JP2004502649A - 負電荷を有するペプチド核酸誘導体、薬剤ならびにその製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＰＮＡ誘導体に関し、該誘導体は、ＰＮＡ主鎖のＮ末端上に、例えばホスフェートまたは置換ホスホリル基、置換ホスホリル誘導体のようなホスホリル基を有し、必要であれば、１以上のマーカー基、架橋のための基、細胞内吸収を促進する基、またはＰＮＡ誘導体の核酸に対する結合親和性を高める基を有する。また本発明は、上記ＰＮＡ誘導体の製造方法、および医薬や診断薬としてのそれらの使用に関する。

Description

【０００１】
本発明は、改善された特性を有するＮ末端リン酸化ポリアミド核酸（ＰＮＡ）誘導体、その使用、薬剤およびその製造方法に関する。
【０００２】
ポリアミド核酸は、ペプチド核酸（ＰＭＡ）とも称され、天然オリゴヌクレオチドより高い親和性で相補標的配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に結合し、さらに、天然ＤＮＡに比べて、血清中で非常に安定であるという利点を有する。ＰＮＡは、当初、全ての糖−リン酸主鎖がＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位で置換された非天然核酸類似体として説明された（Ｍ． Ｅｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４， １４９７−１５００； ＷＯ ９２／２０７０２； Ｍ． Ｅｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ （１９９３） ３６５， ５６６−５６８； Ｐ． Ｎｉｅｌｓｅｎ， （１９９４） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５， ３−７； Ｅ． Ｕｈｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３７， ２７９６−２８２３）。用いられた塩基は、天然に存在する核酸塩基やヌクレオチド化学で慣用のもの、または天然に存在しない核酸塩基、もしくはそれらのプロドラッグ型、すなわち体内で生体内変化により遊離塩基へのみ転換する前駆物質である。これに加えて、ＰＮＡは、主鎖の全ての位置に塩基残基を有するわけではないこと（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ８２， ２１５１）、アミノエチルグリシンがより複雑な単位で置換されていること（Ｕｈｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ３７， ２７９６； Ｆａｌｋｉｅｗｉｃｚ （１９９９） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｐｏｌ．， ４６， ５０９−５２９）が説明されている。
【０００３】
ＰＮＡ主鎖が実効電荷を全く持たないということは、この種の物質の重要な特徴であり、遠大な重要性を有する。ＰＮＡが、ワトソン−クリック塩基対の規則に従って低い塩濃度でも相補ＤＮＡまたはＲＮＡに結合するのは（例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ； Ｐｅｔｅｒ Ｅ． Ｎｉｅｌｓｅｎ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｅｇｈｏｌｍ （Ｅｄｉｔ．） Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９９， ３）、ＰＮＡの中性特徴と、それに関連する電荷反発の減少のためである。この理由のために、ＰＮＡは、天然オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体が別の方法で用いられるような多数の用途に大概用いることができる。さらにこれに加えて、独特な結合特性により、天然オリゴヌクレオチドでは不可能な多くの用途をも確実にする（例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ； Ｐｅｔｅｒ Ｅ． Ｎｉｅｌｓｅｎ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｅｇｈｏｌｍ （Ｅｄｉｔ．） Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９９を参照）。例えば、ＰＮＡを用いると、二本鎖ＤＮＡの鎖の逆位が観察された。
【０００４】
ＰＮＡに関する用途の典型的な例としては、配列特異的な方法によって細胞のＤＮＡまたはＲＮＡに結合することにより遺伝子発現を阻害するのにＰＮＡを使用することがあげられる。「アンチセンス剤」は、ワトソン−クリック塩基対の方法で相補ｍＲＮＡに結合し、その相当するタンパク質への翻訳を阻害するような、短い、単鎖の核酸誘導体である（Ｕｈｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｅｙｍａｎ（１９９０） Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９０， ５４３； Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １４８９， １５９）。「アンチ遺伝子剤」は、フーグスティーン型塩基対を介してＤＮＡ二重らせんの主溝に結合し、三重らせんを形成し、遺伝子転写を配列特異的な方法によって阻害する（Ｐｒａｓｅｕｔｈ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １４８９， １８１）。また遺伝子発現は、転写因子を結合させるための領域に類似した、いわゆるおとりオリゴマーによって特異的に阻害できる。おとり剤で処理することによって、特定の転写因子を配列特異的な方法で捕獲し、それによる転写の活性化を阻害することができる（Ｍｉｓｃｈｉａｔｉ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４， ３３１１４）。細胞内で作用するオリゴヌクレオチド誘導体の他の群、すなわちキメラプラストは、特異的な遺伝子の校正に用いられる（Ｃｏｌｅ−Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３， １３８９−１３８９）。
従って、ＰＮＡは、医薬および／または診断薬として用いることができ、または、医薬および／または診断薬を製造するために用いることができる。
【０００５】
例えば、ＰＮＡは、ビオチン、フルオレセインまたは他の標識で標識した後、診断目的で用いることができ、さらに、分子生物学において特異的なハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。これまで、標識基の導入に関する４種の方法が文献で説明されている（Ｏｅｒｕｍ ｅｔ ａｌ． （１９９９）、ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐａｇｅｓ ８１−８６； Ｌｏｈｓｅ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ８， ５０３）。第一の方法は、遊離の（脱保護された）ＰＮＡを溶液中で合成した後に標識することに基づく。この方法で、ＰＮＡのアミノ末端は活性化カルボン酸またはイソチオシアネートと反応する。しかしながら、追加のリシン残基がしばしばＰＮＡに導入され、これら残基はその後フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）と反応する。
【０００６】
第二の方法では、保護されたＰＮＡは、まだ固相上にある間に、そのアミノ末端が活性化カルボン酸誘導体またはイソチオシアネートで修飾される。この方法は、標識基が、ＰＮＡの脱保護中および支持体からの分離中における状況下でも安定である場合にのみ適切である。両方の方法で好ましく用いられる反応試薬は、イソチオシアネート（Ｐ． Ｗｉｔｔｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， （１９９５） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３７５， ２７）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）のような活性化カルボン酸（Ｏｅｒｕｍ ｅｔ ａｌ．， １９９９）である。ＮＨＳ誘導体を用いる反応の不利益は、しばしば不十分な収量にしか到達しないことである。この理由として、これはＰＮＡと標識基との間のリンカーまたはスペーサーとしての８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸がしばしば凝集することがある（Ｏｅｒｕｍ ｅｔ ａｌ． １９９９）。両方の結合はアミド結合またはチオウレア結合を介して形成されるが、それ自体を不溶性にしてしまうことがある。別な方法では、カルボン酸を、ペプチド化学において慣用のもの、例えばＨＢＴＵ、ＴＢＴＵまたはＨＡＴＵのような活性化剤を用いて反応させる。
【０００７】
【化６】

【０００８】
第三の方法で、固相上でのＰＮＡ合成中にフルオレセイン複合単量体を用い、アミド結合を介してフルオレセイン標識を形成し（Ｌｏｈｓｅ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ８， ５０３）、ふたたび比較的溶解しにくい複合体にする。
【０００９】
第四の方法は、ＰＮＡペプチド複合体を用い、そのペプチド部分はプロテインキナーゼの基質になる（Ｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ３６， ６９３３）。従って、この方法では、修飾されるのはＰＮＡ部分ではなく、むしろペプチド部分のセリン残基が酵素的にリン酸化される。従って、この方法を用いる場合、ＰＮＡペプチド複合体のペプチド部分に、例えばフルオレセインまたはビオチンのいずれでもなく放射性ホスフェートのみを導入することができる。
【００１０】
【化７】

【００１１】
ＰＮＡは水溶液中で凝集する傾向があり、すなわち生理的条件下でも同様であることが知られている。従って、ＰＮＡは、水性緩衝液中での可溶性が不十分であり、そのため相補配列へのハイブリダイゼーションに利用できない。その上、ＰＮＡは、オリゴマーを精製するのに用いられるＳｅｐｈａｄｅｘ：登録商標（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）、Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔ：登録商標（Ｖａｒｉａｎ製）などの様々な材料または様々なＨＰＬＣクロマトグラフ材料に高い親和性を有し、これは、ＰＮＡがしばしば不十分な収率でしか分離されないことを意味する。従って、ＰＮＡとリシンまたは他の正電荷を有するアミノ酸とを（Ｃ末端を介して）複合する必要がある（Ｅｇｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ （１９９２） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１４， １８９５）。グアニンの多いＰＮＡ配列は、非常に独特な凝集傾向を有し、そのため、このようなＰＮＡを用いないことが勧められる（“Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＰＮＡ ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ” ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （１９９９） ｐａｇｅｓ ２５３−２５５を参照）。例えば、比較的長いフルオレセイン標識ＰＮＡオリゴマーは特に溶解しにくく、有機溶媒の添加や５０℃への加熱が推奨される。
【００１２】
可溶性が不十分な親油性ＰＮＡ誘導体を精製することは特に難しい。ＰＮＡ凝集による数種のピークが、ＨＰＬＣでしばしば検出される。ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ゲル電気泳動技術は、核酸を精製し分離するのに頻繁に用いられるが、これらＰＮＡ誘導体には用いることができない。
【００１３】
上述のＰＮＡを誘導体化する方法では、標識基は常にアミド結合またはチオアミド結合を形成することによって導入され、比較的溶解しにくいＰＮＡ誘導体が形成される。特に、フルオレセインのような親油性残基が導入された場合、可溶性が不十分なＰＮＡ誘導体が形成される。その上、標識化反応がしばしば不十分な収率で進行するため、達成すべき目的は、高収率での製造が可能であり、改善された溶解性、改善された結合反応およびより優れた細胞吸収などの有利な特性を示し、さらに加えて、ＰＮＡオリゴマーを精製するための効率的な方法を使用できる、利用可能な新しいＰＮＡ誘導体を製造するにすることにある。
【００１４】
本発明によれば、この目的は、ＰＮＡ主鎖のＮ末端に１または２以上のホスホリル基を有する、利用可能なＰＮＡ誘導体を製造することによって達成され、該ＰＮＡ誘導体は、オキソ誘導体に加えてチオ誘導体およびイミノ誘導体も含み、少なくとも１つのホスホリル基が１または２以上の脱プロトン化できる基、好ましくはヒドロキシル基またはメルカプト基を有する。ホスホリル基は、それぞれ直接的またはスペーサーを介して、酸素−リン結合、硫黄−リン結合または窒素−リン結合を介してＰＮＡ主鎖に結合し、該スペーサーは、例えばアルカノイルアミド、ポリ（アルコキシ）カルボキシアミドまたはアミノ酸であることが可能であり、これらは必要に応じてα−Ｃまたはβ−Ｃ原子に側鎖を有し、この側鎖は全くホスホリル基を有さない。ホスホリル基の例としては、ホスフェート基、ホスホネート基、チオホスフェート基、ホスホアミデート基（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄａｔｅ）および置換ホスホリル基があり、置換ホスホリル基は、必要に応じて、１以上の標識基、または架橋のための基、または細胞内吸収を促進する基、またはＰＮＡ誘導体の核酸への結合親和性を高める基を有する。
【００１５】
この点について、標識基（標識）は、ＰＮＡ誘導体の化学的または生物学的活性を質的または量的に評価できる基であることとし、例えばビオチンまたはフルオレセインである。架橋は、空間的に隣接した官能基間での分子内または分子間の結合を形成するものとする。架橋のための基の例としては、ソラレン基がある。
【００１６】
本発明は、好ましくは、式ＩのＰＮＡ誘導体に関する。
【化８】

式中、
Ｖは、酸素、硫黄、ＮＲ_１、Ｕ−（ＣＲ_３Ｒ_４）_ｕ’−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ基またはＵ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｕ’−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ基であり、
Ｕは、それぞれ独立して、酸素、硫黄またはＮＨであり、
ｕ’は、それぞれ独立して、１〜１０、好ましくは１〜４、特に好ましくは１であり、
【００１７】
Ｗは、それぞれ独立して、酸素、硫黄またはＮＲ_１であり、
Ｙは、それぞれ独立して、ヒドロキシル、メルカプト、オキシアニオン、チオエートまたはＮＲ_１Ｒ_２であり、
Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立して、水素を含む基またはＣ_１〜Ｃ_６アルキル、好ましくは水素であり、
Ｒ_３およびＲ_４は、それぞれ独立して、水素を含む基もしくはＣ_１〜Ｃ_６アルキル、またはアミノ酸側鎖の基、好ましくは水素であり、
【００１８】
Ｘは、それぞれ独立して、Ｕ−（Ｃ_２〜Ｃ_２２−アルカンジイル）−Ｕ基またはＵ−（ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ）_ｕ’基であり、
または、標識基もしくは架橋のための基、または細胞内吸収を促進する基、またはＰＮＡ誘導体の核酸への結合親和性を高める基であり、例えば、二官能価のフルオレセイン、ローダミン、ＴＡＭＲＡ、ビオチン、ピレン、ジニトロフェニル基、コレステリル基、アクリジン、アダマンチル、ビタミンＥ、シアニン色素、Ｄａｂｃｙｌ、Ｅｄａｎｓ、レキシトロプシン、ソラレン基、ＢＯＤＩＰＹ基、ＲＯＸ基、Ｒ６Ｇ基またはジゴキシゲニン基であり、
【００１９】
Ｚは、ヒドロキシル、メルカプト、オキシアニオン、チオエートまたはＮＲ_１Ｒ_２、Ｃ_１〜Ｃ_２２アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_８アリールアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_２２アルキル−Ｕ、Ｃ_１〜Ｃ_８アリールアルキル−Ｕ、ヒドロキシ−Ｃ_１〜Ｃ_１８−Ｕ、アミノアルキル−Ｕまたはメルカプトアルキル−Ｕであり、
または、式Ｒ_９（ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ）_ｍであり、式中、Ｒ_９はヒドロキシル、アミノまたはＣ_１〜Ｃ_２２アルコキシであり、ｍは１〜１００、好ましくは２〜１０であり、または、標識基もしくは架橋のための基、または細胞内吸収を促進する基、またはＰＮＡ誘導体の核酸への結合親和性を高める基であり、例えば、一官能価または二官能価のフルオレセイン、ローダミン、ＴＡＭＲＡ、ビオチン、ピレン、ジニトロフェニル基、コレステリル基、アクリジン、アダマンチル基、ビタミンＥ、シアニン色素、Ｄａｂｃｙｌ、Ｅｄａｎｓ、レキシトロプシン、ソラレン、ＢＯＤＩＰＹ基、ＲＯＸ基、Ｒ６Ｇ基またはジゴキシゲニン基であり、
【００２０】
ｎは０〜１０、好ましくは０〜３であり、
Ｑは、ヒドロキシル、アミノ、ＮＨＲ_７、ＮＲ_７Ｒ_８、アミノ酸誘導体またはペプチド基であり、
Ｒ_７およびＲ_８は、それぞれ独立して、Ｃ_１〜Ｃ_１８アルキルまたはヒドロキシ−Ｃ_１〜Ｃ_１８アルキルであり、
ただし、少なくとも１つのＹ基またはＺ基は、ヒドロキシル、メルカプト、オキシアニオンまたはチオエートである。
【００２１】
｛ＰＯＬＹ｝は、式ＩＩで示される。
【化９】

【００２２】
ＰＮＡ主鎖は、結果的に、ｚ’＋１個の単量体で構成され、｛ＢＬＯＣＫ｝は、それぞれ独立して、式ＩＩＩＡ
【化１０】

または式ＩＩＩＢ（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ８２， ２１５１）
【化１１】

から、または、式ＩＶＡ〜ＩＶＧ（Ｕｈｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ３７， ２７９６； Ｆａｌｋｉｅｗｉｃｚ （１９９９） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｐｏｌ．， ４６， ５０９−５２９）
【化１２】

から選択される基である。
【００２３】
式中、それぞれの構築ブロック｛ＢＬＯＣＫ｝は異なってよく、
さらに、
Ａは、それぞれ独立して、（ＣＲ_１Ｒ_２）_ｓ基であり、ここでｓは１〜３、好ましくは１であり、
Ｂは、それぞれ独立して、ヘテロ芳香族の特徴を有し得る芳香族基、または水素、またはヒドロキシル、またはＣ_１〜Ｃ_１８アルキルのいずれかであり、
または、天然に存在しかつヌクレオチド化学で慣用の核酸塩基、または天然に存在しない核酸塩基、またはそれらのプロドラッグ型であり、ここで式ＩＩ中の少なくとも１つのＢ基は核酸塩基であり、
【００２４】
Ｄは、それぞれ独立して、（ＣＲ_３Ｒ_４）_ｔ基であり、ここでｔは２〜１０、好ましくは２〜４、特に好ましくは２であり、
さらに、Ｒ_３およびＲ_４は、前述した意味であり、また２つの隣接したＤ基はＣ_５〜Ｃ_８シクロアルキル環を形成することができ、
Ｅは、それぞれ独立して、（ＣＲ_５Ｒ_６）_ｕ’基であり、ここで２つの隣接したＲ_５基およびＲ_６基はまた、Ｃ_５〜Ｃ_８シクロアルキル環またはスピロ化合物を形成することができ、
Ｒ_５およびＲ_６は、それぞれ独立して、水素またはＣ_１〜Ｃ_６アルキルを含む基、好ましくは水素、またはアミノ酸側鎖の基であり、
ｚ’は、０〜１００、好ましくは１〜２０、特に好ましくは４〜１５である。
【００２５】
加えて、本発明は、式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体の生理学的に許容される塩に関する。生理学的に許容される塩は、特に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８５） Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， ＵＳＡ， ｐａｇｅ １４１８で説明される。好ましくは、アンモニウム塩、トリアルキルアンモニウム塩、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩やカリウム塩）およびアルカリ土類金属塩（例えばマグネシウム塩やカルシウム塩）である。特に好ましくはナトリウム塩である。
【００２６】
驚いたことに、式Ｉで示される化合物の特性を決定的に改善するのに、ホスホリル基の部分的な負電荷がすでに十分であることが見出された。ＰＡＡゲル電気泳動の際にＰＮＡそのものは移動しないのに、式Ｉで示される化合物は陽極へ移動する。ホスホリル基は、式Ｉで示される化合物の合成における最後のサイクルでのみ導入されるため、ＰＡＡゲル電気泳動の際に電場に移動するのは本発明に係る化合物のみであり、その一方で誤った配列や副産物は全て移動せず、その結果極めて簡単な方法で分離することができる。
【００２７】
本発明に係るＤＮＡ誘導体のホスホリル基のヒドロキシ置換基またはメルカプト置換基を、ｐＨ４．５〜１４、好ましくは６．５〜１２、特に好ましくは６．５〜９の範囲で脱プロトン化することができる。ホスホリル基のイオン化特性を、式Ｉで示される化合物の精製に有利に用いることができる。一方で、式Ｉで示される化合物は、電気泳動、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製することができる。一方で、陰イオン交換体を用いて該化合物を精製することもできる。この場合、所望の生産物は、塩濃度勾配、例えば塩化ナトリウム濃度勾配、またはｐＨ勾配を用いて溶出させることが好ましい。本発明に係る式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体は、陰イオン交換体を用いて特に簡単かつ効率的に精製できる。電荷を有する生産物はカラムに吸着するが、電荷を持たない副産物は陰イオン交換体に吸着しないことが見出された。水で洗浄した後、酢酸または塩化ナトリウム溶液を用いて、所望の生産物を純粋な形態で分離することができた。用いられた陰イオン交換体は、好ましくは強陰イオン交換体または混合モード相であり、例えばＯａｓｉｓ ＭＡＸ：登録商標（Ｗａｔｅｒｓ ＧｍｂＨ， Ｅｓｃｈｂｏｒｎ）である。
【００２８】
さらに、本発明に係る式Ｉで示される化合物は、ホスホリル基を有さない相当ＰＮＡオリゴマーに比べて、概して水性媒体により容易に溶解するということが見出された。フルオレセイン誘導体またはヘキサデシル誘導体のような親油性誘導体の場合、水性媒体への可溶性が大きく改善されるため、このような特徴が特に著しく明白である。
【００２９】
見出された追加の驚くべき正電荷の効果は、例えばホスフェートなどのようなホスホリル基を親油性誘導体（例えばヘキサデシルホスホジエステルのような）に導入することにより、相補ＤＮＡまたはＲＮＡへのＰＮＡの親和性が高められることであった。この効果は予想外であり、なぜならＰＮＡの相補ＤＮＡまたはＲＮＡへの強い結合は、ＰＮＡの中性特徴と、それに関連する電荷反発の減少によるものだからである（例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ； Ｐｅｔｅｒ Ｅ． Ｎｉｅｌｓｅｎ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｅｇｈｏｌｍ （Ｅｄｉｔ．） Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９９， ３）。
【００３０】
ビオチンは、ホスホリル基を介して特に効率的に導入された。ハイブリダイゼーションプローブとして用いる場合、式Ｉで示されるビオチン化ＰＮＡ（Ｘおよび／またはＺがビオチン基）は、相当するビオチン化ＤＮＡプローブより、優れた結合特性を示し、かつ、誤りの非特異的なバックグラウンドエフェクトが少なかった。
【００３１】
また、電荷を持たないＰＮＡとは異なり、本発明に係る式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体は、電場に移動することができ、それにより該ＰＮＡ誘導体をミクロレベルで位置確認し（ｍｉｃｒｏｌｏｃａｔｅ）、固定化相補核酸誘導体上にそれらを濃縮することができる。ポリ陰イオン系オリゴヌクレオチドの場合、電場を用いた本方法は、塩基のミスマッチの迅速な決定としてすでに説明されている（Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４， １１１９）。
【００３２】
本発明は、特に、ＡおよびＥがＣＨ_２であるＰＮＡ誘導体に関する。さらに本発明は、特にＤ置換基が（ＣＨ_２）_２であるＰＮＡ誘導体に関する。また好ましくは、Ｖ、ＷおよびＹが酸素である、式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体である。
【００３３】
天然の塩基の例としては、アデニン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、チミンおよびウラシルがある。非天然の塩基の例としては、プリン、２，６−ジアミノプリン、Ｎ^４Ｎ^４−エタノシトシン、Ｎ^６Ｎ^６−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−（Ｃ_３〜Ｃ_６）−アルキニルウラシル、５−（Ｃ_３〜Ｃ_６）−アルキニルシトシン、５−（１−プロパルギルアミノ）ウラシル、５−（１−プロパルギルアミノ）シトシン、フェノキサジン、９−アミノエトキシフェノキサジン、５−フルオロウラシルまたはシュードイソシトシン、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−アミノウラシル、シュードウラシル、ジヒドロウラシル、５−（Ｃ_１〜Ｃ_６）−アルキルウラシル、５−（Ｃ_１〜Ｃ_６）−アルキルシトシン、５−（Ｃ_２〜Ｃ_６）−アルケニルシトシン、５−フルオロシトシン、５−クロロウラシル、５−クロロシトシン、５−ブロモウラシル、５−ブロモシトシン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、８−アザプリン、および７−デアザ−７−置換プリンがある。
【００３４】
Ｑは、好ましくはヒドロキシアルキルアミノ基、特に、ヒドロキシヘキシルアミノ基であるか、または、既知の天然または非天然のアミノ酸誘導体もしくはペプチド誘導体である。適切なペプチド配列は、好ましくは、ＰＮＡの器官分布または細胞内局在を最適化した配列、例えばトランスポータン、インスリン様成長因子、核局在化シグナルまたは他のキャリアー配列である（Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １５９−１６６）。またペプチドも、親和性タグとして用いることができ、例えば（Ｈｉｓ）_６鎖である。
【００３５】
本発明は、Ｘ基およびＺ基を広範囲に変化させることができ（例えば、図１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａおよび３ｂがある）、それによって、ＰＮＡに様々な特異的な機能特徴を導入することを可能にする。
【００３６】
Ｚの好ましい実施形態は、Ｃ_１〜Ｃ_２２アルキル基である。また、Ｃ_１〜Ｃ_２２アルコキシ基、特にＣ_１６アルコキシ基も好ましい。他の好ましい基は、ヒドロキシ（Ｃ_１〜Ｃ_１８アルコキシ）基、特にＨＯ（ＣＨ_２）_３−１２Ｏである。また、アミノアルコキシ基、特に６−アミノヘキソキシ基や５−アミノペントキシ基も好ましい。また、式Ｒ_９（ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ）_ｍで示される基も好ましく、式中、Ｒ_９はヒドロキシル、アミノまたはＣ_１〜Ｃ_２２アルコキシ、好ましくはヒドロキシルであり、ｍは０〜１００、好ましくは２〜１０である。特に、ＨＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ）_２、ＨＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ）_６およびＨ_２Ｎ−（ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ）_２が好ましい。Ｚの他の好ましい例としては、メルカプトアルコキシ基、特に６−メルカプトヘキシルオキシがある。
【００３７】
他の好ましい実施形態において、Ｚは、フルオレセイン、ローダミン、ＴＡＭＲＡまたはシアニン色素のような蛍光性の基を含む。好ましい蛍光性の基を、図１ａ〜３ｂに示す。また、Ｚがビオチンであることも特により好ましい。Ｚに関する他の好ましい基としては、Ｄａｂｃｙｌ、ソラレン、アクリジン、ＤＮＰおよびコレステロール（図１ｂおよび２ｂ）、ＢＯＤＩＰＹ基、ＲＯＸ基またはＲ６Ｇ基（Ｓｕ−Ｃｈｕｎ Ｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５５， ３２−３８）ならびにジゴキシゲニン（Ｔａｒｒａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｏｌｏｇｙ （１９９９） Ｖｏｌ． ３１３， ２５７−２６８）がある。これに加えて、Ｚは、一官能価または二官能価のフルオレセイン、ローダミン、ＴＡＭＲＡ、ビオチン、ピレン、ジニトロフェニル基、コレステリル基、アクリジン、アダマンチル基、ビタミンＥ、シアニン色素、Ｄａｂｃｙｌ、Ｅｄａｎｓ、レキシトロプシン、またはソラレン基であり得る。一官能価の末端の基は、図１ａ、図１ｂ、図２ａおよび図３ａで示される例を介して形成され、一方、二官能価の結合基は図２ｂおよび図３ｂに記載される。他の好ましい実施形態において、ｎは０、すなわちＰＮＡ部分はホスフェートまたはホスホリル基を１つだけ有する。
【００３８】
Ｘの好ましい例は、Ｕ−（Ｃ_２〜Ｃ_２２アルカンジイル）−Ｕ、特にＯ−（Ｃ_２〜Ｃ_２２アルカンジイル）−Ｏであり、特に好ましくはＯ−（ＣＨ_２）_２−６−Ｏである。Ｘの他の好ましい実施形態は、式Ｕ−（ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ）_ｕ’で示される基であり、式中、ｕ’は１〜１０、好ましくは１〜６であり、Ｕは好ましくはオキシである。さらに好ましい例において、Ｘは、フルオレセイン、ローダミン、ＴＡＭＲＡまたはシアニン色素（例えばＣｙ３：登録商標（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））のような蛍光性の基を含む。好ましい二官能価の基を、図２ａおよび３ａに示す。また、Ｘがビオチンであることが特により好ましい。Ｘとして好ましい他の基としては、Ｄａｂｃｙｌ、ソラレン基、アクリジン、ＤＮＰ、コレステロール、ＢＯＤＩＰＹ基、ジゴキシゲニン、ＲＯＸ基およびＲ６Ｇ基がある。
【００３９】
式Ｉ中のＸおよびＺに関する基を異ならせることにより、異なる機能を実現することができる。フルオレセイン基は、ＤＮＡ配列決定やシグナル増幅において、または、ＰＮＡの細胞吸収を測定するマーカーとして、広範な用途を有する。シアニン色素基（Ｃｙ３：登録商標およびＣｙ５：登録商標）により、フルオレセインそのものよりも実質的により強くかつより長期持続する蛍光シグナルを得る。ソラレン基は、相補核酸との架橋のために用いられる。アクリジン基は、有効な挿入剤であり、それによって、ＰＮＡの結合親和性を増大させることができる。またビオチン、アクリジンおよびソラレン誘導体も、アンチセンス実験用に用いることができる。加えて、ヘキサデシルオキシおよびコレステロール誘導体は、ＰＮＡが膜を通過する能力を高めるのに用いることができる。式Ｉで示されるＤＮＰで標識した化合物は、抗ＤＮＰ抗体を用いて検出することができる。アミノアルコキシ基は、他の基上にカップリングするのに用いることができ、例えばレキシトロプシンである（実施例１７；ＰＮＡ−１６を参照）。同様の方法において、メルカプトアルコキシ基もまたさらなる誘導のために用いることができる。
【００４０】
さらに本発明は、式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体の医薬としての使用に関する。これら医薬は、特定の遺伝子を発現または過剰発現することによって伴われる病気を予防および／または治療するのに用いることができる。さらに本発明は、式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体の診断薬としての使用に関する。これら診断薬は、上述の病気を初期段階で診断するのに用いることができる。
【００４１】
医薬または診断薬として用いる場合、式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体は、それらの配列に依存する、アンチセンス剤、アンチ遺伝子剤、おとり剤およびキメラプラスト剤として用いることができる。本発明に係るＰＮＡ誘導体は、特に、特定の遺伝子が原因であるかまたはその過剰発現の結果として関与するような病気を治療するための医薬を製造するために用いられる。
【００４２】
これらの医薬は、例えば、ＣＭＶ、ＨＩＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、インフルエンザ、ＶＳＶ、Ｂ型肝炎ウイルスまたはポリオーマウイルスのようなウイルスによって引き起こされる病気を治療するために、対応するウイルスの配列を標的にして用いられる。
【００４３】
これら標的に対して活性な本発明に係るアンチセンスＰＮＡ誘導体は、例えば以下の塩基配列を有する。
ａ）ＣＭＶに対して、例えば、

ｂ）ＨＩＶに対して、例えば、

ｃ）ＨＳＶ−１に対して、例えば、

である。
【００４４】
またこのような医薬は、例えばがんを治療するのにも適している。これに関連して、好ましくは、発がんまたはがんの成長に関与する標的に対して設定された配列を用いることができ、特にテロメラーゼを阻害する（Ｅ． Ｍａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７， １１５２）。この性質を有する追加の標的は、
１）ｃ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｆｏｓ／ｊｕｎ、ＰＣＮＡ、ｐ１２０のような、核内がんタンパク質、
２）ＥＪ−ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ｒｒｇ、ｂｃｌ−２、ｃｄｃ−２、ｃ−ｒａｆ−１、ｃ−ｍｏｓ、ｃ−ｓｒｃ、ｃ−ａｂｌ、ｃ−ｅｔｓのような、細胞質／膜関連がんタンパク質、
３）ＥＧＦ受容体、Ｈｅｒ−２、ｃ−ｅｒｂＡ、ＶＥＧＦ受容体（ＫＤＲ−１）、レチノイド受容体、プロテインキナーゼ調節サブユニット、ｃ−ｆｍｓ、Ｔｉｅ−２、ｃ−ｒａｆ−１キナーゼ、ＰＫＣ−α、およびプロテインキナーゼＡ（Ｒ１α）のような細胞受容体、
４）ＣＳＦ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ミエロブラスチンおよびフィブロネクチンのような、サイトカイン、成長因子および細胞外マトリックス
がある。
【００４５】
このような標的に対して活性なアンチセンスＰＮＡ誘導体は、例えば、以下の塩基配列を有する。
ａ）ｃ−Ｈａ−ｒａｓに対して、例えば、

ｂ）ｂＦＧＦに対して、例えば、

ｃ）ｃ−ｍｙｃに対して、例えば、

ｄ）ｃ−ｍｙｂに対して、例えば、

ｅ）ｃ−ｆｏｓに対して、例えば、

ｆ）ｐ１２０に対して、例えば、

ｇ）ＥＧＦ受容体に対して、例えば、

ｈ）ｐ５３腫瘍サプレッサーに対して、例えば、

ｉ）ｂｃｌ−２に対して、例えば、

ｋ）ＶＥＧＦに対して、例えば、

ｌ）ｃ−ｒａｆキナーゼに対して、例えば、

ｍ）ＰＫＣ−αに対して、例えば、

ｎ）プロテインキナーゼＡに対して、例えば、

である。
【００４６】
さらに、式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体を含む医薬は、例えば、インテグリンや細胞−細胞接着受容体によって、例えばＶＬＡ−４、ＶＬＡ−２、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭまたはＥＬＡＭなどよってもたらされる病気を治療するのに適している。
【００４７】
このような標的に対して活性なアンチセンスＰＮＡ誘導体は、例えば、以下の塩基配列を有する。
ａ）ＶＬＡ−４に対して、例えば、

ｂ）ＩＣＡＭ−１に対して、例えば、

ｃ）ＥＬＡＭ−１に対して、例えば、

ｄ）インテグリンα（Ｖ）に対して、例えば、

である。
【００４８】
また式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体を含む医薬は、例えば再狭窄を防ぐのにも適している。これに関連して、増殖または移動に関与する標的に対して設定されたＰＮＡ配列を用いることができる。このような標的の例は、
１）ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｆｏｓ／ｊｕｎ、サイクリンおよびｃｄｃ２キナーゼのような、核トランスアクチベータータンパク質およびサイクリン、
２）ＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦおよびＴＧＦ−βのようなマイトジェンまたは成長因子、
３）ｂＦＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体およびＰＤＧＦ受容体のような、細胞受容体
がある。
【００４９】
このような標的に対して活性であるアンチセンスＰＮＡ誘導体は、例えば、以下の塩基配列を有する。
ａ）ｃ−ｍｙｂに対して、例えば、

ｂ）ｃ−ｍｙｃに対して、例えば、

ｃ）ｃｄｃ２キナーゼに対して、例えば、

ｄ）ＰＣＮＡ（ラットの増殖性細胞核抗原）に対して、例えば、

である。
【００５０】
ＰＮＡ誘導体は、例えば白皮症や乾癬のような、白斑および他の色素脱失の病気もしくは色素脱失障害（例えば、皮膚、髪および目の）の治療、または、喘息の治療に、アデノシンＡ１受容体、アデノシンＡ３受容体もしくはブラジキニン受容体の発現、またはＩＬ−１３の発現を、適切なアンチセンス剤を用いて阻害することによって同様に用いられる。このような塩基配列の例は、

である。
【００５１】
式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体を含む医薬は、例えば、医薬調剤の形態で用いることができ、該調剤は、例えば錠剤、被覆錠剤、ハードまたはソフトゼラチンカプセル、溶液、乳濁液または懸濁液の形態で経口投与することができる。また該調剤は、例えば座薬の形態で直腸内に投与することもでき、また、例えば注射用溶液の形態で非経口投与することもできる。医薬調剤を製造するために、これらの化合物は、治療上不活性な有機または無機の賦形剤中に加工され得る。錠剤、被覆錠剤およびハードゼラチンカプセル用のこのような賦形剤の例としては、ラクトース、コーンスターチまたはその誘導体、獣脂およびステアリン酸またはその塩がある。溶液を調製するのに適した賦形剤としては、水、ポリオール、スクロース、転化糖およびグルコースがある。注射溶液用の賦形剤に適した賦形剤としては、水、アルコール、ポリオール、グリセロールおよび植物油がある。座薬に適した賦形剤としては、植物油や水素化油、ワックス、脂肪および半液体のポリオールがある。また医薬調剤は、保存剤、溶媒、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、染料、着香料、浸透圧を変えるための塩、緩衝液、被覆剤、抗酸化剤、さらに必要に応じて、他の治療上活性な化合物を含ませることができる。
【００５２】
好ましい投与形態は、例えばカテーテルを用いることによる、または吸入、注射もしくは注入による、表面への適用、局所適用および経口投与である。注射に関して、式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体は溶液、好ましくは、ハンクス液やリンガー液のような、生理学的に許容される緩衝液に配合される。しかしながら、オリゴヌクレオチドを固形状のものに配合し、使用前に溶解または懸濁してもよい。計画的な投与で好ましい用量は、一日あたり、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００５３】
さらに本発明は、式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体および／またはその生理学的に許容される塩、加えて、製薬上問題のない賦形剤および添加剤を含む医薬調剤に関する。式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体および／またはその生理学的に許容される塩は、動物、好ましくは哺乳類、特にヒトに、医薬として投与することができ、ここで該医薬は、局所、経皮、非経口、腸内での使用が可能であり、通常の製薬上問題のない賦形剤および／または添加剤と共に少なくとも１種のＰＮＡ誘導体の有効量を活性成分として含む、それぞれの混合物または医薬調剤の形態である。該調剤は、通常、治療的に活性な化合物を、約０．１〜９０重量％含む。局所適用は、例えば軟膏、ローションまたはチンキ剤、乳濁液または懸濁液の形態で、皮膚病を治療することが好ましい。
【００５４】
該医薬調剤は、それ自体は既知の方法で製造され（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ． Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ．）、製薬上不活性な無機および／または有機賦形剤を用いる。丸剤、錠剤、被覆錠剤およびハードゼラチンカプセルを製造するには、例えば、ラクトース、コーンスターチおよび／またはその誘導体、獣脂、ステアリン酸および／またはその塩などを用いることができる。ソフトゼラチンカプセルおよび／または座薬用の賦形剤の例としては、脂肪、ワックス、半固体および液体のポリオール、天然および／または水素化油などがある。溶液および／またはシロップを製造するのに適した賦形剤の例としては、例えば、水、スクロース、転化糖、グルコース、ポリオールなどがある。注射用溶液を製造するのに適した賦形剤としては、水、アルコール、グリセロール、ポリオール、植物油などがある。マイクロカプセル、インプラントおよび／またはロッドに適した賦形剤としては、グリコール酸や乳酸からなるコポリマーがある。当業者周知のリポゾーム製剤（Ｎ． Ｗｅｉｎｅｒ， Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐ Ｉｎｄ Ｐｈａｒｍ １５ （１９８９） １５２３； “Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｄｅｒｍａｔｉｃｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ １９９２）、例えば、ＨＶＪリポゾーム（Ｈａｙａｓｈｉ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３ （１９９６） ８７８）も適している。また皮膚への適用も、イオン泳動および／またはエレクトロポレーションを用いた方法を用いてなされ得る。
【００５５】
活性化合物や賦形剤に加えて、医薬調剤は、添加剤、例えば、充填剤、増量剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、湿潤剤、安定剤、乳化剤、保存剤、甘味料、染料、着香料または芳香剤、増粘剤、希釈剤および緩衝物質、さらに、溶媒および／または可溶化剤および／または持続した放出効果を達成するための物質、またさらに、浸透圧を変えるための塩、被覆剤および／または抗酸化剤を含んでよい。また該調剤は、２以上の異なる式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体および／またはその生理学的に許容される塩を含んでもよく、さらに、式Ｉで示される少なくとも１種のＰＮＡ誘導体に加えて、１以上の異なる治療的に活性な物質を含んでもよい。その用量は、広範囲に変動させることができ、各個人の場合における個人の状況にあわせて調節することができる。
【００５６】
さらに本発明は、式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体の、診断薬としての使用、特にＤＮＡ診断における補助としての使用、および分子生物学における使用に関する（例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ； Ｐｅｔｅｒ Ｅ． Ｎｉｅｌｓｅｎ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｅｇｈｏｌｍ （Ｅｄｉｔ．） Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９９を参照）。ＤＮＡ診断では、遺伝子プローブは、ＤＮＡプローブまたはハイブリダイゼーションプローブとも称されるが、特定の遺伝子の配列特異的検出において重要な役割を持つ。一般的に、遺伝子プローブは、認識配列および１以上の適切な標識基（標識）を含む。分析サンプル中の標的配列が相補遺伝子プローブとハイブリダイズすることによって同定されるような特異性は、認識配列およびその化学構造によって決定される。またこの技術はＰＮＡにも適用できる。天然構造を有するオリゴヌクレオチドと比べて、ＰＮＡは、標的配列に対するより高い親和性や、塩基を認識するより高い能力を有するという利点がある。
【００５７】
従って、式Ｉで示される化合物の使用は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションや蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）にも関する。またｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、例えば、微生物やウイルスを検出するのにも用いることができる（Ｊｕｓｔ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｖｉｒ． Ｍｅｔｈｏｄ． ７３， １６３−１７４）。本発明の化合物の他の用途は、核酸の検出および定量に関する。これに関して、その使用はアレイ技術で構成されることが好ましく（Ｓｔｒｏｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． （２０００） １２２， １２０５−１２０９； Ｎｉｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． （１９９９） １１１， ３０３９−３０４３； Ｐｉｒｒｕｎｇ （１９９７） Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９７， ４７３−４８８）、これは高いサンプルのスループットおよび高感度を提供する。この場合、ＰＮＡプローブは、適切な支持体またはＰＮＡチップ上に固定される。これを達成するために、ＰＮＡを実施例で説明されたように合成し、続いて支持体またはＰＮＡチップ上に固定することができる。あるいは、ＰＮＡを支持体上に直接製造してもよい。他の用途としては、核酸を検出するためのバイオセンサーとしての式Ｉで示される化合物の使用がある（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ （１９９６） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１８， ７６６７）。ヒスチジル−ＰＮＡのような、親和性標識を有する式Ｉで示されるＰＮＡの使用としては、核酸を精製する他の用途がある（Ｏｅｒｕｍ ｅｔ ａｌ． （１９９９）， ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）。
【００５８】
ＰＮＡ主鎖は、文献で説明された方法を用いて合成され、例えば、ｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニル（ＢＯＣ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはモノメトキシトリチル（Ｍｍｔ）保護基による方法を用いる（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ； Ｐｅｔｅｒ Ｅ． Ｎｉｅｌｓｅｎ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｅｇｈｏｌｍ （Ｅｄｉｔ．） Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９９）。好ましくは、アミノエチルグリシンのアミノ官能基を一時的に保護するためのＭｍｔ保護基を用いることや、ヘテロ環式の核酸塩基上に塩基不安定性の保護基を用いることである（Ｄ． Ｗｉｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５１， １２０６９； Ｂｒｅｉｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５３， １４６７１−１４６８６）。単量体の構築ブロックの例としては、式Ｖ〜ＶＢで示される化合物があり、Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、ｕ’およびＵは上記の意味である。ＰＧは、ベンゾイル基、アニソイル基、イソブチロイル基、アセチル基またはｔｅｒｔ−ブチルベンゾイル基のようなアミノ保護基である（Ｂｒｅｉｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５３， １４６７１−１４６８６）。ＴＲは、ジメトキシトリチル（Ｄｍｔ）（ＵはＯおよびＳである）またはＭｍｔ（ＵはＮＨである）のような、酸不安定性の保護基である。
【００５９】
【化１３】

【００６０】
ＰＮＡ主鎖を構築した後、Ｎ末端の遊離アミノ官能基は、適切なリン酸化試薬と直接反応させることができ、例えば相当するホスホアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）（式ＩにおいてＵはＮＲ_１である）を得る。
【００６１】
【化１４】

【００６２】
このようにして、実施例８のＰＮＡ−７（ＵはＮＨ）は、例えば、最後にカップリングされた構築ブロックにある、ここでＢはアデニンであるＮ末端をビオチン−ホスホアミダイト（ｂｉｏｔｉｎ−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）５と反応させることによって（図４ｂ）得られた。別の方法では、式ＶＡで示される、Ｄｍｔで保護されたヒドロキシアルキル構築ブロック（ＵはＯである）またはＤｍｔで保護されたメルカプトアルキル構築ブロック（ＵはＳである）は、最後のサイクルでカップリングさせることができる。Ｄｍｔ基を除去した後、遊離のヒドロキシ基またはメルカプト官能基を、例えばリン酸化試薬１（図４ａ）を用いて反応させることができる。酸化、支持体からの解離および保護基の除去の後、式Ｉで示されるホスフェート（Ｖ、Ｗ、ＸおよびＹはＯである）またはチオホスフェート（ＶはＳであり、Ｗ、ＸおよびＹはＯである）が得られる。アミノ末端単位が全く核酸塩基（Ｂは水素である）を含まない場合、式ＶＢで示される構築ブロックは最後のサイクルの縮合反応で用いられ、Ｆｍｏｃ保護基は合成の最後にアンモニアと共に除去される。ＰＮＡのアミノ末端は、実際のリン酸化反応が行われる前に、式ＶＣで示される構築ブロックを濃縮することによって延長することができる。
【００６３】
ホスホリル基は、ヌクレオチド化学で用いられる通常の試薬を用いて導入されることができ、例えば、ホスホアミダイト法、Ｈ−ホスホネート方法またはホスホトリエステル方法によって導入され得る（Ｅ． Ｓｏｎｖｅａｕｘ （１９８６） Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １４， ２７４； Ｓ． Ｌ． Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｒ． Ｐ． Ｉｙｅｒ （１９９３） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９， １９２５； Ｅ． Ｕｈｌｍａｎｎ ａｎｄ Ａ． Ｐｅｙｍａｎ （１９９０） Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９０， ５４３）。式Ｉで示される化合物を製造するのに用いることができる多数のリン酸化試薬がある（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓｔｅｒｌｉｎｇ， ＶＡ ２０１６４， ＵＳＡ）。試薬の選択は図４ａ〜４ｄに示されるが、本発明はこれら特定の誘導体に限定されない。上述のリン酸化試薬において、Ｚは、Ｘの意味を持つことができ、反応性基は中間段階で適切な保護基で保護される。
【００６４】
アミノ末端の修飾をどのようにして変化させるのかを、ＰＮＡ−６、ＰＮＡ−１２、ＰＮＡ−１３およびＰＮＡ−１４の合成に基づき説明することができる。まず第一に、ＰＮＡ ｔ（ｏｅｇ）−ａｔ ｔｃｃ ｇｔｃ ａｔ−ｈｅｘ−ＣＰＧ（ＰＮＡ塩基は、相当する核酸塩基を意味する小文字で略して書かれており、ｏｅｇとは、ヒドロキシエチルグリシンを意味する）を完全に保護された形態で、ヒドロキシエチルグリシン−（ｏｅｇ）−アセチルチミンを最後の構築ブロックとして有するＣＰＧ（多孔質ガラス）支持体上に合成する。その時点で、ヒドロキシル基はそれぞれホスホアミダイト１，５，７および３と個々に反応する。酸化、保護基の除去およびＣＰＧ支持体からの生成物の分離の後、ＰＮＡ−６、ＰＮＡ−１２、ＰＮＡ−１３およびＰＮＡ−１４がそれぞれ同様にして得られる。ＴｅｎｔａＧｅｌ：登録商標（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ＧｍｂＨ， Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ）やアミノメチルポリスチレンも固相支持体として用いることができる。
【００６５】
また原則的に、ヌクレオチド化学において既知である試薬の全てはホスホリル官能基の導入に適しており、特に適したものは、式ＶＩＡ、ＶＩＢ、ＶＩＣおよびＶＩＤで示される以下の試薬である。
【化１５】

【００６６】
式中、Ｋはハロゲン、好ましくはＣｌ、トリアゾリル、イミダゾリルまたはジアルキルアミノであり、Ｚは上述の意味かまたはＸの意味であり、反応性基は適切に保護される。例えば、フルオレセイン−ホスホアミダイト３（図４ａ）のヒドロキシル基は、ピバル酸でエステル化することによって保護される。
【００６７】
式ＶＩで示される化合物は、このような試薬の例としてのみ認識されるべきもので、これらは必要に応じて、塩基、酸または縮合剤のような他の補助剤をさらに存在させて反応させられる。特に好ましくは、式ＶＩＡで示される試薬であり、これはホスホアミダイト法に従って反応する（Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｉｙｅｒ， １９９３）。これらの試薬は、リン（ＩＩＩ）化合物として反応させ、続いて酸化させる。例えば、酸化がヨウ素／水／ピリジンまたはｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドを用いてなされる場合、その結果、ホスホリル誘導体（ＷはＯである）が得られる。一方で、酸化が硫黄原子またはＢｅａｕｃａｇｅ試薬を用いてなされる場合、その結果、相当するチオホスホリル化合物（ＷはＳである）が得られる。
【００６８】
試薬（図４ａ〜４ｄ）は、「二官能価試薬」としても見出され、初めに保護される第二の基を有するため数回反応させることができる。ホスホアミダイト４、６および８〜１３は、このような二官能価試薬の例である。これに関連して、試薬の複数の複合か、または異なる試薬との継続的な反応が問題となり得る。従って、例えば、フルオレセイン−ホスホアミダイト３は、１回だけ反応させることができる。これに対して、フルオレセイン−ホスホアミダイト４はＤｍｔ基で保護されたヒドロキシル基を有し、これはＤｍｔ基を除去した後にリン酸化剤と再び反応することができる。この方法では、１種の同じ基かまたは異なる基を数回導入することができる。ＰＮＡ−１６は、複数の複合の典型的な例である。ＰＮＡ鎖を合成した後、ヒドロキシエチレングリシン−Ｃ構築ブロックを最後のサイクルでカップリングし、この構築ブロックを、ＨＢＴＵのようなペプチドカップリング試薬で活性化すると同時に、スペーサー１８ホスホアミダイト９と、アミノ変性剤５ホスホアミダイト１２と連続的に２回反応させ、そして最終的に式ＶＩＩのレキシトロプシンと反応させる。アミノ変性剤のカップリングにより、さらなる残基の継続した導入が可能になり、該残基は活性化カルボン酸誘導体の形態で導入され得る。これに関連して、例えばイソチオシアネートやＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いることもできる。
【００６９】
【化１６】

【００７０】
図５ａおよび５ｂは、式Ｉで示される化合物のＮ末端修飾に関するいくつかの化合物型の例を示す。化合物型Ａは、ＰＮＡの末端ヒドロキシル基をリン酸化試薬１と反応させることによって得られる。化合物型Ｂは、ＰＮＡの末端アミノ基をビオチン−ホスホアミダイト５と反応させることによって得られる。化合物型Ｃは、末端ヒドロキシル基を有するＰＮＡをスペーサー１８ホスホアミダイト９、アミノ変性剤−５ホスホアミダイト１２およびレキシトロプシンと連続的に反応させることによって得られる。化合物型Ｄは、末端ヒドロキシル基を有するＰＮＡを、スペーサー−９ホスホアミダイト８およびシアニン−３ホスホアミダイト１０と連続的に反応させることによって得られる。化合物型Ｅは、末端ヒドロキシル基を有するＰＮＡを、二官能価フルオレセイン−ホスホアミダイト４、スペーサー−９ホスホアミダイト８、およびＣ１６−リン酸化試薬７と連続的に反応させることによって得られる。化合物型Ｆは、ＰＮＡの末端アミノ基を４−ヒドロキシブチル酸と反応させ、そのヒドロキシル基は一時的にＤｍｔ基で保護され、続いてフルオレセイン−ホスホアミダイト３と反応させることによって得られる。酸化や保護基の除去のような実行すべき追加の処置は、実施例で説明される。
【００７１】
【実施例】
以下の化合物の製造は、実施例によって説明される。
【化１７】

【００７２】
【化１８】

【００７３】
【化１９】

【００７４】
ここで、それぞれの場合の塩基配列は、以下の配列で示される。

【００７５】
さらに、｛ＰＯＬＹ｝は式ＩＩによって説明され、｛ＢＬＯＣＫ｝はそれぞれの場合において式ＩＩＩＡによって説明され、加えて、ＡおよびＥはＣＨ_２であり、Ｄは（ＣＨ_２）_２であり、ｚ’はそれぞれの場合においてオリゴマーの配列の長さから確認される。
【００７６】
実施例１：
ＰＮＡ鎖の合成
以下の試薬をＰＮＡ部分の製造に用いた。
１．ホスホアミダイト試薬（０．１Ｍ、アセトニトリル（ＡＣＮ）中）
２．Ｍｍｔ−ＰＮＡ単量体および／またはＤｍｔ−ｏｅｇ−ＰＮＡ単量体（０．２Ｍ、ＤＭＦ：ＡＣＮ（１：１；ｖ：ｖ）中）
３．無水ＡＣＮ（水は３０ｐｐｍ以下）
４．トリクロロ酢酸（３％）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中
５．無水酢酸、２，６−ルチジン、ＴＨＦ中（１：１：８；ｖ：ｖ：ｖ）；（Ｃａｐ Ａ）
６．Ｎ−メチルイミダゾール（１６％）、ＴＨＦ中；（Ｃａｐ Ｂ）
７．ヨウ素溶液（０．０５Ｍ）、ＴＨＦ、水、ピリジン（７：２：１；ｖ：ｖ：ｖ）中
８．洗浄溶液（ＴＨＦ、水、ピリジン（７：２：１；ｖ：ｖ：ｖ））
９．テトラゾール（０．３Ｍ）、ＡＣＮ中
１０．ＨＢＴＵ；０．２Ｍ、ＤＭＦ：ＡＣＮ（１：１；ｖ：ｖ）中
１１．ＤＩＰＥＡ；０．２Ｍ、ＤＭＦ：ＡＣＮ（１：１；ｖ：ｖ）中
１２．ＤＭＦ（＞９９．５％）
１３．固相支持体：Ｍｍｔ−アミノヘキサ−１−イルヘミスクシネートを装填したアミノプロピル−ＣＰＧ（５５０Å）（ＰＮＡ−ヘキシルアミド用）
【００７７】
Ｍｍｔ／アシルで保護された、または、Ｄｍｔ／アシルで保護されたｏｅｇ単量体は、すでに説明されている（Ｂｒｅｉｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５３， １４６７１−１４６８６）。アミノプロピル−ＣＰＧへのＭｍｔ−アミノヘキサ−１−イルヘミスクシネートの装填も同様にすでに説明されている（Ｗｉｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５１， １２０６９−１２０８２）。ＰＮＡの合成は、だいたい２〜５μｍｏｌのスケールで行われた。
【００７８】
以下のサイクルをＰＮＡ合成に用いた。
１．ＡＣＮで洗浄する段階
２．ＴＣＡ３％のＤＣＭ溶液で１１０秒処理することによってＭｍｔ基またはＤｍｔ基を脱保護すること
３．ＤＭＦ／ＡＣＮ（１：１）で洗浄する段階
４．ＤＭＦ／ＡＣＮ（１：１）中でＤＩＰＥＡで中和すること
５．ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ／ＰＮＡ単量体（１：１：１の割合で、総体積は４５０μｌ）を固相に充填して予め活性化し（１５分）、カップリングする（４５分）ことによって、単量体の構築ブロック上にカップリングすること
６．ＡＣＮで洗浄する段階
７．無水酢酸／Ｎ−メチルイミダゾールでキャッピングすること
８．ＡＣＮで洗浄する段階
９．新たなサイクル
【００７９】
実施例２：
ホスホネート−｛ａ（ｏｅｇ）ａｃｔ｝−ｈｅｘ（ＰＮＡ−１）の合成
ＰＮＡ部分は、実施例１で説明したような固相合成によって製造される（２μｍｏｌの合成）。最後のサイクルで、核酸塩基としてアデニンを有するヒドロキシエチルグリシン（ｏｅｇ）を基礎とした構築ブロックをカップリングする（式ＶＡ；ここで、ＴＲはＤｍｔであり、Ｕは酸素であり、ｕ’は２であり、ＰＧはアニソイルであり、Ｂはアデニンである）。末端Ｄｍｔ基を３％ＴＣＡで除去した後、遊離のヒドロキシル官能基を、触媒としてテトラゾールを用いてリン酸化試薬１（図４ａ）と反応させる。この反応は、過剰のリン酸化試薬１（約２５倍）（アセトニトリル／テトラヒドロフラン（１：１；ｖ：ｖ）中の０．３Ｍ溶液として）、および、テトラゾール（約５０倍；アセトニトリル中、０．５Ｍ）が用いられる。縮合が起こった後、ヨウ素溶液（０．０５Ｍ、テトラヒドロフラン／水、ピリジン（７：２：１；ｖ：ｖ：ｖ）中）を用いて酸化する。続いて、５０℃で一晩、濃アンモニアで処理することによって、ＰＮＡを支持体から分離し、同時に保護基を除去する。８３ＯＤ（２６０ｎｍ）のものが得られる。これらから、４０ＯＤのものを、予備的なポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ゲル電気泳動によって精製する。所望の生成物のバンドを、０．２Ｍトリエチル重炭酸アンモニウム緩衝液で溶離し、Ｂｏｎｄ−Ｅｌｕｔ Ｃ１８カラム（１ｇ）を通して脱塩した。１３．５ＯＤのものが得られる。その生成物を、陰イオンマススペクトロメトリーで分析し、それにより計算量を確認した（計算値 １２６６．２； 実測値 １２６５．９）。
【００８０】
実施例３：
ホスホネート−｛ａ（ｏｅｇ）ｃａ ｔｃａ ｔｇｇ ｔｃｇ｝−ｈｅｘ（ＰＮＡ−２）の合成
実施例２で説明されたのと類似の方法で製造が行われ、２μｍｏｌが合成される。アンモニアで分離した後、１２２ＯＤの粗生成物が得られ、この粗生成物は１５％ＰＡＡゲルによる電気泳動によって精製される。２７ＯＤのものが得られる。この生成物を陰イオンマススペクトロメトリーで分析し、それにより計算量を確認した（計算値 ３４５０．３； 実測値 ３４５０．４）。
【００８１】
実施例４：
ホスホネート−｛ｃ（ｏｅｇ）ｃａ ｃｇａ ｔｇａ ｔｇｔ｝−ｈｅｘ〈ＰＮＡ−３）の合成
実施例２で説明されたのと類似の方法で製造が行われ（２μｍｏｌの合成）、核酸塩基としてシトシンを有するヒドロキシエチルグリシンを基礎とした構築ブロックを最後のサイクルでカップリングする。アンモニアで分離した後、１２４ＯＤの粗生成物が得られ、この粗生成物は１５％ＰＡＡゲルによる電気泳動によって精製される。１９ＯＤのものが得られる。この生成物を陰イオンマススペクトロメトリーで分析し、それにより計算量を確認した（計算値 ３４５０．３； 実測値 ３４５０．１）。
【００８２】
実施例５：
ホスホネート−｛ｇ（ｏｅｇ）−ａｇ ｃｃａ ｔｇｔ ａｔａ ｇｔｇ ａｃ｝−ｈｅｘ（ＰＮＡ−４）の合成
実施例２で説明されたのと類似の方法で製造が行われ（２μｍｏｌの合成）、核酸塩基としてグアニンを有するヒドロキシエチルグリシンを基礎とした構築ブロックを最後のサイクルでカップリングする。アンモニアで分離した後、１２０ＯＤの粗生成物が得られる。この粗生成物の６０ＯＤの部分が１５％ＰＡＡゲルによる電気泳動によって精製される。１０ＯＤのものが得られる。この生成物を陰イオンマススペクトロメトリーで分析し、それにより計算量を確認した（計算値 ４８４８．６； 実測値 ４８４９．９）。
【００８３】
実施例６：
ホスホネート−｛ｔ（ｏｅｇ）ｃｇ ｇｔｔ ｔｇａ ｇａｔ ｃｔｇ ｇ｝−ｈｅｘ（ＰＮＡ−５）の合成
実施例２で説明されたのと類似の方法で製造が行われ（２μｍｏｌの合成）、核酸塩基としてチミンを有するヒドロキシエチルグリシンを基礎とした構築ブロックを最後のサイクルでカップリングする。アンモニアで分離した後、２５０ＯＤの粗生成物が得られる。この粗生成物の６０ＯＤの部分が１５％ＰＡＡゲルによる電気泳動によって精製される。２２．９ＯＤのものが得られる。この生成物を陰イオンマススペクトロメトリーで分析し、それにより計算量を確認した（計算値 ４５９５．４； 実測値 ４５９６．３）。
【００８４】
実施例７：
ホスホネート−｛ｔ（ｏｅｇ）ａｔ ｔｃｃ ｇｔｃ ａｔ｝−ｈｅｘ（ＰＮＡ−６）の合成
実施例２で説明されたのと類似の方法で製造が行われ（０．５μｍｏｌの合成）、核酸塩基としてチミンを有するヒドロキシエチルグリシンを基礎とした構築ブロックを最後のサイクルでカップリングする。アンモニアで分離した後、６３ＯＤの粗生成物が得られる。この粗生成物の３０ＯＤの部分が１５％ＰＡＡゲルによる電気泳動によって精製される。４．２ＯＤのものが得られる。この生成物を陰イオンマススペクトロメトリーで分析し、それにより計算量を確認した（計算値 ３１２４．５； 実測値 ３１２４．８）。
【００８５】
実施例８：
ビオチン−ｐ−｛ａｃｔ ｇａｔ ｇｔａ ｇｃｔ｝−ｈｅｘ（ＰＮＡ−７）の合成
ＰＮＡ部分は、実施例１で説明されたような固相合成で製造された（２μｍｏｌを合成）。最後のサイクルで、核酸塩基としてアデニンを有する通常のＰＮＡ構築ブロックをカップリングする（式ＶＡ；式中、ＴＲはＭｍｔであり、ＵはＮＨであり、ｕ’は２であり、ＰＧはアニソイルであり、Ｂはアデニンである）。末端Ｍｍｔ基を３％ＴＣＡで除去した後、遊離のアミノ官能基を、触媒としてテトラゾールを用いて、ビオチン−ホスホアミダイト５（図４ｂ）と反応させる。この反応は、過剰のリン酸化試薬（約１０倍）（アセトニトリル中の０．１２Ｍ溶液として）、および、テトラゾール（約５倍；アセトニトリル中、０．５Ｍ）が用いられる。縮合が起こった後、ヨウ素溶液（０．０５Ｍ、テトラヒドロフラン／水、ピリジン（７：２：１；ｖ：ｖ：ｖ）中）を用いて酸化する。アンモニアで分離した後、２８８ＯＤの粗生成物が得られる。この粗生成物を１５％ＰＡＡゲルによる電気泳動によって精製する。１７．５ＯＤのものが得られる。この生成物を陰イオンマススペクトロメトリーで分析し、それにより計算量を確認した（計算値 ３７８９．６； 実測値 ３７８９．８）。
【００８６】
実施例９：
ビオチン−ｐ−｛ｇ（ｏｅｇ）−ｃｔ ｇａｔ ｇｔａ ｇｔｃ｝−ｈｅｘ（ＰＮＡ−８）の合成
ＰＮＡ部分は、実施例１で説明されたような固相合成で製造される（１μｍｏｌを合成）。核酸塩基としてグアニンを有するヒドロキシエチレングリシン構築ブロック（式ＶＡ；ここで、ＴＲはＤｍｔであり、Ｕは酸素であり、ｕ’は２であり、ＰＧはアニソイルであり、Ｂはグアニンである）を最後のサイクルでカップリングする。末端Ｄｍｔ基を３％ＴＣＡで除去した後、遊離のヒドロキシル官能基を、触媒としてテトラゾールを用いて、ビオチン−ホスホアミダイト５（図４ｂ）と反応させる。この反応は、過剰のリン酸化試薬（約１０倍）（アセトニトリル中の０．１２Ｍ溶液として）、および、テトラゾール（約５０倍；アセトニトリル中、０．５Ｍ）が用いられる。縮合が起こった後、ヨウ素溶液（０．０５Ｍ、テトラヒドロフラン／水、ピリジン中（７：２：１；ｖ：ｖ：ｖ））を用いて酸化する。アンモニアで分離した後、６３ＯＤの粗生成物が得られる。この粗生成物を１５％ＰＡＡゲルによる電気泳動によって精製する。１１．２ＯＤのものが得られる。この生成物を陰イオンマススペクトロメトリーで分析し、それにより計算量を確認した（計算値 ３８０６．８； 実測値 ３８０７．２）。
【００８７】
実施例１０：
ビオチン−ｐ−｛ｇ（ｏｅｇ）ｇｔ ａｔｇ ｇｇａ ｔａｔ｝−ｈｅｘ（ＰＮＡ−９）の合成
実施例９で説明されたのと類似の方法で製造が行われ（２μｍｏｌの合成）、核酸塩基としてグアニンを有するヒドロキシエチルグリシンを基礎とした構築ブロックを最後のサイクルでカップリングする。ビオチン残基はビオチン−ホスホアミダイト５（図４ｂ）で導入された。アンモニアで分離した後、２７４ＯＤの粗生成物が得られる。この粗生成物を１５％ＰＡＡゲルによる電気泳動によって精製する。２５．８ＯＤのものが得られる。この生成物を陰イオンマススペクトロメトリーで分析し、それにより計算量を確認した（計算値 ３８７０．８； 実測値 ３８６９．７）。
【００８８】
実施例１１：
ビオチン−ｐ−｛ｔ（ｏｅｇ）ｇａ ａｇｇ ａａｇ ａｇｇ｝−ｈｅｘ（ＰＮＡ−１０）の合成
実施例９で説明されたのと類似の方法で製造が行われ（２μｍｏｌの合成）、核酸塩基としてチミンを有するヒドロキシエチルグリシンを基礎とした構築ブロックを最後のサイクルでカップリングする。ビオチン残基はビオチン−ホスホアミダイト５（図４ｂ）で導入された。アンモニアで分離した後、１９０ＯＤの粗生成物が得られる。この粗生成物を１２％ＰＡＡゲルによる電気泳動によって精製する。予想分子量を有する２９ＯＤのものが得られる（計算値 ３９１３．９； 実測値 ３９１３．７）。
【００８９】
実施例１２：
ビオチン−ｐ−｛ｇ（ｏｅｇ）−ｇｔ ａｔｇ ｇｇａ ｔａｔ｝−ｈｅｘ（ＰＮＡ−１１）の合成
実施例９で説明されたのと類似の方法で製造が行われ（２μｍｏｌの合成）、核酸塩基としてグアニンを有するヒドロキシエチルグリシンを基礎とした構築ブロックを最後のサイクルでカップリングする。ビオチン残基はビオチン−ホスホアミダイト５（図４ｂ）で導入された。アンモニアで分離した後、１６２ＯＤの粗生成物が得られる。この粗生成物を１２％ＰＡＡゲルによる電気泳動によって精製する。２１ＯＤのものが得られる。この生成物を陰イオンマススペクトロメトリーで分析し、それにより計算量を確認した（計算値 ３８７０．８； 実測値 ３８７０．８）。
【００９０】
実施例１３：
ビオチン−ｐ−｛ｔ（ｏｅｇ）ａｔ ｔｃｃ ｇｔｃ ａｔ｝−ｈｅｘ（ＰＮＡ−１２）の合成
実施例９で説明されたのと類似の方法で製造が行われ（０．５μｍｏｌの合成）、核酸塩基としてチミンを有するヒドロキシエチルグリシンを基礎とした構築ブロックを最後のサイクルでカップリングする。ビオチン残基はビオチン−ホスホアミダイト５（図４ｂ）で導入された。アンモニアで分離した後、６７ＯＤの粗生成物が得られる。この粗生成物を１２％ＰＡＡゲルによる電気泳動によって精製する。８．５ＯＤのものが得られる。この生成物を陰イオンマススペクトロメトリーで分析し、それにより計算量を確認した（計算値 ３４４９．５； 実測値 ３４４９．９）。
【００９１】
実施例１４：
ヘキサデシル−Ｏ−ｐ−｛ｔ（ｏｅｇ）ａｔ ｔｃｃ ｇｔｃ ａｔ｝−ｈｅｘ（ＰＮＡ−１３）の合成
実施例９で説明されたのと類似の方法で製造が行われ（０．５μｍｏｌの合成）、核酸塩基としてチミンを有するヒドロキシエチルグリシンを基礎とした構築ブロックを最後のサイクルでカップリングする。ヘキサデシル残基はＣ１６−リン酸化試薬７（図４ｃ）で導入された。アンモニアで分離した後、５８ＯＤの粗生成物が得られる。この粗生成物（３０ＯＤ）を１２％ＰＡＡゲルによる電気泳動によって精製する。予想された分子量を有する２ＯＤのものが得られる（計算値 ３３４９．４； 実測値 ３３４９．７）。
【００９２】
実施例１５：
フルオレセイン−ｐ−｛ｔ（ｏｅｇ）ａｔ ｔｃｃ ｇｔｃ ａｔ｝−ｈｅｘ（ＰＮＡ−１４）の合成
実施例９で説明されたのと類似の方法で製造が行われ（０．５μｍｏｌの合成）、核酸塩基としてチミンを有するヒドロキシエチルグリシンを基礎とした構築ブロックを最後のサイクルでカップリングする。フルオレセイン残基はフルオレセイン−ホスホアミダイト３（図４ａ）で導入された。アンモニアで分離した後、６２ＯＤの粗生成物が得られる。この粗生成物（３０ＯＤ）を１２％ＰＡＡゲルによる電気泳動によって精製する。４．２ＯＤのものが得られる。この生成物を陰イオンマススペクトロメトリーで分析し、それにより計算量を確認した（計算値 ３５８１．５； 実測値 ３５８２．４）。
【００９３】
実施例１６：
ＨＯ−スペーサー９−ｐ−｛ｇ（ｏｅｇ）−ｔｔ ａｇｇ ｇｔｔ ａｇ｝−ｈｅｘ（ＰＮＡ−１５）の合成
実施例９で説明されたのと類似の方法で製造が行われ（１μｍｏｌの合成）、核酸塩基としてチミンを有するヒドロキシエチルグリシンを基礎とした構築ブロックを最後のサイクルでカップリングする。スペーサー９は相当するホスホアミダイト８（図４ｃ）で導入された。アンモニアで分離した後、５２ＯＤの粗生成物が得られる。この粗生成物（３０ＯＤ）を１５％ＰＡＡゲルによる電気泳動によって精製する。１．８ＯＤのものが得られる。この生成物を陰イオンマススペクトロメトリーで分析し、それにより計算量を確認した（計算値 ３４０２．３； 実測値 ３４０１．８）。
【００９４】
実施例１７：
レキシトロプシン−アミノ結合Ｃ５−ｐ−スペーサーＣ１８−ｐ−スペーサーＣ１８−ｐ−｛ｃ（ｏｅｇ）−ｃ ｃｃｔ ｔｃｃ｝−ｈｅｘ（ＰＮＡ−１６；ここで、ｃはシュードイソシトシンＰＮＡ構築ブロックである）の合成
実施例９で説明されたのと類似の方法で製造が行われ（１μｍｏｌの合成）、核酸塩基としてシトシンを有するヒドロキシエチルグリシンを基礎とした構築ブロックを最後のサイクルでカップリングする。その後、スペーサー１８ホスホアミダイト９を２回連続して縮合し、次にアミノ変性剤５ホスホアミダイト１２（図４ｄ）を１回縮合する。カップリング反応後、Ｄｍｔおよび／またはＭｍｔ基を３％トリクロロ酢酸で処理することによっていずれの場合も除去した。レキシトロプシン上にカップリングするために、３００μｌの相当する活性エステル（０．１Ｍのレキシトロプシンカルボン酸、０．１ＭのＴＢＴＵおよび０．４Ｍのジイソプロピルエチルアミン（１：１：１＝ｖ：ｖ：ｖ）から製造され、３０分予め活性化させる）を加え、その混合物を３時間反応させる。次にＤＭＦを用いて洗浄する。アンモニアで分離した後、４３ＯＤの粗生成物が得られる。この粗生成物（３５ＯＤ）を１５％ＰＡＡゲルによる電気泳動によって精製する。５．３ＯＤのものが得られる。この生成物を陰イオンマススペクトロメトリーで分析し、それにより計算量を確認した（計算値 ３５８３．５； 実測値 ３５３８．１）。
【００９５】
実施例１８：
融解温度の測定
融解温度は、ＨＰ８４５２Ａダイオード−アレイスペクトロフォトメーター、ＨＰ８９０９０ＡペルティエエレメントおよびＨＰ温度コントロールソフトウェアＲｅｖ．Ｂ５．１（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ製）を用いて測定された。測定は、０．５℃／分の段階で、緩衝液として１４０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの二水素リン酸ナトリウム、０．１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）中で行われた。オリゴマーの濃度は、１ｍｌ当たり０．５〜１ＯＤ_２６０である。
驚いたことに、ホスホリルで修飾されたＰＮＡ−６およびＰＮＡ−１２〜ＰＮＡ−１４誘導体は、相補ＤＮＡおよびＲＮＡに対して、電荷を持たないＰＮＡ（対照物質）よりも高い結合の度合いを示した。
【００９６】
【表１】

【００９７】
実施例１９：
蛍光ラベリング後の細胞吸収の測定
ＣＯＳ細胞を、５ｃｍのペトリ皿を用いて、１０％ＦＣＳを追加したダルベッコのＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ）中で群になるまで培養する。細胞を、血清を含まないＤＭＥＭで２回洗浄する。ペトリ皿中央の約１ｃｍ^２の領域を、滅菌針を用いて掻き取る。調査するＰＮＡ溶液（１０μＭ）をこの領域に適用する。この皿を３７℃、ＣＯ_２雰囲気下でインキュベートする。２、４および１６時間後、細胞を、蛍光顕微鏡検査法によって調べる。この際、細胞を、血清を含まないＤＭＥＭで４回洗浄し、カバーガラスで覆い、蛍光顕微鏡または位相差によって観察する。
細胞吸収を調査するために、ＰＮＡ−６およびＰＮＡ−１３は、Ｃ末端をフルオレセインで標識し、次に顕微鏡で観察された。
ｐ−｛ｔ（ｏｅｇ）−ａｔ ｔｃｃ ｇｔｃ ａｔ｝−フルオレセイン
ヘキサデシル−Ｏ−ｐ−｛ｔ（ｏｅｇ）ａｔ ｔｃｃ ｇｔｃ ａｔ｝−フルオレセイン
これに関連して、ヘキサデシル−ＰＮＡ誘導体（ＰＮＡ−１３）は、より効率的に細胞に吸収されることが見出された。
【００９８】
実施例２０：
ＰＮＡ−１３を用いた細胞増殖の阻害
ＰＮＡ−１３の配列は、Ｈａ−ｒａｓ ｍＲＮＡの翻訳開始部位に対して設定される。ＲＥＨ細胞（ヒトプレＢ白血病細胞、ＤＳＭ　ＡＣＣ２２）またはＡ５４９腫瘍細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２下で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ， Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を含むＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中で培養した。分析するための細胞濃度は、約１×１０６個／ｍｌであった。２４ウェルのプレート中で、ＰＮＡ−１３（１０μＭ）を細胞と一緒にインキュベートした。３７℃、５％ＣＯ_２下で９６時間インキュベートした後、細胞濃度を測定した。細胞濃度の平均値を、与えられたＰＮＡ濃度あたりそれぞれ３つのウェルで測定した。ＰＮＡ−１３が、ＲＥＨ細胞の増殖を阻害することが見出された。４日を超過するインキュベートの後、ＰＮＡ−１３は、相当するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドよりも、さらに強い阻害を示した。
【００９９】
実施例２１：
ＨＯ−スペーサー９−ｐ−｛ｇｔｔ ａｇｇ ｇｔｔ ａｇ｝−ｈｅｘ（ＰＮＡ−１７）の合成
実施例９および１６で説明されたのと類似の方法で調整が行われ（０．６７μｍｏｌの合成）、核酸塩基としてチミンを有する通常の２−アミノエチルグリシン構築ブロックを、ＰＮＡ合成の最後のサイクルでカップリングする。スペーサー９は相当するホスホアミダイト８（図４ｃ）で続いて導入された（３×５分の反応時間）。アンモニアで分離した後、１０８ＯＤの粗生成物が得られる。この粗生成物を１５％ＰＡＡゲルによる電気泳動によって精製する。５．７ＯＤのものが得られる。この生成物を陰イオンマススペクトロメトリーで分析し、それにより計算量を確認した（計算値 ３４０１．３； 実測値 ３３９９．８）。
【０１００】
実施例２２：チオホスフェート−｛ｔ（ｏｅｇ）−ａｔ ｔｃｃ ｇｔｃ ａｔ｝−ｈｅｘ（ＰＮＡ−１８）の合成
実施例２および７で説明されたのと類似の方法で調整が行われ（１μｍｏｌの合成）、核酸塩基としてチミンを有するヒドロキシエチルグリシンを基礎とする構築ブロックを最後のサイクルでカップリングする。末端Ｄｍｔ基を３％ＴＣＡで除去した後、遊離のヒドロキシル基を、触媒としてテトラゾールを用いて、リン酸化試薬１（図４ａ）と反応させる。縮合が起こった後、チオ基を導入するために、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（アセトニトリル中、０．０７５Ｍの３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド）を用いて酸化する。アンモニアで分離した後、６６．５ＯＤの粗生成物が得られる。粗生成物の６１ＯＤの部分を１５％ＰＡＡゲルによる電気泳動によって精製する。１２．４ＯＤのものが得られる。この生成物を陰イオンマススペクトロメトリーで分析し、それにより計算量を確認した（計算値 ３１４１； 実測値 ３１４０）。
【０１０１】
略語のリスト：
ＡＣＮ　　　　アセトニトリル
ＢＯＣ　　　　ｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニル
Ｃ，ｃ　　　　シュードイソシトシン
ＣＯＳ　　　　ＣＶ１オリジンＳＶ４０
ＣＰＧ　　　　多孔質ガラス
ＤＣＭ　　　　ジクロロメタン
ＤＩＰＥＡ　　ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＥＭ　　　ダルベッコＭＥＭ培地
ＤＭＦ　　　　ジメチルホルムアミド
Ｄｍｔ　　　　ジメトキシトリチル
ＤＮＡ　　　　デオキシリボ核酸
ＤＮＰ　　　　ジニトロアリール
ＦＩＴＣ　　　フルオレセインイソチオシアネート
Ｆｍｏｃ　　　フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＡＴＵ　　　Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−
テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＢＴＵ　　　Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル
ウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ｈｅｘ　　　　−ＮＨ−（ＣＨ_２）_６−ＯＨ
【０１０２】
ＭＥＭ　　　　改変イーグル最小培地
Ｍｍｔ　　　　モノメトキシトリチル
ＯＤ　　　　　光学濃度
ｏｅｇ　　　　Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）グリシン
ＰＡＡ　　　　ポリアクリルアミド
ＰＧ　　　　　保護基
ＰＮＡ　　　　ポリアミド核酸
ＲＮＡ　　　　リボ核酸
ＴＢＴＵ　　　Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル
ウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＣＡ　　　　トリクロロ酢酸
ＴＨＦ　　　　テトラヒドロフラン
ＴＲ　　　　　酸不安定性の保護基
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】末端Ｚ基の例を示す。
【図１ｂ】末端Ｚ基の例を示す。
【図２ａ】Ｘ基をもたらす例を示す。
【図２ｂ】末端Ｚ基の例を示す。
【図３ａ】Ｘ基をもたらす例を示す。
【図３ｂ】末端Ｚ基の例を示す。
【図４ａ】リン酸化試薬の例を示す。
【図４ｂ】リン酸化試薬の例を示す。
【図４ｃ】リン酸化試薬の例を示す。
【図４ｄ】リン酸化試薬の例を示す。
【図５ａ】単一（Ａ、Ｂ）および複数（Ｃ〜Ｆ）のＰＮＡのＮ末端の誘導体の例を示す。
【図５ｂ】単一（Ａ、Ｂ）および複数（Ｃ〜Ｆ）のＰＮＡのＮ末端の誘導体の例を示す。

Claims (35)

1. 式Ｉ
   

   

   〔式中、
   Ｖは、酸素、硫黄、ＮＲ_１、Ｕ−（ＣＲ_３Ｒ_４）_ｕ’−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ基またはＵ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｕ’−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ基であり、
   Ｕは、それぞれ独立して、酸素、硫黄またはＮＨであり、
   ｕ’は、それぞれ独立して、１〜１０、好ましくは１〜４、特に好ましくは１であり、
   Ｗは、それぞれ独立して、酸素、硫黄またはＮＲ_１であり、
   Ｙは、それぞれ独立して、ヒドロキシル、メルカプト、オキシアニオン、チオエートまたはＮＲ_１Ｒ_２であり、
   Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立して、水素を含む基またはＣ_１〜Ｃ_６アルキル、好ましくは水素であり、
   Ｒ_３およびＲ_４は、それぞれ独立して、水素を含む基もしくはＣ_１〜Ｃ_６アルキル、またはアミノ酸側鎖の基、好ましくは水素であり、
   Ｘは、それぞれ独立して、Ｕ−（Ｃ_２〜Ｃ_２２−アルカンジイル）−Ｕ基またはＵ−（ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ）_ｕ’基であり、
   または、Ｘは、二官能価の標識基で、好ましくは、フルオレセイン、ローダミン、ＴＡＭＲＡ、ビオチン、ピレン、ジニトロフェニル、アクリジン、シアニン色素、Ｄａｂｃｙｌ、ジゴキシゲニンまたはＥｄａｎｓ誘導体からなる群より選択され、特に好ましくはビオチン誘導体であり、
   または、Ｘは、相補核酸と架橋するのための二官能価の基で、好ましくはソラレン誘導体であり、
   または、Ｘは、細胞内吸収を促進する二官能価の基で、好ましくは、コレステリル、アダマンチルおよびビタミンＥ誘導体からなる群より選択され、
   または、Ｘは、ＰＮＡ誘導体の標的核酸への結合親和性を高める二官能価の基で、好ましくはアクリジンおよびレキシトロプシン誘導体であり、
   Ｚは、ヒドロキシル、メルカプト、オキシアニオン、チオエートまたはＮＲ_１Ｒ_２、Ｃ_１〜Ｃ_２２アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_８アリールアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_２２アルキル−Ｕ、Ｃ_１〜Ｃ_８アリールアルキル−Ｕ、ヒドロキシ−Ｃ_１〜Ｃ_１８−Ｕ、アミノアルキル−Ｕ、アリールアルキル−Ｕまたはメルカプトアルキル−Ｕであるか、
   または、Ｚは、式Ｒ_９（ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ）_ｍで示される基［ここでＲ_９はヒドロキシル、アミノまたはＣ_１〜Ｃ_２２アルコキシ、そしてｍは１〜１００、好ましくは２〜１０である］であるか、
   または、Ｚは、一官能価または二官能価の標識基で、好ましくは、フルオレセイン、ローダミン、ＴＡＭＲＡ、ビオチン、ピレン、ジニトロフェニル、アクリジン、シアニン色素、Ｄａｂｃｙｌ、ジゴキシゲニンまたはＥｄａｎｓ誘導体からなる群より選択され、特に好ましくはビオチン誘導体であり、
   または、Ｚは、一官能価または二官能価の架橋基で、好ましくはソラレン誘導体であり、
   または、Ｚは、細胞内吸収を促進する一官能価または二官能価の基で、好ましくは、コレステリル、アダマンチルおよびビタミンＥ誘導体からなる群より選択され、
   または、Ｚは、ＰＮＡ誘導体の標的核酸への結合親和性を高める一官能価または二官能価の基で、好ましくはレキシトロプシン誘導体であり、
   ｎは０〜１０、好ましくは０〜３であり、
   Ｑは、ヒドロキシル、アミノ、ＮＨＲ_７、ＮＲ_７Ｒ_８、アミノ酸誘導体またはペプチド基であり、
   Ｒ_７およびＲ_８は、それぞれ独立して、Ｃ_１〜Ｃ_１８アルキルまたはヒドロキシ−Ｃ_１〜Ｃ_１８アルキルであり、
   そして、｛ＰＯＬＹ｝は、式ＩＩ
   

   

   で示され、ここで、｛ＢＬＯＣＫ｝は、それぞれ独立して、式ＩＩＩＡ
   

   

   または式ＩＩＩＢ、
   

   

   または、式ＩＶＡ〜ＩＶＧ
   

   

   で示され、ここで各構築ブロック｛ＢＬＯＣＫ｝は異なってよく、
   さらに、ｚ’は、０〜１００、好ましくは１〜２０、特に好ましくは４〜１５であり、
   Ａは、それぞれ独立して、（ＣＲ_１Ｒ_２）_ｓ基で、ここでｓは１〜３、好ましくは１であり、
   Ｂは、それぞれ独立して、ヘテロ芳香族の特徴を有し得る芳香族基、または水素、またはヒドロキシル、またはＣ_１〜Ｃ_１８アルキルのいずれかであり、
   または、Ｂは、天然に存在しかつヌクレオチド化学で慣用の核酸塩基、または天然に存在しない核酸塩基、またはそれらのプロドラッグ型であり、ここで少なくとも１つのＢ基は核酸塩基であり、
   Ｄは、それぞれ独立して、（ＣＲ_３Ｒ_４）_ｔ基で、ここでｔは２〜１０、好ましくは２〜４、特に好ましくは２であり、
   ここで、２つの隣接したＲ_３基およびＲ_４基はまた、Ｃ_５〜Ｃ_８シクロアルキル環を形成してよく、
   Ｅは、それぞれ独立して、（ＣＲ_５Ｒ_６）_ｕ’基で、ここで２つの隣接したＲ_５基およびＲ_６基はまた、Ｃ_５〜Ｃ_８シクロアルキル環またはスピロ化合物を形成してよく、
   Ｒ_５およびＲ_６は、それぞれ独立して、水素またはＣ_１〜Ｃ_６アルキルを含む基、好ましくは水素であるか、またはアミノ酸側鎖である〕
   で示されるＰＮＡ誘導体、および式Ｉで示されるＰＮＡ誘導体の生理学的に許容される塩（ただし、少なくとも１つのＹ基またはＺ基がヒドロキシル、メルカプト、オキシアニオンまたはチオエートである）。
2. 式Ｉにおいて、少なくとも１つのＹ基またはＺ基が、ｐＨ範囲が４．５〜１４、好ましくは６．５〜１２、特に好ましくは６．５〜９において、オキシアニオンまたはチオエートである、請求項１に記載のＰＮＡ誘導体。
3. Ｄが（ＣＨ_２）_２である、請求項１または２に記載のＰＮＡ誘導体。
4. ＡおよびＥがＣＨ_２である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
5. Ｑがヒドロキシアミノアルキル基、好ましくはヒドロキシアミノヘキシル基であるか、またはキャリアー配列、好ましくはトランスポータン、インスリン様成長因子、核局在化シグナルもしくは親和性タグ、好ましくは（Ｈｉｓ）_６鎖である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
6. Ｂがアデニン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、チミンもしくはウラシルであるか、またはプリン、２，６−ジアミノプリン、Ｎ^４Ｎ^４−エタノシトシン、Ｎ^６Ｎ^６−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−（Ｃ_３〜Ｃ_６）−アルキニルウラシル、５−（Ｃ_３〜Ｃ_６）−アルキニルシトシン、５−（１−プロパルギルアミノ）ウラシル、５−（１−プロパルギルアミノ）シトシン、フェノキサジン、９−アミノエトキシフェノキサジン、５−フルオロウラシルもしくはシュードイソシトシン、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−アミノウラシル、シュードウラシル、ジヒドロウラシル、５−（Ｃ_１〜Ｃ_６）−アルキルウラシル、５−（Ｃ_１〜Ｃ_６）−アルキルシトシン、５−（Ｃ_２〜Ｃ_６）−アルケニルシトシン、５−フルオロシトシン、５−クロロウラシル、５−クロロシトシン、５−ブロモウラシル、５−ブロモシトシン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、８−アザプリンもしくは７−デアザ−７−置換プリンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
7. Ｗが酸素であり、Ｙがヒドロキシルまたはオキシアニオンである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
8. Ｘが、Ｕ−（Ｃ_２〜Ｃ_２２アルカンジイル）−Ｕ基、好ましくはＯ−（Ｃ_２〜Ｃ_２２アルカンジイル）−Ｏ、特に好ましくはＯ−（ＣＨ_２）_２−６Ｏであり、または、Ｕ−（ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ）_ｕ’基、好ましくはＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ）_ｕ’であり、式中ｕ’好ましくはは１〜６である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
9. Ｚが、ホスフェートであり、または、Ｃ_１〜Ｃ_２２基、またはＣ_１〜Ｃ_２２−Ｕ基、好ましくはＣ_１〜Ｃ_２２アルコキシ基、特に好ましくはＣ_１６アルコキシ基であり、または、ヒドロキシ−Ｃ_１〜Ｃ_１８−Ｕ、好ましくはヒドロキシ−Ｃ_１〜Ｃ_１８−Ｏ、特に好ましくはＨＯ−（ＣＨ_２）_３−１２Ｏであり、または、アミノアルキル−Ｕ基、好ましくはアミノアルコキシ基、特に好ましくは６−アミノヘキソキシもしくは５−アミノペントキシであり、または、式Ｒ_９−（ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ）_ｍで示される基（式中、Ｒ_９は、好ましくはＯＨまたはＮＨ_２であり、ｍは１〜６である）、特に好ましくはＨＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ）_２、ＨＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ）_６およびＨ_２Ｎ−（ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ）_２であり、または、メルカプトアルキル−Ｕ基、好ましくはメルカプトアルコキシ基、特に好ましくは６−メルカプトヘキシルオキシである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
10. ＸおよびＺが、それぞれ独立して、ビオチン、フルオレセインおよびレキシトロプシン誘導体からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
11. ＸおよびＺが、それぞれ独立して、ローダミン、ＴＡＭＲＡおよびシアニン色素からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
12. ＸおよびＺが、それぞれ独立して、Ｄａｂｃｙｌ、ソラレン、アクリジン、ＤＮＰおよびコレステロールからなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
13. 塩基配列が、がん抑制遺伝子、がん遺伝子もしくはテロメラーゼの部分、またはそれらの転写産物に対するものである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
14. ＰＮＡ部分の塩基配列が、ＨＡ−ｒａｓ　ｍＲＮＡの翻訳開始部位に対するものである、請求項１３に記載のＰＮＡ誘導体。
15. 医薬として使用される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
16. がん治療用医薬を製造するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体の使用。
17. 診断薬として使用するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体。
18. 微生物および／またはウイルスを検出するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体の使用。
19. 核酸を検出および／または定量するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体の使用。
20. ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用の検出試薬としての、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体の使用。
21. アンチセンス剤、アンチ遺伝子剤、おとり剤またはキメラプラスト剤としての、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体の使用。
22. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体を含む、検出試薬。
23. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体を含む、ＰＮＡチップ。
24. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体を含む、バイオセンサー。
25. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体、必要に応じて他の生理学的に許容される添加剤および／または賦形剤を含む、医薬。
26. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体を含むアンチセンス剤。
27. ａ）活性化アミノ核酸を用いてＣ末端からＰＮＡ主鎖を合成し、そして
    ｂ）Ｎ末端をリン酸化試薬と反応させる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＰＮＡ誘導体の製造方法。
28. ＰＮＡが、ｔ−ブチロキシカルボニル（ＢＯＣ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはモノメトキシトリチル（Ｍｍｔ）保護基を用いて製造される、請求項２７に記載の方法。
29. ＰＮＡが固相支持体を用いて製造される、請求項２８に記載の方法。
30. 固相支持体として、ＣＰＧ、テンタゲルまたはアミノメチルポリスチレンを用いる、請求項２９に記載の方法。
31. ａ）請求項２７〜３０のいずれか一項に記載のようにＰＮＡ誘導体を製造し、そして
    ｂ）さらに、必要に応じて、薬理学的に許容される添加剤および／または賦形剤を該誘導体に加える、医薬の製造方法。
32. 初めに、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載のようにＰＮＡ誘導体を製造し、次に、固相支持体に固定すること、または、該ＰＮＡ誘導体を固相支持体上に直接製造する、ＰＮＡチップの製造方法。
33. さらに、リン基の酸性の特徴を利用して、クロマトグラフィーまたは電気泳動によってＰＮＡを精製する、請求項２７〜３０に記載の式Ｉに示されるＰＮＡ誘導体の製造方法。
34. ＰＮＡ誘導体を、塩基性固定相および酸または塩を含む溶離液を用いたクロマトグラフィーによって精製する、請求項３３に記載の方法。
35. 固定相は、陰イオン交換体または混合モード相である、請求項３４に記載の方法。

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