MXPA02009738A - Derivados de acido nucleico de peptido con carga negativa, agentes y metodos para su preparacion. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a derivados de PNA que llevan un radical fosforilo en la terminal N de la estructura de PNA, por ejemplo un radical fosfato o un radical fosforilo sustituido, en donde derivados fosforilo sustituidos llevan opcionalmente uno o varios grupos marcadores o grupos para reticulacion o grupos que favorecen la absorcion, intracelular o grupos que incrementan la afinidad de enlace del derivado de PNA con acidos nucleicos. La invencion se refiere tambien a un metodo para producir los derivados de PNA mencionados arriba y a su uso como farmacos y agentes de diagnostico.

Description

DERIVADOS DE ÁCIDO NUCLEICO DE PÉPTIDQ CON CARGA NEGATIVA, AGENTES Y MÉTODOS PARA SU PREPARACIÓN La presente invención se refiere a- derivados de ácido nucleico de poliamida fosforilados en terminal N (PNA) que tienen propiedades mejorada, a su uso y a agentes y procesos para prepararlos . Ácidos nucleicos de poliamida que se conocen también como ácidos nucleicos de péptido ' (PNA) , se unen a secuencias objetivo complementarias (ADN _o ARN) con una _ afinidad mayor que los oligonucleótidos naturales y, aderdás, tienen la ) ventaja, en comparación con 'el ADN natural, que son muy • estabas en el suero. Los PNA 'fueron originalmente descritos como análogos no naturales de ácidos nucleicos en donde toda ! la estructura de azúcar-fosfato es reemplazada con unidades - I de N- (2-aminoetil) glicina (M. Egholm y colaboradores. (1991) ! I Science 254, 1497-1500; WÍ3 92/20702; M. Egholm y • colaboradores. Nature (1993) 365, 566-568; P. ielsen, (1994) ' Bioconjugate Chem. 5,3-7; E. Uhlmann y colaboradores. (1998) Angewandte Chemie Int. Ed. Engl. 37, 2796-2823). Las bases I ' empleadas son las nucleobases que ocurren naturalmente y son ¡ habituales en la quimica ?le los nucleótidos o bien nucleobases que no ocurren naturalmente, o bien sus formas de ' I profármacos, es decir precursores que son solamente convertidos en la base libre mediante biotransformación en el cuerpo. Además de esto, se ha descrito PNAs en los cuales no todas las posiciones en la estructura llevan residuos de bases (Greiner y colaboradores. (1999) Helv. Chim. Acta 82,2151), y en donde la aminoetilglicina es reemplazada por unidades más complejas (Uhlmann y colaboradores (1998) Angewandte Chem. Int. Ed. 37,2796, Falkiewicz (1999) Biochim. Pol. 46, 509-529) . El hecho que la estructura del PNA no tenga ninguna carga neta es una característica de esta clase de sustancias y tiene consecuencias importantes. El hecho que el PNA se una a ARN y ADN complementario aún én concentración de sal baja (por ejemplo, Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications [Ácidos nucleicos de péptido: Protocolos y Aplicaciones]; ¿'éter E. Nielsen y Michael Egholm (Edit) Horizon Scientific Press, 1999, 3) , con las reglas de • ; i apareamiento de bases de Watson-Crick observándoße, se asigna al carácter neutral de los PNA y a la disminución de repulsión de carga asociada con esta situación. Por esta razón, los PNA pueden, en principio, utilizarse para numerosas aplicaciones en las cuales, de otra forma, se emplearían oligonucleótidos naturales o derivados de i oligonucleótidos. Sin embargo. Además de esto, debido a las propiedades de eµlace únicas, un gran número der aplicaciones que no son posibles con oligonucleótidos naturales pueden efectuarse (por ejemplo véase Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications [Ácidos Nucleicos de péptido: Protocolos y Aplicaciones]; Peter E. Nielsen y Michael Egholm (Edit) Horizon Scientific Press, 1999) . Por ejemplo, una invasión de cadena de ADN de doble cadena ha sido observada cuando se utiliza PNA. , Ejemplos típicos de aplicaciones para PNA incluyen su uso para inhibir la expresión de genes mediante enla?e, en forma especifica para secuencias, con ADN o ARN celular . Los "agentes de antisentido" son derivados de ácido nucleico de i una sola cadena, cortos, que se unen, a través de apareamiento de ' bases según Watson-Crick, a un AR?m ! complementario cuya traducción en , la proteína correspondiente i ' debe ser inhibida^ (Uhlmann y Peyman (1990) Chem. Rev. 90,543; i ' | I ' Lársen y colaboradores ( 1999) Biochem. Biophys . ' Acta 1489, 159) . Los "agentes antígenos" se unen, 'través del apareamiento de bases de Hoogsteejn, en la i?endidu¡ra mayor de lá ! doble hélice dei AD? con la formación de una triple hélice, l? que resulta efi la inhibición ,de la transcripción de los genes en forma especifica para secuencias (Praseuth y colaboradores (1999) Biochem. Biophys. Acta 1489*, 181) . La expresión de gen fuede ser inhibida específicamente a través • dei lo que se conoce como oligómeros señuelo que ' imitan las rejgiones para enlazar factores de transcripción. Mediante tratamiento con agentes señuelo, factores de transcripción particulares pueden ser capturados en forina específica para secuencias y se puede evitar la esta manera la activación de la transcripción (Mischiati y colaboradores (1999) J. Biol . Chem. 274, 33114 ) . Otro grupo de derivados de oligonucleótidos que actúan de manera intracelular, es decir, los quimeraplastos, se emplean para revisar genes específicos (Cole-Strauss y colaboradores (1996) Science 273, 1386-1389) .

Los PNAs pueden por consiguiente utilizarse como agentes farmacéuticos y/o de diagnóstico o bien para la producción de agentes farmacéuticos y/o de diagnóstico . I ' Por i ejemplo, después de haber sid Io marcadas con biotina, fluoresceina o bien otros marcadores, los PNA pueden ser utilizados para propósitos de diagnóstico en biología molecular, como una sonda de hibridación especifica. A la fectjia cuatro métodos, han sido descritos en la literatura para introducir los grupos marcadores ' (Oeru y colaboradores (1999) , en Peptide Nucleic Acids : Piptocols and Applications i I [Ácidos nucleicos de péptido : Protocolos y Aplicaciones] ; I i páginas 81-86; Lohse y colaboradores (1997) Bioconjugate Chem. 8, 503) . El primer método se basa en el marcado del PNA libre (desprotegido) después de su síntesis en solución. En este método, la terminal amino del PIjíA reacciona con un ácido carb xílico activado o un isotiocianato . Sin embargo, residuos de lisina adicionales son introducidos frecuentemente en el PNA y estos residuos reaccionan después con isotiocianato de fluoresceina (FITC) . En el segundo método, el PNA protegido es modificado en su terminal amino con derivados de ácido carboxílicos activados o bien isotiocianatos mientras se encuentra todavía en fase sólida. Este método , es adecuado solamente para etiquetar grupos estables en las condiciones pertinentes durante la desprotección del PNA y durante su disociación del soporte . Los agentes de reacción reactivos que se utilizan de preferencia en ambos, casos con isotiocinatos (P. Wittung _y colaboradores (1995) FEBS Lett. 375,27). Y ácidos carboxílicos activados, • por ejemplo esteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) (Oerum y colaboradores, 1999) . Una desventaja de la reacción utilizando los derivados de NHS ?s que se . lofra frecuentemente solamente con rendimientos .' ' ' pobres. Por. esta razón, el ácido d-amino-3, 6-dioxaoctanoico ! > i es frecuentemente condensado, como enlazador o espaciador, entre' el P?i y el cjfrupo marcador (Oerum y colaboradores, 1999) . Amboá enlaces se efectúan a través de enlaces amida _o enlaces tiourea que, , como tales, presentan sin embargo una mayor probabilidad de ' causar insolubilidad. Alternativamente, los ácidos carboxílic s reaccionan utilizando activadores que son habituales en la' quimica de los péptidos, por ejemplo I HBTU, ' TBTU O HATU.

E? un tercer método, monómeros conjugados con fluoresceína se utiliza^ durante la síntesis del >NA en la fase sólida, con el etiquetados fluorescente efectuándose a través de un enlace mida (Lohse y colaboradores (1997) Bioconjugate Chem. 8,. 503)', lo que lleva otra vez .más a conjugados que son relativamente difíciles de disolver. Un cuarto método utiliza conjugados de péptidos de PNA en donde la porción de péptido forma un sustrato para una proteína quinasa (Kohc y colaboradores (1995) Tetrahedron Lett. 36, 6933) . De esta forma, por consiguiente, no es la porción de PNA que es modificada; al contrario, el residuo de serina en el segmento de péptido es fosforilado enzimáticamente. Cuando se utiliza este método, por consiguiente, es posible solamente introducir fosfato radioactivo y no, por ejemplo, fluoresceína o biotina, en el segmento de péptido del conjugado de PNA-péptido. Porción de péptido porción de PNA serina Se sabe que un PNA tiende a agregarse en solución acuosa, es decir en condiciones fisiológicas también. Un PNA por consiguiente presenta una solubilidad pobre en amortiguador acuoso y por consiguiente no es disponible para hibridación con secuencias complementarias. Además, un PNA tiene alta afinidad para varios materiales tales como Sephadex® (de Pharmacia) , Bond Elu® (de Varian) o bien varios materiales para cromatografía HPLC que se utilizan en la purificación de los oligómeros, lo que significa que el _ PNA puede frecuentemente solamente ser aislado con rendimieritos pobres.

Por consiguiente, es necesario conjugar PNA con lisina o bien i otros aminoácidos cargados positivamente (a través de la terminal C) {Egholm y colabora (1992) J. Am. Chem. Soc. 114, 1895) . Secuencias de PNA ricas en guanina tiene una ! tendencia muy particular a agregarse, y por esta razón el I i consejo es no utilizar dicha PNA (véase "Guidelines for seqúense design of P?A oligomers" i [Lineamientos para diseño de secuencias de oligómeros de P?A] en Peptide ?ucleic Acids: Protocols and Applications [Ácidos nucleicos de péptido : Protocolos y Aplicaciones] (1999) páginas 253!-255) . Por ¡ ejemplo, oligómeros de P?A marcados con fluoresceína relativamente largo son especialmente difíciles de disolver, i con adición de un solvente orgánico y calentamiento a 50° C recomendándose . Es especialmente difícil purificar los derivados de P?A lipofílicos poco solubles. Varios tipos que se deben a agregados de PNA son frecuentemente detectados en HPLC. La técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAA) , que se emplea frecuentemente para purificar y separar ácidos nucleicos no puede utilizarse en el caso de estos derivados de PNA. En los métodos para derivar PNA que se describen arriba, e grupo de marcado es introducido siempre mediante la formación ¡ 1 de un enlace amida o i de un enlace ti' oamida, con derivados de PNA formándose los ,cuales son relativamente difíciles de disolver. Derivados ' de PNA poco solubles se forman, en i particular, cuando ' residuos lipofílicos tales como fluoresceína son introducidos. Además, puesto que las reacciones de .arjado se efectúan frecuéntente con < I rendimientos pobres, ' un objeto a lograr consiste en hacer ! i disponibles derivadojs de PNA novedosos que deben poder prepararse con altos ; rendimientos, que presentan propiedades provechosas, por ejemplo una solubilidad mejorada, un comportamiento de enlace mejorado, y una mejor absorción I celular y que, además, hacen posible la utilización de métodos eficientes para purificar los oligómeros de PNA. Según la presente invención, este obj eto se logra haciendo 1 I disponibles derivados de PNA que llevan uno o varios radicales de fosforilo en la terminal N de la estructura de PNA, con derivados tio y derivados imino incluyéndose también además de derivados oxo y con por lo menos uno de los radicales fosforilo llevando _ uno o varios , grupos desprotonatables, de preferencia grupos hidroxilo o grupos mercapto . Los radicales fosforilo están unidos , a la estructura de PNA a través de un enlace oxígeno-fósforo, enlace, azufre-fósforo o bien enlace nitrógeno-fósforo, . ya sea I directamente o bien a través de un espaciador, siendo posible que el espaciador sea, por ejemplo una alcanoilamida, una poli (alcoxi) carboxamida o un aminoácido que, en caso apropiado, lleva una óadena lateral en el átomo a-C o ß-C, no I permitiendo que esta cadena lateral lleve un radical i ' fosforilo. Ejemplos de radicales fosforilo son fosfato, fos >fona I to, tiofosfato, fosfoamidato así como rad I icales ! ' ' fosforilo sustituidos, con radicales fosforilo sustituidos que • l¡levan, en ca?o apropiado, uno o varios i grupos marcadores, o bien grupos de reticulación, o grupos que promueven la absorción intracelular, o bien grupos que 'elevan la afinidad de enlace del derivado de P?A para ácidos ! • ' nucleicos . ! En cuanto a este aspecto, grupos marcadores (etiquetas) se comprenden como grupos que permiten que la actividad química o biológica de los derivados de P?A pueda evaluarse de' manera cualitativa o cuantitativa, por ejemplo, biotina o fluoresceína. La reticulación se entiende como la formación de enlaces intramoleculares o intermoleculares < entre funcionalidades espacialmente adyacentes. Un ejemplo del grupo para reticulación es el grupo psoraleno. La invención se refiere de preferencia a derivados de PNA de la fórmula I 1 1 Fórmula I en donde ' V es oxígeno, azufre, NRi, un grupo U--(CR3R4)U'-C(?} -NH o un grupo U7(CH2CH20)U'-CH2-C-(0)-NH, U es, independientemente entre ellos, oxigeno, azufre o NH, u' es, independientemente entre ellos, de 1 a 10, de preferencia de 1 a 4, de manera particularmente preferible 1, W, es, independientemente entre ellos, oxígeno, azufre o NRi, Y es, independientemente entre ellos, ' hidroxilo, mercapto, I oxianió?, tioato o NR?R2, . Ri y R2 , son, independientemente entre ellos, un radical que l consiste de hidrógeno, o alquilo C?-C6, de preferencia hidrógeno, R3 y R4 ' son, independientemente entre ellos, un radical que consiste de hidrógeno o alquilo C?-C6, o bien el radical de una cadena lateral de aminoácidos, de preferencia hidrógeno, X es, independientemente entre ellos, un grupo U- (alcandiilo C2-C22)-U o bien un grupo U- (CHCH^-O)^, o bien es un grupo marcador o un grupo para reticulación, o 1 bien un grupo que promueve la absorción intracelular, o bien 5 un grupo que eleva la afinidad de enlace del derivado de PNA para ácidos nucleicos, _ por ejemplo, una fluoresceína bifuncional, rodamina, TAMRA, biotina, pireno, dinitrofenilo, colesterilo, acridina, adamantilo, vitamina E, colorante de cianina, Dabcyl, Edans, lexitropsina, psoraleno, BODIPY, ROX, 10 R6G o bien un radical de dígoxigenina, Z es hidroxilo, mercapto, oxianión, tioato o bien NR?R2, 1 alquilo C?-C22, arilalquilo Ci-Cß, alquilo C?-C22-U, arilquilo Ci-Cß-U, hidroxi-Ci-Cis-U, aminoalquilo-U o mercaptoalquilo-U, o un grupo de la fórmula R9 (CH2CH2-0) m, en donde R9 es i i 15 hidroxilo, amino o bien al|C?xi C?-C22, y m es de 1 a 100, de I i preferencia de 2 a 10, o bien es un grupo marcador, o bien un grupo para reticulación o bien un grupo que promueve la absorción intracelular, o ' bien un grupo que incrementa la afinidad de enlace del derivado de PNA para ácidos nucleicos, ! 20 por ejemplo, un radical , monofuncional o bifuncional de f fluoresceína, rodamina, ' TAMRA, biotina, pireno, dinitrofenilo, colesterilo, acridina, adamantilo, vitamina E, colorante de cianina, Dabcyl, Edans, lexitrospsina, psoralen, BODIPY, ROX, R6G o dioxigenina, 25 n es de 0 a 10, de preferencia de 0 a 3, Q es hidroxilo, amino, NHR7, NR7Rs, un derivado de aminoácido o un radical' de péptido, R7 y Re son, , independientemente entre ellos, alquilo Ci-Cis o bien hidroxialquilo CX-CXS/ a condición que por lo menos uno de los radicales Y o Z sea hidroxilo, mercapto, oxianión o tioato. {POLI} se describe a través de la fórmula II.

' ' • Fórmula II 1 I La estructura de PNA consiste por consiguiente de z'+l monómeros, eín donde {BLOQUE} , TS independientemente entre ellos, un grupo descrito por la fórmula IIIA, Fórmula IHA o bien de la fórmula 11IB (Greiner y colaboradores (1999) Helv. Chim Acta 82,2151), Fór ula ?IIB o bien de las fórmulas IV A a IV G (Uhlmann y colaboradores (1998) Angewandte Chem. Int. Ed., 31,2196; Falkiewicz (1999) Biochim. Pol. 46,509-529), Fórmula IV A Fórmula IV B Fórmula IV C Fórmula IV D Fórmula IV E Fórmula IV F Fórmula IV G , en donde cada bloque de construcción {BLOQUE } puede ser i diferente, i y en donde , ; A es, independientemente entre ellos, un grupo (CR?R2) s, en > ) i donde s es de 1 a 3, de preferencia 1, ¡ - t \ B es, independientemente entre ellos,, o bien un radical ( i aromático que puede poseer también un carácter heteroaromático, o bien hidrógeno, o bien hidroxilo o bien t i alquilo Ci-Ciß í I ¡ . ! ' o bien una nu?leobase que ocurre naturalmente, y es habitual ¡ en la química de los nucleótidos, o bien que no ocurre ¡ naturalmente, o bien su forma de profármaco, • • i I en donde por lo menos un radical B en ,1a fórmula II es una nucleobase, í D es, independientemente entre ellos, un grupo (CR3R4)t en I ! donde t es de 2 a 10, de preferencia de 2 a 4, de manera t particularmente preferida 2, en donde R3 y R4 tienen el significado antes mencionado, y dos radicales D adyacentes pueden formar también un anillo cicloalquilo C5-C8, E es, independientemente entre ellos, un grupo (CRóRd)u', en donde dos radicales R5 y e puede formar también un anillo cicloalquilo C5 a Cs o bien un compuesto espiro, R5 y R6 son, independientemente entre ellos, un radical que consiste de hidrógeno o alquilo C1-C5, de preferencia hidrógeno, o bien el radical de una cadena lateral de aminoácidos, , r z ' es de 0 a 100, de preferencia de 1 a 20, y especialmente de 4 a 15. . Además, la invención se ' refiere a sales fisiológicamente 1 toleradas de los derivados de PNA de la fórmula I . Sales fisiológicamente toleradas se describen, ínter. alia, ' en Remingtons Pharmaceuti 'calí Science (1985) Mack Publishing Company, Easton, PA, Estados Unidos de America, pagina 1418.

Se da preferencia ' a !| sales de a 1monio, sales ' de trialquilamonio, sales de' metales alcalinos (por ejemplo, sales de sodio y sales jde potasio) , y sales de metales alcalinos férreos (por ejemplo sales de magnesio y sales de calcio) . Se da particular preferencia a las sales de sodio.

Se ha encontrado, sorprendentemente, que. una carga parcial negativa en el radical fosforilo ya es suficiente para mejorar de manera significativa las propiedades de los compuestos de la fórmula I. Mientras que el PNA mismo no migra durante la electroforesis en gel de PAA, los compuestos de la fórmula I migran hacia el ánodo. Puesto que el radical fosforilo es solamente introducido en el último ciclo durante la síntesis de los compuestos de la fórmula I, es solamente los compuestos de conformidad con la invención que migran en el campo eléctrico durante la electroforesis en gel de PAA', mientas ,que( todas secuencias erróneas y subproductos np migran y pueden por consiguiente ser separados de manera " ! extremadamente sencilla. i 1 ' Los sustituyentes hidroxi ¡ o mercapto de los radicales fosforilo de los derivadoá de ADN de conformidad con 1^ I presente invención pueden ser desprotonatados en un rango de i ' pH de 4.5 a 14, de preferencia de 6.5 a 12, de manera dé d os la I pueden ser purificados 'por electroforesis, por ejemplo electroforesis en gel de poliacrilamida. Por otra parte, eá también posible purificarlos utilizando intercambiadores dé aniones. En este caso, los productos deseados son eluidos de preferencia mediante la utilización de un gradiente de sal; por ejemplo, ¡un gradiente de cloruro de sodio, o un gradiente ¡ ' de pH. Los derivados de PNA 1 de la fórmula I de conformidad con la invención puede ser purificados de manera particularmente simple ' y eficiente utilizando intercambiadores de aniones . Se encontró que los subproductos no cargados no son retardados en el interca biador de aniones mientras que el producto cargado es adherido a la columna . Después del lavado con agua, fue posible aislar el producto deseado en forma pura utilizando ácido acético 'o una solución de cloruro de sodio . Los intercambiadores de aniones empleados son de preferencia intercambiadores fuertes de ' aniones o bien fases de modo mixto, por ejemplo ®Oasis MAX (Waters GMBH, Eschborn) . , Se encontró además que los compuestos de la fprmula I según i la presente invención en general son más fácilmente solubles i ' ¡ en medio acuoso que los oligómeros de PNA correspondientes I que no poseen el radical fosforilo. Esto es particularmente i ¡ aparente, en f'orma de una solubilidad muy mejorada en medio i ' ' ! acuoso, en el1 caso de derivados lipofílicosi, por ejemplo derivados de fli iuoresceína o bien derivados de héixadecilo. i Un efecto positivo sorprendente adicional que fue encontrado 1 fue que la introducción de un radical fosforilo, por ejemplo - fosfato o bien de otro tipo en forma de una derivación lipofilica (pof ejemplo, como µn fosfodiester de hexadecilo) | incrementa la afinidad del PNA para ARN o ADN complementario.

¡ Este efecto fue inesperado puesto que el fuerte' enlace de PNA , con ARN o ADN complementario fue atribuido al carácter ; neutral del PNA y a la repulsión de carga reducida asociada , con este carácter (por ejemplo, Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications [Ácidos nucleicos de péptido: Protocolos y aplicaciones]; Peter E. Nielsen y Michael Egholm (Edit) Horizon Scientific Press, 1999, 3} . La biotina fue introducida ,de manera particularmente eficiente a través de un radical ' fosforilo. Cuando se utilizó ( como sondas de hibridación, el PNA biotinilado de la fórmula I (X y/o Z = radical de biotina) presentó mejores propiedades de enlace y menos efectos de fondo no específicos, espurios 1 ' que las sondas de ADN biotiniladas correspondientes. En contraste al PNA sin carga, ,103 derivados de PNA de la fórmula I según ,1a presente invención pueden también migrar fen un campo eléctrico, haciendo de esta forma posible iaicrolocalizarlos y concentrarlos en derivados de ácido • I I ' nucleico complementarios inmovilizados. En el caso de los I pligonucleótidos , polianiónicos, |ßste método que utiliza el campo eléctrico ya ha sido descrito para la determinación 1 i tapida de faltas de correspondencia de bases (Sosnowski y colaboradores (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94,1119).

La invención se refiere, en parti'cular, a derivados de PNA en donde A y E son CH2. La invención se refiere además, en particular, a derivados de PNA en donde los sustituyentes D son (CH2)2. Se da también preferencia a derivados de PNA de la fórmula I en donde V, y Y son oxígeno. Ejemplos de bases naturales son adenina, citosina, 5-metilxotosina, guanina, timina y, uracilo. Ejemplos de bases no naturales son pupna, 2, 6-diaminopurina, N"N~-etanocitosina, . N t6°NT6°-etano-2, 6, -dia inopurina, alquiniluracilo (C3-C6) , 5-alquinilcitosina (C3-C6) , 5-(l-propoargila ino) uracilo, 5- (1-propargilamino) citosina, fenoxazina, 9-aminoetoxifenoxazina, 5-fluorouracilo o bien pseudoisocitosina, 5- (hidroximetil) uracilo, 5-aminouracilo, pseudouracilo, dihidrouracilo, 5-alquiluracilo (Ci-Ce) , 5-alquilcitosina (d-Cß) , 5-alquenilcitosina (C2-Ce) , 5-fluorocitocsina, 5-clorouracilo, 5-clorocitosina, 5-bromouracilo, 5 bromocitosina, 7-deazaadenina, 7-deazaguanina, 8-azapurina, y purinas sustituidas en 7-deaza.

Q es de preferencia un radical hidroxialquilamino, en particular un radical hidroxihexilamino, o un derivado de un aminoácido natural ' conocido o no natural, o bien de un péptido . Secuencias , de péptidos adecuadas son de preferencia las, secuencias que 'optimizan la distribución de órganos o la localización celular del PNA, por ejemplo transportano, factor de crecimiento de tipo insulina, señales de 1 localización nuclear o bien otras secuencias portadoras (Larsen y colaboradores ( 1999) Biochim. Biophys . Acta 159- ! 166) . El péptido puede también utilizarse como una etiqueta de afinidad, por ejemplo, una cadena (His) 6- La presente invención habilita los radicales X y Z de ral manera .que varíen ampliamente (Ejemplos se ofrecen en las figuras la, lb, 2a, 2b, 3a, 3b) y por consiguiente hace posible introducir diferentes características funcionales espe?íficas en el PNA. Una modalidad preferida de Z es un radical alquilo Ci a C-? .

Se da también preferencia a radicales alcoxi Ci a Cz r en particular radicales alcoxi Cíe. Otros radicales preferidos son, radicales hidroxi (alcoxi Ci a Cíe), en particular HO(CH2)3-i2?. Se da también preferencia a radicales aminoalcoxi, en particular radicales 6-aminohexoxi y 5-a inopentoxi . Se da también preferencia a radicales de l,a fórmula Rg (CH2CH2-0) m, en donde Rg es hidroxilo, amino o alcoxi Ci a C22, de preferencia, sin embargo, hidroxilo y m es de 0 'a 1 i 100, de preferencia de 2 a 10. Se da preferencia particular ¡a HO(CH2CH2-0)2, HO (CH2CH2-0) 6 y H2N- (CH2CH2-0) 2. Otros ejemplos preferidos de Z incluyen radicales mercaptoalquilo, eh ! i partipular 6-mercaptohexiloxi. : I I En otra modalidad preferida, Z comprende un grupp fluorescente, por ejemplo fluoresceína, rodamina, TAMRA o uh colorante de cianina. Grupos fluorescentes preferidos pueden encontrarse en las figuras la a 3b. Preferencia muy particular se proporciona también a Z siendo biotina. Otros grupos preferidos para Z incluyen Dabcyl, psoralen, acridinaf DNP y' colesterol, (Figuras lb y 2b), radicales BODIPY-, ROX-o R6G (Su-Chun Hung y colaboradores (1998) Analytic Biochemistry 255, 32-38) y digoxigenina (Tarrason y colaboradores. Methods in Enzyology (1999) Vol. 313,257,268).

Además de esto, Z puede ser un grupo que consiste de un radical monofuncional o bifuncionai de fluoresceína, rodamina, TAMRA, biotina, pireno, dinotrifenilo, colesterilo, acridina, adamantilo, vitamina E, colorantes de cianina, Dabcyl, Edans, lexitrosina o psoralen. Grupos de extremo monofuncionales son ejecutados a titulo de ejemplo en las figuras la, lb, 2a y 3a, mientras que grupos de puente bifuncionales se presentan en la lista en las figuras 2b y 3b. En otra modalidad preferida, n es o, es decir, la porción de PNA lleva solamente un radical fosfato o fosforilo. ' Una modalidad preferida de X es U- (alcandiilo C2-C22)-U, en particular O- (alcandiilo C2-C22)-0, de manera1 particularmente i preferible O- (CH2) 2-6-0. Otra modalidad preferida de X es un grupo de la fórmula U- (CH2CH2-0) ', en donde u es de 1 a 10, i de preferencia de 1 a 6 y en donde U es de preferencia oxi. I ' En una modalidad preferida adicional, X conjprende un grupo fluorescente, por ejemplo fluoresceína, rodamina, TAMRA, o u? colorante de cianina, por ejemplo, ®Cy3 (de Amersham Pharmacia Biotech) . Grupos bifuncionales preferidos pueden encontrarse en las figuras 2a y 3a. Preferencia muy particular se proporciona también a X siendo biotina. Otros grupos que son preferidos para X incluyen Dabcilo, psoralen, acridina, DNP, colesterol, BODIPY, digcxigenina, radicales ROX- y R6G. Los radicales diferentes para X y Z en la fórmula I pueden cumplir funciones diferentes. Los radicales de fluoresceína tienen aplicaciones de largo alcance en el secuenciamiento de ADN y en la amplificación de señales o bien como marcadores para determinar la absorción celular de PNA. Los radicales de colorante de cianina (®Cy3 y ®Cy5) proporcionan una señal de fluorescencia sustancialmente más intensa y de mayor duración que la fluoresceína misma. El radical de psoralen es empleado para reticulación con ácidos nucleicos complementarios. El i radical de acridina es un i?tercalador efectivo y puede aumentar por consiguiente la afinidad de enlace del PNA. Los derivados de biotina, acridina! y psoralen, pueden también utilizarse para experimentos! de antisent do. Además, derivados de hexadexiloxi y colesterol pueden emplearse para incrementar la capacidad del EÍN? para atravesar membranas. I i Compuestos marcados con DNP de la fórmula ' I pueden ser detectados empleando anticuerpos anti-DNP . , Radicales de aminoalcoxi pueden ser utilizados para acoplamiento en otros grupos, por ejemplo, lexitrosiná (véase Ejemplo 17; PNA-16) .

De manera similar, grupos mercaptoalcoxi pueden también ser utilizados para derivación adicional . ! La invención se refiere además l uso de derivados de PNA de la fórmula I como agentes farmacéuticos . Estos agentes farmacéuticos pueden ser utilizados para prevenir y/o tratar enfermedades acompañadas por la expresión o sobreexpresión de genes particulares . La invención se refiere también al uso de derivados de PNA de la fórmula I como agentes de diagnóstico. Estos agentes de diagnóstico pueden ser utilizados para diagnosticar las enfermedades mencionadas arriba en una etapa inicial. Cuando se emplea como agentes farmacéuticos o agentes de diagnóstico, los derivados de PNA de la fórmula I pueden ser utilizados como agentes de antisentido, agentes antigénicos, agentes señuelo y como agentes de quimeraplasto, según su , ! secuencia. Los derivados de PNA de conformidad con la invención se emplean, en particular, para la producción de • ) agentes farmacéuticos para el tratamiento de enfermedades en ! donde genes definidos son la causa o están involucrados como resultado de su sooreexpresión. Estos agentes farmacéuticos pueden, por ejemplo, para . í enfermedades provocadas por virus> por ejemplo, por virus de CMV, VIH, HSV-1,: HSV-2, influenza, VSV, hepatitis B o papiloma, con la 'Secuencia viral! correspondiente siendo el blanco. ' Derivados de PNA de antisentido de conformidad con la presente invención que son activoís con estos blancos tienen, por ejemplo, las siguientes secuencias de bases . a) contra CMV, por ¡ ej emplo SEQ ID No . 1 5' -GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3' b) contra HIV, por ejemplo SEQ ID No. 2 5' -ACACCCAATTCTGAAAATGG-3' SEQ ID No. 3 5'-AGGTCCCTGTTCGGGCGCCA-3' c) contra HSV-1, por ejemplo SEQ ID No. 4 5'-GCGGGGCTCCATGGGGGTCG-3' Tales agentes farmacéuticos son también adecuados, por ejemplo, para tratar cáncer, en cuanto este aspecto, es preferiblemente posible utilizar secuencias dirigidas contra objetivos que son responsables de la carcinogénesis o del crecimiento del un cáncer, en particular mediante la inhibición de la telomerasa (E . Matthes y colaboradores (1999) Nucleic Acids Res. 27, 1152) b Objetivos adicionales de esta naturaleza son. | > 1) Opcopro teínas nucleares, como por ej emplo c-myc, N-myc, c-myb, ' c-fos, c-fos/ Jun, PCNA, pl20, 2) Oncoproteínas citoplásmicas/asociadas con membrana, como I i por ejemplo EJ-ras, ' c-Ha-ras, N-ras,, rrg, bcl-2, qdc-2, c- l i raf-1, c-mos, c-src, c-abl, c-ets, ' ' 3) Receptoras celulares, como por ej emplo receptor , de EGF, Her-2, c-erbA, receptor de VEGF (KDR-1 ) , receptores de retirioide, subunidad reguladora de proteína quinasa1, c-fms, ! ' Tie-2, c-raf-1 quin sa, PKC-alfa, y proteína quinasa A (Rl alfa);, [ 4) Citosinas, factores de crecimiento y matriz extrácelular, como por ej emplo CSF . l , IL-6, IL-la, IL-lb, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, bFGF, VEGF, mieloblastina y fibronectina . Derivados de PNA de ' antisentido que son activos contra tales objetivos tienen, por ejemplc, las siguientes secuencias de bases: a) contra c-Ha-ras, por ejemplo: SEQ ID No.5 5'-CAGCTGCAACCCAGC-3' SEQ ID No.6 5' -TATTCCGTCAT-3' SEQ ID No.7 5' -TTCCGTCATCGCTCCTCAGGGG-3' b) bFGF, por ejemplo: SEQ ID No.8 5'-GGCTGCCATGGTCCC-3' c) c-myc, por ejemplo: SEQ ID No.9 5'-GGCTGCTGGAGCGGGGCACA?-3' SEQ ID No.10 5'-AACGTTGAGGGGCAT-3' d) c-myb, por ejemplo: SEQ ID No.11 5'-GTGCCGGGGTCTTCGGGC-3; e) c-fos, por ejemplo: ' SEQ ID No . 12 5' -CGAGAACATGATCGTGG-3 ' , I I SEQ ID No .13 5'-GGAGAACATCATGGTCGAAAG-3' SEQ l? ?o.14 5'-CCCGAGAACATCATGGTCGAAG-3' 1 SEQ ID ?o.15 5' -GGGGAAAGCCCGGCAAGGGG-!-3' f) pl20, por ejemplo: ' SEQ ID ?o.16 5' -CACCCGCCTTGGCCTCCCAC 3' g) receptor de EGF, por ejemplo: SEQ ID ?o.17 5' -GGGACTCCGGCGCAGCGC-3r SEQ ID ?o.18 S'-GGCAAACTTTCTTTTCCTCC-S' h) supresor de tumor p53, por ej emplo : SEQ l? ?o . 19 S' -GGGAAGGAGGAGGATGAGG-S' SEQ ID No.20 5' -GGCAGTCATCCAGCTTCGGAG-3' i) bcl-2, por ejemplo: SEQ ID No.21 5'-TCTCCCAGCGTGCGCCAT-3' k) VEGF, por ejemplo: SEQ ID No.22 5' -GCGCTGATAGACATCCATG-3' SEQ ID No.23 5' -GGAGGCCCGACC-3' SEQ ID No.24 5' -GGTTTCGGAGGC-3 I SEQ ID No.25 5' -TGGTGGAGGTAG-3' SEQ ID No.26 5' -GCATGGTGGAGG-3' SEQ ID Np.27 5' -TTGGCA?;GGTGG-3' SEQ ID No.28 5' -GCCTGGGACCAC-3' 1 SEQ ID No.29 5' -CAGCCTGGGACC-3' , , i SEQ ID No.30 5'-TGCAGCd ITGGGA-3' SEQ ID No.31 5'-GTGCAGCCTGGG-3' SEQ ID No . 32 5' -GGTGCAGJCCTGG-3' , i SEQ ID No.33 5' -ATGGGTGCAGCC-3' SEQ ID No.34 5' -GGCTTGAAGATG-3f SEQ ID No.35 5' -GCAGCCCCCGCA-3' SEQ ID Np.36 5' -GCAGCAGCCCCC-3' 1) c-raf quinasa, por ejemplo: SEQ ID No.37 5' -TCCCGCCTGTGACATGCATT-3' m) PKC-alfa, por ejemplo:' SEQ ID No.38 5' -GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA-3' n) proteína quinasa A, por ejemplo: SEQ ID No.39 5' -GCGTGCCTCCTCACTGGC-3' Agentes farmacéuticos que comprende derivados de PNA de la fórmula ,1 son además adecuados, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades provocadas por integrinas o receptores de adhesión célula-célula, por ejemplo por VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM o ELAM. Derivados de PNA de antisentido que son activos contra tales blancos tienen, por ejemplo, las siguientes secuencias de bases: a) VLA-4, por ejemplo: SEQ ID Nor40 5' -GCAGTAAGCATCCATATC-3' b) ICAM-1; por ejemplo: SEQ ID No , 41 5' -GCCC^GCTGGCATCCGTCA-3 ' SEQ ID No '.42 5' -CCCCCACCACTTCCCCTCTC-3 ' SEQ ID No ¡.43 5' -CTCCCCCACCACTTCCCCTC-3' SEQ ID No ¡.44 5' -GCTGGGAGCCATAGCGAGG-3 ' i c) ELAM-l; por ejemplo: I SEQ ID No.45 5' -ACTGCTGCCTCTTGTCTCAGG-3' SEQ ID No 1 146 5' -CAATCAATGACTTCAAGAGTTC-3' d) integrina alfa(V), por ejemplo: SEQ ID Nor47 5' -GCGGCGGAAAAGCCATCG-3' Agentes farmacéuticos que comprenden derivados de PNA de la fórmula I' son también adecuados, por ejemplo, para prevenir la restenpsis. En cuanto a este aspecto, es posible utilizar secuencias de PNA que . son enfocadas contra blancos responsables de la proliferación o migración. Ejemplos de tales objetivos son: 1) Proteínas de transactivadores nucleares y ciclinas, como por ejemplo c-myc, c-myb, c-fos, c-fos/Jun, ciclinas y cdc2 quinasa > 2) Mitógenos o factores de crecimiento, tales como PDGF, bFGF, VEGF, EGF, HB-EGF y TGF-ß. 3) Receptores de células, como por ejemplo receptores de bFGF, receptor de EGF y receptor de PDGF. Derivados de PNA de antisentido que son activos contra tales 10 objetivos tienen, por ejemplo, las siguientes secuencias de base: ' ¡ a) c-myb, por ejemplo: : SEQ ID No.48 5r -GTGTCGGGGTCTCCGGGC-3r ' b) c-myc, por ejemplo: ' I ,15 SEQ ID No.49 5' -CACGTTGAGGGGCAT-3' I c) cdc2 quinasa, por ejemplo: ¡ SEQ ID No.50 5' -GTCTTCCATAGTTACTCA-3' d) PCNA (antígeno nuclear de células proliferantes de ratas) , por ejemplo ¿0 SEQ ID No. 51 5' -GATCAGGCGTGCCTCAAA-3' Derivados de PNA pueden también utilizarse ,' para el tratamiento del vitíligo y otras enfermedades de I despigmentación o trastornos de despigmentación (por ejemplo, de la piel, del cabello y de los ojos, por ejemplo albinismo 5 y psoriasis, o bien para el tratamiento del asma, con expresión del receptor de adenosina Al, receptor de adenosina A3 o receptor de bradiquinina, o bien de IL-13, inhibida mediante el uso de agentes de antisentido adecuados. Ejemplo de una secuencia de bases de este tipo e¡s: SEQ ID No. 52 5' -GATGGAGGGCGGCATGGCGGG-3' Agentes farmacéuticos que comprenden un derivado de PNA de la fórmula I pueden emplearse, por ejemplo, en forma de preparaciones farmacéuticas que pueden administrarse oralmente, por ejemplo, en forma de tabletas, tabletas revestidas, cápsulas de gelatina dura o blanda, soluciones, emulsiones o suspensiones. Pueden t 1ambién administrarse rectalpiente, por ejemplo, en forma de supositorios o bien de manera parenteral, por 'ejemplo, en forma de soluciones para inyección. Con el objeto de pr ducir preparaciones farmacéuticas, estos compuestos puedep. ser procesados en I , i excipientes orgánicos e inorgánicos terapéuticamente inertes.

Ejemplos de tales excipientes para > tabletas, tabletas revestidas y cápsulas de gelatina dura ¡ son lactosa, almidón de maíz o derivados de , los mismos, sebo y ácido esteárico o sales !de los mismos. Excipientes , adecuados para la preparación de soluciones son agua, polioles, sucrosa, azúcar invertida y glucosa. Excipientes adecuados para soluciones para inyecciones son agua, alcoholes, polioles, glicerol y aceites vegetales . Excipientes adecuados para supositorios son aceites vegetales y. aceites hidrogenados, ceras, grasas y polioles semilíquidos. Las preparaciones farmacéuticas pueden también comprender conservadores, solventes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsificantes, endulzantes, colorantes, saborizantes, sales pa a alterar la presión osmótica, amortiguadores, agentes de revestimiento, antioxidantes y, en caso apropiado, otros compuestos terapéuticos activos. Las formas de administración preferidas son aplicaciones tópicas, aplicaciones locales, por ejemplo empleando un catéter o bien por inhalación, inyecciones o infusiones y administración oral. Para inyección, los derivados de PNA de la fórmula I son formulados en la solución líquida, más de preferencia en amortiguador fisiológicamente aceptable, por ejemplo una solución de 'Hank o una solución de Ringer, sin embargo, los oligonucleótidos pueden también ser formulados , 1 en forma , sólida y disuel^os o suspendidos antes de uso. Las dosis preferidas para ' administración sistémica son de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal y por día. ' La invención se refiere además a preparaciones farmacéuticas y comprenden derivados de PNA de la fórmula I y/o sus sales fisiológicamente toleradas además de excipientes farmacéuticamente tolerables y/o aditivos. Los derivados de PNA de la fórmula I y/o sus sales fisiológicamente toleradas pueden ser administrados a animales, de preferencia a mamíferos, particularmente a seres humanos, como agentes farmacéuticos, solos, en mezcla entre ellos, o bien en forma de preparación farmacéuticas que permiten un uso tópico, percutáneo, parenteral o enteral y que comprenden, como constituyente activo, una dosis efectiva de por lo menos un derivado de PNA junto con excipientes y aditivos habituales, farmacéuticamente no objetables . Las preparaciones comprenden normalmente de aproximadamente 0.1 a 90% en peso del I compuesto terapéuticamente activo . Una aplicación tópica, como por ejemplo, en forma de ungüentos, lociones o tinturas, emulsiones o suspensiones, se prefiere para el tratamiento de enfermedades cutáneas. I Las preparaciones farmacéuticas son producidas de manera conocida per se (por ejemplo, Remingtons Pharmaceutical Sciences, 'Mack Publ. Co., Easton, PA) , con excipientes orgánicos y/o inorgánicos farmacéuticamente inertes empleándose. Es posible, por ejemplo, utilizar la lactosa, almidón de. maíz y/o derivados de los mismos, sebo, ácido i esteárico ^/o sus sales, por ejemplo, para la producción de pildoras, ' tabletas, tabletas revestidas y cápsulas de I gelatina dura . Ej emplos de excipientes para cápsulas de i gelatina dura y/o supositorios son grasas, ceras, polioles semisólidos y líquidos, aceites naturales y/o hidrogenados, etc. excipientes adecuados para producción de soluciones y/o jarabes son, por ejemplo agua, sucrosa, azúcar invertida, glucosa, polioles, etc. Excipientes adecuados para la producción de soluciones para inyecciones son agua, alcoholes, glicerol, polioles, aceites vegetales, etc. Excipientes adecuados para microcápsulas, implantes y/o varillas son copolímeros que consisten de ácido glicólico y ácido láctico. Formulaciones de liposoma conocidas por parte del experto en la materia (N. Weiner, Drug Develop Ind Pharma .15 (1989) 1523; "Liposome Dermatics, Springer Verlag 1992) , por ejemplo liposomas HVJ (Hayashi, Gene Therapy 3 (1996) i 878) están también disponibles. Una aplicación dérmica puede , también efectuarse, por ejemplo, empleando > métodos ionoforéticos y/o utilizando electroporación. Además de los compuestos activos y excipientes, una formulación farmacéutica puede contener también aditivos, como por ejemplo rellenadores, expendedores, desint grantes, I | aglomerantes, agentes de deslizamiento, agentes humectantes, estabilizadores, emulsificantes, conservadores, endulzantes, colorantes, saborizantes, o agentes aromatizantes, espesadores, diluyentes y sustancias amortiguadoras ¡y además solventes y/o agentes de solubilización y/o agentes para , lograr un efecto de liberación prolongada y también sales para alterar la presión osmótica, agentes de revestimiento y/o antioxidantes. Pueden comprender dos o más derivados diferentes de PNA de la fórmula I y/o sales fisiológicamente toleradas y también, además de por lo menos un derivado de PNA de la fórmula I, una o varias sustancias diferentes terapéuticamente activas . La dosis puede variar dentro de limites amplios y debe ajustarse a las circunstancias individuales en cada caso individual . La invención se refiere además del uso de derivados PNA de la fórmula I como agentes de diagnóstico, en particular como auxiliares en el diagnóstico de ADN y en biología molecular (véase, por ejemplo : Peptide Nucleic Acids : Protocols and Applications [Ácidos Nucleicos de Péptido : Protocolos y ¡ I Aplicaciones] ; Peter E . Nielsen and _ Michael Egholm , (Edit . ) Horizon Scientific Press, 1999) . En el diagnóstico del ADN, sondas génicas, que se conocen también como sondas de ADN o bien sonadas de hibridación, desempeñan una función importante en la detección específica para secuencias de genes particulares . En general, una s'onda génica consiste de i una secuencia de reconocimiento y uno o varios grupos de marcado adecuados (etiquetas) . La especificidad con , la cual una secuencia blanco en una muestra analítica es identificada a través de hibridación con una sondja génica complementaria es determinada por la secuencia de reconocimiento y su i estructura química . Esta técnica puede también aplicarse a I PNA. En comparación con oligonucleótidos que tienen una I estructura natural, el PNA tiene la , ventaja que tiene una I mayor afinidad para la secuencia blanco y una mayor habilidad para discriminar entre bases . El uso de los compuestos de la fórmula I se refieren también por consiguiente a hibridación in situ e hibridación in situ con fluorescencia (FISH) . La hibridación in situ puede también emplearse, por ejemplo, para detectar microorganismos y virus (Just y colaboradores (1998) J. Vir Method. 73, 163-174) . Otra aplicación de los compuestos de la invención se refiere a la detección y cuantificación de ácidos nucleicos.

Para este propósito, se utiliza de preferencia una tecnología de conjunto (Strother y colaboradores. J. Am. Chem. Soc. (2000) 122, 1205-1209; [ Niemeyer y colaboradores., Angew. Chem. (1999) 111, 3039-3043; Pirrung (1997) Chem. Rev. 97, ' ) 473-488) , que ofrece un' alto rendimiento de muestras y un alto grado de sensibilid Iad. En este caso, las sondas de PNA se fijan sobre un soporte adecuado o bien un chip de • PNA. Para lograr este objetivo, el PNA puede ser sintetizado de conformidad con lo ' descrito en los ejemplos y subsecuentemente fijada ¡ en el soporte o chip de ' PNA. Alternativamente, el PNA puede ser separado directamente en el soporte. Otra aplicación es el uso de los compuestos de la fórmula I como biosensores para detectar ácidos nucleicos {Wang y colaboradores (1996) J. Am. Chep? Soc. 118, 7667) . El uso de PNA de la fórmula I que poseen una etiqueta de afinidad, como por ejemplo histidilo-PNA, es otra aplicación para purificar ácidos nucleicos (Oerum y colaboradores. (1999), en Peptide Nucleic Acids: Protocols and Application [Ácidos Nucleicos de Péptidos: Protocolos y Aplicaciones]).

La estructura de PNA es sintetizada utilizando los métodos descritos en la literatura, por ejemplo utilizando la estrategia de grupo de protección de terc-but i loxicarbonilo (BOC) , 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o bien monometoxitritilo (Mmt) (Peptide Nucleic Acids : Protocols and Applications [Ácidos Nucleicos de Péptidos : Protocolos y Aplicaciones] ; Peter E . Nielsen y Michael Egholm (Edit . ) 1 Horizon Scientific Press, 1999) . Se prefiere utilizar , el grupo de protección Mmt • para la protección temporal de< la función amino de la aminoetilglicina y los ' grupos ' de protección, lábiles para bases en las .nucleobases heterocíclicas (D. Will y colaboradores . , ( 1995) ¡Tetrahedron I ¡ ¡ ' 51, 12069; Breipohl y colaboradores ( 1997 ) Tetrahedron ?53, ' l ' i 14671-14686) . Ej emplos de, bloques de construcción monoméricos son compue Istos de las fórImulas V a V B, en donde ¡ 'A, B, D, E,i¡ u' y U tienen! los significados antes mencionados . PG ¡es un grupo de protección amino, por ej emplo benzoilo, aniso.il-isobutiroil-, acetil- o terc-butilben^oilo (Breipohl ' y 1 , I colaboradores ( 1997 ) Tetrahedron 53, 14671-14686) . TR es , un grupo de protección lábil para ácidos como por ej emplo í | dimetoxitritilo (Dmt) (para U=0 y S) o Mmt (para U=NH) Fórmula V Fórmula V A Fórmula V B Fórmula V C Después de ,1a construcción de la estructura de PNA, la función de, amino libre del extremo N puede reaccionar directamente con un reactivo de fosforilación apropiado, por ejemplo para proporcionar el fosforamidató correspondiente (U=NR? en la formula I) .

NH4OH Así, se obtuvo el PNA-7 en el Ejemplo (U=NH) , por ejemplo, mediante , la reacción del extremo N (en el bloque de construcción ,que fue acoplado al final, en donde el B= i adenina) • con biotina-fosforamidita 5 (Figura 4b) .

Alternativamente, un bloque de construcción de hidroxialquilo protegido | con Dmt (U=0) o Sun bloque de construcción, de mercaptoa|.quilo protegido con 'Dmt (para U=S) de la formula V ! A puede . acoplarse en el último ciclo. Después de la eliminación del grupo Dmt, la función hidroxi o mercapto libre puede reaccionar, por , ejemplo, con un reactivo de fosforilación 1 (Figura 4a) . Después de la oxidación la disociación del soporte' y la remoción de los grupos de protección, el fosfato (Y = W = X = Y = 0) o tiofosfato (V = S, W = X = Y = O) de la formula I se obtiene. Si la unidad de terminal amino no contiene ninguna nucleobase (B es hidrógeno) , el bloque de construcción mostrado en la fórmula V B se utiliza en la reacción de condensación del último ciclo, con el , grupo de protección Fmoc eliminándose con amoniaco al final de la síntesis. El extremo amino del PCA puede ser extendido mediante la condensación de bloques de construcción de la fórmula V C antes de llevar a cabo la reacción de fosforilación misma. Los radicales fosforilo pueden ser introducidos empleando los reactivos habitualmente utilizados en la química de los nucleótidos, por ejemplo, a través del método de fosforamidita, ,el método de H-fosfonato o el método de , fosfotriéster (E 1. Sonveaux (1986) Bioorganic Chemistry 14, ! 274; S.L. Beaucage y R.P. Iyer (1993) Tetrahedron 49, 1925; i E. Uhl ann y A. ' Peyman (1990) Chem. Rev. 90, 543). Existe un gran número de' reactivos de fosforilación (Glen Research Corporation, Steriing, VA 20164, Estados Unidos de América) I 1 que pueden utilizarse para preparar los compuestos de la fórmula I. Una selección de los reactivos se muestra en las 1 figuras 4a a 4b, y la invención sin embargo no se limita a , estos derivados ' especiales . En la reacción de fosforilación descrita arriba, Z puede también tener el significado de X, • con funciones reactivas protegidas en etapas intermedias con grupos protectores adecuados . La variación de la modificación de la terminal amino puede ser ilustrada con base en la síntesis de PNA-6, PNA-12, PNA- 13 y PNA-14. Primero, se sintetiza t (oeg) -at tcc gtc at-hex- CPG de PNA (bases de PNA son abreviadas con letras minúsculas para las nucleobases correspondientes; oeg representa hidroxietilglicina) , en forma totalmente protegida, en el doporte de CPG (vidrio con poros controlados), que lleva una hidroxietilglicina- (oeg) -acetiltimina como el último bloque de construcción. El grupo hidroxilo puede reaccionar ahora de manera individual con fosforamiditas . 1, 5, 7 y 3, respectivamente. Después de la oxidación, eliminación de los .grupos de protección y disociación del producto del soporte 1 i dje CPG, se obtienen correspondientemente PNA-6, PNA-12, PNA- I 13 y PNA-14, respectivamente. Se pueden utilizar también , ' ' ' ! ,®TentaGel (de Rapp Polymers GMBH, Tübingen) y 1 i I unc n os or o, os react vos que 'son part cu armente adecuados son los siguientes reactivos de las fórmulas VI A, VI B, VI C y VI D Fórmula VI A Fórmula VI B Fórmula VI C Fórmula VI D en donde K es halógeno, de preferencia Cl, triazolilo, imidazolilo o dialquilamino y Z tiene el significado mencionado arriba o el significado de X, con grupos reactivos apropiadamente protegidos. Por ejemplo, los grupos hidroxilo de la fluoresceína-fosforamidita 3 (Figura 4a) son protegidos por esterificación con ácido piválico. Los compuestos de la fórmula VI deben considerarse solamente como ejemplos de tales reactivos, que reacciona, en caso apropiado, en presencia agregada de( otros reactivos auxiliares, tales como bases, ácidos' o reactivos ' de ' 1 condensación. Se da preferencia particular1 a los reactivos de la fórmula VI A, que reaccionan de conformidad con el método de fosforamidita (Beaucage y lyer, 1993) . Estos reactivos | 1 reaccionan como los compuestos de fós'foro (III) y son i subsecuentemente oxidados. Por ejemplo, si la oxidación¡ se lleva a cabo utilizando yodo/agua/piridina o bien hidroperóxido de terc-butilo, los derivados obtienen entonces derivados de fosforilo (W = O) . Por otra parte, si , la oxidación se efectúa empleando azufre elemental o bien reactivo de Beaucage, se obtiene entonces el compuesto' de tiofosforilo correspondiente (W = S) . ¡ Entre los reactivos (Figuras 4a a 4b) se , encuentran también "reactivos bifuncionales" que, debido a la posesión de µna segunda función, que es inicialmente protegida, pueden reaccionar varias veces. Las fosforamiditas 4, 6 y 8 a 13 son ejemplos de tales reactivos bifuncionales. En cuanto a este aspecto, puede ser un asunto de conjugación múltiple del reactivo o bien de reacción sucesivas con reactivos diferentes. Por consiguiente, por ejemplo, se puede provocar que la fluoresceína-fosforamidita 3 reaccione solamente una vez. En comparación, la fluoresceína-fosforamidita 4 posee una función hidroxilo protegido con grupo Dmt que puede reaccionar otra vez con un reactivo de fosforilación después i de la eliminación del grupq Dmt . De esta forma, es posible introducir un mismo grupo o bien grupos ¡diferentes varias I veces . PNA-16 es un ejemplo típico de una conjugación múltiple . Después de la sintetización de la cadena de PNA, un bloque de construcción de hidroxietilenglicina-C fue acoplado en el último ciclo, con I este bloque de construcción ' ! reaccionando sucesivamente dos veces con el espaciador 18 I ¡ fosforamidita 9, el modificador de amino 5 fosforamidita 12 y finalmente con lexitropsina de la fórmula VII mientras se somete a activación con reactivos de acoplamiento de péptido, por ejemplo HBTU. El acoplamiento de un modificador de amino permite la introducción subsecuente de un residuo adicional, que puede ser introducido en forma de un derivado de ácido carboxílico activado. En cuanto a este asp 1ecto, es también I posible, por ejemplo, utilizar isotiocianatos y esteres de N-hidroxisuccinimida.

! ' ) Fórmula ' VII Las Figuras 5á y 5b muestran algunos ejemplos de tipos de ! .' ! » compuesto para la modificación de la terminal N de los ; i j compuestos de la fórmula I. El tipo de compuesto A se obtiene mediante la reacción del grupo hidroxilo terminal del PNA con I ' ' i . el reactivo de fosforilación 1. Un tipo de compuesto B se l obtiene mediante la reacción del grupo amino terminal del PNA i con la biotina-fosforaínidita , 5. El tipo de compuesto C se obtiene haciendo reaccionar sucesivamente el PNA que tiene un grupo hidroxilo í terminal con , el espaciador 18 fosforamidita 9, modificador ? de amino 5 fosforamidita 12 y lexitropsina. Un I tipo de compuesto D se obtiene mediante la reacción sucesiva del PNA que tiene un grupo hidroxilo terminal con el espaciador 9 fosforamidita 8 y cianina-3 fosforamidita 10. Un tipo dé compuesto E se obtiene mediante la reacción sucesiva del PNA que tiene un grupo hidroxilo terminal con la fluoresceína-fosforamidita 4 bifuncional, el espaciador-9 fosforamidita 8, y el reactivo de fosforilacion.de C16 7. En un tipo de compuesto F se obtiene mediante la reacción del grupo amino terminal del PNA con ácido 4-hidroxibutírico cuya función hidroxilo es temporalmente protegido con un grupo Dmt, y mediante reacción subsecuente con la luoresceína- fosforamidita 3. Los pasos que deben ser efectuados adicionalmente como por ejemplo oxidación y eliminación y be a PNA- 8 a PNA-12 : •'SI -VNd :ei-VNd Sfr PNA- 16 ,en donde las secuencias de base en cada caso se describen a .través de las siguientes secuencias, SEQ ID No.53 5'-AACT-3' (PNA-1) SEQ ID No .54 5' -ACATCATGGTCG-3' (PNA-2) SEQ ID No.55 5' -CCACGATGATGT-3' (PNA-3) SEQ ID No.56 5' -GAGCCATGTATAGTGAC-3' (PNA-4) SEQ ID No.57 5' -TCGGTTTGAGATCTGG-3' (PNA-5) I SEQ ID No.58 5' -TATTCCGTCAT-3' (PNA-6, PNA-12, PNA-13,PNA-14,PNA-18) SEQ ID .No.59 5' -ACTGATGTAGTC-3' (PNA-7) SEQ ID No.60 5' -GCTGATGTAGTC-3' (PNA-8) 1 SEQ ID No.61 5' -GGTATGGGATAT-3' (PNA-9,PNA-11) SEQ ID I No.62 5' -TGAAGGAAGAGG-3' (PNA-10) SEQ ID,No.63 5' -GTTAGGGTTAG-3' (PNA-15,PNA-17) SEQ ID No.64 5'-CCCCTTCC-3' (PNA-16) en donde {POLI} se describe por la fórmula II y {BLOQUE} se1 describe en cada caso a través de la fórmula IIIA, y en I ' donde, ¡además, A y E son CH2 y D es (CH2)2, y z' en cada caso1 I i se desprende de la longitud de la secuencia del oligómero . > I I Ejemplo 1: Síntesis de cadena PNA i Los siguientes reactivos fueron utilizados para preparar la porción I de PNA: i 1. Reactivo de fosforamidita (0.1 M en acetonitrilo (ACN)) 2. Monómeros de Mmt-PNA y/o monómeros de Dmt-oeg-PNA (0.2 M en DMFrACN (1:1; v:v) ) 3. ACN anhidro (= 30 ppm de agua) 4. Ácido tricloroacético (3%) en diclorometano (DCM) 5. Anhídrido acético, 2,6-lutidina en THF (1:1:8; v:v:v); (Cap A) 6. N-Metilimidasol (16%) en THF; (Cap 3) 7. Solución de yodo (0.05 M) en THF, agua, piridina (7:2:1; v:v:v) 8. Solución de lavado (THF, agua, piridina (7:2:1; v:v:v) 9. Tetrazol (0.3 M) en ACN 10. BUT; 0.2 M en DMF: ACN (1:1; v:v) 11. DIPEA: 0.2M en DMF: ACN (1:1; v:v) _ ' 12. DMF (>99.5%) 13. Soporte de fase sólida: aminopropilo-CPG (550 Á) cargado con Mmt/hemisuccinato de aminohex-1-ilo • (para PNA-hexilamidas) . ' Los monómeros oeg protegidos con Mmt/acilo o Dmt/acilo fueron preparados como ya se describió (Breipohl, ¡ colaboradores (1997) Tetrahedron 53, 14671-14686) Lá carga de aminopropilo-CPG con el Mmt-hemisuccinato de aminohex-1-ilo también ha sido descrito (Will y colaboradores (1995) Tetrahedron 51, 12069-12082) . La síntesis de PNA fueron efectuadas en general en una escala de 2 a 5 µmoles. El siguiente ciclo fue utilizado para la síntesis de PNA: 1. Paso de lavado con ACN 2. Remoción de la protección del grupo Mmt o del grupo Dmt mediante el tratamiento con TCA al 3% en DCM; 110 sec. 3. paso de lavado con DMF/ACN (1:1) 4. Neutralización con DIPEA en DMF/ACN !1:1) 5. Acoplamiento en el bloque de construcción monomérico por preactivación (15 min) con monómero BUT/EIPEA/PNA (proporción 1:1:1, volumen total 450 µl) carga de la fase sólida y acoplamiento (45 min) 6. Paso de lavado con ACN 7. Tapa con anhídrido acético /N-metilinidazol 8. Paso de lavado con ACN 9. Nuevo ciclo Ej emplo 2 ; sintetización de fosfato- {a (oeg) act} -hex (PNA-1) i La porción de PNA es preparada mediante síntesis de fase sólida de conformidad con lo , descrito en el Ej emplo 2 (síntesis µmoles) . En el último ciclo, un bloque de construcción basado en hidroxietiiglicina (oeg) que tiene una adenina como la nucleobase es acoplado (Formula V A; en donde 1 TR es Dmt, U es oxigeno, u' es' 2, PG es anisoilo y B es i adenina) . Después de la eliminación del grupo terminal Dmt con TCA al 3%, la función hidrpxilo libre reacciona como reactivo de fosforilación 1 (Figura 4a) utilizando tetrazol como catalizador. Esta reacción emplea un exceso del reactivo > de fosforilación 1 (aproximadamente 25 veces) , en forma de una solución 0.3 M en acetonitrilo/tetrahidrofurano (1:1; v:v) y el tetrazol (aproximadamente 50 veces; 0.5 M en acetonitrilo) . Después de la condensación, la oxidación se efectúa empleando una solución de yodo ( 0 . 05 M en tetrahidrofurano/agua, piridina ( 7 : 2 : 1 ; v: v: v) ) . El PNA es después disociado del soporte, y los grupos protectores son removidos al mismo tiempo, mediante tratamiento con amoniaco concentrado a 50°C durante la noche. Se obtienen 83 OD (260 nm) . Entre estos, 40 OD son purificados per electroforesis en gel de poliacrilamida de preparación (PAA) . La banda del producto deseado es eluida con un amortiguador de tricarbonato de trietilamonio 0.2 M y remoción de sal a través de una columna Bond-Elut C18 (1 g) . Se obtienen 13.5 OD. El producto fue analizado por espectrometría de masa de | > ion negativo, que confirmó la masa calculada (calculada 1266.2; encontrada 1265.9). ' Ejemplo 3: Síntesis de fosfato-{a (oeg) ca tca tgg tcg}-hex (PNA-2) : La preparación se 'efectúa en la síntesis de 2 µmoles, de manera análoga a l!o descrito en el Ejemplo 2. Después de disociación con amoniaco, se obtienen 122 OD de producto 1 I crudo, con este i producto crudo siendo purificado por electroforesis a través de un gel 'de PAA al 15% se obtienen 27 OD. El producto fue analizado por espectrometría de masa de iones negativos, y se confirmó la masa calculada (calculada 3540.3; encontrada 3450.4). Ejemplo 4: Síntesis de fosfato-{s (oeg) ca cga tga tgt}-hex (PNA-3) | La preparación se efectúa en una . síntesis de 2 µmoles, de manera análoga a la descrito en el Ejemplo 2, con un bloque de construcción basado en hidroxietilglicina que tiene citosina como la nucleobase acoplado en el último ciclo . Después de disociación con amoniaco, se obtienen 12,4 OD de producto crudo, con este producto crudo siendo purificado por electroforesis a través de un gel de PAA al 15% . Se obtienen 19 OD. El producto fue analizado por espectrometría 'de masa de( iones negativos que confirmó la masa calculada (calculada 3450.3; encontrada 3450.1). Ejemplo 5: Síntesis de fosfato-{g (oeg) -ag cca tgt ata gtg I > ' ac}-hex (PNA-4) ? _ La preparación se efectúa, en la síntesis de 2 µmoles, de manera análoga a lo descrito en el Ejemplo 2, con uri bloque i ' de construcción basado en hidroxietilglicina que tiene i ! , , ? guanina como la nucíeobase acoplada1 en el último ciclo.

De pues de disociación con amoniaco, se obtienen 12 OD de i ' producto crudo. Se purificaron 60 OD, del producto crudo por ! I • ' eléctrjoforesis a través de un gel de 'PAA al 15%. Se pbtienen 10 OD., El producto fue analizado por, espectrometría de masa de io'nes negativos, _ lo que confirmó la masa calculada (calculada 4848.6; encontrada 4849.9) ., i ' Ejemplo 6: Síntesis de fosfato- {5 (oeg) cg gtt tga gat ctg g}- La ' preparación se efectúa, en una síntesis de 2 µmoles, de I ' manera, análoga a lo descrito en el Ejemplo 2, con un bloque de construcción basado en hidroxietilglicina que tiene1 timina como la nucleobase acoplando en el último ciclo . Después de la disociación con amoniaco, se obtienen 250 OD de producto crudo. Se purificaron 60 OD del , producto crudo por electroforesis a través de un gel de PAA al 15%. Se obtienen 22.9 OD. El producto fue analizado por .espectrometría de masa de iones negativos, lo que confirmó la masa calculada (calculada 4595.4; encontrada 4596.3). Ejemplo 7: Síntesis de fosfato- {t (oeg) at tcc gtc at}-hex r (PNA-6) La preparación se efectúa, en la síntesis de 0.5 µmol, de manera 'análoga a lo descrito en el Ejemplo 2, con un bloque de construcción basado en hidroxietilglícina que tiene timina como lá nucleobase conectado en el último ciclo. Después de disociación con amoniaco, se obtienen 64 OD de producto crudo. Se purificaron 30 OD del ¡ producto crudo por electroforesis a través, de un gel de P£|A al 15% . Se obtienen ! 4.2 OD. El producto fue analizado por espectrometría de masa de iorfes negativos, lo que confirmó la masa calculada (calculada 3124.5; encontrada 3124.8) . ¡ Ejemplo 8 : Síntesis de ,biotina-p- {act gat gta gtc} -hex (PNA-7) ; La porción de PNA es preparada mediante síntesis de fase sólida de conformidad con lo descrito en el Ejemplo 1 (síntesis de 2 µmoles) en el último ciclo, un bloque de construcción de PNA normal, que tiene adenina como la nucleobáse, es acoplado (Formula VA; en donde TR es Mmt, U es NH, u' es 2, PG es anis?lilo y B es adenina) . Después de la eliminación del grupo de Mmt terminal con TCA al 3%, la función de amino libre reacciona con biotina-fosforamidita 5 (Figura 4b) utilizando . tetrazol como catalizador. Esta reacción emplea un exceso del reactivo de fosforilación (aproximadamente 10 veces) como una solución 0.12 M en acetonitrilo y el tetrazol (aproximadamente 5 veces; 0.5 M en 1 acetonitrilo) . Después de la condensación, se efectúa la oxidación empleando una solución de yodo (0.05 M en tetrahidrofurano/agua, pi,ridina (7 : 2 : 1; v:v:v) ) . Después de disociación con amoniaco', se obtiene 288 OD del producto crudo. El producto crudo .fue purificado por electroforesis a través de un gel de PAÁ al 15%, se obtienen 17.5 OD. El producto fue analizado por espectrometría de masa de iones negativos, lo que confirmó la masa calculada (calculada I 3806.8; encontrada 3807.2) . Ejemplo 9: Síntesis de biotina-p-{g(oeg)-ct gat gta gtc}-hex (PNA-8) 1 La porción de PNA es preparada por sintesis de base sólida de conformidad con lo descrito en el Ejemplo 1 (1 µmol) . Un bloque de construcción basado en hidroxietilenglicina que tiene guanina como la nucleobase (formula V A; en donde TR es Dmt, U es oxigeno, u' es 2, PG es anisoilo y B es guanina) es acoplado en el último ciclo. Después de eliminar el grupo Dmt terminal con TCA al 3%, la función hidroxilo libre reacciona con biotina-fosforamidita 5 (Figura 4b) utilizando tetrazol como catalizador. Esta reacción emplea un exceso del reactivo de fosforilación (aproximadamente 10 veces) como una solución 0.12 M en acetonitrilo y el tetrazol (aproximadamente 50 veces; 0.5 M en acetonitrilo). Después de la condensación, la oxidación es efectuada empleando una solución de yodo (0.05 M en tetrahidrofurano/agua, pridina I (7:2:1; v:v:v)). Después de disociación con amoniaco, se obtienen 63 OD de producto crudo. El producto crudo fue purificado Ror electroforesis a través de un gel PAA al 15%.

Se obtienen 11.2 OD. El producto fue analizado por espectrometría de masa de iones negativos, que confirmó la masa calcul 'a1da (calculada 3806.8; encontrada 3807.2). Ejemplo 10 : ¡Síntesis de biotina-p- {g (oeg) gt atg gga tat }-hex (PNA- 9) ¡ I La preparación fue efectuada en una síntesis de 2 µmoles, de manera análoga a lo descrito en el Ejemplo 9, con un bloque de construcción basado en hidroxietilglicina que tiene guanina como la nucleobase acoplado en el último ciclo. El residuo de biotina fue introducido con biotina-fosforamidita 5 (Figura 4b) . Después de disociación con amoniaco, se obtienen 247 OD de producto crudo. El producto crudo fue purificado por electroforesis a través de un gel de PAA al 15%. Se obtienen 25.8 OD. El producto fue analizado por espectrometría de masa de iones negativos, que confirmó la masa calculada (calculada 3870.8; encontrada 3869.7). Ejemplo 11: Síntesis de biotina-p-{t (oeg) ga agg aag agg} -hex (PNA-10) La preparación fue efectuada, en una síntesis de 2 µmoles, de manera análoga a lo descrito en el Ejemplo 9, con ún bloque de construcción basado en hidroxietilglicina que tiene timina como la nucleobase, acoplado en el último ciclo. El residuo de biotina fue introducido con biotina-fosforamidita 5 , i (Figura 4b). Después de disociación con amoniaco, se ¡obtienen , 190 OD de producto crudo. El producto crudo fue purificado por electroforesis a través de un gel de PAA al ¡ 12%. Se obtienen 29 OD con el peso molecular esperado (calculado 3913.9; encontrada 3913.7) . , ¡ Ejemplo 12: Síntesis de biotina-p- {g (oeg) -gt atg gga tat}-hex ' I , (PNA-11) j La preparación fue efectuada, en una síntesis de 2 µnjoles, de manera análoga a lo descrito en el Ejemplo 9, con un bloque de construcción basado en hidroxietilglicina qµ'e tiene guanina como la nucleobase, acoplado en el último ciclo. El , residuo de biotina fue introducido con biotina-fosforamidita 5 (Figura 4b) . Después de disociación con amoníaco, se obtienen 162 OD de producto crudo. El producto crudo fue ¡ purificado por electroforesis a través de un gel de PAA al 12%. Se obtienen 21 OD. El producto fue analizado por espectrometría de masa de iones negativos, lo que confirmó la masa calculada (calculada 3870.8; encontrada 3870.8) . Ejemplo 13 : Síntesis de biotina-p- { 5 (oeg) at tcc gtc at } -hex (PNA-12) La preparación fue efectuada, en una síntesis de 0.5 µmol , de manera análoga a lo descrito en el Ej emplo 9, con un bloque de construcción basado en hidroxietilgiicina que tiene timina como la nucleobase, acoplado en el último ciclo. El residuo de biotina fue introducido con biotina-fosforamidita 5 ¡ (Figura 4b) . Después de disociación con amoniaco^ se qbtienen 67 OD de producto crudo. El producto crudo fue purificado por i 1 electroforesis a través de un gel de PAA al 12%. Se obtienen 8.5 OD. El producto fue analizado por ¡¡espectrometría 'de masa de iones negativos, lo que confirmó la masa calculada (calculada 3449.5; encontrada 3449.9) . 'j i Ejemplo 14: Síntesis de hexadecilo-O-p t (oeg) at tcc gtc at}- ! I hex (PNA-13) ¡ La preparación fue efectuada, en una síntesis de 0.5 µmol, de manera análoga a lo descrito en el, Ejemplo 9, con un, bloque de construcción basado en hidroxietilglicina que tiene? timina i como nucleobase, acoplado en el último ciclo. El residuo de hexadecilo fue introducido con un reactivo de fosforilación C16 7 (Figura 4c) . Después de disociación con amoniaco, se t obtienen 58 OD de producto crudo. El producto crudo (30 OD) fue purificado por electroforesis a través de un gel de PAA al 12%. Se obtienen 2 OD con el peso molecular esperado (calculado 3349.4; encontrada 3349.7). Ejemplo 15: Síntesis de fluoresceína-p-{t (oeg) at tcc gtc at}- hex (PNA-14) La preparación fue efectuada, en una síntesis de 0.5 µmol, de manera análoga a lo descrito en el Ejemplo 9, con un bloque de construcción basado en hidroxietilglicina que tiene timina como la nucleobase, acoplado en el último ciclo. El residuo de fluoresceína fue introducido con fluoresceína- , í fosforamidita 3 (Figura 4a) . Después^ de disociación con amoniaco, se obtienen 62 OD de producto crudo. El producto ag} -hex (PNA-15) i La preparación se efectuó, en la síntesis de 1 µmol, de manera análoga a lo descrito en el Ejemplo 9, con un bloque de construcción basado en hidroxietilglícina que tiene timina como la nucleobase, acoplado en el último ciclo. El espaciador 9 fue , introducido con fosforamidita 1 i correspondiente 8 (Figura 4c) . Después de disociación con amoniaco, se obtienen 52 OD de producto crudo. El producto crudo (30 OD) fue purificado por electroforesis a través de un gel de PAA al 15%. Se obtienen 1.8 OD. El producto fue analizado por espectrometría de masa de iones negativos, que confirmó la masa calculada (calculada 3402.3; encontrada 3401.8). Ejemplo 17: Síntesis de lexitropsina-aminoenlaceC5-p-espaciadorC18-p-espaciadorC18-p-{c (oeg) -c cct tcc}-hex (PNA- 16; en donde c es un bloque de construcción de PNA de pseudo-iso-citosina) i ' La preparación fue efectuada, en una síntesis de 1 µmol, de manera análoga a lo descrito en el Ejemplo 9, con un bloque ' 1 de construcción basado en hidroxietilglicina que tiene i ' citosina como la nucleobase, acoplado en el último ciclo.

Después de esto, el espaciador-18 fosforamidita 9 'es condensado j dos veces sucesivamente y el aminomodificado¡-5 fosforamidita 12 (Figura 4d) es después condensado una ve,z.

Después de ¡ las reacciones de acoplamientos el grupo Dmt y/o Mmt fue eliminado en cada caso por tratamiento con ácido tricloracét'ico al 3%. Con el objeto de acoplarse con a lexitropsiría, 300 µl del éster activo correspondiente, ! preparado a partir de ácido lexitropsincarboxílico 0.1 M, TBTU 0.1 M y diisopropiíetilamina 0.4 M; 1:1:1 = v:v:v; ) preactivacipn de 30 minutos) se agregan y la mezcla se deja 1 i ' reaccionar . durante 3 horas. El lavado se efectúa después empleando DMF. Después de disociación con amoniaco, se obtienen 43, OD de producto ' crudo. El producto crudo 35 OD fue purificado por electroforesis a través de un gel de PAA al 15%. Se obtienen 5.3 OD. El producto fue analizado por espectrometría de masa de iones negativos, que confirmó la masa calculada (calculada 3583.5; encontrada , 3583.1) . '5 Ejemplo 18: Determinación de las temperaturas de fusión , Las temperaturas de fusión fueron determinadas empleando un espectrofotómetro de conjunto de diodos HP 8452A, un elemento HP 89090A Peltier y una Programática de Control de ! i Temperatura ^P Rev. B5.1 (de Hewlett Packard). La medición se 0 efectúa en' incrementos de 0.5°C/min en KCl 140 mM, 1 dihidrogenfosfato de sodio 10 mM, EDTA 0.1 mM (pH 7.4) como ! amortiguador. La concentración de oligómero es de 0.5 a 1 ' ' ! OD260 por ml . I De manera sorprendente, los derivados de ÉNA-6 y PNA-12 a i5 PNA-14 modificados con fosforilo presentaron un mayor grado ! I de enlace c ion el ARN y ADN complementario que el PNA sin i cambio (sustancia de referencia) . 1 ¡ Derivado de PNA T (ADN) tm (ARN) Referencia Ac-HN-tat tcc gtc, at-hex 4 ? . 9°C 56. . 6°C ¡ 0 PNA-6 p!-{t(oeg)-at tcc gtc at}-hex 44 . 0 °C 57 . . 5 °C ; PNA-13 Hexadecilo-0-p-{t(oeg)at tcc 46.7 °C 58 . . 9°C , gtc at-hex ¡ PNA-14 Fluoresceína-p-ít(oeg)at tcc 42.5°C 56.7°C : gtc at}-hex 5 PNA-12 BÍotina-p-{t(oeg)at tcc gtc 43.6°C 57.9°C at } -hex Ejemplo 19 : Determinación de absorción celular después de marcado con fluorescencia Se dejó crecer células COS hasta confluencia en MEM de, Dulbecco (DMEM) , que había sido complementado con FCS al 10%, en cajas de Petri de 5 cm. Las células son lavadas dos veces, 1 con DMEM sin suero. Se rasga un área de aproximadamente 1 cm2 en la parte media de la caja de Petri utilizando una aguja estéril. La solución de PNA (10 µM) bajo investigación es aplicada a esta área. La caj'a es incubada a una temperatura de 37°C bajo1 una atmósfera de C02. Después de 2, 4 y 16 i horas, las células son examinadas por microscopía de fluorescencia.' Para este propósito, las células son lavadas cuatro vecßs bon DMEM sin suero, cubiertas con una tapa de I recubrimiento y evaluadas bajo el microscopio de ' ! i fluorescencia ¡o bien mediante, contraste de fase. Con el objeto de investigar ?a absorción de células, PNA-6 y PNA-13 son etiquetados fluoresceína en la terminal C y después examinados microscópicamente. p-{t(oeg)-at tcc gtc at}-fluoresceína hexadecilo dé fluoresceína-0-p-{t (oeg) at tcc gtc at}-fluoresceína , 1 i en cuanto a eßte aspecto, se encontró que el derivado de DNA modificado con hexadecilo (PNA-13) fue absorbido con mayor eficiencia en las células.

Ejemplo 20: Inhibición de la proliferación de células con PNA-13 La secuencia de PNA-13 es enfocada contra el inicio de la t traducción de ARNm de Ha-ras. Células REH .(células pre- 5 leucemia B de ser humano, DSM ACC 22) o ' bien células tumorales A5 9 fueron cultivadas, a una temperatura de 37°C y bajo una atmósfera de C02 al 5%, en OptiMEM (Gibco BRL) que ' contiene suero fetal de becerro al 10% (FCS, GIBCO-BRL) . La 1 ' densidad celular para el ensayo fue de aproximadamente 1 x 10 ¡ 106 ml. El PNA-13 (10 µM) fue incubado con l,as células en 1 placas de 24 posos. Después de la incubación a una i ' Í temperatura de ' 37 °C y bajo una atmósfera de C02 ' al 5% durante , 1 I 96 horas, se determinó la densidad celular. V i alores medios ' para la densidad celular fueron determinados partir de 3 • I ' ' i 15 posos individuales a una concentración dada, de PNA. Se ! I j encontró que P?A-13 inhibe la proliferación de las células i REH. Después de > de 4 días ¡ de incubación, .la inhibición ' provocada por P?A-13 es mayor que la inhibición' provocada por un oligonucleotido de fosforotioato correspondiente . 20 . Ej emplo 21. Sirjtesis de HO-espaciador9-p- { gtt agg gtt ag} -hex ; (P?A-17) ! , La preparación fue efectuada, en la síntesis de ' 0. 67 µmol , de . manera análoga a lo descrito en los Ejemplos 9 y 16, con un : bloque de construcción normal de 2-arrtinoetilglicina, que 25 , tiene timina cómo nucleobase, acoplado en el último ciclo de la síntesis de PNA. El espaciador 9 fue introducido subsecuentemente utilizando , la fosforamidita 8 correspondiente (Figura 4c) (tiempo de reacción 3 x 5 min) . Después de disociación con amoniaco, se obtienen 108 OD de producto crudo. El producto crudo fue purificado por 1 electroforesis a través de un gel de PAA al 15%. Se obtienen 5.7 OD. El producto fue analizado por espectrometría de masa de iones negativos, que confirmó la masa calculada (calculada 3401.3; encontrada 3399.8). Ejemplo 22: Síntesis de tiofosfatp-{t (oeg) -at tcc gtc at}-hex (PNA-18) í.a preparación se efectúa en la síntesis de 1 µmol, de manera análoga a los Ejemplos descritos 2 y 7, con un bloque de construcción basado en hidroetilglicina que tiene timina como 1 lja nucleobase, acoplado en el | último ciclo. Después de I . i e¡liminar el grupo Dmt terminal con TCA al 3%, la función h'idroxilo libre reacciona con el reactivo de fosforilación 1 (Figura 4a) utilizando tetrazol Como catalizador. Después de terminar la condensación, la oxidación es efectuada empleando 1 el reactivo Beaucage (1, 1-dióxido , de 3H-l,2-benzoditiol-3-ona 0,.075 M en acetonitrilo) con el objeto de introducir la función tio. Después de disociación con amoniaco, se obtienen 1 66.5 OD del producto crudo. 61 0I¡ del producto crudo fueron purificados por electroforesis a través de un gel de PAA al 15% . Se obtienen 12.4 OD. El producto fue analizado por espectrometría de masa de iones negativos, que confirmó la masa calculada (calculada 3141; encontrada 3140) . Lista de Abreviaturas: ACN acetonitrilo BOC terc-butiloxicarbonilo C,c Pseudo-iso !-citosina COS, SV40 origen de CV1 CPG vidrio con poros controlados DCM diclorometano DIPEA diisopropiletilamina DMEM MEM de Dulbecco 1 DMF' dimetilformamida Dmt, dimetoxitr'itilo DNA' ácido desoxiribonucléico DNP dinitroari|lo FITC isotiocianato de fluoresceína Fmoc f luorenilmetoxicarbonilo HATÚ hexafluorofosfato de O- (7-azabenzotriazol-l-il) - 1, 1, 3, 3-tetrametiluronio BUT hexafluorofosfato de O- (benzotriazol-1-il) -1, 1, 3, 3- tetrametilronio Hex -NH- (CH2) 6-OH MEM medio esencial mínimo de Eagle modificado Mmt monometoxitritilo OD densidad óptica Oeg ' N- (2-hidroxietil) glicina PAA , poliacrilamida PG grupo protector PNA ácido nucleico de poliamida PNA ácido ribonucleico TBTU tetrafluoroborato de 0- (benzotriazol-1-il) -1,1,3,3- tetrametiluronio TCA ácido tricloroacético THF tetrahidrofurano TR , grupo protector lábil para ácidos Las Figuras la, lb, 2b y 3b muestran ejemplos de radicales Z terminales. • Las tiguras 2a y 3a muestran ejemplos de radicales X de puente. ! i Las .Figuras 4a, 4b, 4c y 4d muestran ejerplos de reactivos de I I fosforilación. j Las Figuras 5a y 5b muestran ejemplos de derivación de ?-terminal única (A, B) y múltiple (C a F) ce P?A.

LISTA DE SECUENCIAS <110> Aventis Pharma Deutschland GmbH <120> DERIVADOS DE ÁCIDO NUCLEICO DE PÉPTIDO CON CARGA NEGATIVA, AGENTES Y MÉTODOS PARA SU PREPARACIÓN <130> AVE D-2000/A022 <140> 10019136.3-43 <141> 2000-04-18 <160> 64 <170> PatentIn Ver. 2.1 ¡ <210> 1 <211> 21 i <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> ! ' I <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (21) <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <400> 1 gcgtttgctc ttcttcttgc g <210> 2 <211> 15 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> ' <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (15) <220> <223> Descripción de la secuencia artificial : oligonucleótidos <400> 2 aacgttgagg ggcat <210> 3 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de lá secuencia artificial : oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (18) <400> 3 gtgccggggt cttcgggc <210> 4 <211> 17 <212> AD? <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial : - r oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (17) <220> <400> 4 cgagaacatc atcgtgg <210> 5 <211> 21 <212> ADN i <213> Secuencia artificial <220> ' <223> Descripción de la secuencia artificial: • I oligonucleótidos ' ' i I <220> ¡ <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (21)¡ <400> 5 ggagaacatc atggtcgaaa g ! <210> 6 ¡ ! <211> 21 . ¡ <212> ADN ', <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <2¿1> enlace misceláneo <222> (1) .. (21) <400> 6 ggagaacatc atggtcgaaa g <210> 7 ! > ' <2ll> 20 <212> ADN ) <213> Secuencia artificial <220> de la secuencia artificial: o gonuc e t os . í <220> I j <22l> enlace misceláneo <222> (1) .. (20 ' <40¡0> 7 gggaaagcc cggcaagggg i <210> 8 : <2Í1> 20 ! ¡<2Í2> ADN i <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción' de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (20) <400> 8 cacccgcctt ggcctccac . <210> 9 ) <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial , <220> <223> Descripción de la secuencia artificial : oligonucleótidos > <220> ¡ <221 enlace misceláneo ¡ <222> (1) .. (18) ¡ <400:> 9 ] gggactccgg cgcagcgc • ¡ <210> 10 <211 20 <212> ADN ¡ <213> Secuencia artificial <220> ! <223> Descripción de la secuencia artificial ; oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (20) <400> 10 ggcaaacttt cttttcctcc <210> 11 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: I oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo! <222> (1) .. (19) | I <400> 11 I gggaaggagg aggatgagg <210> 12 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1)¡ .. (20) <400> 12 acacccaatt ctgaaaatgg <210> 13 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> pescripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos 1 <220> <221> enlace misceláneo <222> (1)¡ .. (21) <400> 13ggcagtcatc cagcttcgga g <210> 14 ' <211> 18 , <212> ADN' <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial : oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (18) <400> 14 tctcccagcg tgcgccat <210> 15 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos , <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (19) <400> 15 gcgctgatag acatccatg , <210> 16 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> , <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (12) <400> 16 ggaggcccga cc <210> 17 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (12) <400> 17 ggtttcggag cc <210> 18 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (12) <400> 18 tggtggaggt ag <210> 19 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción , de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (12) <400> 19 i gcatggtgga gg I <210> 20 ' <211> 12 ¡ I <212> ADN i <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción ¡ de la secuencia artificial : oligonucleótidos ¡ <220> <221> enlace misceláneb <222> (1) .. (12) ¡ <400> 20 ttggcatggt gg <210> 21 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> ¡ <223> Descripción de la secuencia artificial : oligpnucleótidos <220> <221> enlace misceláneo ! <222> (í) .. (12) <400> 21 gcctgggacc ac ! <210> 22 ! <211> 1¿ <212i> A?N • I <213> Secuencia artificial <220í> ¡ , <223> Descripción ' de la secuencia artificial : oligpnucleótidos <220> ' i <221> enlace misceláneo! <222> ( 1 ) . . ( 12 ) <400> 2 cagcctggga cc <210> 23 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial , <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: 5 oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) '.. (20) <400> 23 0 aggtccctgt tcgggcgcca , i <210> 24 i <211> 12 ' ¡ 1 <212> ADN 1 <213> Secuencia artificial ' I ' . 5 <220> , , I i ¡ ! <223> Descripción de la secuencia artificial oligonucléótidos <220> <221> enlace misceláneo 0 <222> (1) ;.. (12) ; <400> 24 ¡ ¡ tgcagcctgg ga <210> 25 <211> 12 5 <212> ADN ' <213> Secuencia artificial <220> , <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo ! <222> (1) .. (12) 1 <400> 25 gtgcagcctg gg 1 » <210> 26 1 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial ' 1 <220> <223> Descripción de | la secuencia artificial: oligonucleótidos 1 <220> ' <221> enlace misceláneo <222> (1) .., (12) 1 : <400> 26 ggtgcagcct gg <210> 27 <211> 12 1 <212> ADN ' <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> I <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (12) <400> 27 I atgggtgcag cc <210> 28 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial , t <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: I oligonucleótidos I <220> I <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (12) <400> 28 1 ggcttgaaga tg , <210> 29 <211> 12 <212> ADN ¡ <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (12) <400> 29 gcagcccccg ca <210> 30 <211> 12 , <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos ,' <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (12) <400> 30 cgcagcagccc cc , <210> 31 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> • <223> Descripción de la secuencia artificial': oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (20 <400> 31 tcccgcctgt gacatgcatt <210> 32 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (20 <400> 32 gttctcgctg gtgagtttca <210> 33 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (8) <400> 33 gcgtgcctcc tcactggc <210> 34 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (20 <400> 34 gcggggctcc atgggggtcg <210> 35 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuen?ia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (18 <400> 35 gcagtaagca tccatatc <210> 36 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de ' la secuencia artificial: 1 oligonucleótidos i <220> : I <221> enlace misceláneo <222> (1 ) . .' (20 ) • I <400> 36 i ¡ gcccaagctg atccgtca <210> 37 <211> 20 , ! <212> ADN <213> Secuencia artificial ! <220> , . ! <223> Descripción de la secuencia artificial: ¡ oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (20) <400> 37 cccccaccac ttcccctctc <210> 38 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial ' <220> í 1 <223> Descripción de la secuencia artificial: , oligonucleótidos i <220> i i <221> enlace misceláneo > 1I <222> (1) .. (20) 1 <400> 38 I i ctcccccacc acttcccctc • ! ¡ ¡ <210> 39 I <211> 19 1 <212> ADN 1 <213> Secuencia artificial <220> ; ¡ <223> Descripción de la secuencia artificial ¡ oligonucleótidos ! <220> : <221> enlace misceláneo . <222> (1) .. (19) <400> 39 gctgggagcc atagcgagg <210> 40 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: 1 oligonucleótidos <220> 1 <221> enlace misceláneo '<222> (1) .. (21) i <400> 40 actgctgcct cttgtctcag g <210> 41 I <211> 22 '<212> ADN <213> Secuencia artificial <220> ;<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (22) <400> 41 caatcaatga cttcaagagt te <210> 42 <211> 18 <212> ADN 1 <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: 1 oligonucleótidos <220> 1 <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (18) 1 <400> 42 . i gcggcggaaa agecateg <210> 43 <211> 18 j i <212> ADN I <2Í3> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (18) ' <400> 43 gtgtcggggt ctccgggc <210> 44 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo I <222> (1) .. (15) <400> 44 cacgttgagg ggcat <210> 45 • I <213> Secuencia artificial <220}> <223> Descripción de la secuencia artificial; oligónucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (15) <400> 45 cagctgcaac ccagc <210> 46 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (18) <400> 46 gtcttccata gttactca <210> 47 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> ._ <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (18) <400> 47 gatcaggcgt gcctcaaa <210> 48 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial : oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (27 <400> 48 gatggagggc ggcatggcgg g <210> 49 <211> 4 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la i secuencia artificial; oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (4) <400> 49 aact <210> 50 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial; oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (12 <400> 50 actcatggt cg <210> 51 <211> 12 , , i <212> ADN : , 1 <213> Secuencia artificial <220> ' I <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos ¡ <220> i <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (12) <400> 51 , ccacgatgat gt <210> 52 , <211> 17 ' [ <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (17) <400> 52 gagccatgta tagtgac <210> 53 , <211> 16 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial; | oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (16) <400> 53 , tcggtttgag atctgg <210> 54 <211> 11 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (11) <400> 54 tattccgtca t <210> 55 ' <211> 12 . , <212> ADN <213> Secuencia artificial ' <220> , i <223> Descripción de la ßecµencia artificial oligonucleótidos I <220> <221> enlace misceláneo | <222> (1) .. (12) ; <400> 55 ¡ actgatgtag te <210> 56 <211> 11 ¡ <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (11) <400> 56 tattccgtca t <210> 57 <211> 12 I I <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> i <223> Descripción d'e la secuencia artificial: oligonucleótidos . <220> ' ! <221> enlace misceláneo ' i I i <222> (1) .. (12) ' | <400> 57 í gctgatgtag te ¡ <210> 58 <211> 12 , : I <212> ADN i <213> Secuencia artificial 1 <220> ¡ <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (12) <400> 58 ggtatgggat at <210> 59 , <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial; oligonucleótidos <220> ! <221> enlace misceláneo I <222> (1) .. (12) I <400> 59 ¡ tgaaggaaga gg <210> 60 ; <211> li <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> ¡ <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (11) <400> 60 gttagggtta g <210> 61 <211> 8 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: ¡ oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (8) ! <400> 61 ' I ccccttcc <210> 62 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (22) <400> 62 ttccgtcatc gctcctcagg gg <210> 63 <211> 15 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220í> <221> enlace misceláneo , 1 <22,2> (1) .. (15) <400^> 63 I ggctgccatg gtccc I <21'0:> 64 <211> 21 <213> Secuencia artificial <220> <223 Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos <220> <221> enlace misceláneo <222> (1) .. (21) <400> 64 ggctgctgga gcggggcaca c

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Un derivado PNA de la fórmula I Fórmula I en donde , ' - i V es oxígeno, azufre, NRa, un grupo U- (CR3R4 ) u' -C (0) -NH I o un grupo U- (CH2CH20) u.-CH2-C- (O) -NH, U es, independientemente entre ellos, oxígeno, azufre o NH, ¡ 1 i u' es, independientemente entre ellos, de ' 1 a 10, de I I preferencia de 1 a 4 , de manera particularmente i preferible 1, W, es, independientemente entre ellos, oxígeno, azufre o NRi, Y es, independientemente ' entre ellos, hidroxilo, mercapto, oxianión, tioato o NR^, Ri y R2 son, independientemente entre ellos, un radical I que consiste de hidrógeno, o alquilo Ci-Cß, de preferencia hidrógeno, R3 y R4 son, independientemente entre ellos, , un radical que consiste de hidrógeno o alquilo Ci-Cß, o bien el radical de una cadena lateral de aminoácidos, de preferencia hidrógeno, X es, independientemente entre ellos, un grupo U- (alcandiilo C2-C22) -U o bien un grupo U- (CH:CH2-0) u> , o bien X es un grupo marcador, bifuncional, seleccionado de preferencia dentro del grupo que consiste de 1 derivado de fluoresceína, rodamina, TAMRA, biotina, pireno, dinitrofenilo, acridina, colorante de cianina, i > Dabcyl, digoxigenina, o Edans, especialmente un derivado de biotina, o bien X es u? grupo bifuncional para reticulación con ácidos nucleicos complementarios, de preferencia un derivado de ps ralen, o bien X es un grupo bifuncional que promueve la absorción intracelular, seleccionado de preferencia dentro del ¡ grupo que consiste de colesterilo, 1 adamantilo, y derivados de la vitamina E, o bien X es ¡un grupo bifuncional que incrementa la afinidad de unión del derivado de PNA por un ácido nucleico blanco, de preferencia derivados de acridina y lexitropsina, Z es hidroxilo, mercapto, o !xianión, tioato o bien I NR?R2, alquilo C?~C22, arilalqµilo C?-C8, alquilo C?-C22-U, arilquilo Ci-Cs-U, hidroxi-C?-C:3-U, aminoalquilo-U o mercaptoalquilo-U, o un grupo de la fórmula R? (CHCH;-0) m, en donde Rg es hidroxilo, amino o bien alcoxi C?-C22, y m es de 1 a ,100, de preferencia de 2 a 10, 0 bien Z es un grupo marcador monofuncional o bifuncional, seleccionado de preferencia dentro del grupo que consiste de derivado de fluoresceína, rodamina, TAMRA, biotina, pireno, dinitrofenilo, acridina, colorante de cianina, Dabcyl, ! digoxigenina, o, Edans, especialmente un derivado de biotina, ' , . b bien Z es un grupo monofuncional o bifuncionq.1 para I ' ireticulación, de preferencia un derivado de psorálen, ' o bifuncio?al que , seleccionado de que consiste de de la vitamina E, ?> bien Z es un grupo monofuncional o bifuncional que incrementa la afinidad de unión del derivado de PNA por un ácido nuclei?o blanco, de preferencia un derivado de 1 i lexitropsina, n es de 0 a 10, de preferencia de 0 a 3, ¡ Q es hidroxilo, amino, NHR-, NRtRs, un derivado de i ' aminoácido o un radical de péptido, R.7 y Rs son, independientemente entre ellos, alquilo Ci- Ciß o bien hidroxialquilo Ci-Cia, y en donde {POLI} se describe a través de la fórmula II 1 Fórmula II donde {BLOQUE}, es independientemente entre ellos, un qrupo descrito por la fórmula IIIA, Fórmula IIIA o bien por la fórmula 11IB Fórmula IIIB o bien por las fórmulas IV A a IV Fórmula IV A Fórmula IV B Fórmula IV C Fórmula IV D Fórmula IV E Fórmula IV F en donde cada bloque, de construcción {BLOQUE } puede ser diferente, y en donde además z' es de 0 a 100, de preferencia de 1 a 20, especialmente de 4 a 15, A es, independientemente entre ellos, un grupo (CR?R2) s, en donde s es de 1 a 3, de preferencia 1, B es, independientemente entre ellcs, o bien un radical aromático que puede poseer también un carácter heteroaromático, o bien hidrógeno, o bien hidroxilo o bien alquilo QL-CIS, o bien una nucleobase que ocurre naturalmente, y es habitual en la química de los nucleótidos, o bien que no ocurre naturalmente, o bien su forma de profármaco, en donde por lo menos un radical B en la fórmula II es una nuqleobase, D es, independientemente entre ellos, un grupo (CR3R) , en donde t es de 2 a 10, de preferencia de 2 a 4, de manera 'particularmente preferida 2, en don< e dos radicales R3 y R adyacentes pueden formar tambié? un anillo cicloalquilo C5-C;, E es, i independientemente entre ellos, un grupo 1 (CR5R6) 4' , en donde dos radicales R5 y Re adyacentes pueden - formar también un anillo cicloalquilo C5-C8 o bien un compuesto espiro, R5 y Re son, independientemente entre ellos, un radical que consiste de hidrógeno o alquilo C?~C6, de preferencia hidrógeno, o bien una cadena lateral de aminoácidos, y también sales fisiológicamente toleradas del derivado de PNA de la fórmula I, a condición que por lo menos un radical Y o Z sea hidroxilo, percapto, axianión o tioato. 2. Un derivado de PNA de conformidad con la reivindicación 1, en donde por lo menos un radical Y o Z en la fórmula I es un oxianión o tioato en un rango de pH de 4.5 a 14, de preferencia de 6.5 a 12, con preferencia particular de 6.5 a 9. 3. Un derivado de PNA de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde D es (CH)2. 4. Un derivado de PNA de conformidad con cualesquiera de , las reivindicaciones 1 a 3, en donde A y E son CH2. 5. Un derivado de PNA de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde Q es un ¡ radical i hidroxiaminoalquilo, de preferencia un , radical i hidroxiaminohexilo, o bien es una secuencia portadora, j de preferencia trasportano, factor de crecimiento de tipo insulina, señales de localización nuclear: o bien una etiqueta de afinidad, de preferencia una cadena (His)6. 6. Un derivado de PNA de conformidad con cualesquiera de , las reivindicaciones 1 a 5, en donde B es adenina, citosina, 5-metilcitosina, guanina, timina o uracilo, o bien es purina, 2, 6-diaminopurina, N4N4-etanocitosina, N6N6-etano-2, 6-diaminopurina, 5- (alkiniluracilo (C3-C6) , 5-alquinilcitosina (C3-C6) , 5- (1-propargilamino) uracilo, 5- (1-propargilamino) citosina, fenoxasina, 9- aminoetoxifenoxazina, 5-fluorouracilo o bien pseudoisocitosina, 5- (hidroximetil) uracilo, 5-a inouracilo, pseudouracilo, diidrouracilo, 5-alquiluracilo (Ci-Cß) , 5-alquilcitosina (Ci-Cß) , 5-alquenilcitosina (C2-Ce) , 5-fluorocitosina, , 5-clorouracilo, 5-clorocitosina, 5-bromouracilo, 5- I bro ocitosina, 7-dezazaadenina, , 7-deazaguanina, 8-azapurina, o bien una purina 7-deaza-7-sustituida. Un derivado de PNA de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde W es oxígeno y Y es hidroxilo u oxianión . ( Un derivado de PNA de conformidad con cualesquiera de i las reivindicaciones 1 a 7, en dqnde X es un grupo U- (alcandiilo C2-C22)-U, de preferencia 0- (alcandiilo C2-C22)-0, de manera particularmente ¡preferida 0-(CH2)2-6?, o bien un grupo U- (CH2CH-0) n> , de i preferencia 0(CH2CH2-0) u' , en donde u' es de preferencia' de 1 a 6. Un derivado de PNA de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde Z es un fosfato o bien un radical Ci a C22, o bien un radical C?-C22-U, de preferencia un radical alcoxi , C?-C2, de manera I particularmente preferida alcoxi Cíe o bien hidroxi-U- •* • i Ci-Cis, de preferencia hidroxi-O-Ci-Cis, de manera particularmente preferida HO- (CH:) 3-?cO, o bien un radical aminoalquilo-U, de preferencia un radical aminoalcoxi, de manera particularmente preferida 6- aminohexoxi o bien 5-aminopentoxi, c bien un grupo de la fórmula R9- (CH2CH2-0) m, en donde R.- es de preferencia OH o bien NH2 y m es de 1 a 6, de preferencia H0(CH2CH2- 0)2; H0(CH2CH—0)6 y H^N-ÍC^CH^-Q) , o un radical mercaptoalquilo-U, de preferencia un radical mercaptoalcoxi, de manera particularmente preferida 6- 1 mercaptohexiloxi . Un derivado de PNA de conformidad con la reivindicación 1 a 7, en donde X y Z se selecciona', independientemente entre ellos, dentro 'del grupo que consiste de derivados cianina. ' , Un derivado de PNA ,de conformidad ,con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en, donde X y Z se seleccionan, independientemente entre ellos, dentro del grupo que consiste ele Dabcyl, psoralen, acridina, DNP y ¡ colesterol. 1 I Un derivado de PNA de conformidad pon lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la secuencia de bases se enfoca contra partes de genes supresores de tumor, oncogenes o telomerasas, o bien sus productos de transcripción. 14. Un derivado de PNA de conformidad con la reivindicación 13, en donde la secuencia de bases de la porción de PNA se enfoca contra el inicio de traducción de ARNm de HA- ras . 15.Un derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para su uso i como agente farmacéutico . , 16.El uso de un derivado de PNA de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para a producción de un agente farmacéutico para terapia tumora¡L. ' , , • i 17. Un derivado de PNA de conformidad con cualesquiera de ' I ' ' las reivindicaciones 1 a 14 para su uso como agente de diagnóstico . , 18.El uso de un derivado de PNA de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para la detección de microorganismos y/o virus. 19. El uso de un derivado de PNA de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para i,'a detección y/o cuantificación de ácidos nucleicos. i ' 20.El uso de un derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 14 como agente de detección para la hibridación in sitú o hibridación in situ con fluorescencia. 2l.El uso de un derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 14 como agente de antisentido, agente antigénico, agente de señuelo o bien agente de quimeraplasto. i 22.Un reactivo de detección, que comprende un derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14. 23.Un chip de PNA, que comprende un derivado de PNA de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 1 a 14. 1 24.Un biosensor, que comprende un derivado de PNA de conformidad con lo reclamado en cuaiesquiera de las reivindicaciones 1 a 14. ¡ l 25.Un agente farmacéutico, que comprende l un derivado de cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y, en caso apropiado, otros aditivos y/u excipientes farmacológicamente tolerados, 26.Un agente de antisentido, que comprende un derivado de PNA de ' conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14. ¡ 27.Un proc 1eso para la preparación de un derivado de PNA, de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde a) la estructura de PNA es sintetizada, empezando a partir de la terminal C, utilizando ácidos amidonucleicos activados, y b) la terminal N reacciona con un reactivo de fosforilación. _ 28. El proceso de conformidad ' con la reivindicación 27, en donde el P?A se prepara utilizando los grupos t- butiloxicarbonilo (BOC) , 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o monometoxotitritilo (Mmt) . , 29.El proceso de conformidad . con la reivindicación 28, en ' donde el P?A se prepara empleando soporte sólidos. 30.El proceso de conformidad con la reivindicación 29, en 1 ' donde CPG, tentagel o aminometilpoliestireno se utiliza 1 como el soporte sólido. 31. Un proceso para la ¡producción de un agente | 1 , farmacéutico, en donde i I I I . , ; a) se prepara un derivado de P?A de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30, y ¡ b) se agregan aditivos y/o excipientes '. farmacológicamente tolerados adicionales a dicho derivado, en caso apropiado. 32.Un proceso para la producción de un chip de P?A en donde, de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30, un derivado de P?A se prepara primero y después se fij a sobre un soporte sólido, o , bien el derivado de PNA se prepara directamente, en el soporte. Un proceso para la preparación de un derivado de PNA de la fórmula , I de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30, en donde, además, el PNA es purificado a través de cromatografía o electroforesis mientras se explota el carácter ácido del radical fósforo. El proceso de conformidad con la reivindicación 33, en donde un derivado de PNA es purificado a través de cromatografía utilizando una fase estacionaria básica y un ácido o uñ eluyente que contiene sal. í ____ El proceso d,e conformidad con la reivindicación 34, en donde la fase estacionaria es un intercambiador de aniones o bien una fase de modo mixto. tr 110 RESUMEN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a derivados de PNA que llevan un radical fosforilo en la terminal N de la estructura de PNA, por ej emplo un radical fosfato o un radical fosforilo sustituido, en donde derivados fosforilo sustituidos llevan opcionalmente uno o varios grupos marcadores o grupos para reticulación o grupos que favorecen la absorción . intracelular o grupos que incrementan la afinidad de enlace del derivado de P?A con ácidos nucleicos . La invención se refiere también a un método para producir los derivados de P?A mencionados arriba y a su uso como fármacos y agentes de diagnóstico .