NO328910B1 - PNA-derivater, legemiddel, fremgangsmate for fremstilling samt anvendelse - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelsen vedrører N-terminal fosforylerte polyamidnukleinsyre-(PNA)-derivater med forbedrede egenskaper; fremgangsmåte for deres fremstilling; anvendelser av nevnte derivater; samt legemidler, påvisningsreagens, PNA-chip, biosensor og antisense agens inneholdende nevnte PNA-derivater.

Polyamidnukleinsyrer, også kalt peptidnukleinsyrer (PNA) binder seg til komplementære målsekvenser (DNA eller RNA) med høyere affinitet enn naturlige oligonukleotider og har i forhold til naturlig DNA i tillegg den fordel at de er meget stabile i serum. PNA ble opprinnelig beskrevet som unaturlige nukleinsyre-analoger i hvilke hele sukker-fosfat-ryggraden er erstattet med N-(2-aminoetyl)-glycin-enheter (M. Egholm et al. (1991) Science 254,1497-1500; WO 92/20702; M. Egholm et al. Nature

(1993) 365, 566-568; P. Nielsen, (1994) Bioconjugate Chem. 5, 3-7; E. Uhlmann et al.

(1998) Angewandte Chemie Int. Ed. Engl. 37,2796-2823). Som baser benyttes de i nukleotidkjemi vanlige naturlig forekommende eller også ikke naturlig forekommende nukleobaser eller deres prodrugformer, altså mellomprodukter som først i organismen gjennom biotransformasjon overføres til de frie basene. Derutover ble det beskrevet PNA'er i hvilke ikke alle posisjoner til ryggraden bære baserester (Greiner et al. (1999) Heiv. Chim. Acta 82, 2151), og i hvilke aminoetylglycin er erstattet med mer komplekse enheter (Uhlmann et al. (1998) Angewandte Chem. Int. Ed. 37,2796; Falkiewicz (1999) Biochim. Pol., 46, 509-529).

Den ladningsnøytrale karakteren til PNA-ryggraden er et viktig kjennetegn til denne substansklasse med vidtrekkende konsekvenser. Det faktum at PNA binder til komplementær DNA og RNA selv ved lave saltkonsentrasjoner (for eksempel Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications; Peter E. Nielsen und Michael Egholm (Edit.) Horizon Scientific Press, 1999, 3), hvor Watson-Crick-baseparingsreglene følges, tilskrives den nøytrale karakteren til PNA og den følgende reduserte ladningsfrastøtning. Av denne årsak er PNA i prinsippet egnet ved tallrike anvendelser i hvilke deres naturlige oligonukleotider hhv. oligonukleotid-derivater anvendes. Derutover finnes dog på grunn av de enestående bindingsegenskapene også tallrike anvendelser som ikke er mulig med de naturlige oligonukleotider (se for eksempel: Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications; Peter E. Nielsen und Michael Egholm (Edit.) Horizon Scientific Press, 1999). Eksempelvis er det med PNA observert en strenginversjon på dobbeltstrenget DNA.

Typiske eksempler på anvendelse av PNA inkluderer deres anvendelse ved inhibering av genekspresjon gjennom sekvenspesifikk binding til cellulært DNA eller RNA.

"Antisens-reagenser" er korte enkeltstrengede nukleinsyrederivater som binder, ved hjelp av Watson-rik baseparing, til en komplementær mRNA, hvis oversettelse i det tilsvarende protein skal hemmes (Uhlmann und Peyman (1990) Chem. Rev. 90, 543; Larsen et al. (1999) Biochem. Biophys. Acta 1489,159). "Anti-gen-reagenser" binder, ved hjelp av Hoogsteen-baseparing, i den store rillen til DNA-doppelheliksen under dannelse av en trippelheliks, hvorved transkripsjonen av genene hemmes sekvensspesifikt (Praseuth et al. (1999) Biochem. Biophys. Acta 1489,181). Genekspresjonen kan også hemmes spesifikt med såkalte avlednings-oligomerer som etterligner områdene som binder transkripsjonsfaktorer. Gjennom behandling med avlednings-reagenser kan bestemte transkripsjonsfaktorer fanges opp sekvensspesifikt og derved forhindres aktiveringen av transkripsjonen (Mischiati et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 33114). En ytterligere gruppe av intracellulære virkende oligonukleotidderivater er chimeraplastene. Disse anvendes ved spesifikk gen korrekturlesning (Cole-Strauss et al. (1996) Science 273,1386-1389).

PNA kan derfor anvendes som legemiddel og/eller diagnostikum hhv. til fremstilling av legemidler og/eller diagnostika.

For diagnostiske formål og innen molekylærbiologien kan PNA eksempelvis anvendes som spesifikke hybridiseringsprober etter merking med biotin, fluorecein eller andre markører. For innføring av markørgrupper, er det i litteraturen inntil nå beskrevet fire fremgangsmåter (Oerum et al. (1999), in Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications, side 81-86; Lohse et al. (1997) Bioconjugate Chem. 8, 503). Den første metoden bygger på markeringen av den frie (avbeskyttede) PNA etter dens syntese i oppløsning. I denne metoden blir aminoterminalen til PNA omsatt med en aktiv karboksylsyre eller et isotiocyanat. Ofte innføres dog ytterligere lysin-rester i PNA som deretter omsettes med fluoresceinisotiocyanat (FITC).

Ved den andre fremgangsmåten blir det beskyttede PNA, stadig i den faste fasen, modifisert på aminoterminalen med aktiverte karboksylsyrederivater eller isotiocyanater. Denne fremgangsmåten egner seg kun for markørgrupper som er stabile under betingelsene for avbeskyttelsen av PNA og under avspaltningen av bæreren. Som reaktive reagenser foretrekkes i begge tilfeller isotiocyanater (P. Wittung et al., (1995) FEBS Lett. 375,27) eller aktiverte karboksylsyrer som eksempelvis N-hydroksysuksinimidester (NHS), (Oerum et al., 1999). En ulempe ved reaksjonen med NHS-derivatene er at den ofte resulterer i dårlig utbytte. Derfor er 8-amino-3,6-dioksaoktansyre ofte kondensert, som linker eller spacer, mellom PNA og markørgruppen. Begge koblinger effektueres iform av amidbindinger eller tioureabindinger, som i seg selv ofte fører til uoppløselighet. Alternativt reageres karboksylsyrene ved bruk av aktivatorer som er standard innen peptid-kjemien, slik som eksempelvis HBTU, TBTU eller HATU.

I den tredje fremgangsmåten blir fluorescein-konjugerte monomerer anvendt ved fastfasesyntese av PNA, hvorved fluorescensmerkingen effektueres i form av amidbindinger (Lohse et al. (1997) Bioconjugate Chem. 8, 503), som igjen fører til relativt tungt oppløselige konjugater.

En fjerde fremgangsmåte anvender PNA-peptid-konjugater i hvilke peptid-delen danner et substrat for en protein-kinase (Koch et al. (1995) Tetrahedron Lett. 36, 6933). På denne måte blir altså ikke PNA-delen modifisert, men serin-resten til peptid-segmentet fosforylert enzymatisk. Med denne fremgangsmåten kan altså kun radioaktivt fosfat, men eksempelvis ikke fluorescein eller biotin, innføres i peptid-segmentet til PNA-peptid-konjugatet.

Det er kjent at PNA i vandig oppløsning, altså under fysiologiske betingelser, har tendens til aggregatdannelse. PNA er derfor dårlig oppløselig i vandig buffer og er da ikke tilgjengelig for hybridisering til komplementære sekvenser. PNA viser i tillegg en høy affinitet til forskjellige materialer som Sephadex<®>(Fa. Pharmacia), Bond Elut®

(Fa. Varian), eller forskjellige HPLC-kromatografimaterialer som finner anvendelse ved

rensingen av oligomerene, slik at PNA ofte isoleres i dårlig utbytte. Derfor er det nødvendig å konjugere PNA med lysin eller andre postivt ladede aminosyrer (over C-terminalen) (Egholm et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114,1895). Guaninrike PNA-sekvenser har helt spesiell tendens til aggregatdannelse og det er derfor anvendelse av slik PNA frarådes (se "Guidelines for sequence design of PNA oligomers" i Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applicatioons (1999) Side 253-255). Spesielt tungt oppløselig er eksempelvis lengre fluorescein-markerte PNA-oligomerer, hvor tilsetningen av et organisk løsemiddel og oppvarming til 50°C anbefales.

Rensingen av de tungt oppløselige lipofile PNA-derivatene er spesielt vanskelig. Ved HPLC detekteres ofte flere topper som skyldes PNA-aggregater. Den for rensingen og adskillelsen av nukleinsyrer ofte anvendte teknikk med polyakrylamid (PAA)-gelelektroforese er ikke mulig for disse PNA-derivater.

Ved de ovenfor beskrevne fremgangsmåtene for derivatiseringen av PNA blir markør-gruppen alltid innført ved dannelse av en amidbinding eller tioamidbinding, hvorved det dannes relativt tungt oppløselige PNA-derivater. Spesielt ved innføringen av lipofile rester, som eksempelvis fluorescein, dannes tungt oppløselige PNA-derivater. Da markeringsreaksjonen i tillegg ofte forløper i dårlig utbytte, består en oppgave som skal løses i å tilveiebringe nye PNA-derivater som skal kunne fremstilles med høyt utbytte og ha fordelaktige egenskaper, som forbedret oppløselighet, forbedret bindingsoppførsel, bedre cellulært opptak, og som i tillegg tillater anvendelsen av effektive rensefremgangsmåter for PNA-oligomere.

Oppgaven løses ifølge oppfinnelsen ved tilveiebirngelsen av PNA-derivater som på N-terminalen til PN A-ryggraden bærer en eller flere fosforyl-rester. Oppfinnelsen tilveiebringer PNA derivater som bla. er tio derivater, imino derivater og okso derivater. PNA derivatene ifølge oppfinnelsen kan ha minst en av fosforylrestene bærende på en eller flere deprotonerbare grupper, fortrinnsvis hydroksy- eller merkaptogrupper. Fosforylrestene er bundet over en oksygen-fosfor-svovel-fosfor eller en nitrogen-fosfor-binding enten direkte eller over en spacer med PNA-ryggraden, hvor spaceren eksempelvis kan være et alkanoylamid, et poly(alkoksy)karboksamid eller en aminosyre, som eventuelt på a-C eller |3-C-atomet bærer en sidekjede, hvor denne sidekjede ikke må bære noen fosforyl-rest. Eksempler på fosforyl-rester er fosfat, fosfonat, tiofosfat, fosamidat eller substituerte fosforylrester hvor substituerte fosforylrester eventuelt bærer en eller flere markørgrupper eller kryssbindende gruppe, eller grupper som begunstiger det cellulære opptaket, eller grupper som øker bindingsaffiniteten til PNA-derivatet til nukleinsyrer.

Under markørgrupper (Labels) forstår man grupper som tillater en kvalitativ eller kvantitativ bedømmelse av den kjemiske eller biologiske aktiviteten til PNA-derivatene, eksempelvis biotin eller fluorescein. Under kryssbinding forstår man dannelsen av intra-hhv. intramolekylære bindinger mellom romlige nabofunksjonaliteter. Et eksempel på en kryssbindende gruppe er psoraliengruppen.

Et første aspekt ved oppfinnelsen vedrører PNA-derivat med formelen I,

hvor

V er lik oksygen, svovel, NR|, en gruppe U-(CR3R4)U-C(0)-NH eller en gruppe U-(CY2CH20)u.-CH2-C(0)-NH,

U er uavhengig av hverandre lik oksygen, svovel eller NH,

u' er uavhengig av hverandre lik 1 til 10, fortrinnsvis 1 til 4, spesielt foretrukket 1,

W er uavhengig av hverandre lik oksygen, svovel eller NR|,

Y er uavhengig av hverandre hydroksy, merkapto, oksyanion, tioat eller NR1R2,

Ri og R2betyr uavhengig av hverandre en rest bestående av hydrogen eller Ci- C$-alkyl, fortrinnsvis hydrogen,

R3og R4betyr uavhengig av hverandre en rest bestående av hydrogen eller C1-C6-alkyl, eller resten av en aminosyre-sidekjede, fortrinnsvis hydrogen,

X er uavhengig av hverandre lik en gruppe U-(C2-C22-alkandiyl)-U eller en gruppe

U-(CH2CH2-0)u-, eller

X er lik en bifunksjonell markørgruppe, fortrinnsvis fra gruppen fluorescein-, rhodamin-, TAMRA-, biotin-, pyren-, dinitrofenyl-, kolesteryl-, acridin-, cyaninfargestoff-, dabcyl-, digoxigenin- eller edans-deirvatene, spesielt foretrukket et biotin-derivat,

eller X er lik en bifunksjonell gruppe til tverrbinding med komplementære nukleinsyrer, fortrinnsvis et psoralen-derivat,

eller X er lik en bifunksjonell gruppe som begunstiger det intrazellulære

opptaket, fortrinnsvis fra gruppen av kolesteryl-, adamantyl- og vitamin E-derivater,

eller X er lik en bifunksjonell gruppe som øker bindingsaffiniteten til PNA-derivatet til en bærer-nukleinsyre, fortrinnsvis akridin- og lexitropsin-derivat,

Z er lik hydroksy, merkapto, oksyanion, tioat eller NR1R2, Ci-C22-alkyl, Ci-Cg-Arylalkyl, Ci-C22-alkyl-U, Ci-Cg-arylalkyl-U, hydroksy-Ci-Ci8-U, aminoalkyl-U, merkaptoalkyl-U,

eller en gruppe av formel R9(CH2CH2-0)m, hvor R9er lik hydroksy, amino eller Ci-C22-alkoksy og m er lik 1 til 100, fortrinnsvis 2 til 10,

eller Z er en monofunksjonell eller bifunksjonell markørgruppe, fortrinnsvis fra gruppen fluorescein-, rhodamin-, TAMRA-, biotin-, pyren-, dinitrofenyl-,

acridin-, cyaninfargestoff-, dabcyl-, digoxigenin-, edans-derivatene, spesielt foretrukket et biotin-derivat,

eller Z er lik en monofunksjonell eller bifunksjonell tverrbindende gruppe,

fortrinnsvis en psoralen-derivat,

eller Z er lik en monofunksjonell eller bifunksjonell gruppe som begunstiger det intrazellulære opptaket, fortrinnsvis fra gruppen kolesteryl-, adamantyl- og vitamin-E-derivatene,

eller Z er lik en monofunksjonell eller bifunksjonell gruppe som øker bindingsaffiniteten til PNA-derivatet til en bære-nukleinsyre, fortrinnsvis et lexitropsin-derivat,

n er like 0 til 10, fortrinnsvis 0 til 3,

Q er lik hydroksy, amino, NHR7, NR7R8, aminosyre-derivat eller en peptid-rest,

R7og Rg er uavhengig av hverandre C1 -C18-alkyl eller hydroksy-C 1 -C18-alkyl,

og hvor {POLY} beskrives av formelen II

PNA-ryggraden er således oppbygget av z'+l monomerer, hvor {BLOKK} uavhengig av hverandre er en gruppe valgt blant formel HIA,

hvor {BLOKK} uavhengig av hverandre enten beskrives av formel HIA,

eller av formel UIB (Greiner et al. (1999) Heiv. Chim Acta 82, 2151), eller formel IV A til IV G (Uhlmann et al. (1998) Angewandte Chem. Int. Ed. 37, 2796; Falkiewicz (1999) Biochim. Pol., 46, 509-529),

hvor hver byggstein {BLOKK} kan være forskjellig,

og hvor det videre gjelder at

z' er lik 0 til 100, fortrinnsvis 1-20, spesielt foretrukket 4-15,

A er uavhengig av hverandre en gruppe (CRiR.2)shvor s er lik 1 til 3, fortrinnsvis 1,

B er uavhengig av hverandre enten en aromatisk rest som også kan ha heteroaromatisk karakter eller hydrogen, eller hydroksy, eller Ci-Ci8-alkyl,

eller en innen nukleotidkjemien vanlig naturlig forekommende eller ikke naturlig forekommende nukleobase eller dens prodrogform,

hvor minst en rest B i formel II er en nukleobase,

D er uavhengig av hverandre en gruppe (CR3R4)t, hvor t er lik 2 til 10, fortrinnsvis 2 til 4, spesielt foretrukket 2,

hvor to naborester R3og R4også kan danne en Cs-Cs-cykloalkylring,

E er uavhengig av hverandre en gruppe (CR5R6) hvor to naborester R5og R6også kan danne en C5- til Cs-cykloalkyl-ring eller en spiroforbindelse,

R5og R6betyr uavhengig av hverandre en rest bestående av hydrogen eller C1-C6-alkyl, fortrinnsvis hydrogen eller en aminosyre-sidekjede,

så vel som fysiologisk akseptable salter av PNA-derivatene av formel I,

med det forbehold at minst en av restene Y eller Z er lik hydroksy, merkapto, oksyanion eller tioat.

Fysiologisk akseptable salter er blant annet beskrevet i Remingtons Pharmaceutical Science (1985) Mack Publishing Company, Easton, PA, USA, side 1418. Det foretrekkes ammoniumsalter, trialkyl-ammoniumsalter, alkalimetallsalter (som natrium-og kaliumsalter) og jordalkalisalter (magnesium- og kalsiumsalter). Spesielt foretrukket er natriumsalter.

Overraskende ble det funnet at kun en negativ delladning på fosforyl-resten er tilstrekkelig til å vesentlig forbedre egenskapene til forbindelsene med formel I. Mens

PNA selv ved PAA-gelelektroforesen ikke vandrer, vandrer forbindelsene av formel I til anoden. Da fosforylresten under syntesen av forbindelsene av formelen I først innføres i den siste syklus, vandrer kun forbindelsene ifølge oppfinnelsen i det elektriske feltet ved PAA-gelelektroforesen, mens alle feilsekvenser og biprodukter ikke vandrer og dermed kan skilles fra på en ekstremt enkel måte.

Hydroksy- hhv. merkapto-substituentene til fosforyl-restene til PNA-derivatene ifølge oppfinnelsen kan deprotoneres i et pH-område fra 4,5 til 14, fortrinnsvis 6,5 til 12, spesielt foretrukket 6,5 til 9. Det faktum at fosforylrestene kan ioniseres kan fordelaktig utnyttes ved rensing av forbindelsene med formel I. På den ene side kan forbindelsene med formel I renses ved elektroforese, eksempelvis polyakrylamid-gelelektroforese. På den annen side er rensing ved hjelp av anionbytterer mulig. Derved blir de ønskede produktene fortrinnsvis eluert ved anvendelse av en saltgradient, eksempelvis en kokesaltgradient eller en pH-gradient. Spesielt enkelt og effektivt lar PNA-derivatene ifølge oppfinnelsen med formel I seg rense med anionbyttere. Det viser seg at de uladede biproduktene ikke holdes tilbake på anionbytteren, mens det ladede produktet hefter til kolonnen. Etter vasking med vann kan det ønskede produktet isoleres på ren form med eddiksyre eller en kokesaltoppløsning. Som anionbytter anvender man fortrinnsvis sterke anionbytterer eller blandet-modus-faser som eksempelvis "Oasis MAX" (Waters GmbH, Eschborn).

Videre viste det seg at forbindelsene av formel I ifølge oppfinnelsen generelt er bedre oppløselig i vandig medium enn de tilsvarende PNA-oligomerene uten fosforyl-rest. Dette gjør seg helt spesielt bemerket ved de lipofile derivatene som eksempelvis fluorescein-derivatene eller heksadecyl-derivatene i form av en sterkt forbedret oppløselighet i vandig medium.

Som ytterligere overraskende positiv effekt viste seg at innføringen av en fosforylrest, eksempelvis som fosfat eller også i form av en lipofil derivatisering (for eksempel som heksadecylfosfodiester), øker PNA sin affinitet til komplementære DNA eller RNA. Denne effekt var ikke forventet, da den sterke bindingen av PNA til komplementære DNA eller RNA ble tilskrevet den nøytrale karakteren til PNA og den dermed forbundne reduserte ladningsrfastøtning (se for eksempel Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications; Peter E. Nielsen und Michael Egholm (Edit.) Horizon Scientific Press, 1999, 3).

I enkelte uførelsesformer blir biotin spesielt effektivt introdusert i form av en fosforylrest. Biotinylerte PNA med formel I (X og/eller Z = biotinrest) utviste som hybridiseringsprober bedre bindingsegenskaper og mindre forstyrrende ikke-spesifikke bakgrunnseffekter enn tilsvarende biotinylerte DNA-prober.

I motsetning til uladet PNA kan PNA-derivatene med formel I ifølge oppfinnelsen også vandre i det elektriske felt, hvorved en mikrolokalisering og en konsentrering på immobiliserte komplementære nukleinsyrederivater er mulig. I tilfelle av de polyanioniske oligonukleotider er anvendelsen av elektrisk felt for mikrolokalisering og konsentrering allerede beskrevet for rask bestemmelse av baseparringsfeil (Sosnowski et al. (1997) Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 94,1119).

Oppfinnelsen vedrører spesielt PNA-derivater i hvilke A og E er lik CH2. Videre vedrører oppfinnelsen spesielt PNA-derivater i hvilke D er lik (CH2)2. Foretrukket er videre PNA-derivater av formel I i hvilke V, W og Y er lik oksygen.

Eksempler på naturlige baser er adenin, cytosin, 5-metylcytosin, guanin, thymin og uracil. Eksempler på unaturlige baser er purin, 2,6-diaminopurin, N^-etanocytosin, N<6>N<6->etano-2,6-diaminopurin, 5-(C3-Ce)-alkynyl-uracil, 5-(C3-C6)-alkynyl-cytosin, 5-(l-propargylamino)-uracil, 5-(l-propargylamino)-cytosin, fenoksazin, 9-aminoetoksyfenoksazin, 5-fluor-uracil eller pseudoisocytosin, 5-(hydroksymetyl)uracil, 5-aminouracil, pseudouracil, dihydrouracil, 5-(Ci-C6)-alkyl-uracil, 5-(Ci-C6)-alkyl-cytosin, 5-(C2-C6)-alkenylcytosin, 5-fluorcytosin, 5-kloruracil, 5-klorcytosin, 5-bromurcil, 5-bromcytosin, 7-deazaadenin, 7-deazaguanin, 8-azapurin eller 7-deaza-7-substituerte puriner.

Q er fortrinnsvis en hydroksyalkylamino-rest, spesielt en hydroksy-heksylamino-rest eller et derivat av en kjent naturlig eller unaturlig aminosyre eller et peptid. Som peptidsekvenser kommer fortrinnsvis slike i betraktning som optimerer organfordelingen eller den cellulære lokaliseringen av PNA, eksempelvis transportant, insulin-like Growth Factor, Nuclear Localisation Signale eller andre bæresekvenser (Larsen et al. (1999) Biochim. Biophys. Acta 159-166). Peptidet kan også tjene som affinitets-tag, som for eksempel en (His)6kjede.

Den foreliggende oppfinnelsen muliggjør en bred variasjon av restene X og Z (eksempler gitt i figurene la, lb, 2a, 2b, 3a og 3b) og tillater således innføringen av forskjellige spesifikke funksjonskjenneteng i PNA.

En foretrukket utførelsesform av Z er en Ci- til C22-alkyl-rest. Foretrukket er også Ci-til C22-alkoksy-rester, spesielt Ci6-alkoksy-rester. Andre foretrukne rester er hydroksy-(Ci-Ci8-alkoksy)-rester, spesielt HO(CH2)3-i20. Videre foretrukket er aminoalkoksy-rester, spesielt 6-aminoheksoksy- og 5-aminopentoksy-rester. Videre foretrukket er rester av formelen R.9(CH2CH2-0)m, hvor R9er lik hydroksy, amino eller C1-C22-alkoksy, fortrinnsvis dog hydroksy, og m er lik 0 til 100, fortrinnsvis 2 til 10. Spesielt foretrukket er HO(CH2CH2-0)2, HO(CH2CH2-0)6og H2N-(CH2CH2-0)2. Videre foretrukne eksempler på Z omfatter merkaptoalkoksy-rester, spesielt 6-merkaptoheksyloksy.

I en videre trukket utførelsesform omfatter Z en fluorescerende gruppe som fluorescein, rhodamin, TAMRA eller et cyanin-fargestoff. Foretrukne fluorescerende grupper finnes i figurene la til 3b. Helt spesielt foretrukket for Z er også biotin. Andre foretrukne grupper for Z omfatter dabcyl, psoralen, acridin, DNP og kolestrol, (figurer lb og 2b), BODIPY-, ROX- eller R6G-rester (Su-Chun Hung et al. (1998) Analytical Biochemistry 255, 32-38) og digoksigenin (Tarrason et al., Methods in Enzyology

(1999) Vol. 313, 257-268). Derutover kan Z være lik en gruppe bestående av en monofunksjonell eller en bifunksjonell fluorescein-, rhodamin-, TAMRA-, biotin-, pyren-, dinitrofenyl-, kolesteryl-, acridin-, adamantyl-, vitamin-E, cyaninfargestoff-, dabcyl-, edans-, lexitropsin- eller psoralen-rest. Monofunksjonelle sluttgrupper er eksempelvis anført på figurene la, lb, 2a og 3a, bifunksjonelle brodannende grupper er anført på figurene 2b og 3b. I en annen foretrukket utførelsesform er n lik 0, dvs. PNA-delen bærer kun en fosfat- eller fosforylrest.

En foretrukket utførelsesform av X er U-( C2-C22-alkandiyl)-U, spesielt 0-( C2-C22-alkandiy)-0, helst spesielt foretrukket 0.(CH2)2-6-0. En annen foretrukket utførelsesform av X er en gruppe av formelen U-(CH2CH2-0)U-, hvor u' er lik 1 til 10, fortrinnsvis 1 til 6 og hvor U fortrinnsvis 1 til 6 og hvor U fortrinnsvis er oksy. I en videre foretrukket utførelsesform omfatter X en fluorescerende gruppe som fluorescein, rhodamin, TAMRA eller et cyanin-fargestoff, eksempelvis Cy3® (Fa. Amersham Pharmacia Biotech). Foretrukne bifunksjonelle grupper finnes på figurene 2a og 3a. Helt spesielt foretrukket for X er også biotin. Andre foretrukne grupper for X omfatter dabcyl-, psoralen-, acridin-, DNP-, kolesterol-, BODIPY-, digoksigenin-, ROX- og R6G-rester.

De forskjellige restene for X og Z i formel I kan oppfylle forskjellige funksjoner. Fluorescein-restene har utbredt anvendelse ved DNA-sekvensiering, signalamplifikasjon eller som markører til bestemmelse av det cellulære opptak av PNA. Cyanin-fargestoff-restene (Cy3® og Cy5®) gir en vesentlig mer intensiv og lengre vedvarende fluorescenssignal enn fluorescein selv. Psoralen-resten anvendes til tverrbinding (kross-linking) med komplementære nukleinsyrer. Acridin-resten er en effektiv interkalator og kan dermed forsterke bindingsaffiniteten til PNA. Biotin-, acridin- og psoralen-derivatene kan også anvendes for antisense-eksperimenter. Videre kan heksadecyloksy- og kolesterol-derivater anvendes til økning av membrangjennom-trengeligheten til PNA. DNP-markerte forbindelser av formel I kan påvises med anti-DNP-antistoffer. Aminoalkoksy-resten kan utnyttes til kobling med ytterligere grupper som eksempelvis lexitropsin (jfr- eksempel 17; PNA-16). På lignende måte kan også merkaptoalkoksy-gruppene benyttes til ytterligere derivatisering.

Oppfinnelsen vedrører videre nevnte PNA-derivater med formel I som legemiddel. Disse legemidler kan anvendes til prevensjon og/eller behandling av sykdommer som forbindes med ekspresjonen hhv. en overekspresjon av bestemte gener. Videre vedrører oppfinnelsen nevnte PNA-derivater med formel I som diagnostikum. Disse diagnostika kan anvendes til tidlig diagnostisering av de ovenfor nevnte sykdommene.

Som legemiddel hhv. diagnostikum kan PNA-derivatene av formel I benyttes avhengig av deres sekvens som antisens-, antigen-, avledning- og kimeraplast-reagenser. PNA-derivatene ifølge oppfinnelsen blir spesielt anvendt til fremstilling av legemidler for behandling av sykdommer, hvor definerte gener er årsaken eller er involvert, som et resultat av deres overekspresjon.

Disse legemidler kan eksempelvis anvendes for behandling av sykdommer som fremkalles av virus, eksempelvis av CMV, HIV, HSV-1, HSV-2, influensa, VS V, Hepatitt B eller papilloma virus, hvor den tilsvarende virus-sekvensen er målet ("Target").

Antisense-PNA-derivater ifølge oppfinnelsen som er effektive mot slike mål har eksempelvis følgende basesekvens.

a) mot CMV, for eksempel

b) mot HIV, for eksempel c) mot HS V-1, for eksempel Slike legemidler egner seg eksempelvis også til behandling av kreft. Fortrinnsvis kan det herved anvendes sekvenser som er rettet mot mål (Targets) som er ansvarlig for dannelsen av kreft hhv. veksten av kreft, spesielt gjennom inhiberingen av telomerasen (E. Matthes et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27,1152). Slike mål (Targets) er videre: 1) Nukleære onkoproteiner som eksempelvis c-myc, N-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, PCNA,pl20, 2) Cytoplastiske/membran-assosierte onkoproteiner som eksempelvis EJ-ras, c-Ha-ras, N-ras, rrg, bcl-2, cdc-2, c-raf-1, c-mos, c-src, c-abl, c-ets, 3) Cellulære reseptorer som eksempelvis EGF-reseptor, Her-2, c-erbA, VEGF-reseptor (KDR-1), retinoid-reseptorer, protein-kinase regulatorisk underenhet, c-frns, Tie-2, c-raf

1 kinase, PKC-alfa, proteinkinase A (RI alfa),

4) Cytokiner, vekstfaktorer, ekstracellulær matriks som eksempelvis CSF-1, IL-6, IL-la, IL-lb, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, bFGF, VEGF, myeloblastin, fibronectin.

Antisens-PNA-derivater som er effektive mot slike mål (Targets) har eksempelvis følgende basesekvens:

a) mot c-Ha-ras, for eksempel

b) bFCF, for eksempel c) c-myc, for eksempel d) c-myb, for eksempel e) c-fos, for eksempel f) pl20, for eksempel g) EGF-reseptor, for eksempel h) p53 tumorsuppressor, for eksempel i) bcl-2, for eksempel k) VEGF, for eksempel 1) c-raf kinase, for eksempel m) PKC-alfa, for eksempel n) Proteinkinase A, for eksempel

Legemidler inneholdende PNA-derivater med formel I egner seg eksempelvis videre til behandling av sykdommer som påvirkes gjennom integrin eller celle-celle-adhesjonsreseptorer, eksempelvis VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM eller ELAM.

Anisens-PNA-derivater som er virksomme mot slike mål (targets) har eksempelvis følgende basesekvens:

a) VLA-4, for eksempel

b) ICAM-1, for eksempel c) ELAM-1, for eksempel d) Integrin alfa (V), for eksempel Legemidler inneholdende PNA-derivater med formel I egner seg eksempelvis også til forhindring av restenose. Herved kan PNA-sekvenser anvendes som er rettet mot mål (targets) som er ansvarlig for proliferasjon eller migrasjon. Slike mål (targets) er eksempelvis: 1) Nukleære transaktivator-proteiner og cyklin som eksempelvis c-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, cyklin og cdc2-kinase 2) Mitogener eller vekstfaktorer som eksempelvis bFGF-reseptor, EGF-reseptor og PDGF-reseptor.

Antisens-PNA-derivater som er virksomme mot slike mål (targets) har eksempelvis følgende base-sekvens:

a) c-myb, for eksempel

b) c-myc, for eksempel c) cdc2-kinase, for eksempel d) PCNA (profilerating cell nuclear antigen of rat), for eksempel PNA-derivater kan også anvendes til behandling av vitiligo og andre depigmenteringssykdommer hhv. depigmenteringsforstyrrelser (for eksempel av huden, håret, øynene) som eksempelvis albinismus og psoriasis eller til behandling av astma, hvor ekspresjonen av adenosin-Al-reseptoren, adenosin-A3-reseptoren, bradikinin-reseptoren eller av IL-13 inhiberes ved hjelp av egnede antisense reagenser. En slik basesekvens er eksempelvis:

Legemiddel inneholdende PNA-derivat med formel I kan for eksempel anvendes i form av farmasøytiske preparater som man kan administrere oralt for eksempel i form av

tabletter, drageer, harde eller myke gelatinkapsler, oppløsninger, emulsjoner eller suspensjoner. De kan også administreres rektalt for eksempel i form av suppositorier eller parenteralt for eksempel i form av injeksjonsoppløsninger. For fremstillingen av farmasøytiske preparater kan disse forbindelser forarbeides med terapeutisk inerte organiske og uorganiske bærer. Eksempler på slike bærer for tabletter, drageer og harde gelatinkapsler er laktose, maisstivelse eller derivater derav, talkum og stearinsyre eller salter derav. Egnede bærer for fremstillingen av oppløsninger er vann, polyoler, sakkaroser, invertssukker og glukose. Egnede bærer for injeksjonsoppløsninger er vann, alkoholer, polyoler, glyserol og vegetabilske oljer. Egnede bærer for suppositorier er vegetabilske og herdede oljer, vokser, fettstoffer og halvflytende polyoler. De farmasøytiske preparatene kan også inneholde konserveringsmidler, løsemidler, stabil iseringsmidler, fuktemidler, emulgatorer, søtestoffer, fargestoffer, smaksstoffer, salter til forandring av de osmotiske trykk, buffer, belegningsmiddel, antioksidanter, så vel som eventuelt andre terapeutiske virkestoffer. Foretrukne administreringsformer er topiske administreirngsformer, lokale administreirngsformer som eksempelvis ved hjelp av et kateter eller gjennom inhalasjon, injeksjon hhv. infusjon og den orale administreringen. Til injeksjon formuleres PNA-derivatene med formel I i en flytende oppløsning, fortrinnsvis i en fysiologisk akseptabel buffer som for eksempel Hank's oppløsning eller Ringer's oppløsning. Oligonukleotidene kan dog også formuleres på fast form og før anvendelse oppløses eller suspenderes. Den for den systematiske administreringen foretrukne doseringen utgjør ca. 0,01 mg/kg til 50 mg/kg kroppsvekt og dag.

Oppfinnelsen vedrører videre farmasøytiske preparater som ved siden av PNA-derivatene med formel I og/eller deres fysiologisk akseptable salter inneholder farmasøytisk uproblematiske bære- og/eller tilsetningsstoffer. PNA-derivatene med formel I og/eller deres fysiologisk akseptable salter kan administreres til dyr, fortrinnsvis pattedyr og spesielt mennesker alene som legemiddel, i blandinger med hverandre eller på form av farmasøytiske preparater som tillater en topisk, perkutan, parenteral eller enteral anvendelse og som ved siden av vanlige farmasøytisk uproblematiske bære- og tilsetningsstoffer som aktiv bestanddel inneholder en effektiv dose av minst et PNA-derivat. Preparatene inneholder normalt ca. 0,1 til 90 vekt-% av den terapeutisk effektive forbindelsen. Til behandling av hudsykdommer foretrekkes en topisk anvendelse, for eksempel i form av salver, lotion eller tinkturer, emulsjoner, suspensjoner.

Fremstillingen av de farmasøytiske preparatene foregår på for så vidt kjent måte (for eksempel Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publ. Co., Easton, PA.), hvor farmasøytiske inerte uorganiske og/eller organiske bærestoffer anvendes. For fremstillingen av piller, tabletter, drageer og harde gelatinkapsler kan man for eksempel anvende laktose, maisstivelse og/eller derivater av denne, talk, stearinsyre og/eller deres salter og så videre. Bærestoffer for myke gelatinkapsler og/eller suppositorier er for eksempel fettstoffer, voks, halvfaste og flytende polyoler, naturlig og/eller herdede oljer. Som bærestoff for fremstillingen av oppløsninger og/eller siruper egner seg for eksempel vann, sakkrose, invertssukker, glukose, polyoler osv. Som bærestoffer for fremstilling av injeksjonsoppløsninger egner seg vann, alkoholer, glyserin, polyoler, vegetabilske oljer osv. Som bærestoffer for mikrokapsler, implantater og/eller "Rods" egner seg blandingspolymerisater av glykolsyre og melkesyre. Derutover er liposomformuleringer kjent av fagmannen egnet (N. Weiner, Drug Develop Ind Pharm 15 (1989) 1523; "Liposome Dermatics, Springer Verlag 1992), eksempelvis HVJ-liposomer (Hayashi, Gene Therapy 3 (1996) 878). Den dermale administreringen kan eksempelvis også foregå ved hjelp av ionoforetiske eller metoder og/eller ved hjelp av elektroporasjon.

Et farmasøytisk preparat kan ved siden av virke- og bærestoffene videre inneholde tilsetningsstoffer som for eksempel fyllstoffer, strekk-, spreng-, binde-, glide-, fukte-, stabiliserings-, emulgerings-, konserverings-, søte-, farge-, smak- eller aromatiserings-, fortyknings-, fortynningsmidler, puffersubstanser, videre løsemidler og/eller oppløsningsformidlerer og/eller midler til oppnåelse av en depotvirkning, så vel som salter til forandring av det osmotiske trykk, belegningsmidler og/eller antioksidanter. De kan også inneholde to eller flere forskjellige PNA-derivater med formel I og/eller deres fysiologisk akseptable salter så vel som videre ved siden av minst et PNA-derivat med formel I en eller flere andre terapeutisk effektive stoffer. Dosen kan varieres innenfor brede grenser og må tilpasses i hvert enkelt tilfelle til de individuelle omstendighetene.

Videre vedrører oppfinnelsen PNA-derivater med formel I som diagnostikum, spesielt som hjelpemiddel innen DNA-diagnostik og innen molekylærbiologi (se for eksempel: Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications; Peter E. Nielsen und Michael Egholm (Edit.) Horizon Scientific Press, 1999). Innen DNA-diagnostikk spiller genprober, også kalt DNA-prober og/eller hybridiseirngs-prober en stor rolle til sekvens spesifikk påvisning av bestemte gener. En genprobe består generelt av en gjenkjennelsessekvens og en hhv. flere egnede markørgrupper (Labels). Spesifisitet av bestemmelsen av en målsekvens i en analyseprøve ved hjelp av hybridisering med en komplementær genprobe bestemmes gjennom gjenkjennelsessekvensen og dennes kjemiske struktur. Denne teknikk kan overføres til PNA. PNA har overfor den naturlige oligonukleotidstrukturen den fordel at den har en høyere affinitet til målsekvensen og en høyere evne til basediskirminering.

Anvendelsen av forbindelsene med formel I vedrører derfor også in-situ-hybridisering og fluoressens-in-situ-hybirdisering (FISH). In-situ-hybirdiseringen kan eksempelvis også tjene til påvisning av mikroorganismer og virus (Just et al. (1998) J. Vir.Method.

73,163-174). En videre anvendelse av forbindelsene ifølge oppfinnelsen vedrører påvisningen og kvantifiseringen av nukleinsyrer. Hertil utnytter man fortrinnsvis også Array-teknologien (Strother et al. J. Am. Chem. Soc. (2000) 122,1205-1209; Niemeyer et al., Angew. Chem. (1999) 111, 3039-3043; Pirrung (1997) Chem. Rev. 97,473-488), som har en høy prøvegjennomstrømning og høy følsomhet. Herved blir PNA-probene fiksert på en egnet bærer eller PNA-chip. Hertil kan PNA syntetiseres som beskrevet i eksemplene og etterfølgende fikseres på bæreren eller PNA-chipen. Alternativt kan PNA fremstilles direkte på bæreren. En videre anvendelse er anvendelsen av forbindelsen med formel I som biosensorer til deteksjon av nukleinsyrer (Wang et al

(1996) J. Am. Chem. Soc. 118, 7667). Anvendelsen av PNA med formelen I med en affinitetsmarkør, som eksempelvis histidyl-PNA, er en videre anvendelse til rensing av nukleinsyrer (Oerum et al. (1999), in Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications).

Syntesen av PNA-ryggraden foregår ifølge de i litteraturen beskrevne fremgangsmåtene, for eksempel etter tert-butyloksykarbonyl-(BOC), 9-fluorenylmetoksykarbonyl-(Fmoc) eller monometoksytrityl-(Mmt) beskyttelsesgruppe-strategien (Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications; Peter E. Nielsen und Michael Egholm (Edit.) Horizon Scientific Press, 1999). Fortrinnsvis blir Mmt-beskyttelsesgruppene anvendt til temporær beskyttelse av aminofunksjonen til aminoetylglycinet og baselabile beskyttelsesgrupper på de heterocykliske nukleobasene (D. Will et al. (1995) Tetraherdron 51, 12069; Breiphol et al. (1997) Tetrahedron 53,14671-14686). Eksempler på monomerbyggestein er forbindelser av formel V til V B, hvor A, B, D, E, u' og U har betydningen ovenfor. PG er en amino-beskyttelsesgruppe som eksempelvis benzoyl, anisoyl-, isobutyroyl-, acetyl-, tert-butylbenzoyl (Breipohl et al. (1997) Tetrahedron 53,14671-14686). TR er en syrelabil beskyttelsesgruppe som dimetoksytrityl (Dmt) (for U = O og S) eller Mmt (for U = NH).

Etter oppbygning av PNA-ryggraden kan den frie aminofunksjonen til N-terminalen direkte omsettes med et tilsvarende fosforyleirngsreagens eksempelvis tilsvarende fosforamidat (U = NRii formel I).

Således ble eksempelvis PNA-7 i eksempel 8 (U = NH) oppnådd gjennom omsetning av N-terminalen (på den til sist tilkoplede byggesten med B = adenin) med biotin-fosforamidit 5 (figur 4b). Alternativt kan i den siste syklusen en Dmt-beskyttet hydroksyalkyl- -eller (for U = O) eller Dmt-beskyttet merkaptoalkyl-byggestein (for U = S) av formelen V A tilkoples. Etter fraspaltning av Dmt-grupppen kan den frie hydroksy- eller merkaptofunksjonen eksempelvis bringes til reaksjon med fosforyleringsreagenset 1 (figur 4a). Etter oksidasjon, avspaltning fra bæreren og fjernelse av beskyttelsesgruppen oppnår man fosfatet (V = W = X = Y = 0) hhv. tiofosfatet (V = S, W = X = Y = O) av formelen I. Skal aminoterminalenhetene ikke ha noen nukleobase (B lik hydrogen), så blir byggestenen ifølge formel V B innført i kondensasjonsreaksjonen i den siste syklus, hvorved Fmoc-beskyttelsesgruppen ved slutten av syntesen fraspaltes med ammoniakk. Aminoterminalen til PNA kan forlenges med kondensasjon av byggestenen av formelen V C før den egentlige fosforyleringsreaksjonen gjennomføres.

Fosforylrestene kan innføres ved hjelp av innen nukleotid-kjemien vanligvis anvendte reagenser, eksempelvis ved fosforamidit-metoden, ved H-fosfonat-metoden eller fosfotriester-metoden (E. Sonveaux (1986) Bioorganic Chemistry 14,274; S. L. Beaucage og R.P. lyer (1993) Tetrahedron 49,1925; E. Uhlmann und A. Peyman

(1990) Chem. Rev. 90, 543). Det er tallrike fosforylerings-reagenser tilgjengelig (Glen Research Corporation, Sterling, VA 20164, U.S.A.), som kan trekkes frem for fremstilling av forbindelsene av formelen I. Et utvalg av reagensene er vist på figurene 4a til 4d, hvor oppfinnelsen dog ikke er innskrenket til disse spesielle derivater. Ved den ovenfor beskrevne fosforyleringsreaksjonen kan Z også ha betydningen til X hvorved reaktive funksjoner intermediært er beskyttet med egnede beskyttelsesgrupper.

Hvor mangfoldig aminoterminalmodifikasjonen er, kan tydeliggjøres ved hjelp av syntensen av PNA-6, PNA-12, PNA-13 og PNA-14. Først bygges PNA t(oeg)-at tcc gtc at-hex-CPG (PNA-basene forkortes med små bokstaver for de tilsvarende nukleobaser; oeg står for hydroksyetylglycin) i fullstendig beskyttet form på CPG-bærer (controlled pore glass), hvilken som siste byggesten bærer en hydroksyetylglycin-(oeg)-acetyltymin. Hydroksygruppen kan nå individuelt omsettes med fosforamiditene 1, 5, 7 hhv. 3. Etter oksidasjon, avspaltning av beskyttelsesgruppene og spaltning av produktet fra CPG-bæreren oppnår man tilsvarende PNA-6, PNA-12, PNA-13 hhv. PNA-14. Som fast bærer benyttes i tillegg ©TentaGel (Fa. Rapp Polymers GmbH, Tiibingen) og aminometyl-polystyren.

For innføring av fosforylfunksjonen kommer i prinsippet alle innen nukleotidkjemien kjente reagenser i betraktning, spesielt dog de følgende reagenser av formel VI A, formel VIB, formel VIC og formel VID hvor K er lik halogen, fortrinnsvis Cl, triazolyl, imidazolyl eller dialkylamino og Z har den ovenfor nevnte betydning eller betydningen til X, hvor reaktive grupper er tilsvarende beskyttet. Eksempelvis er hydroksygruppene til fluorescein-fosforamidit 3 (figur 4a) beskyttet gjennom forestring med pivalinsyre.

Forbindelsene av formel VI skal kun ansees som eksempler på slike reagenser som eventuelt kan reagere under tilsetning av ytterligere hjelpereagenser som baser, syre eller kondensasjonsreagenser. Spesielt foretrukket er reagensene av formel VIA som reagerer ifølge fosforamidit-fremgangsmåten (Beaucage og lyer, 1993). Disse blir brakt til reaksjon som fosfor-(III)-forbindelser og etterfølgende oksidert. Blir oksidasjonen eksempelvis gjennomført med jod/vann/pyridin eller tert-butylhydroperoksid oppnår man fosforylderivatet (W = O). Foregår oksidasjonen derimot med elementært svovel eller Beaucage-reagens, så oppnår man den tilsvarende tiofosforyl-forbindelsen (W =

S).

Blant reagensene (figur 4a til 4d) befinner seg også "bifunksjonelle reagenser", som på grunn av andre funksjon som først er beskyttet, kan anvendes flere ganger til reaksjon. Eksempler på slike bifunksjonelle reagenser er fosforamidene 4,6, 8 til 13. Herved kan det dreie seg om den multiple konjugasjon av et reagens eller om den suksessive reaksjon med forskjellige reagenser. Således kan eksempelvis fluorescein-fosforamidit 3 kun bringes til reaksjon en gang. Derimot har fluorescein-fosforamidit 4 en gjennom en Dmt-gruppe beskyttet hydroksyfunksjon som etter avspaltning av Dmt-gruppen enda en gang kan forringes til reaksjon med et fosforyleringsreagens. På denne måte kan en av den samme gruppe eller også forskjellige grupper innføres flere ganger. PNA-16 er et typisk eksempel på en flere ganger konjugasjon. Etter oppbygning av PNA-kjeden ble i den siste syklus en hydroksyetylglycin-C-byggesten koplet inn som suksessivt ble omsatt to ganger med Spacer-18 fosforamidit 9, aminomodifikator 5 fosforamidit 12 og til sist med lexitropsin av formelen VII under aktivering med peptid-koplingsreagenser som HBTU. Koplingen av en aminomodifikator tillater den etterfølgende innføring av en ytterligere rest som er innførbar i formen av et aktivert karboksylsyrederivat. Herved kan eksempelvis også isotiocyanat og N-hydroksy-suksinimidester anvendes.

På figur 5a og 5b er det vist noen eksempler på forbindelsestyper for den N-terminale modifikasjon av forbindelsene med formel I. Forbindelsestypen A oppnår man gjennom reaksjon av den dannede hydroksygrupppen til PNA med fosforyleringsreagenset 1. Forbindelsestypen B oppnår man gjennom reaksjon av den dannede aminogruppen til PNA med biotin-fosforamidit 5. Forbindelsestype C oppnår man gjennom suksessiv omsetning av PNA med en endestående hydroksygruppe med spacer-18 fosforamidit 9, aminomodifikator-5 fosforamidit 12 og lexitropsin. Forbindelsestype D oppnår man gjennom suksessiv omsetning av PNA med en sluttstående hydroksygruppe med spacer-9 fosforamidit 8 og cyanin-3 fosforamidit 10. Forbindelsestype E oppnår man gjennom suksessiv omsetning av PNA med en endestående hydroksygruppe med den bifunksjonelle fluorescein-fosforamidit-4, spacer-9 fosforamidit 8 og Cl6-fosforyleirngsreagens 7. Forbindelsestype F oppnår man gjennom reaksjon av den endestående aminogruppen til PNA med 4-hydroksysmørsyre, hvis hydroksyfunksjonen intermediært er beskyttet med en Dmt-gruppe og etterfølgende reaksjon med fluorescein-fosforamidit 3. De ytterligere trinnene som må gjennomføres som oksidasjon og avspaltning av beskyttelsesgrupper er beskrevet i eksemplene.

Eksempler:

Fremstillingen av følgende forbindelser er eksempelvis beskrevet:

hvor baserekkefølgen respektivt beskrives med de følgende sekvenser:

og hvor {POLY} beskrives gjennom formel II, {BLOKK} respektivt beskrives gjennom formel HIA og hvor A og E videre er lik CH2og D er lik (CH2)2og z' respektivt er gitt ut fra sekvenslengden til oligomeren.

Eksempel 1: synetese av PNA-kjeden

For fremstilling av PNA-delen ble det anvendt de følgende reagenser:

1. Fosforamidit-reagens (0,1 Mi acetonitril (ACN))

2. Mmt-PNA-monomer hhv. Dmt-oeg-PNA-monomer (0,2 M i DMFACN

(1:1; v: v))

3. Vannfri ACN (< 30 ppm vann)

4. Trikloreddiksyre (3 %) i diklormetan (DCM)

5. Acetanhydrid 2,6-lutidin i THF (1:1:8, v:v:v); (Cap A)

6. N-metylimidazol (16%) i THF; (Cap B)

7. Jodoppløsning (0,05 M) i THF, vann, pyridin, (7:2:1; v:v:v)

8. Vaskeoppløsning (THF, vann, pyridin (7:2:1; v:v:v)

9. Tetrazol (0,3 M) i ACN

10. HBTU; 0,2 Mi DMFACN (1:1; v:v)

11. DIPEA; 0,2 M i DMFACN (1:1; v:v)

12. DMF (>99,5 %) 13. Fastfasebærer: aminopropyl-CPG (550 Å) laget med Mmt-aminoheks-l-yl hemisuksinat (for PNA-heksylamid).

De Mmt/acyl-beskyttede hhv. Dmt/acyl-beskyttede oeg-monomerene ble allerede beskrevet fremstilt (Breipohl et al. (1997) Tetrahedron 53,14671-14686). Ladningen av aminopropyl-CPG med Mmt-amionheks-l-yl-hemisuksinatet ble også allerede beskrevet (Will et al. (1995) Tetrahedron 51,12069-12082). PNA-syntesen ble generelt gjennomført i målestokk fra 2 til 5 umol.

Følgende syklus ble anvendt til PNA-syntese:

1. Vasketrinn med ACN

2. Avgeskyttelse av Mmt-gruppene hhv. Dmt-gruppene ved behandling med 3% TCA i DCM, 110 sekunder.

3. Vasketrinn med DMF/ACN (1:1)

4. Nøytralisering med DIPEA i DMF/ACN (1:1)

5. Kopling av monomer-byggestenene gjennom foraktivering (15 min.) med HBTU/DIPEA/PNA-monomer (forhold 1:1:1; totalvolum 450 ul)

fylling av fastfasen og kopling (45 min.)

6. Vasketrinn med ACN

7. Kapping med acetanhydrid/N-metylimidazol

8. Vasketrinn med ACN

9. Ny syklus

Eksempel 2: Syntese av fosfat-{a(oeg) act}-hex (PNA-1)

PNA-delen blir fremstilt som beskrevet i eksempel 1 gjennom fastfasesyntese (2 umol syntese). I den siste syklusen blir en byggesten basert på hydroksyetylglycin (oeg) koplet med adenin som nukleobase (formel V A; hvor TR er lik Dmt, U er lik oksygen, u' er lik 2, PG er lik anisoyl og B er lik adenin). Etter fraspaltning av den terminale Dmt-gruppen med 3% TCA bringes den frie hydroksyfunksjonen til reaksjon med fosforyleirngsreagens 1 (figur 4a) under tetrazol-katalyse. Herved blir fosforyleringsreagenset 1 anvendt i overskudd (ca. 25-ganger) som 0,3 M oppløsning i acetonitril/tetrahydrofuran (1:1; v:v) ogtetrazolet (ca. 50-ganger; 0,5 M i acetonitril). Etter foregått kondensasjon oksideres med en jodoppløsning (0,05 M i tetrahydrofuran/vann, pyridin (7:2:1; v:v:v)). Deretter blir PNA'et fraspaltet fra bæreren gjennom behandling med konsentert ammoniakk ved 50°C natten igjennom og samtidig fjernes beskyttelsesgruppen. Man oppnår 83 OD (260 nm). Herav blir 40 OD renset gjennom preparativ polyakrylamid (PAA)-gelelektroforese. Det ønskede produktbånd blir eluert med 0,2M trietylammoniobikarbonat-buffer og avsaltet over en bånd-elut C18-kolonne (1 g). Man oppnår 13,5 OD. Produktet ble analysert gjennom negativion- massespektrometri, hvilket bekrefter den beregnede masse (beregnet 1266,2; funnet 1265,9).

Eksempel 3: Syntese av fosfat- {a(oeg) ca tea tgg tcg} -hex (PNA-2)

Fremstillingen foregår analogt med den i eksempel 2 beskrevne i en 2 umol syntese. Etter spaltning med ammoniakk oppnår man 122 OD råprodukt, hvilket renses over en 15% PAA-gel gjennom elektroforese. Man oppnår 27 OD. Produktet ble analysert gjennom negativion-massespektrometri, hvilket bekreftet den beregnede massen (beregnet 3450,3; funnet 3450,4).

Eksempel 4: Syntese av fosfat-{c(oeg) ca ega tga tgt}-hex (PNA-3)

Fremstillingen foregikk analogt som den i eksempel 2 beskrevne i en 2 umol syntese, hvori en siste syklus en på hydroksyetylglycin basert byggesten ble koplet med cytosin som nukleobase. Etter spaltningen med ammoniakk oppnår man 124 OD råprodukt, hvilket ble renset over 15% PAA-gel gjennom elektroforese. Man oppnår 19 OD. Produktet ble analysert med negativion-massespektrometri hvilket bekreftet den beregnede massen (beregnet 3450,3; funnet 3450,1).

Eksempel 5: Syntese av fosfat-{g(oeg) ag cca tga ata gtg ac}-hex (PNA-4)

Fremstillingen foregikk analogt med den i eksempel 2 beskrevne i en 2 umol syntese, hvori den siste syklusen en på hydroksyetylglycin basert byggesten ble koplet med guanin som nukleobase. Etter spaltningen med ammoniakk oppnår man 120 OD råprodukt. 60 OD av råproduktet ble renset med elektroforese over 15% PAA-gel. Man oppnådde 10 OD. Produktet ble analysert med negativion-massespektrometri hvilket bekreftet den beregnede massen (beregnet 4848,6; funnet 4849,9).

Eksempel 6: Syntese av fosfat-{t(oeg) cg gtt tga gat etg g}-hex (PNA-5)

Fremstillingen foregikk analogt med den i eksempel 2 beskrevne i en 2 umol syntese, hvori den siste syklusen en på hydroksyetylglycin basert byggesten ble koplet med tymin som nukleobase. Etter spaltningen med ammoniakk oppnådde man 120 OD råprodukt. 60 OD av råproduktet ble renset med elektroforese over en 15% PAA-gel. Man oppnådde 10 OD. Produktet ble analysert med negativion-massespektrometri hvilket bekreftet den beregnede massen (beregnet 4596,4; funnet 4596,3).

Eksempel 7: Syntese av fosfat-{t(oeg) at tee gtc at}-hex (PNA-6)

Fremstillingen foregikk analogt med den i eksempel 2 beskrevne i en 0,5 umol syntese, hvori den siste syklusen en på hydroksyetylglycin basert byggesten ble koplet med tymin som nukleobase. Etter spaltningen med ammoniakk oppnådde man 63 OD råprodukt. 30 OD av råproduktet ble renset med elektroforese over en 15% PAA-gel. Man oppnådde 4,2 OD. Produktet ble analysert med negativion-massespektrometri hvilket bekreftet den beregnede massen (beregnet 3124,5; funnet 3124,8).

Eksempel 8: Syntese av biotin-p-{act gat gta gtc}-hex (PNA-7)

PNA-delen fremstilles som beskrevet i eksempel 1 gjennom fastfasesyntese (2 umol syntese). I den siste syklusen blir en normal PNA-byggesten koplet med adenin som nukleobase (formel V A; hvor TR er lik Mmt, U er lik NH, u' er lik 2, PG lik anisoyl og B er lik adenin). Etter fraspaltning av den terminale Mmt-gruppen med 3% TCA blir den frie aminofunksjonen brakt til reaksjon med biotin-fosforamidit-5 (figur 4b) under tetrazolkatalyse. Herved blir fosforyleringsreagenset anvendt i overskudd (ca. 10 ganger) som 0,12 M oppløsning i acetonitril og tetrazol (ca. 50 ganger; 0,5 M i acetonitril). Etter foregått kondensasjon oksideres med en jodoppløsning (0,05 M i tetrahydrofuran/vann, pyridin (7:2:1; v:v:v)). Etter spaltningen med ammoniakk oppnår man 288 OD råprodukt. Råproduktet ble renset gjennom elektroforese over en 15% PAA-gel. Man oppnådde 17,5 OD. Produktet ble analysert med negativion-massespektrometeri, hvilket bekreftet den beregnede massen (beregnet 3789,6; funnet 3789,8).

Eksempel 9: Syntese av biotin-p- {g(oeg)-ct gat gta gtc}-hex (PNA-8)

PNA-delen fremstilles som beskrevet i eksempel 1 gjennom fastfasesyntese (1 umol syntese). I den siste syklusen blir en byggesten basert på hydroksyetylglycin koplet med guanin som nukleobase (formel V A; hvor TR er lik Dmt, U er lik oksygen, u' er lik 2, PG lik anisoyl og B er lik guanin). Etter fraspaltning av den terminale DMmt-gruppen med 3% TCA blir den frie hydroksyfunksjonen brakt til reaksjon med biotin-fosforamidit-5 (figur 4b) under tetrazolkatalyse. Herved blir fosforyleringsreagenset tilsatt i overskudd (ca. 10 ganger) som 0,12 M oppløsning i acetonitril og tetrazolen (ca.

50 ganger; 0,5 M i acetonitril). Etter foregått kondensasjon oksideres med en jodoppløsning (0,05 M i tetrahydrofuran/vann, pyridin (7:2:1; v:v:v)). Etter spaltningen med ammoniakk oppnår man 63 OD råprodukt. Råproduktet ble renset gjennom elektroforese over en 15% PAA-gel. Man oppnådde 11,2 OD. Produktet ble analysert gjennom negativion-massespektrometeri, hvilket bekreftet den beregnede massen (beregnet 3806,8; funnet 3807,2).

Eksempel 10: Syntese av biotin-p-{g(oeg) gt atg gga tat}-hex (PNA-9)

Fremstillingen foregikk analog med den i eksempel 9 beskrevne i en 2 umol syntese, hvori den siste syklusen en byggesten basert på hydroksyetylglycin ble koplet med guanin som nukleobase. Biotin-resten ble innført med biotin-fosforamidit 5 (figur 4b). Etter spaltning med ammoniakk oppnår man 274 OD råprodukt. Råproduktet ble renset med elektroforese over en 15% PAA-gel. Man oppnådde 25,8 OD. Produktet ble analysert med negativion-massespektrometri, hvilket bekreftet den beregnede massen (beregnet 3870,8; funnet 3869,7).

Eksempel 11: Syntese av biotin-p-{t(oeg) ga agg aag agg}-hex (PNA-10)

Fremstillingen foregikk analog med den i eksempel 9 beskrevne i en 2 umol syntese, hvori den siste syklusen en byggesten basert på hydroksyetylglycin ble koplet med tymin som nukleobase. Biotin-resten ble innført med biotin-fosforamidit 5 (figur 4b). Etter spaltning med ammoniakk oppnår man 190 OD råprodukt. Råproduktet ble renset med elektroforese over en 15% PAA-gel. Man oppnådde 29 OD med den forventede molekylvekt (beregnet 3913,9; funnet 3913,7).

Eksempel 12: Syntese av biotin-p-{g(oeg)-gt atg gga tat}-hex (PNA-11)

Fremstillingen foregikk analog med den i eksempel 9 beskrevne i en 2 umol syntese, hvori den siste syklusen en byggesten basert på hydroksyetylglycin ble koplet med guanin som nukleobase. Biotin-resten ble innført med biotin-fosforamidit 5 (figur 4b). Etter spaltning med ammoniakk oppnår man 162 OD råprodukt. Råproduktet ble renset med elektroforese over en 12% PAA-gel. Man oppnådde 21 OD. Produktet ble analysert med negativion-massespektrometri, hvilket bekreftet den beregnede massen (beregnet 3870,8; funnet 3870,8).

Eksempel 13: Syntese av biotin-p-{t(oeg) at tcc gtc at}-hex (PNA-12)

Fremstillingen foregikk analog med den i eksempel 9 beskrevne i en 0,5 umol syntese, hvori den siste syklusen en byggesten basert på hydroksyetylglycin ble koplet med guanin som nukleobase. Biotin-resten ble innført med biotin-fosforamidit 5 (figur 4b). Etter spaltning med ammoniakk oppnår man 67 OD råprodukt. Råproduktet ble renset med elektroforese over en 12% PAA-gel. Man oppnådde 8,5 OD. Produktet ble analysert med negativion-massespektrometri, hvilket bekreftet den beregnede massen (beregnet 3449,5; funnet 3449,9).

Eksempel 14: Syntese av heksadecyl-0-p-{t(oeg) at tcc gtc at}-hex (PNA-13)

Fremstillingen foregikk analog med den i eksempel 9 beskrevne i en 0,5 umol syntese, hvori den siste syklusen en byggesten basert på hydroksyetylglycin ble koplet med tymin som nukleobase. Heksadecyl-resten ble innført med C16-fosforyleringsreagens 7 (figur 4c). Etter spaltning med ammoniakk oppnår man 58 OD råprodukt. Råproduktet (30 OD) ble renset med elektroforese over en 12% PAA-gel. Man oppnådde 2 OD med den forventede molekylvekt (beregnet 3349,4; funnet 3349,7).

Eksempel 15: Syntese av fluorescein-p-{t(oeg) at tcc gtc at}-hex (PNA-14)

Fremstillingen foregikk analog med den i eksempel 9 beskrevne i en 0,5 umol syntese, hvori den siste syklusen en byggesten basert på hydroksyetylglycin ble koplet med tymin som nukleobase. Fluorescein-resten ble innført med fluorescein-fosforamidit 3 (figur 4a). Etter spaltning med ammoniakk oppnår man 62 OD råprodukt. Råproduktet (30 OD) ble renset med elektroforese over en 12% PAA-gel. Man oppnådde 4,2 OD. Produktet ble analysert med negativion-massespektrometri, hvilket bekreftet den beregnede massen (beregnet 3581,5; funnet 3582,4).

Eksempel 16: Syntese av HO-spacer9-p-{g(oeg)-tt agg gtt ag}-hex (PNA-15)

Fremstillingen foregikk analog med den i eksempel 9 beskrevne i en 1 umol syntese, hvori den siste syklusen en byggesten basert på hydroksyetylglycin ble koplet med tymin som nukleobase. Spacer-9 ble innført med tilsvarende fosforamidit 8 (figur 4c). Etter spaltning med ammoniakk oppnår man 52 OD råprodukt. Råproduktet (30 OD) ble renset med elektroforese over en 15% PAA-gel. Man oppnådde 1,8 OD. Produktet ble analysert med negativion-massespektrometri, hvilket bekreftet den beregnede massen (beregnet 3402,3; funnet 3401,8).

Eksempel 17: Syntese av leksitopsin-aminolinkC5-p-spacerC18-p-spacerC18-p-{c(oeg)-c cct tcc}-hex (PNA-16; hvor c er lik en pseudo-iso-cytosin PNA-byggestein)

Fremstillingen foregikk analog med den i eksempel 9 beskrevne i 1 umol syntese, hvori siste syklus en byggesten baserast på hydroksyetylglycin ble koplet med cytosin som nukleobase. Deretter kondenseres etter hverandre to ganger spacer-18 fosforamidit 9 og en gang aminomodifikator-5 fosforamidit (12 (figur 4d). Etter koplingsreaksjonene avspaltes Dmt- hhv. Mmt-gruppene respektivt ved behandling med 3% trikloreddiksyre. Til kopling av lexitropsinet tilsetter man 300 ul av den tilsvarende aktive esteren og lar den stå i 3 timer (fremstilt av 0,1 M lexitropsinkarboksylsyre, 0,1M TBTU og 0,4M diisopropyletylamin; 1:1:1 = v:v:v; 30 min. foraktivering). Deretter vaskes med DMF. Etter spaltning med ammoniakk oppnår man 43 OD råprodukt. Råproduktet (35 OD) ble renset med elektroforese over en 15% PAA-gel. Man oppnår 5,3 OD. Produktet ble analysert med negativion-massespektrometeri, hvilket bekreftet den beregnede massen (beregnet 3583,5; funnet 3583,1).

Eksempel 18: Bestemmelse av smeltetemperaturene

Bestemmelsen av smeltetemperaturen foregikk ved hjelp av et HP 8452A diodearray-spektrofotometer, et HP 89090A Peltier-element og HP temperatur kontroll software utgave B5.1 (produsent Hewlett Packard). Det måles i 0,5°C/min. trinn i 140 mM KC1, 10 mM natriumdihydrogenfosfat, 0,1 mM EDTA (pH 7,4) som buffer. Oligomerkonsentrasjonen utgjør 0,5 til 1 OD260pr. ml.

Overraskende viste de fosforylmodifiserte derivatene PNA-6, PNA-12 til PNA-14 en høyere binding overfor komplementære DNA og RNA enn de ikke-ladede PNA (referansesubstans).

Eksempel 19: Bestemmelse av celleopptaket etter fluoressens-markering

Man lar COS-cellene vokse til konfluens i Dulbecco's MEM (DMEM), som er supplert med 10% FCS, i 5 cm pektriskåler. Cellene blir vasket to ganger med serumfri DMEM. Ved hjelp av en steril nål blir en flate på ca. 1 cm<2>i midten av petriskålen krasset opp. I denne flaten blir PNA-oppløsningen som skal undersøkes (10 um) påført. Det inkuberes ved 37°C under C02-atmosfære. Etter 2,4 og 16 timer blir cellene undersøkt med fluoressensmikroskopi. Hertil blir cellene vasket fire ganger med serumfri DMEM dekket med en glassbærer og vurdert under fluoressens mikroskopet hhv. gjennom fasekontrast.

Til undersøkelse av celleopptaket ble PNA-6 og PNA-13 markert på C-terminalen med fluorescein og undersøkt mikroskopisk.

p-{t(oeg)-at tcc gtc at}-fluorescein

heksadecyl-0-p-{t(oeg) at tcc gtc at}-fluorescein

Herved viser seg at heksadecyl-PNA-derivatet (PNA-13) ble opptatt mer effektivt i cellene.

Eksempel 20: Hemming av celleproliferasjonen gjennom PNA-13

Sekvensen til PNA-13 er rettet mot translasjonsstarten til Ha-ras mRNA. REH-cellene (human pre-B leukemiceller, DSM ACC 22) eller A549-tumorceller ble dyrket i OptiMEM (Gibco BRL) med 10% føtalt kalveserum (FCS, GIBCO-BRL) ved 37°C under 5% C02. Celletettheten for analysen var ca. 1 x 106 / ml). PNA-13 (10 um) ble inkubert med cellene i 24-brønnplater. Etter 96 inkubasjon ved 37°C under 5% C02ble celletettheten bestemt. Middelverdien av celletettheten ble målt ut fra 3 individuelle huller med en PNA-konsentrasjon. Det viste seg at PNA-13 hemmer proliferasjonen av REH cellene. Etter mer enn 4 dagers inkubasjonstid er hemmingen med PNA-13 sterkere enn med et tilsvarende fosfortioat-oligonukleotid.

Eksempel 21: Syntese av HO-spacer9-p- {gtt agg gtt ag} -hex (PNA-17)

Fremstillingen foregikk analogt med den i eksempel 9 og 16 beskrevne i en 0,67 |imol syntese hvori siste syklusen ved PNA-syntesen en normalt 2-amino-etylglycinbyggesten ble koplet med tymin som nukleobase. Etterfølgende ble spacer-9 innført med det tilsvarende fosforamidit 8 (figur 4c) (3x5 min reaksjonstid). Etter spaltningen med ammoniakk oppnår man 108 OD råprodukt. Råproduktet ble renset med elektroforese over en 15% PAA-gel. Man oppnår 5,7 OD. Produktet ble analysert med negativion-massespektrometeri, hvilket bekreftet den beregnede massen (beregnet 3401,3; funnet 3399,8).

Eksempel 22: Syntese av tiofosfat-{t(oeg)-at tcc gtc at}-hex (PNA-18)

Fremstillingen foregikk analogt med den i eksempel 2 og 7 beskrevne i en 1 umol syntese hvori siste syklusen ved PNA-syntesen hvori den siste syklusen en byggesten baserat på hydroksyetylglycin blir koplet med et tymin som nukleobase. Etter spaltningen av den terminale Dmt-gruppen med 3% TCA blir den frie hydroksyfunksjonen brakt til reaksjon med fosforyleringsreagenset 1 (figur 4a) under tetrazolkatalyse. Etter foregått kondensasjon ble det for innføring av tio-funksjonen oksidert med Beaucage-reagens (0,075 M 3H-l,2-benzoditiole-3-on 1,1-dioksid i acetonitil). Etter spaltningen med ammoniakk oppnår man 66,5 OD råprodukt. 61 OD produktet ble renset med elektroforese over en 15% PAA-gel. Man oppnår 12,4 OD. Produktet ble analysert med negativion-massespektrometeri, hvilket bekreftet den beregnede massen (beregnet 3141; funnet 3140).

Fortegnelse over forkortelse:

ACN aceonitril

BOC tert-butyloksykarbonyl

C, c pseudo-iso-cytosin

COS CV1 origin SV 40

CPG kontrollert poreglass (controlled pore glass)

DCM diklormetan

DIPEA diisopropyletylamin

DMEM Dulbecco's MEM

DMF dimetylformamid

Dmt dimetoksytrityl

DNA desoksyribonukleinsyre

DNP dinitroaryl

FITC fluoresceinisotiocyanat

Fmoc fluorenylmetoksykarbonyl

HATU 0-(7-azabenzotriazol-1 -yl)-1,1,3,3 -tetrametyluronium-heksafluorfosfat

HBTU 0-(benzotriazol-1 -yl)-1,1,3,3 -tetrametyluronium-heksafluorfosfat

hex -NH-(CH2)6-OH

MEM modifisert Eagle's minimal essensielt medium ("Modified Eagle's

minimal essential medium"

Mmt monometoksytrityl

OD optisk tetthet

oeg N-(2-hydroksyetyl)glycin

PAA polyakrylamid

PG beskyttelsesgruppe

PNA polyamidnukleinsyre

RNA ribonukleinsyre

TBTU 0-(benzotriazol-1 -yl)-1,1,3,3-tetrametyluronium-tetrafluorborat TCA trikloreddiksyre

THF tetrahydrofuran

TR syrelabil beskyttelsesgruppe

Figurene la, lb, 2b og 3b viser eksempler på terminale Z rester.

Figurene 2a og 3a viser eksempler på brodannende X rester.

Figurene 4a, 4b, 4c og 4d viser eksempler på fosforyleringsreagenser.

Figurene 5a og 5b viser eksempler på den enkle (A, B) og multiple (C til F) N-terminale derivatisering av PNA.

Claims (35)

1. PNA-derivat av formelen I,

hvor V er lik oksygen, svovel, NRi, en gruppe U-(CR3R4)U'-C(0)-NH eller en gruppe U-(CY2CH20)u-CH2-C(0)-NH, U er uavhengig av hverandre lik oksygen, svovel eller NH, u' er uavhengig av hverandre lik 1 til 10, fortrinnsvis 1 til 4, spesielt foretrukket 1, W er uavhengig av hverandre lik oksygen, svovel eller NRi, Y er uavhengig av hverandre hydroksy, merkapto, oksyanion, tioat eller NRiR2, Ri og R2betyr uavhengig av hverandre en rest bestående av hydrogen eller C\- C6- alkyl, fortrinnsvis hydrogen, R3og R4betyr uavhengig av hverandre en rest bestående av hydrogen eller C1-C6- alkyl, eller resten av en aminosyre-sidekjede, fortrinnsvis hydrogen, X er uavhengig av hverandre lik en gruppe U-(C2-C22-alkandiyl)-U eller en gruppe U-(CH2CH2-OV, eller X er lik en bifunksjonell markørgruppe, fortrinnsvis fra gruppen fluorescein-, rhodamin-, TAMRA-, biotin-, pyren-, dinitrofenyl-, kolesteryl-, acridin-, cyaninfargestoff-, dabcyl-, digoxigenin- eller edans-derivatene, spesielt foretrukket et biotin-derivat, eller X er lik en bifunksjonell gruppe til tverrbinding med komplementære nukleinsyrer, fortrinnsvis et psoralen-derivat, eller X er lik en bifunksjonell gruppe som begunstiger det intrazellulære opptaket, fortrinnsvis fra gruppen av kolesteryl-, adamantyl- og vitamin E-derivater, eller X er lik en bifunksjonell gruppe som øker bindingsaffiniteten til PNA-derivatet til en bærer-nukleinsyre, fortrinnsvis akridin- og lexitropsin-derivat, Z er lik hydroksy, merkapto, oksyanion, tioat eller NR1R2, Ci-C22-alkyl, Ci-Cg- Arylalkyl, Ci-C22-alkyl-U, Ci-Cg-arylalkyl-U, hydroksy-Ci-Cig-U, aminoalkyl-U, merkaptoalkyl-U, eller en gruppe av formel R9(CH2CH2-0)m, hvor R9er lik hydroksy, amino eller Ci-C22-alkoksy og m er lik 1 til 100, fortrinnsvis 2 til 10, eller Z er en monofunksjonell eller bifunksjonell markørgruppe, fortrinnsvis fra gruppen fluorescein-, rhodamin-, TAMRA-, biotin-, pyren-, dinitrofenyl-, acridin-, cyaninfargestoff-, dabcyl-, digoxigenin-, edans-deirvatene, spesielt foretrukket et biotin-derivat, eller Z er lik en monofunksjonell eller bifunksjonell tverrbindende gruppe, fortrinnsvis en psoralen-derivat, eller Z er lik en monofunksjonell eller bifunksjonell gruppe som begunstiger det intrazellulære opptaket, fortrinnsvis fra gruppen kolesteryl-, adamantyl- og vitamin-E-derivatene, eller Z er lik en monofunksjonell eller bifunksjonell gruppe som øker bindingsaffiniteten til PNA-derivatet til en bære-nukleinsyre, fortrinnsvis et lexitropsin-derivat, n er like 0 til 10, fortrinnsvis 0 til 3, Q er lik hydroksy, amino, NHR7, NR7R8, aminosyre-derivat eller en peptid-rest, R7og Rg er uavhengig av hverandre C1 -C1 g-alkyl eller hydroksy-C 1 -C1 g-alkyl, og hvor {POLY} beskrives av formelen II

hvor {BLOKK} uavhengig av hverandre enten beskrives med formel HIA,

eller med formel UIB,

hvor hver byggstein {BLOKK} kan være forskjellig, og hvor det videre gjelder at z' er lik 0 til 100, fortrinnsvis 1 -20, spesielt foretrukket 4-15, A er uavhengig av hverandre en gruppe (CRiR2)shvor s er lik 1 til 3, fortrinnsvis 1, B er uavhengig av hverandre enten en aromatisk rest som også kan ha heteroaromatisk karakter eller hydrogen, eller hydroksy, eller Ci-Cig-alkyl, eller en innen nukleotidkjemien vanlig naturlig forekommende eller ikke naturlig forekommende nukleobase eller dens prodrogform, hvor minst en rest B i formel II er en nukleobase, D er uavhengig av hverandre en gruppe (CR3R4X, hvor t er lik 2 til 10, fortrinnsvis 2 til 4, spesielt foretrukket 2, hvor to naborester R3og R4også kan danne en Cs-Cg-cykloalkylring, E er uavhengig av hverandre en gruppe (CR5R6) hvor to naborester R5og Ré også kan danne en C5- til Cs-cykloalkyl-ring eller en spiroforbindelse, Rs og R6betyr uavhengig av hverandre en rest bestående av hydrogen eller C1-C6- alkyl, fortrinnsvis hydrogen eller en aminosyre-sidekjede, så vel som fysiologisk akseptable salter av PNA-derivatene med formel I, med det forbehold at minst en av restene Y eller Z er lik hydroksy, merkapto, oksyanion eller tioat.

2. PNA-derivat ifølge krav 1,karakterisert vedat minst en Y eller Z rest i formel I er oksyanion eller tioat i et pH-område på 4,5 til 14.

3. PNA-derivat ifølge et av kravene 1 til 2,karakterisertved at D er lik (CH2)2.

4. PNA derivat ifølge et av kravene 1 til 3,karakterisertved at A og E er lik CH2.

5. PNA-derivat ifølge et av kravene 1 til 4,karakterisertved at Q er lik en hydroksyaminoalkylrest, fortrinnsvis en hydroksyaminoheksyl-rest eller lik en bærersekvens fortrinnsvis transportan, insulin-lignende vektfaktor (Insulin-like Growth Factor), nuklear lokaliseirngssignal (Nuclear Localisation Signale) eller en affinitets-tag, fortrinnsvis en (His)6-kjede.

6. PNA-derivat ifølge et av kravene 1 til 5,karakterisertved at B er lik adenin, cytosin, 5-metylcytosin, guanin, thymin og uracil, eller lik purin, 2,6-diaminopurin,N<4>N4-etanocytosin,N<6>N6-etano-2,6-diaminopurin, 5-(C3-Cé)-alkynyl-uracil, 5-(C3-C6)-alkynyl-cytosin, 5-(l-propargylamino)-uracil, 5-(l-propargylamino)-cytosin, fenoksazin, 9-aminoetoksyfenoksazin, 5-fluor-uracil eller pseudoisocytosin, 5-(hydroksymetyl)uracil, 5-aminouracil, pseudouracil, dihydrouracil, 5-(C|-C6)-alkyl-uracil, 5-(Ci-C6)-alkyl-cytosin, 5-(C2-C6)-alkenylcytosin, 5-fluorcytosin, 5-kloruracil, 5-klorcytosin, 5-bromuracil, 5-bromcytosin, 7-deazaadenin, 7-deazaguanin, 8-azapurin eller 7-deaza-7-substituert purin.

7. PNA-derivat ifølge et av kravene 1 til 6,karakterisertved at W er lik oksygen og Y er lik hydroksy eller oksyanion.

8. PNA-derivat ifølge et av kravene 1 til 7,karakterisertved at X er lik en gruppe U-( C2-C22-alkandiyl)-U, fortrinnsvis 0-( C2-C22-alkandiy)-0, spesielt foretrukket 0-(CH2)2-6-0, eller er lik en gruppe U-(CH2CH2-0)U', fortrinnsvis U-(CH2)2-6-0)u-, hvor u' fortrinnsvis er 1 til 6.

9. PNA-derivat ifølge et av kravene 1-8,karakterisertved at Z er lik fosfat eller en Ci- til C22-rest eller en Ci-C22-U-rest, fortrinnsvis en Ci-C22-alkoksy-rest, spesielt foretrukket Ci6-alkoksy, eller hydroksy-Ci-Cis-U, fortrinnsvis hydroksy-Ci-Cig-O, spesielt foretrukket H0-(CH2)3-|20, eller en aminoalkyl-U-rest, fortrinnsvis en aminoalkoksy-rest, spesielt foretrukket 6-aminoheksoksy eller 5-aminopentoksy, eller en gruppe der formel R9-(CH2CH2-0)m, hvor R9fortrinnsvis er OH eller NH2og m er lik 1 til 6, spesielt foretrukket HO(CH2CH2-0)2, HO(CH2CH2-0)6og H2N-(CH2CH2-0)2, eller en merkaptoalkyl-U-rest, fortrinnsvis en merkaptoalkoksy-rest, spesielt foretrukket 6-merkaptoheksyloksy.

10. PNA-derivat ifølge krav 1 til 7,karakterisert vedat X og Z uavhengig av hverandre er valgt blant gruppen biotin-, fluorescein- eller lexitropsin-derivat.

11. PNA-derivat ifølge et av kravene 1 til 7,karakterisertved at X og Z uavhengig av hverandre er valgt blant gruppen rhodamin, TAMRA eller cyanin-fargestoff.

12. PNA-derivat ifølge et av kravene 1 til 7,karakterisertved at X og Z uavhengig av hverandre er valgt blant gruppen dabcyl, psoralen, acridin, DNP eller kolesterol.

13. PNA-derivat ifølge et av kravene 1 til 13,karakterisertv e d at basesekvensen er rettet mot deler av tumorsupressor-gener, onkogener eller telomeraser eller deres transkripsjonsprodukter.

14. PNA-derivat ifølge krav 13,karakterisert vedat basesekvensen til PNA-delen er rettet mot translasjonsstarten til HA-ras mRNA.

15. PNA-derivat ifølge et av kravene 1 til 14 for anvendelse som legemiddel.

16. Anvendelse av PNA-derivat ifølge et av kravene 1-14 for fremstilling av et legemiddel for tumorterapi.

17. PNA-derivat ifølge et av kravene 1 til 14, for anvendelse som diagnostikum.

18. Anvendelse av PNA-derivat ifølge et av kravene 1 til 14 for invitro påvisning av mikroorganismer og/eller virus.

19. Anvendelse av et PNA-derivat ifølge et av kravene 1 til 14 for invitro påvisning og/eller kvantifisering av nukleinsyrer.

20. Anvendelse av et PNA-derivat ifølge et av kravene 1 til 14 som invitro påvisningsreagens for in-situ- eller fluorescens-in-situ-hybridisering.

21. Anvendelse av et PNA-derivat ifølge et av kravene 1 til 14 som invitro antisense-, anti-gen-, avledning- eller chimperaplast-agens.

22. Påvisningsreagens inneholdende et PNA-derivat ifølge et av kravene 1 til 14.

23. PNA-chip inneholdende et PNA-derivat ifølge et av kravene 1 til 14.

24. Biosensor inneholdende et PNA-derivat ifølge et av kravene 1-14.

25. Legemiddel,karakterisert vedat det inneholder et PNA-derivat ifølge et av kravene 1 til 14 og eventuelt ytterligere farmakologisk akseptable tilsetnings- og/eller bærestoffer.

26. Antisens-agens inneholdende et PNA-derivat ifølge et av kravene 1 til 14.

27. Fremgangsmåte for fremstilling av et PNA-derivat ifølge et av kravene 1 til 14,karakterisert veda) at PNA-skjelettet oppbygges startende fra C-terminalen ved hjelp av aktiverte amidnukleinsyrer, og b) ved N-terminalen omsettes med et fosforyleringsreagens.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 27,karakterisert vedat PNA'et fremstilles under anvendelse av beskyttelsesgruppene t-butyloksykarbonyl (BOC), 9-fluorenylmetoksykarbonyl (Fmoc) eller monometoksytrityl (Mmt).

29. Fremgangsmåte ifølge krav 28,karakterisert vedat PNA'et fremstilles under anvendelse av faste bærer.

30. Fremgangsmåte ifølge krav 29,karakterisert vedat det som faste bærer anvendes CPG, tentagel eller aminometylpolystyren.

31. Fremgangsmåte for fremstilling av et legemiddel,karakterisert veda) at det fremstilles et PNA-derivat ifølge et av kravene 27 til 30, og b) eventuelt omsettes med videre farmakologisk akseptable tilsetnings-og/eller bærestoffer.

32. Fremgangsmåte for fremstilling av en PNA-chip,karakterisert vedat enten fremstilles først et PNA-derivat ifølge et av kravene 27 til 30 og dette fikseres deretter til en fast bærer eller PNA-derivatet fremstilles direkte på bæreren.

33. Fremgangsmåte for fremstilling av en PNA-derivat med formel I ifølge krav 27 til 30, viderekarakterisert vedat PNA'et renses ved hjelp av kromatografi eller elektroforese under utnyttelse av den sure karakteren til fosforresten.

34. Fremgangsmåte ifølge krav 33,karakterisert vedat et PNA-derivat renses gjennom kromatografi ved hjelp av en basis stasjonær fase og en sur eller saltholdig eluent.

35. Fremgangsmåte ifølge krav 34,karakterisert vedat den stasjonære fasen er en anionbytter eller en "Mixed-Mode"-fase.