KR20230096856A - 신규 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체 및 이의 용도 - Google Patents

신규 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체 및 이의 용도 Download PDF

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양유수
김선화
권익찬
김은혜
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한국과학기술연구원
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Abstract

본원발명은 TAM과 암세포에서 다양한 암 관련RNA의 활성을 억제하거나, 발현을 증진을수 있는 제제에 관한 것으로, PD-L1 수용체가 과발현된 종양 세포와 대식세포 모두에 결합할 수 있는 이중 표적 약물 전달 시스템에 관한 것이다.

Description

신규 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체 및 이의 용도{Novel peptide-oligonucelotide conjugate and use thereof}
본 명세서는 PD-L1 수용체를 과발현하는 암세포와 대식세포를 모두 공략할 수 있는 신규한 펩타이드-올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트 및 이의 용도에 관한 것이다.
MicroRNA(miRNA)는 다양한 세포에서 여러 유전자의 발현을 제어하고 많은 생리학적 세포 과정 및 병리를 조절하는 20-25개의 뉴클레오티드로 구성된 작은 내인성 비암호화 RNA이다. 또한, 종양 미세 환경(tumor microenvironment, TME) 내에서 miRNA 발현의 광범위한 조절 장애는 종양 퇴행과 강하게 연관되어 있으므로 TME 내의 특정 miRNA는 잠재적인 암 바이오마커 또는 치료 표적으로 사용될 수 있다.
miRNA-21(miR-21)은 최초로 확인된 발암성 miRNA 중 하나로 흑색종을 비롯한 다양한 유형의 종양에서 일반적으로 상향 조절되며, 일반적으로 생존에 대한 나쁜 예후를 나타낸다. 예를 들어, miR-21이 결핍된 마우스는 야생형 마우스보다 더 작은 B16 종양을 발생시키는 것으로 보고되었다. miR-21은 증식, 세포자멸사, 세포 침입, 이동 및 화학 저항성을 포함하여 종양 발병에 관련된 다양한 다운스트림 이펙터를 조절함으로써 종양 형성에 관여한다. 암 세포 외에도 miR-21은 TME 침윤 비악성 세포(TME-infiltrating non-malignant cells)에서 가장 풍부하게 발현되는 miRNA이며 종양 형성 동안 세포 기능을 조절한다. 특히, TAM(tumor-associated macrophage)에서 miR-21의 발현은 pro-tumorigenic M2-like phenotype에 대한 macrophage polarization을 조절하는 데 중추적인 역할을 한다. M2 극성 TAM은 종양 전이를 강화하고 혈관 신생을 촉진하며 적응 면역 반응을 방해하여 종양 성장을 촉진한다. 특히, TAM에서 miR-21의 발현은 종양 성장 촉진에 책임이 있는 것으로 보고되었다.
miR-155는 대표적인 종양 촉진 miRNA로서 유방암을 포함한 여러 혈액암 및 고형암, 두경부암, 림프종, 여러 고형 종양에서 과발현 되어 있는 oncogenic miRNA 특징을 가지고 있는 것으로 보고되었다.
miR-19a/b는 발암성 특성을 갖는 것으로 간주된 최초의 miRNA으로서, oncogenic miRNA 17-92 cluster 중 가장 중요한 miRNA이다. 특히나, 급성골수성 백혈병, 결장직장암 및 위암을 비롯한 여러 종류의 암에서 과발현 되어있다고 보고되었으며, 이는 종양 성장 및 전이를 촉진하는 역할을 한다.
miR-17-92는 강력한 종양 유발 miRNA이자 가장 잘 연구가 되어있는 miRNA 로서, 특히나, cell cycle, proliferation, apoptosis와 같은 다양한 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고 되었다.
miR-128의 비정상적인 발현은 많은 종류의 malignant tumors에서 관찰되어 보고 되었다.
miR-125b는 non-small-cell lung cancer (NSCLC), acute myeloid leukemia (AML), gastric cancer 을 포함한 다양한 암종에서 과발현 되어 있다. 특히나, 이러한 miR-125b의 기능은 oncogenic한 역할 뿐만 아니라 각기 다른 암종에서 종양미세환경에 따라 항종양성 역할도 수행할 수 있다고 연구가 보고 되었다.
miR-504는 tumor suppressor gene으로 연구되어 있는 mRNA인 FOXP1, NRF1, CDK6, P53에 직접 상호 작용하여 조절함으로써, 이 유전자들이 관여하는 cell-cycle arrest, apoptosis 및 종양 형성을 촉진시키는 oncogenic miRNA로 보고 되었다.
miR-25는 gastric cancer, prostate cancer, liver cancer, colon cancer을 포함한 다양한 암종에서 과발현 되어있고 보고 되었다.
miR-30d는 종양 발달 및 진행을 담당하는 miR-30의 family로, 이것에 비정상적인 발현은 다양한 암의 발병 및 진행에서 tumor suppressor gene 또는 oncogene 과 관련이 있다고 보고 되었다.
종양 세포만을 죽이는 것보다 종양 세포와 TAM을 모두 표적으로 하는 것은 항종양 치료의 효능을 향상시키는 유망한 전략으로 입증되었다. 그러나, 아직까지 상기 종양 세포와 TAM을 모두 표적으로 하는 항종양 치료제에 대한 연구는 미흡한 실정이다.
한편, Anti-miRNA 올리고뉴클레오티드(anti-miRNA)는 비정상적인 miRNA 발현의 효과적이고 비가역적인 억제를 위한 잠재적인 암 치료제이다. 그러나 anti-miRNA는 reticuloendothelial system에 의해 쉽게 제거되고 혈청에서 분해되기 쉽다. 가장 중요한 문제는 전하 반발이 anti-miRNA와 세포막 사이의 상호작용을 방해하여 세포 흡수가 불량하다는 것이다. 따라서 anti-miRNA 기반 치료법은 적절한 전달 시스템에 의해 지원되어야 한다.
한국등록특허 제10-0721696호
이에 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 연구를 한 결과, anti-miRNA가 PD-L1 결합 펩타이드에 직접 결합된 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 설계하였고 이를 제공하고자 한다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해 질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기와 같은 과제의 해결 수단을 제공한다.
본 발명의 일측면은, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체(peptide-oligonucleotide conjugate)에 있어서, 상기 펩타이드는 PD-L1 결합 펩타이드이며, 상기 올리고뉴클레오티드는 항암 효과가 있는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 변형된 올리고뉴클레오티드인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 PD-L1 결합 펩타이드는 서열번호 1의 서열을 가지는, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 PD-L1 결합 펩타이드는 아자이드기로 기능화된 PD-L1 결합 펩타이드인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 siRNA(small interfering RNA), shRNA(small hairpin RNA), miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산 압타머인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 항-miRNA 21, 항-miRNA 155, 항-miRNA 19, 항-miRNA 17-92, 항-miRNA 128, 항-miRNA 125b, 항-miRNA 504, 항-miRNA 25 및 항-miRNA 30d 중 어느 하나 이상을 포함하는 miRNA 억제제인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
일구현예에 있어서, 상기 miRNA 억제제는 항-miRNA 21, 항-miRNA 155, 항-miRNA 19, 항-miRNA 17-92 및 항-miRNA 128 중 어느 하나 이상인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 miRNA 34a, miRNA 194, miRNA 192, miRNA 29, miRNA 215, miRNA 200, miRNA 605, miRNA 122 및 miRNA 143/145중 어느 하나 이상을 포함하는 miRNA 전달제인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
일구현예에 있어서, 상기 miRNA 전달제는 miRNA 34a, miRNA 194, miRNA 192 및 miRNA 29중 어느 하나 이상인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드 변형된 뉴클레오사이드간(internucleoside) 링키지, 변형된 당 및 변형된 핵염기 중 어느 하나 이상을 포함하는, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
일구현예에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오사이드간 링키지는 포스포로티오에이트(Phosphorothioate, PS) 뉴클레오사이드간 링키지, 포스포디에스테르(Phosphodiester) 뉴클레오사이드간 링키지, 포스포트리에스테르(Phosphotriester) 뉴클레오사이드간 링키지, 모르폴리노(Morpholino) 뉴클레오사이드간 링키지, 프로테인 핵산(Protein nucleic acid, PNA) 뉴클레오사이드간 링키지 중 어느 하나 이상이며, 상기 변형된 당은 2'-O-메톡시에틸, 2'-O-하이드록시메틸, 2'-하이드록실, 2'-플루오르 및 2',4'-LNA 중 어느 하나 이상인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
일구현예에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오사이드간 링키지는 포스포로티오에이트(Phosphorothioate, PS) 뉴클레오사이드간 링키지이며, 상기 변형된 당은 2',4'-LNA 인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 항-miRNA-21인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 항-miRNA-21는 서열번호 2의 서열을 가지는, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 변형된 항-miRNA-21이며, 상기 변형된 항-miRNA-21는 포스포로티오에이트(Phosphorothioate, PS) 뉴클레오사이드간 링키지를 올리고뉴클레오타이드 서열 전체에 대하여 1 내지 10의 링키지 수를 포함하며, 2',4'-LNA의 변형된 당을 올리고뉴클레오타이드 서열 전체에 대하여 1 내지 10의 변형된 당을 포함하는, 올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
일 구현예에 있어서, 상기 변형된 항-miRNA-21는 하기 서열 구조식으로 나타내며, 하기 서열 구조식에서 (PS)는 포스포로티오에이트(Phosphorothioate, PS) 뉴클레오사이드간 링키지이며, 아래첨자 L은 2',4'-LNA의 당 변형인, 올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
5'-T(PS)CL(PS)A(PS)ACLATCLAGTLCTGLATALAG(PS)CL(PS)T(PS)A-3'
일 구현예에 있어서, 상기 서열 구조식은 서열번호 3의 서열에 의해 표현되는, 올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 디아릴사이클로옥틴(diarylcyclooctyne, DBCO)으로 기능화된 올리고뉴클레오티드인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 접합체는 아자이드기로 기능화된 PD-L1 결합 펩타이드와 디아릴사이클로옥틴(diarylcyclooctyne, DBCO)으로 기능화된 올리고뉴클레오티드가 클릭 반응(click reaction)으로 결합된 접합체인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 접합체는 하기 화학식 1의 화학구조를 가지는, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 화학식 1에서
R1 내지 R3는 각각 독립적으로 수소; C1-C13 알킬기; C1-C6 알콕시기; C6-C10 아릴기; C3-C10 사이클릴기; C3-C10 헤테로아릴기; C3-C10 헤테로사이클릴기; -C(O)-(C1-C13 알킬); -C(O)-(C6-C10 아릴기); 또는 -C(O)-(C3-C10 헤테로아릴기); 이며
m, n, p, q 또는 r은 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이며,
W1 내지 W3는 각각 독립적으로 -NR3-; -NR3CH2-; -NR3-C(O)-; -NR3-C(O)-NR4-; -NR3-C(S)-NR4-; -C(O)-; -C(O)CH2-; -C(O)O-; -C(O)NR3-; -(CH2)-; -(CR3R4)-; -(CH2)(CR3R4)-; -S(O)2-; -NR3S(O)2-; 또는 -S(O)2NR3- ; 이며,
상기 C1-C13 알킬기, C3-C10 사이클릴기, C1-C6 알콕시기, 는, 수소; 히드록시기; 할로겐기; C1-C13 알킬기; C1-C6 알콕시기; 아미노기(-NR3R4); 니트로기(-N(O)2); 아마이드기(-(C=O)NR3R4); 카르복실산기(-C(O)OH); 니트릴기(-CN); 유레아기(-NR3(C=O)NR4-); 술폰아미드기(-NHS(O)2-); 설피드기(-S-); 술폰기(-S(O)2-); 포스피릴기(-P(O)R3R4); C6-C10 아릴기; C3-C10 헤테로아릴기; 및 C3-C10 헤테로사이클릴기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 치환기를 포함하며,
상기 C6-C10 아릴기, C3-C10 헤테로아릴기 또는 C3-C10 헤테로사이클릴기는, 수소; 히드록시기; 할로겐기; 카보닐기(-(C=O)R3R4); 할로겐 또는 C3-C10 헤테로사이클릴기로 치환 또는 비치환된 C1-C3 알킬기; 할로겐 또는 C3-C10 헤테로사이클릴기로 치환 또는 비치환된 C1-C3 알콕시기; C6-C10 페녹시; 아미노기(-NR3R4); 니트로기(-N(O)2); 아마이드기(-(C=O)NR3R4); 카르복실산기(-C(O)OH); 니트릴기(-CN); 유레아기(-NR3(C=O)NR4-); 술폰아미드기(-NHS(O)2-); 설피드기(-S-); 술폰기(-S(O)2-); 포스피릴기(-P(O)R3R4); C6-C10 아릴기; C3-C10 헤테로아릴기 및 C3-C10 헤테로사이클릴기로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 치환기를 포함하고,
상기 R3 및 R4은 각각 독립적으로 수소; C1-C6 알킬기; C1-C6 알케닐기; C1-C6 알키닐기; C6-C10 아릴기; C3-C10 헤테로아릴기; C3-C10 헤테로사이클릴기; 또는 R3는 R4과 연결된 질소 또는 탄소 원자와 함께 N, O, S, NH, C=N, C=O, -NHC(O)-, -NHC(O)NH-, -NHS(O)2-, 또는 SO2 중 적어도 1종을 임의로 포함할 수 있고, 수소, C1-C13 알킬기, C6-C10 아릴기, C3-C10 헤테로아릴기, 히드록실기, 할라이드기 및 시아노기 중 적어도 1종으로 임의로 치환될 수 있는 3 내지 7원(membered) 포화 고리를 형성하고, 상기 C3-C10 헤테로아릴기 및 C3-C10 헤테로사이클릴기는 N, O, 및 S로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 헤테로원자를 포함한다.
일 구현예에 있어서,
R1 또는 R2는 각각 독립적으로 수소; 또는 C1-C13 알킬기;이며, m 또는 p은 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이며,
R3는 수소; 또는 C1-C3 알킬기;이며,
W1 은 -(CH2)-; -(CR3R4)-; 또는 -(CH2)(CR3R4)-; 이며, r은 0, 1 또는 2 이며,
W2 은 -(CH2)-; 또는 -(CR3R4)-; 이며, n은 1 또는 2 이며,
W3은 -(CH2)-; 또는 -(CR3R4)-; 이며, q은 0, 1 또는 2 인,
펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 화학식 1에서 Peptide는 PD-L1 결합 펩타이드이며, PD-L1 결합 펩타이드는 서열번호 1의 서열을 가지며, 상기 화학식 1에서 Oligonucleotide는 항-miRNA-21 또는 변형된 항-miRNA-21이며, 상기 항-miRNA-21는 서열번호 2의 서열을 가지고, 상기 변형된 항-miRNA-21는 서열번호 3의 서열을 가지는, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 목록 4로 표시되는 항-miRNA 155, 서열 목록 5로 표시되는 항-miRNA 19a, 서열 목록 6로 표시되는 항-miRNA 19b, 서열 목록 7로 표시되는 항-miRNA 17, 서열 목록 8로 표시되는 항-miRNA 125b, 서열 목록 9로 표시되는 항-miRNA 504, 서열 목록 10로 표시되는 항-miRNA 25, 및 서열 목록 11로 표시되는 항-miRNA 30d 중 어느 하나인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체는 세포에서 miR-21, miRNA 155, miRNA 19, miRNA 17-92, miRNA 128, miRNA 125b, miRNA 504, miRNA 25 및 miRNA 30d 중 어느 하나 이상의 발현을 억제하는, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체는 세포에서 miRNA 34a, miRNA 194, miRNA 192, miRNA 29, miRNA 215, miRNA 200, miRNA 605, miRNA 122 및 miRNA 143/145 중 어느 하나 이상의 발현을 향상시키는, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 포함하는 암 예방, 경감 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 암은 흑색종, 유방암, 폐암, 대장암, 난소암, 두경부암, 신경아세포종인, 암 예방, 경감 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체의 제조 방법에 있어서, 상기 방법은 (a) PD-L1 결합 펩타이드를 아자이드기로 기능화시키는 단계; (b) 올리고뉴클레오티드를 디아릴사이클로옥틴(diarylcyclooctyne, DBCO)으로 기능화시키는 단계; 및 (c) 디아릴사이클로옥틴(diarylcyclooctyne, DBCO)으로 기능화된 올리고뉴클레오티드와 아자이드기로 기능화된 PD-L1 결합 펩타이드를 클릭 반응(click reaction)으로 반응시켜 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제조하는 단계;를 포함하는, 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 아자이드기로 기능화된 PD-L1 결합 펩타이드는 하기 화학식 2의 화합물이며, 상기 디아릴사이클로옥틴(diarylcyclooctyne, DBCO)으로 기능화된 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식 3의 화합물인, 방법을 제공한다:
[화학식 2]
Figure pat00002
[화학식 3]
Figure pat00003
상기 화학식 2 또는 3에서
R1 내지 R3는 각각 독립적으로 수소; C1-C13 알킬기; C1-C6 알콕시기; C6-C10 아릴기; C3-C10 사이클릴기; C3-C10 헤테로아릴기; C3-C10 헤테로사이클릴기; -C(O)-(C1-C13 알킬); -C(O)-(C6-C10 아릴기); 또는 -C(O)-(C3-C10 헤테로아릴기); 이며
m, n, p, q 또는 r은 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이며,
W1 내지 W3는 각각 독립적으로 -NR3-; -NR3CH2-; -NR3-C(O)-; -NR3-C(O)-NR4-; -NR3-C(S)-NR4-; -C(O)-; -C(O)CH2-; -C(O)O-; -C(O)NR3-; -(CH2)-; -(CR3R4)-; -(CH2)(CR3R4)-; -S(O)2-; -NR3S(O)2-; 또는 -S(O)2NR3- ; 이며,
상기 C1-C13 알킬기, C3-C10 사이클릴기, C1-C6 알콕시기, 는, 수소; 히드록시기; 할로겐기; C1-C13 알킬기; C1-C6 알콕시기; 아미노기(-NR3R4); 니트로기(-N(O)2); 아마이드기(-(C=O)NR3R4); 카르복실산기(-C(O)OH); 니트릴기(-CN); 유레아기(-NR3(C=O)NR4-); 술폰아미드기(-NHS(O)2-); 설피드기(-S-); 술폰기(-S(O)2-); 포스피릴기(-P(O)R3R4); C6-C10 아릴기; C3-C10 헤테로아릴기; 및 C3-C10 헤테로사이클릴기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 치환기를 포함하며,
상기 C6-C10 아릴기, C3-C10 헤테로아릴기 또는 C3-C10 헤테로사이클릴기는, 수소; 히드록시기; 할로겐기; 카보닐기(-(C=O)R3R4); 할로겐 또는 C3-C10 헤테로사이클릴기로 치환 또는 비치환된 C1-C3 알킬기; 할로겐 또는 C3-C10 헤테로사이클릴기로 치환 또는 비치환된 C1-C3 알콕시기; C6-C10 페녹시; 아미노기(-NR3R4); 니트로기(-N(O)2); 아마이드기(-(C=O)NR3R4); 카르복실산기(-C(O)OH); 니트릴기(-CN); 유레아기(-NR3(C=O)NR4-); 술폰아미드기(-NHS(O)2-); 설피드기(-S-); 술폰기(-S(O)2-); 포스피릴기(-P(O)R3R4); C6-C10 아릴기; C3-C10 헤테로아릴기 및 C3-C10 헤테로사이클릴기로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 치환기를 포함하고,
상기 R3 및 R4은 각각 독립적으로 수소; C1-C6 알킬기; C1-C6 알케닐기; C1-C6 알키닐기; C6-C10 아릴기; C3-C10 헤테로아릴기; C3-C10 헤테로사이클릴기; 또는 R3는 R4과 연결된 질소 또는 탄소 원자와 함께 N, O, S, NH, C=N, C=O, -NHC(O)-, -NHC(O)NH-, -NHS(O)2-, 또는 SO2 중 적어도 1종을 임의로 포함할 수 있고, 수소, C1-C13 알킬기, C6-C10 아릴기, C3-C10 헤테로아릴기, 히드록실기, 할라이드기 및 시아노기 중 적어도 1종으로 임의로 치환될 수 있는 3 내지 7원(membered) 포화 고리를 형성하고, 상기 C3-C10 헤테로아릴기 및 C3-C10 헤테로사이클릴기는 N, O, 및 S로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 헤테로원자를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 R1 또는 R2는 각각 독립적으로 수소; 또는 C1-C13 알킬기;이며, m 또는 p은 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이며, R3는 수소; 또는 C1-C3 알킬기;이며, W1 은 -(CH2)-; -(CR3R4)-; 또는 -(CH2)(CR3R4)-; 이며, r은 0, 1 또는 2 이며, W2 은 -(CH2)-; 또는 -(CR3R4)-; 이며, n은 1 또는 2 이며, W3은 -(CH2)-; 또는 -(CR3R4)-; 이며, q은 0, 1 또는 2 인, 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 (c) 단계는 pH 6.5 내지 8.0 의 완충액에서 30 ℃ 내지 45 ℃의 온도조건에서 700 rpm 내지 1500 rpm 으로 클릭 반응을 진행하는 것인, 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 (c) 단계는 디아릴사이클로옥틴(diarylcyclooctyne, DBCO)으로 기능화된 올리고뉴클레오티드와 아자이드기로 기능화된 PD-L1 결합 펩타이드가 1 : 1.5 내지 2.5의 몰비로 합성되는, 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 (c) 단계는 1 내지 3시간 동안 반응하는 것인, 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 PD-L1 결합 펩타이드는 서열번호 1의 서열을 가지는, 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 항-miRNA-21는 서열번호 2 또는 3의 서열을 가지는, 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 따른 펩타이드-올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트는 PD-L1 수용체를 과발현하는 암세포와 대식세포를 모두 공략한다.
본 발명의 일측면에 따른 펩타이드-올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트는 miRNA-21(miR-21), miRNA 155, miRNA 19, miRNA 17-92, miRNA 128, miRNA 125b, miRNA 504, miRNA 25 및 miRNA 30d 이 발현되는 암세포와 대식세포 모두에 대하여 결합하여 상기 핵산들의 발현을 조절한다.
본 발명의 일측면에 따른 펩타이드-올리고뉴클레오티드 콘쥬게이트는 흑색종, 유방암, 폐암, 대장암, 난소암, 두경부암, 신경아세포종을 포함한 다양한 암에 효과적인 치료법을 제공한다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 한정되지 않는다. 본 발명의 효과는 이하의 설명에서 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.
도 1은 본 발명 실시예 1의 합성개요이다.
도 2는 실시예 2의 몰 비율 비교의 실험결과이다.
도 3은 실시예 2의 접합시간 비교의 실험결과이다.
도 4는 실시예 3의 miRNA-21과 Pep-21의 결합 친화력 확인-1 결과이다.
도 5는 실시예 3의 miRNA-21과 Pep-21의 결합 친화력 확인-2 결과이다.
도 6은 실시예 4의 실험결과이다.
도 7은 실시예 5의 실험결과이다.
도 8은 실시예 6-1의 실험결과이다.
도 9a 및 도 9b는 실시예 6-2의 실험결과이다.
도 10은 실시예 7의 실험결과이다.
도 11a는 실시예 8 동물실험의 개요이며, 도 11b 및 도 11c는 실시예 8의 실험결과이다.
도 12a 및 도 12b는 실시예 9에서 TUNEL assay 실험결과이다.
도 12c 및 도 12d는 실시예 9에서 면역형광법 실험결과이다.
도 13은 실시예 10의 실험결과이다.
도 14a는 실시예 11에서 RT-PCR 결과이며, 도 14b는 실시예 11에서 독성실험결과이며, 도 14c는 실시예 11에서 western blot 결과이다.
도 15는 실시예 12의 실험결과이다.
도 16a 및 도 16b는 실시예 13의 실험결과이다.
도 17는 본원발명 일측면에 따른 약물전달시스템의 개념도이다.
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 성분, 반응 조건, 성분의 함량을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은, 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로, 모든 경우 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 기재에서 수치범위가 개시되는 경우, 이러한 범위는 연속적이며, 달리 지적되지 않는 한 이러한 범 위의 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지의 모든 값을 포함한다. 더 나아가, 이러한 범위가 정수를 지칭하는 경우, 달리 지적되지 않는 한 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지를 포함하는 모든 정수가 포함된다.
본 명세서에 있어서, 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
발암성 miRNA-21(miR-21)의 상향 조절(upregulation)은 암세포의 증식, 이동 및 침입에 중추적인 역할을 합니다. 암세포 외에도 종양 관련 대식세포(tumor-associated macrophages, TAM)에는 miR-21이 풍부하여 발암 후기 단계에서 종양의 악성 진행을 가속화합니다. 종양관련대식세포(TAM)와 암세포에서 miR-21의 종양유발 기능에도 불구하고 두 유형의 세포에서 miR-21 활성을 동시에 억제하는 신뢰할 수 있는 치료 전략은 아직 개발되지 않았다.
이에, 본원발명의 발명자들은 상기 TAM과 암세포에서 miR-21의 활성을 동시에 억제할 수 있는 제제에 대한 연구를 한 결과, PD-L1 수용체가 과발현된 종양 세포와 대식세포 모두에 결합할 수 있는 miR-21 억제제의 이중 표적 약물 전달 시스템을 발명하였다. 이 펩타이드 올리고뉴클레오타이드 접합체(Pep-21)는 클릭 화학(click chemistry)을 통해 anti miR-21 억제제와 공유적으로 연결된 PDL1-결합 펩타이드로 구성된다. Pep-21은 두 세포 유형 모두에서 우선적으로 내재화되어 결과적으로 내인성 miR-21이 고갈되게 한다. 본 발명에 따르면 Pep-21 치료가 종양 세포 이동을 감소시키고 면역억제성 M2형 TAM(immunosuppressive M2-type TAMs)을 M1형 대식세포(M1-type macrophages)로 재프로그래밍하고 종양 진행을 억제한다는 것을 발견하였다. 종합적으로, 암세포와 TAM 모두에서 miR-21 활성의 중화는 효과적인 항종양 반응을 위한 유망한 전략이 될 수 있다.
본 발명의 발명자들은 anti-miR-21이 PD-L1 결합 펩타이드에 직접 결합된 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 설계하였고 이를 제공하고자 한다. 펩타이드-올리고뉴클레오타이드 접합체와 해당 수용체(PD-L1) 간의 상호작용은 miRNA 억제제의 세포내 전달 가능성을 향상시켰다. 특히 PD-L1 결합 펩타이드와의 생체접합은 TME 내의 특정 세포, 특히 표면에서 PD-L1을 과발현하는 대식세포 및 종양에 miR-21 억제제의 표적 전달을 촉진하였다. PD-L1과 PD-L1 결합 펩타이드 사이의 이러한 상호작용은 수용체 매개 세포내이입을 통한 후속 내재화로 이어졌다. 최근에는 PD-L1에 선택적으로 결합하여 T 세포 활성을 활성화하고 종양 진행을 억제하는 펩타이드가 미러 이미지 파지 디스플레이 접근법을 사용하여 성공적으로 확인되었다. 본원발명에서는 PDL1의 N-말단 아지드 잔기에 공유적으로 결합하는 디아릴시클로옥틴(diarylcyclooctyne, DBCO) 기능화된 항-miR-21 억제제로 구성된 펩티드-올리고뉴클레오티드 접합체(Pep-21)의 1단계 무 구리 클릭 화학(one step copper free click chemistry)을 통한 설계 결합 펩타이드를 제공한다.
본원발명의 발명자들은 상기 Pep-21이 매우 음으로 하전된 항-miR-21 억제제를 세포 내로 내재화할 수 있어 B16 흑색종 세포와 M2형 대식세포(M2φ) 모두에서 서열 특이적 상보성을 통해 표적 miR-21을 침묵시킬 수 있다는 것을 확인하였다. anti-miR-21의 전달은 또한 miR-21 관련 단백질 발현을 조절하여 종양 세포 사멸과 M2-type TAM의 종양 제거 분극화를 증가시켰다. Pep-21에 의한 종양 세포 및 TAM의 이중 표적화는 B16 종양 보유 마우스에서 종양 성장을 유의하게 제어할 수 있는 잠재력을 갖는 것으로 나타났으므로 보다 정확하고 효과적인 암 치료법에 대한 유망한 접근 방식을 제공한다. 본원발명 접합체의 종양세포와 종양관련대식세포에 대한 작용 메커니즘은 도 17과 같다.
또한,본원 발명의 발명자들은 항-miRNA 155, 항-miRNA 19, 항-miRNA 17-92, 항-miRNA 128, 항-miRNA 125b, 항-miRNA 504, 항-miRNA 25 및 항-miRNA 30d의 miRNA 억제제를 제공한다.
또한, 본원발명의 발명자들은 miRNA 34a, miRNA 194, miRNA 192, miRNA 29, miRNA 215, miRNA 200, miRNA 605, miRNA 122 및 miRNA 143/145중 어느 하나 이상을 포함하는 miRNA 전달제를 제공한다.
한편, 본 발명에서 제공하는 서열들은 하기와 같다.
서열 목록 1
PD-L1 결합 펩타이드 : NYSKPTDRQYHF
서열 목록 2
항 miR-21 : TCA ACA TCA GTC TGA TAA GCT A
서열 목록 3
변형된 항 miR-21 :
5'-T(PS)CL(PS)A(PS)ACLATCLAGTLCTGLATALAG(PS)CL(PS)T(PS)A-3'
서열 목록 4
Anti-miR-155 : 5' AACCCUAUCACGAUUAGCAUUAA 3'
서열 목록 5
Anti-miR-19a : 5′-UGUAGUGCAACUAUGCAAAACU-3
서열 목록 6
Anti-miR-19b : 5' UGAAAUGCAAACCUGCAAAACU 3'
서열 목록 7
Anti-miR-17 : 5' CUACCUGCACUGUAAGCACUUUG 3'
서열 목록 8
Anti-miR-125b : 5' UCACAAGUUAGGGUCUCAGGGA 3'
서열 목록 9
Anti-miR-504 : 5' GAUAGAGUGCAGACCAGGGUCU 3'
서열 목록 10
Anti-miR-25 : 5' CAAUUGCCCAAGUCUCCGCCU 3'
서열 목록 11
Anti-miR-30d : 5' CUUCCAGUCGGGGAUGUUUACA 3'
이하, 본 발명의 다양한 측면에 대하여 설명한다.
본 발명의 일측면은, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체(peptide-oligonucleotide conjugate)에 있어서, 상기 펩타이드는 PD-L1 결합 펩타이드이며, 상기 올리고뉴클레오티드는 항암 효과가 있는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 변형된 올리고뉴클레오티드인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 PD-L1 결합 펩타이드는 서열번호 1의 서열을 가지는, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 PD-L1 결합 펩타이드는 아자이드기로 기능화된 PD-L1 결합 펩타이드인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 siRNA(small interfering RNA), shRNA(small hairpin RNA), miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산 압타머인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 항-miRNA 21, 항-miRNA 155, 항-miRNA 19, 항-miRNA 17-92, 항-miRNA 128, 항-miRNA 125b, 항-miRNA 504, 항-miRNA 25 및 항-miRNA 30d 중 어느 하나 이상을 포함하는 miRNA 억제제인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
일구현예에 있어서, 상기 miRNA 억제제는 항-miRNA 21, 항-miRNA 155, 항-miRNA 19, 항-miRNA 17-92 및 항-miRNA 128 중 어느 하나 이상인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 miRNA 34a, miRNA 194, miRNA 192, miRNA 29, miRNA 215, miRNA 200, miRNA 605, miRNA 122 및 miRNA 143/145중 어느 하나 이상을 포함하는 miRNA 전달제인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
일구현예에 있어서, 상기 miRNA 전달제는 miRNA 34a, miRNA 194, miRNA 192 및 miRNA 29중 어느 하나 이상인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 변형된 올리고뉴클레오티드 변형된 뉴클레오사이드간(internucleoside) 링키지, 변형된 당 및 변형된 핵염기 중 어느 하나 이상을 포함하는, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
일구현예에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오사이드간 링키지는 포스포로티오에이트(Phosphorothioate, PS) 뉴클레오사이드간 링키지, 포스포디에스테르(Phosphodiester) 뉴클레오사이드간 링키지, 포스포트리에스테르(Phosphotriester) 뉴클레오사이드간 링키지, 모르폴리노(Morpholino) 뉴클레오사이드간 링키지, 프로테인 핵산(Protein nucleic acid, PNA) 뉴클레오사이드간 링키지 중 어느 하나 이상이며, 상기 변형된 당은 2'-O-메톡시에틸, 2'-O-하이드록시메틸, 2'-하이드록실, 2'-플루오르 및 2',4'-LNA 중 어느 하나 이상인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
일구현예에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오사이드간 링키지는 포스포로티오에이트(Phosphorothioate, PS) 뉴클레오사이드간 링키지이며, 상기 변형된 당은 2',4'-LNA 인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 항-miRNA-21인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 항-miRNA-21는 서열번호 2의 서열을 가지는, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 변형된 항-miRNA-21이며, 상기 변형된 항-miRNA-21는 포스포로티오에이트(Phosphorothioate, PS) 뉴클레오사이드간 링키지를 올리고뉴클레오타이드 서열 전체에 대하여 1 내지 10의 링키지 수를 포함하며, 2',4'-LNA의 변형된 당을 올리고뉴클레오타이드 서열 전체에 대하여 1 내지 10의 변형된 당을 포함하는, 올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
일 구현예에 있어서, 상기 변형된 항-miRNA-21는 하기 서열 구조식으로 나타내며, 하기 서열 구조식에서 (PS)는 포스포로티오에이트(Phosphorothioate, PS) 뉴클레오사이드간 링키지이며, 아래첨자 L은 2',4'-LNA의 당 변형인, 올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
5'-T(PS)CL(PS)A(PS)ACLATCLAGTLCTGLATALAG(PS)CL(PS)T(PS)A-3'
일 구현예에 있어서, 상기 서열 구조식은 서열번호 3의 서열에 의해 표현되는, 올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 디아릴사이클로옥틴(diarylcyclooctyne, DBCO)으로 기능화된 올리고뉴클레오티드인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 접합체는 아자이드기로 기능화된 PD-L1 결합 펩타이드와 디아릴사이클로옥틴(diarylcyclooctyne, DBCO)으로 기능화된 올리고뉴클레오티드가 클릭 반응(click reaction)으로 결합된 접합체인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 접합체는 하기 화학식 1의 화학구조를 가지는, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다:
[화학식 1]
Figure pat00004
상기 화학식 1에서
R1 내지 R3는 각각 독립적으로 수소; C1-C13 알킬기; C1-C6 알콕시기; C6-C10 아릴기; C3-C10 사이클릴기; C3-C10 헤테로아릴기; C3-C10 헤테로사이클릴기; -C(O)-(C1-C13 알킬); -C(O)-(C6-C10 아릴기); 또는 -C(O)-(C3-C10 헤테로아릴기); 이며
m, n, p, q 또는 r은 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이며,
W1 내지 W3는 각각 독립적으로 -NR3-; -NR3CH2-; -NR3-C(O)-; -NR3-C(O)-NR4-; -NR3-C(S)-NR4-; -C(O)-; -C(O)CH2-; -C(O)O-; -C(O)NR3-; -(CH2)-; -(CR3R4)-; -(CH2)(CR3R4)-; -S(O)2-; -NR3S(O)2-; 또는 -S(O)2NR3- ; 이며,
상기 C1-C13 알킬기, C3-C10 사이클릴기, C1-C6 알콕시기, 는, 수소; 히드록시기; 할로겐기; C1-C13 알킬기; C1-C6 알콕시기; 아미노기(-NR3R4); 니트로기(-N(O)2); 아마이드기(-(C=O)NR3R4); 카르복실산기(-C(O)OH); 니트릴기(-CN); 유레아기(-NR3(C=O)NR4-); 술폰아미드기(-NHS(O)2-); 설피드기(-S-); 술폰기(-S(O)2-); 포스피릴기(-P(O)R3R4); C6-C10 아릴기; C3-C10 헤테로아릴기; 및 C3-C10 헤테로사이클릴기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 치환기를 포함하며,
상기 C6-C10 아릴기, C3-C10 헤테로아릴기 또는 C3-C10 헤테로사이클릴기는, 수소; 히드록시기; 할로겐기; 카보닐기(-(C=O)R3R4); 할로겐 또는 C3-C10 헤테로사이클릴기로 치환 또는 비치환된 C1-C3 알킬기; 할로겐 또는 C3-C10 헤테로사이클릴기로 치환 또는 비치환된 C1-C3 알콕시기; C6-C10 페녹시; 아미노기(-NR3R4); 니트로기(-N(O)2); 아마이드기(-(C=O)NR3R4); 카르복실산기(-C(O)OH); 니트릴기(-CN); 유레아기(-NR3(C=O)NR4-); 술폰아미드기(-NHS(O)2-); 설피드기(-S-); 술폰기(-S(O)2-); 포스피릴기(-P(O)R3R4); C6-C10 아릴기; C3-C10 헤테로아릴기 및 C3-C10 헤테로사이클릴기로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 치환기를 포함하고,
상기 R3 및 R4은 각각 독립적으로 수소; C1-C6 알킬기; C1-C6 알케닐기; C1-C6 알키닐기; C6-C10 아릴기; C3-C10 헤테로아릴기; C3-C10 헤테로사이클릴기; 또는 R3는 R4과 연결된 질소 또는 탄소 원자와 함께 N, O, S, NH, C=N, C=O, -NHC(O)-, -NHC(O)NH-, -NHS(O)2-, 또는 SO2 중 적어도 1종을 임의로 포함할 수 있고, 수소, C1-C13 알킬기, C6-C10 아릴기, C3-C10 헤테로아릴기, 히드록실기, 할라이드기 및 시아노기 중 적어도 1종으로 임의로 치환될 수 있는 3 내지 7원(membered) 포화 고리를 형성하고, 상기 C3-C10 헤테로아릴기 및 C3-C10 헤테로사이클릴기는 N, O, 및 S로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 헤테로원자를 포함한다.
일 구현예에 있어서,
R1 또는 R2는 각각 독립적으로 수소; 또는 C1-C13 알킬기;이며, m 또는 p은 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이며,
R3는 수소; 또는 C1-C3 알킬기;이며,
W1 은 -(CH2)-; -(CR3R4)-; 또는 -(CH2)(CR3R4)-; 이며, r은 0, 1 또는 2 이며,
W2 은 -(CH2)-; 또는 -(CR3R4)-; 이며, n은 1 또는 2 이며,
W3은 -(CH2)-; 또는 -(CR3R4)-; 이며, q은 0, 1 또는 2 인,
펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 화학식 1에서 Peptide는 PD-L1 결합 펩타이드이며, PD-L1 결합 펩타이드는 서열번호 1의 서열을 가지며, 상기 화학식 1에서 Oligonucleotide는 항-miRNA-21 또는 변형된 항-miRNA-21이며, 상기 항-miRNA-21는 서열번호 2의 서열을 가지고, 상기 변형된 항-miRNA-21는 서열번호 3의 서열을 가지는, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체는 세포에서 miR-21, miRNA 155, miRNA 19, miRNA 17-92, miRNA 128, miRNA 125b, miRNA 504, miRNA 25 및 miRNA 30d 중 어느 하나 이상의 발현을 억제하는, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체는 세포에서 miRNA 34a, miRNA 194, miRNA 192, miRNA 29, miRNA 215, miRNA 200, miRNA 605, miRNA 122 및 miRNA 143/145 중 어느 하나 이상의 발현을 향상시키는, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 목록 4로 표시되는 항-miRNA 155, 서열 목록 5로 표시되는 항-miRNA 19a, 서열 목록 6로 표시되는 항-miRNA 19b, 서열 목록 7로 표시되는 항-miRNA 17, 서열 목록 8로 표시되는 항-miRNA 125b, 서열 목록 9로 표시되는 항-miRNA 504, 서열 목록 10로 표시되는 항-miRNA 25, 및 서열 목록 11로 표시되는 항-miRNA 30d 중 어느 하나인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 포함하는 암 예방, 경감 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 암은 흑색종, 유방암, 폐암, 대장암, 난소암, 두경부암, 신경아세포종인, 암 예방, 경감 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 본 발명의 일측면 중 어느 하나에 따른 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체의 제조 방법에 있어서, 상기 방법은 (a) PD-L1 결합 펩타이드를 아자이드기로 기능화시키는 단계; (b) 올리고뉴클레오티드를 디아릴사이클로옥틴(diarylcyclooctyne, DBCO)으로 기능화시키는 단계; 및 (c) 디아릴사이클로옥틴(diarylcyclooctyne, DBCO)으로 기능화된 올리고뉴클레오티드와 아자이드기로 기능화된 PD-L1 결합 펩타이드를 클릭 반응(click reaction)으로 반응시켜 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제조하는 단계;를 포함하는, 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 아자이드기로 기능화된 PD-L1 결합 펩타이드는 하기 화학식 2의 화합물이며, 상기 디아릴사이클로옥틴(diarylcyclooctyne, DBCO)으로 기능화된 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식 3의 화합물인, 방법을 제공한다:
[화학식 2]
Figure pat00005
[화학식 3]
Figure pat00006
상기 화학식 2 또는 3에서
R1 내지 R3는 각각 독립적으로 수소; C1-C13 알킬기; C1-C6 알콕시기; C6-C10 아릴기; C3-C10 사이클릴기; C3-C10 헤테로아릴기; C3-C10 헤테로사이클릴기; -C(O)-(C1-C13 알킬); -C(O)-(C6-C10 아릴기); 또는 -C(O)-(C3-C10 헤테로아릴기); 이며
m, n, p, q 또는 r은 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이며,
W1 내지 W3는 각각 독립적으로 -NR3-; -NR3CH2-; -NR3-C(O)-; -NR3-C(O)-NR4-; -NR3-C(S)-NR4-; -C(O)-; -C(O)CH2-; -C(O)O-; -C(O)NR3-; -(CH2)-; -(CR3R4)-; -(CH2)(CR3R4)-; -S(O)2-; -NR3S(O)2-; 또는 -S(O)2NR3- ; 이며,
상기 C1-C13 알킬기, C3-C10 사이클릴기, C1-C6 알콕시기, 는, 수소; 히드록시기; 할로겐기; C1-C13 알킬기; C1-C6 알콕시기; 아미노기(-NR3R4); 니트로기(-N(O)2); 아마이드기(-(C=O)NR3R4); 카르복실산기(-C(O)OH); 니트릴기(-CN); 유레아기(-NR3(C=O)NR4-); 술폰아미드기(-NHS(O)2-); 설피드기(-S-); 술폰기(-S(O)2-); 포스피릴기(-P(O)R3R4); C6-C10 아릴기; C3-C10 헤테로아릴기; 및 C3-C10 헤테로사이클릴기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 치환기를 포함하며,
상기 C6-C10 아릴기, C3-C10 헤테로아릴기 또는 C3-C10 헤테로사이클릴기는, 수소; 히드록시기; 할로겐기; 카보닐기(-(C=O)R3R4); 할로겐 또는 C3-C10 헤테로사이클릴기로 치환 또는 비치환된 C1-C3 알킬기; 할로겐 또는 C3-C10 헤테로사이클릴기로 치환 또는 비치환된 C1-C3 알콕시기; C6-C10 페녹시; 아미노기(-NR3R4); 니트로기(-N(O)2); 아마이드기(-(C=O)NR3R4); 카르복실산기(-C(O)OH); 니트릴기(-CN); 유레아기(-NR3(C=O)NR4-); 술폰아미드기(-NHS(O)2-); 설피드기(-S-); 술폰기(-S(O)2-); 포스피릴기(-P(O)R3R4); C6-C10 아릴기; C3-C10 헤테로아릴기 및 C3-C10 헤테로사이클릴기로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 치환기를 포함하고,
상기 R3 및 R4은 각각 독립적으로 수소; C1-C6 알킬기; C1-C6 알케닐기; C1-C6 알키닐기; C6-C10 아릴기; C3-C10 헤테로아릴기; C3-C10 헤테로사이클릴기; 또는 R3는 R4과 연결된 질소 또는 탄소 원자와 함께 N, O, S, NH, C=N, C=O, -NHC(O)-, -NHC(O)NH-, -NHS(O)2-, 또는 SO2 중 적어도 1종을 임의로 포함할 수 있고, 수소, C1-C13 알킬기, C6-C10 아릴기, C3-C10 헤테로아릴기, 히드록실기, 할라이드기 및 시아노기 중 적어도 1종으로 임의로 치환될 수 있는 3 내지 7원(membered) 포화 고리를 형성하고, 상기 C3-C10 헤테로아릴기 및 C3-C10 헤테로사이클릴기는 N, O, 및 S로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 헤테로원자를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 R1 또는 R2는 각각 독립적으로 수소; 또는 C1-C13 알킬기;이며, m 또는 p은 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이며, R3는 수소; 또는 C1-C3 알킬기;이며, W1 은 -(CH2)-; -(CR3R4)-; 또는 -(CH2)(CR3R4)-; 이며, r은 0, 1 또는 2 이며, W2 은 -(CH2)-; 또는 -(CR3R4)-; 이며, n은 1 또는 2 이며, W3은 -(CH2)-; 또는 -(CR3R4)-; 이며, q은 0, 1 또는 2 인, 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 (c) 단계는 pH 6.5 내지 8.0 의 완충액에서 30 ℃ 내지 45 ℃의 온도조건에서 700 rpm 내지 1500 rpm 으로 클릭 반응을 진행하는 것인, 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 (c) 단계는 디아릴사이클로옥틴(diarylcyclooctyne, DBCO)으로 기능화된 올리고뉴클레오티드와 아자이드기로 기능화된 PD-L1 결합 펩타이드가 1 : 1.5 내지 2.5의 몰비로 합성되는, 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 (c) 단계는 1 내지 3시간 동안 반응하는 것인, 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 PD-L1 결합 펩타이드는 서열번호 1의 서열을 가지는, 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 항-miRNA-21는 서열번호 2 또는 3의 서열을 가지는, 제조 방법을 제공한다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 펩타이드-올리고뉴클레오티드 복합체 (pep-21) 합성
N-말단 azide가 변형된 PDL1 결합 펩타이드는 Peptron Company(대전, 대한민국)에서 구입하였다. 아자이드로 변형된 PDL1 결합 펩타이드의 특정 서열은 다음과 같다.
Asn-Tyr-Ser-Lys-Pro-Thr-Asp-Arg-Gln-Tyr-His-Phe (N3-NYSKPTDRQYHF, d-form)
DNA(DBCO-21, 서열: DBCO-5'-TCA ACA TCA GTC TGA TAA GCT A-3')로 구성된 5'-Diarylcyclooctyne(DBCO)-modified-anti-miR-21, Cy5-labeled DBCO-21 , 대조군 miR-21 DNA(서열: 5'-UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A-3') 및 음성대조군 miRNA는 바이오니아(대전, 대한민국)로부터 입수하였다.
Azide-functionalized PDL1-binding peptide (3.3 μg, 2 nmole) 와 DBCO-functionalize Anti-miR-21 (7.8 μg, 1 nmole) 을 PBS 완충액 (10㎕, pH 7.4) 에서 37℃, 1100rpm 으로 무구리 click reaction으로 합성을 진행하였다. 인큐베이션 후, 생성된 PDL1-결합 펩티드-항-miR-21 접합체(Pep-21)를 아가로스 겔로 확인하고 MALDI-TOF 질량 분석기로 하기 실시예 4에서 확인하였다.
실시예 2. Pep-21의 합성 효율 비교
PDL1-binding peptide 와 DBCO-Anti-21을 다양한 몰비와 합성 시간으로 합성 효율 비교 진행하였다. 모든 실험은 PBS(pH7.4), 37℃에서 진행하였다.
(1) 몰 비율 비교
Peptide, DBCO-Anti-21 을 다양한 몰 비율(0.5, 1, 2, 4, 8)로 2h 동안 합성 진행하였다. 실험 결과는 도 2와 같았다.
(2) 접합 시간 비교
Peptide : DBCO-Anti-21 2:1 비율을 0.5, 1, 2, 3, 4 h 동안 합성 진행하였다.
실험 결과는 도 3과 같았다.
PDL1-binding peptide : DBCO-Anti-21 = 2: 1 의 몰비 일때, 가장 최적의 합성 효율임을 agarose 젤 전기 영동을 통해 확인하였다.
2:1 의 몰비로 다양한 시간(0.5, 1, 2, 3, 4) 에서 합성 진행하였을 때, 2시간일 때, 가장 최적의 합성 효율임을 agarose 젤 전기 영동을 통해 확인하였다.
실시예 3. Pep-21(PDL1-binding peptide-anti-miR-21 conjugates)의 특성 분석
miRNA-21과 Pep-21의 결합 친화력 을 Free-21과의 비교를 agarose 젤 전기 영동을 통해 확인하였다.
이와 동일한 조건인, 합성 Pep-21(10pmole)을 37℃에서 1시간 동안 100μL PBS에서 miRNA-21과 negative control miRNA 각각과 반응 시켜, pep-21이 miRNA-21에 특이적 서열을 인식하여 결합하는지 agarose 젤 전기 영동을 통해 확인하였다.
(1) miRNA-21과 Pep-21의 결합 친화력 확인-1
miRNA-21과 Pep-21의 결합 친화력 을 Free-21과의 비교를 통해 확인 하고자 하였다.
Free-21(10pmole)을 37℃에서 1시간 동안 100μL PBS에서 miR-21(0, 0.25, 0.5, 0.75 및 1)과 다양한 몰비로 annealing 하였을 때, 농도가 증가함에 따라 결합 친화력이 증가됨을 확인하였다.
합성 Pep-21(10pmole)을 37℃에서 1시간 동안 100μL PBS에서 miR-21(0, 0.25, 0.5, 0.75 및 1)과 다양한 몰비로 annealing 하였을 때, 농도가 증가함에 따라 결합 친화력이 증가되었음을 확인하였다.
실험 결과는 도 4와 같았다.
(2) miRNA-21과 Pep-21의 결합 친화력 확인-2
Negative control miRNA를 사용하여 Pep-21이 miRNA-21에 특이적 서열을 인식하여 결합하는지 확인하였다.
실험 결과는 도 5와 같았다.
Neg-miRNA과 반응시 band가 shift 되지 않았다.
miRNA-21과 반응시 band가 shift 되며 합성 형태를 확인 할 수 있었다.
즉, Pep-21은 miRNA-21에 특이적 서열을 인식하여 선택적으로 결합하는지 확인하였다.
실시예 4. Pep-21(PDL1-binding peptide-anti-miR-21 conjugates)의 특성 분석
Maldi-Tof Mass (말디토프 질량분석기)를 사용한 분자량 분석 진행하였다.
실험 결과는 도 6과 같았다.
Free-21의 Molecular weight 은 약 7209.3061 g/mol, Pep-21의 Molecular weight 은 약 8842.9584 g/mol로 pep-21의 합성 되었음을 분자량 증가로 확인하였다.
실시예 5. PD-L1 발현 양 확인 (B16, M2
Figure pat00007
, MDA-MB-231)
본 연구에서 cellular uptake 를 비교 분석하기 위해, 세가지 세포주를 사용하였다. B16 (흑생종 모델), M2φ (M2 골수 유래 대식세포), MDA-MB-231 (인간 유방암 세포) 각각의 세포주에서 PD-L1 발현 정도를 flow cytometry로 확인하였다.
상기 실험방법은 각각의 세포주에 APC형광이 달린 PD-L1 항체를 사용하여 세포표면에 발현한 PD-L1을 염색하여 발현을 측정하였다.
실험 결과는 도 7과 같았다.
B16, M2
Figure pat00008
cell line 에서 PD-L1 overexpression 됨을 확인하였다. 그러나, MDA-MB-231 에서 PD-L1이 상대적으로 발현되지 않았다.
실시예 6-1. Pep-21의 B16 melanoma cell에서 uptake 비교
(1) B16 melanoma cell에서 uptake 비교
흑색종 세포 (B16)에 Cy5 형광 다이로 레이블링한 300nM miRNA-21 을 6시간 처리한 후, 세포 내 흡수 정도를 형광 현미경으로 관찰하였다.
실험 결과는 도 8과 같았다.
세포 내부에서 매우 적은 양으로 관찰된 free-21과 비교했을 때, Pep-21을 처리하면 anti-miR21의 세포 내 전달에 있어서 상당한 이점을 보여준다.
동일한 조건에서 PD-L1 antibody로 blocking 하였을 때, cellular uptake가 감소 함을 통해, pep-21은 PD-L1-receptor-mediated endocytosis로 internalize 됨을 확인하였다.
실시예 6-2. B16 melanoma cell 에서 Pep-21과 Lysosome의 co-localization
흑색종 세포 (B16)에 Cy5 형광 다이로 레이블링한 300nM miRNA-21 을 처리한 후, 형광 찍기 1시간 전에 1 μM 의 LysoTracker™ Green DND-26을 사용하여 lysosome을 염색하였다.
이후, 형광현미경으로 세포 내에 흡수되는 Pep-21과 lysosome의 co-localization을 확인 하였다.
실험 결과는 도 9a 및 도 9b와 같았다.
Pep-21과 Lysosome의 correlation efficient 가 0.3556 으로, 이 결과를 통해 Pep-21은 엔도좀(endosome)을 성공적으로 피하며 Anti-miR21 을 세포질로 방출함을 확인하였다.
실시예 7. M2
Figure pat00009
(M2 골수 유래 대식세포) 에서 uptake 비교
M2
Figure pat00010
(M2 골수 유래 대식세포)에서 Cy5 형광 다이로 레이블링한 300nM miRNA-21 을 6시간 처리한 후, 세포 내 흡수 정도를 형광 현미경으로 관찰하였다.
실험 결과는 도 10과 같았다.
Free-21에 비해 Pep-21은 세포질에 성공적으로 Anti-21을 잘 전달 함을 확인하였다.
실시예 8. 항종양 효과 동물실험
종양 동물모델 (B16 melanoma)에 Pep-21 500pmole을 3일 간격으로 3번 처리하였을 때 암 성장이 억제됨을 확인하였다.
Tumor inoculation 후 Day 12 시점 (tumor size 약 70 mm3) 에서, 3일 간격으로 PBS, Peptide, Free-21, Pep-21 3번 intratumoral injection 하였다. 실험 개요는 도 11a와 같았다.
실험 결과는 도 11b 및 도 11c와 같았다.
Pep-21을 처리한 암조직 내에서 miRNA-21 발현양을 실시간 중합효소연쇄반응 (RT-PCR)로 분석한 결과 , miRNA-21 발현이 대조군 그룹에 비해 상대적으로 감소하였음을 확인하였다.
실시예 9. Pep-21 처리한 종양 조직 내에서 세포 사멸(apoptosis)과 혈관신생(angiogenesis) 확인
상기 동물실험을 진행 후, 21일 뒤 적출된 종양 조직을 면역 형광법 (immunofluorescence)으로 분석하였다.
세포사멸(apoptosis) 정도를 보기 위해 종양 조직에서 TUNEL assay 진행 하였다.
실험 결과는 도 12a 및 도 12b와 같았다. 실험 결과, control 그룹 대비 Pep-21 그룹에서 세포사멸 정도가 증가하였음을 확인하였다.
또한, 혈관신생(angiogenesis) marker인 CD31 을 사용하여 면역형광법을 진행하였다.
실험 결과는 도 12c 및 도 12d와 같았다. 한 결과, control 그룹 대비 Pep-21 그룹에서 발현이 감소하였음을 확인하였다.
실시예 10. Pep-21 처리한 종양 조직 내에서 대식세포(macrophage) 분석
상기 동물실험을 진행 후, 21일 뒤 적출된 종양 조직에 침투한 대식세포 (Tumor-associated macrophage)를 면역 형광법 (immunofluorescence;IF)으로 분석하였다.
실험 결과는 도 13과 같았다.
IF를 통해 Pep-21을 treat 한 tumor 조직에서 상대적으로 iNOS(M1 marker) 증가, Arginase1 (M2 marker) 감소 하였음을 확인하였다.
실시예 11. Pep-21의 B16 melanoma cell에서 anti-tumor effect 확인
(1) Pep-21을 처리하였을 때, miRNA-21의 발현이 저해되는지 확인하기 위해 실시간 중합효소연쇄반응 (RT-PCR)을 진행하였다. B16 cell 에 300nM의 Pep-21를 18h 동안 처리 후, RNA를 isolation 및 cDNA 합성후 이후 miRNA-21 primer을 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응 (RT-PCR)을 진행하였다.
실험 결과는 도 14a와 같았다. B16 cell line에서 Pep-21을 처리하였을 때, miRNA-21의 발현이 상대적으로 감소하였음을 확인하였다.
(2) 이 물질에 대한 세포독성을 확인하기위해, B16 세포에서 300nM Pep-21를 24h 동안 처리하고 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 를 사용하여 세포독성을 확인 하였다.
실험 결과는 도 14b와 같았다. B16 cell line에서 Pep-21을 처리하였을 때, 세포 독성이 거의 없음을 확인하였다.
(3) 단백질 발현정도 확인
B16 세포에 300 nM의 Pep-21를 serum free media 에서 24시간 처리 후, 단백질 정량하여 western blot 진행하였다.
miRNA-21관련 marker들 : programmed cell death 4 (PDCD4), matrix metalloproteinase-2 (MMP2), tissue inhibitor of metalloproteinase-3 (TIMP3)
실험 결과는 도 14c와 같았다.
Pep-21을 처리하였을 때, miRNA-21 관련 marker 인 PDCD4 , MMP2, Timp3 의 발현 정도 확인한 결과, PDCD4, Timp3 발현이 증가하였고, MMP2 발현 감소함을 확인하였다.
실시예 12. Pep-21의 B16 melanoma cell에서 cell migration (세포 이동 분석) 확인
세포 이동 분석을 위해 scratch-wound healing assay를 진행하였다.
B16 세포에 200 μL 파이펫 팁을 사용하여 상처를 낸후, 300 nM의 Pep-21를 serum free media 에서 48시간 처리 후, growth media로 교체해 24시간 동안 안정화 시켰다.
실험 결과는 도 15와 같았다.
상처 낸지 총 72시간 뒤에 세포 이동을 관찰 한 결과 , 대조 그룹에 비해 Pep-21를 처리하였을 때, 암세포 이동이 저해되었음을 확인.
실시예 13. Pep-21의 M2
Figure pat00011
(M2 골수 유래 대식세포)에서의 anti-tumor effect
Pep-21을 처리하였을 때, miRNA-21의 발현이 저해되는지 확인하기 위해 실시간 중합효소연쇄반응 (RT-PCR)을 진행하였다. M2
Figure pat00012
에 300nM의 Pep-21를 18h 동안 처리 후, RNA를 isolation 하여 이후 실시간 중합효소연쇄반응 (RT-PCR)을 진행하였다.
실험 결과는 도 16a와 같았다. M2
Figure pat00013
에서 Pep-21을 처리하였을 때, miRNA-21의 발현이 감소하였음을 확인하였다.
또한, 염증성 사이토카인(inflammatory cytokines) 발현 정도를 RT-PCR을 통해 확인하였다.
실험 결과는 도 16b와 같았다. M2
Figure pat00014
에서 Pep-21을 처리하였을 때, 염증성 사이토카인(inflammatory cytokines)인 TNF-α, IL-12의 mRNA발현이 증가하였음을 확인하였다. 이 결과는 Pep-21이 miRNA-21의 발현을 저해하며, 대식세포의 phenotype을 M2
Figure pat00015
에서 M1
Figure pat00016
으로 전환 시킨다는 결과를 제시한다.
이상, 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징으로 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (34)

  1. 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체(peptide-oligonucleotide conjugate)에 있어서,
    상기 펩타이드는 PD-L1 결합 펩타이드이며,
    상기 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 변형된 올리고뉴클레오티드인,
    펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 PD-L1 결합 펩타이드는 서열번호 1의 서열을 가지는, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 PD-L1 결합 펩타이드는 아자이드기로 기능화된 PD-L1 결합 펩타이드인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드는 siRNA(small interfering RNA), shRNA(small hairpin RNA), miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산 압타머인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드는 항-miRNA 21, 항-miRNA 155, 항-miRNA 19, 항-miRNA 17-92, 항-miRNA 128, 항-miRNA 125b, 항-miRNA 504, 항-miRNA 25 및 항-miRNA 30d 중 어느 하나 이상을 포함하는 miRNA 억제제인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 miRNA 억제제는 항-miRNA 21, 항-miRNA 155, 항-miRNA 19, 항-miRNA 17-92 및 항-miRNA 128 중 어느 하나 이상인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드는 miRNA 34a, miRNA 194, miRNA 192, miRNA 29, miRNA 215, miRNA 200, miRNA 605, miRNA 122 및 miRNA 143/145중 어느 하나 이상을 포함하는 miRNA 전달제인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 miRNA 전달제는 miRNA 34a, miRNA 194, miRNA 192 및 miRNA 29중 어느 하나 이상인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 변형된 올리고뉴클레오티드 변형된 뉴클레오사이드간(internucleoside) 링키지, 변형된 당 및 변형된 핵염기 중 어느 하나 이상을 포함하는, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 변형된 뉴클레오사이드간 링키지는 포스포로티오에이트(Phosphorothioate, PS) 뉴클레오사이드간 링키지, 포스포디에스테르(Phosphodiester) 뉴클레오사이드간 링키지, 포스포트리에스테르(Phosphotriester) 뉴클레오사이드간 링키지, 모르폴리노(Morpholino) 뉴클레오사이드간 링키지, 프로테인 핵산(Protein nucleic acid, PNA) 뉴클레오사이드간 링키지 중 어느 하나 이상이며,
    상기 변형된 당은 2'-O-메톡시에틸, 2'-O-하이드록시메틸, 2'-하이드록실, 2'-플루오르 및 2',4'-LNA 중 어느 하나 이상인,
    펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 변형된 뉴클레오사이드간 링키지는 포스포로티오에이트(Phosphorothioate, PS) 뉴클레오사이드간 링키지이며,
    상기 변형된 당은 2',4'-LNA 인,
    펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오타이드는 항-miRNA-21인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 항-miRNA-21는 서열번호 2의 서열을 가지는, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체.
  14. 제 1항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오타이드는 변형된 항-miRNA-21이며, 상기 변형된 항-miRNA-21는
    포스포로티오에이트(Phosphorothioate, PS) 뉴클레오사이드간 링키지를 올리고뉴클레오타이드 서열 전체에 대하여 1 내지 10의 링키지 수를 포함하며,
    2',4'-LNA의 변형된 당을 올리고뉴클레오타이드 서열 전체에 대하여 1 내지 10의 변형된 당을 포함하는,
    올리고뉴클레오티드 접합체.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 변형된 항-miRNA-21는 하기 서열 구조식으로 나타내며,
    하기 서열 구조식에서 (PS)는 포스포로티오에이트(Phosphorothioate, PS) 뉴클레오사이드간 링키지이며,
    아래첨자 L은 2',4'-LNA의 당 변형인, 올리고뉴클레오티드 접합체.
    5'-T(PS)CL(PS)A(PS)ACLATCLAGTLCTGLATALAG(PS)CL(PS)T(PS)A-3'
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 서열 구조식은 서열번호 3의 서열에 의해 표현되는, 올리고뉴클레오티드 접합체.
  17. 제 1항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드는 디아릴사이클로옥틴(diarylcyclooctyne, DBCO)으로 기능화된 올리고뉴클레오티드인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체.
  18. 제 1항에 있어서,
    상기 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체는 아자이드기로 기능화된 PD-L1 결합 펩타이드와 디아릴사이클로옥틴(diarylcyclooctyne, DBCO)으로 기능화된 올리고뉴클레오티드가 클릭 반응(click reaction)으로 결합된 접합체인, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드 접합체는 하기 화학식 1의 화학구조를 가지는, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체:
    [화학식 1]
    Figure pat00017

    상기 화학식 1에서
    R1 내지 R3는 각각 독립적으로 수소; C1-C13 알킬기; C1-C6 알콕시기; C6-C10 아릴기; C3-C10 사이클릴기; C3-C10 헤테로아릴기; C3-C10 헤테로사이클릴기; -C(O)-(C1-C13 알킬); -C(O)-(C6-C10 아릴기); 또는 -C(O)-(C3-C10 헤테로아릴기); 이며
    m, n, p, q 또는 r은 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이며,
    W1 내지 W3는 각각 독립적으로 -NR3-; -NR3CH2-; -NR3-C(O)-; -NR3-C(O)-NR4-; -NR3-C(S)-NR4-; -C(O)-; -C(O)CH2-; -C(O)O-; -C(O)NR3-; -(CH2)-; -(CR3R4)-; -(CH2)(CR3R4)-; -S(O)2-; -NR3S(O)2-; 또는 -S(O)2NR3- ; 이며,
    상기 C1-C13 알킬기, C3-C10 사이클릴기, C1-C6 알콕시기, 는, 수소; 히드록시기; 할로겐기; C1-C13 알킬기; C1-C6 알콕시기; 아미노기(-NR3R4); 니트로기(-N(O)2); 아마이드기(-(C=O)NR3R4); 카르복실산기(-C(O)OH); 니트릴기(-CN); 유레아기(-NR3(C=O)NR4-); 술폰아미드기(-NHS(O)2-); 설피드기(-S-); 술폰기(-S(O)2-); 포스피릴기(-P(O)R3R4); C6-C10 아릴기; C3-C10 헤테로아릴기; 및 C3-C10 헤테로사이클릴기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 치환기를 포함하며,
    상기 C6-C10 아릴기, C3-C10 헤테로아릴기 또는 C3-C10 헤테로사이클릴기는, 수소; 히드록시기; 할로겐기; 카보닐기(-(C=O)R3R4); 할로겐 또는 C3-C10 헤테로사이클릴기로 치환 또는 비치환된 C1-C3 알킬기; 할로겐 또는 C3-C10 헤테로사이클릴기로 치환 또는 비치환된 C1-C3 알콕시기; C6-C10 페녹시; 아미노기(-NR3R4); 니트로기(-N(O)2); 아마이드기(-(C=O)NR3R4); 카르복실산기(-C(O)OH); 니트릴기(-CN); 유레아기(-NR3(C=O)NR4-); 술폰아미드기(-NHS(O)2-); 설피드기(-S-); 술폰기(-S(O)2-); 포스피릴기(-P(O)R3R4); C6-C10 아릴기; C3-C10 헤테로아릴기 및 C3-C10 헤테로사이클릴기로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 치환기를 포함하고,
    상기 R3 및 R4은 각각 독립적으로 수소; C1-C6 알킬기; C1-C6 알케닐기; C1-C6 알키닐기; C6-C10 아릴기; C3-C10 헤테로아릴기; C3-C10 헤테로사이클릴기; 또는 R3는 R4과 연결된 질소 또는 탄소 원자와 함께 N, O, S, NH, C=N, C=O, -NHC(O)-, -NHC(O)NH-, -NHS(O)2-, 또는 SO2 중 적어도 1종을 임의로 포함할 수 있고, 수소, C1-C13 알킬기, C6-C10 아릴기, C3-C10 헤테로아릴기, 히드록실기, 할라이드기 및 시아노기 중 적어도 1종으로 임의로 치환될 수 있는 3 내지 7원(membered) 포화 고리를 형성하고, 상기 C3-C10 헤테로아릴기 및 C3-C10 헤테로사이클릴기는 N, O, 및 S로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 헤테로원자를 포함한다.
  20. 제 19항에 있어서,
    R1 또는 R2는 각각 독립적으로 수소; 또는 C1-C13 알킬기;이며, m 또는 p은 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이며,
    R3는 수소; 또는 C1-C3 알킬기;이며,
    W1 은 -(CH2)-; -(CR3R4)-; 또는 -(CH2)(CR3R4)-; 이며, r은 0, 1 또는 2 이며,
    W2 은 -(CH2)-; 또는 -(CR3R4)-; 이며, n은 1 또는 2 이며,
    W3은 -(CH2)-; 또는 -(CR3R4)-; 이며, q은 0, 1 또는 2 인,
    펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체.
  21. 제 20항에 있어서,
    상기 화학식 1에서 Peptide는 PD-L1 결합 펩타이드이며, PD-L1 결합 펩타이드는 서열번호 1의 서열을 가지며,
    상기 화학식 1에서 Oligonucleotide는 항-miRNA-21 또는 변형된 항-miRNA-21이며, 상기 항-miRNA-21는 서열번호 2의 서열을 가지고, 상기 변형된 항-miRNA-21는 서열번호 3의 서열을 가지는, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체.
  22. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체는 세포에서 miR-21, miRNA 155, miRNA 19, miRNA 17-92, miRNA 128, miRNA 125b, miRNA 504, miRNA 25 및 miRNA 30d 중 어느 하나 이상의 발현을 억제하는, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체.
  23. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체는 세포에서 miRNA 34a, miRNA 194, miRNA 192, miRNA 29, miRNA 215, miRNA 200, miRNA 605, miRNA 122 및 miRNA 143/145 중 어느 하나 이상의 발현을 향상시키는, 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체.
  24. 제 1항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드는
    서열 목록 4로 표시되는 항-miRNA 155,
    서열 목록 5로 표시되는 항-miRNA 19a,
    서열 목록 6로 표시되는 항-miRNA 19b,
    서열 목록 7로 표시되는 항-miRNA 17,
    서열 목록 8로 표시되는 항-miRNA 125b,
    서열 목록 9로 표시되는 항-miRNA 504,
    서열 목록 10로 표시되는 항-miRNA 25, 및
    서열 목록 11로 표시되는 항-miRNA 30d 중 어느 하나인,
    펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체.
  25. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 포함하는 암 예방, 경감 또는 치료용 약학 조성물.
  26. 제 25항에 있어서,
    상기 암은 흑색종, 유방암, 폐암, 대장암, 난소암, 두경부암, 신경아세포종인, 암 예방, 경감 또는 치료용 약학 조성물.
  27. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체의 제조 방법에 있어서, 상기 방법은
    (a) PD-L1 결합 펩타이드를 아자이드기로 기능화시키는 단계;
    (b) 올리고뉴클레오티드를 디아릴사이클로옥틴(diarylcyclooctyne, DBCO)으로 기능화시키는 단계; 및
    (c) 디아릴사이클로옥틴(diarylcyclooctyne, DBCO)으로 기능화된 올리고뉴클레오티드를 아자이드기로 기능화된 PD-L1 결합 펩타이드와 클릭 반응(click reaction)으로 반응시켜 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체를 제조하는 단계;를 포함하는,
    제조 방법.
  28. 제 27항에 있어서,
    상기 아자이드기로 기능화된 PD-L1 결합 펩타이드는 하기 화학식 2의 화합물이며,
    상기 디아릴사이클로옥틴(diarylcyclooctyne, DBCO)으로 기능화된 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식 3의 화합물인, 방법:
    [화학식 2]
    Figure pat00018

    [화학식 3]
    Figure pat00019

    상기 화학식 2 또는 3에서
    R1 내지 R3는 각각 독립적으로 수소; C1-C13 알킬기; C1-C6 알콕시기; C6-C10 아릴기; C3-C10 사이클릴기; C3-C10 헤테로아릴기; C3-C10 헤테로사이클릴기; -C(O)-(C1-C13 알킬); -C(O)-(C6-C10 아릴기); 또는 -C(O)-(C3-C10 헤테로아릴기); 이며
    m, n, p, q 또는 r은 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이며,
    W1 내지 W3는 각각 독립적으로 -NR3-; -NR3CH2-; -NR3-C(O)-; -NR3-C(O)-NR4-; -NR3-C(S)-NR4-; -C(O)-; -C(O)CH2-; -C(O)O-; -C(O)NR3-; -(CH2)-; -(CR3R4)-; -(CH2)(CR3R4)-; -S(O)2-; -NR3S(O)2-; 또는 -S(O)2NR3- ; 이며,
    상기 C1-C13 알킬기, C3-C10 사이클릴기, C1-C6 알콕시기, 는, 수소; 히드록시기; 할로겐기; C1-C13 알킬기; C1-C6 알콕시기; 아미노기(-NR3R4); 니트로기(-N(O)2); 아마이드기(-(C=O)NR3R4); 카르복실산기(-C(O)OH); 니트릴기(-CN); 유레아기(-NR3(C=O)NR4-); 술폰아미드기(-NHS(O)2-); 설피드기(-S-); 술폰기(-S(O)2-); 포스피릴기(-P(O)R3R4); C6-C10 아릴기; C3-C10 헤테로아릴기; 및 C3-C10 헤테로사이클릴기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 치환기를 포함하며,
    상기 C6-C10 아릴기, C3-C10 헤테로아릴기 또는 C3-C10 헤테로사이클릴기는, 수소; 히드록시기; 할로겐기; 카보닐기(-(C=O)R3R4); 할로겐 또는 C3-C10 헤테로사이클릴기로 치환 또는 비치환된 C1-C3 알킬기; 할로겐 또는 C3-C10 헤테로사이클릴기로 치환 또는 비치환된 C1-C3 알콕시기; C6-C10 페녹시; 아미노기(-NR3R4); 니트로기(-N(O)2); 아마이드기(-(C=O)NR3R4); 카르복실산기(-C(O)OH); 니트릴기(-CN); 유레아기(-NR3(C=O)NR4-); 술폰아미드기(-NHS(O)2-); 설피드기(-S-); 술폰기(-S(O)2-); 포스피릴기(-P(O)R3R4); C6-C10 아릴기; C3-C10 헤테로아릴기 및 C3-C10 헤테로사이클릴기로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 치환기를 포함하고,
    상기 R3 및 R4은 각각 독립적으로 수소; C1-C6 알킬기; C1-C6 알케닐기; C1-C6 알키닐기; C6-C10 아릴기; C3-C10 헤테로아릴기; C3-C10 헤테로사이클릴기; 또는 R3는 R4과 연결된 질소 또는 탄소 원자와 함께 N, O, S, NH, C=N, C=O, -NHC(O)-, -NHC(O)NH-, -NHS(O)2-, 또는 SO2 중 적어도 1종을 임의로 포함할 수 있고, 수소, C1-C13 알킬기, C6-C10 아릴기, C3-C10 헤테로아릴기, 히드록실기, 할라이드기 및 시아노기 중 적어도 1종으로 임의로 치환될 수 있는 3 내지 7원(membered) 포화 고리를 형성하고, 상기 C3-C10 헤테로아릴기 및 C3-C10 헤테로사이클릴기는 N, O, 및 S로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 헤테로원자를 포함한다.
  29. 제 28항에 있어서,
    R1 또는 R2는 각각 독립적으로 수소; 또는 C1-C13 알킬기;이며, m 또는 p은 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4이며,
    R3는 수소; 또는 C1-C3 알킬기;이며,
    W1 은 -(CH2)-; -(CR3R4)-; 또는 -(CH2)(CR3R4)-; 이며, r은 0, 1 또는 2 이며,
    W2 은 -(CH2)-; 또는 -(CR3R4)-; 이며, n은 1 또는 2 이며,
    W3은 -(CH2)-; 또는 -(CR3R4)-; 이며, q은 0, 1 또는 2 인,
    제조 방법.
  30. 제 28항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 pH 6.5 내지 8.0 의 완충액에서 30 ℃ 내지 45 ℃의 온도조건에서 700 rpm 내지 1500 rpm 으로 클릭 반응을 진행하는 것인, 제조 방법.
  31. 제 28항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 디아릴사이클로옥틴(diarylcyclooctyne, DBCO)으로 기능화된 올리고뉴클레오티드와 아자이드기로 기능화된 PD-L1 결합 펩타이드가 1 : 1.5 내지 2.5의 몰비로 합성되는, 제조 방법.
  32. 제 28항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 1 내지 3시간 동안 반응하는 것인, 제조 방법.
  33. 제 28항에 있어서,
    상기 PD-L1 결합 펩타이드는 서열번호 1의 서열을 가지는, 제조 방법.
  34. 제 28항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 서열을 가지는 항-miRNA-21인, 제조 방법.
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KR100721696B1 (ko) 1999-07-28 2007-05-28 사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하 분자를 생물학적 막을 통해 수송하기 위한 접합체 및 이의 제조방법

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