KR101228030B1

KR101228030B1 - Ｌ―３，４―디하이드록시페닐알라닌이 도입된 형광단백질을 이용한 금속 탐지 바이오센서

Info

Publication number: KR101228030B1
Application number: KR1020110028620A
Authority: KR
Inventors: 윤형돈; 니라이쿨람아야두레이; 나다라잔사라바난프라부; 카나가벨디판쿠마; 이창수
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2011-03-30
Filing date: 2011-03-30
Publication date: 2013-01-30
Also published as: KR20120110633A

Abstract

본 발명은 L-3,4-디하이드록시페닐알라닌(3,4-dihydroxyphenylalanine; L-DOPA)가 도입된 형광단백질을 포함하는 바이오센서에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 L-DOPA과 재조합 단백질의 타이로신 코돈을 재분배하는 유전자코드엔지니어링 방법을 이용하여 제조된 L-DOPA가 도입된 녹색형광단백질(green fluorescent protein; GFP)은 구리와 같은 중금속 이온에 대한 형광 소광(quenching)이 기존의 형광단백질에 비해 현저히 높게 나타나고, 상기 L-DOPA가 도입된 형광단백질은 NaIO₄를 처리하면 손쉽게 고정화 또는 컨쥬게이션시킬 수 있으므로, L-DOPA가 도입된 형광단백질을 이용한, 2가 금속 이온, 특히 구리 이온을 검출하는 신규한 바이오센서에 관한 것이다.

Description

Ｌ―３，４―디하이드록시페닐알라닌이 도입된 형광단백질을 이용한 금속 탐지 바이오센서 {Fluorescent protein containing L―３，４―dihydroxyphenylalanine as a metal biosensor}

본 발명은 중금속 이온 검출용 바이오센서, 상기 바이오센서의 제조방법 및 상기 바이오센서를 이용한 중금속 이온의 검출방법에 관한 것으로, 구체적으로 유전자코드엔지니어링(genetic code engineering)을 이용하여 제조된 L-3,4-디하이드록시페닐알라닌(3,4-dihydroxyphenylalanine; L-DOPA) 도입 녹색형광단백질(green fluorescent protein; GFP)을 포함하는 구리 이온 검출용 바이오센서, 이의 제조방법 및 상기 바이오센서를 이용한 구리 이온 검출방법에 관한 것이다.

구리는 산화적 소기 메커니즘에서 금속 보조인자로서 결정적인 역할을 하는 인체에 있는 중요한 전이 금속 이온이다(비특허문헌 1). 그러나, 구리의 불균형은 메켄(Menkes), 알츠하이머(Alzheimer's), 윌슨씨(Wilson's) 질환과 같은 병리학적 결과를 야기한다(비특허문헌 2). 게다가, 구리는 산업공정에서 생물부착방지도료(anti-fouling agent)로서 널리 사용되고 환경의 중금속 이온 오염에서 주성분 중 하나이다(비특허문헌 3).

원자흡수분광법(atomic absorption spectroscopy), 유도결합 플라스마 질량분석기(inductively coupled plasma mass spectrometry) 및 전기화학(electrochemistry)과 같은 현재 이용가능한 방법은 생물학적 및 환경적 시료에서 구리 수준을 결정하기 위해서 매우 복잡하다. 상기 방법에서, 시료는 상기 분석 동안 파괴될 수 있으므로, 이런 방법들은 현장 구리 검출을 위해 부적합하다(비특허문헌 4).

최근까지, 많은 소분자 기초 센서, 킬레이터 기초 센서, 효소 및 전기화학적 기술이 구리 수준을 측정하기 위해 개발되어왔다. 이런 기술들은 결합 요소가 신호를 발생시키기 위해 리포터 분자로 변형되어야 하는 주요한 제한을 가지고 있다(비특허문헌 3).

한편, 센서 도구로서 단백질을 전환시키는 것(단백질 센서)이 많은 관심을 받고 있으며, 최근 몇몇 그룹은 구리 바이오센서로서 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)를 사용하는 것이 시도되었다(비특허문헌 5).

최근에, 시험관내(in vitro) 바이오 감지 시스템은 다양한 유전공학 및 구리 농도에 대한 형광 소광(quenching)을 야기하는 직접적 변화 접근을 통해 GFP내로 구리 결합 부위를 도입함으로써 개발되었다. 상기 기재된 시스템에서 대부분의 경우, 금속 결합 특성은 GFP에서 자연적으로 발생하는 아미노산을 히스티딘 잔기로 치환함에 의해 획득하고 풍부해졌다(비특허문헌 6). 그러나, Cu² ⁺이온쪽으로 GFP의 민감성 및 선택성이 여전히 비효율적이고 아직 개발되지 않았다는 것이 언급할 가치가 있는 것이다. 유사하게, 붉은 형광 단백질(red fluorescent protein, DsRed) 또한 금속 바이오센서로서 보고되었다(비특허문헌 7). 상기 DsRed의 고유한 금속 결합 특성은 흥미로운 것이다.

그러나, 이것은 긴 성숙 시간, 낮은 발현량 및 낮은 배수의 효율과 같은, 주요한 결점을 가지고 있다(비특허문헌 8). 이런 이유로, 생물학적 상황에서 구리를 모니터링하기 위한 단순하고 선택적인 생분석 도구를 개발하는 것은 화학생물학에서매우 도전적인 것이다.

최근에 비자연적 아미노산 내에 내포된 신규한 기능의 유전적 도입은 새롭고 증진된 특성을 가지는 표적 단백질을 고안 및 다루기 위해 필수적인 요구가 되었다. 그러므로, 자연적으로 발생하는 아미노산에서 이용가능한 것들로부터 유래한 신규 작용기 부분을 도입하기 위해 단백질 내로 비 정준형 아미노산(non canonical amino acid, NCAA)의 융합을 위해 많은 노력이 있었다. 종종, 센스 코돈(유전자코드엔지니어링)(비특허문헌 9) 및 비-센스 억제(부위-특이적 통합)(비특허문헌 10)와 같은 두 개의 실험적 접근은 재조합 단백질 내로 NCAA의 생체내(in vivo) 융합을 위해 사용되었다.

한편, 2가의 전이 금속 이온은 카테콜아민(catechol amine)과 강한 상호작용을 가지는 것으로 잘 알려져 있다. L-DOPA는 분자의 카테콜레이트(catecholate)(O, O) 또는 아미노산(O, N) 부분 중 어느 하나를 통해 이좌배위자 리간드(bidentate ligand)로서 금속 이온과 조화될 수 있는 중요한 카테콜아민이다(비특허문헌 11).

이에, 본 발명자들은 녹색형광단백질(GFP) 내로 금속 킬레이트 NCAA인 3,4-디하이드록시-L-페닐알라닌(3,4-dihydroxy-L-phenylalanine; L-DOPA)를 도입함으로써, 새로운 형광을 기초로 하는 구리 이온 검출용 바이오센서를 제작함으로써, 본 발명을 완성하였다.

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본 발명의 목적은 L-3,4-디하이드록시페닐알라닌(3,4-dihydroxyphenylalanine; L-DOPA)가 도입된 형광단백질을 포함하는 중금속 이온, 특히 구리 이온의 검출용 바이오센서, 상기 바이오센서의 제조 방법, 및 상기 바이오센서를 이용한 생물학적 및 환경적 시료 내에 포함된 중금속 이온, 특히 구리 이온을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 L-3,4-디하이드록시페닐알라닌(3,4-dihydroxyphenylalanine; L-DOPA)가 도입된 형광단백질을 포함하는 중금속 이온 검출용 바이오센서를 제공한다.

또한, 본 발명은

1) L-DOPA가 포함된 형광단백질을 과요오드산염(NaIO₄)으로 전처리하는 단계; 및

2) 전처리된 L-DOPA가 도입된 단백질을 기판에 고정시키는 단계를 포함하는, L-DOPA가 도입된 형광단백질을 포함하는, 중금속 이온 검출용 바이오센서를 제조하는 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) L-DOPA가 포함된 형광단백질을 고정화시킨 바이오센서에 피검시료를 처리하는 단계; 및

2) 상기 바이오센서의 L-DOPA가 도입된 형광단백질에 결합된 중금속 이온을 확인하는 단계를 포함하는, 피검시료 내 중금속 이온을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 L-3,4-디하이드록시페닐알라닌(3,4-dihydroxyphenylalanine; L-DOPA)가 도입된 형광단백질을 이용한 바이오센서에 관한 것으로, 형광단백질이 이가 중금속 이온, 특히 구리 이온과 결합하면 형광이 없어지는 형광 소광(quenching) 현상이 일어나므로 중금속 이온을 검출할 수 있고, 이런 형광단백질에 L-DOPA를 도입한 결과 중금속 이온 검출 능력이 현저히 증가시킬 수 있으며, L-DOPA를 도입하면 L-DOPA에 NaIO₄를 처리하면 손쉽게 고정화시킬 수 있으므로, 본 발명은 이가 중금속 이온, 특히 구리 이온을 센싱하는 특징과 손쉽게 고정화되는 특징을 모두 갖는 L-DOPA-도입 형광단백질을 이용하여 새로운 형광을 기초로 하는 바이오센서를 제조하는 방법을 제공한다.

도 1은 GFPdopa 단백질에서 다양한 이가 금속 이온의 형광 소광 효과를 나타내는 그래프이다. GFPdopa의 형광 강도는 금속 이온을 포함하지 않는 시료의 형광 강도에 의해 시료내 형광 강도를 구분함으로써 정규화시켰다. 각 금속 이온은 1 mM 농도로 3 uM의 GFPdopa 단백질과 반응시켰다. 각 실험은 3번 반복하였다.
도 2a는 GFP 및 GFPdopa의 형광 방출에 대한 다양한 이가 금속 이온의 효과를 나타내는 그래프이다. 각 금속 이온(0.1 mM)은 GFP 및 GFPdopa 각각의 단백질과 함께 반응시켰다. 도 2b는 GFP 및 GFPdopa에 대해 다양한 농도의 Cu²⁺을 첨가함으로써 생성시킨 검정곡선(calibration curve)을 나타내는 그래프이다. 도 2c는 (●) 25℃, (■) 30℃, (▲) 45℃ 온도에서 구리 이온의 존재 하에 생성된 Stern-Volmer 플랏을 나타내는 그래프이다. 도 2d는 구리 이온의 존재 하에 GFP 및 GFPdopa의 원형이색성(Circular dichroic, CD) 프로파일을 나타내는 그래프이다.
도 3은 다양한 농도의 Cu²⁺ 이온 존재 하에서 515 nm에서 여기(excitation)에 의해 획득된 GFPdopa의 적정과 GFPdopa의 Cu²⁺ 방출 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
도 4는 GFPdopa(■) 및 구리의 존재 하에 GFPdopa(●)의 UV-시각화 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
도 5는 연속된 분취의 Cu²⁺ 및 EDTA를 첨가한 후 모니터링한 GFPdopa의 형광 강도를 나타내는 그래프이다. GFPdopa의 용액을 평형화(5분)가 될 때까지 100 uM 구리와 반응시킨 다음, 구리 이온을 복합체화하기 위해 EDTA를 첨가하였다. 상기 강도를 초기 강도로 정규화시켰다. 상기 실험은 3번 반복하였다.
도 6a는 GFP내 발색단 상호작용 부위를 나타내는 그림이다. 도 6b는 GFPdopa와 Cu²⁺의 바이오센싱 상호작용을 나타내는 그림이다. 도 6c는 GFPdopa 및 돌연변이 변이체 사이의 형광 강도를 다양한 농도의 Cu²⁺을 첨가함으로써 모니터링된 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 GFP 변이체 단백질에서 부위 특이적 및 전반적으로 통합된 L-DOPA를 니켈 친화성 크로마토그래피 컬럼으로 정제한 결과를 나타내는 그림이다.
도 8a는 다양한 농도의 Cu²⁺을 첨가함으로써 NaIO₄ 처리된 GFPdopa의 상대적인 형광 강도를 나타내는 그래프이다. 도 8b는 아민 물질로 변형된 표면에 GFPdopa 단백질의 형광 이미지 및 마이크로패턴의 강도를 나타내는 그림이다. 이때, A는 Cu²⁺으로 처리하기 전 형광 이미지이고, B는 Cu²⁺으로 처리한 후 형광 이미지이며, C는 Cu²⁺으로 처리한 후 EDTA를 첨가한 형광 이미지이다. 도 8c는 GFPdopa 기초 단백질 바이오센서의 밀도계측 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 EDTA 첨가 후 모니터링된 GFPdopa의 형광 강도를 나타내는 그래프이다. 상기 강도는 초기 형광 강도(대조군 단백질의 형광)로 정규화시켰다. 상기 실험은 3번 반복하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 L-3,4-디하이드록시페닐알라닌(3,4-dihydroxyphenylalanine; L-DOPA)가 도입된 형광단백질을 포함하는 중금속 이온 검출용 바이오센서를 제공한다.

상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein; GFP)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 타이로신(tyrosine)을 포함하는 형광단백질은 모두 사용가능하다.

상기 중금속 이온은 이가 금속 이온인 것이 바람직하며, 구리 이온인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않으며, K⁺, Mg² ⁺, Ca² ⁺, Na⁺ 또는 Mn² ⁺중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 L-DOPA가 도입된 형광단백질은 유전자 코드 엔지니어링(genetic code engineering)을 이용하여 형광단백질 내 L-DOPA를 도입된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 L-DOPA가 도입된 형광단백질은 구체적으로 다음과 같은 단계를 포함하는 제조방법으로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

1) 아미노산 서열에서 타이로신(tyrosine)을 하나 이상 포함하는 단백질을 발현하는 타이로신 영양요구주(auxotroph)를 준비하는 단계;

2) 상기 타이로신 영양요구주를 타이로신이 결핍된 배지에 배양하는 단계;

3) 상기 배지에 L-DOPA를 첨가한 후 배양하는 단계; 및

4) 배양된 영양요구주로부터 아미노산 서열에서 타이로신 대신에 L-DOPA가 포함되어 있는 형광단백질을 선별하는 단계.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 타이로신 영양요구주는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 숙주 타이로신 영양요구주에 형질전환시킨 형질전환체인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 타이로신 영양요구주는 대장균(E. coli) JW2581 타이로신 영양요구주인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 바이오센서는 유리 기판; 상기 기판상에 적층된 실리콘 기판; 및 상기 실리콘 기판에 고정화된 L-DOPA가 포함된 형광단백질을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 L-DOPA가 도입된 형광단백질을 포함하는 중금속 이온 검출용 바이오센서를 제조하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 바이오센서의 제조방법은

2) 전처리된 L-DOPA가 도입된 형광단백질을 기판에 고정시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

구체적으로, 상기 바이오센서의 제조방법은

1) 기판에 고분자층을 적층한 후, 패터닝하는 단계;

2) 상기 패터닝된 고분자층에 마이크로 유체 채널을 형성하는 단계; 및

3) 상기 마이크로 유체 채널에 과요오드산염(NaIO₄)으로 전처리된 L-DOPA가 도입된 형광단백질을 적재함으로써 상기 채널에 L-DOPA가 도입된 형광단백질을 고정시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 제조방법에 있어서, 기판은 유리 기판인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 유리, PMMA, PS 또는 PDMS 기판이 모두 사용가능하다.

상기 제조방법에 있어서, 고분자층은 폴리디메틸실록산(Polydimethylsiloxane, PDMS)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 제조방법에 있어서, 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein; GFP)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 타이로신(tyrosine)을 포함하는 형광단백질은 모두 사용가능하다.

상기 제조방법에 있어서, 중금속 이온은 이가 금속 이온인 것이 바람직하며, 구리 이온인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않으며, K⁺, Mg² ⁺, Ca² ⁺, Na⁺ 또는 Mn²⁺ 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 L-DOPA가 도입된 형광단백질을 포함하는 바이오센서를 이용한 중금속 이온 검출 방법을 제공한다.

구체적으로,

1) 본 발명에 따른 바이오센서에 피검시료를 처리하는 단계; 및

2) 상기 바이오센서의 L-DOPA가 도입된 형광단백질에 결합된 중금속 이온을 확인하는 단계를 포함하는, 피검시료 내 중금속 이온의 검출 방법을 제공한다.

상기 검출 방법에 있어서, 피검시료는 생물학적 또는 환경적 시료인 것이 바람직하며, 조성물 또는 화합물일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

상기 검출 방법에 있어서, 중금속 이온의 확인은 가시적(visually), 광학적(optical) 또는 전기화학적(electrochemically) 방법을 통해 수행될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

상기 검출 방법에 있어서, 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein; GFP)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 타이로신(tyrosine)을 포함하는 형광단백질은 모두 사용가능하다.

상기 검출 방법에 있어서, 중금속 이온은 이가 금속 이온인 것이 바람직하며, 구리 이온인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않으며, K⁺, Mg² ⁺, Ca² ⁺, Na⁺ 또는 Mn² ⁺ 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 한가지 실시예에서는 유전자 코드 엔지니어링(genetic code engineering)을 이용하여 GFP내 L-DOPA를 도입함으로써 단백질 바이오센서(biosensor)를 제조하였다(개요도 1 참조).

하기 개요도 1은 유전자 코드 엔지니어링(genetic code engineering method)을 이용한 단백질 바이오센서의 제조를 위한 접근 방법을 나타낸다.

본 발명의 한가지 실시예에서는 바이오 센싱 활성을 책임지는 작용 부위를 유전자 코드 엔지니어링을 확장하여 조사하였다. 이때, L-DOPA의 융합은 기존에 알려진 방법(비특허문헌 12 참조)과 같이, 산화환원반응 염색(redox staining) 및 LC-MS/MS 및 ESI-MS 분석을 기초로 하는 질량 이동(mass shift)에 의해 확인하였다.

본 발명의 한가지 실시예에서는, 초기 테스트로서 MOPS 완충용액에서 GFP 및 GFPdopa 단백질에 대한 높은 농도(1 mM)(도 1 참조) 및 낮은 농도(0.1 mM) 수준의 K⁺, Mg² ⁺, Ca² ⁺, Na⁺, Mn² ⁺ 및 Cu² ⁺와 같은 다양한 이가 금속 이온의 효과를 평가하였다(도 2a 참조). 그 결과, GFP 및 GFPdopa의 형광은 높거나 낮은 농도의 K⁺, Mg² ⁺, Ca²⁺, Na⁺ 및 Mn² ⁺ 금속 이온의 존재 하에서 약간 영향을 받았다. 그러나, 0.1 mM 농도의 Cu² ⁺의 첨가는 GFPdopa 단백질의 형광을 완벽하게 소멸시켰다. 대조적으로, GFP는 0.1 mM 농도의 Cu² ⁺의 첨가 후 75% 이상의 형광이 유지되었다. 테스트된 금속 이온들 중에서, GFPdopa는 오로지 Cu² ⁺ 금속 이온과 선택적으로 형광 소광(fluorescence quenching)을 보였다. Cu² ⁺ 이온과 GFPdopa의 결합은 형광 여기 및 방출 최대에서 어떠한 파장 변화를 보이지 않았다(도 1 참조). 그러나, Cu² ⁺ 이온과 GFPdopa의 결합은 구리 농도에 대하여 형광 방출 강도의 감소를 야기하였다. 구리 농도에 대한 형광 소광의 양을 프랏팅함으로써 GFP 및 GFPdopa에 대한 검정 곡선(calibration curve)을 나타내었다(도 2b 참조). 그 결과, 20 uM의 구리 농도는 GFPdopa 형광의 50% 소광을 나타내었다. 그럼에도 불구하고, 100 uM의 구리 농도로 처리될 때 완벽한 형광 소광을 나타내었다. 한편, 100 uM의 Cu² ⁺ 존재 하에서 GFP의 75% 이상의 형광 강도가 유지되는 것으로 나타났다. 한편, GFPdopa의 해리상수는 Cu² ⁺ 이온에 대해 높은 친화성을 나타내는 5.6±0.3 uM인 것으로 확인되었다. 구리 해리 상수는 붉은 형광 단백질과 유사하고 Rmu13, drFP583 및 gRF 보다 낮은 수치였다(비특허문헌 13 및 14 참조).

또한, 본 발명의 한가지 실시예에서는, 형광 소광의 메커니즘을 확인하기 위해, 다양한 온도에서 다양한 농도의 Cu² ⁺의 첨가에 따른 GFPdopa 단백질의 형광을 측정함으로써 Stern-Volmer 플랏을 생성시켰다(도 2d 참조). GFPdopa의 소광 상수는 온도의 증가에 대하여 감소하였다(도 2c 참조). 이는 상기 소광이 충돌 소광(collisional quenching)이 아니고, 구리 및 GFPdopa 단백질 사이의 상호작용에 기인하는 정적 소광(static quenching)에 의한 것임을 제시하는 것이다.

또한, 본 발명의 한가지 실시예에서는, 상기 정적 소광의 메커니즘을 입증하기 위해, Cu² ⁺의 존재 및 부재 하에서 각각 GFPdopa 단백질의 UV 흡수 스캔을 수행하였다. 일반적으로, 충돌 소광은 형광단(fluorophore)의 흥분 상태(excited state)만 영향이 미치는 반면에, 정적 소광은 형광단의 바닥 상태(ground state)에 영향이 미친다(비특허문헌 15 참조). 정적 소광의 결과로서, GFPdopa의 흡수 스펙트럼이 구리의 부재 하에서 단백질과 비교하여 Cu² ⁺의 존재 하에서 영향을 받지 않았다(도 4 참조). GFPdopa의 형광 회복은 에틸렌 디아민 테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)의 존재 하에서 평가하였다. 소광 후, 70% 이상의 GFPdopa 형광이 평형화의 5분에서 회복되었다(도 5 참조). 이는 평형화 조건에서, 교환가능한 구리의 반복되고 재생가능한 모니터링이 GFPdopa를 이용하여 가능하다는 것을 제시하는 것이다.

또한, 본 발명의 한가지 실시예에서는, 구리의 결합이 GFPdopa의 구조 및 형태에 영향을 미치는지 원편광 이색성 분광 측정법(circular dichroism)을 통해 조사하였다. 일반적으로, GFP는 11 베타 플레이트 시트(11 β beta-pleated sheet)로 구성되는 독특한 β 구조를 가지고 있다. 그러므로, 약 215-216 nm에서 다수의 급격한 음성 굴절이 CD 스펙트럼 분석 동안 관찰되었다. GFPdopa의 이색성 프로파일은 구리로 처리한 후 여전히 동일하게 남아있는 단백질의 전체적 이차 구조를 확인하였다. 상기 결과, 관찰된 GFPdopa에서 형광 소광은 단백질의 구조적 또는 형태적 변화 때문이 아닌 것을 제시하였다(도 2d 참조).

이런 결과를 종합하여 보면, 구리가 GFPdopa의 DOPA 부분에 결합하고, GFPdopa는 구리에게 전자를 제공하고 비-형광의 바닥 상태 복합체를 형성하는 것을 알 수 있다. 구리 이온은 L-DOPA의 곁사슬에 존재하는 아미노카르복실레이트(aminocarboxylate) 및 카테콜(catechol) 기의 조화를 선호하는 것을 알려져 있다(비특허문헌 11 참조). 이런 작용기들은 형광 소광을 야기하는 Cu² ⁺과 GFPdopa의 결합을 지지할 수 있다.

또한, 본 발명의 한가지 실시예에서는, GFP에서 가능한 Cu²⁺ 결합 부위를 알아보기 위해, 현재 GFP 변이체의 결정 구조를 이용할 수 없기 때문에, 상동성 모델링에 의해 GFP의 3-D 모델 구조를 만들었다. 에너지 최소화 모델을 기초로 하여, His148 및 Tyr92과 같은 두 개의 잔기가 바이오 센싱에서 중요한 역할을 할 수 있는 것으로 추정하였다. 이런 잔기들은 모두 GFP 발색단과 직접적으로 관련성이 있다. 상기 Tyr92는 Gln94 및 His148 잔기가 발색단 잔기와 직접적으로 상호작용하는 것을 통해 발색단과 상호작용한다(도 6a 참조). 이런 두 쌍(DOPA66-His148 상호작용 및 DOPA92-DOPA66 상호작용)에서 L-DOPA의 대체는 구리와 발색단의 결합을 지지하고, 정적 소광을 야기한다. 이를 조사하기 위해, 유전자 코드 방법을 확장하여 원하는 위치에 L-DOPA를 도입한 다양한 돌연변이를 제조하였다. 이런 목적을 위해, 앰버 돌연변이(amber mutation)는 Tyr66(GFP_Y66dopa) 및 Tyr92 위치(GFP_Y92dopa)에 도입하였고 L-DOPA는 조작된 Methanococcus jannaschii tRNATyr/tyrosyl-tRNA 합성효소를 이용하여 부위 특이적으로 융합시켰다. 유사하게 페닐알라닌에 대해 Tyr92에서 점 돌연변이(GFP_dopaY92F)를 도입하였고 남아있는 Tyr 잔기들을 유전자 코드 엔지니어링 방법을 통해 L-DOPA로 변형시켰다(도 7 참조). 본 발명자들은 Tyr66 및 Tyr92 위치에 이중 앰버 돌연변이를 도입(GFP_Y66Y92dopa)하였으나, 직각의 tRNA/합성효소 시스템의 낮은 효율 때문에 단백질과 두 개의 앰버 돌연변이를 제공하는데 실패하였다. LC-MS/MS 분석은 돌연변이 단백질에서 L-DOPA의 부위 특이적 융합을 확인하였고(표 1 참조), 구리 센싱 분석을 상기 돌연변이 단백질로 수행하였다. GFP_Y66dopa 변이체는 GFP 및 GFP_dopaY92F 변이체 보다 높은, GFPdopa 보다는 낮은 구리 센싱 활성을 보였다. 이는 발색단 Y66dopa가 오로지 Cu²⁺ 바이오센싱 활성과 관련된 것이 아닐 수 있음을 제시하는 것이다. 대조적으로, GFP_Y92dopa는 GFP_Y66dopa일 때 더 높은 구리 센싱 활성을 보였다. 흥미롭게도, 페닐알라닌이 도입된 GFP_dopaY92F 돌연변이는 GFP_Y92dopa 및 GFP_Y66dopa 돌연변이와 비교할 때, 낮은 구리 센싱 활성을 보였다. 상기 구리 센싱 활성을 기초로 하여, 발색단 잔기 DOPA66 및 상호작용 잔기 DOPA92가 GFPdopa가 구리 센싱 활성을 유지하기 위해 중요한 것임을 알 수 있다. 또한, 바이오센싱 활성은 구리 결합이 DOPA92 잔기를 약간 선호하는 것을 제시하였다. 구리가 단백질의 발색단(DOPA66)에 가까이 있는 것은 발색단으로부터 구리에 전자를 제공하게 하며, 이는 강한 형광 소광을 야기한다. 따라서, GFP의 다중 부위에서 L-DOPA의 상호의존적 효과는 효율적인 Cu²⁺ 바이오센싱 활성을 위해 필수적인 것임을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 한가지 실시예에서는, GFPdopa 단백질과 미세제작 장치(microfabricated device)를 통합하여 바이오센서를 제작하였다. 단백질 바이오센서를 제작하기 위한 결정적인 단계는 그것의 구조적 및 기능적 특성의 변화없이 장치내 센서 단백질을 고정시키는 것이다. 이런 관점에서, DsRed 및 GFP을 각각 폴리아크릴아마이드 기질 및 졸-겔(sol-gel) 내에 캡슐화하였다(비특허문헌 18). 그러나, 졸-겔 고정의 각 유형은 그 자체의 장단점을 가지고 있다. 최근에, 본 발명자들은 L--DOPA를 포함하는 단백질이 선택적으로 산화되고, 아민을 포함하는 다당류와 공유적으로 결합할 수 있다는 입증하였다(비특허문헌 12). 이는 단백질 바이오센서를 개발하기 위한 GFPdopa의 중요한 특징이다. 그러므로, 이런 노력은 bioMEMS를 기초로 하는 바이오센싱 적용의 실행가능성을 위한 GFPdopa 단백질의 용도를 확장하게 하였다. 아민으로 코팅된 물질 위에 GFPdopa 단백질의 고정을 위해, NaIO₄에 의한 GFPdopa에서 DOPA 산화를 통해 선택적으로 생성될 수 있는 오쏘-퀴논(o-quinone)이 요구된다. 본 발명자들은 퀴논의 형성이 GFPdopa의 Cu² ⁺ 센싱 활성을 방해할 수 있음을 알 수 있었다. 그러므로, 다양한 농도의 구리에 대해 NaIO₄ 처리된 GFPdopa를 기초로 생성된 검정곡선을 분석하였다. 형광 강도는 Cu² ⁺ 농도에 따라 선형으로 소광하였으며(도 8a 참조), 상기 형광은 EDTA로 평형화할 때 즉시 회복하였다(도 9 참조). NaIO₄ 처리된 GFPdopa의 해리상수는 NaIO₄의 부재 하에 GFPdopa와 유사한 4.3±1.1 uM으로 확인되었다. 이는 NaIO₄의 처리 후 GFPdopa 단백질이 Cu² ⁺에 대한 바이오센싱 활성을 유지하는 것을 제시하는 것이다. 본 발명자들은 바이오센싱 활성이 표면에 노출된 DOPA(DOPA151, DOPA182, DOPA200 및 DOPA237)가 NaIO₄ 처리 동안 오쏘-퀴논으로 전환될 수 있는 방법에서 그대로 유지될 수 있음을 알 수 있었다. 반대로, 내부적으로 포함된 DOPA(DOPA66 및 DOPA92)은 NaIO₄의 접근 가능성이 없기 때문에 오쏘-퀴논으로 전환될 수 없으며, 어떠한 변형 없이 DOPA 부분으로 존재할 것임을 알 수 있었다. Cu² ⁺과 상호작용하고 형광 소광을 야기하는 것은, 표면 노출된 DOPA 및 내부적으로 포함된 DOPA 모두가 오쏘-퀴논으로 전환될 수 있고 퀴논의 형성은 구리와 직접적으로 상호작용하고 형광 소광을 야기할 수도 있음을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 한가지 실시예에서는, bioMEMS 기초로 하는 바이오센서를 제조하기 위해, 어레이를 기초로 폴리디메틸실로산(polydimethylsiloxane ; PDMS)과 같은 유연성 있는 엘라스토머(elastomer)로 리소그라피(lithography)를 사용하였다(비특허문헌 17). 자기 조립화된 아민 층을 가진 마이크로 접촉 프린팅(uCP)은 GFPdopa의 제작을 위해 사용되었다. 이를 위해, 본 발명자들은 우선 PDMS microstamp를 GFPdopa 용액에 30분 동안 담근 후 마이크로 접촉 프린팅을 이용한 아민 코팅 슬라이드에 이동시킴으로써 단백질을 지지시켰다. 마이크로패턴화된 단백질을 형광 현미경 하에 관찰하였다. 패턴 크기는 동일하였고 높은 신뢰성 모양으로 아민 슬라이드에 GFPdopa의 제작을 확인하였다. 이때, GFPdopa가 유리 슬라이드 위해 원래의 기능을 유지하는 것을 나타내는 강한 형광 신호를 유지하였다.

또한, 본 발명의 한가지 실시예에서는, 제조된 바이오센서의 단백질 센서의 수행을 평가하기 위해, GFPdopa 슬라이드를 5분 동안 Cu² ⁺ 용액(100 uM)과 함께 반응시킨 후 형광 현미경 하에 관찰하였다. 그 결과, 형광 신호는 구리 이온의 첨가 후에 완전히 소광되었다(도 8b의 B 참조). 또한, 슬라이드는 5분 동안 EDTA로 평형화시킨 후, 형광 현미경에서 동일한 조건에서 관찰하였다. 그 결과, GFPdopa의 원래의 형광 방출이 즉시 회복되었다(도 8b의 C 참조). 또한, Scion Image PC 소프트웨어 패키지를 이용하여 형광 회복을 정량화하였다. 그 결과, GFPdopa의 원래의 형광 강도의 94%가 회복된 것을 나타내었다(도 8c 참조). 이런 유의적인 차이는 GFPdopa가 Cu² ⁺ 검출을 위한 선택적이고 민감한 바이오센서를 수행할 수 있는 것을 명백히 제시하는 것이다.

결론적으로, 본 발명은 가역성 방식으로 Cu² ⁺에 특이적으로 결합하는 센싱 요소로서 L-DOPA를 포함하는 단백질을 특정하였다. 일반적으로, 환경적으로 오염된 시료 및 생물학적 시료에서 구리의 농도는 밀리몰랄(milimolar) 내지 마이크로몰랄(micromolar) 범위 내에서 발견된다(비특허문헌 3). GFPdopa의 독특한 형광 소광 및 회복, 및 간편한 제작 방법은 환경 시료 내 구리 센싱에 적용할 수 있을 뿐만 아니라 구리 검출을 위한 신규한 분자 진단 도구를 개발하는데 적용될 수 있다. 게다가, 이것은 단백질 농도를 낮추거나 더 민감한 형광 분광형광계를 이용함으로써 개발될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정하는 것은 아니다.

L- DOPA 도입 단백질의 제조

<1-1> 플라스미드 및 균주의 제조

DNA 조작은 Sambrook and Russel에 기재된 절차에 따라 수행하였다(비특허문헌 18 참조). PCR 반응(50 ㎕)은 10 pM의 각 프라이머, 50 ng의 주형 DNA, 1X Taq DNA 중합효소(polymerase) 완충용액, 1 U of Taq DNA 중합효소(Promega, Madison, WI, USA), 0.2 mM의 각 디옥시리보뉴클레오티드 삼인산(deoxyribonucleotide triphosphates) 및 1.5 mM MgCl₂을 이용하여 수행하였다. 증폭은 초기 변성(94℃에서 1분 동안) 이어서 94℃에서 1분, 60℃에서 1분 및 72℃에서 0.5분의 30 사이클, 72℃에서 10분 동안의 연장으로 프로그램된 DNA 열순환기(Master Gradient thermal cycler, Eppendorf, Hamburg, Germany)에서 수행하였다. 8개의 타이로신 잔기를 포함하는 GFPhs2를 포함하는 pQE-60를 BamH1 및 HindIII 제한효소를 이용하여 플라스미드 pQE-80 L(Qiagen)(Valencia, CA, USA) 내에 클로닝함에 의해 제작하였다(비특허문헌 19 참조). 이때, PCR 시약, T4 DNA 리가아제 및 제한 엔도뉴클레아제는 Promega(Madison, WI, USA)에서 구입하였다. 그런 다음, 상기 제작된 pQE80-GFPhs2 (이하, GFP로 기재한다) 플라스미드를 자연 및 비자연적 재조합 단백질의 생산을 위해, E. coli JW2581 타이로신 영양요구주(E. coli Genetic Stock Centre, Yale University, New Haven, USA) 내로 형질전환시켰다. 이런 컨스트럭트를 서열분석하였으며, 이의 표적 단백질 서열을 확인하였다. 플라스미드를 포함한 E. coli 세포는 형질전환체의 선별을 위한 적절한 항생제가 첨가된, Luria-Bertani (LB) 배지(Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA) 또는 LB 아가 플레이트에서 호기성으로 성장하였다.

<1-2> 녹색 형광 단백질 내로 L- DOPA 의 도입 확인

상기 실시예 <1-1>에서 제작된 컨스트럭트를 0.4% (w/v)의 글루코즈, 0.1 mM의 CaCl₂, 1.0 mM의 MgSO₄, 35 ㎍/mL의 티아민(thiamine), 20개의 아미노산(40 mg/L) 및 적절한 항생제를 첨가한 M9 최소 배지에서 성장시켰다. 상기 배양액의 광학 밀도는 OD₆₀₀에서 0.8 내지 1.0에 달하는 경우, 4℃에서 10분 동안 원심분리(5,000 rpm)를 수행하였다. 세포 펠렛을 0.9%(w/v)의 NaCl 용액으로 두 번 세척하였다. 그런 다음, 상기 세포를 타이로신이 결핍된 19개의 아미노산(40 mg/L)이 첨가된 M9 최소 배지에서 재현탁시켰다. 상기 재현탁된 세포를 양성 대조군으로서 L-타이로신(40 mg/L)을, 시험군으로서 L-DOPA(1 mM)가 첨가된 M9 최소 배지를 포함하는 배양 플라스크에 각각 첨가하였다. 이때, 자연적 아미노산과 L-DOPA는 모두 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 10분 동안 37℃에서 배양한 후, 1 mM의 이소프로필-D-티오갈락토피라노사이드(isopropyl-D-thiogalactopyranoside; IPTG)(sigma chemicals)(St. Louis, MO, USA)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 단백질 발현유도 6시간 후, 세포를 채취하였으며 OD₆₀₀을 측정하였다. 원심분리에 의해 채취된 세포를 사용할 때까지 -70℃에서 저장하였다. BugBuster 단백질 추출 키트(Novagen) 및 이어서 초음파 처리를 이용하여 세포용해를 수행하였다. 1 mL의 배양액에 상응하는 채취된 세포 펠렛을 100 ㎕의 용해 완충용액에 재현탁한 후 10분 동안 상온에서 배양한 다음, 20분 동안 9000g, 4℃로 원심분리하였다. 상청액을 수용성 단백질 분획으로 제공하였으며, SDS-PAGE(12% 아크릴아마이드 겔)로 분석하였다.

<1-3> L- DOPA 도입 녹색 형광 단백질의 정제

E. coli 타이로신 영양요구주 내 pQE80-GFP를 100 mL M9 배지에서 0.6의 OD₆₀₀로 성장시킨 후, 6시간 동안 1 mM IPTG로 유도한 다음, 펠렛화시켰다. 단백질의 정제는 니켈니트리로트리아세트산(nickelnitrilotriacetic acid; Ni-NTA) HisBind Resin(Novagen)을 이용하여 Ni-NTA 친화성 컬럼(Qiagen)(Valencia, CA, USA) 및 겔 투과 크로마토그래피(gel permeation chromatography; GPC)을 통해 수행하였다. Histag 정제 샘플은 4℃에서 Superdex 75 HR를 포함하는 AKTA Explorer FPLC 시스템에 의해 겔 투과 크로마토그래피(GPC) 정제를 수행하였다.

<1-4> L- DOPA 도입 녹색 형광 단백질의 정량 및 형광 분석

단백질의 농도는 Bradford 분석법을 이용하여 정량하였다. 대조군 및 시험군 단백질의 형광 스펙트럼은 디지털 소프트웨어가 장착된 Perkin Elmer LS-55 분광형광계(spectrofluorimeter)로 측정하였다.

L- DOPA 도입 단백질 친화성 금속 이온의 스크리닝

<2-1> 형광분광측정법을 통한 금속 바이오- 센싱

금속 이온 스크리닝은 0.1 mM 및 1 mM의 K⁺, Mg² ⁺, Ca² ⁺, Na⁺, Mn² ⁺ 및 Cu² ⁺과 같은 다른 금속 이온을 가지는 3 uM의 GFP 및 GFPdopa를 각각 포함하는 MOPS(4-morpholinepropane sulfonic acid, pH 7.2) 완충용액에서 수행하였다. 사전에, 임의의 미량 금속을 제거하기 위해 MOPS 완충용액을 Chelex-100 컬럼으로 통과시켰다. 형광 측정은 winlab 소프트웨어가 장착된 Perkin Elmer LS-55 분광형광계로 측정하였다. 또한, 구리 농도에 대한 형광 소광의 양을 프랏팅(plotting)함으로써 GFP 및 GFPdopa에 대한 검정 곡선(calibration curve)을 나타내었다

<2-1> 구리 적정 및 해리 상수 결정

구리 적정 실험은 단백질의 결합 상수를 결정하기 위해 수행하였다. Cu² ⁺결합 연구를 수행하기 위해, 100 uL 농도의 구리 용액을 100 uL의 GFP 및 GFPdopa 단백질(3 uM)에 첨가하였다. 형광 스펙트럼은 GFP 및 GFPdopa에 대해 505 및 515 nm에서 시료를 흥분시키고, 각각 515-530 nm 사이의 방출을 야기하는 것으로 기록함으로써, 분광형광계에서 획득하였다. 이런 실험은 각 포인트를 위해 표준편차를 계산하기 위해 반복수행하였다. 형광 판독은 [ΔF/ΔF0]로 나타내고, 이는 하기 [일반식]을 이용하여 산출하였다.

[일반식]

,

여기서, △F는 측정된 형광의 변화이고, △Fmax는 최대의 형광 변화이며, [P]는 총 단백질 농도이고, Kd는 구리 결합 부위의 해리 상수이며, [Cu² ⁺]는 구리의 총 농도이다.

그 결과, GFP 및 GFPdopa의 형광은 0.1 mM 및 1 mM 농도의 K⁺, Mg² ⁺, Ca² ⁺, Na⁺ 및 Mn² ⁺ 금속 이온의 존재 하에서 약간 영향을 받았다. 그러나, 0.1 mM 농도의 Cu²⁺의 첨가는 GFPdopa 단백질의 형광을 완전하게 소멸시켰다. 반면에, GFP는 0.1 mM 농도의 Cu² ⁺의 첨가 후 75% 이상의 형광이 유지되었다. 테스트된 금속 이온들 중에서, GFPdopa는 오로지 Cu² ⁺ 금속 이온과 선택적으로 형광 소광을 보였다(도 1 및 도 2a). Cu² ⁺ 이온과 GFPdopa의 혼합은 형광 여기 및 방출에서 파장 변화를 보이지 않았다(도 3). 20 uM의 구리 농도는 GFPdopa 형광의 50% 소광을 나타내었고, 100 uM의 구리 농도로 처리될 때 완전한 형광 소광을 나타내었다. 한편, 100 uM의 Cu²⁺ 존재 하에서 GFP의 75% 이상의 형광 강도가 유지되는 것으로 나타내었다(도 2b).

한편, GFPdopa의 해리상수는 Cu² ⁺ 이온에 대해 높은 친화성을 나타내는 5.6±0.3 uM인 것으로 확인되었다. 상기 구리 해리 상수는 붉은 형광 단백질과 유사하고 Rmu13, drFP583 및 gRF 보다 낮은 수치였다(비특허문헌 13 및 14 참조).

L- DOPA 도입 단백질과 구리 이온의 형광 소광의 메커니즘 분석

<3-1> 스턴 - 볼머 플랏 ( Stern - Volmer plot ) 분석

100 uL 농도의 구리 용액을 각각의 마이크로 적정 웰에서 100 uL의 단백질(3 uM)을 포함하는 MOPS에 첨가하였다. 구리의 첨가 후, 상기 용액을 다양한 온도(25, 30 및 45℃)에서 반응시켰다. 형광 판독은 시료를 자극한 후 각 단백질에 대한 적절한 파장에서 방출을 측정함으로써 수행되었다. GFPdopa와 구리의 해리 상수는 25℃에서 측정된 상대적인 소광(quenching) 데이타를 기초로 측정하였다.

<3-2> UV -시각화 스페트럼 ( UV - visible spectra ) 분석

1 ml 부피의 단백질(3 uM)을 큐벳트(cuvette)에 부은 후, 단백질의 흠수 스펙트럼을 상온에서 기록하였다. 이를 위해 0.1 mM의 구리는 첨가한 후, 10분 동안 반응시킨 다음, 흡수 스펙트럼을 기록하였다.

<3-3> 센서의 가역성 분석

센서의 가역성을 시료 용액에 1 mM의 에틸렌 디아민 테트라아세트산(ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA)을 첨가하여 최종 농도 1 mM의 용액을 만든 후 평가하였다.

그 결과, GFPdopa의 소광 상수는 온도의 증가에 대하여 감소하는 것으로 나타났다(도 2c 및 도 2d). 이는 상기 소광이 충돌 소광(collisional quenching)이 아니고, 구리와 GFPdopa 단백질 사이의 상호작용에 기인하는 정적 소광(static quenching)에 의한 것임을 알 수 있다.

또한, GFPdopa의 흡수 스펙트럼은 Cu² ⁺의 부재 하의 경우에 비교하여 Cu² ⁺의 존재 하에서 영향을 받지 않는 것으로 나타났다(도 4). 또한, 형광 소광 후 GFPdopa 형광의 70% 이상이 평형화한 후 5분 뒤에 회복되는 것으로 나타났다(도 5). 따라서 평형화 조건에서, GFPdopa를 이용하여 구리의 반복되고 재생가능한 모니터링이 가능하다는 것을 알 수 있다.

구리 이온의 결합이 L- DOPA 도입 단백질의 구조에 미치는 영향 분석

<4-1> 원편광 이색성 분광 측정법( circular dichroism )

JASCO J-715 분광계에서 37℃에서 GFPdopa 및 GFPdopa로 처리된 구리에 대해 Far UV CD 스펙트럼을 기록하였다. 상기 분석을 위해, 250 uL 부피의 단백질(3 uM)을 0.2 cm 세포에 둔 후, CD 흡수 스펙트럼을 상온에서 획득하였다. 구리 1 당량에 상응하는, 10 uL 부피의 구리를 첨가한 후, 흡수 스펙트럼을 기록하였다. 20개의 스캔을 스펙트럼마다 축적하고, Jasco 소프트웨어 패키지를 이용하여 미가공 데이타를 공정하였다. 최종 결과를 분석한 후, Origin 소프트웨어를 이용하여 그래프화하였다.

그 결과, GFPdopa의 이색성 프로파일은 구리 이온으로 처리한 후의 경우 처리 전의 경우와 동일한 이차 구조를 가지고 있는 것으로 확인되었다(도 2d). 따라서, 관찰된 GFPdopa에서의 형광 소광은 단백질의 구조적 또는 형태적 변화로 기인한 것이 아님을 알 수 있다.

L- DOPA 도입 단백질 내 구리 이온의 결합 부위 확인

<5-1> 분자 모델링 및 발색단 ( chromophore ) 상호작용 연구

GFP 모델 구조는 디폴트 함수(default parameter)를 이용한 PDB(Protein Databank)에 대해 BlastP 검색을 통해 획득한 잠재적 주형 구조(PDB Id-2B3P 및 1RRX)를 이용하여 모델러(Modeler)를 이용한 비교 모델링(comparative modeling)에 의해 제작하였다. 주형으로서 2B3P의 서열 배열 및 3D 구조를 이용하여, 모델을 발색단 내에서 변형되는 GYG 부위를 제외한 쿼리 서열(query sequence)에 대해 제작하였다. 말단 및 c-말단 오버행을 각 모델링 단계 동안 제거하였다. 그런 다음, 2B3P의 발색단 부위를 모델러의 모델 리간드 복합체 방법을 이용하여 GFP 모델 구조 내로 도입하였다. 제작된 모델 구조는 약 200단계의 최대 경사 최소화(steepest descent minimization)에서 최소화된 에너지를 가지며 SAVES 서버를 이용하여 구조 품질에 대해 평가하였다. 모델링 공정의 완수를 확인하기 위해 평균평방근편차(root mean square deviation, RMSD) 값을 모델링된 구조 및 이의 상응하는 주형 구조 사이에 산출하였다. GFP의 분자 모델의 품질은 라마찬드란 플랏(Ramachandran plot)에서 아미노산 잔기의 분포를 조사함으로써 결정하였다. 그런 다음, help Discovery studio 2.1을 갖춘 1RRX의 결정 좌표(crystal coordinate)를 도입함으로써 상기 모델의 티로신 잔기를 L-DOPA로 대체하여 에너지를 최소화하였다. 에너지가 최소화된 구조의 구조 품질은 상기 기재된 바와 같이 측정하였다. 발색단과 주변 잔기들 사이 상호작용을 분석하기 위해, 리간드 단백질 플랏을 GFP 및 GFPdopa에 대한 Ligplot을 이용하여 생성시켰다.

<5-2> 인-겔 절단( In - gel digestion )

샘플을 SDS-PAGE에 의해 분해한 후 Colloidal Coomassie blue R250 용액(ProteomeTech Inc. Korea)으로 염색하였다. 기존에 알려진 방법(비특허문헌 20 참조)의 변형을 통해 수행하였다. 겔 밴드를 1 mm³ 큐브(cube) 내로 절단하였고 50% 아세토니트릴(acetonitrile)을 포함하는 50 mM 탄산수소 암모늄(ammonium bicarbonate)으로 두 번 세척하였다. 단백질 환원 및 알킬화를 56℃에서 1시간 동안 50 mM 탄산수소 암모늄에서 10 mM DTT로, 이어서 상온에서 45분 동안 50 mM 탄산수소 암모늄에서 10 mM 아크릴아마이드로 각각 수행하였다. 겔 조작들을 50 mM 탄산수소 암모늄, 50% 아세토니트릴로 두 번 세척하였고, 100% 아세토니트릴로 탈수시켰고, speed vac으로 건조시켰다. 건조된 겔 조각들을 50 mM 탄산수소 암모늄에서 20 ng uL-1 sequencing grade trypsin(Promega, CA, USA)로 탈수시킨 후 37℃에서 밤새 반응시켰다. 상청액을 새로운 튜브로 이동시킨 다음, 겔 조각들에 남은 펩티드들을 40분 동안 중탕 냄비에 50% 아세토니트릴을 포함하는 5% TFA로 초음파 처리에 의해 추출하였다. 상기 추출물을 POROSR2/R3(Applied Biosystems, CA, USA)가 구비된 GeLoader tip 컬럼을 이용하여 결합, 약 2 uL로 건조 및 탈염화시킨 다음, 상기 용출된 펩티드들을 질량분석(mass spectrometric analysis)하였다.

<5-3> 나노 LC - MS / MS

기존에 알려진 방법과 같이(비특허문헌 21) FAMOS autosampler 및 Switchos column switching valve(LC-Packings, Amsterdam, The Netherlands)를 포함하는 Ultimate nanoLC 시스템을 통해, 트립신에 의한 분해물을 분리하였고, 나노스프레이 계면(nanospray interface)이 구비된 QSTAR Mass 분광계(Applied Biosystems, CA, USA)에 의해 온-라인(on-line) 분석하였다. 펩티드 결합은 10분 동안 4 uL/min의 유량(flow rate)으로 5% 아세토니트릴을 포함하는 0.1% 포름산으로 2 cm 200 um ID self-packed column Zorbax 300SB-C18, 5 um(Agilent)에서 발생하였다. 결합된 펩티드들은 동일한 레진으로 내부 장착되고, 0.2 uL/min의 유량으로 45분 동안 5-50 %(v/v) 아세토니트릴을 포함하는 0.1 % 포름산으로 녹여서 분리하는, 15 cm 융합된 실리카 에미터(fused silica emitter)(75 um ID)에서 분리하였다. MS/MS 스펙트럼은 충돌 오프셋 값(collision offset values)의 m/z-의존적 세트를 갖는 자동화된 스위칭 모드 탠덤 질량 분석계(automated switching mode tandem mass spectrometer)에서 획득하였다.

<5-4> 돌연변이체의 생성 및 부위 지정 돌연변이( site - directed mutagenesis) 분석

GFP의 코딩 서열을 플라스미드 GFP_Y66amber, GFP_Y92amber, GFP_Y92F and GFP_Y66Y92amber를 만들기 위해 사용된 발현벡터 pQE80L 내로 미리 클론화시켰다. Tyr66, Tyr92, Tyr66-92 위치에서 앰버 스탑 코돈(amber stop codon, TAG) 및 페닐알라닌에 대해 Tyr92에서 점 돌연변이를 갖는 하기 돌연변이 벡터를 Quick-change site directed mutagenesis kit(Stratagene, La Jolla, CA)를 이용하여 매뉴얼의 제조사의 설명에 따라 수행하여 생성시켰다. 상기 돌연변이 생성은 Cosmo Genetech(Dajeon, South Korea)에서 DNA 서열 분석을 수행하여 확인하였다.

<5-5> GFP 변이체 내로 L- DOPA 의 부위-특이적 및 전반적 융합

pQE80-GFP_Y66am GFP_Y92amber, GFP_Y66Y92amber 및 부위 특이적 융합을 위해 직교의 tRNA/합성효소(synthetase)를 포함하는 pAC-DOPA-6TRN를 포함하는 Escherichia coli BL21 (DE3)를 앰피실린(ampicillin)(50 mg/mL) 및 테트라사이클린(tetracycline)(7.5 mg/mL)이 첨가된 LB 배지에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 작은 개시 배양에서 세포를 채취하고, 인산완충식염수에 재현탁한 후, 앰피실린(50 mg/mL) 및 테트라사이클린(7.5 mg/mL)이 첨가된 글리세롤 최소 배지 내로 접종시켰다. OD₆₀₀이 대략 0.7이 도달할 때까지 배양시켰으며, 1 mM L-DOPA(Sigma Aldrich, USA)를 유도 전에 첨가하였다. 유도는 37℃에서 7시간 동안 1 mM IPTG를 제공한 후 세포를 췌취한 후, 정제 동안 -70℃에서 냉동시켰다. 유사하게, GFP_dopaY92F를 포함하는 타이로신 영양요구주를 격렬한 진탕으로 37℃에서 앰피실린을 포함한 Luria-Bertani 배지에서 배양하였다. 그런 다음, 세포를 M9 최소 배지에 순응시킨 후, L-DOPA의 전반적인 융합을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다.

상기 분자 모델링 분석 결과, His148 및 Tyr92 두 개의 잔기 GFP 발색단과 직접적으로 관련성이 있는 것으로 나타났다. 상기 Tyr92는 Gln94 및 His148 잔기가 발색단 잔기와 직접적으로 상호작용하는 것을 통해 발색단과 상호작용하는 것을 알 수 있었다(도 6a). 이런 DOPA66-His148의 상호작용 및 DOPA92-DOPA66의 상호작용에서 L-DOPA의 대체는 구리와 발색단의 결합을 지지하고, 정적 소광을 야기하는 것을 알 수 있었다.

또한, 다양한 GFP 돌연변이 분석 결과, GFP_Y66dopa 변이체는 GFP 및 GFP_dopaY92F 변이체 보다 높은 구리 센싱 활성을 나타내었고, GFPdopa 보다는 낮은 구리 센싱 활성을 나타내었다. 반면에, GFP_Y92dopa는 GFP_Y66dopa일 때 더 높은 구리 센싱 활성을 나타내었다. 한편, 페닐알라닌이 도입된 GFP_dopaY92F 돌연변이는 GFP_Y92dopa 및 GFP_Y66dopa 돌연변이와 비교할 때, 낮은 구리 센싱 활성을 보였다. 따라서, 발색단 잔기 DOPA66 및 DOPA92는 GFPdopa의 구리 센싱 활성을 가지기 위해 중요한 부위인 것을 알 수 있다. 또한, 구리가 GFPdopa 단백질의 상기 발색단 잔기에 가까이 있는 것은 발색단으로부터 구리에 전자를 제공하고, 이를 통해 형광 소광을 가져오는 것을 알 수 있다.

L- DOPA 도입 단백질을 포함하는 바이오센서의 제작

<6-1> 고정을 위한 GFPdopa 에 대한 NaIO ₄ 의 전처리

L-DOPA를 포함하는 GFPdopa(30 ug/ml) 단백질을 1시간 동안 NaIO₄(1 mM)와 함께 반응시킴으로써 전처리를 수행하였다. Amicon Ultra 15 30,000 MWCO centrifugal filters(Millipore, MA, USA)를 이용하여 농축시켰다. 농축된 시료를 상기 기재된 바와 같이 구리 감지 분석에 적용하였다. 형광 소광 및 가역성은 winlab 소프트웨어를 이용한 Perkin Elmer LS-55에서 모니터하였다.

<6-2> 바이오 센싱을 위한 아민 슬라이드에서 GFPdopa 단백질의 마이크로 패턴화

기존에 알려진 방법(비특허문헌 22 참조)에 따라 PDMS 스탬프(stamp) 및 마이크로콘택트 프린팅(microcontact printing)을 이용하여 단백질의 마이크로패터닝(Micropatterning)을 수행하였다. PDMS 스탬프는 50 um(구멍 크기)의 웰을 포함하는 웰이 포함된 마이크로칩 위에 실리콘 엘라스토머(silicone elastomer)와 실리콘 베이스(silicone base)의 9:1 혼합물을 부워서 제조하였다. 그런 다음, 1시간 동안 65℃에서 반응시킨 후 패턴을 잘랐다. 단백질 용액 내로 PDMS 마이크로스탬프를 담그기 전에, GFPdopa를 5분 동안 1 mM NaIO₄로 처리한 후, 즉시 마이크로칩 위에 적재한 다음 15분 동안 반응시켰다. 그런 다음, 과다한 단백질 드롭(drop)을 피펫으로 흡수시킨 후 질소 스프레이를 이용하여 건조시켰다. 또한, PDMS는 아민으로 코팅된 유리 슬라이드에 새긴 다음 30분 동안 상온에서 반응시켰다. 반응 후, PDMS 스탬프를 형광 현미경으로 관찰하였다. 이미지는 수은 램프 조명 및 FITC 및 Cy3 필터 세트를 갖춘 Zeiss Axiovert 200 형광 현미경으로 획득하였다. 이미지는 단순 PCI 소프트웨어를 이용한 Hamamatsu ORCA-ER 그레이 스케일 디지털 카메라에서 포획하였다. 컬러 패널을 위해 분리된 그레이 스케일 이미지는 PCI에서 세팅된 자동 노출로 FITC 및 Cy3 필터 세트와 함께 포획하였다. 상기 그레이 스케일 이미지는 Corel Draw를 이용하여 결합 및 착색시켰다. 상기 이미지는 255 게인(gain) 및 0.0125초 노출로 포획하였다. 그런 다음, 마이크로 스팟을 100 uM CuSo₄ 용액으로 처리한 후, 형광 이미지를 동일한 조건에서 포획하였다. 상기 스팟을 EDTA로 다시 한번 처리한 후 형광 현미경을 이용하여 포획하였다. 또한, 상기 이미지를 이미지 소프트웨어로 분석하였다.

NaIO₄ 처리된 GFPdopa로 생성된 검정곡선을 분석한 결과, 형광 강도는 Cu² ⁺ 농도에 따라 선형으로 소광하였으며(도 8a) 상기 형광은 EDTA로 평형화할 때 즉시 회복하였다(도 9). NaIO₄ 처리된 GFPdopa의 해리상수는 NaIO₄의 부재 하에 GFPdopa와 유사한 4.3±1.1 uM으로 확인되었다. 따라서 NaIO₄의 처리 후 GFPdopa 단백질이 Cu²⁺에 대한 바이오센싱 활성을 유지하는 것을 알 수 있었다.

또한, 단백질 센서의 수행을 평가하기 위해, GFPdopa 슬라이드와 Cu² ⁺의 반응 후 형광을 분석한 결과, 형광 신호는 구리 이온의 첨가 후에 완전히 소광되는 것으로 나타났고(도 8b의 B), 상기 슬라이드를 5분 동안 EDTA로 평형화시킨 경우, GFPdopa의 원래의 형광 방출이 회복되는 것으로 나타났으며(도 8b의 C), 상기 형광 회복의 밀도계측 분석 결과, GFPdopa의 원래의 형광 강도의 94%가 회복되는 것으로 나타났다(도 8c). 따라서 GFPdopa가 Cu² ⁺ 검출을 위한 선택적이고 민감한 바이오센서를 수행할 수 있는 것을 알 수 있다.

Claims

L-3,4-디하이드록시페닐알라닌(3,4-dihydroxyphenylalanine; L-DOPA)가 도입된 형광단백질을 포함하는 중금속 이온 검출용 바이오센서.
제 1항에 있어서, L-DOPA가 도입된 형광단백질은
1) 아미노산 서열에서 타이로신(tyrosine)을 하나 이상 포함하는 단백질을 발현하는 타이로신 영양요구주(auxotroph)를 준비하는 단계;
2) 상기 타이로신 영양요구주를 타이로신이 결핍된 배지에 배양하는 단계;
3) 상기 배지에 L-DOPA를 첨가한 후 배양하는 단계; 및
4) 배양된 영양요구주로부터 아미노산 서열에서 타이로신 대신에 L-DOPA가 포함되어 있는 형광단백질을 선별하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제 2항에 있어서, 상기 단계 1)의 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein; GFP)인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제 2항에 있어서, 단계 2)의 타이로신 영양요구주는 대장균(E. coli) JW2581 타이로신 영양요구주인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제 1항에 있어서, 중금속 이온은 구리 이온인 것을 특징으로 하는, 바이오센서.
제 1항에 있어서,
유리 기판; 상기 기판상에 적층된 실리콘 기판; 및 상기 실리콘 기판에 고정화된 L-DOPA가 포함된 형광단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이오 센서.
1) L-DOPA가 포함된 형광단백질을 과요오드산염(NaIO₄)으로 전처리하는 단계; 및
2) 전처리된 L-DOPA가 도입된 형광단백질을 기판에 고정시키는 단계를 포함하는, L-DOPA가 도입된 형광단백질을 포함하는, 중금속 이온 검출용 바이오센서의 제조방법.
제 7항에 있어서,
1) 기판에 고분자층을 적층한 후, 패터닝하는 단계;
2) 상기 패터닝된 고분자층에 마이크로 유체 채널을 형성하는 단계; 및
3) 상기 마이크로 유체 채널에 과요오드산염(NaIO₄)으로 전처리된 L-DOPA가 도입된 형광단백질을 적재함으로써 상기 채널에 L-DOPA가 도입된 형광단백질을 고정시키는 단계를 포함하는, 바이오센서의 제조방법.
1) 제 1항의 바이오센서에 피검시료를 처리하는 단계; 및
2) 상기 바이오센서의 L-DOPA가 도입된 형광단백질에 결합된 중금속 이온을 확인하는 단계를 포함하는, 피검시료 내 중금속 이온의 검출 방법.
제 9항에 있어서, 중금속 이온의 결합 확인은 가시적(visually), 광학적(optical) 또는 전기화학적(electrochemically) 방법을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.