ITUA20163876A1 - Biorecettore per ioni metallici. - Google Patents
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Description
“Biorecettore per ioni metallici”
Riassunto dell’invenzione
L’invenzione ha per oggetto un dispositivo che agisca da biorecettore di ioni metallici e che sia applicabile allo sviluppo di dispositivi di “sensing” ad esempio nei settori del monitoraggio ambientale, agroalimentare e della salute.
Contesto tecnico
Numerosi sono i metalli pesanti che inquinano l’ambiente. Anche a concentrazioni atmosferiche non elevate, i metalli pesanti possono infiltrarsi e accumularsi nel terreno influendo su tutti gli organismi viventi tramite catena alimentare. Tra questi, legato principalmente all'inquinamento antropico (e cioè all’inquinamento principalmente dovuto all’attività umana di produzione di materiali ed energie utili alla vita dell’uomo), si pone anche il nichel. Questo metallo di transizione è importante per gli organismi viventi e, in quantità ridotte, è importante anche per l'uomo, per il quale dimostra un'utilità legata ai batteri saprofiti che ne colonizzano l'intestino. Nonostante la sua importanza biologica, il nichel risulta però spesso causa di disturbi, per l’effetto, legato alla sua forma ionica, esercitato sul sistema immunitario. Il nichel nella sua forma ionica è infatti capace di combinarsi facilmente con albumina, aminoacidi (in particolare alanina, istidina) di peptidi e di formare complessi riconosciuti dai linfociti T. Nell'uomo, le principali forme di sensibilizzazione e allergia sono: la dermatite allergica da contatto (DAC)
la sindrome da allergia sistemica al nichel (SNAS).
L’Italia risulta al primo posto in Europa per prevalenza di persone allergiche a questo metallo (32,1%).
Per ovviare all'inquinamento da nichel, sono stati sviluppati diversi sistemi di filtraggio basati per lo più sull'utilizzo di resine a scambio ionico capaci di legare il metallo, oppure sistemi basati sull’azione di agenti chelanti (EDTA) oppure ancora basati sulla precipitazione del nichel sotto forma di sale insolubile, mediante l'aggiunta di prodotti chimici. Nei sistemi di depurazione delle acque reflue, ad esempio, si sfrutta spesso l’azione di fanghi attivi, nei quali la gran parte degli inquinanti viene accumulata nei microrganismi utilizzatori. I suddetti fanghi attivi, una volta saturi ed esauriti, vengono smaltiti, a fine ciclo, in discarica.
La presenza di nichel in soluzioni campione può, ad esempio, essere attualmente rilevata mediante tecniche che sfruttano strumentazioni costose e complesse, come ad esempio plasma accoppiato induttivamente associato a spettrometria di emissione atomica (ICP-AES) o la spettrometria di massa (ICP-MS), o l’analisi di assorbimento atomico (AAS) (tecniche con capacità di rilevazione nell'ordine delle ppb), oppure tramite l'uso di molecole chimiche chelanti, sempre però utilizzando metodiche complessometriche e gravimetriche (e.g. acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), dimetilgliossima), che risultano comunque meno sensibili e accurate di quelle più sopra citate. Da tempo è in studio lo sviluppo di elettrodi iono-selettivi, per misurazioni di tipo potenziometrico, ma i risultati attualmente disponibili dimostrano una bassa riproducibilità delle misure effettuate, dettata dall'interferenza di altri ioni metallici presenti, lunghi tempi di risposta e funzionalità a ristretti intervalli di concentrazioni (Singh AK, Sharma CL, Baniwal S, Panwar A. Nickel(II)-selective membrane electrode based on macrocyclic ligand. Electroanalysis; 13:1209-1214 (2001); Mashhadizadeh MH, Sheikhshoaie I, Saeid-Nia S. Nickel(II)-selective membrane potentiometric sensor using a recently
synthesized Schiff base as neutral carrier. Sensors and Actuators B: Chemical; 94:241 -246 (2003); Shamsipur M, Poursaberi T, Karami AR, Hosseini M, Momeni A, Alizadeh N. Development of a new fluorimetric bulk optode membrane based on 2,5-thiophenylbis(5-tertbutyl-1,3-benzexazole) for nickel(II) ions. Analytica Chimica Acta; 501:55-60 (2004); Gupta VK, Goyal RN, Agarwal S, Kumar P, Bachheti N. Nickel(II)-selective sensor based on dibenzo-18-crown-6 in PVC matrix. Talanta; 71:795-800 (2007)). Tali metodiche spesso richiedono attrezzature specifiche di grandi dimensioni e di costi elevati oltre alla necessità di utilizzare numerosi prodotti chimici, alcuni potenzialmente tossici e/o pericolosi, per realizzare le procedure di messa a punto e di processazione di ciascuna singola fase di preparazione del campione.
I sistemi enzimatici e proteici nei processi di detection di inquinanti e metalli pesanti garantiscono invece una maggior rapidità e economicità rispetto alle tecniche tradizionali, presentando in aggiunta minori costi di esecuzione. Inoltre, date le ridotte dimensioni dei componenti, è favorita una maggior integrabilità delle parti, utile allo sviluppo di dispositivi portatili.
WO 95/33767 descrive la proteina ATCC 75806 isolata da Helicobacter Pylori che funge da legante per il nichel ed il suo impiego nel campo della diagnosi, profilassi e trattamento dei disturbi gastrici, in particolare legati al nichel. Viene anche descritto in termini del tutto generali l’impiego della suddetta proteina per la detossificazione non-clinica da nichel. In particolare, secondo quanto descritto in WO 95/33767, la proteina viene indicata come agente purificante per le soluzioni acquose, mediante miscelazione di porzioni solubili della proteina con acque reflue. Una volta legato il nichel, il complesso nichel-proteina viene descritto essere allontanato dalla soluzione da purificare ad esempio mediante immunoprecipitazione e centrifugazione. Viene anche citata la possibilità che la proteina possa essere associata ad un supporto solido del
tipo resina o altro supporto mai specificato, aggiunta alla soluzione da purificare e miscelata ad essa per consentire la formazione del complesso nichel-proteina. Una volta formato il complesso, viene detto che è possibile centrifugare la resina o rimuovere il supporto in modo semplice. Tuttavia, nulla altro viene detto circa il tipo di supporto che può essere utilizzato, né circa il sistema richiesto per ancorare il supporto solido alla proteina, né tantomeno se e che eventuale tipo di legame sia necessario affinché non soltanto la proteina rimanga ancorata al supporto, ma anche possa svolgere la sua azione complessante nei confronti del nichel in modo efficace, pur se associata alla resina o ancorata al supporto. Non ci sono informazioni di alcun tipo per la preparazione di tale sistema proteina-supporto né alcuna indicazione tecnica che possa consentire la riproducibilità di tale sistema. Non sono inoltre presenti indicazioni tecniche circa le quantità minime di proteina da impiegare nell’ipotetico ancoraggio, né alcuna modalità sperimentale che consenta la realizzazione di tale sistema. Tantomeno sono presenti dati sperimentali a supporto del fatto che tale sistema possa effettivamente ed efficacemente funzionare da chelante/complessante per il nichel in acque reflue.
Si tratta quindi di affermazioni teoriche, per nulla supportate da alcuna evidenza sperimentale.
Scopi dell’invenzione
Scopo della presente invenzione è quello di mettere a disposizione un dispositivo di tipo biotecnologico per la rilevazione di ioni metallici, in particolare nichel, che possa essere applicato nei settori del monitoraggio ambientale, agroalimentare e nel monitoraggio della salute umana.
Pure scopo della presente invenzione è quello di mettere a disposizione un dispositivo di tipo biotecnologico per la rilevazione di ioni metallici, in particolare nichel, che risulti altamente specifico e, al tempo stesso, di facile utilizzo.
Ancora scopo della presente invenzione è quello di mettere a disposizione un dispositivo di tipo
biotecnologico per la rilevazione di ioni metallici, in particolare nichel, che risulti economico e che sia comunque in grado di fornire risultati altamente riproducibili ed affidabili.
Sempre scopo della presente invenzione è quello di mettere a disposizione un dispositivo di tipo biotecnologico per la rilevazione di ioni metallici, in particolare nichel, che sia sensibile anche a basse concentrazioni e che sia quindi in grado di rilevare anche quantità infinitesime di ioni metallici.
Ancora scopo della presente invenzione è quello di mettere a disposizione un dispositivo di tipo biotecnologico per la rilevazione di ioni metallici che consenta il riutilizzo del dispositivo stesso per più volte, consentendone la rigenerazione in modo semplice e senza la necessità di utilizzare reagenti chimici e chelanti, che poi debbano essere a loro volta smaltiti.
Pure scopo dell’invenzione è quello di mettere a disposizione un procedimento per la preparazione di un dispositivo di tipo biotecnologico per la rilevazione di ioni metallici, in particolare nichel.
Descrizione dell’invenzione
Questi ed altri scopi ancora che meglio saranno chiariti dalla descrizione che segue, vengono raggiunti da un dispositivo biorecettore di ioni metallici, caratterizzato dal fatto che comprende almeno un supporto solido ed almeno una componente proteica, detta componente proteica essendo almeno una proteina Hpn, preferibilmente almeno una proteina His-Hpn, ancorata a detto supporto tramite legame di tipo covalente.
L’invenzione ha quindi per oggetto un dispositivo del tipo biorecettoriale realizzato su substrato solido, utilizzabile per la captazione di ioni metallici, in particolare ioni nichel, da soluzioni inquinate o da campioni biologici isolati.
La proteina Hpn è una piccola proteina citoplasmatica, che lega ioni Ni<2+>con buona affinità. È una proteina costituita da 60 amminoacidi e presenta inoltre un'alta concentrazione in residui di
His e motivi EEGCC (SEQ. ID NO.1) caratterizzanti la sua funzione di legame nei confronti di cationi metallici bivalenti. La funzione della proteina in vivo è proprio quella di accumulare ioni Ni<2+>per mantenere i livelli ionici al di sotto delle concentrazioni di tossicità. L'azione di storage e prevenzione, che è espressa a pH 7,4 risulta convertita al rilascio per valori di pH inferiori a 6,3. Tale caratteristica di rilascio del Ni<2+>pH dipendente, apre la possibilità di riciclo dei processi di legame, nel senso che sfruttando le differenze nei valori di pH e le conseguenti differenze di comportamento della proteina Hpn (come anche di proteine da essa derivate, ad esempio His-Hpn) a tali valori, è possibile modulare il comportamento del dispositivo oggetto dell’invenzione in modo da poterlo utilizzare sia come complessante del Ni<2+>che come agente di rilascio di tali ioni, quando sia necessario ad esempio riattivare il dispositivo e prepararlo per un nuovo utilizzo.
L'analisi di dicroismo circolare della proteina Hpn in condizioni di aggiunta di nichel, ha evidenziato cambiamenti conformazionali in presenza del metallo: una riduzione dal 20% al 10% in contenuto di α-eliche contro un aumento di β-foglietti dal 22% al 37% dopo l'aggiunta, per ogni proteina, di 5 ioni Ni<2+>(Ge R, Watt RM, Sun X, Tanner JA, He QY, Huang JD, Sun H. Expression and characterization of a histidine-rich protein, Hpn: potential for Ni<2+>storage in Helicobacter pylori. Biochemical Journal; 93:285-293 (2006)). Queste particolari variazioni strutturali, connesse ad un sistema di trasduzione, consentono la rilevazione delle concentrazioni di ioni Ni<2+>nella soluzione trattata.
Secondo una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, la proteina Hpn ha sequenza MAHHEEQHGGHHHHHHHTHHHHYHGGEHHHHHHSSHHEEGCCSTSDSHHQEEGC CHGHHE (SEQ. ID NO.2).
Preferibilmente, la proteina Hpn secondo la presente invenzione ha una sequenza
amminoacidica avente almeno il 70%, preferibilmente almeno l’80%, più preferibilmente almeno il 90% di identità di sequenza o omologia con la sequenza MAHHEEQHGGHHHHHHHTHHHHYHGGEHHHHHHSSHHEEGCCSTSDSHHQEEGC CHGHHE (SEQ. ID NO.2).
Preferibilmente, la sequenza nucleotidica codificante per la proteina Hpn di sequenza SEQ. ID NO. 2 è ATGGCACACCATGAAGAACAACACGGCGGGCACCACCACCACCATCACCACACA CACCACCACCACTATCATGGCGGTGAACACCACCATCACCACCACAGCTCTCATC ATGAAGAAGGTTGTTGCAGCACTAGCGACAGTCATCATCAAGAAGAAGGTTGCT GCCACGGGCATCACGAGTAA (SEQ. ID NO.3).
Si noti che, data la degenerazione del codice genetico, altre sequenze nucleotidiche, diverse dalla sequenza SEQ. ID NO. 3 indicata, possono essere utilizzate indifferentemente per codificare la proteina Hpn di sequenza SEQ. ID NO.2.
Secondo un aspetto preferito della presente invenzione, la proteina utilizzata è stata espressa nel sistema eterologo Escherichia coli BL21(DE3), a partire dal costrutto pRSETA-Hpn, ed è munita di tag poli-istidina utile alla purificazione con resina Ni-IDA, con ottenimento di His-Hpn.
Secondo una forma di realizzazione preferita della presente invenzione, la proteina His-Hpn ha sequenza MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDRWGSELAAASMAHHEEQHGG HHHHHHHTHHHHYHGGEHHHHHHSSHHEEGCCSTSDSHHQEEGCCHGHHE (SEQ. ID NO.4).
In grassetto è indicata la sequenza tag poli-istidina, “His-tag”, che costituisce i residui amminoacidici da posizione 5 a posizione 10 della sequenza della proteina His-Hpn, quando
tale proteina ha sequenza amminoacidica SEQ. ID NO.4.
Sempre considerando la SEQ. ID NO. 4, i residui amminoacidici da 11 a 42 formano una sequenza linker, comprendente un sito di clivaggio per l’enzima enterochinasi (EK) (residui 27-31).
Preferibilmente, la proteina His-Hpn secondo la presente invenzione ha una sequenza amminoacidica avente almeno il 70%, preferibilmente almeno l’80%, più preferibilmente almeno il 90% di identità di sequenza o omologia con la sequenza MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDRWGSELAAASMAHHEEQHGG HHHHHHHTHHHHYHGGEHHHHHHSSHHEEGCCSTSDSHHQEEGCCHGHHE (SEQ. ID NO.4).
Preferibilmente, la sequenza nucleotidica codificante per la proteina His-Hpn di sequenza SEQ. ID NO.4 è ATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCATGACTGGTGGAC AGCAAATGGGTCGGGATCTGTACGACGATGACGATAAGGATCGATGGGGATCCG AGCTCGCGGCCGCAAGCATGGCACACCATGAAGAACAACACGGCGGGCACCACC ACCACCATCACCACACACACCACCACCACTATCATGGCGGTGAACACCACCATCA CCACCACAGCTCTCATCATGAAGAAGGTTGTTGCAGCACTAGCGACAGTCATCAT CAAGAAGAAGGTTGCTGCCACGGGCATCACGAGTAA (SEQ. ID NO.5).
Si noti che, data la degenerazione del codice genetico, altre sequenze nucleotidiche, diverse dalla sequenza SEQ. ID NO. 5 indicata, possono essere utilizzate indifferentemente per codificare la proteina His-Hpn di sequenza SEQ. ID NO.4.
Per garantire l'utilizzo delle funzioni di questa proteina, si è proceduto allo sviluppo di un procedimento adatto alla funzionalizzazione di superficie tale da consentirne l'ancoraggio, per mezzo di un legame di tipo covalente, su substrato solido. Tale accorgimento, nel caso specifico
del sistema basato su Hpn (e/o His-Hpn), permette il riutilizzo della superficie attivata con la proteina per più cicli eseguendo semplici lavaggi, a valori di pH specifici, senza necessità di utilizzo di reagenti chimici e chelanti.
Il procedimento per la preparazione del dispositivo oggetto dell’invenzione prevede l’impiego di supporti in vetro e/o silice. La funzionalizzazione di tali supporti è stata eseguita sulle superfici in vetro e/o silice del supporto prescelto mediante l'uso in sequenza dell’agente silanizzante 3-Amminopropiltrietossisilano (APTS) e del cross-linker glutaraldeide, secondo un processo di auto-assemblaggio dei monostrati molecolari. In seguito, i substrati trattati sono stati esposti alla proteina His-Hpn trasferita in strati continui o con disegni specifici (litografici) tramite il processo litografico soffice della stampa a microcontatto o Micro-Contact Printing (Kumar A e Whitesides GM. Features of gold having micrometer to centimeter dimensions can be formed through a combination of stamping with an elastomeric stamp and an alkanethiol ink followed by chemical etching. Applied Physics Letters. 63:2002- 2004 (1993); Jackman R, Wilbur J, Whitesides GM. Fabrication of Submicron Features on Curved Surfaces by Microcontact Printing. Science; 269:664-666 (1995)).
Con riferimento alle allegate figure, date a solo titolo indicativo e non limitativo del presente trovato, si può notare che la Fig. 1 descrive, schematicamente, i vari passaggi necessari ad ottenere la funzionalizzazione del supporto solido o substrato. In particolare, con riferimento alla Figura 1, il supporto solido o substrato attivato per trattamento al plasma O2, viene incubato con una soluzione acquosa di APTS al 9% a 40°C per 30 minuti (a). Al termine dell'incubazione e dei lavaggi, viene addizionato il cross-linker glutaraldeide in soluzione acquosa al 10% per 3 ore (b). La glutaraldeide legata al silanizzante, reagisce con la proteina aggiunta, dopo essere stato sottoposto ad adeguate fasi di lavaggio (c) costituendo il legame di tipo covalente tra proteina His-Hpn e la superficie del supporto solido o substrato (d).
In pratica, il legame di tipo covalente che si forma tra supporto solido o substrato e proteina, si forma per reazione tra il gruppo amminico terminale della proteina e il gruppo aldeidico terminale della glutaraldeide, che è stata a sua volta ancorata chimicamente al supporto solido durante le precedenti fasi di attivazione e che funge da cross-linker tra il supporto silanizzato e la proteina. Tale legame è detto legame imminico ed è caratterizzato dalla presenza del gruppo funzionale -C=N- .
Il supporto solido o substrato in vetro e/o silice, che nella sua struttura chimica presenta quindi dei legami -Si-O- reattivi, viene fatto reagire con l’agente silanizzante APTS. Il prodotto di reazione viene quindi fatto reagire con glutaraldeide, che funge, una volta reagita con il supporto solido o substrato, da cross-linker per l’attacco mediante legame covalente del tipo imminico, della proteina Hpn, in particolare la proteina His-Hpn, a detto supporto solido o substrato.
La Figura 2 mostra invece i risultati dell’analisi effettuata tramite immunofluorescenza indiretta del dispositivo di tipo biotecnologico per la rilevazione di ioni metallici ottenuto secondo l’invenzione.
In particolare, la Figura 2 mostra i risultati di funzionalizzazione e stampa per microcontatto con His-Hpn, su vetro e Si/SiO2. Le immagini sono state acquisite al microscopio invertito Eclipse Ti (Nikon), dotato di sistema confocale, per substrati in vetro (a sinistra) e Si/SiO2 (a destra) microstrutturati, mediante μCP di His-Hpn a concentrazione di 15μg/ml. La proteina è stata rilevata mediante l’utilizzo di un anticorpo primario Anti-His e di un anticorpo secondario coniugato con TRITC, a seguito di un’incubazione con una soluzione di BSA all'1% per 15 minuti a temperatura ambiente, per saturare gli spazi della superficie in cui non è stata immobilizzata la proteina His-Hpn, evitando in questo modo il legame aspecifico dell’anticorpo primario. In entrambi i substrati sono visibili (a) il pattern strutturato in righe larghe 10 μm e
distanziate 50, (b) un array di quadrati aventi 100 μm di lato, (c) (d) i controlli, prodotti su una superficie piana con strati continui, rispettivamente positivo e negativo.
Sono state anche verificate le capacità di legame della proteina immobilizzata, mediante ICP-AES. Sono stati effettuati controlli di legame per testare le capacità del substrato ai vari stadi di preparazione e l'influenza del pH sulla proteina completa, trattando tutti i campioni con una soluzione di NiSO4 a concentrazione 1 μg/ml. Il risultato ottenuto ha mostrato una netta differenza fra i campioni privi di proteina, lavati a pH 7.4 al termine dell'incubazione, e il sistema completo. Risulta inoltre apprezzabile la forte differenza fra il campione trattato a pH 6.3 e quello trattato a pH 7.4 (Fig.3).
La Figura 3 mostra infatti i risultati dell’analisi ICP-AES dei livelli di nichel trattenuti dalle superfici funzionalizzate (in alto vetro, in basso silice). I campioni in vetro e silice delle dimensioni di 1 cm<2>di superficie, sono stati prelevati alle varie fasi di lavorazione: solo substrato privo di trattamenti (vetro o silice), substrato+APTS (+APTS), substrato+APTS+glutaraldeide (+APTS+GLUT), substrato con proteina immobilizzata (+Prot). I vari campioni sono stati incubati in una soluzione di NiSO4 a concentrazione di 1 μg/ml per tutta una notte. In seguito, si e proceduto al lavaggio in PBS a pH 7.4 per tutte le superfici tranne che per una, trattata a pH 6.3 (+Prot pH6.3) per valutare il rilascio dello ione. Si è inoltre proceduto ad un'analisi delle capacità di legame a varie concentrazioni di incubazione, trattando tutte le superfici con un lavaggio preliminare in PBS a pH 6.3 e 7.4, e successivamente incubando a varie concentrazioni di NiSO4 in soluzione acquosa a partire da uno stock 38 mM. I campioni incubati sono stati nuovamente lavati a pH 7.4 per rimuovere eventuali eccessi ionici (Fig.4).
La Figura 4 mostra i risultati dell’analisi ICP-AES delle capacità di legame del sistema His-Hpn immobilizzato secondo la presente invenzione. Le prove sono state condotte su vetro (A,
B) e silice (C, D) funzionalizzate secondo il procedimento oggetto della presente invenzione ed incubate a concentrazioni di NiSO4 di 0 - 0,01 - 1 - 100 μg/ml per 4 ore. Per tutti i campioni sono stati effettuati lavaggi prima dell'incubazione con PBS a pH 6.3 ed in seguito a pH 7.4. La presente invenzione ha quindi per oggetto un nuovo dispositivo biorecettore di ioni metallici utilizzabile per lo sviluppo di dispositivi di “sensing” ad esempio nei settori del monitoraggio ambientale, agroalimentare e della salute.
Il dispositivo secondo l’invenzione è costituito da un supporto solido (ad esempio realizzato in vetro o in silicio/silice), necessario al fissaggio/ancoraggio della componente proteica o proteina capace di legare in maniera specifica ioni metallici, in particolare nichel. Il dispositivo si compone di una serie di strati molecolari utili al legame covalente della proteina alla superficie inorganica del supporto solido o substrato, realizzati per autoassemblaggio sulla superficie. La soluzione contenente gli ioni metallici, posta in contatto col dispositivo secondo l’invenzione, permette alla proteina di legare il nichel, con alta specificità. Le capacità di legame sono state testate in intervalli di concentrazioni compresi fra gli 0.01 μg/ml e i 100 μg/ml. Legame e rilascio dello ione sono fenomeni strettamente legati al pH. Si è visto che la proteina Hpn risulta solidamente e definitivamente ancorata al supporto tramite legame di tipo covalente, in particolare legame imminico, attraverso la reazione con il cross-linker utilizzato (glutaraldeide). Il dispositivo così realizzato è in grado di complessare, e quindi di sottrarre ioni nichel dalla soluzione nella quale essi risultano presenti, e di rilasciare tali ioni in condizioni di pH modificate. In questo modo il dispositivo secondo l’invenzione lavora come recettore di ioni nichel a determinate condizioni di pH, e allo stesso tempo può essere rigenerato e preparato ad un nuovo utilizzo, variando le condizioni di pH in modo da liberare ed eliminare gli ioni nichel precedentemente complessati.
Nessuno dei dispositivi noti prevede che l’ancoraggio della componente proteica al supporto
solido avvenga tramite legami covalenti, in particolare legami di tipo imminico realizzati tramite cross-linker, come invece avviene secondo la presente invenzione. I dispositivi noti prevedono che la componente proteica o simile sia associata al supporto ad esempio per adsorbimento, o mediante interazione ionica o in modo comunque reversibile. Questo tipo di interazione fa sì che la componente proteica sia debolmente associata al supporto solido e che le rese di reazione siano fortemente influenzate da questo fattore. Inoltre, una volta utilizzata, la componente proteica difficilmente può essere efficientemente recuperata e ri-utilizzata. Nel caso del dispositivo secondo la presente invenzione, invece, la presenza del componente attivante e del cross-linker, unitamente alla presenza del legame covalente di tipo imminico tra la componente proteica e il cross-linker, a suo volta ancorato al supporto solido tramite formazione di legame covalente stabile, consente di ancorare la proteina al supporto solido in modo stabile. Questo fa sì che la proteina possa esplicare efficacemente e con alte rese la sua azione di complessazione degli ioni metallici presenti. Una volta complessati gli ioni metallici, questi possono essere rilasciati per trattamento del supporto isolato in adatte condizioni di pH, ad esempio trattando il dispositivo che porta la proteina complessata agli ioni metallici da sottrarre, in adatte condizioni di pH. La proteina, fermamente ancorata al supporto, viene così rigenerata in modo che il dispositivo secondo l’invenzione, risulti pronto per un nuovo utilizzo, senza necessità di ancorare nuovamente proteina e supporto o substrato solido.
La presente invenzione si basa quindi su un approccio biomimetico, grazie al quale è possibile sfruttare l’elevata specificità evolutasi nei sistemi biologici per uso sensoristico. E’ stata testata la capacità del biorecettore oggetto dell’invenzione di svolgere la sua funzione anche a basse concentrazioni (da 0,01 μg/ml fino a 100 μg/ml) e con volumi di soluzione di analita dell'ordine dei millilitri (3 ml) per superfici di 1 cm<2>. La presenza di nichel in soluzioni campione, secondo la tecnica nota, può essere rilevata tipicamente mediante tecniche che sfruttano strumentazioni
costose e complesse, come ad esempio ICP-AES (tecniche con capacità di rilevazione nell’ordine delle ppb) o con l’uso di molecole chimiche chelanti in metodiche complessometriche e gravimetriche, poco sensibili e accurate, o ancora per mezzo di elettrodi ionoselettivi per misurazioni di tipo potenziometrico, ma in questo caso i risultati ottenuti mostrano bassa riproducibilità, problemi di interferenza con altri ioni metallici e funzionalità a ristretti intervalli di concentrazione.
L'utilizzo della tecnica di litografia soffice rende versatile il procedimento oggetto dell’invenzione permettendo così di realizzare strutture, tracciate secondo uno specifico pattern, dell'ordine dei micrometri integrabili, ad esempio, in sistemi portatili di ridottissime dimensioni. Le capacità di accumulo e rilascio degli ioni da parte della proteina His-Hpn consentono l'uso policiclico del dispositivo. A differenza degli attuali sistemi noti, il dispositivo secondo il trovato non richiede l'uso di particolari reagenti chimici o metodiche complesse. Inoltre, il procedimento di produzione del dispositivo biorecettore oggetto dell’invenzione richiede tempi brevi per il suo completamento e quantità limitate di materiale.
La presente invenzione verrà descritta in dettaglio con riferimento alla seguente parte sperimentale, fornita al solo scopo esplicativo, ma non limitativo.
Preparazione di cellule competenti
Per rendere competenti le cellule di Escherichia coli BL21(DE3) è stato utilizzato il metodo Inoue (Inoue H, Nojima H, Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene; 96(1):23-28 (1990)).
La crescita dei batteri viene effettuata ad una temperatura minore di 37° C, ottimale per Escherichia coli. Si inocula una colonia batterica di cellule di Escherichia coli in 5 ml di brodo LB e si lascia a 37°C in agitazione per tutta la notte. Il giorno seguente si prelevano 500 μl di tale inoculo e si versano in 200 ml di SOB. Si mette ad incubare a 23°C in agitazione fino al
raggiungimento di un valore di OD600 pari a 0.6. A questo punto si pone la coltura in ghiaccio per 10 minuti, si centrifuga a 2500 x g (dove “x g” è un simbolo tecnico che indica la gravità alla quale è sottoposto il campione in centrifuga), 10 minuti a 4°C e si elimina il surnatante. Il pellet viene risospeso in 80 ml di TB (“Transformation Buffer”, cioè “tampone di trasformazione”) freddo e viene posto in ghiaccio per 10 minuti. Si centrifuga a 2500 x g per 10 minuti a 4°C e si elimina il surnatante. Il pellet viene nuovamente risospeso in 20 ml di tampone di trasformazione (TB) freddo e si aggiunge DMSO, che è un agente criopreservante, ad una concentrazione finale del 7%. Si mette ad incubare in ghiaccio per 10 minuti e infine le cellule sono aliquotate in provette eppendorf (cioè il volume di cellule risospese in buffer viene suddiviso in volumi minori per limitare sprechi negli utilizzi futuri) per poi essere congelate in azoto liquido e conservate a -80°C.
TERRENI DI COLTURA:
Terreno di coltura SOB:
Triptone 20g/l
Estratto di lievito 5g/l
NaCl 10 mM
KCl 2.5 mM
MgCl2 10 mM
MgSO4 10 mM
pH 6.7-7.0
I componenti del terreno di coltura SOB sono OXOID.
Tampone di trasformazione TB:
Pipes 10 mM
MnCl2 55 mM
CaCl2 15 mM
KCl 250 mM
La soluzione tampone viene portata a pH 6.7 con KOH 5N prima dell’aggiunta di MnCl2. Trasformazione
Si utilizzano 200 μl di cellule batteriche rese competenti messe in contatto con 10-100 ng di ligato pRSETA-hpn, cioè il plasmide di espressione della proteina His-Hpn. Si pone in incubazione in ghiaccio per 30 minuti, poi per 2 minuti a 42°C e successivamente si pone di nuovo in ghiaccio. Si aggiungono 800 μl di SOC e si pone in incubazione a 37°C per circa un'ora in agitazione a 500 rpm (giri al minuto). Al termine dell'ora d'incubazione si centrifuga a 3000 rpm (giri al minuto) per 10 minuti, si elimina il surnatante e si risospende il pellet in 200 μl di SOC.
Infine, si piastra su terreno solido LB-Agar contenente l'antibiotico appropriato scelto in base alla resistenza presente sul plasmide utilizzato per la trasformazione. Si pone in incubazione a 37°C per tutta la notte.
Il giorno dopo sarà possibile osservare sulla superficie del terreno la presenza di colonie contenenti il costrutto pRSETA-hpn.
Il plasmide pRSETA-hpn utilizzato negli esperimenti qui descritti ha sequenza GATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTC CCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCGGGGTTC TCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGT CGGGATCTGTACGACGATGACGATAAGGATCGATGGGGATCCGAGCTCGCGGCC GCAAGCATGGCACACCATGAAGAACAACACGGCGGGCACCACCACCACCATCAC CACACACACCACCACCACTATCATGGCGGTGAACACCACCATCACCACCACAGCT CTCATCATGAAGAAGGTTGTTGCAGCACTAGCGACAGTCATCATCAAGAAGAAG
GTTGCTGCCACGGGCATCACGAGTAAACCTGCTTTTGCTCGCTTGGATCCGAATTC GAAGCTTGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGC CACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGG GGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATCTGGCGTAATAGCGAAGAGGC CCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCG CCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCG CTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCG CCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTC CGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTT CACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCC ACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTC GGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAA ATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTAC AATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTT CTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTT CAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTA TTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGA AAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGG ATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAAT GATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCG GGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTA CTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATG CAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACG ATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAA
CTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGC GTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGG CGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGAT AAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGA TAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCA GATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTA TGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTG GTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATT TTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATC CCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAG GATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAA CCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCC GAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAG CCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTC TGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGG GTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGG GGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATA CCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGA CAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCC AGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTG AGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAG CAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTT TCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTG ATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAG
CGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTA ATGCAG (SEQ. ID NO.6).
Il plasmide pRSETA-hpn avente sequenza SEQ. ID NO. 6, utilizzato negli esperimenti qui descritti, consente l’espressione della proteina His-Hpn di sequenza SEQ. ID NO.4 nelle cellule in cui tale plasmide viene inserito, per esempio cellule batteriche.
TERRENI UTILIZZATI:
Terreno di coltura SOC
E’ costituito da terreno SOB con l'aggiunta di glucosio 20 mM.
Terreno LB per la crescita in coltura liquida
Triptone 10 g/l
Estratto di lievito 5 g/l
NaCl 10 g/l
Sciogliere le polveri in acqua distillata e sterilizzare in autoclave.
Terreno LB per la crescita su strato solido
Triptone 10 g/l
Estratto di lievito 5 g/l
NaCl 10 g/l
Agar 15 g/l
Sciogliere le polveri in acqua distillata e sterilizzare in autoclave. Al terreno LB o LB-Agar è stato aggiunto antibiotico ad una opportuna concentrazione:
Ampicillina 75 μg/l
I componenti dei terreni di coltura LB e LB-Agar sono OXOID.
Inoculo di una colonia
Il giorno successivo si inocula una colonia in 100 ml di LB più Ampicillina. Si fa crescere la
colonia a 37°C per tutta la notte.
Induzione dell’espressione di pRSETA-Hpn con IPTG in cellule BL21
Si diluisce l’inoculo del giorno precedente ad O.D.600 pari a 0.05 in 200 ml di LB+Ampicillina. Quindi si lascia crescere a 37 ̊C fino ad O.D.6000.7. Si prelevano 2 ml di coltura non indotta (N.I.) per i controlli. A questo punto si aggiunge IPTG (Isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside) in concentrazione 0.3 mM nella beuta contenente l’inoculo e si induce per circa tre ore. Trascorso il tempo dell’induzione, si centrifuga il contenuto della beuta a 4000 rpm (giri al minuto) per 10 minuti a temperatura ambiente e si elimina il surnatante.
Separazione membrane-citosol (metodo Zerial)
I campioni batterici vengono centrifugati per 10 minuti a 4000 rpm (giri al minuto) a 4°C e il pellet ottenuto viene risospeso in tampone di risospensione Zerial (5ml di tampone per 100 ml di inoculo) al quale si aggiunge inibitore delle proteasi 1X.
Dopo aver risospeso, si aggiungono (per 100 ml di inculo) 400μl di lisozima preparato in acqua e 200 μl di PMSF (Fluoruro di fenilmetansulfonile). Di conseguenza si lascia sull’agitatore un’ora a 4°C. Successivamente si aggiunge 1.2 ml di deossicolato di sodio 20% e si lascia ancora 10 minuti su agitatore a 4°C. Si siringa finché la soluzione diventa fluida e si centrifuga a 15000 x g 1h a 4°C. Il pellet contiene le membrane, il surnatante il citosol. Il pellet si risospende con 2.8 ml di tampone Zerial (per 100ml di inoculo di partenza). Si fanno delle aliquote sia del surnatante che del pellet, si congela in azoto liquido e si conserva a -80°C. Da entrambi i campioni si preleva un’aliquota che viene trattata con Laemmli2Xe DTT 200 mM, la quale viene poi caricata su SDS-PAGE per valutare l’avvenuta separazione.
REAGENTI:
Tampone di risospensione (ZERIAL)
Tris HCl pH 8.5 64 mM
MgCl2 8 mM
EDTA 2 mM
β-mercapto-etanolo 20 mM (si aggiunge prima dell’uso)
Lisozima è preparato in acqua ad una concentrazione di 10 mg/ml
PMSF (Fluoruro di fenilmetan sulfonile) 50 mM
Serina proteasi
Cisteina proteasi (E-64)
Deossicolato di sodio 20%
2g di deossicolato di sodio in 10 ml di acqua distillata, si fa sciogliere in acqua a 20°C in un becher. Si conserva a -20°C.
Purificazione della proteina con la resina Ni-IDA
Si utilizzano 100 μl del surnatante (citosol) ottenuto nella lisi dalla centrifugazione del lisato, e si uniscono a 5 μl di resina Ni-IDA (Biontex). Si pone in incubazione per 60 minuti a 4°C. Si lava la resina per 3 volte con 10 volumi di soluzione di lavaggio, con incubazione di 5’ a 4°C, e si centrifuga per 10’’ a 1000 x g. A questo punto si elimina la fase liquida contenente le proteine prive di poli-His. Dopo aver effettuato i lavaggi, si eluisce la proteina His-Hpn tre volte con 1 volume di buffer di eluizione, con incubazione di 5’ a 4°C, e si conserva l’eluato a -20°C. Si preleva una aliquota per controllo. Il tampone di eluizione contiene una elevata concentrazione di imidazolo, che compete con la poli-His per la chelazione del metallo, determinando il rilascio della proteina di fusione, cioè His-Hpn, dalla resina, che può essere così recuperata sotto forma di soluto della fase mobile stessa.
Attivazione delle superfici in vetro e Si/SiO2
Per permettere l'attacco covalente della proteina alla superficie del supporto solido o substrato è indispensabile preparare il substrato facendo sì che esponga gruppi funzionali in grado di
legare i residui amminoacidici in modo stabile. A tal fine è stato messo a punto il protocollo seguente. Sono stati utilizzati campioni ottenuti a partire da vetrini portaoggetto in vetro (Bio Optica) e wafer di Si/SiO2 (Si-Mat,Kaufering, Germany), con biossido di silicio superficiale dello spessore di 100nm. Si effettua il lavaggio dei substrati per immersione in sequenza in acetone, metanolo, isopropanolo ed acqua, per 5 minuti ciascuno, in un bagno a ultrasuoni e a temperatura ambiente. I singoli vetrini sono stati in seguito asciugati con un flusso abbondante d'azoto. I campioni così ripuliti sono pronti per essere sottoposti a trattamento mediante plasma ad ossigeno; il processo è stato effettuato con l’impiego di ossigeno al 80%, con una potenza di 50 Watt per 60 secondi, consentendo in questo modo l’esposizione dei gruppi -OH funzionali presenti sulla superficie del substrato. A questo punto si procede alla silanizzazione delle superfici mediante immersione in una soluzione di APTS (3-Ammino propil trietossisilano, Fluka) al 9% per 30 minuti a 40°C; terminato il tempo d'incubazione, si sottopone la superficie a 4 lavaggi con acqua distillata di cui l'ultimo in un bagno a ultrasuoni per 5 minuti, utili alla rimozione degli eccessi di APTS. Viene quindi addizionato il cross-linker per immersione in una soluzione di glutaraldeide 10% a temperatura ambiente per 3 ore. Anche in questo caso si effettuano 4 lavaggi in acqua distillata di cui l'ultimo in ultrasuoni per 5 minuti.
Le superfici così preparate, espongono i gruppi aldeidici del cross-linker, che servono per l'ancoraggio della proteina, mediante interazione diretta con la sua porzione N-terminale. E’ cosi possibile procedere con il protocollo di litografia soffice.
REAGENTI:
Superficie in vetro
Vetrini portaoggetto (Bio Optica)
Superficie in Si/SiO2
Wafer di Si/SiO2 (Si-Mat, Kaufering, Germany) con biossido di silicio superficiale dello
spessore di 100nm
Soluzione al 9% di APTS (3-Ammino propil trietossisilano)
Preparato in acqua a partire da APTS puro al ≥98.0% (Fluka)
Soluzione al 10% di Glutaraldeide
Preparato in acqua a partire da una soluzione acquosa al 50% di Glutaraldeide (Sigma-Aldrich) Produzione dello stampo in PDMS: Replica Molding
Le repliche in PDMS sono state prodotte mediante Replica Molding, sfruttando dei master in silicio ottenuti per litografia ottica. Si procede alla preparazione del PDMS (Sylgard 184, Dow Corning) miscelando energicamente in un recipiente la base polimerica ed il curing agent forniti nel kit, in rapporto 9:1. Si ottiene un liquido estremamente viscoso e ricco di bolle d’aria, che viene posto sotto vuoto per favorire il processo di degasamento. A questo punto si versa il composto liquido sui master posizionati su appositi supporti e si porta il sistema alla temperatura di 140°C per 15 minuti. Ad avvenuta polimerizzazione, la replica di PDMS viene incisa con un bisturi lungo il perimetro del pattern e staccata delicatamente dal master con delle pinzette. La replica in PDMS e pronta per essere utilizzata come stampo nel protocollo di Microcontact Printing.
REAGENTI:
Polidimetilsilossano (PDMS) (Sylgard 184, Dow Corning)
Microcontact Printing della proteina His-Hpn
Al termine dell'attivazione delle superfici supporto e della produzione delle repliche, si avvia la procedura utile allo stampaggio della proteina.
Si procede depositando la soluzione contenente la proteina His-Hpn ad una concentrazione 15 μg/ml sulle superfici delle repliche in PDMS. E’ importante che la distribuzione dell’inchiostro molecolare permetta una completa copertura del pattern da replicare. L'incubazione dello
stampo elastomerico con la proteina procede per 30 minuti a 4°C al fine di ottenerne la deposizione ed un blando physisorption, cioè un’interazione di bassa intensità tra la superficie elastomerica e la proteina dovuta a legami intermolecolari deboli (es. legami di van der Waals). Terminata l'incubazione, prima di procedere al contatto della replica sulla superficie, viene favorita l'evaporazione del solvente mediante abbondante flusso di azoto. Si posiziona la replica con la faccia recante il pattern inchiostrato sulla superficie esprimente il crosslinker, cercando di realizzare un contatto conforme. Per garantire la costituzione dei legami covalenti, lo stampo è lasciato sul substrato una notte a 4°C. Il giorno seguente, viene rimossa la replica e si effettuano quindi 3 lavaggi in PBS 1X al termine dei quali è possibile conservare i campioni in PBS 1X a 4°C.
REAGENTI:
Buffer di lavaggio
PBS 1X
Claims (10)
- Rivendicazioni 1. Dispositivo biorecettore di ioni metallici, caratterizzato dal fatto che comprende almeno un supporto solido ed almeno una componente proteica, detta componente proteica essendo almeno una proteina Hpn ancorata a detto supporto tramite legame di tipo covalente.
- 2. Dispositivo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto legame di tipo covalente è un legame covalente imminico.
- 3. Dispositivo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detti ioni metallici sono ioni Ni<2+>.
- 4. Dispositivo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta proteina Hpn è una proteina His-Hpn avente sequenza amminoacidica MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDRWGSELAAASMAHHEE QHGGHHHHHHHTHHHHYHGGEHHHHHHSSHHEEGCCSTSDSHHQEEGCCH GHHE (SEQ. ID NO.4).
- 5. Dispositivo secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che detta proteina è espressa nel sistema eterologo Escherichia coli BL21(DE3), a partire dal costrutto pRSETA-Hpn avente sequenza SEQ. ID NO.6.
- 6. Dispositivo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto supporto solido è vetro e/o silice.
- 7. Procedimento per la preparazione del dispositivo di cui alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto supporto è funzionalizzato mediante l'uso in sequenza dell’agente silanizzante 3-Amminopropiltrietossisilano (APTS) e del cross-linker glutaraldeide, mediante auto-assemblaggio dei monostrati molecolari, con ottenimento di un supporto funzionalizzato.
- 8. Procedimento secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che detto supporto funzionalizzato è esposto a detta proteina trasferita in strati continui o con disegni specifici (litografici) tramite il processo litografico soffice della stampa a microcontatto o Micro-Contact Printing.
- 9. Uso del dispositivo biorecettore di ioni metallici di cui alla rivendicazione 1, per la rilevazione di ioni metallici.
- 10. Uso del dispositivo biorecettore di ioni metallici di cui alla rivendicazione 1, come componente di dispositivi biomedicali.
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| Country | Link |
|---|---|
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