KR100690199B1 - 구리 이온 선택성을 갖는 플루오레세인 유도체, 이의제조방법 및 이를 이용한 생체 내 구리 이온 검출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 구리 이온(Cu^{2 +}) 선택성을 갖는 플루오레세인 유도체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 생체 내 구리 이온 검출방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 플루오레세인 유도체는 구리 이온(Cu^{2 +})과 매우 강한 결합을 하여 구리 이온(Cu^{2 +})에 대해 선택성이 뛰어나며, 생체 내에서 트랜스페린 단백질 또는 아밀로이드 단백질의 양이 증가함에 따라 형광이 증가하는 현상을 보이므로, 생체 내에서 구리 이온(Cu^{2 +}) 검출방법으로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

구리 이온 선택성을 갖는 플루오레세인 유도체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 생체 내 구리 이온 검출방법{Fluorescein derivative having selectivity for copper ion, preparation method thereof and detection method of copper ion in vivo using the same}

도 1은 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물(1μM)에 pH 7.4(20 mM HEPES 완충액)에서 여러 가지 금속 이온(Ca^{2 +}, Cd^{2 +}, Hg^{2 +}, Zn^{2 +}, 100μM)을 가하였을 때 형광변화를 관찰한 도이다.

도 2는 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물(1μM)에 pH 7.4(20 mM HEPES 완충액)에서 구리 이온의 농도(0.2~10μM)를 달리하여 첨가하였을때, 상기 용액의 형광변화를 관찰한 도이다.

도 3은 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물(1μM)에 pH 7.4(20 mM HEPES 완충액)에서 여러 가지 금속 이온(Ca^{2 +}, Cd^{2 +}, Hg^{2 +}, Zn^{2 +}, 100μM)을 가한 후, 다시 Cu^{2 +} (5μM)를 가하였을 때 형광변화를 관찰한 도이다.

도 4는 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물에 구리 이온(Cu^{2 +})과 트랜스페린 단백질을 첨가한 후 형광변화를 관찰한 도이다.

((a) 화학식 1의 화합물(4μM),

(b) 화학식 1의 화합물(4μM) + Cu^{2 +}(4μM),

(c) 화학식 1의 화합물(4μM) + Cu^{2 +}(4μM) + 트랜스페린 단백질(0.1μM),

(d) 화학식 1의 화합물(4μM) + Cu^{2 +}(4μM) + 트랜스페린 단백질(0.5μM),

(e) 화학식 1의 화합물(4μM) + Cu^{2 +}(4μM) + 트랜스페린 단백질(1μM),

(f) 화학식 1의 화합물(4μM) + Cu^{2 +}(4μM) + 트랜스페린 단백질(5μM))

도 5는 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물에 구리 이온(Cu^{2 +})과 아밀로이드 단백질을 첨가한 후 형광변화를 관찰한 도이다.

(파란 막대 : 화학식 1의 화합물(4μM) + 아밀로이드 단백질(0~50 μM),

붉은 막대 : 화학식 1의 화합물(4μM) + 아밀로이드 단백질(0~50 μM) + Cu^{2 +}(4μM))

본 발명은 구리 이온 선택성을 갖는 플루오레세인 유도체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 생체 내 구리 이온 검출방법에 관한 것이다.

생체 내 주요물질과 이온들에 대한 새로운 센서의 설계와 연구는 그 동안 활발히 진행되어져 왔다. 최근 초분자(supramolecule)화학에 대한 이해와 연구는 선 택적으로 이온 혹은 여러 가지 다른 종류의 손님화합물들과 결합할 수 있는 주인화합물의 설계에 큰 가능성을 보여왔으며, 최근 이러한 초분자 화합물을 형광물질에 연결시킴으로써 손님화합물과의 선택적 결합을 형광변화를 이용하여 보다 손쉽게 관찰할 수 있는 형광 화학센서(fluorescent chemosensor)의 개발에 대한 연구에 큰 도움을 주고 있다.

형광이란 특정한 광파장 (여기파장)을 갖는 광자가 표지분자(indicator molecule)와 충돌하고, 그 충돌의 결과로 전자가 고에너지 준위로 여기하면서 일어나는 광화학적 현상이다. 여러 분석 방법 중에서 형광을 이용하는 방법은 아주 뛰어난 감도로 인해 10^-9 M 농도에서도 신호를 관찰할 수 있는 큰 장점을 가지고 있다. 최근에는 이러한 성질을 이용하여 양이온, 음이온 그리고 중성유기분자들에 대한 형광화학 센서에 대한 연구들이 발표된 바 있다 (A. P. de Silva 등, Chem . Rev. 1997, 97, 1515).

여러 금속 이온 중에서도 구리 이온 (Cu^{2 +})은 인체 내 존재하는 중금속 이온 중 세 번째로 그 양이 많으며, 생체 내에서 여러 가지 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 구리는 생명체에서 중요하지만 구리와 관련된 세포 항상성의 변화는 멘케스 윌슨(Menkes and Wilson diseases), 유전성 경화, 알츠하이머 및 프라이언(prion diseases)과 같은 심각한 퇴행성 신경 질환과 연결된다. 구리의 독성 성질로 인해 세포는 세포 내의 구리 분포에 대해 엄격한 통제를 한다. 그럼에도 불구하고 세포 내 구리의 취이 및 방출은 속도론적으로 빨리 진행되어, 세포 내 구리 농도는 한 시간 내에 20배로 증가될 수 있다. 세포질, 미토콘드리아, 소포체 효소 등은 산화환원 보조인자(cofactor)로써 구리를 필요로 하지만, 산소 및 반응성 산소종과 비조절된 구리 이온의 반응은 단백질, 핵산, 지질의 산화를 야기한다.

이와 같이, 금속이온들은 생체 내의 역할 혹은 환경적 측면으로 인해 그 농도를 손쉽고 정확하게 알아낼 필요가 있어 그 중요성 만큼이나 많은 연구가 진행되고 있으며, 환경학적으로 그 검출방법이 중요하다 할 수 있다.

이와 관련하여 트랜스페린 (transferrin) (C. Ka Luk, Biochemistry 1971, 10, 2838; J. Hirose 등, Biochim . Biophys . Acta 1996, 1296, 103)과 아밀로이드 단백질 (amyloid precursor protein) (L. Hesse 등, FEBS Lett . 1994, 349, 109; R. Hassett 등, J. Biol . Chem. 1995, 270, 128; G. Muthaup 등, Science 1996, 271, 1406; F. H. Ruiz 등, J. Neurochem . 1999, 73, 1288; C. J. Maynard 등, Int . J. Exp . Path. 2005, 86, 147)의 구리 이온 결합에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.

구리 이온 (Cu⁺)에 대해 선택적으로 형광하는 화학센서로는 하기 화학식 4로 표시되는 화합물이 알려져 있으며, 구리 이온 (Cu^{2 +})에 대해 선택적으로 형광하는 화학센서로는 칼세인(calcein)이 알려져 있다.

한편, 플루오레세인 (fluorescein)은 520 ㎚ 정도에서 형광방출 최대치를 보이며, 형광 효율 또한 뛰어나 표지 화합물 및 형광화학센서로 자주 사용되는 물질이다. 최근 MIT의 립파드(Lippard) 그룹에서 하기 화학식 5로 표시되는 플루오레세인 유도체를 이용한 아연이온(Zn²⁺)에 대하여 형광화학센서를 발표한 바 있다.

이에, 본 발명자들은 금속이온들 중 구리 이온 (Cu^{2 +})에 대해 선택적인 형광화학센서에 대하여 연구하던 중, 플루오레세인 유도체인 이미노디아세트산 플루오레세인을 합성하게 되었으며, 상기 이미노디아세트산 플루오레세인이 구리 이온 (Cu^{2 +})에 대해 선택적으로 작용함으로 인하여 트랜스페린 및 아밀로이드 단백질의 구리 이온 결합 현상의 확인에 이용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 구리 이온(Cu^{2 +}) 선택성을 갖는 플루오레세인 유도체를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 구리 이온(Cu^{2 +}) 선택성을 갖는 플루오레세인 유도체의 중간체를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 플루오레세인 유도체의 제조방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 플루오레세인 유도체를 이용한 생체 내 구리 이온(Cu²⁺)을 검출하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 구리 이온(Cu^{2 +}) 선택성을 갖는 플루오레세인 유도체를 제공한다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 3으로 표시되는 구리 이온(Cu^{2 +}) 선택성을 갖는 플루오레세인 유도체의 중간체 화합물을 제공한다.

상기 화학식 3에서, R은 C₁~C₈의 알킬기이다.

또한, 본 발명은 구리 이온(Cu^{2 +}) 선택성을 갖는 플루오레세인 유도체의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 플루오레세인 유도체의 제조방법은

1) 2',7'-디클로플루오레세인 (2',7'-dichlorofluorescein), 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 및 디알킬 이미노디아세테이트(dialkyl iminodiacetate)를 반응시켜 화학식 3의 화합물인 디알킬 이미노디아세테이트 플루오레세인 (dialkyl iminodiacetate fluorescein )을 얻는 단계, 및

2) 상기 1)단계에서 얻어진 디알킬 이미노디아세테이트 플루오레세인을 염기로 가수분해하여 화학식 1의 화합물을 얻는 단계를 포함하여 이루어진다.

상기 제조방법을 디에틸 이미노디아세테이트를 예를 들어 상세히 설명하면, 하기 반응식 1로 표시된다.

상기 1)단계에서는 2',7'-디클로플루오레세인과, 파라포름알데히드 및 디에틸 이미노디아세테이트의 생성물의 이미늄 이온을 반응시켜 만니히 반응(Mannich reaction)을 통해 아미노메틸화된 화학식 2의 화합물을 제조한다.

상기 2)단계에서는 상기 1)단계에서 제조된 화학식 2의 화합물을 KOH로 가수분해하여 화학식 1의 화합물을 제조한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물을 이용한 생체 내 구리 이온을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 522nm에서의 형광 최대치가 구리 이온의 양이 증가함에 따라 점차적으로 감소하여, 구리 이온이 1당량 첨가되었을 때 최소치에 근접한다. 따라서, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 구리 이온 (Cu^{2 +})에 대한 결합력이 뛰어나며, 다른 금속 이온에 비해 구리 이온(Cu²⁺)에 대한 선택성이 뛰어남을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 선택적인 새로운 형광화학센서로 이용할 수 있다.

한편, 본 발명의 화학식 1의 화합물과 Cu^{2 +}의 용액에서 트랜스페린 단백질 또는 아밀로이드 단백질의 양이 증가함에 따라 본 발명에 따른 화합물의 형광이 증가하는 현상을 보인다. 즉, 트랜스페린 단백질 또는 아밀로이드 단백질은 구리 이온과의 결합자리를 가지고 있어, 구리 이온이 본 발명의 화합물로부터 트랜스페린 단백질 또는 아밀로이드 단백질로 자리 옮김을 함에 따라 본 발명의 화합물의 형광이 구리 이온을 넣기 전으로 되돌아가는 현상을 관찰할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물은 생체 내에서 구리 이온(Cu^{2 +}) 검출방법으로 유용하게 사용할 수 있다.(도 4 및 도 5 참조).

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 화학식 2의 화합물의 제조 ( 디에틸 이미노디아세테이트 플루오레세인 )

디에틸 이미노아세테이트 (1.52 mL, 8.68 mmol) 및 파라포름알데히드 (0.224 g, 7.47 mmol)를 20 mL의 CH₃CN에 넣고, 30분 동안 환류시켰다. 30 mL의 CH₃CN/H₂O (1:1) 내에 있는 2',7'-디클로로플루오레세인 (1.00 g, 2.49 mmol)을 상기 용액에 가하고, 반응혼합물을 24시간 동안 환류시켰다. CH₃CN을 제거하고, 생성물과 잔류물을 30 mL의 끓는 에탄올로 녹였다. 실온으로 냉각시킨 후, 5 mL의 에테르를 상기 용액에 가하였다. 4℃에서 생성된 침전물을 걸러내어 화학식 2의 화합물(1.21 g, 61%)을 얻었다.

¹H NMR (CDCl₃) δ 8.06 (d, 1H, J = 6.8Hz), 7.69 (quintet, 2H, J = 7.4 Hz), 7.20 (d, 1H, J = 6.2 Hz), 6.69 (s, 2H), 4.30-4.53 (d, 4H, J= 14 Hz), 4.21 (q, 8H, J = 7.1 Hz), 3.54 (s, 8H), 1.28 (t, 12H, J = 7.1 Hz);

¹³C NMR (CDCl₃) δ 170.6, 169.0, 155.9, 151.6, 148.6, 135.6, 130.6, 128.3, 127.3, 125.8, 124.3, 117.9, 110.9, 109.9, 83.0, 61.6, 54.5, 49.1, 31.2, 14.4;

HRMS (FAB) m/z = 825.1805 (M+H+Na)⁺, calc. for C₃₈H₄₀Cl₂N₂O₁₃Na = 825.1805.

실시예 2 : 화학식 1의 화합물의 제조 ( 이미노디아세트산 플루오레세인 )

상기 실시예 1에서 제조한 화학식 2의 화합물(500 mg, 0.62 mmol)을 증류수 25 mL에 녹이고, 수산화칼륨 (KOH)을 가하였다. 반응혼합물을 12시간 동안 환류시켰다. 반응혼합물을 실온으로 냉각시킨 후, 1M 염산을 첨가하여 pH 2~3으로 조절하였다. 석출되는 고체를 거르고, 찬 증류수 (1 mL)로 씻어주었다. 진공펌프를 이용 하여 90℃에서 건조시킨 후, 화학식 1의 화합물 (402 ㎎, 90%의 수율)을 얻었다.

녹는점(m.p.) : 230 ℃, dec.;

¹H-NMR (DMSO d ₆) 8.03 (d, 1H, J = 7.3 Hz), 7.80 (m, 2H), 7.37 (d, 1H, J = 7.3 Hz), 6.63 (s, 2H), 4.30 (s, 4H), 3.55 (s, 8H);

¹³C-NMR (D₂O) 181.4,173.1, 171.6, 170.1, 155.6, 133.7, 133.4, 132.2, 130.5, 130.2, 130.1, 129.9, 127.4, 111.9, 105.2, 56.7, 50.1;

MS (FAB) m/z = 691.09 (M+H)⁺, calc. for C₃₀H₂₅Cl₂N₂O₁₃ = 691.07

실험예 1 : 형광변화 관찰

본 발명에 따른 화합물의 금속 이온 결합 성질을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

1. 본 발명에 따른 화합물과 각 금속 이온들의 적정 실험

실험에 사용한 금속 이온은 Ca^{2 +}, Cd^{2 +}, Cu^{2 +}, Hg^{2 +}, Mg^{2 +}, Ni^{2 +} 및 Zn^{2 +}이다.

형광 금속 이온 적정 용액은, 금속 퍼클로레이트 염(metal perchlorate salts)의 저장액(stock solution)(1 mM)을 이중으로 증류한 탈염수(demineralized water)를 사용하여 제조하였다. 또한, 상기 실시예 2에서 제조한 화학식 1의 화합물의 저장액(1 mM)도 이중으로 증류한 탈염수를 사용하여 제조하였다. 상기 저장액 들은 제조 당일에 사용하였다.

시험액은 40 ㎕의 탐침 저장액(화학식 1의 화합물의 저장액)을 시험관에 넣고, 각 금속 저장액의 적당량(0~400 ㎕, 예를들어 금속 1당량의 경우 4㎕, 금속 10당량의 경우 40㎕)을 가한 다음, 20 mM HEPES 완충액(pH 7.4)으로 용액을 4 mL로 희석시켜 제조하였다.

모든 형광변화는 여기파장(excitation, 505 nm) 및 방출파장(emission, 522 ㎚)에서 측정하였다. 여기와 방출의 슬릿폭(slit width)은 1.5 nm이었다.

상기 용액의 형광변화를 관찰하여, 도 1에 나타내었다.

또한, 상기 실시예 2에서 제조한 화학식 1의 화합물(1μM)에 pH 7.4(20 mM HEPES 완충액)에서 구리 이온의 농도(0.2~10μM)를 달리하여 첨가하였을때, 상기 용액의 형광변화를 관찰하여, 도 2에 나타내었다.

도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 522nm에서의 형광 최대치가 구리 이온의 양이 증가함에 따라 점차적으로 감소하여, 구리 이온이 1당량 첨가되었을 때 최소치에 근접하고 있음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물과 구리 이온이 매우 강한 결합을 보인다는 사실을 알 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 Cu^{2 +} 및 Ni^{2 +}와 함께 큰 CHEQ (chelation-enhanced quenching) 효과를 나타내었다. Cu^{2 +}와의 적정 실험을 통해 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물의 구리 이온에 대한 해리 상수 (K_d)가 26 nM 이하인 것을 알 수 있었다. 또한 Ni^{2 +}와의 적정실험을 통해 해리상수가 700 nM로 계산되어져, 니켈 이온에 대한 구리 이온의 선택성이 25배에 이르는 것을 확인할 수 있었다. 또한 칼슘 이온 1 mM 존재하에서의 구리 이온에 대한 적정실험을 통해 해리 상수에 변화가 없음을 확인하였다.

2. 본 발명에 따른 화합물과 구리 및 기타 금속 이온이 존재할때의 형광변화

상기 실시예 2에서 제조한 화학식 1의 화합물(1μM)에 pH 7.4(20 mM HEPES 완충액)에서 여러 가지 금속 이온(Ca^{2 +}, Cd^{2 +}, Hg^{2 +}, Zn^{2 +}, 100μM)을 가한 후, 다시 Cu^{2 +} (5μM)를 가하였을 때 형광변화를 관찰하였다.

형광변화는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물의 형광변화는 다른 금속이온의 추가없이 Cu^{2 +} 5 당량을 넣은 것과 거의 유사한 결과를 보였다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물은 구리 이온(Cu^{2 +})에 대해 선택성이 뛰어남을 알 수 있다.

3. 본 발명에 따른 화합물에 구리 이온과 트랜스페린 단백질을 첨가한 후 형 광변화

트랜스페린 적정 용액은, 철(Fe)이 없는 인간 트랜스페린(iron-free human transferrin, 시그마)의 저장액을 20 mM HEPES 완충액(pH 7.4) 내에서 여러 가지 농도(1~50 μM)로 제조하였다. 시험액은 100 ㎕의 트랜스페린 저장액 및 40 ㎕의 탐침 저장액을 시험관에 넣고, 각각에 구리 퍼클로레이트 염(1mM)의 저장액 4 ㎕를 가한 다음, 20 mM HEPES 완충액(pH 7.4)과 함께 용액을 1 mL로 희석시켜 제조하였다.

상기 각 용액의 형광변화를 관찰하였다.

형광변화는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 트랜스페린 단백질의 양이 증가함(0μM -> 5μM)에 따라 본 발명에 따른 화합물의 형광이 증가하는 현상을 보였다. 트랜스페린 단백질 역시 구리 이온과의 결합자리를 가지고 있어, 구리 이온이 본 발명의 화합물로부터 트랜스페린 단백질로 자리 옮김을 함에 따라 본 발명의 화합물의 형광이 구리 이온을 넣기 전으로 되돌아가는 현상을 관찰하였다. 이러한 결과는 구리 이온이 본 발명의 화합물의 결합자리에서 트랜스페린 단백질로 옮겨가는 현상을 간단히 확인할 수 있는 검출법이라 할 수 있다.

4. 본 발명에 따른 화합물에 구리 이온과 아밀로이드 단백질을 첨가한 후 형광변화

아밀로이드 단백질 용액은, 인간 와일드-타입에 APP_{135 -155} 서열 (Anaspec Inc.)에 대응하는 펩티드 저장액을 20 mM HEPES 완충액(pH 7.4) 내에서 여러 가지 농도(5~500μM)로 제조하였다. 시험액은 100 ㎕의 APP_{135 -155} 저장액 및 40 ㎕의 탐침 저장액을 시험관에 넣고, 각 구리 퍼클로레이트 염의 저장액(1mM) 4 ㎕를 가한 다음, 20 mM HEPES 완충액(pH 7.4)과 함께 용액을 1 mL로 희석시켜 제조하였다.

상기 용액의 형광변화를 관찰하였다.

형광변화는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 아밀로이드 단백질의 양이 증가함에 따라 본 발명에 따른 화합물의 형광이 증가하는 현상을 보였다. 아밀로이드 단백질 역시 구리 이온과의 결합자리를 가지고 있어, 구리 이온이 본 발명의 화합물로부터 아밀로이드 단백질로 자리 옮김을 함에 따라 본 발명의 화합물의 형광이 구리 이온을 넣기 전으로 되돌아가는 현상을 관찰하였다. 이러한 결과는 구리 이온이 본 발명의 화합물의 결합자리에서 아밀로이드 단백질로 옮겨가는 현상을 간단히 확인할 수 있는 검출법이라 할 수 있다.

본 발명에 따른 플루오레세인 유도체는 구리 이온(Cu^{2 +})과 매우 강한 결합을 하여 구리 이온(Cu^{2 +})에 대해 선택성이 뛰어나다. 또한, 본 발명에 따른 플루오레세인 유도체는 생체 내에서 트랜스페린 단백질 또는 아밀로이드 단백질의 양이 증가함에 따라 형광이 증가하는 현상을 보이므로, 생체 내에서 구리 이온(Cu^{2 +}) 검출방법으로 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (8)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 구리 이온(Cu^{2 +}) 선택성을 갖는 플루오레세인 유도체.

   <화학식 1>

   
2. 하기 화학식 3으로 표시되는 구리 이온(Cu^{2 +}) 선택성을 갖는 플루오레세인 유도체의 중간체 화합물.

   <화학식 3>

   

   상기 화학식 3에서, R은 C₁~C₈의 알킬기이다.
3. 1) 2',7'-디클로플루오레세인 (2',7'-dichlorofluorescein), 파라포름알데히 드(paraformaldehyde) 및 디알킬 이미노디아세테이트(dialkyl iminodiacetate)를 반응시켜 화학식 3의 화합물인 디알킬 이미노디아세테이트 플루오레세인 (dialkyl iminodiacetate fluorescein )을 얻는 단계, 및

   2) 상기 1)단계에서 얻어진 디알킬 이미노디아세테이트 플루오레세인을 염기로 가수분해하여 화학식 1의 화합물을 얻는 단계를 포함하여 이루어지는, 청구항 1의 플루오레세인 유도체의 제조방법.

   <화학식 1>

   

   <화학식 3>

   

   상기 화학식 3에서, R은 C₁~C₈의 알킬기이다.
4. 청구항 3에 있어서, 상기 1)단계에서 디알킬 이미노디아세테이트는 디에틸 이미노디아세테이트인 것을 특징으로 하는 청구항 1의 플루오레세인 유도체의 제조방법.
5. 청구항 3에 있어서, 상기 2)단계에서 염기는 KOH인 것을 특징으로 하는 청구항 1의 플루오레세인 유도체의 제조방법.
6. 청구항 1의 화합물을 이용한 생체 내 구리 이온(Cu^{2 +}) 검출방법.
7. 청구항 6에 있어서, 청구항 1의 화합물을 이용하여 트랜스페린 단백질과 구리 이온(Cu^{2 +})의 결합을 확인하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
8. 청구항 6에 있어서, 청구항 1의 화합물을 이용하여 아밀로이드 단백질과 구리 이온(Cu^{2 +})의 결합을 확인하는 것을 특징으로 하는 검출방법.

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