemplo, un derivado de FDA (p. ej. en el extremo 5' del oligonucleótido) puede combinarse con un radical dabcilo (p. ej. conjugado en el extremo 3'), el cual apaga la señal de fluorescencia también en estado no ligado después de la transformación del derivado de FDA en el derivado de fluoresceína. Estos señaladores modificados con FDA emitirían una señal de fluorescencia sólo después de la absorción en la célula y la hibridación al ARNm diana.
La invención se refiere también al uso de los oligonucleótidos o bien de medicamentos que contienen estos oligonucleótidos, para el tratamiento de enfermedades en las que tienen su origen o participan genes definidos mediante sobre-expresión. Los medicamentos de la presente invención se pueden utilizar, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades que son provocadas por virus, por ejemplo por CMV, VIH, VHS-1, VHS-2, influenza, VSV, hepatitis B o papilomavirus. Los medicamentos de la presente invención se adecuan, por ejemplo, también para el tratamiento del cáncer. Los medicamentos de la presente invención se adecuan, por ejemplo, además para el tratamiento de enfermedades que son influenciadas por integrinas o receptores de adhesión célula-célula, por ejemplo por VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM o ELAM. Los medicamentos de la presente invención se adecuan, por ejemplo, también para evitar la restenosis, para el tratamiento de vitiligo y otras enfermedades de despigmentación o trastornos de despigmentación (p. ej. de la piel, pelos, ojos), por ejemplo albinismo y psoriasis, de asma.
Los medicamentos conciernen, p. ej., a preparados farmacéuticos, los cuales se pueden administrar a) por vía oral, p. ej. en forma de comprimidos, grageas, cápsulas de gelatina dura o blanda, soluciones, emulsiones o suspensiones, b) rectal, p. ej. en forma de supositorios o c) parenteral, p. ej. en forma de soluciones para inyección. Para la preparación de los medicamentos, los conjugados pueden elaborarse para formar, p. ej., soportes orgánicos y/o inorgánicos terapéuticamente inertes; por ejemplo, pueden utilizarse como soportes para comprimidos, grageas y cápsulas de gelatina dura, lactosa, almidón de maíz o sus derivados, sebo y ácido esteárico o sus sales. Como soportes de soluciones son adecuados agua, polioles, sacarosa, azúcar invertido y glucosa, para soluciones para inyección son adecuados agua, alcoholes, polioles, glicerol y aceites vegetales, para supositorios son adecuados aceites vegetales y endurecidos, ceras, grasas y polioles semilíquidos. Los medicamentos pueden contener, además, conservantes, disolventes, estabilizantes, humectantes, emulsionantes, edulcorantes, colorantes, saboreantes, sales para modificar la presión osmótica, tampones, agentes de revestimiento, antioxidantes, así como, eventualmente, otras sustancias activas terapéuticas. Preferiblemente, los medicamentos se administran por vía tópica o localmente, tal como, por ejemplo, con ayuda de un catéter o por inhalación, o a través de inyecciones o infusiones. Para la inyección el conjugado se formula en una solución líquida, con preferencia en un tampón fisiológicamente aceptable tal como, por ejemplo, solución de Hank o solución de Ringer. Sin embargo, el conjugado también se puede formular en forma sólida y disolver o suspender antes de usar. Las dosis preferidas para una administración sistemática son de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal y día.
Los conjugados y/o sus sales fisiológicamente tolerables se pueden administrar en los animales, con preferencia en los mamíferos, y en especial en los seres humanos como medicamentos en sí, en mezclas entre sí o en forma de preparaciones farmacéuticas que permiten una aplicación tópica, percutánea, parenteral o enteral y que contienen como componente activo una dosis eficaz de al menos un conjugado, además de soportes y aditivos farmacéuticamente irreprochables. Las preparaciones contienen normalmente aprox. 0,1 a 90% en peso del compuesto de eficacia terapéutica. Para el tratamiento de enfermedades cutáneas, tales como, por ejemplo, psoriasis o vitiligo, se prefiere una aplicación tópica, por ejemplo en forma de ungüentos, lociones o tinturas, emulsiones, suspensiones. La preparación de los medicamentos se realiza de una forma conocida en sí (por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publ. Co., Easton, PA.), en donde se usan vehículos inorgánicos y/u orgánicos farmacéuticamente inertes. Para preparar píldoras, comprimidos, grageas y cápsulas de gelatina dura se pueden utilizar, por ejemplo, lactosa, almidón de maíz y/o sus derivados, talco, ácido esteárico y/o sus sales, etc. Las sustancias de soporte para cápsulas de gelatina blanda y/o supositorios son, por ejemplo, grasas, ceras, polioles semisólidos y líquidos, aceites naturales y/o endurecidos, etc. Como sustancias de soporte para la preparación de soluciones y/o jarabes son apropiados, por ejemplo, agua, sacarosa, azúcar invertido, glucosa, polioles, etc. Como sustancias de soporte para la preparación de soluciones para inyección son apropiados agua, alcoholes, glicerina, polioles, aceites vegetales, etc. Como sustancias de soporte para microcápsulas, implantes y/o parches son apropiados polimerizados mixtos de ácido glicólico y ácido láctico. Más allá de ello, son apropiadas formulaciones de liposomas que son conocidas por el experto en la materia (N. Weiner, Drug Develop Ind Pharm 15 (1989) 1523; ``Liposome Dermatics, Springer Verlag 1992), por ejemplo, liposomas HVJ (Hayashi, Gene Therapy 3 (1996) 878).
Un medicamento puede contener, además de los principios activos y sustancias de soporte, aditivos tales como, por ejemplo, rellenos, extensores, disgregantes, aglutinantes, lubricantes, reticulantes, estabilizantes, emulsionantes, conservantes, edulcorantes, colorantes, saborizantes o aromatizantes, espesantes, diluyentes, sustancias tampón, además disolventes y/o solubilizantes y/o agentes para lograr un efecto de depósito, así como sales para alterar la presión osmótica, recubrimientos y/o antioxidantes. También pueden contener dos o más oligonucleótidos diferentes y/o sus sales fisiológicamente tolerables, así como también, además de al menos un oligonucleótido, una o varias otras sustancias terapéuticamente eficaces. La dosis puede variar dentro de amplios límites y se puede adaptar a cada caso individual.
Figuras
Figura 1: La figura muestra ejemplos de radicales arilo.
Figuras 2 a y b : La figura muestra ejemplos de radicales arilo.
Figura 3: La figura 3 muestra diferentes ejemplos (A, B, C, D, E, F, G) para una conjugación entre una molécula a transportar (en este caso un oligonucleótido) y radicales arilo de la reivindicación 1. "R" representa un radical de la reivindicación 1; "B" representa una base heterocíclica.
Figura 4: La figura 4 muestra una posibilidad de preparar un conjugado de acuerdo con la invención (consistente en este caso en isotiocianato de FDA y oligonucleótido).
Figura 5: La figura 5 muestra el transcurso con el tiempo de la absorción del conjugado KO_5 en células REH a partir del medio, utilizándose una vez medio sin suero (\blacklozenge) y una vez medio con suero (\blacksquare). La absorción celular se determinó con ayuda de FACS.
Figura 6: Representación de la determinación de la absorción celular de KO_1 (conjugado de FDA; \blacklozenge) y KO_2 (oligómero de FITC; \ding{115}) mediante medición por FACS. La concentración de partida en el conjugado extracelular de oligonucleótidos ascendió a 1 \muM; \medcirc y \boxempty son testigos.
Figura 7: Función de la longitud de la transfección de nucleótidos poliA conjugados con FDA en células REH
Figura 8: Comparación de la absorción celular de conjugados de oligonucleótidos diacetato de fluoresceína y dipivalato de fluoresceína
K39: diacetato de carboxifluoresceína (F3 igual a FDA) del Ejemplo 15
K41: dipivalato de carboxifluoresceína (F2) del Ejemplo 10
Figura 9: Investigación por microcopía de fluorescencia de la absorción celular del conjugado Cy3-oligonucleótido-F3 doblemente marcado [1 \muM] en el caso de incubación con células REH. Absorción al cabo de 4 horas. Izquierda: marcaje por fluorescencia; Centro: colorante cianina; derecha: absorción por contraste de fases: Arriba: oligonucleótido K33; Abajo: oligonucleótido K34.
Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis de oligonucleótidos
Oligonucleótidos fueron sintetizados en un sintetizador automático de ADN (Applied Biosystems Modelo 380B ó 394) aplicando la química estándar de fosforoamidita y oxidación con yodo (F. Eckstein, Ed "Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach", IRL Press, Oxford, 1991). Para la introducción de puentes fosforotioato en fosforotioatos y fosfodiésteres mixtos, los oligonucleótidos se oxidaron en lugar de con yodo con TETD (disulfuro de tetraetiltiuram) o se oxidaron con reactivo de Beaucage. Después de la separación del soporte sólido (CPG o Tentagel) y de eliminación de los grupos protectores con NH_{3} conc. a 55ºC durante 18 h, los oligonucleótidos se purificaron primeramente mediante precipitación con butanol (Sawadogo, Van Dyke, Nucl. Acids Res. 19 (1991) 674). Los oligonucleótidos se purificaron mediante electroforesis en gel preparativa o FPLC. A continuación, se obtuvo la sal sódica por precipitación de una disolución 0,5 M de NaCl con 2,5 partes en volumen de etanol.
El análisis de los oligonucleótidos tuvo lugar mediante
a)
Electroforesis analítica de gel en 20% de acrilamida, 8 M de urea, 454 M de tampón de tris-borato, pH 7,0 y/o
b)
Análisis por HPLC: Waters GenPak FAX, gradiente CH_{3}CN (400 ml), H_{2}O (1,6 l), NaH_{2}PO_{4} (3,1 g), NaCl (11,7 g), pH 6,8 (0,1 M en NaCl), después CH_{3}CN (400 ml), H_{2}O (1,61 l), NaH_{2}PO_{4} (3,1 g), NaCl (175,3 g), pH 6,8 (1,5 M en NaCl) y/o
c)
Electroforesis capilar de gel Beckmann Kapillare eCAP^{TM}, columna de gel U100P, 65 cm de largo, 100 mm I.D., ventana 15 cm desde un extremo, tampón 140 \muM de Tris, 360 mM de ácido bórico, 7 M de urea y/o
d)
Electronebulización - espectroscopia de masas
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El análisis del oligonucleótido dio como resultado que éste se presentaba en cada caso en una pureza mayor que 90%, pero la mayoría de las veces mayor que 95%.
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Ejemplo 2 Introducción de un enlazador 5'-amino en un oligonucleótido
El oligonucleótido se formó como se describe en el Ejemplo 1. Después del acoplamiento del último nucleótido, se separó el grupo dimetoxitritilo en el extremo 5'. El grupo hidroxilo libre se hizo reaccionar, bajo catálisis con tetrazol, con el modificador 5'-amino C6 adquirible en el comercio (Firma Eurogentec, Seraing, Bélgica), y se oxidó con agua yodada. Después, el oligonucleótido se separó del soporte mediante tratamiento con amoniaco conc. a 50ºC durante una noche y todos los grupos protectores inestables frente a bases se separaron en los grupos internucleósido y las funciones amino de las bases heterocíclicas. En la última etapa se separó el grupo protector de monometoxitritilo mediante tratamiento durante 3 horas con ácido acético al 80% a la temperatura ambiente. El oligonucleótido resultante se analizó como se describe en el Ejemplo 1.
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Ejemplo 3 Conjugación del oligonucleótido con enlazador amino con isotiocianato de FDA
(Ejemplo Ilustrativo)
10 OD (260) del oligonucleótido con enlazador 5'-amino del Ejemplo 2 se disolvieron en 16 \mul de tampón bicarbonato de trietilamonio (TBK - siglas en alemán) 0,2 M y se mezclaron con 125 \mul de dimetilformamida (DMF). A esta mezcla se añadieron 1,5 mg del isotiocianato de FDA y se sacudió a éste entonces durante 3 horas bajo la exclusión de la luz. El éxito de la reacción se verificó mediante HPLC. Luego, se añadieron 2 \mul de ácido acético conc. y se concentró en vacío. A continuación, el producto se purificó mediante precipitación con butanol. Con ayuda de la espectroscopía de masas ESI se estableció el peso másico correcto. Las muestras se mantuvieron siempre a un pH menor que 7, con el fin de que no tuviera lugar hidrólisis del éster aromático alguna.
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Ejemplo 4 Síntesis de KO_1 (5'-F3-G*CGAC*GC*CAT*GAC*G*G-3'; F3 = FDA)
El oligonucleótido se formó como se describe en el Ejemplo 1, partiendo de un soporte de CPG, que mantenía unido 1 \mumol de desoxiguanosina a través del extremo 3'. En las posiciones caracterizadas con un * se llevó a cabo la oxidación con el reactivo de Beaucage, con el fin de introducir un puente fosforotioato. Luego se acopló el modificador 5'-amino C6, tal como se describe en el Ejemplo 2. Después de la desprotección con amoniaco conc. y ácido acético al 80%, se obtuvieron 96 OD (260) del enlazador 5'-amino-G*CGAC*GC*CAT*GAC*G*G-3'.
10 OD (260) del oligonucleótido con enlazador 5'-amino se hicieron reaccionar entonces con isotiocianato de FDA tal como se describe en el Ejemplo 3. Después de la precipitación con butanol, se obtuvieron 8,4 OD (260) del oligonucleótido marcado con FDA deseado. ESI-MS para la sal di-Na: 5395,93 (calculado para di-Na: 5395,09).
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Ejemplo 5 Síntesis de KO_13 (5'-F3-TATTCCGTCAT-3')
El oligonucleótido se formó como se describe en el Ejemplo 1, partiendo de un soporte de CPG, que mantenía unido 1 \mumol de timidina a través del extremo 3'. Todas las oxidaciones se llevaron a cabo con agua yodada. Luego se acopló el modificador 5'-amino C6, tal como se describe en el Ejemplo 2. Después de la desprotección con amoniaco conc. y ácido acético al 80%, se obtuvieron 72 OD (260) del enlazador 5'-amino-TATTCCGTCAT-3'. Después de la purificación a través de un gel de poliacrilamida preparativo, se obtuvieron 43 OD (260).
10 OD (260) del oligonucleótido con enlazador 5'-amino se hicieron reaccionar entonces con isotiocianato de FDA tal como se describe en el Ejemplo 3. Después de la precipitación con butanol, se obtuvieron 9,1 OD (260) del oligonucleótido marcado con FDA deseado. ESI-MS: 3934,1 (PM calculado 3933,8).
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Ejemplo 6 Síntesis de KO_21 (5'-F7-A*T*G A C*G G A A*T*T*C)
El oligonucleótido se formó como se describe en el Ejemplo 1, partiendo de un soporte de CPG, que mantenía unido 1 \mumol de N6-benzoilcitidina a través del extremo 3'. Todas las oxidaciones se llevaron a cabo con agua yodada. Luego se acopló el modificador 5'-amino C6, tal como se describe en el Ejemplo 2. Después de la desprotección con amoniaco conc. y ácido acético al 80%, se obtuvieron 145 OD (260) del enlazador 5'-amino-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-3'.
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10 OD (260) del oligonucleótido con enlazador 5'-amino se disolvieron en 16 \mul de tampón TBK 0,2 M, 95 \mul de DMF y se hicieron reaccionar con 30 \mul del éster activo del ácido p-acetoxibenzoico previamente preparado. La preparación del éster activo tuvo lugar mediante mezcladura de 50 \mul de ácido p-acetoxibenzoico 0,2 M con 50 \mul de TBTU 0,3 M, en cada caso en DMF, y reacción durante una hora a la temperatura ambiente. Después de 4 horas de reacción del oligonucleótido con enlazador amino con el éster activo, se añaden 2 \mul de ácido acético semiconcentrado y se concentra en vacío. El reactivo en exceso se eliminó mediante precipitación con butanol. Se obtuvieron 10,7 OD (260) del conjugado de oligonucleótidos deseado. ESI-MS: 4109,2 (PM calculado 4108,2).
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Ejemplo 7 Investigación de la absorción celular de los conjugados de oligonucleótidos
Para la investigación de la absorción celular se mezcló 1 ml de la suspensión de células en una cámara Bachofer en medio de cultivo (o después de aclarado en PBS en el caso de medios con fluorescencia propia) bajo control microscópico con 1 ml de una solución 1 \mumolar del conjugado de oligonucleótidos, teniendo lugar la mezcladura a fondo con la pipeta y mediante sacudimiento de la cámara. La microscopía se llevó a cabo con ayuda del aparato Zeiss Axiovert 135 TV (100 x Plan-Neofluar) en modo de contraste de fases. Como filtros de fluorescencia servían filtros 09 (450-490/FT 510/LP 520)/HBO 59W. Como referencia se empleó una disolución 2,4 \muM de FDA (Aldrich Chem. Co, FW.416.39) en acetona/tampón PBS (1: 1000; v:v). En el caso de los conjugados de FDA puede vigilarse, después de la absorción, la fluorescencia propia del ligando de fluoresceína resultante de la separación del éster. En el caso de ligandos no fluorescentes, tales como ácido acetoxinaftalin-carboxílico se incorporó en el oligonucleótido, adicionalmente, una marca de fluorescencia adecuada (FITC, rodamina colorante cianina Dy 3 o Dy5). Una marcación doble como en KO_9 servía para demostrar que el FDA no fue separado por el oligonucleótido. Las muestras individuales se evaluaron 2 a 120 minutos después de la adición del conjugado de oligonucleótidos. En el caso de células REH la fluorescencia se podía reconocer claramente al cabo de 5 a 10 min, en el caso de K562 y células adherentes, así como células de insectos tuvo lugar un cierto incremento todavía hasta 60 min después de la adición. En el caso de protozoos vivos, la absorción duró hasta 1 h. En el caso de levaduras, la absorción tuvo lugar sólo tras largo tiempo y de forma no homogénea en todas las células. Las esporas de hongos absorbían mejor los conjugados de FDA-oligonucleótido que las células de hifas. Los resultados se recopilan en las Tablas 1 a 3.
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Ejemplo 8 Investigación de la acción antiproliferativa de los conjugados de oligonucleótidos
Las células REH (células de leucemia pre-B humanas, DSM ACC 22) o células tumorales A549 se cultivaron en OptiMEM con suero de ternero fetal al 10% (FKS;GIBCO-BRL) a 37ºC bajo 5% de CO_{2}. El día antes de la tanda de ensayos, las células se hicieron reaccionar de manera que al cabo de 24 h se podía alcanzar una concentración de células de aproximadamente 1 x 10^{6}/ml. Los oligonucleótidos o bien sus conjugados se disolvieron en agua destilada en forma de soluciones patrón 1 mM y se conservaron en el frigorífico a -20ºC. La siembra de células: (1 x 10^{6} células/ml en OptiMEM con FKS al 10%) tuvo lugar en placas de 24 pocillos. Para la investigación, los derivados de oligonucleótidos se diluyeron hasta 2 \muM (en OptiMEM sin FKS). Por cada pocillo se mezclaron 100 \mul de solución de oligonucleótidos y 100 \mul de suspensión de células (volumen total 200 \mul/pocillo; concentración de oligonucleótidos 1 \muM, concentración en suero FKS al 5%, concentración de células 0,5 x 10^{6} células/ml). Tras 4 h de incubación a 37ºC y 5% de CO_{2} se añadieron por cada pocillo 800 \mul de OptiMEM con FKS al 11% (concentración de células, ahora 1x10^{5} células/ml, concentración en suero, ahora FKS al 10%) y se continuó incubando. Al cabo de 96 h a 37ºC y 5% de CO_{2} tuvo lugar la medición de la concentración de células en el Casy 1 (Firma Schärfe). Para ello, las células se mezclaron en cada pocillo mediante succión durante 10 veces y soplado con una pipeta de 1000 e inmediatamente se diluyó en la relación 1:100 (en el caso de intenso desarrollo de las células, en la relación 1:200) con Casyton. Tuvo lugar una determinación del valor medio de la densidad de células a partir de en cada caso 3 muestras idénticamente aplicadas de una tanda de ensayos.
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Ejemplo 9 Síntesis de 5'-F4'(CO-NH)-A*T*G A C*G G A A*T*T*C
(Ejemplo Ilustrativo)
El oligonucleótido se formó como se describe en el Ejemplo 1, partiendo de un soporte de CPG, que mantenía unido 1 \mumol de N4-benzoilcitidina a través del extremo 3'. Las oxidaciones se llevaron a cabo con agua yodada o bien reactivo de Beaucage para la introducción de un radical fosforotioato (cuando hay un * en la secuencia). Luego se acopló el modificador 5'-amino C6, tal como se describe en el Ejemplo 2. Después de la desprotección con amoniaco conc. y ácido acético al 80%, se obtuvieron 145 OD (260) del 5'-enlazador amino-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-3'.
10 OD (260) del oligonucleótido con 5'-enlazador amino se disolvieron en 16 \mul de tampón TBK 0,2 M, 95 \mul de DMF y se hicieron reaccionar con 12,5 \mul de diacetato de diclorofluoresceína-hidroxisuccinimida (PM: 626,36). Después de 3 horas de reacción del oligonucleótido con enlazador amino con la hidroxisuccinimida, se añaden 2 \mul de ácido acético semiconcentrado y se concentra en vacío. Después de la desalación a través de una columna NAP^{TM}(Pharmacia) se llevó a cabo una precipitación con butanol. Se obtuvieron 2,8 OD (260) del conjugado de oligonucleótido-diacetato de diclorofluoresceína deseado. ESI-MS: 4403,3 (PM calculado 4403,2).
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Ejemplo 10 Síntesis de 5'-F2'-(CO-NH)-A*T*G A C*G G A A*T*T*C
(Ejemplo Ilustrativo)
El oligómero 5'-enlazador amino-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-3' se preparó como se describe en el Ejemplo 9. 10 OD (260) del oligonucleótido con 5'-enlazador amino se disolvieron en 16 \mul de tampón TBK 0,2 M, 95 \mul de DMF y se hicieron reaccionar con 12,5 \mul de dipivalato de carboxifluoresceína-hidroxisuccinimida (PM: 641,64). Al cabo de 2 horas de reacción del oligonucleótido con enlazador amino con la hidroxisuccinimida se añaden de nuevo 12,5 \mul de la hidroxisuccinimida y se deja reaccionar durante otras 2 horas. Luego se añaden 2 \mul de ácido acético semiconcentrado y se concentra en vacío. Después de la desalación a través de una columna NAP^{TM} (Pharmacia) se llevó a cabo una precipitación con butanol. Se obtuvieron 8,1 OD (260) del conjugado de oligonucleótido-dipivalato de fluoresceína deseado. ESI-MS: 4472,9 (PM calculado 4471,6).
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Ejemplo 11 Síntesis de 5'-F9-A*T*G A C*G G A A*T*T*C
El oligómero 5'-enlazador amino-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-3' se preparó como se describe en el Ejemplo 9. 10 OD (260) del oligonucleótido con 5'-enlazador amino se disolvieron en 16 \mul de tampón TBK 0,2 M, 95 \mul de DMF y se hicieron reaccionar con 25 \mul del éster activo de ácido acetoxinaftilcarboxílico. La preparación del éster activo tuvo lugar mediante mezcladura de 12,5 \mul de ácido acetoxinaftilcarboxílico 0,2 M (2,5 mg en 50 \mul de DMF) con 12,5 \mul TBTU (4 mg en 50 \mul de DMF) y reacción durante una hora a la temperatura ambiente. Después de 17 horas de reacción del oligonucleótido con enlazador amino con el éster activo, se añaden 2 \mul de ácido acético semiconcentrado y se concentra en vacío. Después de la desalación a través de una columna NAP^{TM} (Pharmacia) se llevó a cabo una precipitación con butanol. Se obtuvieron 8,5 OD (260) del conjugado de oligonucleótidos-acetoxinaftilo deseado. ESI-MS: 4158,2 (PM calculado 4157,2).
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Ejemplo 12 Síntesis de 5'-F8-A*T*G A C*G G A A*T*T*C
El oligómero 5'-enlazador amino-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-3' se preparó como se describe en el Ejemplo 9. 10 OD (260) del oligonucleótido con 5'-enlazador amino se disolvieron en 16 \mul de tampón TBK 0,2 M, 95 \mul de DMF y se hicieron reaccionar con 25 \mul del éster activo de ácido acetoxicumarincarboxílico. La preparación del éster activo tuvo lugar mediante mezcladura de 12,5 \mul de ácido acetoxicumarincarboxílico 0,2 M (2,7 mg en 50 \mul de DMF) con 12,5 \mul TBTU (4 mg en 50 \mul de DMF) y reacción durante una hora a la temperatura ambiente. Después de 17 horas de reacción del oligonucleótido con enlazador amino con el éster activo, se añaden 2 \mul de ácido acético semiconcentrado y se concentra en vacío. Después de la desalación a través de una columna NAP^{TM} (Pharmacia) se llevó a cabo una precipitación con butanol. Se obtuvieron 8,0 OD (260) del conjugado de oligonucleótido-acetoxicumarina deseado. ESI-MS: 4178,5 (PM calculado 4175,2).
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Ejemplo 13 Síntesis de 5'-F3-(dA)_{n} dA*dA*dA (n= 17, 47 y 77; F3 = FDA)
Los oligonucleótidos se formaron como se describe en el Ejemplo 1, partiendo de un soporte de CPG, el cual estaba derivatizado con N6-benzoil-2'-desoxiadenosina en el extremo 3'. Las oxidaciones después de los dos primeros acoplamientos se llevaron a cabo con reactivo de Beaucage para la introducción de los radicales fosforotioato (designados en la secuencia con un *), y todas las restantes oxidaciones se llevaron a cabo con agua yodada. Luego se acopló el modificador 5'-amino C6, tal como se describe en el Ejemplo 2. Después de la desprotección con amoniaco conc. y ácido acético al 80% y de la purificación a través de un gel de poliacrilamida preparativo, se obtuvieron 2,95 OD (260) del 5'-enlazador amino-(dA)_{17} dA*dA*dA, 4,9 OD (260) del 5'-enlazador amino-(dA)_{47} dA*dA*dA y 5 OD (260) del 5'-enlazador amino-(dA)_{77} dA*dA*dA. Los oligonucleótidos de 5'-enlazador amino se disolvieron en cada caso en 8 \mul de tampón TBK 0,2 M, 62 \mul de DMF y se hicieron reaccionar con 1,6 \mumol de isotiocianato de FDA. Después de 3 horas de reacción, se añade isotiocianato de FDA adicional y se deja que siga reaccionando todavía durante 2 horas. Luego se añaden 2 \mul de ácido acético semiconcentrado y se concentra en vacío. Después de la desalación a través de una columna NAP^{TM} (Pharmacia) se llevó a cabo una precipitación con butanol. Se obtienen 1,5 OD (260) del 5'-F3-(dA)_{17}dA*dA*dA, 2,2 OD (260) del 5'-F3-(dA)_{47}dA*dA*dA y 0,9 OD (260) del 5'-F3-(dA)_{77}dA*dA*dA.
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Ejemplo 14 Síntesis del oligonucleótido 5'-Cy3-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-C6-F3 doblemente marcado; F3 = FDA
El oligonucleótido se formó como se describe en el Ejemplo 1, partiendo de un soporte de CPG, el cual permite la introducción de un enlazador amino C6 en el extremo 3' (Petrie et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3, 85-87). Las oxidaciones se llevaron a cabo con agua yodada o bien reactivo de Beaucage para la introducción de un radical fosforotioato (cuando hay un * en la secuencia). Después de la separación del último grupo protector de dimetoxitritilo, se hizo reaccionar el extremo 5' del oligonucleótido con una fosforoamidita Cy3-CE (Firma Glen Research, Sterlin, VA; Nº de catálogo 10-5913-xx) y se oxido con agua yodada. Después de la desprotección con amoniaco conc. (2 horas a 70ºC), se obtuvieron 64 OD (260) del producto bruto. Después de la purificación a través de un gel de poliacrilamida preparativo, se obtuvieron 3,8 OD del 5'-Cy3-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-C6-enlazador amino-3'. De ellas se disuelven 3,5 OD (260) en 8 \mul de tampón TBK 0,2 M, 62 \mul de DMF y se hacen reaccionar con 1,6 \mumol de isotiocianato de FDA. Después de 3,5 horas de reacción del oligonucleótido con enlazador amino con la hidroxisuccinimida, se añade 1 \mul de ácido acético semiconcentrado y se concentra en vacío. Después de la desalación a través de una columna NAP^{TM} (Pharmacia) se llevó a cabo una precipitación con butanol. Se obtienen 3,5 OD (260) del oligonucleótido 5'-Cy3-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-C6-F3 doblemente marcado, deseado. ESI-MS: 4926,2 (PM calculado 4927,1).
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Ejemplo 15 Síntesis de 5'-F3-A*T*G A C*G G A A*T*T*C; F3 = FDA
El oligómero 5'-enlazador amino-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-3' se preparó como se describe en el Ejemplo 9. 10 OD (260) del oligonucleótido con 5'-enlazador amino se disolvieron en 16 \mul de tampón TBK 0,2 M, 95 \mul de DMF y se hicieron reaccionar con 25 \mul del isotiocianato de FDA (5 mg en 100 \mul de DMF). Al cabo de 3 horas de reacción del oligonucleótido con enlazador amino con el isotiocianato, se añaden de nuevo 5 \mul del isotiocianato y se deja reaccionar durante otras 2 horas. Luego se añaden 2 \mul de ácido acético semiconcentrado y se concentra en vacío. Después de la desalación a través de una columna NAP^{TM} (Pharmacia) se llevó a cabo una precipitación con butanol. Se obtuvieron 8,5 OD (260) del conjugado de oligonucleótido-diacetato de fluoresceína deseado. ESI-MS: 4418,4 (PM calculado 4418,5).
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Ejemplo 16 Comparación de la absorción celular de conjugados de oligonucleótidos de diferente longitud 5'-F3-(dA)_{n} dA*dA*dA (n= 17, 47 y 77; F3 = FDA)
La determinación de la absorción celular de los conjugados de diferente longitud y peso molecular del Ejemplo 12 se llevó a cabo, en principio, como se describe en el Ejemplo 7, con células REH. La cuantificación tuvo lugar con ayuda de un citómetro de flujo. Al cabo de 60 minutos, las señales de fluorescencia relativas para 5'-F3-(dA)_{17}dA*dA*dA ("A20") son igual a 49, para 5'-F3-(dA)_{47}dA*dA*dA ("A50") son igual a 34, y para 5'-F3-(dA)_{77}dA*dA*dA ("A80") son igual a 91. El conjugado de FDA con la parte de oligonucleótido mayor, que se compone de un total de 80 nucleótidos, fue absorbida, sorprendentemente, de la manera más eficaz por las células REH.
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Ejemplo 17 Comparación de la absorción celular de conjugados de oligonucleótidos de distinta derivatización
Un compuesto relacionado con el diacetato de fluoresceína (FDA) es el dipivalato de fluoresceína, el cual se distingue por una estabilidad incrementada de los grupos éster. Los correspondientes conjugados de oligonucleótidos se investigaron en cuanto a su absorción en el citómetro de flujo. La mayor estabilidad del pivalato con respecto a álcalis y esterasas conduce a una menor absorción del correspondiente conjugado de oligonucleótido. Así, la fluorescencia relativa medida para el conjugado de diacetato de fluoresceína al cabo de 60 minutos es igual a 195, mientras que para el correspondiente conjugado de dipivalato de fluoresceína asciende a sólo 55.
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Ejemplo 18 Investigación de la absorción celular del conjugado de oligonucleótidos 5'-Cy3-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-C6-FDA doblemente marcado del Ejemplo 13
En el FACScan, el conjugado de Cy3-oligonucleótido mostró una absorción más rápida en células REH. El tratamiento de las células con un conjugado de oligonucleótidos/complejo de Cellfectin proporciona una absorción similar, pero claramente más irregular. En este caso, se solapa el efecto del conjugado de FDA claramente con el del complejo de Cellfectin-oligonucleótido.
Además, debería investigarse la co-localización de los dos diferentes grupos marcadores en el oligonucleótido en la incubación con células, con el fin de excluir que la fluorescencia medida sólo se basara en el FDA o en la fluoresceína separado. El conjugado Cy3-oligonucleótido-F3 contenía unido de forma covalente el colorante cianina en el extremo 5' y el FDA en el extremo 3'. La figura 9 muestra la fluorescencia verde y roja después de incubación durante 4 horas de las células REH con el conjugado Cy3-oligonucleótido-F3. Dado que se observa una co-localización de los dos marcadores en las células, se debe de partir del hecho de que el oligonucleótido fue absorbido de forma intacta. Únicamente se hidrolizaron los grupos acetilo de la parte FDA, presumiblemente por parte de esterasas, ya que, evidentemente, el radical FDA no fluorescente fue trasnformado en el resto fluoresceína fluorescente. La absorción del conjugado de Cy3/FDA tuvo lugar muy rápidamente, dado que los dos marcadores ya podían ser detectados a los 7 min después de la adición.
El conjugado de oligonucleótido-FDA KO_1 del Ejemplo 4 se sometió a ensayo a cuatro concentraciones en cuanto al efecto antiproliferativo de células tumorales A549. Inhibía la proliferación sin la adición de un reforzador de la penetración. El correspondiente oligonucleótido sin conjugado F3 (ON1) inhibe la proliferación solamente después de la formación del complejo con un reforzador de la penetración (CellFectin, Firma Gibco-BRL). Los resultados se representan en la Tabla 4.
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TABLA 1 Investigación microcópica por fluorescencia de la absorción de oligonucleótidos marcados con FDA (conjugado de oligonucleótido-FDA) en células de mamífero
41
TABLA 2 Investigación microscópica por fluorescencia de la absorción de oligonucleótidos marcados con FDA en células de insectos (leyenda, véase la Tabla 1)
43
TABLA 3 Investigación microscópica por fluorescencia de la absorción de oligonucleótidos marcados con FDA en diferentes organismos
44
TABLA 4 Resultados del Ejemplo 8
47 
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TABLA 5 Dependencia de la longitud de la transfección de conjugados de FDA (A20, A50, A80 del Ejemplo 15)
48
TABLA 6 Comparación de la absorción celular de conjugados de oligonucleótidos de diacetato de fluoresceína y dipivalato de fluoresceína (Ejemplo 16, figura 8)
49 
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<110> Aventis Pharma Deutschland GmbH
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<120> Conjugados y procedimiento para la preparación, así como para su uso para el transporte de moléculas a través de membranas biológicas
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<130> 1999/L045
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<150> 19935302.6
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<151> 28-07-1999
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<170> PatentIn Ver.2.1
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12 
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\hfill
12 
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\hfill
12 
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12 
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gcagcccccg ca 
\hfill
12 
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tcccgcctgt gacatgcatt 
\hfill
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gttctcgctg gtgagtttca 
\hfill
20 
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gcgtgcctcc tcactggc 
\hfill
18 
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<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<212> ADN
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gcagtaagca tccatatc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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gcccaagctg gcatccgtca 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
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<211> 20
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<212> ADN
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\hskip-.1em\dddseqskip
cccccaccac ttcccctctc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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<220>
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<222> (1)..(20)
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcccccacc acttcccctc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gctgggagcc atagcgagg 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (1)..(21)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
actgctgcct cttgtctcag g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caatcaatga cttcaagagt tc 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcggcggaaa agccatcg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgtcggggt ctccgggc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(15)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacgttgagg ggcat 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtcttccata gttactca 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatcaggcgt gcctcaaa 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(21)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gatggagggc ggcatggcgg g 
\hfill
21

Claims (8)

1. Uso de un radical arilo de las fórmulas F1 y F3 a F11, con
51
52
que está unido a una molécula a transportar, seleccionada de un polinucleótido, oligonucleótido o mononucleótido, para el transporte de esta molécula a través de una membrana biológica in vitro.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Uso de un radical arilo de las fórmulas F1 y F3 a F11, con
53
530
54
que está unido a una molécula a transportar, seleccionada de un polinucleótido, oligonucleótido o mononucleótido, para la preparación de un medicamento para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades que van acompañadas de la expresión o sobre-expresión de determinados genes, y/o de un agente de diagnóstico para el diagnóstico o la detección precoz de enfermedades de este tipo.
\vskip1.000000\baselineskip
3 Uso según la reivindicación 1 ó 2,
en el que el o los radicales arilo están unidos en el extremo 5', el extremo 3', la base heterocíclica, el azúcar o el puente internucleósido, pero también a través de componentes no nucleotídicos.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Procedimiento para el transporte de una molécula a través de una membrana in vitro, en el que se incuba con la membrana un radical arilo, tal como se ha descrito en las reivindicaciones 1-3, con una molécula a transportar, seleccionada de un polinucleótido, oligonucleótido o mononucleótido.
5. Procedimiento para el transporte de una molécula en una célula in vitro, en el que se incuba con la célula un radical arilo, tal como se ha descrito en una de las reivindicaciones 1-3, con la molécula a transportar, seleccionada de un polinucleótido, oligonucleótido o mononucleótido, tras lo cual se transporta el conjugado a la célula, sin que se separe el radical arilo.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la célula es una célula eucariótica o una célula procariótica.
7. Procedimiento según las reivindicaciones 5 ó 6, en el que la célula es una célula bacteriana, una célula de levadura o una célula de mamífero.
8. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 5 a 7, en el que la célula es una célula humana.
9. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 5 a 8, en el que la célula es una célula tumoral.
ES00956220T 1999-07-28 2000-07-20 Conjugados y procedimiento para su preparacion, asi como su uso para el transporte de moleculas a traves de membranas biologicas. Expired - Lifetime ES2335741T3 (es)

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DE19935302A DE19935302A1 (de) 1999-07-28 1999-07-28 Konjugate und Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung zum Transport von Molekülen über biologische Membranen
DE19935302 1999-07-28

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