PL202881B1 - Zastosowanie grupy arylowej, sposób transportowania cząsteczki poprzez membranę in vitro oraz sposób transportowania cząsteczki do komórki in vitro - Google Patents

Zastosowanie grupy arylowej, sposób transportowania cząsteczki poprzez membranę in vitro oraz sposób transportowania cząsteczki do komórki in vitro

Info

Publication number
PL202881B1
PL202881B1 PL353069A PL35306900A PL202881B1 PL 202881 B1 PL202881 B1 PL 202881B1 PL 353069 A PL353069 A PL 353069A PL 35306900 A PL35306900 A PL 35306900A PL 202881 B1 PL202881 B1 PL 202881B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
oligonucleotide
cell
synthetic sequence
oligonucleotides
fda
Prior art date
Application number
PL353069A
Other languages
English (en)
Other versions
PL353069A1 (pl
Inventor
Eugen Uhlmann
Beate Greiner
Eberhard Unger
Gislinde Gothe
Marc Schwerdel
Original Assignee
Sanofi Aventis Deutschland
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi Aventis Deutschland filed Critical Sanofi Aventis Deutschland
Publication of PL353069A1 publication Critical patent/PL353069A1/pl
Publication of PL202881B1 publication Critical patent/PL202881B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie grupy arylowej, sposób transportowania cząsteczki poprzez membranę in vitro oraz sposób transportowania cząsteczki do komórki in vitro.
Czynnikiem ograniczającym terapeutyczne wykorzystanie cząsteczek, których punkt przyczepienia znajduje się wewnątrz komórki, częstokroć jest niewystarczające wchłanianie przez komórkę i niekorzystne rozmieszczenie wewnątrz komórki. Typowymi przykładami są tu makrocząsteczki, takie jak kwasy nukleinowe, które w sposób sekwencyjnie specyficzny wiążą się z komórkowymi DNA lub RNA i przez to powodują hamowanie ekspresji genowej. Oligonukleotydami antysensownymi są krótkie, jednoniciowe kwasy nukleinowe, wiążące się poprzez pary zasad Watsona-Cricka z komplementarnymi mRNA. Przetłumaczenie ich sekwencji na sekwencję aminokwsów odpowiedniegp białka zostaje w ten sposób zahamowane. Oligonukleotydy tworzące tripleksy wiążą się poprzez tak zwane parowanie zasad Hoogsteena w duże bruzdy podwójnej spirali DNA z tworzeniem potrójnej spirali, przez co transkrypcja genów ulega zahamowaniu w sposób sekwencyjnie specyficzny. Innymi wewnątrzkomórkowe aktywnymi oligonukleotydami są, przykładowo, tak zwane oligonukleotydy Decoy, które imitują regiony wiązania dla sygnałów transkrypcji. Przez traktowanie oligonukleotydami Decoy można w sposób sekwencyjnie specyficzny wychwytywać określone sygnały transkrypcji, a tym samym przeszkadzać zaktywowaniu samej transkrypcji. Inną grupę wewnątrzkomórkowe aktywnych oligonukleotydów stanowią chimeraplasty, które stosuje się do ukierunkowanej naprawy genów [Cole-Strauss i in.. Science, 273, 1386 - 1389 (1996)]. Także i dla tego rodzaju naprawy genów istotną rolę odgrywa wchłonięcie przez komórkę oligonukleotydu typu chimeraplastu. Dalszymi przykładowymi kwasami nukleinowymi aktywnymi wewnątrzkomórkowe są takie kwasy, które oddziaływują wzajemnie z enzymami komórkowymi, zwł aszcza z telomerazami [Norton i in., Nat. Biotechn., 14, 615 (1996)]. Dalszą klasę kwasów nukleinowych, korzystnie dwuniciowych DNA, stanowią te kwasy, które kodują określone białka tworzone na zasadzie wewnątrzkomórkowej ekspresji, w zakresie terapii genowej.
Przykładowo, in vitro pobieranie oligonukleotydu przez komórkę, na przykład za pomocą prostego wprowadzenia oligonukleotydu do podłoża hodowli komórkowej, jest procesem względnie niewydajnym, ponieważ tylko niewielka część dodanego oligonukleotydu zostanie w rzeczywistości wchłonięta przez komórkę. Proces pobierania przez komórkę oligonukleotydu z podłoża trwa wiele godzin i najczęściej dopiero po upływie 8 - 16 godzin osiąga fazę plateau. Przyjmuje się, że oligonukleotydy pobierane są w procesie typu endocytozy. Jednakże, ogólny problem występujący przy pobieraniu w procesie endocytozy polega na tym, że większość oligonukleotydów obecna będzie nie w stanie wolnym w cytoplazmie, ale zamknię ta w okreś lonych strukturach, w lizosomach i endosomach. I rzeczywiście, takie punktowe rozmieszczenie w przypadku oligonukleotydów znakowanych fluorescencyjnie stwierdza się także metodą mikroskopii fluorescencyjnej. W wyniku takiego pęcherzykowego usytuowania, zostaje silnie zmniejszone stężenie wolnego oligonukleotydu, który może być realnie wykorzystany w procesie hybrydyzacji z mRMA.
Poza tym, w zależności od typu komórek i aktualnych warunków, oligonukleotyd pobierany jest w ogóle tylko przez określoną frakcję komórek. Stą d też , na ogół, w celu stosowania oligonukleotydów antysensownych w sposób wydajny używa się mieszanin zawierających środki wzmacniające przenikanie, takie jak, na przykład, lipidy kationowe [Bennett i in.. Mol. Pharmacol., 41, 1023 (1992)].
Zadanie niniejszego wynalazku polega na tym, aby polepszyć pobieranie przez komórki cząsteczek, zwłaszcza makrocząsteczek, takich jak, na przykład, oligonukleotydy.
Badanie pobierania przez komórki oligonukleotydów odbywa się, na ogół, przy pomocy oligonukleotydów znakowanych albo radioaktywnie, albo fluorescencyjnie. Znakowania danego oligonukleotydu metodą fluorescencyjną dokonuje się na drodze reakcji funkcji aminowej tego oligonukleotydu z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC). I tak, na przyk ł ad, fluoresceinę moż na wprowadzić na koniec 3' oligonukleotydu przy użyciu dostępnego w handlu derywatyzowanego fluoresceiną nośnika w fazie stałej, albo na koniec 5' przy użyciu dostępnego w handlu odczynnika fosforynylującego fluoresceinę. We wszystkich przypadkach, fluoresceiną związana z oligonukleotydem w oparciu o funkcję kwasu karboksylowego występuje jako ujemnie naładowany element struktury silnie fluoryzujący.
PL 202 881 B1
W przeciwień stwie do fluoresceiny, dioctan fluoresceiny (FDA) jest oboję tnym barwnikiem przyżyciowym, który przekształca się we fluoryzującą fluoresceinę dopiero po odszczepieniu obu grup estrowych i otwarciu pierścienia laktonowego, ale który w postaci laktonu nie wykazuje żadnej fluorescencji.
Z publikacji Whittemore N.A i inni Synthesis and Electrochemistry of anthraquinone-oligodeoxynucleotide conjugates Bioconjugate Chem. Tom 10, 2 maja 1999 str. 261-270 znane są pochodne aminowe nukleozydów i oligonukleozydów W publikacji tej opisano również syntezę koniugatów oligodeoksynukleotydów i antrachinonu.
Wiadomo, że FDA (określany w dalszej części niniejszego opisu skrótowo jako F3), jako obojętna, niefluoryzująca cząsteczka, pobierany jest przez żyjące komórki na zasadzie dyfuzji biernej i wewnątrz komórki rozszczepiany przez esterazy na fluoryzującą fluoresceinę [Breeuwer i in., Appl. Environ. Microbiol., 61, 1614 (1995), Maeda i in., Cell Struct. Funct., 7, 177 (1982)]. Jak dotychczas, opisano jedynie te pochodne FDA, które zawierają grupy reaktywne w stosunku do grupy aminowej, takie jak, na przykład, ugrupowanie izotiocyjanianu. Tych pochodnych FDA używa się do barwienia wewnątrzkomórkowych białek lub składników komórki. Ponadto, nie opisano dotychczas żadnych koniugatów FDA z innymi cząsteczkami i odpowiednio do tego nie są także opisane, jak dotychczas, oligonukleotydy znakowane przy użyciu FDA (koniugaty złożone z FDA i oligonukleotydu).
W cytoplazmie, FDA zostaje rozszczepiony w wyniku działania esteraz. Dzięki oznakowaniu oligonukleotydu FDA staje się więc możliwe oznaczenie udziału wolnego oligonukleotydu, to znaczy oznaczenie ilości oligonukleotydu obecnego w cytoplazmie i nadającego się do hybrydyzacji, w stosunku do udziału oligonukleotydu obecnego w pęcherzykach (oligonukleotydu uwięzionego), a więc nie do wykorzystania w procesie hybrydyzacji. Z uwarunkowaniem wynikającym z ogólnej dużej ilości ładunków ujemnych w oligonukleotydzie i faktu, że oligonukleotydy znakowane FDA różnią się od nukleotydów znakowanych fluoresceiną (przy założeniu, że oba nukleotydy są takie same) tylko ładunkiem netto, można było oczekiwać, że oligonukleotydy znakowane FDA i oligonuklotydy znakowane fluoresceiną będą wykazywać bardzo podobny stopień pobierania i rozmieszczania w komórkach.
Jednakże, nieoczekiwanie stwierdzono, że oligonukleotydy znakowane FDA różnią się znacznie od oligonukleotydów znakowanych fluoresceiną jeśli chodzi o pobieranie ich przez komórki i to zarówno pod względem czasu trwania, jak i wydajności procesu wchłaniania oligonukleotydów, a poza tym także pod względem usytuowania pobranych oligonukleotydów w komórce. Oligonukleotyd znakowany FDA zostaje pobrany przez komórkę o wiele szybciej niż odpowiedni oligonukleotyd znakowany fluoresceiną. Podczas gdy pobranie znakowanych radioaktywnie i znakowanych fluoresceiną oligonukleotydów wymaga wielu godzin, oligonukleotydy znakowane FDA można było wykryć w komórkach, na przykład w komórkach ludzkich, już po zwykłej inkubacji trwającej 5 minut. Zaskakujące przy tym było to, że oligonukleotydy znakowane FDA były pobierane przez prawie wszystkie komórki (> 90% komórek), podczas gdy poziom pobrania oligonukleotydów przez komórki w dotychczas opisanych metodach wprowadzania oligonukleotydów lub polinukleotydów do komórek był, na ogół, zasadniczo niższy; często tylko około 30 - 60% komórek naładowanych było oligonukleotydami. Korzystne jest także wewnątrzkomórkowe rozmieszczenie oligonukleotydów znakowanych FDA, które jest o wiele bardziej równomierne. Takie równomierne rozmieszczenie wskazuje na to, że oligonukleotydy nie są
PL 202 881 B1 w większości zamknięte (jak to powyżej opisano) w pę cherzykach (na przykład endosomach czy lizosomach), ale są rozprowadzone w całej komórce, to znaczy w cytosolu i jądrze. Stanowi to poszlakę, że ma się tu do czynienia z dużym udziałem wolnych oligonukleotydów. Tylko te wolne oligonukleotydy zdolne są do wykorzystania, jeśli chodzi o ich wiązanie się ze strukturą docelową (komórką docelową, docelowym kwasem nukleinowym), lub też do użycia jako substancja aktywna. Korzystne jest także i to, że w przypadku oligonukleotydów znakowanych FDA nie daje się zaobserwować żadnego uszkodzenia komórek. W przeciwieństwie do tego, zastosowanie lipokationowych środków wzmacniających przenikanie często prowadzi do uszkodzenia błony komórkowej. W wyniku tych nieoczekiwanych właściwości, oligonukleotydy znakowane FDA przewyższają dotychczas stosowane metody wprowadzania do komórek oligonukleotydów względnie polinukleotydów tą zasadniczą korzystną cechą znamienną, że można je w sposób bardziej efektywny wprowadzać do komórek i lepiej tam udostępniać. Dzięki temu, oligonukleotydy znakowane FDA wykazują wyraźnie polepszoną skuteczność biologiczną. Dzięki tej polepszonej aktywności biologicznej trzeba używać mniejszej ilości oligonukleotydu. W rezultacie, oraz na podstawie tego faktu, że oligonukleotyd znakowany FDA wchłaniany jest przez komórkę w sposób bardziej skuteczny (tak pod względem ilościowym jak i czasowym), zredukowane zostają (toksyczne) działania uboczne.
Nieoczekiwanie stwierdzono, że korzystne właściwości nie są ograniczone tylko do oligonukleotydów znakowanych FDA, ale że praktycznie każdą cząsteczkę, przy pomocy znakowania FDA (to znaczy sprzężenia względnie skoniugowania przewidzianej do transportowania cząsteczki z utworzeniem koniugatu z FDA), można w sposób efektywny wprowadzić do komórki względnie przetransportować poprzez błonę biologiczną. Dalej, stwierdzono, że zasada ta nie ogranicza się tylko do koniugatów z FDA, ale rozciąga się na wszystkie koniugaty grup arylowych o określonej budowie chemicznej. Tak więc, wynalazek niniejszy oferuje nową zasadę transportowania cząsteczek poprzez błony biologiczne. Ponieważ związki takie, z pominięciem jednego wyjątku, nie są opisane w dotychczasowym stanie techniki, odpowiednie koniugaty (a więc przewidziana do transportowania cząsteczka sprzężona względnie skoniugowana z grupą arylową o określonej budowie chemicznej) są również nowe. Koniugatów tego rodzaju nie można wytworzyć znanymi sposobami. Toteż, nowy jest także sposób wytwarzania koniugatów.
Znane są bioodwracalne koniugaty O-acyloarylowe, zaproponowane jako proleki oligonukleotydów [lyer i in., Bioorganic & Med. Chem. Lett., 7, 871 - 876 (1997)]. Związki te zbliżone są pod względem swej struktury chemicznej (w przypadku, gdy grupa arylowa stanowi aromatyczny układ 6-pierścieniowy) do koniugatów według wynalazku. Jednakże, w przypadku bioodwracalnych koniugatów 0-acyloarylowych, hydroliza estrów powoduje destabilizację wiązania między grupą arylową a fosfotriestrem oligonukleotydu, tak, ż e bioodwracalny koniugat O-acyloarylowy ulega rozszczepieniu na swe części składowe, to znaczy wolny oligonukleotyd i grupę O-acyloarylową. Tego rodzaju pomysł proleku służy temu, aby zamaskować ujemny ładunek międzynukleotydowego mostka fosforowego, a przez to ułatwić pobranie oligonukleotydu przez komórkę. Jednakże, w przeciwieństwie do koniugatów według wynalazku, w przypadku takich proleków nie stwierdza się żadnego przyspieszonego przyjmowania oligonukleotydów przez komórki, a także żadnej zmiany w rozmieszczeniu oligonukleotów w samej komórce. Następnie, nie ma tam doniesienia odnoszącego się do pobierania oligonukleotydów przez inne organizmy. W przeciwieństwie do tego, w przypadku koniugatów według wynalazku kowalencyjne wiązanie między grupą arylową i oligonukleotydem zostaje przy wchłanianiu przez komórkę utrzymane, przy czym utrzymanie tego kowalencyjnego wiązania między grupą arylową i oligonukleotydem można łatwo stwierdzić badaniem metodą mikroskopii fluorescencyjnej, ponieważ jednostka aromatyczna (jak, przykładowo, FDA) wykazuje fluorescencję dopiero po odszczepieniu estru.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest więc zastosowanie grupy arylowej o wzorach F1, F3, F4 i F5
PL 202 881 B1
związanej z przewidzianą do transportowania cząsteczką wybraną z polinukleotydu, oligonukleotydu lub z mononukleotydu, do transportowania tej cząsteczki przez biologiczną membranę in vitro.
PL 202 881 B1
Korzystnie grupa/grupy arylowe są związane z 5'-końcem, 3'-końcem, heterocykliczną zasadą, cukrem lub mostkiem międzynukleozydowym ale także przez elementy nienukleotydowe.
Dalszym przedmiotem wynalazku jest sposób transportowania cząsteczki poprzez membranę in vitro, charakteryzujący się tym, że wytwarza się koniugat, w którym przewidziana do transportowania cząsteczka związana jest z co najmniej jedną grupą arylową F1, F3-F5 wyżej określoną i ten koniugat inkubuje się z membraną.
Dalszym przedmiotem wynalazku jest sposób transportowania cząsteczki do komórki in vitro charakteryzujący się tym, że wytwarza się koniugat, w którym przewidziana do transportowania cząsteczka związana jest z co najmniej jedną grupą arylową F1, F3-F5 wyżej określoną i ten koniugat inkubuje się z komórką, po czym koniugat zostaje przetransportowany do komórki bez odszczepienia grupy arylowej.
Korzystnie komórka jest: komórką eukariotyczną lub komórką prokariotyczną, a zwłaszcza komórką bakterii, komórką droż dż ową lub komórką ssaka.
Korzystnie komórka jest komórką ludzką a zwłaszcza komórką nowotworową.
Cząsteczką przewidzianą do transportowania może być każda dowolna cząsteczka wybrana spośród polinukleotydu, oligonukleotydu lub z mononukleotydu. Korzystnie, przewidziana do transportowania cząsteczka ma masę cząsteczkową wynoszącą > 3 50 daltonów.
Jeden ze sposobów wykonania wynalazku dotyczy koniugatów, w przypadku których cząsteczką przeznaczoną do transporttowania jest makrocząsteczka, na przykład o masie cząsteczkowej > 500 daltonów, korzystnie > 1000 daltonów, szczególnie korzystnie > 2000 daltonów lub większej.
Cząsteczką przeznaczoną do transportowania może być także związek o małej masie cząsteczkowej, na przykład o masie cząsteczkowej < 500 daltonów, korzystnie o masie cząsteczkowej mieszczącej się w zakresie od 350 do 500 daltonów. Związkiem o małej masie cząsteczkowej może być mononukleotyd.
Przeznaczone do transportowania cząsteczki mogą być substancjami należącymi do różnych klas związków, na przykład mogą to być biopolimery, takie jak, na przykład, mononukleotydy, polinukleotydy, korzystnie oligonukleotydy,
Polinukleotydy, oligonukleotydy i mononukleotydy są albo naturalnymi kwasami nukleinowymi, albo ich znanymi pochodnymi. Przez określenie pochodne rozumie się tu, między innymi, sole pochodzące od cząsteczek lub koniugatów przeznaczonych do transportowania, zwłaszcza ich sole fizjologicznie dozwolone, a także, na przykład, kwasy nukleinowe modyfikowane względnie stabilizowane.
Cząsteczka przeznaczona do transportowania może być skoniugowana z jedną, lub większą ilością grup arylowych, na przykład z dwiema, trzema, czterema, pięcioma, sześcioma, siedmioma, ośmioma, dziewięcioma, dziesięcioma, piętnastoma, dwudziestoma i jeszcze większą ilością grup arylowych.
Grupa arylowa może być przyłączona do przeznaczonej do transportowania cząsteczki jednokrotnie lub wielokrotnie, przy czym wiązania te mogą być usytuowane w rozmaitych pozycjach grupy arylowej. W przypadku, gdy przeznaczona do transportowania cząsteczka związana jest w większą ilością grup arylowych, wtedy mogą one być takie same lub różne. Grupa arylowa może być związana z cząsteczką albo bezpośrednio, albo poprzez określone ugrupowanie chemiczne.
Przez związanie w/w grup arylowych z przewidzianymi do transportowania cząsteczkami wyżej omówionymi powstają odpowiednie koniugaty.
Grupy arylowe stosowane według wynalazku o wzorach F1, F3, F4 i F5 przedstawione są na arkuszu wzorów 2a.
W szczególnym sposobie wykonania wynalazku, cząsteczkę przeznaczoną do transportowania stanowi oligonukletyd. Oligonukletyd, przykładowo, może być zbudowany całkowicie z nukleotydów, a mianowicie adenozynofosforanu, guanozynofosforanu, inozynofosforanu, cytydynofosforanu, urydynofosforanu i tymidynofosforanu.
W innych wariantach wykonania wynalazku, oligonukleotyd może, ewentualnie, zawierać jedną, lub więcej niż jedną modyfikację, na przykład modyfikację chemiczną.
Oligonukleotyd może obejmować takie same i/lub różne modyfikacje.
Przykładowe modyfikacje chemiczne są znane specjalistom z tej dziedziny techniki i opisane są, na przykład w: E. Uhlmann i A. Peyman, Chemical Reviews, 90, 543 (1990); Protocols for Oligonukleotides and Analogs, Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, red.
PL 202 881 B1
S. Agrawal, Humana Press, Totowa, USA (1993); J. Hunziker i C. Leumann, 'Nucleic Acid Analogs:
Synthesis and Properties' w: Modern Synthetic Methods (red. Beat Ernst i C. Leumann), Verlag Helvetica Chimica Acta, Bazyleja, S, 331 - 417.
Chemiczna modyfikacja oligonukleotydu może obejmować na przykład:
a) całkowite lub częściowe zastąpienie mostków fosforodiestrowych, przez, na przykład, mostki fosforotianowe fosforoditianowe, NR1R1'-fosforoamidanowe, boranofosforanowe, ester fosforano-(C1-C21)-O-alkilowy, ester fosforano-[(C6-C12)arylo-(C1-C21)-O-alkilowy], mostki (C1-C8)alkilofosfonianowe i/lub mostki (C6-C12)-arylofosfonianowe, przy czym:
R1 i R1' oznaczają, niezależnie, wodór, grupę (C1-C18)-alkilową, grupę (C6-C20)-arylową, grupę (C6-C14)-arylo-(C1-C8)-alkilową, korzystnie wodór, grupę (C1-C8)-alkilową lub grupę metoksyetylową, szczególnie korzystnie wodór, grupę (C1-C4)-alkilową i/lub grupę metoksyetylową, lub
R1 i R1' razem z atomem azotu, do którego są przyłączone, oznaczają 5 - 6-członowy pierścień heterocykliczny, który dodatkowo zawiera jeszcze jeden heteroatom wybrany z grupy obejmującej O, S i N;
b) całkowite lub częściowe zastąpienie mostków 3'- i/lub 5'-fosfodiestrowych przez mostki typu defosfo [opisane, na przykład w: E. Uhlmann i A. Peyman w: Methods in Molecular Biology, tom 20, Protocols for Oligonukleotides and Analogs, red. S Agrawal, Humana Press, Totowa, rozdział 16 str. 355 i następne (1993)], przykładowo przez formacetal; 3'-tioformacetal, metylohydroksyloaminę, oksym, grupę metylenodimetylohydrazo, sulfon dimetylowy i/lub grupy sililowe;
c) całkowite lub częściowe zastąpienie szkieletu cukrowofosforanowego przez, przykładowo, oligomery typu morfolino [jak to opisano, na przykład, w: E.P. Stirchak i in., Nucleic Acids Res., 17, 6129 (1989); J. Summerton i D. Meller, Antisense and Nucleic Acid Drug Dev., 7, 187 - 195 (1997)] i/lub przez kwasy poliamidowo-nukleinowe (PNA) [jak to opisano, na przykład, w: P.E. Nielsen i in., Bioconj. Chem., 5 (1994)] i/lub przez kwasy (ester kwasu fosforowego) nukleinowe (PHONA), opisane, na przykład w: Peyman i in., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 35, 2632 - 2638 (1996)];
d) całkowite i/lub częściowe zastąpienie jednostek e-D-2'-dezoksyrybozy, przez, przykładowo, α-D2'-dezoksyrybozę, L-2'-dezoksyrybozę, 2'-F-2'-dezoksyrybozę, 2'-O-(C1-C6)alkilorybozę, 2'-O-(C2-C6)-alkenylorybozę, 2'-[O-(C1-C6)-alkilo-O-(C1-C6)-alkilorybozę, 2'-NH2-2'-dezoksyrybozę, β-D-ksylofuranozę, α-arabinofuranozę, 2,4-didezoksy-e-D-erytroheksopiranozę, konformacyjnie ograniczone analogi cukrów, takie jak LNA [Locked nucleic acids; Singh i in., Chem. Commun, 4, 455 (1998); Singh i in., Chem. Commun., 12, 1247 (1998)], oraz analogi cukrów, czy to karbocykliczne [opisane, na przykład, w: Froehler, J. Am. Chem. Soc., 114, 8320 (1992)], czy też o otwartym pierścieniu [opisane, na przykład, w: Vandendriessche i in., Tetrahedron, 49, 7223 (1993)] i/lub bicykliczne analogi cukrów [opisane, na przykład, w: M. Tarkov i in., Helv. Chim. Acta, 76. 481 (1993)].
e) Modyfikacja dokonana albo przez całkowite albo częściowe zastąpienie naturalnych zasad nukleozydowych przez, na przykład, 5-(hydroksymetylo)uracyl, 5-aminouracyl, pseudouracyl, pseudoizocytozynę, dihydrouracyl, 5-(C1-C6)-alkilouracyl, 5-(C2-C6)-alkenylouracyl, 5-(C2-C6)-alkinylouracyl, 5-(C1-C6)-alkilocytozynę, 5-(C2-C6)-alkenylocytozynę, 5-(C2-C6)-alkinylocytozynę, 5-fluorouracyl, 5-fluorocytozynę, 5-chlorouracyl, 5-chlorocytozynę, 5bromouracyl, 5-bromocytozynę lub 7-deaza-7-podstawioną purynę.
Następnie, chemiczne modyfikacje oligonukleotydu obejmują też związanie oligonukleotydu z jedną, lub z większą ilością cząsteczek, które korzystnie wpływają na szczególne właściwości oligonukleotydu, takie jak oporność na działanie nukleaz, powinowactwo do sekwencji docelowej i właściwości farmakokinetyczne, na przykład, w przypadku hybrydyzacji zmodyfikowanego oligonukleotydu do sekwencji docelowej, jej zaczepienie przez związanie i/lub usieciowanie poprzeczne. Dalszymi przykładowymi tego rodzaju cząsteczkami są: polilizyna, interkalatory, takie jak piren, akrydyna, fenazyna i fenantrydyna, związki fluoryzujące, takie jak fluoresceiną, środki sieciujące, takie jak psoralen i azydoproflawina, cząsteczki lipofilowe, takie jak ugrupowania (C12-C20)-alkilowe, korzystnie ugrupowania (C12-C20)-alkilowe, lipidy, takie jak 1,2-diheksadecylo-rac-gliceryna, steroidy, takie jak cholesterol lub testosteron, witaminy, takie jak witamina E, glikol poli- względnie oligoetylenowy, diestry (C12-C18)-alkilofosforanowe, korzystnie diestry (C14-C18)-alkilofosforanowe i ugrupowania -O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C18)-alkilowe, korzystnie ugrupowania -O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C16)-alkilowe. Te dalsze cząsteczki można skoniugować na końcu 5' i/lub 3' i/lub w obrębie sekwencji, na przykład z zasadą kwasów nukleinowych (nukleozasadą). Sposoby wytwarzania tak zmodyfikowanych oligonukleotydów znane są specjalistom z tej dziedziny techniki i opisane są, na przykład, w: E. Uhlmann, & A. Peyman, A. Chem. Rev., 90 543 (1990); i/lub M. Manoharan w: Antisense Research and Applications,
PL 202 881 B1 red. Crooke and Lebleu, CRC Press, Boca Raton, rozdział 17, str. 303 i strony następne (1993); i/lub dokument patentowy EP-A 0 552 766.
W następnym, specjalnym sposobie wykonania niniejszego wynalazku, oligonukleotyd może wykazywać na końcu 3' i/lub 5' inwersje 3'-3' i/lub 5'-5'. Taki rodzaj modyfikacji chemicznych znany jest specjalistom z tej dziedziny techniki i opisany, na przykład, w: M. Koga i in., J. Org. Chem., 56, 3757 (1991).
W przypadku koniugatu skł adają cego się z jednego, lub wię kszej iloś ci oligonukleotydów i jednego, lub większej ilości grup arylowych, związanie (sprzężenie) grup arylowych z oligonukleotydem może dokonać się, na przykład, na końcu 5' (A), na końcu 3' (F), z zasadą heterocykliczną (E i G), z cukrem (C) lub z mostkiem międzynukleozydowym (B). Zwią zanie może zajść takż e z nienukleotydowymi elementami cząsteczki, tak, jak w przypadku (D). Przykłady te przedstawiono na fig. 3.
Wspomnianych modyfikacji można, odpowiednio, dokonać także z udziałem dłuższych polinukleotydów, ale dogodnie korzysta się z mono- względnie dinukleotydów względnie nukleozydów.
Długość oligonukleotydów mieści się, na przykład, w zakresie od 8 do 50 nukleotydów, korzystnie w zakresie od 10 do 20 nukleotydów. Jednakże, stosowne są także oligo-względnie polinukleotydy dłuższe, na przykład o długości mieszczącej się w zakresie od 50 do 10000 nukleotydów, korzystnie w zakresie od 100 do 1000 nukleotydów, które, ewentualnie, mogą występować jako podwójne spirale.
Oligonukleotydy mogą posiadać każdą dowolną sekwencję. Sekwencję oligonukleotydu dobiera się, lub projektuje, w zależności od wybranego celu, co oznacza, że w przypadku, gdy tym celem jest kwas nukleinowy, zależy ona od jego sekwencji, a w przypadku, gdy tym celem jest białko, zależy ona od sekwencji kwasu nukleinowego kodującej to docelowe białko. I tak, gdy takim celem jest wirus, na przykład CMV, HIV, HSV-1, HSV-2, wirus grypy, VSV, wirus zapalenia wątroby B lub wirus brodawek, wtedy oligonukleotyd może mieć, przykładowo, jedną z następujących sekwencji:
a) ukierunkowane na CMV
SEQ ID NO. 12 5'-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG
b) ukierunkowane na HIV, na przykład:
SEO ID NO. 13 5'-ACACCCAATTCTGAAAATGG-3' lub SEO ID NO. 14 5'-AGGTCCCTGTTCGGGCGCCA-3', lub
c) ukierunkowane na HSV-1, na przykład:
SEQ ID NO. 15 5'-GCGGGGCTCCATGGGGGTCG-3'.
Celem może być białko, odpowiedzialne za karcynogenezę lub za rozwój raka. Celami tego rodzaju są:
1) jądrowe onkoproteiny, takie jak, na przykład c-myc, N-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, PCNA, p120;
2) onkoproteiny cytoplazmatyczne/zasocjowane z błonami, takie jak, na przykład, EJ-ras, c-Haras, N-ras, rrg, bcl-2, cdc-2, c-raf-1, c-mos, c-src, c-abl, c-ets;
3) receptory komórkowe, takie jak, na przykład, receptor EGF, Her-2, c-erbA, receptor VEGF (KDR-1), receptory retinoidowe, podjednostka regulatorowa kinazy białek, c-fms, Tie-2, kinaza c-raf-1, PKC-alfa, kinaza białek A (R1 alfa);
4) cytokiny, czynniki wzrostowe, macierz pozakomórkowa, tak jak, na przykład CSF-1, IL-6, IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, bFGF, VEGF, mieloblastyna, fibronektyna.
Oligonukleotydy, które ukierunkowane są na wspomniane cele, mogą mieć, na przykład, następujące sekwencje zasad: a) ukierunkowane na c-Ha-ras, na przykład:
PL 202 881 B1
a) ukierunkowane na c-Ha-ras, na przykład:
SEQ ID NO. 16 5'-CAGCTGCAACCCAGC-3' lub
SEQ ID NO. 17 5'-TATTCCGTCAT-3' lub
SEQ ID NO. 18 5’-TTCCGTCATCGCTCCTCAGGGG-3
b) bFGF, na przykład:
SEQ ID NO. 19 5’-GGCTGCCATGGTCCC-3'
c) c-myc, na przykład:
SEQ ID NO. 20 5'-GGCTGCTGGAGCGGGGCACAC-3’
SEQ ID NO. 21 5’-AACGTTGAGGGGCAT-3’
d) c-myb, na przykład:
SEQ ID NO. 22 5'-GTGCCGGGGTCTTCGGGC-3'
e) c-fos, na przykład:
SEQ ID NO. 23 5' -CGAGAACATCATCGTGG-3'
SEQ ID NO. 24 5’ -GGAGAACATCATGGTCGAAAG-
SEQ ID NO. 25 5' -CCCGAGAACATCATGGTCGAAG
SEQ ID NO. 26 5’ -GGGGAAAGCCCGGCAAGGGG-3
f) p!20, na przykład:
SEQ ID NO. 27 5' -CACCCGCCTTGGCCTCCCAC-3
g) receptor EGF, na przykład:
SEQ ID NO. 28 5' -GGGACTCCGGCGCAGCGC-3’
SEQ ID NO. 29 5' -GGCAAACTTTCTTTTCCTCC-3
PL 202 881 B1
h) supresor nowotworu p53, na przykład:
SEQ ID NO. 30 5' '-GGGAAGGAGGAGGATGAGG-3'
SEQ i) ID NO. bcl-2 31 5’ '-GGCAGTCATCCAGCTTCGGAG-3'
SEQ k) ID NO. VEGF 32 5' ’-TCTCCCAGCGTGCGCCAT
SEQ ID NO. 33 5' '-GCGCTGATAGACATCCATG
SEQ ID NO. 34 3' ’-CCAGCCCGGAGG-5',5'-GGAGGCCCGACC-3'
SEQ ID NO. 35 3' '-CGGAGGCTTTGG-5',5'-GGTTTCGGAGGC-3'
SEQ ID NO. 36 3 1 '-GATGGAGGTGGT-5',5'-TGGTGGAGGTAG-3'
SEQ ID NO. 37 3' '-GGAGGTGGTACG-5',5'-GCATGGTGGAGG-3'
SEQ ID NO. 38 3 1 '-GGTGGTACGGTT-5',5'-TTGGCATGGTGG-3'
SEQ ID NO. 39 3' '-CACCAGGGTCCG-5',5'-GCCTGGGACCAC-3’
SEQ ID NO. 40 3 1 '-CCAGGGTCCGAC-55'-CAGCCTGGGACC-3'
SEQ ID NO. 41 3 ' '-AGGGTCCGACGT-5',5'-TGCAGCCTGGGA-3'
SEQ ID NO. 42 3 1 '-GGGTCCGACGTG-5',5'-GTGCAGCCTGGG-3'
SEQ ID NO. 43 3 ' '-GGTCCGACGTGG-5',5'-GGTGCAGCCTGG-3'
SEQ ID NO. 44 3' ’-CCGACGTGGGTA-5',5'-ATGGGTGCAGCC-3'
SEQ ID NO. 45 3 ' ’-GTAGAAGTTCGG-5',5'-GGCTTGAAGATG-3’
SEQ ID NO. 46 3' '-ACGCCCCCGACG-5', 5 '-GCAGCCCCCGCA-3', lub
SEQ ID NO. 47 3' '-CCCCCGACGACG-5',5'-GCAGCAGCCCCC-3'
1) kinaza . c- raf
SEQ m) ID NO. 48 PKC-alfa 5 ' '-TCCCGCCTGTGACATGCATT
SEQ ID NO. 49 5' '-GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA
n) kinaza . białek A
SEQ ID NO. 50 5' ’-GCGTGCCTCCTCACTGGC
w przypadku, gdy celem jest integryna lub receptor adhezji komórka-komórka, jak na przykł ad VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM lub ELAM, wtedy oligonukleotyd może mieć, przykładowo, jedna z następujących sekwencji:
PL 202 881 B1
a) VLA-4, na przykład:
SEQ ID NO. 51 5'-GCAGTAAGCATCCATATC-3 ' lub
b) ICAM-1, na przykład:
SEQ ID NO. 52 5' -GCCCAAGCTGGCATCCGTCA
SEQ ID NO. 53 5' -CCCCCACCACTTCCCCTCTC-3'
SEQ ID NO. 54 5' -CTCCCCCACCACTTCCCCTC-3’
SEQ ID NO. 55 5' -GCTGGGAGCCATAGCGAGG-3'
c)
SEQ
SEQ
d)
SEQ
ELAM-1, na
ID NO. 56
ID NO. 57 integryna
ID NO. 58 przykład:
5’-ACTGCTGCCTCTTGTCTCAGG-3 ' -CAATCAATGACTTCAAGAGTTCalfa(V)
5'-GCGGCGGAAAAGCCATCG
W przypadku, gdy celem jest białko, odpowiedzialne za proliferację lub migrację, wzglę dnie zaangażowane w jednym lub obu tych procesach, takie jak:
1) jądrowe białka transaktywujące i cykliny, jak na przykład c-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, cyklina i kinaza cdc2;
2) mitogeny lub czynniki wzrostowe, takie jak, przykładowo, PDGF, bFGF, VEGF, EGF,
HB-EGF i TGF-β;
3) receptory komórkowe, takie jak, przykładowo, receptor bFGF, receptor EGF i receptor PDGF; wtedy oligonukleotyd może mieć, przykładowo, jedną z następujących sekwencji zasad:
a) c-myb
SEQ ID NO. 59 5'-GTGTCGGGGTCTCCGGGC-3'
b) c-myc
SEO ID NO. 60 5'-CACGTTGAGGGGCAT-3'
c) kinaza cdc2
SEO ID NO. 61 5'-GTCTTCCATAGTTACTCA-3'
d) PCNA (szczurzy antygen jądrowy komórek proliferujących)
SEO ID NO. 62 5'-GATCAGGCGTGCCTCAAA-3'
W przypadku, gdy celem jest, na przykład, receptor adenozynowy A1, receptor adenozynowy A3, receptor bradykininowy lub IL-13, wtedy możliwa jest, przykładowo, następująca sekwencja zasad:
PL 202 881 B1
SEQ ID NO. 63 5'- GATGGAGGGCGGCATGGCGGG
Otrzymano następujące oligonukleotydy (5’ —> 3')
ONI: 5’ -d(G*CGAC*GC*CAT*GAC*G*G) SEQ ID NO. 1
ON2 : 5' -d(C*GAC*GC*CAT*G*A*C) SEQ ID NO. 2
ON3: 5’ -d(A*T*GAC*GGAA*T*T*C) SEQ ID NO. 3
ON4 : 5' -d(TATTCCGTCAT) SEQ ID NO. 4
ON5: 5' - (dA) 20 SEQ ID NO. 5
ON6: 5' - (dA) jo SEQ ID NO. 6
ON7 : 5' - (dA) 80 SEQ ID NO. 7
ON8: 5' -T*T*CC*AT*GG*TG*G*C SEQ ID NO. 8
0N9: 5’ -T*T*CA*CT*GT*GG*G*C SEQ ID NO. 9
ONIO: 5’ -T*G*GC*GC*CG*GG*C*C SEQ ID NO. 10
ON11: 5’ _t*g*cc*gg*cc*gg*g*c SEQ ID NO. 11
przy czym * podaje pozycje, w których mostek fosfodiestrowy zastąpiony jest przez międzynukleozydowy mostek fosforotianowy.
Sekwencje te przekształcono w następujące koniugaty (KO):
KO_1: F3-Li1-ON1
KO_2: F0-Li1-ON1
KO_3: F3-Li1-ON2
KO_4: F0-Li1-ON2
KO_5: F3-Li1-ON3
KO_6: F9-Li1-ON3
KO_7: F2-Li1-ON3
KO_8: F0-Li1-ON3
KO_9: F3-Li1-ON3-rodamina
KO_10: F9-Li1-ON3-rodamina
KO_11: F6-Li1-ON3-rodamina
KO_12: F0-Li1-ON3-rodamina
KO_13: F3-Li1-ON4
KO_14: F3-Li1-ON5
KO_15: F3-Li1-ON6
KO_16: F3-Li1-ON7
KO_17: F3-Li1-ON8
KO_18: F3-Li1-ON9
KO_19: F3-Li1-ON10
KO_20: F3-Li1-ON11
KO_21: F7-Li1-ON3 przy czym:
F1 - F11 oznaczają grupy arylowe o wzorach F1 - F11 (przedstawione na arkuszu wzorów fig. 2a i 2b).
Li1 stanowi grupę 6-aminoheksylofosforanową, związaną na końcu 5' oligonukleotydu (na przykład patrz: figura 4);
ON1 - ON11 oznaczają oligonukleotytdy o sekwencjach SEO ID NO. 1 - SEQ ID NO. 11;
PL 202 881 B1 rodamina stanowi wykrywalne, obok fluoresceiny, oznakowanie rodaminą na końcu 3' oligonukleotydu.
W sposobie transportowania czą steczki poprzez membranę in vitro oraz w sposobie transportowania cząsteczki do komórki in vitro najpierw wytwarza się koniugat zawierający przeznaczoną do transportowania cząsteczkę i co najmniej jedną grupę arylową, przy czym:
a) otrzymuje się przeznaczoną do transportowania cząsteczkę, która zawiera reaktywną funkcję w pozycji, w której powinna zostać związana grupa arylowa;
b) otrzymuje się grupę arylową; oraz
c) poddaje się przeznaczoną do transportowania cząsteczkę reakcji z grupą arylową z utworzeniem koniugatu.
Korzystnie, funkcję reaktywną stanowi grupa aminowa, grupa merkapto, grupa chloroacetylowa, grupa izocyjanianowa, grupa izotiocyjanianowa, grupa karboksylową, grupa N-hydroksysukcynoimi dowa lub ugrupowanie chlorku kwasu karboksylowego.
Przekształcenia przeznaczonej do transportowania cząsteczki przeprowadzanego z udziałem grupy arylowej dokonuje się przy pH < 7,5, korzystnie przy pH < 7,3, szczególnie korzystnie przy pH 7,0 lub niższym, przykładowo przy pH < 7, korzystnie przy pH < 6,5.
W przypadku tych reakcji sprzęgania, wszystkie inne grupy reaktywne muszą być zabezpieczone (przed przereagowaniem) grupami zabezpieczającymi, znanymi specjalistom w tej dziedzinie techniki.
Zgodnie z rozwiązaniem według wynalazku cząsteczką przeznaczoną do transportowania jest polinukleotyd, oligonukleotyd lub mononukleotyd.
Sposoby wytwarzania obejmują metodę polegającą na tym, że w pierwszym etapie otrzymuje się cząsteczkę przeznaczoną do transportowania. W takiej sytuacji wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania oligonukleotydów. Oligonukleotydy otrzymywać można z wykorzystaniem rozmaitych, znanych metod chemicznych, takich jak, na przykład, metody opisane w: F. Eckstein, Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991). Oligonukleotydy można też wytworzyć w procesach obejmujących jeden, lub większą ilość etapów enzymatycznych. Otrzymywanie koniugatów oligonukleotydów zasadniczo opisane jest w piśmiennictwie [J. Goodchild, Bioconjugate Chem., 1, 165 (1990); S. Beaucage i R. lyer, Tetrahedrton, 49, 1925 (1993); S. Agrawal, Methods in Molecular Biology, tom 26, Protocols for oligonucleotide Conjugates, Humana Press (1994)].
Jednakże, w przypadku syntezy koniugatów oligonukleotydów należy brać pod uwagę to, że związki te mogą ulegać rozkładowi w środowisku o odczynie alkalicznym. Stąd też, na przykład, przy zastosowaniu istniejących metod, nie jest możliwa żadna synteza oligonukleotydów znakowanych FDA przy użyciu syntezatora oligonukleotydów, ponieważ od razu zostają zhydrolizowane grupy estrowe ugrupowania FDA w wyniku obróbki z udziałem amoniaku, potrzebnej do odszczepienia oligonukleotydu od nośnika i odszczepienia aminowych grup zabezpieczających zasady heterocykliczne. Dlatego, wpierw otrzymuje się oligonukleotyd w postaci nie zabezpieczonego prekursora, a w ostatnim etapie kondensuje się go z grupą arylową (fig. 4). Prekursor oligonukleotydu obejmuje funkcję reaktywną lub zdolną do zaktywowania, którą następnie derywatyzuje się sposobami znanymi specjalistom w tej dziedzinie techniki przy użyciu odczynnika zawierającego grupę stosowaną według wynalazku. Jako funkcje reaktywne, względnie zdolne do zaktywowania, bierze się tu pod uwagę takie grupy, jak grupa aminowa, grupa merkapto, grupa chloroacetylowa, grupa izo(tio)cyjanianowa i grupa karboksylową. Wymienione aminołączniki wprowadza się do oligonukleotydów szczególnie łatwo przy pomocy odczynników dostępnych handlowo. Następnie, oligonukleotydy z aminołącznikami poddaje się reakcji, na przykład, z odczynnikami reaktywnymi zawierającymi grupę arylową. Takimi reaktywnymi odczynnikami są, na przykład, odpowiednie izotiocyjaniany. W tym przypadku, grupa arylowa stosowana według wynalazku zostaje związana poprzez funkcję tiomocznikową (załącznik 4). Innymi reaktywnymi odczynnikami są, na przykład, chlorki kwasów karboksylowych. Do łagodnych odczynników reaktywnych należą, przykładowo, N-hydroksysukcynoimidy odpowiednich kwasów karboksylowych. Odczynnikami zdolnymi do zaktywowania są, na przykład, odpowiednie kwasy karboksylowe, które można sprzęgać z odczynnikami sprzęgającymi peptydy, takimi jak HBTU, TBTU lub TOTU. W takim przypadku, grupa arylowa stosowana według wynalazku zostaje związana poprzez funkcję amidową. W zasadzie, wprowadzenie grup arylowych stosowanych według wynalazku może dojść do skutku w dowolnej pozycji oligonukleotydu. Korzystne są pozycje uwidocznione na fig. 3.
Synteza zmodyfikowanych oligonukleotydów odbywa się poprzez syntezę łańcucha oligonukleotydu prowadzoną metodami typowymi, takimi jak synteza w fazie stałej metodą fosforoamidytową
PL 202 881 B1 i derywatyzacja koń ca 5' przy uż yciu handlowo dostę pnego 5'-aminomodyfikatora C6 (na przykł ad z firmy Eurogentec, Seraing, Belgia).
5'-Aminomodyfikator C6 (Mmt = 4-monometoksytrityl)
Po odszczepieniu pochodnej oligonukleotydu od nośnika i odblokowaniu wszystkich grup zabezpieczających labilnych w środowisku alkalicznym przez potraktowanie amoniakiem, odszczepia się grupę monometoksytritylową przez podziałanie 80% kwasem octowym w temperaturze otoczenia. Otrzymuje się zmodyfikowany oligonukleotyd jako 5'-aminoheksylofosforan. Następnie, funkcję aminową tej pochodnej oligonukleotydu poddaje się reakcji z FDA-izotiocyjanianem w środowisku buforu z 0,2 M wodorowęglanem trietyloamoniowym (bufor TBK) pH 7/DMF. Już po upływie około 2-3 godzin oligonukleotyd z aminołącznikiem całkowicie przereagował z utworzeniem żądanej pochodnej FDA (fig. 4). Reakcję z izotiocyjananem fluoresceiny przeprowadza się w zwykły sposób przy pH 8. Przy tej wartości pH dioctan ugrupowania FDA w praktyce całkowicie ulega hydrolizie.
Oczywiście, użyć tu można także i innych odczynników typu aminołączników, takich jak, na przykład, 5'-aminomodyfikator C3, 5'-aminomodyfikator C12, 5'-aminomodyfikator 5 lub tiolomodyfikator C6 (wszystkie one z firmy Eurogentec).
Przez użycie 3'-aminomodyfikatora dla fazy stałej, takiego jak, na przykład 3'-aminomodyfikator C3 CPG (z firmy Eurogentec), można wytworzyć pochodne oligonukleotydów z ugrupowaniem 3'-aminoalkilowym, które następnie poddaje się reakcji z izotiocyjanianem FDA, w wyniku czego otrzymuje się pochodną oligonukleotydu:
3'-Aminomodyfikator C3 CPG (Fmoc = fluorenylometoksykarbonyl) która zawiera związaną z nią na końcu 3' grupę arylową zgodną z wynalazkiem.
Do wprowadzenia koniugatu do zasady heterocyklicznej nukleozydu można w syntezie posłużyć się, zamiast normalnie stosowanym elementem fosforoamidytowym, odpowiednim aminomodyfikatorem C6 dT (z firmy Eurogentec) wywodzącym się z tymidyny. Na końcu syntezy oligonukleotydu odszczepia się zabezpieczającą grupę trifluoroacetylową na drodze obróbki z udziałem amoniaku i wolną grupę aminową poddaje się w roztworze reakcji z izotiocyjanianem FDA.
PL 202 881 B1
Aminomodyfikator C6 dT
W podobny sposób można grupy arylowe zgodne z wynalazkiem wprowadzić w dowolne pozycje oligonukleotydu. Jak łatwo zrozumieć, możliwe jest tu wprowadzenie wielu takich samych lub różnych grup.
W procesie wytwarzania koniugatów w sposobie transportowania cząsteczki przez membranę względnie do komórki prowadzonym według wynalazku, w którym cząsteczką przeznaczoną do transportowania jest kwas peptydowo-nukleinowy (PNA), można, na przykład, pierwszorzędową funkcję aminową ugrupowania aminoetylowego poddać reakcji z izotiocyjanianem FDA. W procesie wytwarzania koniugatów, w których cząsteczka przeznaczona do transportowania jest polipeptydem, można, na przykład, aminowy koniec polipeptydu lub funkcje aminowe lizynowego łańcucha bocznego poddać reakcji z izotiocyjanianem FDA.
Koniugaty, które powstają początkowo w sposobach według wynalazku mają zwłaszcza te zastosowania, które oparte są na opisanych tu korzystnych właściwościach koniugatów. Szczególny sposób wykonania wynalazku dotyczy zastosowania koniugatów do transportu cząsteczek poprzez błonę biologiczną. Korzystnie, błona biologiczna stanowi część składową komórki, pęcherzyka lub organelli.
W sposobie transportowania cząsteczki poprzez błonę, zgodnie z wynalazkiem najpierw
a) wytwarza się koniugat, w przypadku którego cząsteczka przeznaczona do transportowania związana jest z co najmniej jedną grupą arylową zgodną z wynalazkiem, po czym
b) koniugat inkubuje się z błoną.
W szczególności, sposób transportowania cząsteczki do komórki polega na tym, że:
a) wytwarza się koniugat, w przypadku którego cząsteczka przeznaczona do transportowania związana jest z co najmniej jedną grupą arylową zgodna z wynalazkiem, oraz
b) koniugat inkubuje się z komórką, po czym
c) koniugat zostaje przetransportowany do komórki bez odszczepienia grupy arylowej.
Dotyczy to zwłaszcza sposobu, w którym komórką tą jest komórka eukariotyczna lub prokariotyczną, na przykład komórka bakteryjna, komórka drożdżaka lub komórka ssaka, korzystnie komórka ludzka. W szczególnym sposobie wykonania wynalazku, jest to komórka zmieniona patologicznie, na przykład komórka nowotworowa.
W sposobie transportowania cząsteczki do komórki zaobserwowano polepszone pobieranie koniugatu przez komórki nie tylko w przypadku komórek ssaków, ale także u komórek innych eukarlontów, a nawet u prokarlontów.
Koniugaty, które wytwarzane są w sposobie według wynalazku przebadano mikroskopowo pod względem pobierania ich przez żyjące komórki. Wpierw oligonukleotydy znakowane FDA poddano badaniu pod względem współgrania komórek i koniugatów KO_1 i KO_3. Jako związków znanych z dotychczasowego stanu techniki użyto odpowiednich znakowanych fluoresceiną oligonukleotydów KO_2 i KO_4. Wszystkie zbadane żywotne hodowle komórek zwierzęcych pobierały KO_1 i KO_3 (koniugaty z FDA) w ciągu 5-10 minut, podczas gdy koniugatów KO_2 i KO_4 (są to koniugaty z fluoresceiną) nie dało się wykryć w żywotnych komórkach (tabela 1).
Chociaż pobieranie u bakterii i drożdżaków następuje o wiele wolniej niż u ssaków, to jednak przecież po upływie 2 godzin stwierdzono zajście, w pewnym zakresie, wchłonięcia oligonukleotydów według wynalazku przez część komórek, natomiast normalne oligonukleotydy, znakowane fluoresceiną, w ogóle nie zostały pobrane w tych warunkach. Było to zdumiewające, że w zasadzie wszystkie przebadane organizmy pobierały oligonukleotydy według wynalazku lepiej od znanych dotychczas pochodnych oligonukleotydów. Do organizmów tych należały, między innymi, komórki zwierzęce, wiciowce, drożdżaki, grzyby i bakterie (tabela 3).
Następnie, okazało się, że oligonukleotydy są szczególnie dobrze przyjmowane przez komórki rakowe. Dlatego też, użycie oligonukleotydów według wynalazku przydaje się zwłaszcza do leczenia nowotworów. Znakowany FDA antysensowny oligonukleotyd KO_1, który ukierunkowany jest na egS, hamował proliferację komórek A549 już przez samo wprowadzenie go do podłoża, podczas gdy odpowiadający mu nie zmodyfikowany antysensowny oligonukleotyd ON1 oraz znakowany fluoresceiną oligonukleotyd KO_2 hamowały proliferację komórek rakowych dopiero po sformułowaniu ich ze środkami wzmagającymi przenikanie, takimi jak CellFectin.
Koniugaty, w przypadku których cząsteczką przeznaczoną do transportowania jest oligonukleotyd mogą być stosowane do hybrydyzacji z jednoniciowymi i/lub dwuniciowymi kwasami nukleinowymi, przykładowo DNA (na przykład geny, cDNA) i/lub RNA (na przykład pre-mRNA, mRNA). Koniugaty
PL 202 881 B1 te mogą się wiązać w sposób sekwencyjnie specyficzny także z białkami wewnątrzkomórkowymi, takimi jak enzymy, przykładowo polimerazy lub telomerazy, albo z sygnałami transkrypcji.
Takie koniugaty mogą być stosowane do modulowania tak całkowitego jak i częściowego hamowania ekspresji określonych genów docelowych, przykładowo do całkowitego lub częściowego hamowania transkrypcji i/lub translacji lub jako antysensownych oligonukleotydów, rybozymów, sensownych oligonukleotydów, oligonukleotów tworzących potrójną spiralę, chimeraplastów i/lub oligonukleotydów Decoy. Stąd też, omawianych koniugatów można używać jako środków pomocniczych w biologii molekularnej.
Ooligonukleotydy mogą być stosowane jako leki i/lub środki diagnostyczne, względnie do wytwarzania leków i/lub środków diagnostycznych. W szczególności, oligonukleotydy mogą znajdować się w składzie leków służących zapobieganiu i/lub leczeniu chorób przebiegających z ekspresją względnie nadekspresją określonych genów. Następnie, oligonukleotydów takich można używać do diagnozowania lub wczesnego rozpoznawania chorób tego rodzaju. Ponieważ współgranie oligonukleotydów według wynalazku z komórkami jest bardzo dobre, można ich używać do badań diagnostycznych in vivo, na przykład do hybrydyzacji in situ z całymi narządami lub organizmami nienaruszonymi.
Jeden lub więcej koniugatów tworzących się początkowo w sposobie transportowania cząsteczki poprzez membranę lub do komórki według wynalazku mogą być zawartych w odpowiednich lekach względnie w środkach diagnostycznych. Mogą one również wchodzić w skład zestawów testowych.
Oligonukleotydy stosowane w rozwiązaniu według wynalazku mogą być stosowane do wykrywania, rozdzielania i amplifikowania nukleinowych kwasów nukleinowych i ich analogów. Koniugaty nadają się szczególnie do wykrywania kwasów nukleinowych w komórkach, zwłaszcza w komórkach żyjących. Komórki te mogą pochodzić od ludzi lub zwierząt. W szczególny sposób omawiane koniugaty nadają się także do wykorzystania w przypadku organizmów wyszczególnionych w tabeli 3, zwłaszcza do wykrywania organizmów chorobotwórczych. Oligonukleotydy stosowane w rozwiązaniach według wynalazku można stosować w znanych technicznych wariantach amplifikacji kwasów nukleinowych, zwłaszcza w LMPCR (reakcja łańcuchowa polimerazy za pośrednictwem licowania), w teście Invader Assay(znak towarowy, Third Wave technologies, Inc. Wisconsin) w systemie TaqMan (znak towarowy) i w Multiplex Genotyping. Korzystne jest także zastosowanie oligonukleotydów do amplifikacji kwasów nukleinowych przy pomocy urządzenia light-cycler, umożliwiającego dokładne ustalenie czasu amplifikacji. Detekcja oparta na zasadzie cząsteczkowych bikonów (ang. beacons), w przypadku których fluoryzu jacy barwnik w stanie niezwi ą zanym nie fluoryzuje, ponieważ jest zgaszony przez drugą grupę w oligomerze, stanowi dalszą możliwość stosowania oligonukleotydów zgodnych z wynalazkiem. I tak, przykładowo, można połączyć pochodną FDA (na przykład, na końcu 5' oligonukleotydu) z grupą dabcylową (na przykład, skoniugowana na końcu 3'), czego wynikiem, po przekształceniu pochodnej FDA w pochodną fluoresceinowa, jest zgaszenie sygnału fluorescencyjnego w pochodnej z fluoresceiną w stanie niezwiązanym.
Takie zmodyfikowane fluoresceiną bikony wysyłałyby sygnały fluorescencyjne dopiero po wniknięciu do komórki i hybrydyzacji z docelowym mRNA.
Oligonukleotydy względnie leki zawierających te oligonukleotydy, mogą być stosowane do leczenia chorób w przypadku których określone geny, w wyniku nadekspresji, są genami przyczynowymi lub zaangażowanymi.
Leki takie mogą być stosowane do leczenia, przykładowo, tych chorób, które wywoływane są przez wirusy, na przykład przez CMV, HIV, HSV-1, HCV-2, wirusy grypy, VSV, wirus zapalenia wątroby B lub wirusy brodawek.
Leki takie nadają się także, na przykład, do leczenia raka oraz również nadają się do leczenia tych chorób, na które mają wpływ integryny lub receptory adhezyjne komórka-komórka, na przykład VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM lub ELAM.
Także, leki te można wykorzystać, na przykład, do przeszkadzania zachodzeniu restenozy, do leczenia bielactwa innych chorób połączonych z depigmentacją względnie zakłóceniami depigmentacji (na przykład skóry, włosów, oczu) takich jak, na przykład albinizm i łuszczyca, oraz astmy.
W zakres omawianych leków wchodzą, na przykład, preparaty farmaceutyczne, które można podawać:
a) doustnie, na przykład w postaci tabletek, drażetek, kapsułek żelatynowych twardych i miękkich, roztworów, emulsji lub zawiesin;
b) doodbytniczo, na przykład w postaci czopków; albo
PL 202 881 B1
c) pozajelitowe, na przykład w postaci roztworów do wstrzykiwań.
W celu wytworzenia leku, koniugaty można formułować z wykorzystaniem, na przykład, terapeutycznie obojętnych nośników organicznych i/lub nieorganicznych. Przykładowo, jako nośników dla tabletek, drażetek i kapsułek żelatynowych twardych można użyć laktozy, skrobi kukurydzianej lub jej pochodnych, łoju i kwasu stearynowego lub jego soli. Jako nośników dla roztworów można użyć wody, polioli, sacharozy, cukru inwertowanego i glukozy, a dla roztworów do wstrzykiwań nadają się: woda, alkohole, poliole, gliceryna i oleje roślinne. W przypadku czopków można użyć olejów roślinnych i utwardzonych, wosków, tłuszczów i półpłynnych polioli. Oprócz tego, leki mogą zawierać środki konserwujące, rozpuszczalniki, stabilizatory, środki zwilżające, emulgatory, środki słodzące, barwniki, środki polepszające smakowitość, sole do korygowania ciśnienia osmotycznego, bufory, środki powlekające, przeciwutleniacze jak również, ewentualnie, inne lecznicze substancje aktywne. Korzystnie, leki stosuje się miejscowo lub lokalnie, tak jak, na przykład, przy pomocy cewnika lub przez wziewanie, albo przez wstrzykiwanie lub wlew. Z przeznaczeniem do wstrzykiwania koniugat formułuje się w postać ciekłego roztworu, korzystnie w buforze fizjologicznie zgodnym, takim jak, na przykład, płyn Hanksa lub płyn Ringera. Jednakże, koniugat można sformułować także w postać preparatu stałego, który przed użyciem rozpuszcza się lub zawiesza. Korzystne dawki przy stosowaniu systematycznym mieszczą się w zakresie od około 0,01 mg/kg masy ciała/dzień do około 50 mg/kg masy ciała/dzień. Koniugaty i/lub ich fizjologicznie dozwolone sole można, jako leki, podawać zwierzętom, korzystnie ssakom, a zwłaszcza ludziom, jako takie, albo w postaci mieszanin, albo w postaci preparatów farmaceutycznych, umożliwiających stosowanie miejscowe, przezskórne, pozajelitowe lub dojelitowe i zawierających, jako składnik aktywny, skuteczną dawkę co najmniej jednego koniugatu oprócz zwykle stosowanych farmaceutycznie zgodnych nośników i dodatków. Normalnie, preparaty zawierają od około 0,1 do 90% wag związku terapeutycznie czynnego. W przypadku leczenia chorób skóry, takich jak, na przykład, łuszczyca czy bielactwo, korzystne jest stosowanie miejscowe, na przykład w postaci maści, lotionów lub nalewek, emulsji i zawiesin. Wytwarzanie leku odbywa sie w znany sposób (na przykład: Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publ. Co., Easton, PA), przy czym użyć można farmaceutycznie obojętnych nośników nieorganicznych i/lub organicznych. Do wytworzenia pigułek, tabletek, drażetek i kapsułek żelatynowych twardych użyć można, na przykład, laktozy, skrobi kukurydzianej i/lub jej pochodnych, talku, kwasu stearynowego i/lub jego soli itd. W przypadku wytwarzania kapsułek żelatynowych miękkich i/lub czopków nośnikami są, na przykład, tłuszcze, woski, półstałe i płynne poliole, oleje naturalne i/lub utwardzone itd. Jako nośniki w przypadku otrzymywania roztworów i/lub syropów nadają się do użycia, na przykład: woda, sacharoza, cukier inwertowany, glukoza, poliole itd. Przy wytwarzaniu roztworów do wstrzykiwań, jako nośników użyć można wody, alkoholi, gliceryny, polioli, olejów roślinnych itd. Do otrzymywania mikrokapsułek, implantatów i/lub pręcików nadają się kopolimery utworzone z kwasu glikolowego i kwasu mlekowego. Poza tym, odpowiednie są też preparaty w postaci liposomów, znane specjalistom w tej dziedzinie techniki [N. Weiner, Drug Develop. Ind. Pharm., 15, 1523 (1989); Liposome Dermatics, Springer Verlag (1992)], na przykład liposomy HVJ [Hayashi, Gene Therapy, 3, 878 (1996)].
Omawiane tu leki mogą zawierać, obok substancji aktywnych i nośników, także substancje dodatkowe, takie jak, na przykład, wypełniacze, domieszki objętościowe, środki rozsadzające, środki wiążące, środki poślizgowe, środki zwilżające, stabilizatory, emulgatory, środki konserwujące, środki słodzące, barwniki, środki polepszające smakowitość lub aromatyzujące, środki zagęszczające, rozcieńczalniki, substancje buforujące, a dalej rozpuszczalniki i/lub środki solubilizujące i/lub środki do uzyskiwania efektu przedłużonego działania, jak również sole do korygowania ciśnienia osmotycznego, środki powlekające i/lub przeciwutleniacze. Także, mogą one zawierać dwa, lub więcej niż dwa różne oligonukleotydy i/lub ich fizjologicznie dozwolone sole, jak również, oprócz co najmniej jednego oligonukleotydu, jedną, lub większą ilość innych substancji terapeutycznie czynnych. Dawka może się wahać w szerokim zakresie i w każdym indywidualnym przypadku musi być dopasowana do konkretnych uwarunkowań.
Figury
Fig. 1 i Fig. 2b przedstawiają wzory przykładowych porównawczych grup arylowych.
Fig. 2a przedstawia wzory grup arylowych stosowanych w wynalazku. Zamieszczony na tym arkuszu wzór F2 przedstawia porównawczą grupę arylową.
Fig. 3 przedstawia rozmaite przykłady (A, B, C, D, E, F, G) sprzężenia zachodzącego między cząsteczką przeznaczoną do transportowania (tu: oligonukleotydem) i grupami arylowymi stosowany18
PL 202 881 B1 mi zgodnie z wynalazkiem. Symbol R oznacza w/w grupę arylową a symbol B oznacza zasadę heterocykliczną.
Fig. 4 pokazuje możliwość wytworzenia koniugatu zgodnego z wynalazkiem (tu: składającego się z izotiocyjanianu FDA i oligonukleotydu).
Fig. 5 pokazuje przebieg z upływem czasu pobierania koniugatu KO_5 przez komórki REH z podłoża, przy czym użyto raz podłoża bez surowicy (♦) i raz podłoża z surowicą (czarne kwadraty). Pobranie przez komórki oznaczono z zastosowaniem FACS.
Fig. 6 - oznaczenie pobrania przez komórki KO_1 (koniugat z FDA; ♦) i KO_2 (oligomer z FITC; czarne trójkąty) za pomocą pomiaru z zastosowaniem FACS. Stężenie wyjściowe pozakomórkowego koniugatu oligonukleotydu wynosiło 1 μM; O i □ oznaczają kontrole.
Fig. 7 - zależność transfekcji komórek pollA-nukleotydów skoniugowanych z FDA od długości.
Fig. 8 - porównanie koniugatów oligonukleotydów z dioctanem fluoresceiny i koniugatów oligonukleotydów z dipiwalanem fluoresceiny pod względem pobierania ich przez komórki.
K39: dioctan karboksyfluoresceiny (F3 = FDA) z przykładu 15
K41: dipiwalan karboksyfluoresceiny (F2) z przykładu 10.
Fig. 9. - badanie metodą mikroskopii fluorescencyjnej pobierania przez komórki dwukrotnie znakowanego koniugatu Cy3-oligonukleotyd-F3 w warunkach inkubacji z komórkami REH. Pobranie: po upływie 4 godzin.
Na lewo: znakowanie fluorescencyjne. W środku: barwnik cyjaninowy. Na prawo: pobranie z kontrastem fazowym. Na górze: oligonukleotyd K33. Na dole: oligonukleotyd K34.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1. Synteza oligonukleotydów
Oligonukleotydy zsyntetyzowano na automatycznym syntezatorze DNA (Applied Biosystems Model 380B lub 394) z zastosowaniem typowej chemicznej metody fosforoamiditowej i utleniania przy użyciu jodu [red. F. Eckstein, Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991)]. Dla wprowadzenia mostków fosforotianowych w mieszaninie fosforotianów i oligonukleotydów fosfodiestrowych, utlenienia dokonano, nie jodem, ale przy użyciu TETD (disulfid tetraetylotiuramu) lub odczynnika Beaucage'a. Po odszczepieniu od stałego nośnika (CPG lub Tentagel) i usunięciu grup zabezpieczających przy użyciu stężonego NH3 w temperaturze 55°C, w ciągu 18 godzin, oligonukleotydy oczyszczono wpierw z zastosowaniem wytrącania butanolem [Sawadogo, Van Dyke, Nucl. Acid. Res., 19, 674 (1991)], po czym oligonukleotydy poddano oczyszczaniu metodą preparatywnej elektroforezy w żelu lub metodą FPLC. Następnie, otrzymano sól sodową za pomocą wytrącenia z 0,5 M roztworu NaCl przy użyciu 2,5 objętości etanolu.
Analizę oligonukleotydów przeprowadzono następującymi metodami:
a) analityczna elektroforeza w żelu (20% akryloamid, 8 M mocznik, 454 M bufor Tris-boran, pH 7,0, i/lub
b) HPLC (Waters GenPak FAX, gradient CH3CN (400 ml), H2O (1,6 litra), NaH2PO4 (3,1 g), NaCl (11,7 g), pH 6,8 (0,1 M w przeliczeniu na NaCl) po CH3CN (400 ml), H2O (1,6 litra), NaH2PO4 (3,1 g), NaCl 175,3 g), pH 6,8 (1,5 M w przeliczeniu na NaCl) i/lub
c) elektroforeza kapilarna w żelu z zastosowaniem kapilary Beckmanna eCAP™, (U100P Gel Column, 65 cm length, 100 mm I.D., window 15 cm from one end), bufor 140 μM Tris, 360 mM kwas borowy, 7 M mocznik i/lub
d) spektroskopia mas z jonizacją elektronową.
Wyniki badania oligonukleotydów wykazały ich czystość każdorazowo powyżej 90%, przy czym najczęściej powyżej 95%
P r z y k ł a d 2. Wprowadzenie 5'-aminołącznika do oligonukleotydu.
Oligonukleotyd skonstruowano sposobem opisanym w przykładzie 1. Po sprzężeniu ostatniego nukleotydu odszczepiono grupę dimetoksytritylową na końcu 5'. Wolną grupę hydroksylową poddano reakcji z dostępnym handlowo 5'-aminomodyfikatorem C6 (z firmy Eurogentec, Seraing, Belgia) warunkach katalizy tetrazolowej i przeprowadzono utlenianie wodą jodową. Następnie, oligonukleotyd odszczepiono od nośnika za pomocą traktowania stężonym amoniakiem, w temperaturze 50°C, przez noc i odszczepiono wszystkie nietrwałe w warunkach alkalicznych grupy ochronne obecne przy grupach międzynukleozydowych i funkcjach aminowych zasad heterocyklicznych. W ostatnim etapie, odszczepiono monometoksytritylową grupę ochronną za pomocą 3-godzinnej obróbki z udziałem 80% kwasu octowego, w temperaturze otoczenia. Utworzony tak oligonukleotyd poddano analizie w sposób opisany w powyższym przykładzie 1.
PL 202 881 B1
P r z y k ł a d 3. Sprzężenie z izotiocyjanianem FDA oligonukleotydu z aminołącznikiem
W 16 μΐ buforu z 0,2 M wodorowęglanem trietyloamoniowym (TBK) rozpuszczono 10 OD (260) oligonukleotydu z 5'-aminołącznikiem z przykładu 2, po czym dodano 125 μl dimetyloformamidu (DMF). Do utworzonej tak mieszaniny wprowadzono 1,5 mg izotiocyjanianu FDA i całość mieszano w ciągu 3 godzin bez dostępu światła. Postęp reakcji kontrolowano metodą HPLC, po czym dodano 2 μl stężonego kwasu octowego i mieszaninę zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Następnie produkt wyodrębniono za pomocą wytrącenia butanolem i ustalono jego masę cząsteczkową z wykorzystaniem spektrometrii mas z jonizacją elektronową (ESI-MS).
Próbki przetrzymywano przy pH poniżej 7, dzięki czemu nie dochodziło do hydrolizy estrów aromatycznych.
P r z y k ł a d 4. Synteza KO_1(5'-F3-G*CGAC*GC*CAT*GAC*G*G-3'; F3 = FDA)
Oligonukleotyd skonstruowano wychodząc z CPG-nośnika z 1 μmolem dezoksyguanozyny związanej poprzez koniec 3', sposobem opisanym w powyższym przykładzie 1.
W pozycjach oznaczonych * dokonano utlenienia przy użyciu odczynnika Beaucage'a w celu wprowadzenia mostków fosforotianowych.
Następnie, przeprowadzono sprzęganie z 5'-aminomodyfikatorem sposobem opisanym w powyższym przykładzie 2.
Po usunięciu grup zabezpieczających przy użyciu stężonego amoniaku i 80% kwasu octowego otrzymano 96 OD (260) 5'-aminołącznik-G*CGAC*GC*CAT*GAC*G*G-3'
Następnie, 10 OD (260) 5'-aminołącznik-oligonukleotydu poddano reakcji z izotiocyjanianem FDA w sposób opisany w powyższym przykładzie 3. Po wytrąceniu butanolem otrzymano 8,4 OD (260) żądanego oligonukleotydu znakowanego FDA. ESI-MS (dla soli disodowej): 5395,93 (obliczono dla di-Na: 5395,09).
P r z y k ł a d 5. Synteza KO_13(5'-F3-TATTCCGTCAT-3')
Oligonukleotyd skonstruowano wychodząc z CPG-nośnika z 1 μmolem tymidyny związanej poprzez koniec 3', sposobem opisanym w powyższym przykładzie 1. Wszystkich utlenień dokonano z udziałem wody jodowej. Następnie przeprowadzono sprzęganie z 5'-aminomodyfikatorem C6, sposobem opisanym w powyższym przykładzie 2. Po usunięciu grup zabezpieczających przy użyciu stężonego amoniaku i 80% kwasu octowego otrzymano 72 OD (260) 5'-aminołącznik-TATTCCGTCAT-3'. Po oczyszczeniu metodą preparatywną z użyciem żelu poliakryloamidowego otrzymano 43 OD (260).
Następnie, 10 OD (260) 5'-aminołącznik-oligonukleotydu poddano reakcji z izotiocyjanianem FDA w sposób opisany w powyższym przykładzie 3. Po wytrąceniu butanolem otrzymano 9,1 OD (260) żądanego oligonukleotydu znakowanego FDA. ESI-MS: 3934,1 (masa cząsteczkowa obliczona: 3933,8).
P r z y k ł a d 6. Synteza KO_21(5'-F7-A*T*GAC*GGAA*T*T*C)-przykład porównawczy
Oligonukleotyd skonstruowano wychodząc z CPG-nośnika z 1 pmolem N6-benzoilocytydyny związanej poprzez koniec 3', sposobem opisanym w powyższym przykładzie 1. Wszystkich utlenień dokonano z udziałem wody jodowej. Następnie przeprowadzono sprzęganie z 5'-aminomodyfikatorem C6, sposobem opisanym w powyższym przykładzie 2. Po usunięciu dokonanym przy użyciu stężonego amoniaku i 80% kwasu octowego otrzymano 145 OD (260) 5'-aminołącznik-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-3'.
OD (260) 5'-aminołącznik-oligonukleotydu rozpuszczono w 16 μl 0,2 M buforu TBK, 95 μl DMF i poddano reakcji z 30 μl uprzednio otrzymanego aktywnego estru kwasu p-acetoksybenzoeso wego. Wytwarzanie estru aktywnego polegało na zmieszaniu 50 μl 0,2 M kwasu p-acetoksybenzoesowego z 50 μl 0,3 M TBTU, każdorazowo w DMF i przeprowadzeniu jednogodzinnej reakcji w temperaturze otoczenia. Po upływie 4 godzin zachodzenia reakcji między estrem aktywnym a oligonukleotydem z 5'-aminołącznikiem dodano 2 μl półstężonego kwasu octowego i całość zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Nadmiar odczynnika usunięto przez wytrącenie butanolem, w wyniku czego otrzymano 10,7 OD (260) żądanego koniugatu oligonukleotydu.
ESI-MS: 4109,2 (masa cząsteczkowa obliczona: 4108,2)
P r z y k ł a d 7. Badanie pobierania przez komórki koniugatu oligonukleotydu
W celu zbadania pobierania przez komórki, do 1 ml zawiesiny komórek w komorze Bachofera w podłożu hodowlanym (lub po płukaniu w PBS w przypadku podłoży z samoistną fluorescencją) wprowadzono, pod kontrolą mikroskopową, 1 ml 1 μmolowego roztworu koniugatu oligonukleotydu, przy czym układ ten mieszano pipetą i przez wstrząsanie komory. Badanie mikroskopowe przeprowadzono przy użyciu aparatu Zeiss Axiovert 135 TV (100 X Plan-Neofluar) z zastosowaniem kontrastu fazowego. Jako filtry fluorescencyjne służyły filtry 09(450-490/FT 510/LP 520)/HBO 59W. Jako odnośnika użyto 2,4 μM roztworu FDA (Aldrich Chem. Co, FW.416.39) w układzie aceton/bufor PBS (1 : 1000, obj/obj).
PL 202 881 B1
W przypadku koniugatów z FDA można było śledzić, po pobraniu przez komórkę, samoistną fluorescencję, występującą w wyniku odszczepienia estrów powstałych ligandów fluoresceiny. W przypadku ligandów niefluoryzujących, takich jak acetoksynaftalen-kwas karboksylowy, wprowadzano do oligonukleotydu dodatkowo stosowny znacznik fluorescencyjny (FITC, rodaminę, barwnik cyjaninowy Dy3 lub Dy5). Podwójne znakowanie, jak w przypadku KO_9, służyło do wykazania, że FDA nie ulegał odszczepieniu od oligonukleotydu. Poszczególne próbki poddawano ocenie po upływie 2 do 120 minut od wprowadzenia koniugatu oligonukleotydu. W przypadku komórek REH można było wykryć wyraźną fluorescencję już po upływie 5 - 10 minut, w przypadku komórek K562 i przyległych, lub komórek owadzich, pobieranie w pewnym zakresie odbywało się jeszcze w okresie do 60 minut od wprowadzenia. W przypadku wolno żyjących pierwotniaków pobieranie trwało w ciągu godziny, a u droż dżaków następowało dopiero po upływie dłuższego czasu i nie jednorodnie we wszystkich komórkach. Zarodniki grzybów wchłaniały koniugaty oligonuklotyd-FDA lepiej od komórek strzępkowych. Otrzymane wyniki zebrano w poniższych tabelach 1 - 3.
P r z y k ł a d 8 Badanie antyproliferacyjnego działania koniugatów oligonukleotydów
Komórki REH (ludzka białaczka z prelimfocytami B, DSM ACC 22) lub komórki nowotworowe A549 hodowano w OptiMEM z 10% cielęcą surowicą płodową (FKS; GIBCO-BRL), w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO2. Na dzień przed rozpoczęciem próby komórek użyto w takiej ilości, aby po upływie 24 godzin uzyskać ich stężenie wynoszące około 1 x 106 /ml. Oligonukleotydy, względnie ich koniugaty, rozpuszczono w wodzie destylowanej jako 1 mM roztwory macierzyste i przechowywano w chłodni w temperaturze -20°C. Wysiewu komórek (1 x 106 komórek/ml w OptiMEM z 10% FKS) dokonano na 24-studzienkowe płytki. Do badania, pochodne nukleotydów rozcieńczono (w OptiMEM bez FKS) do stężenia 2 μΜ. Do każdej studzienki wprowadzono z wymieszaniem 100 μΐ roztworu oligonukleotydu i 100 μl zawiesiny komórek [całkowita objętość 200 μl/studzienkę; stężenie oligonukleotydu 1 μM; stężenie surowicy 5% FKS, stężenie komórek 0,5 x 10* komórek/ml). Po upływie 4 godzin inkubacji w temperaturze 37°C i w atmosferze 5% CO2 do studzienek wprowadzono po 800 μl OptiMEM z 11% FKS (stężenie komórek wynosiło teraz 1 x 105 komórek/ml, stężenie surowicy 10% FKS) i inkubację prowadzono w dalszym ciągu. Po upływie 96 godzin w temperaturze 37°C i w atmosferze 5% CO2 dokonano pomiaru stężenia komórek z użyciem Casy 1 (z firmy Scharfe). W tym celu, komórki z każdej studzienki dziesięciokrotnie zassano i ponownie wprowadzono pipetą (1000) i natychmiast rozcieńczono w stosunku 1 : 100 (a przy silniejszym wzroście komórek w stosunku 1 : 200) przy użyciu Casyton. Następnie, obliczono średnią wartość gęstości komórek dla 3 każdorazowo identycznie założonych prób eksperymentu.
P r z y k ł a d 9. Synteza 5'-F4'-(CO-NH)-A*T*GAC+GGAA*T*T*C
Oligonukleotyd skonstruowano wychodząc z CPG-nośnika z 1 gmolem N4-benzoilocytydyny związanej poprzez koniec 3', sposobem opisanym w powyższym przykładzie 1. Utlenień dokonano z udziałem wody jodowej względnie odczynnika Beaucage'a w celu wprowadzenia grupy fosforotianowej (tam, gdzie * w sekwencji). Następnie przeprowadzono sprzęganie z 5'-aminomodyfikatorem C6, sposobem opisanym w powyższym przykładzie 2. Po usunięciu grup zabezpieczających przy użyciu stężonego amoniaku i 80% kwasu octowego otrzymano 145 OD (260) 5'-aminołącznik-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-3'.
OD (260) 5'-aminołącznik-oligonukleotydu rozpuszczono w 16 μl 0,2 M buforu TBK, 95 μl DMF i poddano reakcji z 12,5 μl dichloro(dioctan fluoresceiny)hydroksysukcynoimidu (masa cząsteczkowa: 626,36). Po upływie 3 godzin zachodzenia reakcji między hydroksysukcynoimidem a oligonukleotydem z aminołącznikiem, dodano 2 μl półstężonego kwasu octowego i całość zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Odsolenia dokonano na kolumnie NAP™ (Pharmacia) i po wytrąceniu butanolem otrzymano 2,8 OD (260) żądanego koniugatu oligonukleotydu z dioctanem dichlorofluoresceiny.
ESI-MS: 4403,3 (masa cząsteczkowa obliczona: 4403,2).
P r z y k ł a d 10. Synteza 5'-F2'-(CO-NH)-A*T*GAC*GGAA*T*T*C
Wytworzono oligomer 5'-aminołącznik-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-3' sposobem opisanym w powyższym przykładzie 9.
OD (260) 5'-aminołącznik-oligonukleotydu rozpuszczono w 16 μl 0,2 M buforu TBK, 95 μl DMF i poddano reakcji z 12,5 μl karboksyfluoresceinodipiwalanohydroksysukcynoimidu (masa cząsteczkowa: 641,64. Po upływie 2 godzin zachodzenia reakcji między hydroksysukcynoimidem a oligonukleotydem z aminołącznikiem dodano jeszcze 12,5 hydroksysukcynoimidu i reakcję prowadzono w ciągu dalszych 2 godzin. Następnie dodano 2 μl półstężonego kwasu octowego i całość zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Po odsoleniu na kolumnie NAP™ (Pharmacia) i po wytrąceniu butanolem, otrzymano 8,1 OD (260) żądanego koniugatu oligonukleotydu z dipiwalanem fluoresceiny.
PL 202 881 B1
ESI-MS: 4472,9 (masa cząsteczkowa obliczona: 4471,6).
P r z y k ł a d 11. Synteza 5'-F9-A*T*GAC*GGAA*T*T*C
Wytworzono oligomer 5'-aminołącznik-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-3' sposobem opisanym w powyższym przykładzie 9.
OD (260) 5'-aminołącznik-oligonukleotydu rozpuszczono w 16 μl 0,2 M buforu TBK, 95 μl DMF i poddano reakcji z 25 μl aktywnego estru kwasu acetoksynaftylokarboksylowego. Wytwarzanie estru aktywnego polegało na zmieszaniu 12,5 μl 0,2 M kwasu acetoksynaftylokarboksylowego (2,5 mg w 50 μl DMF) z 12,5 μl TBTU (4 mg w 50 μl DMF) i przeprowadzeniu jednogodzinnej reakcji w temperaturze otoczenia. Po upływie 17 godzin zachodzenia reakcji między aktywnym estrem a aminołącznik-oligonukleotydem dodano 2 μl półstężonego kwasu octowego i całość zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Po odsoleniu na kolumnie NAP™ (Pharmacia) i po wytrąceniu butanolem, otrzymano 8,5 OD (260) żądanego koniugatu oligonukleotydowo-acetoksynaftylowego.
ESI-MS: 4158,2 (masa cząsteczkowa obliczona: 4157,2).
P r z y k ł a d 12. Synteza 5'-F8-A*T*GAC*GGAA*T*T*C
Wytworzono oligomer 5'-aminołącznik-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-3' sposobem opisanym w powyższym przykładzie 9.
OD (260) 5'-aminołącznik-oligonukleotydu rozpuszczono w 16 μl 0,2 M buforu TBK, 95 μl DMF i poddano reakcji z 25 μl aktywnego estru kwasu acetoksykumarynokarboksylowego. Wytwarzanie estru aktywnego polegało na zmieszaniu 12,5 μl 0,2 M kwasu acetoksykumarynokarboksylowego (2,7 mg w 50 μl DMF) z 12,5 μl TBTU (4 mg w 50 μl DMF) i przeprowadzeniu jednogodzinnej reakcji w temperaturze otoczenia. Po upływie 17 godzin zachodzenia reakcji miedzy aktywnym estrem a aminołącznik-oligonukleotydem dodano 2 μl półstężonego kwasu octowego i całość zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Po odsoleniu na kolumnie NAP™ (Pharmacia) i po wytrąceniu butanolem, otrzymano 8,0 OD (260) żądanego koniugatu oligonukleotydu z acetoksykumaryną.
ESI-MS: 4178,5 (masa cząsteczkowa obliczona: 4175,2).
P r z y k ł a d 13. Synteza 5'-F3-(dA)ndA*dA*dA (n= 17, 47 i 77; F3 = FDA)
Oligonukleotydy skonstruowano wychodząc z CPG-nośnika zderywatyzowanego N6-benzoilo2'-dezoksyadenozyną związaną poprzez koniec 3', sposobem opisanym w powyższym przykładzie 1. Utlenień po pierwszych dwóch sprzęganiach dokonano z udziałem odczynnika Beaucage'a w celu wprowadzenia grupy fosforotianowej (tam, gdzie * w sekwencji), natomiast wszystkich pozostałych utlenień z udziałem wody jodowej. Następnie przeprowadzono sprzęganie z 5'-aminomodyfikatorem C6 sposobem opisanym w powyższym przykładzie 2. Po usunięciu grup zabezpieczających przy użyciu stężonego amoniaku i 80% kwasu octowego, oraz oczyszczeniu metodą preparatywną z użyciem żelu poliakryloamidowego, otrzymano 2,95 OD (260) 5'-aminołącznik-(dA)17dA*dA*dA, 4,9 OD (260) 5'-aminołącznik-(dA)47dA*dA*dA i 5 OD (260) 5'-aminołącznik-(dA)77dA*dA*dA. 5'-Aminołącznikoligonukleotydy rozpuszczono, każdorazowo, w 8 μl 0,2 M buforu TBK, 62 μl DMF i poddano reakcji z 1,6 μmola izotiocyjanianu FDA. Po upływie 3 godzin zachodzenia reakcji dodano jeszcze dalszą ilość izotiocyjanianu FDA i reakcję prowadzono w ciągu następnych 2 godzin. Potem, dodano 2 półstężonego kwasu octowego i całość zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Po odsoleniu na kolumnie NAP™ (Pharmacia) przeprowadzono wytrącanie butanolem, w wyniku czego otrzymano 1,5 OD (260) 5'-F3-(dA)17A*dA*Da, 2,2 OD (260) 5'-F3-(dA)47dA*dA*dA i 0,9 OD (260) 5'-F3-(dA)77dA*dA*dA.
P r z y k ł a d 14. Synteza podwójnie znakowanego oligonukleotydu
5'-Cy3-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-C6-F3 (F3 = FDA)
Oligonukleotyd skonstruowano, wychodząc z CPG-nośnika umożliwiającego wprowadzenie C6-aminołącznika na końcu 3' [Petrie i in., Bioconjugate Chem., 3, 85 - 87 (1992)], sposobem opisanym w powyższym przykładzie 1. Utlenień dokonano z udziałem wody jodowej względnie odczynnika Beaucage'a w celu wprowadzenia grupy fosforotianowej (tam, gdzie * w sekwencji). Po odszczepieniu ostatniej dimetoksytritylowej grupy zabezpieczającej poddano koniec 5'oligonukleotydu reakcji z fosforoamidytem Cy3-CE (z firmy Glen Research, Sterlin, VA; nr katalogowy 10-5913-xx) i przeprowadzono utlenianie z zastosowaniem wody jodowej. Po usunięciu grup zabezpieczających przy użyciu stężonego amoniaku (2 godziny w temperaturze 70°C) otrzymano 64 OD (260) produktu surowego. Po oczyszczeniu metodą preparatywną z użyciem żelu poliakryloamidowego otrzymano 3,8 OD 5'-Cy3A*T*GAC*GGAA*T*T*C-C6-aminołącznik-3'. Z produktu tego pobrano 3,5 OD (260) i rozpuszczono w 8 μl 0,2 M buforu TBK, 62 μl DMF, po czym poddano reakcji z 1,6 μmola izotiocyjanianu FDA. Po upływie 3,5 godziny zachodzenia reakcji między aminołącznik-oligonukleotydem
PL 202 881 B1 a hydroksysukcynoimidem dodano 1 μl półstężonego kwasu octowego i całość zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Po odsoleniu na kolumnie NAP™ (Pharmacia) przeprowadzono wytrącanie butanolem, w wyniku czego otrzymano 3,5 OD (260) żądanego, podwójnie znakowanego oligonukleotydu
5'-Cy3-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-C6-F3.
ESI-MS: 4926,2 (masa cząsteczkowa obliczona: 4927,1).
P r z y k ł a d 15. Synteza 5'-F3-A*T*GAC*GGAA*T*T*C (F3 = FDA)
Wytworzono oligomer 5'-aminołącznik-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-3' sposobem opisanym w powyższym przykładzie 9.
OD (260) 5'-aminołącznik-oligonukleotydu rozpuszczono w 16 μl 0,2 M buforu TBK, 95 μl DMF i poddano reakcji z 25 μl izotiocyjanianu FDA (5 mg w 100 μl DMF). Po upływie 3 godzin zachodzenia reakcji między aminołącznik-oligonukleotydem a izotiocyjanianem dodano jeszcze 5 izotiocyjanianu i reakcję prowadzono w ciągu dalszych 2 godzin. Następnie dodano 2 μl półstężonego kwasu octowego i całość zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Po odsoleniu na kolumnie NAP™ (Pharmacia) i po wytrąceniu butanolem, otrzymano 8,5 OD (260) żądanego koniugatu oligonukleotydu z dioctanem fluoresceiny.
ESI-MS: 4418,4 (masa cząsteczkowa obliczona: 4418,5).
P r z y k ł a d 16. Porównanie pobrania przez komórki koniugatów oligonukleotydów o rozmaitej długości 5'-F3-(dA)ndA*Da*Da (n= 17, 47 i 77; F3 = FDA)
Oznaczenie pobrania przez komórki koniugatów o rozmaitej długości i różnej masie cząsteczkowej z przykładu 12 przeprowadzono w zasadzie tak, jak to opisano w powyższym przykładzie 7 w przypadku komórek REH. Kwantyfikacji dokonano przy użyciu cytometru przepływowego. Po upływie 60 minut względne sygnały fluorescencji wynosiły: dla 5'-F3-(dA)17dA*dA*dA (A20), 49, dla 5'-F3--(dA)47dA*dA*dA (A50) 34 i dla 5'-F3-(dA)77A*dA*dA (A80) 91. Nieoczekiwanie okazało się, że koniugat z FDA o najdłuższej części oligonukleotydowej, złożonej łącznie z 80 nukleotydów, był najefektywniej pobierany przez komórki REH.
P r z y k ł a d 17. Porównanie pobierania przez komórki koniugatów oligonukleotydów derywatyzowanych w różny sposób.
Związkiem pokrewnym dioctanowi fluoresceiny (FDA) jest dipiwalan fluoresceiny, odznaczający się podwyższoną trwałością grup estrowych. Odpowiednie koniugaty oligonukleotydów poddano badaniu pod względem rozmiarów ich wchłonięcia przez komórki przy użyciu cytometru przepływowego. Zwiększona trwałość piwalanu wobec alkaliów i esteraz prowadzi do zmniejszenia pobrania odpowiednich koniugatów nukleotydów. Toteż, zmierzona po upływie 60 minut względna fluorescencją dla koniugatu z dioctanem fluoresceiny wynosiła 195, podczas gdy dla odpowiedniego koniugatu z dipiwalanem fluoresceiny tylko 55.
P r z y k ł a d 18. Badanie pobierania przez komórkę dwukrotnie znakowanego koniugatu oligonukleotydu 5'-Cy3-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-C6-FDA z przykładu 13.
FACScan wykazał szybkie pobieranie koniugatu Cy3-oligonukleotyd-F3 przez komórki REH. Traktowanie komórek koniugatem oligonukleotydu/kompleksem z CellFectin dało w wyniku podobny obraz pobierania, jednakże zachodzącego w sposób wyraźnie nierównomierny. Przy tym, efekt uzyskiwany w przypadku koniugatu z FDA wyraźnie przewyższa skutki użycia kompleksu CellFectinoligonukleotyd.
Następnie, należało poddać badaniu współlokalizację na oligonukleotydzie obu różniących się grup znacznikowych w warunkach inkubacji z komórkami, a to w celu wykluczenia możliwości, że zmierzona fluorescencją opiera się tylko na odszczepionym FDA względnie na odszczepionej fluoresceinie. Do koniugatu Cy3-oligonukleotyd-F3 wprowadzono na końcu 5' barwnik cyjaninowy, natomiast FDA na końcu 3' związano kowalencyjnie. Na fig. 9 uwidoczniono zieloną i czerwoną fluorescencję po 4-godzinnej inkubacji komórek REH z koniugatem Cy3-oligonukleotyd-F3. Zaobserwowano współlokalizację w komórkach obu znaczników, toteż przyjęto, że oligonukleotyd pobrany został w postaci nieaktywnej.
Hydrolizie uległy jedynie grupy acetylowe części FDA, przypuszczalnie w wyniku działania esteraz, gdyż nie fluoryzujące ugrupowanie FDA zostało przeprowadzone we fluoryzujące ugrupowanie fluoresceiny. Pobranie koniugatu Cy3/FDA dokonało się bardzo szybko, gdyż już po upływie 7 minut od wprowadzenia można było wykryć oba znaczniki.
Koniugat oligonukleotyd-FDA, KO_1, z przykładu 4 przetestowano w czterech stężeniach pod względem działania antyproliferacyjnego z udziałem komórek nowotworowych A549. Produkt ten haPL 202 881 B1 mował namnażanie bez dodania środka wzmagającego przenikanie. Odpowiedni oligonukleotyd bez koniugatu F3 (ONI) hamował proliferację tylko po utworzeniu kompleksu ze środkiem wzmagającym przenikanie (CellFectin, z firmy Gibco-BRL). Otrzymane wyniki przedstawiono w poniższej tabeli 4.
T a b e l a 1
Badanie metodą mikroskopii fluorescencyjnej pobierania oligonukleotydów znakowanych FDA (koniugatów oligonukleotyd-FDA) u ssaków
Komórki ssaków: oznaczenie linii komórkowej Fluorescencja po 5 min Fluorescencja po 20 min Fluorescencja po 60 min Fluorescencja po 120 min
A B A B A B A B
REH + - + - + + - ++ *
K562 ( + ) + +
Lu 18 ( + ) +
KB3-1 + +
Ptk 2 ( + ) +
A: inkubacja ze znakowanymi FDA oligonukleotydami KO_1 i KO_3 B: inkubacja ze znakowanymi fluoresceiną oligonuklotydami KO_2 i KO_4. (+) pobranie słabe + pobranie średnio mocne ++ pobranie bardzo silne
- brak pobrania * pobranie stwierdzone tylko w komórkach uszkodzonych
T a b e l a 2
Badanie metodą mikroskopii fluorescencyjnej pobierania oligonukleotydów znakowanych FDA przez komórki owadzie (legenda: patrz tabela 1)
Komórki owadzie Fluorescencja po 20 min Fluorescencja po 60 min Fluorescencja po 120 min
A B A B A B
Komórki SF9 + - ++ - ++ -
T a b e l a 3
Badanie metodą mikroskopii fluorescencyjnej pobierania oligonukleotydów znakowanych FDA przez różne organizmy
Organizm Fluorescencja po 20 min Fluorescencja po 60 min Fluorescencja po 120 min
A B A B A B
Bac. subtilis (6633)# - - - - + -
L. bulgaricus# - - + - + -
E. coli (K12)# - - - + -
Yarrowia lipolytica# (forma dzika H 222) - - - - + -
Saccharomyces cerevisiae# - - - - + -
Zarodniki Fusarium culmorum (JP15, grzyb) ( + ) - + - + -
Cysty Reticulomyxa filosa (ameba z wód słodkich) - - ++ szczególnie jądra - + -
Haematococcus pluvialis (niem. Schneealge, wiciowiec) - - + - + -
Chlorogonium sp. (niem. Gmnalge, wiciowiec) - - + - + -
Dunaliella salina (okrzemki morskie) - - + - + -
PL 202 881 B1
A: inkubacja ze znakowanymi FDA oligonukleotydami KO_1 i KO_3
B: inkubacja ze znakowanymi fluoresceiną oligonuklotydami KO_2 i KO_4.
(Legenda odnosząca się do oceny: patrz tabela 1).
# Do pobrania dochodzi tylko u części komórek tych szybko dzielących się organizmów.
T a b e l a 4 Wyniki z przykładu 8
I Substancja Gęstość komórek % zahamowania
Nie użyto żadnej 5,96 -
FDA 6,05 -1,5
100 nM KO_1 5,65 5,2
200 nM KO_1 5,3 11,1
500 nM KO_1 5,03 15,6
1000 nM KO 1 4,16 30,2
T a b e l a 5
Zależność transfekcji koniugatów z FDA od długości (A20, A50, A80O z przykładu 15)
Czas Fluorescencja Fluorescencja Fluorescencja
(min) A20 A50 A80
0 0,0103 0,0103 0,0103
10 11,71 8,9 43,31
20 39,68 28,06 88,36
30 48,59 34,38 91,28
40 54,7 38,75 92,35
50 58,66 41,64 93,19
60 62,13 44,33 93,62
T a b e l a 6
Porównanie pobierania przez komórki koniugatów oligonukleotyd-dioctan fluoresceiny i oligonukletyddipiwalan fluoresceiny (przykład 16, fig. 8)
Czas (min) Fluorescencja K39 Fluorescencja K41
0 2,66 2,75
10 72,37 8,49
20 112,34 18,17
30 142,97 28,67
40 164,64 38,34
50 184,96 46,62
60 195,57 55,26
70
80 218,12 68,02
90
100 231,04 83,7
110
120 253,84 97
PL 202 881 B1
Wykaz sekwencji <110> Aventis Pharma Deutschland GmbH <120> Koniugaty, sposoby ich wytwarzania oraz ich zastosowanie do transportu cząsteczek poprzez błony biologiczne.
<130> 1999/L045
<140>
<141>
<150> 19935302.6
<151> 1999-07-28
<160> 63
PL 202 881 B1 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd modyfikowany <220>
<221> misc_feature <222> (1) . . (16) <400> 1 dgcgacgcca tgacgg Ig <210> 2 <211> 13 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd modyfikowany <220>
<221> misc_feature <222> (1) .. (13) <400> 2 dcgacgccat gac 13 <210> 3
PL 202 881 B1 <211> 13 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd modyfi kowany
<220>
<221> <222> misc_feature (1)..(13)
<400> 3
datgacggaa ttc 13
<210> 4
<211> 12
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> misc feature
<222> (1) .. (12)
<400> 4
dtattccgtc at 12
<210> 5
<211> 2
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
<220>
PL 202 881 B1
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) . . (2)
<400> 5
da 2
<210> 6
<211> 2
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> misc feature
<222> (1) . . (2)
<400> 6
da 2
<210> 7
<211> 2
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> misc feature
<222> (1) . . (2)
PL 202 881 B1 <400> 7 da <210> 8 <211> 12 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd modyfikowany <220>
<221> misc_feature <222> (1) . . (12) <400> 8 ttccatggtg gc <210> 9 <211> 12 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd modyfikowany <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(12) <400> 9 ttcactgtgg gc <210> 10
PL 202 881 B1 <211> 12 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd modyfikowany <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(12) <400> 10 tggcgccggg cc <210> 11 <211> 12 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd modyf i kowany <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(12) <400> 11 tgccggccgg gc
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
PL 202 881 B1
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> misc _feature
<222> (1) .. (21)
<400> 12
gcgtttgctc ttcttcttgc g
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 13
acacccaatt ctgaaaatgg <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <220>
<221> misc feature
PL 202 881 B1 <222> (1) . . (20) <400> 14 aggtccctgt tcgggcgcca 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd.
<220>
<221> misc_feature <222> (1) .. (20) <400> 15 gcggggctcc atgggggtcg 20 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <220>
<221> misc_f eature <222> (1) . . (15) <400> 16 cagctgcaac ccagc 15 <210> 17
PL 202 881 B1
<211> 11
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> misc feature
<222> (1) .. (11)
<400> 17
tattccgtca t
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) .. (22)
<400> 18
ttccgtcatc gctcctcagg gg <210> 19 <211> 15 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
PL 202 881 B1
PL 202 881 B1 aacgttgagg ggcat <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> <222> misc feature (1)..(18)
<400> 22
gtgccggggt cttcgggc 18
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> misc_featurę
<222> (1)..(17)
<400> 23 cgagaacatc atcgtgg <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna
PL 202 881 B1 <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <220> . <221> misc_feature <222> (1)..(21) <400> 24 ggagaacatc atggtcgaaa g <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(22) <400> 25 cccgagaaca tcatggtcga ag <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <220>
<221> misc feature
PL 202 881 B1 <222> (1)..(20) <400> 26 ggggaaagcc cggcaagggg 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(20) <400> 27 cacccgcctt ggcctcccac 20
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (1).. (18)
<400> 28
gggactccgg cgcagcgc 18 <210> 29
PL 202 881 B1 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (1) .. (20) <400> 29 ggcaaacttt cttttcctcc 20 <210 30 <211> 19 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(19) <400> 30 gggaaggagg aggatgagg 19 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
PL 202 881 B1 <220>
<221>
misc feature <222>
(1) . . (21) <400>
ggcagtcatc cagcttcgga g <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (1) . . (18) <400> 32 tctcccagcg tgcgccat 18 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(19) <400> 33
PL 202 881 B1
gcgctgatag acatccatg 19
<210> 34
<211> 12
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> misc feature
<222> (1) .·(12)
<400> 34
ggaggcccga cc 12
<210> 35
<211> 12
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> misc feature
<222> (1)..(12)
<400> 35
ggtttcggag gc 12
<210> 36
<211> 12
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
PL 202 881 B1 <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej:
<220>
<221> misc_feature <222> (1)..(12) oligonukleotyd <400> 36 tggtggaggt ag 12 <210> 37 <211> 12 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> misc feature
<222> (1) . . (12)
<400> 37
gcatggtgga gg 12
<210> 38
<211> 12
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> misc feature
PL 202 881 B1 <222> (1)..(12) <400> 38 ttggcatggt gg <210> 39 <211> 12 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> <222> mi sc_feature (1)..(12)
<400> 39
gcctgggacc ac
<210> 40
<211> 12
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(12) <400> 40 cagcctggga cc <210> 41
PL 202 881 B1 <211> 12 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(12) <400> 41 tgcagcctgg ga
<210> 42
<211> 12
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(12)
<400> 42
gtgcagcctg gg <210> 43 <211> 12 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220> .
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
PL 202 881 B1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) . . (12)
<400> 43
ggtgcagcct gg
<210> 44
<211> 12
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> misc feature
<222> (1) .. (12)
<400> 44
atgggtgcag cc 12
<210> 45
<211> 12
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) .. (12)
<400> 45
PL 202 881 B1
ggcttgaaga tg 12
<210> 46
<211> 12
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) . · (12)
<400> 46
gcagcccccg ca <210> 47 <211> 12 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <220>
<221> misc_f eature <222> (1)..(12)
<400> 47
gcagcagccc cc
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
PL 202 881 B1
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 48
tcccgcctgt gacatgcatt 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (1}..(20) <400> 49 gttctcgctg gtgagtttca <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <220>
<221> misc_feature
PL 202 881 B1 <222> (1)..(18) <400> 50 gcgtgcctcc tcactggc <210> 51 <211> 18 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(18)
<400> 51
gcagtaagca tccatatc 18
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> misc feature
<222> (1)..(20)
<400> 52
gcccaagctg gcatccgtca 20
<210> 53
PL 202 881 B1
<211> 20
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 53
cccccaccac ttcccctctc <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> misc feature
<222> (1) .. (20)
<400> 54
ctcccccacc acttcccctc <210> 55 <211> 19 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
PL 202 881 B1 <223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(19) <400> 55 gctgggagcc atagcgagg
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<400> 56
actgctgcct cttgtctcag g <210> 57 <211> 22 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(22)
PL 202 881 B1 <400> 57
caatcaatga cttcaagagt tc 2Ź
<210> 58
<211> 18
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220
<221> mi sc__f eature
<222> (1).. (18)
<400> 58
gcggcggaaa agccatcg 18
<210> 59
<211> 18
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<400> 59
gtgtcggggt ctccgggc 18
PL 202 881 B1 <210> 60 <211> 15 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <220>
<221> mi sc_f eature <222> (1)..(15) <400> 60 cacgttgagg ggcat
<210> 61
<211> 18
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
<220>
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) .. (18)
<400> 61
gtcttccata gttactca <210> 62 <211> 18 <212> DNA <213> Sekwencja syntetyczna <220>
PL 202 881 B1
<223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd
<220>
<221> misc feature
<222> (1)..(18)
<400> 62
gatcaggcgt gcctcaaa 18
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> Sekwencja syntetyczna
<220> * <223> Opis sekwencji syntetycznej: oligonukleotyd <220>
<221> misc_feature <222> (1) .. (21) <400> 63 gatggagggc ggcatggcgg g 21
PL 202 881 B1

Claims (8)

1. Zastosowanie grupy arylowej o wzorach F1, F3, F4, i F5
PL 202 881 B1 związanej z przewidzianą do transportowania cząsteczką wybraną z polinukleotydu, oligonukleotydu lub z mononukleotydu, do transportowania tej cząsteczki przez biologiczną membranę in vitro.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że grupa/grupy arylowe są związane z 5'-końcem, 3'-końcem, heterocykliczną zasadą, cukrem lub mostkiem międzynukleozydowym ale także przez elementy nienukleotydowe.
3. Sposób transportowania cząsteczki poprzez membranę in vitro, znamienny tym, że wytwarza się koniugat, w którym przewidziana do transportowania cząsteczka związana jest z co najmniej jedną grupą arylową określoną w zastrzeżeniu 1 i ten koniugat inkubuje się z membraną.
4. Sposób transportowania cząsteczki do komórki in vitro, znamienny tym, że wytwarza się koniugat, w którym przewidziana do transportowania cząsteczka związana jest z co najmniej jedną grupą arylową określoną w zastrzeżeniu 1 i ten koniugat inkubuje się z komórką, po czym koniugat zostaje przetransportowany do komórki bez odszczepienia grupy arylowej.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że komórka jest komórką eukariotyczną lub komórką prokariotyczną.
6. Sposób według zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, że komórka jest komórką bakterii, komórką drożdżową lub komórką ssaka.
7. Sposób według jednego lub więcej zastrz. 4 do 6, znamienny tym, że komórka jest komórką ludzką.
8. Sposób według jednego lub więcej zastrz. 4 do 7, znamienny tym, że komórka jest komórką nowotworową.
PL353069A 1999-07-28 2000-07-20 Zastosowanie grupy arylowej, sposób transportowania cząsteczki poprzez membranę in vitro oraz sposób transportowania cząsteczki do komórki in vitro PL202881B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19935302A DE19935302A1 (de) 1999-07-28 1999-07-28 Konjugate und Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung zum Transport von Molekülen über biologische Membranen
PCT/EP2000/006936 WO2001008707A2 (de) 1999-07-28 2000-07-20 Konjugate und verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zum transport von molekülen über biologische membranen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL353069A1 PL353069A1 (pl) 2003-10-06
PL202881B1 true PL202881B1 (pl) 2009-07-31

Family

ID=7916258

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL353069A PL202881B1 (pl) 1999-07-28 2000-07-20 Zastosowanie grupy arylowej, sposób transportowania cząsteczki poprzez membranę in vitro oraz sposób transportowania cząsteczki do komórki in vitro

Country Status (33)

Country Link
US (1) US8420396B2 (pl)
EP (1) EP1204430B1 (pl)
JP (1) JP4791665B2 (pl)
KR (1) KR100721696B1 (pl)
CN (1) CN1227035C (pl)
AR (1) AR029385A1 (pl)
AT (1) ATE447413T1 (pl)
AU (1) AU776114B2 (pl)
BR (1) BR0012757A (pl)
CA (1) CA2377977C (pl)
CY (1) CY1109744T1 (pl)
CZ (1) CZ2002300A3 (pl)
DE (2) DE19935302A1 (pl)
DK (1) DK1204430T3 (pl)
EE (1) EE05303B1 (pl)
ES (1) ES2335741T3 (pl)
HK (1) HK1047042A1 (pl)
HR (1) HRP20020074B1 (pl)
HU (1) HUP0201995A3 (pl)
IL (2) IL147527A0 (pl)
ME (1) MEP56408A (pl)
MX (1) MXPA01013114A (pl)
NO (1) NO334155B1 (pl)
NZ (1) NZ516838A (pl)
PL (1) PL202881B1 (pl)
PT (1) PT1204430E (pl)
RS (2) RS20100249A (pl)
RU (1) RU2275936C2 (pl)
SI (1) SI1204430T1 (pl)
SK (1) SK287654B6 (pl)
TR (4) TR200200222T2 (pl)
WO (1) WO2001008707A2 (pl)
ZA (1) ZA200200657B (pl)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030129251A1 (en) * 2000-03-10 2003-07-10 Gary Van Nest Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof
US7026166B2 (en) * 2002-01-22 2006-04-11 Chiron Corporation Fluorogenic dyes
US7704756B2 (en) 2003-01-21 2010-04-27 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Fluorogenic dyes
EP1668144B1 (en) * 2003-09-11 2011-08-17 Universitätsklinikum Schleswig-Holstein Campus Lübeck Nucleotide sequences promoting the trans-membrane transport of nucleic acids
US7615539B2 (en) * 2003-09-25 2009-11-10 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid-lipophilic conjugates
EP1645288A1 (en) * 2004-10-07 2006-04-12 CTG Pharma S.r.l. New nuclear transcription factors regulators
KR100690199B1 (ko) * 2006-04-20 2007-03-12 이화여자대학교 산학협력단 구리 이온 선택성을 갖는 플루오레세인 유도체, 이의제조방법 및 이를 이용한 생체 내 구리 이온 검출방법
KR20100068422A (ko) * 2007-10-09 2010-06-23 콜리 파마슈티칼 게엠베하 변경된 당 잔기를 함유하는 면역자극성 올리고뉴클레오티드 유사체
EP3147367A1 (en) * 2010-12-29 2017-03-29 F. Hoffmann-La Roche AG Small molecule conjugates for intracellular delivery of nucleic acids
CN106459975B (zh) * 2014-05-23 2020-03-27 建新公司 肽载体上的多个寡核苷酸部分
US20180036312A1 (en) * 2016-08-02 2018-02-08 ISI Life Sciences Inc. Novel Scaffolds for Intracellular Compound Delivery for the Detection of Cancer Cells
WO2018026965A1 (en) 2016-08-02 2018-02-08 Isi Life Sciences, Inc. Compositions and methods for detecting cancer cells in a tissue sample
US10753942B2 (en) 2017-05-15 2020-08-25 Indicator Systems International, Inc. Methods to detect remnant cancer cells
US10539567B2 (en) * 2017-05-15 2020-01-21 Indicator Systems International, Inc. Biopsy methods and devices
KR20230096856A (ko) 2021-12-22 2023-06-30 한국과학기술연구원 신규 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체 및 이의 용도

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE8801070D0 (sv) * 1988-03-23 1988-03-23 Pharmacia Ab Method for immobilizing a dna sequence on a solid support
WO1995006659A1 (en) * 1992-07-01 1995-03-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US6228982B1 (en) * 1992-05-22 2001-05-08 Benget Norden Double-stranded peptide nucleic acids
US6335434B1 (en) * 1998-06-16 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc., Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates
NZ245720A (en) 1992-01-22 1995-12-21 Hoechst Ag Oligonucleotide analogues; use as gene expression inhibitor or dna probe
US6033909A (en) * 1992-01-22 2000-03-07 Hoechst Aktiengesellschaft Oligonucleotide analogs, their preparation and use
US5633360A (en) * 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5820873A (en) * 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
DE19502912A1 (de) * 1995-01-31 1996-08-01 Hoechst Ag G-Cap Stabilisierte Oligonucleotide
US5698411A (en) * 1995-05-18 1997-12-16 Coulter Corporation Method for determining activity of enzymes in metabolically active whole cells
AU7737196A (en) * 1996-11-14 1998-06-03 Brigham And Women's Hospital Polyphosphoinositide binding peptides for intracellular drug delivery
GB9809084D0 (en) 1998-04-28 1998-06-24 Nycomed Imaging As Improvements in or relating to diagnostic/therapeutic agents
DE19824535A1 (de) * 1998-06-03 1999-12-09 Roche Diagnostics Gmbh Neue Rhodamin-Derivate und deren Verwendung
US6335432B1 (en) 1998-08-07 2002-01-01 Bio-Red Laboratories, Inc. Structural analogs of amine bases and nucleosides
US6080580A (en) * 1998-10-05 2000-06-27 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense oligonucleotide modulation of tumor necrosis factor-α (TNF-α) expression
US7005123B1 (en) 1999-06-17 2006-02-28 Universiteit Gent Functional poly-α-amino-acid derivatives useful for the modification of biologically active materials and their application

Also Published As

Publication number Publication date
TR200706709T2 (tr) 2008-02-21
WO2001008707A3 (de) 2001-11-08
CZ2002300A3 (cs) 2002-05-15
WO2001008707A2 (de) 2001-02-08
MXPA01013114A (es) 2002-06-04
TR201109491T2 (tr) 2012-02-21
NO334155B1 (no) 2013-12-23
HRP20020074A2 (en) 2005-10-31
TR200200222T2 (tr) 2002-07-22
DE50015781D1 (de) 2009-12-17
HK1047042A1 (en) 2003-02-07
CN1360507A (zh) 2002-07-24
PL353069A1 (pl) 2003-10-06
CN1227035C (zh) 2005-11-16
RS20100249A (en) 2011-02-28
KR20020031392A (ko) 2002-05-01
HUP0201995A3 (en) 2005-02-28
HUP0201995A2 (en) 2002-10-28
EE05303B1 (et) 2010-06-15
NZ516838A (en) 2004-07-30
PT1204430E (pt) 2010-01-26
KR100721696B1 (ko) 2007-05-28
EP1204430B1 (de) 2009-11-04
SI1204430T1 (sl) 2010-03-31
MEP56408A (en) 2011-05-10
ES2335741T3 (es) 2010-04-05
JP4791665B2 (ja) 2011-10-12
NO20020367L (no) 2002-03-26
RS51447B (sr) 2011-04-30
AU6825200A (en) 2001-02-19
RU2275936C2 (ru) 2006-05-10
JP2003505517A (ja) 2003-02-12
AU776114B2 (en) 2004-08-26
US20080071069A1 (en) 2008-03-20
IL147527A0 (en) 2002-08-14
HRP20020074B1 (en) 2011-01-31
AR029385A1 (es) 2003-06-25
SK1172002A3 (en) 2002-08-06
EE200200035A (et) 2003-04-15
SK287654B6 (sk) 2011-05-06
IL147527A (en) 2006-08-01
NO20020367D0 (no) 2002-01-23
DK1204430T3 (da) 2010-03-29
US8420396B2 (en) 2013-04-16
CY1109744T1 (el) 2014-09-10
BR0012757A (pt) 2002-04-02
EP1204430A2 (de) 2002-05-15
CA2377977C (en) 2011-09-20
TR201109493T2 (tr) 2012-03-21
ZA200200657B (en) 2003-09-23
DE19935302A1 (de) 2001-02-08
ATE447413T1 (de) 2009-11-15
CA2377977A1 (en) 2001-02-08
YU90301A (sh) 2004-05-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8420396B2 (en) Conjugates and processes for their preparation and their use for transporting molecules across biological membranes
US7550582B2 (en) Polyamide nucleic acid derivatives and agents, and processes for preparing them
JP5149475B2 (ja) 負電荷を有するペプチド核酸誘導体、薬剤ならびにその製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20140720