ES2246318T3 - Derivados de acido peptidonucleico con carga negativa, agentes y procedimiento para su preparacion. - Google Patents
Derivados de acido peptidonucleico con carga negativa, agentes y procedimiento para su preparacion.Info
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Abstract
Derivado de PNA de **fórmula**, en la que V es igual a oxígeno, azufre, NR1, un grupo U-(CH3R4)u- CH2-C(O)-NH o un grupo U-(CH2CH2O)u¿-C(O)-NH, U independientemente uno de otro es igual a oxígeno, azufre o NH, u¿ independientemente uno de otro es de 1 a 10, preferiblemente de 1 a 4, con especial preferencia 1, W independientemente uno de otro es igual a oxígeno, azufre, o NR1, Y independientemente uno de otro es igual a hidroxi, mercapto, oxianión, tioato o NR1R2, R1 y R2 independientemente uno de otro es un resto compuesto por hidrógeno, o alquilo C1-C6, preferiblemente hidrógeno, R3 y R4 independientemente uno de otro significan un resto compuesto por hidrógeno o alquilo C1-C6 o un resto de una cadena lateral de aminoácido, preferiblemente hidrógeno, X independientemente uno de otro es igual a un grupo U- (alcandiil C2-C22)-U o un grupo U-(CH2CH2-O)u¿, o X es igual a un grupo marcador bifuncional, preferiblemente del grupo de derivados de fluoresceína, rodamina, TAMRA, biotina, pireno, dinitrofenilo, acridina, colorante de cianina, dabcilo, digoxigenina o edano, con especial preferencia un derivado de biotina.
Description
Derivados de ácido péptidonucleico con carga
negativa, agentes y procedimiento para su preparación.
La presente invención se refiere a derivados de
ácido poliamidonucleico (PNA) fosforilados con propiedades
mejoradas, a su uso, así como a agentes y procedimientos para su
preparación.
Los ácidos poliamidonucleicos, también denominado
ácido péptidonucleico (PNA), se unen con mayor afinidad que los
oligonucleótidos naturales a secuencias diana complementarias (ADN o
ARN) y tienen además frente al ADN natural la ventaja de que son muy
estables en suero. Los PNA se describieron originalmente como
análogos del ácido nucleico no naturales, en los que todo el
esqueleto de azúcar-fosfato está reemplazado por
unidades de N-(2-aminoetil)-glicina
(M. Egholm y col. (1991) Science 254, 1497 a 1500; documento WO
92/20702; M. Egholm y col. Nature (1993) 365, 566 a 568; P. Nielsen,
(1994) Bioconjugate Chem. 5, 3 a 7; E. Uhlmann y col. (1998)
Angewandte Chemie Int. Ed. Engl. 37, 2796 a 2823). Como bases se
utilizan las bases nucleicas de origen natural habituales en la
química de los nucleótidos o también de origen no natural o su forma
de profármaco, también precursores, que se transforman ya en el
organismo mediante biotransformación en la base libre. Además de
esto se describieron PNA en los que no todas las posiciones del
esqueleto portan restos de bases (Greiner y col. (1999) Helv. Chim
Acta 82, 2151), y en los que está reemplazada aminoetilglicina por
unidades más complejas (Uhlmann y col. (1998) Angewandte Chem. Int.
Ed. 37, 2796; Falkiewicz (1999) Biochim. Pol., 46, 509 a 529). En la
solicitud de patente alemana DE 19508923 A1 se describen además PNA
que se caracterizan por una elevada estabilidad y que pueden
atravesar la membrana celular y del núcleo.
El carácter de carga neutra del esqueleto de PNA
es una característica importante de esta clase de sustancia con
consecuencias de gran alcance. Se atribuye al carácter neutro del
PNA y a la reducida repulsión de carga relacionada con esto que el
PNA tal cual se una a menor concentración salina a ADN y ARN
complementario (por ejemplo, Peptide Nucleic Acids: Protocols and
Applications; Peter E. Nielsen y Michael Egholm (editorial) Horizon
Scientific Press, 1999, 3), con lo que se cumplen las reglas de
emparejamiento de bases de Watson-Crick. Por tanto,
en principio el PNA se puede aprovechar para múltiples usos, en los
que se usan tales oligonucleótidos y/o derivados de oligonucleótidos
naturales. Pero además de esto resultan también en base a las
propiedades de unión únicas múltiples usos, que no son posibles con
oligonucleótidos naturales (véase, por ejemplo: Peptide Nucleic
Acids: Protocols and Applications; Peter E. Nielsen y Michael Egholm
(editorial) Horizon Scientific Press, 1999). Por ejemplo, se ha
observado con PNA una invasión de la hebra en el ADN de doble
hebra.
Ejemplos típicos para uso de PNA comprenden su
uso para la inhibición de la expresión de genes mediante unión
específica de secuencia al ADN o ARN celular. Los "agentes
antisentido" son derivados de ácido nucleico de hebra simple
corta, que se unen por emparejamiento de bases de
Watson-Crick a un ARNm complementario, cuya
traducción en la proteína correspondiente se debe inhibir (Uhlmann y
Peyman (1990) Chem. Rev. 90, 543; Larsen y col. (1999) Biochem.
Biophys. Acta 1489, 159). Los "agentes
anti-sentido" se unen por el emparejamiento de
bases de Hoogsteen en los grandes canales de la hélice doble de ADN
con formación de una triple hélice, con lo que la transcripción de
los genes se inhibe en las secuencia específica (Praseuth y col.
(1999) Biochem. Biophys. Acta 1489, 181). La expresión de genes se
puede inhibir también de forma específica mediante los denominados
oligómeros "Decoy", que imita las regiones de unión para los
factores de transcripción. Mediante el tratamiento con agentes Decoy
se puede captar determinados factores de transcripción de forma
específica de la secuencia y con esto evitar una activación de la
transcripción (Mischiati y col. (1999) J. Biol. Chem. 274, 33114).
Otro grupo de derivados de oligonucleótido que actúan
intracelularmente, los quimeroplastos, se aprovechan para la
corrección de gen pretendida (Cole-Strauss y col.
(1996) Science 273, 1366 a 1389).
Por tanto los PNA se pueden usar como
medicamentos y/o diagnóstico y/o para la preparación de
medicamentos y/o diagnósticos.
Para los fines de diagnóstico y en la biología
molecular el PNA se puede usar, por ejemplo, tras marcado con
biotina, fluoresceína u otras marcas como sonda de hibridación
específica. Para la introducción de los grupos marcadores se
describen hasta la fecha en la bibliografía cuatro procedimientos
(FERUM y col. (1999), en Peptide Nucleic Acids: Protocols and
Applications, páginas 81 a 86; Lohse y col. (1997) Bioconjugate
Chem. 8, 503). El primer procedimiento se base en el marcado de los
PNA libres (desprotegidos) después de su síntesis en solución. A
este respecto se hace reaccionar el término amino del PNA con un
ácido carboxílico activado o un isotiocianato. Sin embargo
frecuentemente se incorporan restos de lisina adicionales en el PNA,
que se hacen reaccionar luego con isotiocianato de fluoresceína
(FITC).
En cuanto al segundo procedimiento se modifica el
PNA protegido en la fase sólida en el término amino con derivados de
ácido carboxílico activados o isotiocianatos. Este procedimiento es
adecuado sólo para grupos marcadores, que son estables en las
condiciones de la desprotección del PNA y durante la escisión del
vehículo. Como reactivos se prefiere usar en ambos casos
isotiocianatos (P. Wittung y col., (1995) FEBS Lett. 375, 27) o
ácidos carboxílicos activados como, por ejemplo, éster de
N-hidroxisuccinimida (NHS) (Oerum y col., 1999). Una
desventaja de la reacción con los derivados de NHS es que
frecuentemente se consigue sólo en bajos rendimientos. Por tanto se
condensa frecuentemente ácido
8-amino-3,6-dioxaoctanoico
como ligador y/o espaciador entre el PNA y el grupo marcador (Oerum
y col., 1999). Ambas uniones se realizan mediante enlaces amida y/o
enlaces tiourea, pero que como tales llevan previamente a
insolubilidad. De forma alternativa se hacen reaccionar los ácidos
carboxílicos con ayuda de activadores habituales en la química de
péptidos como, por ejemplo, HBTU, TBTU o HATU.
En cuanto a un tercer procedimiento se usan
monómeros conjugados con fluoresceína en la síntesis en fase sólida
de PNA, con lo que el marcado de fluorescencia se realiza mediante
un enlace amida (Lohse y col. (1997) Bioconjugate Chem. 8, 503), que
lleva de nuevo a conjugados de solubilidad relativamente mala.
Un cuarto procedimiento usa conjugados de
PNA-péptido, en los que la parte de péptido forma un
sustrato para una proteinquinasa (Koch y col. (1995) Tetrahedron
Lett. 36, 6933). De esta forma tampoco se modifica la parte del PNA,
sino que el resto de serina del segmento peptídico se fosforila
enzimáticamente. Con este procedimiento no sólo se puede incorporar
fosfato radioactivo, sino que por ejemplo no se puede incorporar
fluoresceína o biotina en el segmento peptídico del conjugado
PNA-péptido.
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Se sabe que el PNA en solución acuosa, aunque
también en condiciones fisiológicas, es proclive a la agregación.
Por tanto, el PNA es poco soluble en tampón acuoso y se no se
encuentra disponible para la hibridación en secuencias
complementarias. El PNA muestra además una gran afinidad con
distintos materiales como Sephadex® (compañía Pharmacia), Bond Elut®
(compañía Varian) o distintos materiales para cromatografía de HPLC,
que son de uso en la purificación de oligómeros, de modo que el PNA
se puede aislar frecuentemente sólo en bajos rendimientos. Por
tanto, es necesario conjugar el PNA con lisina u otros aminoácidos
de carga positiva (sobre el término C) (Egholm y col. (1992) J. Am.
Chem. Soc. 114, 1895). Las secuencias de PNA ricas en guanina
tienden muy especialmente a la agregación, por lo cual se
desaconseja el uso de tales PNA (véase "Guidelines for sequence
design of PNA oligomers" en Peptide Nucleic Acids: Protocols and
Applications (1999) páginas 253 a 255). Son especialmente poco
solubles, por ejemplo, oligómeros de PNA marcados con fluoresceína,
en los que se recomienda la adición de un disolvente orgánico y
calentamiento hasta 50ºC.
La purificación del derivado de PNA lipófilo poco
soluble es especialmente dificultosa. En la HPLC se detectan
frecuentemente varios picos que son debidos a los agregados de PNA.
La técnica de la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAA) usada
frecuentemente para la purificación y separación de ácidos nucleicos
no es posible para estos derivados de PNA.
En cuanto a los procedimientos descritos
anteriormente de la derivatización de PNA se incorpora el grupo
marcador mediante conexión de un enlace amida o enlace tioamida, con
lo que se forman derivados de PNA relativamente poco solubles.
Especialmente en la incorporación de restos lipófilos como, por
ejemplo, de fluoresceína, se generan derivados de PNA poco solubles.
Debido a que las reacciones de marcado transcurren además
frecuentemente con bajos rendimientos, se presenta un objetivo a
resolver en proporcionar nuevos derivados de PNA, que se puedan
preparar en rendimientos altos y presenten propiedades ventajosas,
como mejor solubilidad, mejor comportamiento de unión, mejor
captación celular, y que además permita el uso de procedimientos de
purificación más efectivos para los oligómeros de PNA.
El objetivo se consigue según la invención
proporcionando derivados de PNA que portan en el término N del
esqueleto de PNA uno o varios restos fosforilo, con lo que además
están comprendidos derivados oxo, tio e imino, y en los que al menos
uno de los restos fosforilo porta uno o varios grupos
desprotonables, preferiblemente grupos hidroxi o mercapto. Los
restos fosforilo están unidos por un enlace
oxígeno-fósforo, azufre-fósforo o un
nitrógeno-fósforo bien de forma directa o por un
espaciador con el esqueleto de PNA, con lo que el espaciador puede
ser, por ejemplo, una alcanoílamida, una
poli(alcoxi)carboxamida o un aminoácido, que dado el
caso portan en el átomo \alpha o \beta una cadena lateral, en
donde esta cadena lateral no puede portar resto fosforilo alguno.
Ejemplos de restos fosforilo son fosfato, fosfonato, tiofosfato,
fosfoamidato o restos fosforilo sustituidos, en donde los restos
fosforilo sustituidos portan, dado el caso, uno o varios grupos
marcadores, o grupos para la reticulación transversal, o grupos que
favorecen la captación intracelular, o grupos que aumentan la
afinidad de unión del derivado de PNA en ácidos nucleicos.
Con grupos marcadores (marcas) se entienden a
este respecto grupos que permiten una valoración cualitativa o
cuantitativa de la actividad química o biológica de los derivados de
PNA, por ejemplo, biotina o fluoresceína. Con reticulación
transversal (cross-linking) se entiende la formación
de enlaces intra- y/o intermoleculares entre funcionalidades
próximas espacialmente. Un grupo para la reticulación transversal
es, por ejemplo, el grupo psoraleno.
La invención se refiere preferiblemente a
derivados de PNA de fórmula I
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en la
que
- V
- es igual a oxígeno, azufre, NR_{1}, un grupo U-(CH_{3}R_{4})_{u}-C(O)-NH o un grupo U-(CH_{2}CH_{2}O)_{u'}-CH_{2}-C(O)-NH,
- U
- independientemente uno de otro es igual a oxígeno, azufre o NH,
- u'
- independientemente uno de otro es de 1 a 10, preferiblemente de 1 a 4, con especial preferencia 1,
- W
- independientemente uno de otro es igual a oxígeno, azufre, o NR_{1},
- Y
- independientemente uno de otro es igual a hidroxi, mercapto, oxianión, tioato o NR_{1}R_{2},
R_{1} y R_{2}
independientemente uno de otro es un resto compuesto por hidrógeno,
o alquilo C_{1}-C_{6}, preferiblemente
hidrógeno,
R_{3} y R_{4}
independientemente uno de otro significan un resto compuesto por
hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{6} o un resto de
una cadena lateral de aminoácido, preferiblemente
hidrógeno,
- X
- independientemente uno de otro es igual a un grupo U-(alcandiil C_{2}-C_{22})-U o un grupo U-(CH_{2}CH_{2}-O)_{u'},
- \quad
- o es igual a un grupo marcador, o un grupo para la reticulación transversal, o un grupo que favorece la captación intracelular, o un grupo que aumenta la afinidad de unión del derivado de PNA en ácidos nucleicos, por ejemplo, un resto bifuncional de fluoresceína, rodamina, TAMRA, biotina, pireno, dinitrofenilo, colesterilo, acridina, adamantilo, vitamina E, colorante de cianina, dabcilo, edano, lexitropsina, psoraleno, BODIPY, ROX, R6G o digoxigenina,
- Z
- es igual a hidroxi, mercapto, oxianión, tioato o NR_{1}R_{2}, alquilo C_{1}-C_{22}, arilalquilo C_{1}-C_{8}, alquil C_{1}-C_{22}-U, aril C_{1}-C_{8}-alquil-U, hidroxi C_{1}-C_{18}-U, aminoalquil-U, mercaptoalquil-U,
- \quad
- o es un grupo de fórmula R_{9}(CH_{2}CH_{2}-O)_{m}, en el que R_{9} es igual a hidroxi, amino o alcoxi C_{1}-C_{22}, y m es de 1 a 100, preferiblemente de 2 a 10,
- \quad
- o es igual a un grupo marcador, o un grupo para la reticulación transversal, o un grupo que favorece la captación intracelular, o un grupo que aumenta la afinidad de unión del derivado de PNA en ácidos nucleicos, por ejemplo, un resto monofuncional o bifuncional de fluoresceína, rodamina, TAMRA, biotina, pireno, dinitrofenilo, colesterilo, acridina, adamantilo, vitamina E, colorante de cianina, dabcilo, edano, lexitropsina, psoraleno, BODIPY, ROX, R6G o digoxigenina,
- n
- es de 0 a 10, preferiblemente de 0 a 3,
- Q
- es igual a hidroxi, amino, NHR_{7}, NR_{7}R_{8}, derivado de aminoácido o un resto peptídico,
R_{7} y R_{8}
independientemente uno de otro son alquilo
C_{1}-C_{8} o hidroxialquilo
C_{1}-C_{8},
con la condición de que al menos un
resto Y o Z sea igual a hidroxi, mercapto, oxianión o
tioato,
{POLI} se describe mediante la fórmula II
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Por tanto, el esqueleto de PNA está formado por
z'+1 monómeros, en los que {BLOQUE} se seleccionan
independientemente unos de otros de la fórmula IIIA
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
o de la fórmula IIIB (Greiner y
col. (1999) Helv. Chim. Acta 82,
2151),
o de las fórmulas IV A a IV G
(Uhlmann y col. (1998) Angewandte Chem. Int. Ed. 37, 2796;
Falkiewicz (1999) Biochim. Pol., 46, 509 a
529).
en las que cada constituyente
{BLOQUE} puede ser
distinto,
y en las
que
- A
- independientemente uno de otro es un grupo (CR_{1}R_{2})_{s}, en el que s es de 1 a 3, preferiblemente 1,
- B
- independientemente uno de otro es bien un resto aromático, que también puede poseer carácter heteoraromático, o bien hidrógeno, o hidroxi o alquilo C_{1}-C_{18},
- \quad
- o es una base nucleica de origen natural habitual en la química de los nucleótidos o de origen no natural o su forma de profármaco,
- \quad
- en la que al menos un resto B en la fórmula II es una base nucleica,
- D
- independientemente uno de otro es un grupo (CR_{3}R_{4})_{t}, en la que t es de 2 a 10, preferiblemente de 2 a 4, con especial preferencia 2,
- \quad
- en la que R_{3} y R_{4} tienen el significado anteriormente mencionado, y dos restos D próximos puede formar también un anillo cicloalquilo C_{5}-C_{8},
- E
- independientemente uno de otro es un grupo (CR_{5}R_{6})_{u'}, en la que dos restos R_{5} y R_{6} próximos puede formar también un anillo cicloalquilo C_{5} a C_{8} o un compuesto espiro,
R_{5} y R_{6}
independientemente uno de otro son un resto compuesto por hidrógeno
o alquilo C_{1}-C_{6}, preferiblemente
hidrógeno, o significan el resto de una cadena lateral de
aminoácido,
- z'
- es de 0 a 100, preferiblemente de 1 a 20, con especial preferencia de 4 a 15.
La invención se refiere además a sales
fisiológicamente aceptables de los derivados de PNA de fórmula I. Se
describen sales fisiológicamente aceptables, entre otros, en
Remingtons Pharmaceutical Science (1985) Mack Publishing Company,
Easton, PA, Estados Unidos, página 1418. Son preferidas las sales de
amonio, sales de trialquilamonio, sales de metal alcalino (como
sales de sodio y potasio) y sales alcalinotérreas (como sales de
magnesio y calcio). Son especialmente preferidas las sales de
sodio.
De forma sorprendente se ha encontrado que ya es
suficiente una carga parcial negativa en el resto fosforilo para
mejorar de forma decisiva las propiedades de los compuestos de
fórmula I. Mientras que el PNA de por sí no migra en la
electroforesis en gel de PAA, los compuestos de fórmula I migran al
ánodo. Debido a que el resto fosforilo durante la síntesis de los
compuestos de fórmula I se incorpora ya en el último ciclo, en la
electroforesis en gel de PAA migran sólo los compuestos de acuerdo
con la invención en el campo eléctrico, mientras que todas las
secuencias defectuosas y productos secundarios no migran y por ello
se pueden separar de forma extremadamente sencilla.
Los sustituyentes hidroxi y/o mercapto de los
restos fosforilo de los derivados de PNA de acuerdo con la invención
se pueden desprotonar en un intervalo de pH de 4,5 a 14,
preferiblemente de 6,5 a 12, con especial preferencia de 6,5 a 9. La
propiedad de la ionizabilidad de los restos fosforilo puede ser
usada de forma ventajosa para la purificación de los compuestos de
fórmula I. Por un lado se pueden purificar los compuestos de fórmula
I mediante electroforesis, por ejemplo, electroforesis en gel de
poliacrilamida. Por otro lado es posible una purificación con ayuda
de intercambiadores de aniones. A este respecto se eluyen los
productos deseados preferiblemente mediante uso de un gradiente de
sal, por ejemplo, un gradiente de sal común, o un gradiente de pH.
Se puede purificar de forma especialmente sencilla y eficiente los
derivados de PNA de acuerdo con la invención de fórmula I mediante
el intercambiador de aniones. Se demuestra que los productos
secundarios no cargados no son retardados en el intercambiador de
aniones, mientras que el producto cargado se adheriría a la columna.
Tras lavado con agua se podría aislar el producto deseado con ácido
acético o una solución de sal común en forma pura. Como
intercambiador de aniones se usa preferiblemente intercambiadores de
aniones fuertes, o fases mixtas como, por ejemplo, ®Oasis MAX
(Waters GmgH,
Eschbom).
Eschbom).
Además se demuestra que los compuestos de acuerdo
con la invención de fórmula I son generalmente mejor solubles en
medio acuoso que los oligómeros de PNA correspondientes sin el resto
fosforilo. Esto se hace muy especialmente evidente en los derivados
lipófilos como, por ejemplo, los derivados de fluoresceína o los
derivados de hexadecilo, en forma de una solubilidad fuertemente
mejorada en medio acuosa.
Como otro efecto sorprendentemente más positivo
se mostró que la incorporación de un resto fosforilo, por ejemplo,
como fosfato o también en forma de una derivatización lipófila (por
ejemplo, como hexadecilfosfodiéster) aumenta la afinidad del PNA en
ADN o ARN complementario. Este efecto no se esperaba ya que la
fuerte unión de PNA en ADN o ARN complementario se atribuyó al
carácter neutro del PNA y a la reducida repulsión de carga
relacionada con esto (por ejemplo, Peptide Nucleic Acids: Protocols
and Applications; Meter E. Nielsen y Michael Egholm (Edit.) Horizon
Scientific Press, 1999, 3).
La incorporación de biotina se realizó de forma
especialmente efectiva mediante un resto fosforilo. El PNA
biotinilada de fórmula I (X y/o Z = resto biotina) mostró como
sondas de hibridación mejores propiedades de unión y menores efectos
de fondo no específicos distorsionantes que las sondas de ADN
biotiniladas correspondientes.
Al contrario que el PNA no cargado los derivados
de PNA de acuerdo con la invención de fórmula I también migran en el
campo eléctrico, con lo que es posible una microlocalización y una
concentración en derivados de ácido nucleico complementarios
inmovilizados. Para el oligonucleótido polianiónico ya se describió
este procedimiento para la determinación pronta de emparejamientos
fallidos de bases con ayuda del campo eléctrico (Sosnowski y col.
(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 94, 1119).
La invención se refiere especialmente a derivados
de PNA, en los que A y E son iguales a CH_{2}. La invención se
refiere además especialmente a derivados de PNA, en los que D son
iguales a (CH_{2})_{2}. Se prefieren además derivados de
PNA de fórmula I, en los que V, W, e Y son iguales a oxígeno.
Ejemplos de bases naturales son adenina,
citosina, 5-metilcitosina, guanina, timina y
uracilo. Ejemplos de bases no naturales son purina,
2,6-diaminopurina,
N^{4}N^{4}-etanocitosina,
N^{6}N^{6}-etano-2,6-diaminopurina,
5-alquinil
(C_{3}-C_{6})-uracilo,
5-alquinil
(C_{3}-C_{6})-citosina,
5-(1-propargilamino)-uracilo,
5-(1-propargilamino)-citosina,
fenoxazina, 9-aminoetoxifenoxazina,
5-fluor-uracilo o pseudoisocitosina,
5-(hidroximetil)uracilo, 5-aminouracilo,
pseudouracilo, dihidrouracilo, 5-alquil
(C_{1}-C_{6})-uracilo,
5-alquil
(C_{1}-C_{6})-citosina,
5-alquenil
(C_{2}-C_{6})-citosina,
5-fluorocitosina, 5-clorouracilo,
5-clorocitosina, 5-bromouracilo,
5-bromocitosina, 7-deazaadenina,
7-deazaguanina, 8-azapurina o purina
7-deaza-7-sustituida.
Q es preferiblemente un resto hidroxialquilamino,
especialmente un resto hidroxi-hexilamino, o un
derivado de un aminoácido natural o no natural conocido, o de un
péptido. Como secuencias peptídicas se consideran preferiblemente
aquellas que optimizan la distribución en órgano o la localización
celular del PNA como, por ejemplo, transportano, factor de
crecimiento tipo insulina, señales de localización nuclear u otras
secuencias portadoras (Larsen y col. (1999) Biochim. Biophys. Acta
159 a 166). El péptido puede servir también como etiqueta de
afinidad, como una cadena (His)_{6}.
La presente invención hace posible una amplia
variación de los restos X y Z (se dan ejemplos en las figuras 1a,
1b, 2a, 2b, 3a y 3b) y permite así la incorporación de distintas
características de función específicas en PNA.
Una forma de realización preferida de Z es un
resto alquilo C_{1} a C_{22}. Son preferidos también los restos
alcoxi C_{1} a C_{22}, especialmente los restos alcoxi C_{16}.
Otros restos preferidos son restos hidroxi-(alcoxi
C_{1}-C_{16}), especialmente
HO(CH_{2})_{3-12}O. Además son
preferidos los restos aminoalcoxi, especialmente los restos
6-aminohexoxi y 5-aminopentoxi.
Además son preferidos los restos de fórmula
R_{9}(CH_{2}CH_{2}-O)_{m}, en
la que R_{9} es igual a hidroxi, amino o alcoxi
C_{1}-C_{22}, pero se prefiere hidroxi, y m es
de 0 a 100, preferiblemente de 2 a 10. Son especialmente preferidos
HO(CH_{2}CH_{2}-O)_{2},
HO(CH_{2}CH_{2}-O)_{6} y
H_{2}N-(CH_{2}CH_{2}-O)_{2}. Otros
ejemplos preferidos de Z comprenden restos mercaptoalcoxi,
especialmente 6-mercaptohexiloxi.
En otra forma de realización preferida Z
comprende un grupo de fluorescencia como fluoresceína, rodamina,
TAMRA o un colorante de cianina. Se encuentran grupos de
fluorescencia preferidos en las figuras 1a a 3b. Es muy
especialmente preferida también la biotina para Z. Otros grupos
preferidos para Z comprenden dabcilo, psoraleno, acridina, DNP y
colesterol (figuras 1b y 2b), restos BODIPY, ROX o R6G
(Su-Chun Hung y col. (1998) Analytical Biochemistry
255, 32 a 38) y digoxigenina (Tarrason y col., Methods in Enzymology
(1999) volumen 313, 257 a 268). Además de esto Z puede ser igual a
un grupo compuesto por un resto monofuncional o un resto bifuncional
de fluoresceína, rodamina, TAMRA, biotina, pireno, dinitrofenilo,
colesterilo, acridina, adamantilo, vitamina E, colorante de cianina,
dabcilo, edano, lexitropsina, o psoraleno. A modo de ejemplo se
indican grupos terminales monofuncionales en las figuras 1a, 1b, 2a
y 3a, se indican grupos bifuncionales que hacen de puente en las
figuras 2b y 3b. En otra forma de realización preferida n es igual a
0, es decir, la parte de PNA porta sólo un resto fosfato o
fosforilo.
fosforilo.
Una forma de realización preferida de X es
U-(alcandiil C_{2}-C_{22})-U,
especialmente O-(alcandiil
C_{2}-C_{22})-O, con especial
preferencia
O-(CH_{2})_{2-6}-O. Otra
forma de realización preferida de X es un grupo de fórmula
U-(CH_{2}CH_{2}-O)_{u'}, en la que u'
es de 1 a 10, preferiblemente de 1 a 6, y en la que U es
preferiblemente oxi. En otra forma de realización preferida X
comprende un grupo de fluorescencia como fluoresceína, rodamina,
TAMRA o un colorante de cianina, por ejemplo Cy3® (compañía Amersham
Pharmacia Biotech). Se encuentran grupos bifuncionales preferidos en
las figuras 2a y 3a. Se prefiere muy especialmente también biotina
para X. Otros grupos preferidos para X comprenden restos de dabcilo,
psoraleno, acridina, DNP, colesterol, BODIPY, digoxigenina, ROX y
R6G.
Los distintos restos para X y Z en la fórmula I
pueden cumplir distintas funciones. Los restos de fluoresceína
tienen usos de gran alcance en la secuenciación de ADN,
amplificación de señal o como marcador para la determinación de la
captación celular de PNA. Los restos de colorante de cianina (Cy3® y
Cy5®) dan lugar a una señal de fluorescencia esencialmente más
intensiva y más sostenida como la propia fluoresceína. El resto de
psoraleno se usa para la reticulación transversal
(cross-linking) con ácidos nucleicos
complementarios. El resto de acridina es un intercalador más
efectivo y con ello puede reforzar la afinidad de unión del PNA. Los
derivados de biotina, acridina y psoraleno también se pueden usar
para experimentos antisentido. Además se pueden usar derivados de
hexadeciloxi y colesterol para el aumento del paso de membrana del
PNA. Los compuestos marcados con DNP de fórmula I se pueden probar
con anticuerpos anti-DNP. Los restos de aminoalcoxi
se pueden usar para el acoplamiento de otros grupos como, por
ejemplo, lexitropsina (véase el ejemplo 17, PNA-16).
De forma similar se puede usar también otros grupos mercaptoalcoxi
para la derivatización adicional.
La invención se refiere además al uso de
derivados de PNA de fórmula I para la preparación de medicamentos.
Estos medicamentos se pueden usar para la prevención y/o tratamiento
de enfermedades que se dan con la expresión y/o una sobreexpresión
de determinados genes. Además la invención se refiere al uso de
derivados de PNA de fórmula I como diagnóstico. Estos diagnósticos
se pueden usar para el reconocimiento prematuro in vitro de
enfermedades anteriormente citadas.
Como medicamento y/o diagnóstico se pueden usar
los derivados de PNA de fórmula I en función de su secuencia como
agentes antisentido, antígeno, Decoy y quimeroplastos.
Los derivados de PNA de acuerdo con la invención
se usan especialmente para la preparación de medicamentos para el
tratamiento de enfermedades, en las que el gen definido es causa y/o
partícipe por sobreexpresión.
Estos medicamentos se pueden usar, por ejemplo,
para el tratamiento de enfermedades que son provocadas por virus,
por ejemplo, por CMV, VIH, VHS-1,
VHS-2, gripe, VSV, hepatitis B o virus del papiloma,
en los que la secuencia del virus correspondiente es la diana.
Los derivados de PNA antisentido de acuerdo con
la invención que son efectivos contra tales dianas tienen, por
ejemplo, la siguiente secuencia de bases.
a) contra CMV, por ejemplo
- ID SEC Nº: 1
- 5'-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3'
b) contra VIH, por ejemplo
- ID SEC Nº: 2
- 5'-ACACCCAATTCTGAAAATGG-3'
- ID SEC Nº: 3
- 5'-AGGTCCCTGTTCGGGCGCCA-3'
c) contra VHS-1, por ejemplo
- ID SEC Nº: 4
- 5'-GCGGGGCTCCATGGGGGTCG-3'
Tales medicamentos también son adecuados, por
ejemplo, para el tratamiento de cánceres. Preferiblemente a este
respecto se pueden tener en cuenta para el uso de secuencias que
están dirigidas contra dianas que son responsables de la generación
y/o crecimiento de cánceres, especialmente mediante la inhibición de
la telomerasa (E. Matthes y col. (1999) Nucleic Acids Res. 27,
1152). Tales dianas son además:
1) oncoproteínas nucleares como, por ejemplo,
c-myc, N-myc, c-myb,
c-fos, c-fos/jun, PCNA, p120,
2) oncoproteínas asociadas con la membrana
citoplasmática como, por ejemplo, EJ-ras,
c-Ha-ras, N-ras,
rrg, bcl-2, cdc-2,
c-raf-1, c-mos,
c-src, c-abl,
c-ets,
3) receptores celulares como, por ejemplo,
receptor del EGF, Her-2, c-erbA,
receptor del VEGF (KDR-1), receptores de retinoides,
subunidades regulatorias de la proteinquinasa,
c-fms, Tie-2,
c-raf-1 quinasa,
PKC-alfa, proteinquinasa A (R1 alfa).
4) citoquina, factores de crecimiento, matriz
extracelular como, por ejemplo, CSF-1,
IL-6, IL-1a, IL-1b,
IL-2, IL-4, IL-6,
IL-8, bFGF, VEGF, mieloblastina, fibronectina.
Derivados de PNA antisentido que son efectivos
contra tales dianas tienen, por ejemplo, la siguiente secuencia de
bases:
a) contra
c-Ha-ras, por ejemplo
- ID SEC Nº: 5
- 5'-CAGCTGCAACCCAGC-3'
- ID SEC Nº: 6
- 5'-TATTCCGTCAT-3'
- ID SEC Nº: 7
- 5'-TTCCGTCATCGCTCCTCAGGGG-3'
b) bFGF, por ejemplo
- ID SEC Nº: 8
- 5'-GGCTGCCATGGTCCC-3'
c) c-myc, por ejemplo
- ID SEC Nº: 9
- 5'-GGCTGCTGGAGCGGGGCACAC-3'
- ID SEC Nº: 10
- 5'-AACGTTGAGGGGCAT-3'
d) c-myb, por ejemplo:
- ID SEC Nº: 11
- 5'-GTGCCGGGGTCTTCGGGC-3'
e) c-fos, por ejemplo
- ID SEC Nº: 12
- 5'-CGAGAACATCATCGTGG-3'
- ID SEC Nº: 13
- 5'-GGAGAACATCATGGTCGAAAG-3'
- ID SEC Nº: 14
- 5'-CCCGAGAACATCATGGTCGAAG-3'
- ID SEC Nº: 15
- 5'-GGGGAAAGCCCGGCAAGGGG-3'
\newpage
f) p120, por ejemplo,
- ID SEC Nº: 16
- 5'-CACCCGCCTTGGCCTCCCAC-3'
g) receptor del EGF, por ejemplo
- ID SEC Nº: 17
- 5'-GGGACTCCGGCGCAGCGC-3'
- ID SEC Nº: 18
- 5'-GGCAAACTTTCTTTTCCTCC-3'
h) supresor de tumor p53, por ejemplo
- ID SEC Nº: 19
- 5'-GGGAAGGAGGAGGATGAGG-3'
- ID SEC Nº: 20
- 5'-GGCAGTCATCCAGCTTCGGAG-3'
i) bcl-2, por ejemplo
- ID SEC Nº: 21
- 5'-TCTCCCAGCGTGCGCCAT-3'
k) VEGF, por ejemplo
- ID SEC Nº: 22
- 5'-GCGCTGATAGACATCCATG-3'
- ID SEC Nº: 23
- 5'-GGAGGCCCGACC-3'
- ID SEC Nº: 24
- 5'-GGTTTCGGAGGC-3'
- ID SEC Nº: 25
- 5'-TGGTGGAGGTAG-3'
- ID SEC Nº: 26
- 5'-GCATGGTGGAGG-3'
- ID SEC Nº: 27
- 5'-TTGGCATGGTGG-3'
- ID SEC Nº: 28
- 5'-GCCTGGGACCAC-3'
- ID SEC Nº: 29
- 5'-CAGCCTGGGACC-3'
- ID SEC Nº: 30
- 5'-TGCAGCCTGGGA-3'
- ID SEC Nº: 31
- 5'-GTGCAGCCTGGG-3'
- ID SEC Nº: 32
- 5'-GGTGCAGCCTGG-3'
- ID SEC Nº: 33
- 5'-ATGGGTGCAGCC-3'
- ID SEC Nº: 34
- 5'-GGCTTGAAGATG-3'
- ID SEC Nº: 35
- 5'-GCAGCCCCCGCA-3'
- ID SEC Nº: 36
- 5'-GCAGCAGCCCCC-3'
l) c-raf quinasa, por
ejemplo:
- ID SEC Nº: 37
- 5'-TCCCGCCTGTGACATGCATT-3'
m) PKC-alfa, por ejemplo
- ID SEC Nº: 38
- 5'-GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA-3'
n) proteinquinasa A, por ejemplo
- ID SEC Nº: 39
- 5'-GCGTGCCTCCTCACTGGC-3'
Medicamentos que contiene derivados de PNA de
fórmula I son además adecuados, por ejemplo, para el tratamiento de
enfermedades que se ven influenciadas por integrina o receptores de
adhesión célula-célula, por ejemplo por
VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM o ELAM.
Los derivados de PNA antisentido que son
efectivos contra tales dianas tienen, por ejemplo, la siguiente
secuencia de bases:
a) VLA-4, por ejemplo
- ID SEC Nº: 40
- 5'-GCAGTAAGCATCCATATC-3'
b) ICAM-1, por ejemplo
- ID SEC Nº: 41
- 5'-GCCCAAGCTGGCATCCGTCA-3'
- ID SEC Nº: 42
- 5'-CCCCCACCACTTCCCCTCTC-3'
- ID SEC Nº: 43
- 5'-CTCCCCCACCACTTCCCCTC-3'
- ID SEC Nº: 44
- 5'-GCTGGGAGCCATAGCGAGG-3'
c) ELAM-1, por ejemplo
- ID SEC Nº: 45
- 5'-ACTGCTGCCTCTTGTCTCAGG-3'
- ID SEC Nº: 46
- 5'-CAATCAATGACTTCAAGAGTTC-3'
d) integrina alfa (V), por ejemplo
- ID SEC Nº: 47
- 5'-GCGGCGGAAAAGCCATCG-3'
Medicamentos que contienen derivados de PNA de
fórmula I son adecuados, por ejemplo, para evitar la restenosis. A
este respecto se puede considerar para uso secuencias de PNA, que
están dirigidas contra dianas que son responsables de la
proliferación o migración. Tales dianas son, por ejemplo:
1) Proteína transactivadora nuclear y ciclina
como, por ejemplo, c-myc, c-myb,
c-fos, c-fos/jun, ciclina y
cdc2-quinasa
2) Mitogenes o factores del crecimiento como, por
ejemplo, PDGF, bFGF, VEGF, EGF, HB-EGF y
TGF-\beta.
3) Receptores celulares como, por ejemplo,
receptor del bFGF, receptor del EGF y receptor del PDGF.
Derivados de PNA antisentido que son efectivos
contra tales dianas tienen, por ejemplo, la siguiente secuencia de
bases:
a) c-myb, por ejemplo
- ID SEC Nº: 48
- 5'-GTGTCGGGGTCTCCGGGC-3'
b) c-myc, por ejemplo
- ID SEC Nº: 49
- 5'-CACGTTGAGGGGCAT-3'
c) cdc2-quinasa, por ejemplo
- ID SEC Nº: 50
- 5'-GTCTTCCATAGTTACTCA-3'
d) PCNA (proliferación del antígeno nuclear
celular de rata), por ejemplo
- ID SEC Nº: 51
- 5'-GATCAGGCGTGCCTCAAA-3'
Los derivados de PNA se pueden usar igualmente
para el tratamiento del vitiligo y otras enfermedades de
despigmentación o trastornos de despigmentación (por ejemplo, de la
piel, cabello, ojos) como, por ejemplo, albinismo y psoriasis, o
para el tratamiento de asma, con lo que la expresión del receptor de
adenosin-A1, receptor de
adenosin-A3, receptor de bradiquinina o de
IL-13 se inhibe con ayuda de agentes antisentido
adecuados. Una secuencia de bases de este tipo es, por ejemplo:
- ID SEC Nº: 52
- 5'-GATGGAGGGCGGCATGGCGGG-3'
Los medicamentos que contienen un derivado de PNA
de fórmula I se pueden usar, por ejemplo, en forma de preparados
farmacéuticos que se pueden administrar por vía oral, por ejemplo,
en forma de comprimidos, grageas, cápsulas de gelatina dura o
blanda, soluciones, emulsiones o suspensiones. Se pueden administrar
también por vía rectal, por ejemplo, en forma de supositorios o por
vía parenteral, por ejemplo, en forma de soluciones para inyección.
Para la preparación de preparados farmacéuticos se pueden
administrar estos compuestos en vehículos orgánicos e inorgánicos
terapéuticamente inertes. Ejemplos de tales vehículos para
comprimidos, grageas y cápsulas de gelatina dura son la lactosa,
almidón de maíz o derivados de estos, sebo y ácido esteárico o sales
de los mismos. Vehículos adecuados para la preparación de soluciones
son agua, polioles, sacarosa, azúcar invertido y glucosa. Vehículos
adecuados para soluciones para inyección son agua, alcoholes,
polioles, glicerol y aceites vegetales. Vehículos adecuados para
supositorios son aceites vegetales y endurecidos, ceras, grasas y
polioles semilíquidos. Los preparados farmacéuticos también pueden
contener también agentes conservantes, disolventes, agentes de
estabilización, humectantes, emulsionantes, edulcorantes,
colorantes, agentes de corrección del sabor, sales para la
modificación de la presión osmótica, tampones, agentes de
recubrimiento, antioxidantes, así como dado el caso otros principios
activos terapéuticos. Son formas de administración preferidas las
aplicaciones por vía tópica, aplicaciones locales como, por ejemplo,
con ayuda de un catéter o mediante inhalación, inyecciones y/o
infusiones y la administración por vía oral. Para la inyección se
formulan los derivados de PNA de fórmula I en una solución líquida,
preferiblemente en un tampón fisiológicamente aceptable como, por
ejemplo, solución de Hank o solución de Ringer. Sin embargo los
oligonucleótidos se pueden formular también en forma sólida y se
pueden disolver o suspender antes del consumo. Las dosificaciones
preferidas para la administración sistemática alcanzan
aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg de peso
corporal y día.
La invención se refiere además a preparaciones
farmacéuticas que contienen derivados de PNA de fórmula I y/o sales
fisiológicamente aceptables además de vehículos y/o aditivos
farmacéuticamente perfectos. Los derivados de PNA de fórmula I y/o
sus sales fisiológicamente aceptables se pueden administrar al
animal, preferiblemente al mamífero, y especialmente en hombres como
medicamento en solitario, en mezclas unos con otros o en forma de
preparaciones farmacéuticas, que permitan el uso por vía tópica,
percutánea, parenteral o entérica y que contienen como constituyente
activo una dosis efectiva de al menos un derivado de PNA, junto con
vehículos y aditivos usuales farmacéuticamente perfectos. Las
preparaciones contienen normalmente aproximadamente de 0,1 a 90% en
peso del compuesto terapéuticamente efectivo. Para el tratamiento de
enfermedades de la piel se prefiere un uso por vía tópica, por
ejemplo, en forma de pomadas, lociones o tinturas, emulsiones,
suspensiones.
La preparación de preparados farmacéuticos se
realiza de forma conocida (por ejemplo, Remingtons Phamaceutical
Sciences, Mack Publ. Co., Easton, PA), en donde se usan vehículos
inorgánicos y/u orgánicos farmacéuticamente inertes. Para la
preparación de píldoras, comprimidos, grageas y cápsulas de gelatina
dura se pueden usar, por ejemplo, lactosa, almidón de maíz y/o
derivados de los mismos, talco, ácido esteárico y/o sus sales etc.
Vehículos para cápsulas de gelatina blanda y/o suspensiones son, por
ejemplo, grasas, ceras, polioles semisólidos y líquidos, aceites
naturales y/o endurecidos etc. Como vehículos para la preparación de
soluciones y/o jarabes son adecuados, por ejemplo, agua, sacarosa,
azúcar invertido, glucosa, polioles etc. Como vehículos para la
preparación de soluciones para inyección son adecuados agua,
alcoholes, glicerina, polioles, aceites vegetales etc. Como
vehículos para microcápsulas, implantes y/o barras son adecuados
polimerizados mixtos de ácido glicólico y ácido láctico. Además de
estos son adecuadas las formulaciones de liposomas, que son
conocidas por el especialista en la técnica (N Weiner, Drug Develop
Ind Pharm 15 (1989) 1523 ``Liposome Dermatics, editorial Springer
1992), por ejemplo, liposomas HVJ (Hayashi, Gene Therapy 3 (1996)
878). La aplicación por vía dérmica se puede realizar, por ejemplo,
también con ayuda de procedimientos ionoforéticos y/o con ayuda de
electroporación.
Una preparación farmacéutica puede contener
además de los principios activos y vehículos también aditivos como,
por ejemplo, cargas, agentes de extensión, expansivos, aglutinantes,
lubricantes, humectantes, estabilizantes, emulsionantes,
conservantes, edulcorantes, colorantes, de corrección del sabor o
aromatizantes, espesantes, diluyentes, sustancias tampón, además de
disolventes y/o solubilizadores y/o agentes para la consecución de
un efecto depósito así como sales para la modificación de la presión
osmótica, recubrimientos y/o antioxidantes. Pueden contener también
dos o más derivados distintos de PNA de fórmula I y/o sus sales
fisiológicamente aceptables así como además de al menos un derivado
de PNA de fórmula I una o varias sustancias terapéuticamente
efectivas. La dosis puede variar dentro de amplios límites y se ha
de ajustar en cada caso individual a las circunstancias
indi-
viduales.
viduales.
La invención se refiere además al uso de
derivados de PNA de fórmula I como diagnóstico, especialmente como
coadyuvante en el diagnóstico de ADN y en la biología molecular
(véase, por ejemplo: Peptide Nucleic Acids: Protocols and
Applications, Peter E. Nielsen y Michael Egholm (editorial) Horizon
Scientific Press, 1999). En el diagnóstico de ADN las sondas
génicas, también denominadas sondas de ADN o sondas de hibridación,
juegan un gran papel para la comprobación de forma específica de la
secuencia de determinados genes. Una sonda génica se compone en
general de una secuencia de reconocimiento y de uno y/o varios
grupos marcadores adecuados (marcas). La especificidad de la
determinación de una secuencia diana en una sonda de análisis
mediante hibridación con una sonda génica complementaria se
determina por la secuencia de reconocimiento y su estructura
química. Esta técnica se puede transferir al PNA. El PNA tiene al
contrario que los oligonucleótidos de estructura natural la ventaja
de presentar una mayor afinidad con la secuencia diana y una mayor
capacidad para la discriminación de
bases.
bases.
El uso de compuestos de fórmula I se refiere por
tanto también a la hibridación in situ e hibridación in
situ con fluorescencia (FISH). La hibridación in situ
puede servir, por ejemplo, también para la comprobación de
microorganismos y virus (Just y col., (1998) J. Vir. Method. 73, 163
a 174). Un uso más de los compuestos de acuerdo con la invención se
refiere a la comprobación y cuantificación de ácidos nucleicos. Para
este fin sirve preferiblemente también la técnica de matrices
(Strother y col., J. Am. Chem. Soc. (2000) 122, 1205 a 1209;
Niemeyer y col., Angew. Chem. (1999) 111, 3039 a 3043; Pirrung
(1997) Chem. Rev. 97, 473 a 488), que presenta un elevado caudal de
muestra y elevada sensibilidad. A este respecto se fijan las sondas
de PNA sobre un vehículo adecuado o chip de PNA. Para esto se puede
sintetizar PNA como se describe en los ejemplos y a continuación se
fijan sobre el vehículo o chip de PNA. De forma alternativa el PNA
se puede preparar directamente sobre el vehículo. Un uso más es el
uso de los compuestos de fórmula I como biosensores para la
detección de ácidos nucleicos (Wang y col. (1996) J. Am. Chem. Soc.
118, 7667). El uso de PNA de fórmula I con una marca de afinidad
como, por ejemplo, histidil-PNA, es un uso más para
la purificación de ácido nucleicos (Oerum y col. (1999), en Peptide
Nucleic Acids: Protocols and
Applications).
Applications).
La síntesis del esqueleto de PNA se realiza según
los procedimientos descritos en la bibliografía, por ejemplo, según
la estrategia de grupos protectores
terc-butiloxicarbonilo (BOC),
9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o
monometoxitritilo (Mmt) (Peptide Nucleic Acids: Protocols and
Applications; Peter E. Nielsen y Michael Egholm (editorial) Horizon
Scientific Press, 1999). Preferiblemente se usa el grupo protector
Mmt para la protección temporal de la función amino de la
aminoetilglicina y grupos protectores lábiles frente a bases en las
bases nucleicas heterocíclicas (D. Will y col. (1995) Tetrahedron
51, 12069; Breipohl y col. (1997) Tetrahedron 53, 14671 a 14686).
Ejemplos de constituyentes monoméricos son compuestos de fórmula V a
V B, en las que A, B, D, E, u' y U tienen el significado anterior.
PG es un grupo protector de amino como, por ejemplo, benzoílo,
anisoílo, isobutiroílo, acetilo, terc-butilbenzoílo
(Breipohl y col. (1997) Tetrahedron 53, 14671 a 14686). TR es un
grupo protector lábil frente a ácidos como dimetoxitritilo (Dmt)
(para U = O y S) o Mmt (para U = NH).
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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Tras la formación del esqueleto de PNA se puede
hacer reaccionar la función amino libre del término N directamente
con un reactivo de fosforilación correspondiente, por ejemplo, para
dar el fosforamidato correspondiente (U = NR_{1} en la fórmula
I).
De esta forma se obtuvo, por ejemplo, el
PNA-7 en el ejemplo 8 (U = NH) mediante reacción del
término N (en el constituyente acoplado en último lugar con B =
adenina) con la biotin-fosforamidita 5 (figura 4b).
De forma alternativa se puede acoplar en el último ciclo un
constituyente de hidroxialquilo protegido con Dmt (para U = O) o
mercaptoalquilo protegido con Dmt (para U = S) de fórmula V A. Tras
escisión del grupo Dmt se puede hacer reaccionar la función hidroxi
o mercapto libre, por ejemplo, con el reactivo de fosforilación 1
(figura 4a). Tras oxidación, escisión del vehículo y separación de
los grupos protectores se obtiene el fosfato (V = W = X = Y = O) y/o
tiofosfato (V = S, W = X = Y = O) de fórmula I. La unidad
aminoterminal no debe comprender base nucleica alguna (B igual a
hidrógeno), de modo que se usa el constituyente según fórmula V B en
la reacción de condensación del último ciclo, con lo que el grupo
protector Fmoc se escinde al final de la síntesis con amoniaco. El
término amino del PNA se puede alargar mediante condensación de
constituyentes de fórmula V C antes de que se lleve a cabo la
reacción de fosforilación propiamente.
Los restos fosforilo se pueden incorporar con
ayuda de reactivos usados normalmente en la química de los
nucleótidos, por ejemplo, mediante el procedimiento de la
fosforamidita, el procedimiento del H-fosfonato o el
procedimiento del fosfotriéster (E. Sonveaux (1986) Bioorganic
Chemistry 14, 274; S. L. Beaucage y R. P. Lyer (1993) Tetrahedron
49, 1925; E. Uhlmann y A. Peyman (1990) Chem. Rev. 90, 543). Son
múltiples reactivos de fosforilación (Glen Research Corporation,
Sterling, VA 20164, Estados Unidos) susceptibles de poder
involucrarse para la preparación de los compuestos de fórmula I. Se
muestra una elección de los reactivos en las figuras 4a a 4d, en las
que sin embargo la invención no se limita a estos derivados
especiales. En la reacción de fosforilación descrita anteriormente Z
puede tener también el significado de X, con lo que las funciones
reactivas están protegidas intermediariamente con grupos protectores
adecuados.
Como la modificación aminoterminal es de diversas
maneras, se puede aclarar en función de la síntesis de
PNA-6, PNA-12,
PNA-13 y PNA-14. En primer lugar se
forma el PNA t(oeg)-at tcc gtc
at-hex-CPG (las bases de PNA están
abreviadas mediante letras minúsculas para la bases nucleicas
correspondientes; oeg representa hidroxietilglicina) en la forma
completamente protegida en el vehículo CPG (vidrio de poro
controlado), que porta como último constituyente una
hidroxietilglicin-(oeg)-acetiltimina. El grupo
hidroxi se puede hacer reaccionar individualmente con las
fosforamiditas 1, 5, 7 y/o 3. Tras oxidación, escisión de los grupos
protectores y escisión del producto del vehículo CPG se obtiene
PNA-6, PNA-12,
PNA-13 y/o PNA-14
correspondientemente. Como vehículos sólidos se usan además
®TentaGel (compañía Rapp Polymers GmbH, Tübingen) y
aminometilpoliestirenos).
Para la incorporación de la función de fosforilo
se consideran en principio todos los reactivos conocidos de la
química de los nucleótidos, pero especialmente los siguientes
reactivos de fórmula VI A, fórmula VI B, fórmula VI C y fórmula VI
D
en las que K es igual a halógeno,
preferiblemente Cl, triazolilo, imidazolilo o dialquilamino y Z
tiene el significado mencionado anteriormente o el significado de X,
con lo que los grupos reactivos están protegidos
correspondientemente. Por ejemplo, los grupos hidroxi de la
fluoresceín-fosforamidita 3 (figura 4a) están
protegidos mediante esterificación con ácido
piválico.
Los compuestos de fórmula VI se han de ver sólo
como ejemplos de tales reactivos, que dado el caso reaccionan con
adición de otros reactivos coadyuvantes como bases, ácidos o
reactivos de condensación. Son especialmente preferidos los
reactivos de fórmula VI A, que reaccionan según el procedimiento de
la fosforamidita (Beaucage y Lyer, 1993). Estos se hacen reaccionar
como compuesto de fósforo (III) y a continuación se oxidan. Si la
oxidación se lleva a cabo, por ejemplo, con yodo/agua/piridina o
terc-butilhidroperóxido, se obtiene el derivado de
fosforilo (W = O). Si por el contrario se realiza la oxidación con
reactivo de azufre elemental o de Beaucage, se obtiene el compuesto
de tiofosforilo correspondiente (W = S).
Entre los reactivos (figuras 4a y 4d) se
encuentran también los "reactivos bifuncionales", basados en
una segunda función, la cual está protegida previamente, que se
pueden hacer reaccionar varias veces. Ejemplos de tales reactivos
bifuncionales son las fosforamiditas 4, 6, 8 a 13. A este respecto
se puede tratar de la conjugación múltiple de un reactivo o bien de
una reacción sucesiva con distintos reactivos. De esta forma se
puede hacer reaccionar, por ejemplo, la
fluoresceín-fosforamidita 3 sólo una vez. Por el
contrario la fluoresceín-fosforamidita 4 posee una
función hidroxi protegida con un grupo Dmt, que tras escisión del
grupo Dmt se puede hacer reaccionar de nuevo con un reactivo de
fosforilación. De esta forma se pueden incorporar uno y el mismo
grupo o bien grupos distintos varias veces. El
PNA-16 es un ejemplo típico de una conjugación
múltiple. Tras formación de la cadena de PNA se acopló en el último
ciclo un constituyente hidroxietilglicin-C, que se
hizo reaccionar sucesivamente dos veces con el
espaciador-18 fosforamidita 9, la
aminomodificador-5 fosforamidita 12 y a continuación
con lexitropsina de fórmula VII en activación con reactivos de
acoplamiento de péptido, como HBTU. El acoplamiento de un
aminomodificador permite la incorporación subsiguiente de otro
resto, que es admisible en forma de un derivado de ácido carboxílico
activado. En esto se pueden usar, por ejemplo, también
isotiocianatos y ésteres de
N-hidroxisuccinimida.
\vskip1.000000\baselineskip
En la figura 5a y 5b se muestran algunos ejemplos
de tipos de compuesto para la modificación
N-terminal de los compuestos de fórmula I. El tipo
de compuesto A se obtiene mediante reacción del grupo hidroxi
terminal del PNA con el reactivo de fosforilación 1. El tipo de
compuesto B se obtiene mediante reacción del grupo amino terminal
del PNA con la biotin-fosforamidita 5. El tipo de
compuesto C se obtiene mediante reacción sucesiva del PNA con un
grupo hidroxi terminal con la espaciador-18
fosforamidita 9, aminomodificador-5 fosforamidita 12
y lexitropsina. El tipo de compuesto D se obtiene mediante reacción
sucesiva del PNA con un grupo hidroxi terminal con la
espaciador-9 fosforamidita 8 y la
cianin-3 fosforamidita 10. El tipo de compuesto E se
obtiene mediante reacción sucesiva del PNA con un grupo hidroxi
terminal con la fluoresceín-fosforamidita 4
bifuncional, la espaciador-9 fosforamidita 8 y el
reactivo de fosforilación 7 de C16. El tipo de compuesto F se
obtiene mediante reacción del grupo amino terminal del PNA con ácido
4-hidroxibutírico, cuya función hidroxi intermedia
está protegida por un grupo Dmt, y a continuación reacción con la
fluoresceín-fosforamidita 3. Las etapas adicionales
a llevar a cabo, como oxidación y escisión de grupos protectores se
describen en los ejemplos.
La preparación de los siguientes compuestos se
describe a modo de ejemplo:
PNA-1 a
PNA-6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
PNA-7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
PNA-8 a
PNA-12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
PNA-13:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
PNA-14:
\vskip1.000000\baselineskip
PNA-15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
PNA-16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
PNA-17:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
PNA-18:
\vskip1.000000\baselineskip
en las que el orden de sucesión de
bases se describe respectivamente mediante las siguientes
secuencias,
y en las que {POLI} se describe con
la fórmula II, {BLOQUE} se describe respectivamente con la fórmula
IIIA, y en las que además A y E son iguales a CH_{2} y D es igual
a (CH_{2})_{2}, y z' resulta respectivamente de la
longitud de secuencia del
oligómero.
Para la preparación de la parte del PNA se usaron
los siguientes reactivos:
- 1.
- Reactivo de fosforamidita (0,1 M en acetonitrilo (ACN))
- 2.
- Monómeros de Mmt-PNA y/o monómeros de Dmt-oeg-PNA (0,2 M en DMF:ACN (1:1; en relación v/v)
- 3.
- ACN exento de agua (\leq 30 ppm de agua)
- 4.
- Ácido tricloroacético (al 3%) en diclorometano (DCM)
- 5.
- Acetanhidruro 2,6-lutidina en THF (1:1:8; en relación v:v:v); (Cap A)
- 6.
- N-metilimidazol (16%) en THF; (Cap B)
- 7.
- Solución de yodo (0,05 M) en THF, agua, piridina (7:2:1; en relación v:v:v)
- 8.
- Solución de lavado (THF, agua, piridina (7:2:1; en relación v:v:v))
- 9.
- Tetrazol (0,3 M) en ACN
- 10.
- HBTU; 0,2 M en DMF:ACN (1:1; en relación v:v)
- 11.
- DIPEA; 0,2 M en DMF:ACN (1:1; en relación v:v)
- 12.
- DMF (> 99,5%)
- 13.
- Vehículo de fase sólida: aminopropil-CPG (550 \ring{A}) cargado con hemisuccinato de Mmt-Aminohex-1-ilo (para PNA-hexilamida).
Los monómeros de oeg protegidos en acilo con Mmt
o en acilo con Dmt se prepararon como ya se describió (Breipohl y
col. (1997) Tetrahedron 53, 14671 a 14686). La carga de
aminopropil-CPG con el hemisuccinato de
Mmt-aminohex-1-ilo
ya se describió igualmente (Will y col. (1995) Tetrahedron 51, 12069
a 12082). Las síntesis de PNA se llevaron a cabo en general a escala
de 2 a 5 \mumol.
Se usó el siguiente ciclo para la síntesis de
PNA:
- 1.
- Etapa de lavado con ACN
- 2.
- Desprotección del grupo Mmt y/o del grupo Dmt mediante tratamiento con TCA al 3% en DCM; 110 segundos.
- 3.
- Etapa de lavado con DMF/ACN (1:1)
- 4.
- Neutralización con DIPEA en DMF/ACN (1:1)
- 5.
- Acoplamiento del constituyente monomérico mediante activación previa (15 minutos) con monómero de HBTU/DIPEA/PNA (relación 1:1:1; volumen total de 450 \mul) carga de la fase sólida y acoplamiento (45 minutos)
- 6.
- Etapa de lavado con ACN.
- 7.
- Cubrimiento con acetanhidruro/N-metilimidazol.
- 8.
- Etapa de lavado con ACN.
- 9.
- Ciclo de nuevo.
La parte del PNA se prepara como se describe en
el ejemplo 1 mediante síntesis en fase sólida (síntesis de 2
\mumol). En el último ciclo se acopla un constituyente basado en
hidroxietilglicina (oeg) con adenina como base nucleica (fórmula V
A; en la que TR es igual a Dmt, U igual a oxígeno, u' igual a 2, PG
igual a anisoílo y B igual a adenina). Tras escisión del grupo Dmt
terminal con TCA al 3% se hace reaccionar la función hidroxi libre
con el reactivo de fosforilación 1 (figura 4a) con catálisis con
tetrazol. A este respecto se usan el reactivo de fosforilación 1 en
exceso (aproximadamente 25 veces) como solución 0,3 M en
acetonitrilo/tetrahidrofurano (1:1; en relación v:v) y el tetrazol
(aproximadamente 50 veces; 0,5 M en acetonitrilo). Una vez
finalizada la condensación se oxida con una solución de yodo (0,05 M
en tetrahidrofurano/agua, piridina (7:2:1; v:v:v)). Luego se escinde
el PNA del vehículo mediante tratamiento con amoniaco concentrado a
50ºC durante la noche y simultáneamente se eliminan los grupos
protectores. Se obtiene DO de 83 (260 nm). De esto se purifican 40
DO mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAA)
preparativa. Se eluye la banda de producto deseada con tampón de
bicarbonato de trietilamonio 0,2 M y se desalifica con una columna
Bond-Elut C18 (1 g). Se obtiene DO de 13,5. Se
analizó el producto mediante espectrometría de masas de iones
negativos, que confirmó la masa calculada (calculado 1266,2;
obtenido 1265,9).
La preparación se realiza de forma análoga a como
se describe en el ejemplo 2 en una síntesis de 2 \mumol. Tras la
escisión con amoniaco se obtiene DO de 122 de producto bruto, que se
purifica en un gel de PAA al 15% mediante electroforesis. Se obtiene
DO de 27. El producto se analizó mediante espectrometría de masas de
iones negativos, que confirmó la masa calculada (calculado 3450,3;
obtenido 3450,4).
La preparación se realiza de forma análoga a como
se describe en el ejemplo 2 en una síntesis de 2 \mumol, en donde
en el último ciclo se acopla un constituyente basado en
hidroxietilglicina con citosina como base de nucleica. Tras la
escisión con amoniaco se obtiene DO de 124 de producto bruto, que se
purifica en un gel de PAA al 15% mediante electroforesis. Se obtiene
DO de 19. El producto se analizó mediante espectrometría de masas de
iones negativos, que confirmó la masa calculada (calculado 3450,3;
obtenido 3450,1).
La preparación se realiza de forma análoga a como
se describe en el ejemplo 2 en una síntesis de 2 \mumol, en donde
en el último ciclo se acopla un constituyente basado en
hidroxietilglicina con guanina como base nucleica. Tras la escisión
con amoniaco se obtiene DO de 120 de producto bruto. Se purificaron
las 60 DO del producto bruto en un gel de PAA al 15% mediante
electroforesis. Se obtiene DO de 10. El producto se analizó mediante
espectrometría de masas de iones negativos, que confirmó la masa
calculada (calculado 4848,6; obtenido 4849,9).
La preparación se realiza de forma análoga a como
se describe en el ejemplo 2 en una síntesis de 2 \mumol, en donde
en el último ciclo se acopla un constituyente basado en
hidroxietilglicina con timina como base nucleica. Tras la escisión
con amoniaco se obtiene DO de 250 de producto bruto. Se purificaron
60 DO del producto bruto en un gel de PAA al 15% mediante
electroforesis. Se obtiene DO de 22,9. El producto se analizó
mediante espectrometría de masas de iones negativos, que confirmó la
masa calculada (calculado 4595,4; obtenido 4596,3).
La preparación se realiza de forma análoga a como
se describe en el ejemplo 2 en una síntesis de 0,5 \mumol, en
donde en el último ciclo se acopla un constituyente basado en
hidroxietilglicina con timina como base nucleica. Tras la escisión
con amoniaco se obtiene DO de 63 de producto bruto. Se purificaron
30 DO del producto bruto en un gel de PAA al 15% mediante
electroforesis. Se obtiene DO de 4,2. El producto se analizó
mediante espectrometría de masas de iones negativos, que confirmó la
masa calculada (calculado 3124,5; obtenido 3124,8).
La parte de PNA se prepara como se describe en el
ejemplo 1 mediante síntesis en fase sólida (síntesis de 2 \mumol).
En el último ciclo se acopla un constituyente de PNA normal con
adenina como base nucleica (fórmula V A, en la que TR es igual a
Mmt, U igual a NH, u' igual a 2, PG igual a anisoílo y B es igual a
adenina). Tras escisión del grupo Mmt terminal con TCA al 3% se hace
reaccionar la función amino libre con la
biotin-fosforamidita 5 (figura 4b) con catálisis con
tetrazol. A este respecto se usan el reactivo de fosforilación en
exceso (aproximadamente 10 veces) como solución 0,12 M en
acetonitrilo y el tetrazol (aproximadamente 50 veces; 0,5 M en
acetonitrilo). Una vez finalizada la condensación se oxida con una
solución de yodo (0,05 M en tetrahidrofurano/agua, piridina (7:2:1;
en relación v:v:v)). Tras la escisión con amoniaco se obtiene DO de
288 de producto bruto. El producto bruto se purificó en un gel de
PAA al 15% mediante electroforesis. Se obtiene DO de 17,5. El
producto se analizó mediante espectrometría de masas de iones
negativos, que confirmó la masa calculada (calculado 3789,6;
obtenido 3789,8).
La parte de PNA se prepara como se describe en el
ejemplo 1 mediante síntesis en fase sólida (síntesis de 1 \mumol).
En el último ciclo se acopla un constituyente basado en
hidroxietilglicina con guanina como base nucleica (fórmula V A, en
la que TR es igual a Dmt, U igual a oxígeno, u' igual a 2, PG igual
a anisoílo y B igual a guanina). Tras escisión del grupo Dmt
terminal con TCA al 3% se hace reaccionar la función hidroxi libre
con la biotin-fosforamidita 5 (figura 4b) con
catálisis con tetrazol. A este respecto se usan el reactivo de
fosforilación en exceso (aproximadamente 10 veces) como solución
0,12 M en acetonitrilo y el tetrazol (aproximadamente 50 veces; 0,5
M en acetonitrilo). Una vez finalizada la condensación se oxida con
una solución de yodo (0,05 M en tetrahidrofurano/agua, piridina
(7:2:1, en relación v:v:v)). Tras la escisión con amoniaco se
obtiene DO de 63 de producto bruto. El producto bruto se purificó en
un gel de PAA al 15% mediante electroforesis. Se obtiene DO de 11,2.
El producto se analizó mediante espectrometría de masas de iones
negativos, que confirmó la masa calculada (calculado 3806,8;
obtenido 3807,2).
La preparación se realizó de forma análoga a como
se describe en el ejemplo 9 en una síntesis de 2 \mumol, en donde
en el último ciclo se acopla un constituyente basado en
hidroxietilglicina con guanina como base nucleica. El resto de
biotina se incorporó con la biotin-fosforamidita 5
(figura 4b). Tras la escisión con amoniaco se obtiene DO de 274 de
producto bruto. Se purificó el producto bruto en un gel de PAA al
15% mediante electroforesis. Se obtiene Do de 25,8. El producto se
analizó mediante espectrometría de masas de iones negativos, que
confirmó la masa calculada (calculado 3870,8; obtenido 3869,7).
La preparación se realizó de forma análoga a como
se describe en el ejemplo 9 en una síntesis de 2 \mumol, en donde
en el último ciclo se acopla un constituyente basado en
hidroxietilglicina con timina como base nucleica. El resto de
biotina se incorporó con la biotin-fosforamidita 5
(figura 4b). Tras la escisión con amoniaco se obtiene DO de 190 de
producto bruto. Se purificó el producto bruto en un gel de PAA al
12% mediante electroforesis. Se obtiene DO de 29 con el peso
molecular esperado (calculado 3913,9; obtenido 3913,7).
La preparación se realizó de forma análoga a como
se describe en el ejemplo 9 en una síntesis de 2 \mumol, en donde
en el último ciclo se acopla un constituyente basado en
hidroxietilglicina con guanina como base nucleica. El resto de
biotina se incorporó con la biotin-fosforamidita 5
(figura 4b). Tras la escisión con amoniaco se obtiene DO de 162 de
producto bruto. Se purificó el producto bruto en un gel de PAA al
15% mediante electroforesis. Se obtiene DO de 21. El producto se
analizó mediante espectrometría de masas de iones negativos, que
confirmó la masa calculada (calculado 3870,8; obtenido 3870,8).
La preparación se realizó de forma análoga a como
se describe en el ejemplo 9 en una síntesis de 0,5 \mumol, en
donde en el último ciclo se acopla un constituyente basado en
hidroxietilglicina con timina como base nucleica. El resto de
biotina se incorporó con la biotin-fosforamidita 5
(figura 4b). Tras la escisión con amoniaco se obtiene DO de 67 de
producto bruto. Se purificó el producto bruto en un gel de PAA al
12% mediante electroforesis. Se obtiene DO de 8,5. El producto se
analizó mediante espectrometría de masas de iones negativos, que
confirmó la masa calculada (calculado 3449,5; obtenido 3449,9).
La preparación se realizó de forma análoga a como
se describe en el ejemplo 9 en una síntesis de 0,5 \mumol, en
donde en el último ciclo se acopla un constituyente basado en
hidroxietilglicina con timina como base nucleica. El resto de
hexadecilo se incorporó con el reactivo de
C16-fosforilación 7 (figura 4c). Tras la escisión
con amoniaco se obtiene DO de 58 de producto bruto. Se purificó el
producto bruto (DO de 30) en un gel de PAA al 12% mediante
electroforesis. Se obtiene DO de 2 con el peso molecular esperado
(calculado 3349,4; obtenido 3349,7).
La preparación se realizó de forma análoga a como
se describe en el ejemplo 9 en una síntesis de 0,5 \mumol, en
donde en el último ciclo se acopla un constituyente basado en
hidroxietilglicina con timina como base nucleica. El resto de
fluoresceína se incorporó con la
fluoresceín-fosforamidita 3 (figura 4a). Tras la
escisión con amoniaco se obtiene DO de 62 de producto bruto. Se
purificó el producto bruto (DO de 30) en un gel de PAA al 12%
mediante electroforesis. Se obtiene DO de 4,2. El producto se
analizó mediante espectrometría de masas de iones negativos, que
confirmó la masa calculada (calculado 3581,5; obtenido 3582,4).
La preparación se realizó de forma análoga a como
se describe en el ejemplo 9 en una síntesis de 1 \mumol, en donde
en el último ciclo se acopla un constituyente basado en
hidroxietilglicina con timina como base nucleica. El
espaciador-9 se incorporó con la fosforamidita 8
correspondiente (figura 4c). Tras la escisión con amoniaco se
obtiene DO de 52 de producto bruto. Se purificó el producto bruto
(DO de 30) en un gel de PAA al 15% mediante electroforesis. Se
obtiene DO de 1,8. El producto se analizó mediante espectrometría de
masas de iones negativos, que confirmó la masa calculada (calculado
3402,3; obtenido 3401,8).
La preparación se realizó de forma análoga a como
se describe en el ejemplo 9 en una síntesis de 1 \mumol, en donde
en el último ciclo se acopla un constituyente basado en
hidroxietilglicina con citosina como base nucleica. Luego se
condensan sucesivamente dos veces el espaciador-18
fosforamidita 9 y una vez el aminomodificador-5
fosforamidita 12 (figura 4d). Tras las reacciones de acoplamiento se
escindieron el grupo Dmt o Mmt respectivamente mediante tratamiento
con ácido tricloroacético al 3%. Para el acoplamiento de la
lexitropsina se añaden 300 \mul del éster activo correspondiente y
se deja reaccionar durante 3 horas (preparado a partir de ácido
lexitropsincarboxílico 0,1 M, TBTU 0,1 M y diisopropiletilamina 0,4
M; 1:1:1 en relación v:v:v; preactivación de 30 minutos). Luego se
lava con DMF. Tras la escisión con amoniaco se obtiene DO de 43 de
producto bruto. Se purificó el producto bruto (DO de 35) en un gel
de PAA al 15% mediante electroforesis. Se obtiene DO de 5,3. El
producto se analizó mediante espectrometría de masas de iones
negativos, que confirmó la masa calculada (calculado 3583,5;
obtenido 3583,1).
La determinación de las temperaturas de fusión se
realizó con ayuda de un espectrofotómetro de ordenación de diodos HP
8452A, un elemento Peltier HP 89090A y el software de control de
temperatura HP revisión B5.1 (compañía Hewlett Packard). Se mide a
etapas de 0,5ºC/minuto en KCl 140 mM, hidrogenofosfato de sodio 10
mM, EDTA 0,1 mM (pH 7,4) como tampón. La concentración de oligómero
alcanza DO_{260} de 0,5 a 1 por ml.
De forma sorprendente los derivados de
PNA-6, PNA-12 a
PNA-14 modificados con fosforilo mostraron una unión
más elevada frente a ADN y ARN complementarios que el PNA no cargado
(sustancia de referencia).
| Derivado de PNA | T_{m} (ADN) | T_{m} (ARN) | |
| Referencia | Ac-HN-tat tcc gtc at-hex | 41,9ºC | 56,6ºC |
| PNA-6 | p-{t(oeg)-at tcc gtc at}-hex | 44,0ºC | 57,5ºC |
| PNA-13 | Hexadecil-O-p-{t(oeg) at tcc gtc at}-hex | 46,7ºC | 58,9ºC |
| PNA-14 | Fluoresceín-p-{t(oeg) at tcc gtc at}-hex | 42,5ºC | 56,7ºC |
| PNA-12 | Biotin-p-{t(oeg) at tcc gtc at}-hex | 43,6ºC | 57,9ºC |
Se dejan crecer las células de COS en cápsulas de
Petri de 5 cm hasta la confluencia en medio MEM de Dulbecco (DMEM),
que se suplementó con FCS (suero bovino fetal) al 10%. Se lavan las
células dos veces con medio DMEM libre de suero. Con ayuda de una
aguja estéril se rasca una superficie de aproximadamente 1 cm^{2}
a la mitad de la cápsula de Petri. En esta superficie se incorpora
la solución de PNA que se va a estudiar (10 \muM). Se incuba a
37ºC en atmósfera de CO_{2}. Después de 2, 4 y 16 horas se
estudian las células mediante microscopía de fluorescencia. Para
este fin se lavan las células cuatro veces con DMEM libre de suero,
se cubren con un porta de vidrio y se valoran en el microscopio
electrónico y/o por contraste de fases.
Para el estudio de la captación celular se
marcaron PNA-6 y PNA-13 en el
término C con fluoresceína y se estudiaron microscópicamente.
p-{t(oeg)-at tcc gtc
at}-fluoresceína
Hexadecil-O-p-{t(oeg)
at tcc gtc at}-fluoresceína
A este respecto se demuestra que el derivado de
hexadecil-PNA (PNA-13) se captó de
forma más eficiente en las células.
La secuencia de PNA-13 se dirige
contra el comienzo de translación del ARNm Ha-ras.
Las células REH (células de leucemia pre-B humanas,
DSM ACC 22) o células tumorales A549 se cultivaron en OptiMEM (Gibco
BRL) con suero bovino fetal al 10% (FCS, GIBCO-BRL)
a 37ºC en CO_{2} al 5%. La densidad de células para el ensayo era
aproximadamente 1 x 106 / ml). El PNA-13 (10 \muM)
se incubó con las células en placas de 24 pocillos. Tras 96 de
incubación a 37ºC en CO_{2} al 5% se determinó la densidad de
células. Se determinaron valores medios de la densidad de células a
partir de 3 huecos individuales de una concentración de PNA. Se
demostró que el PNA-13 inhibe la proliferación de
células REH. Tras > 4 días de tiempo de incubación la inhibición
por PNA-13 es más fuerte que por un oligonucleótido
fosforotioato correspondiente.
La preparación se realizó de forma análoga a como
se describe en los ejemplos 9 y 16 en una síntesis de 0,67 \mumol,
en donde en el último ciclo de la síntesis de PNA se acopla un
constituyente de 2-amino-etilglicina
normal con timina como base nucleica. A continuación se incorporó el
espaciador-9 con la fosforamidita 8 correspondiente
(figura 4c) (tiempo de retención 3 x 5 minutos). Tras la escisión
con amoniaco se obtiene DO de 108 de producto bruto. Se purificó el
producto bruto en un gel de PAA al 15% mediante electroforesis. Se
obtiene DO de 5,7. El producto se analizó mediante espectrometría de
masas de iones negativos, que confirmó la masa calculada (calculado
3401,3; obtenido 3399,8).
La preparación se realiza de forma análoga a como
se describe en los ejemplos 2 y 7 en una síntesis de 1 \mumol, en
donde en el último ciclo se acopla un constituyente basado en
hidroxietilglicina con timina como base nucleica. Tras la escisión
del grupo Dmt terminal con TCA al 3% se hace reaccionar la función
hidroxi libre con el reactivo de fosforilación 1 (figura 4a) con
catálisis con tetrazol. Una vez realizada la condensación se oxida
para la incorporación de la función tio con el reactivo de Beaucage
(0,075 M
3H-1,3-benzoditiol-3-ona,
1,1-dióxido en acetonitrilo). Tras la escisión con
amoniaco se obtiene DO de 66,5 de producto bruto. Se purificaron 61
DO del producto bruto en un gel de PAA al 15% mediante
electroforesis. Se obtiene DO de 12,4. El producto se analizó
mediante espectrometría de masas de iones negativos, que confirmó la
masa calculada (calculado 3141; obtenido 3140).
- ACN
- acetonitrilo
- ADN
- ácido desoxirribonucleico
- ARN
- ácido ribonucleico
- BOC
- terc-butiloxicarbonilo
- C, c
- pseudo-iso-citosina
- COS
- CV1 Origin SV 40
- CPG
- vidrio de poro controlado
- DCM
- diclorometano
- DIPEA
- diisopropiletilamina
- DMEM
- MEM de Dulbecco
- DMF
- dimetilformamida
- Dmt
- dimetoxitritilo
- DNP
- dinitroarilo
- DO
- densidad óptica
- FITC
- isotiocianato de fluoresceína
- Fmoc
- Fluorenilmetoxicarbonilo
- HATU
- hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetametiluronio
- HBTU
- hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
- hex
- -NH-(CH_{2})_{6}-OH
- MEM
- medio esencial mínimo de Eagle modificado
- Mmt
- monometoxitritilo
- oeg
- N-(2-hidroxietil)glicina
- PAA
- poliacrilamida
- PG
- grupo protector
- PNA
- ácido poliamidanucleico
- TBTU
- tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
- TCA
- ácido tricloroacético
- THF
- tetrahidrofurano
- TR
- grupo protector lábil frente a ácidos
Las figuras 1a, 1b, 2b y 3b muestran ejemplos
para los restos terminales Z.
Las figuras 2a y 3a muestran ejemplos de restos X
que hacen de puente.
Las figuras 4a, 4b, 4c y 4d muestran ejemplos de
reactivos de fosforilación.
Las figuras 5a y 5b muestran ejemplos de
derivatización N-terminal simple (A, B) y múltiple
(C a F) de PNA.
<110> Aventis Pharma Deutschland GmbH
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<120> Derivados de ácido poliamidonucleico,
agentes y procedimientos para su preparación
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<130> D-2000/A022
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<140> 10019136.3 - 43
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<141>
2000-04-18
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<160> 64
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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artificial: Oligonucleótidos
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artificial: Oligonucleótidos
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artificial: Oligonucleótidos
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artificial: Oligonucleótidos
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artificial: Oligonucleótidos
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artificial: Oligonucleótidos
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<212> ADN
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artificial: Oligonucleótidos
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<213> Secuencia artificial
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artificial: Oligonucleótidos
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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artificial: Oligonucleótidos
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótidos
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_unión
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótidos
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<220>
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<221> misc_unión
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótidos
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<220>
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<221> misc_unión
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótido
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<221> misc_unión
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<222> (1)..(15)
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<212> ADN
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótidos
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\hskip-.1em\dddseqskipgtcttccata gttactca
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligonucleótidos
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_unión
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcaggcgt gcctcaaa
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
Claims (35)
1. Derivado de PNA de fórmula I
en la
que
- V
- es igual a oxígeno, azufre, NR_{1}, un grupo U-(CH_{3}R_{4})_{u}-CH_{2}-C(O)-NH o un grupo U-(CH_{2}CH_{2}O)_{u'}-C(O)-NH,
- U
- independientemente uno de otro es igual a oxígeno, azufre o NH,
- u'
- independientemente uno de otro es de 1 a 10, preferiblemente de 1 a 4, con especial preferencia 1,
- W
- independientemente uno de otro es igual a oxígeno, azufre, o NR_{1},
- Y
- independientemente uno de otro es igual a hidroxi, mercapto, oxianión, tioato o NR_{1}R_{2},
R_{1} y R_{2}
independientemente uno de otro es un resto compuesto por hidrógeno,
o alquilo C_{1}-C_{6}, preferiblemente
hidrógeno,
R_{3} y R_{4}
independientemente uno de otro significan un resto compuesto por
hidrógeno o alquilo C_{1}-C_{6} o un resto de
una cadena lateral de aminoácido, preferiblemente
hidrógeno,
- X
- independientemente uno de otro es igual a un grupo U-(alcandiil C_{2}-C_{22})-U o un grupo U-(CH_{2}CH_{2}-O)_{u'},
- \quad
- o X es igual a un grupo marcador bifuncional, preferiblemente del grupo de derivados de fluoresceína, rodamina, TAMRA, biotina, pireno, dinitrofenilo, acridina, colorante de cianina, dabcilo, digoxigenina o edano, con especial preferencia un derivado de biotina,
- \quad
- o X es igual a un grupo bifuncional para la reticulación transversal con ácidos nucleicos complementarios, preferiblemente un derivado de psoraleno,
- \quad
- o X es igual a un grupo bifuncional, que favorece la captación intracelular, preferiblemente del grupo de derivados de colesterilo, adamantilo y vitamina E,
- \quad
- o X es igual a un grupo bifuncional, que aumenta la afinidad de unión del derivado de PNA en un ácido nucleico diana, preferiblemente derivados de acridina y lexitropsina,
- Z
- es igual a hidroxi, mercapto, oxianión, tioato o NR_{1}R_{2}, alquilo C_{1}-C_{22}, arilalquilo C_{1}-C_{8}, alquil C_{1}-C_{22}-U, aril C_{1}-C_{8}-alquil-U, hidroxi C_{1}-C_{18}-U, aminoalquil-U, arilalquil-U, mercaptoalquil-U,
- \quad
- o es un grupo de fórmula R_{9}(CH_{2}CH_{2}-O)_{m}, en el que R_{9} es igual a hidroxi, amino o alcoxi C_{1}-C_{22}, y m es de 1 a 100, preferiblemente de 2 a 10,
- \quad
- o Z es igual a un grupo marcador monofuncional o bifuncional, preferiblemente del grupo de derivados de fluoresceína, rodamina, TAMRA, biotina, pireno, dinitrofenilo, acridina, colorante de cianina, dabcilo, digoxigenina o edano, con especial preferencia un derivado de biotina,
- \quad
- o Z es igual a un grupo de reticulación transversal monofuncional o bifuncional, preferiblemente un derivado de psoraleno,
- \quad
- o Z es igual a un grupo monofuncional o bifuncional, que favorece la captación intracelular, preferiblemente del grupo de los derivados de colesterilo, adamantilo y vitamina E.
- \quad
- o Z es igual a un grupo monofuncional o bifuncional, que aumenta la afinidad de unión del derivado de PNA en un ácido nucleico diana, preferiblemente un derivado de lexitropsina,
- n
- es de 0 a 10, preferiblemente de 0 a 3,
- Q
- es igual a hidroxi, amino, NHR_{7}, NR_{7}R_{8}, derivado de aminoácido o un resto peptídico,
R_{7} y R_{8}
independientemente uno de otro son alquilo
C_{1}-C_{8} o hidroxialquilo
C_{1}-C_{8},
y en la que {POLI} se describe
mediante la fórmula
II
en la que {BLOQUE} se describe
independientemente uno de otro mediante la fórmula
IIIA,
o fórmula
IIIB,
o fórmulas IV A a IV
G,
\vskip1.000000\baselineskip
en las que cada constituyente
{BLOQUE} puede ser
distinto,
y en las que además es válido
que
- z'
- sea de 0 a 100, preferiblemente de 1 a 20, con especial preferencia de 4 a 15.
- A
- independientemente uno de otro es un grupo (CR_{1}R_{2})_{s}, en el que s es de 1 a 3, preferiblemente 1,
- B
- independientemente uno de otro es bien un resto aromático, que también puede poseer carácter heteoraromático, o bien hidrógeno, o hidroxi o alquilo C_{1}-C_{18},
- \quad
- o es una base nucleica de origen natural habitual en la química de los nucleótidos o de origen no natural o su forma de profármaco,
- \quad
- en la que al menos un resto B en la fórmula II es una base nucleica,
- D
- independientemente uno de otro es un grupo (CR_{3}R_{4})_{t}, en la que t es de 2 a 10, preferiblemente de 2 a 4, con especial preferencia 2,
- \quad
- en la que dos restos R_{3} y R_{4} próximos pueden formar también un anillo cicloalquilo C_{5}-C_{8},
- E
- independientemente uno de otro es un grupo (CR_{5}R_{6})_{u'}, en la que dos restos R_{5} y R_{6} próximos puede formar también un anillo cicloalquilo C_{5} a C_{8} o un compuesto espiro,
R_{5} y R_{6}
independientemente uno de otro son un resto compuesto por hidrógeno
o alquilo C_{1}-C_{6}, preferiblemente
hidrógeno, o son una cadena lateral de
aminoácido,
así como sales fisiológicamente
aceptables del derivado de PNA de fórmula I, con la condición de que
al menos un resto Y o Z sea igual a hidroxi, mercapto, oxianión o
tioato.
2. Derivado de PNA según la reivindicación 1, en
el que al menos un resto Y o Z en la fórmula I en un intervalo de pH
de 4,5 a 14, preferiblemente de 6,5 a 12, con especial preferencia
de 6,5 a 9, es igual a oxianión o tioato.
3. Derivado de PNA según una de las
reivindicaciones 1 a 2, en el que D es igual a
(CH_{2})_{2}.
4. Derivado de PNA según una de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que A y E son iguales a CH_{2}.
5. Derivado de PNA según una de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que Q es igual a un resto
hidroxiaminoalquilo, preferiblemente un resto hidroxiaminohexilo, o
es igual a una secuencia portadora, preferiblemente transportano,
factor de crecimiento tipo insulina, señales de localización nuclear
o es una marca de afinidad, preferiblemente una cadena
(His)_{6}.
6. Derivado de PNA según una de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que B es igual a adenina, citosina,
5-metilcitosina, guanina, timina y uracilo, o es
igual a purina, 2,6-diaminopurina,
N^{4}N^{4}-etanocitosina,
N^{6}N^{6}-etano-2,6-diaminopurina,
5-alquinil
(C_{3}-C_{6})-uracilo,
5-alquinil
(C_{3}-C_{6})-citosina,
5-(1-propargilamino)-uracilo,
5-(1-propargilamino)-citosina,
fenoxazina, 9-aminoetoxifenoxazina,
5-fluoro-uracilo o
pseudoisocitosina, 5-(hidroximetil)uracilo,
5-aminouracilo, pseudouracilo, dihidrouracilo,
5-alquil
(C_{1}-C_{6})-uracilo,
5-alquil
(C_{1}-C_{6})-citosina,
5-alquenil
(C_{2}-C_{6})-citosina,
5-fluorocitosina, 5-clorouracilo,
5-clorocitosina, 5-bromouracilo,
5-bromocitosina, 7-deazaadenina,
7-deazaguanina, 8-azapurina o una
purina
7-deaza-7-sustituida.
7. Derivado de PNA según una de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que W es igual a oxígeno e Y es igual
a hidroxi u oxianión.
8. Derivado de PNA según una de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que X es igual a un grupo U-(alcandiil
C_{2}-C_{22})-U, preferiblemente
O-(alcandiil C_{2}-C_{22})-O,
con especial preferencia
O-(CH_{2})_{2-6}-O, o es
igual a un grupo
U-(CH_{2}CH_{2}-O)_{u'},
preferiblemente
O-(CH_{2}CH_{2}-O)_{u'}, en la que u'
es preferiblemente de 1 a 6.
9. Derivado de PNA según una de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que Z es igual a fosfato o un resto
C_{1} a C_{22}, o un resto
C_{1}-C_{22}-U, preferiblemente
un resto alcoxi C_{1}-C_{22}, con especial
preferencia alcoxi C_{16}, o hidroxi
C_{1}-C_{18}-U, preferiblemente
hidroxi-C_{1}-C_{18}-O
con especial preferencia
HO(CH_{2})_{3-12}O, o un resto
aminoalquil-U, preferiblemente un resto aminoalcoxi,
con especial preferencia 6-aminohexoxi y
5-aminopentoxi, o un grupo de fórmula
R_{9}(CH_{2}CH_{2}-O)_{m}, en
la que R_{9} es preferiblemente OH o NH_{2} y m es de 1 a 6, con
especial preferencia
HO(CH_{2}CH_{2}-O)_{2},
HO(CH_{2}CH_{2}-O)_{6} y
H_{2}N-(CH_{2}CH_{2}-O)_{2}, o un
resto mercaptoalquilo-U, preferiblemente un resto
mercaptoalcoxi, con especial preferencia
6-mercaptohexiloxi.
10. Derivado de PNA según la reivindicación 1 a
7, en el que X y Z se seleccionan independientemente uno de otro del
grupo de derivado de biotina, fluoresceína o lexitropsina.
11. Derivado de PNA según una de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que X y Z se seleccionan
independientemente uno de otro del grupo de rodamina, TAMRA o
colorante de cianina.
12. Derivado de PNA según una de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que X y Z se seleccionan
independientemente uno de otro del grupo de dabcilo, psoraleno,
acridina, DNP o colesterol.
13. Derivado de PNA según una de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que la secuencia de bases se dirigen
contra partes de genes supresores tumorales, oncogenes o telomerasas
o sus productos de transcripción.
14. Derivado de PNA según la reivindicación 13,
en el que la secuencia de bases de la parte del PNA se dirige contra
el comienzo de la translación de ARNm de HA-ras.
15. Derivado de PNA según una de las
reivindicaciones 1 a 14 para uso como medicamento.
16. Uso de un derivado de PNA según una de las
reivindicaciones 1 a 14 para la preparación de un medicamento para
la terapia de tumores.
17. Derivado de PNA según una de las
reivindicaciones 1 a 14 para uso como diagnóstico.
18. Uso de un derivado de PNA según una de las
reivindicaciones 1 a 14 para la comprobación de microorganismos y/o
virus in vitro.
19. Uso de un derivado de PNA según una de las
reivindicaciones 1 a 14 para la comprobación y/o cuantificación de
ácidos nucleicos in vitro.
20. Uso de un derivado de PNA según una de las
reivindicaciones 1 a 14 como reactivo de comprobación para la
hibridación in situ o in situ con fluorescencia in
vitro.
21. Uso de un derivado de PNA según una de las
reivindicaciones 1 a 14 como agente antisentido, antigénico, Decoy o
quimeroplástico in vitro.
22. Reactivo de comprobación que contiene un
derivado de PNA según una de las reivindicaciones 1 a 14.
23. Chip de PNA, que contiene un derivado de PNA
según una de las reivindicaciones 1 a 14.
24. Biosensor que contiene un derivado de PNA
según una de las reivindicaciones 1 a 14.
25. Medicamento que contiene un derivado de PNA
según una de las reivindicaciones 1 a 14 y dado el caso otros
aditivos y/o vehículos farmacológicamente aceptables.
26. Agente antisentido, que contiene un derivado
de PNA según una de las reivindicaciones 1 a 14.
27. Procedimiento para la preparación de un
derivado de PNA según una de las reivindicaciones 1 a 14, en el
que
- a)
- el esqueleto de PNA del término C se forma partiendo de ácidos amidonucleicos activados, y
- b)
- se hace reaccionar en el término N con un reactivo de fosforilación.
28. Procedimiento según la reivindicación 27, en
el que el PNA se prepara con uso de los grupos protectores
t-butoxicarbonilo (BOC),
9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o
monometoxitritilo (Mmt).
29. Procedimiento según la reivindicación 28, en
el que el PNA se prepara con uso de vehículos sólidos.
30. Procedimiento según la reivindicación 29, en
el que como vehículo sólido se usa CPG, tentagel o
aminometilpoliestirenos.
\newpage
31. Procedimiento para la preparación de un
medicamento, en el que
- a)
- se prepara un derivado de PNA según una de las reivindicaciones 27 a 30, y
- b)
- dado el caso se añaden otros aditivos y/o vehículos farmacológicamente aceptables.
32. Procedimiento para la preparación de un chip
de PNA, en el que según una de las reivindicaciones 27 a 30 se
prepara en primer lugar bien un derivado de PNA y luego se fija
sobre un vehículo sólido, o bien se preparar el derivado de PNA
directamente sobre el vehículo.
33. Procedimiento para la preparación de un
derivado de PNA de fórmula I según la reivindicación 27 a 30,
caracterizado además porque el PNA se purifica con
utilización del carácter ácido del éster fosfórico mediante
cromatografía o electroforesis.
34. Procedimiento según la reivindicación 33, en
el que un derivado de PNA se purifica mediante cromatografía por
medio de una fase estacionaria básica y un eluyente ácido o que
contiene sal.
35. Procedimiento según la reivindicación 34, en
el que la fase estacionaria es un intercambiador de aniones o una
fase mixta.
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