CN104789639B - 用于对nadh依赖型酶底物进行检测的融合蛋白及其应用 - Google Patents
用于对nadh依赖型酶底物进行检测的融合蛋白及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104789639B CN104789639B CN201510192100.3A CN201510192100A CN104789639B CN 104789639 B CN104789639 B CN 104789639B CN 201510192100 A CN201510192100 A CN 201510192100A CN 104789639 B CN104789639 B CN 104789639B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nadh
- fusion protein
- superfrex
- dehydrogenase
- dependent form
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及用于对NADH依赖型酶底物进行检测的融合蛋白及其应用。本发明的蛋白包括NADH依赖型酶和NADH荧光探针，其可应用于对NADH依赖型酶底物进行检测，具有非常理想的检测灵敏度。本发明还揭示了编码所述融合蛋白的多核苷酸，含有所述多核苷酸的表达载体及宿主细胞，以及应用所述融合蛋白检测NADH依赖型酶底物的方法。
Description
技术领域
本发明属于酶学检测领域，更具体地，本发明涉及用于对NADH依赖型酶底物进行检测的融合蛋白及其应用。
背景技术
氧化还原反应是人体中一类重要的代谢反应，此类反应需要在酶的催化下才能进行。NADH依赖型酶是参与人体氧化还原中最多的酶，据统计约80％的反应是由NADH依赖型酶催化的。NADH依赖型酶的底物大都是人体中非常关键的代谢产物。许多代谢疾病的发生都与这些代谢物水平的异常有关。因此，NADH依赖型酶底物的检测对疾病的诊断和治疗以及基础研究都有重大价值。
但是，由于多数NADH依赖型酶底物没有明显的光学特性，故很难用常规的光学手段直接检测这些代谢产物。较早的检测方法主要是滴定法、HPLC分析、气相色谱法等化学分析法，此类方法存在两个主要的缺陷：1、检测操作复杂且耗时；2、有效灵敏度受仪器精密度所限。随后，根据NADH依赖型酶催化其底物产生或消耗NADH特性，发展出了一系列酶学检测方法，包括：
NADH吸光法：NADH依赖性酶都以NADH或NAD+为辅酶，其催化的反应都会产生或消耗NADH。在吸光方面，NADH在260nm和340nm处各有一吸收峰，而NAD+则只有260nm一处吸收峰，两者间的这种属性差异使得NADH成为NADH依赖性酶检测的重要指标，通过测定反应混合溶液对340nm光吸收的变化来监控酶促反应的进程。已知NADH在340nm的吸光系数为6.2*103L/(mol*cm)，根据检测结果可以直接计算出酶的活力，此种方法虽然操作方便，但灵敏度不高，会影响测定结果的精准度。
NADH荧光检测法：作为NADH依赖性酶的重要检测指标，NADH除具有吸光特性外，还是一种强荧光物质，其最大激发波长和发射波长分别为340和460nm，而NAD+则无荧光。NADH的这一特性为其荧光分析法奠定了基础，因而很早就建立了NADH的荧光测定法，虽然荧光检测法的灵敏度比吸光法提高了许多，但是仍未能满足实验的需要。
MTT及其类似物分析法：MTT是一种黄颜色的染料，全称3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，主要用于检测细胞活力，也常用于NAD+(NADP+)相关的酶偶联分析。MTT用于NADH依赖性酶分析的原理是：NADH依赖性酶催化产生的NADH，可通过硫酸甲酯吩嗪(PMS)将电子传递给MTT，使得MTT被还原成甲臜，后者在波长560nm处有最大吸光，故可在560nm检测反应混合溶液的OD值以测定NADH依赖性酶的活力。但是由于MTT经还原所产生的甲臜难溶于水，需要被溶解后才能检测，既增加了工作量，又影响了实验结果的准确性，故研究人员又相继开发了许多MTT的替代产品，例如，XTT，MTS和WST系列化合物，这些都是四氮唑染料，它们对NADH依赖性酶检测的原理与MTT类似。
酶循环法：酶循环法是采用两种酶进行循环反应，使待测物的酶促反应产物不断扩增，循环数越多，扩增量也越大。酶循环法通过增加反应产物的量和降低共存物质的干扰，提高了检测的灵敏度。申请号为US3384555 A的美国专利公开了一种NADH依赖性酶活性的酶循环检测方法，该方法是基于心肌黄酶/刃天青系统，心肌黄酶催化NADH依赖性酶的生成物NADH将电子转移到刃天青上，产生强荧光的试卤灵，通过测定后者的荧光来计算酶活。
虽然MTT及其类似物分析法和酶循环法都大大提高了检测灵敏度。但是它们的电子转移受体对NADH的选择性较低，NADPH等其它一些电子供体会对检测产生干扰，从而影响检测结果的准确性近年来，一些NADH依赖型酶底物的探针也见诸于文献报道。然而，以上大部分的方法都有不同程度的缺陷，或者检测灵敏度低，或者特异性差，或者生物兼容性差。
因此，本领域亟需发展一种灵敏度高，特异性好的NADH依赖型酶底物检测技术。在酶法分析中，直接检测NADH吸光或荧光的信号很弱，检测结果误差较大。近年来基于Rex蛋白和环形置换荧光蛋白融合的遗传编码NADH荧光探针已经被报道，此类探针的灵敏度高，干扰小，并且可用于单细胞或细胞器的动力学检测，此外，还可通过基因工程手段对探针修饰，改变探针对NADH响应的动力学范围，以满足实验需要。
发明内容
本发明的目的在于提供用于对NADH依赖型酶底物进行检测的融合蛋白及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种用于对NADH依赖型酶底物进行检测的融合蛋白，所述的融合蛋白包括：NADH依赖型酶；和NADH荧光探针，其包含：对环境内NADH敏感的多肽和通过光谱性质的改变对环境内NADH进行表现的部分。
在一个优选例中，所述的NADH依赖型酶是催化NADH依赖型底物将H+转移给NAD+而产生NADH的酶。
在另一优选例中，所述的NADH依赖型酶包括(但不限于)：乳酸脱氢酶(LDHA)、苹果酸脱氢酶(MDH1)、异柠檬酸脱氢酶(IDH3A)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、α-酮戊二酸脱氢酶(OGDH)和磷酸甘油酸脱氢酶(HGDH)。
在另一优选例中，所述的乳酸脱氢酶的底物为L-乳酸，所述的苹果酸脱氢酶的底物为L-苹果酸、所述的异柠檬酸脱氢酶的底物为异柠檬酸、所述的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的底物为甘油醛-3-磷酸、所述的α-酮戊二酸脱氢酶的底物为α-酮戊二酸，所述的磷酸甘油酸脱氢酶的底物为α-羟基戊二酸。
在另一优选例中，所述通过光谱性质的改变对环境内NADH进行表现的部分是荧光蛋白序列；所述对NADH敏感的多肽是具有如下特征的多肽：(1)具有NADH结合特性的Rossman结构域；和/或(2)来源于对NADH敏感的转录调控因子Rex家族蛋白。
在另一优选例中，所述的NADH荧光探针是SuperFrex探针。
在另一优选例中，所述的SuperFrex探针包括：(a)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO：1氨基酸序列经过一个或多个(如1-30个，更佳地1-20个，更佳地1-10个，更佳地1-5个或1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗肿瘤功能的由(a)衍生的多肽；(c)与SEQ ID NO：1氨基酸序列具有80％以上(较佳地90％以上；更佳地95％以上；更佳地98％以上或99％以上)的序列相同性的，且具有抗肿瘤功能的多肽；(d)SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽的生物活性片段；或(e)在(a)多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列构成的多肽。
在另一优选例中，所述的乳酸脱氢酶(LDHA)、苹果酸脱氢酶(MDH1)、异柠檬酸脱氢酶(IDH3A)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、α-酮戊二酸脱氢酶(OGDH)和磷酸甘油酸脱氢酶(HGDH)依次是：具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的多肽；或这些多肽的同功能变异多肽或衍生多肽。
在另一优选例中，所述的NADH依赖型酶位于融合蛋白的N端，所述的NADH荧光探针位于融合蛋白的C端。
在另一优选例中，所述的NADH依赖型酶与所述的NADH荧光探针之间，还包括连接肽；较佳地连接肽长度为2～50aa；更佳地为2～30aa。
在另一优选例中，所述的连接肽包括(但不限于)：PW，ASA，ASGA(SEQ ID NO：72)，GSASG(SEQ ID NO：73)，ASGASGA(SEQ ID NO：74)，ASGASSASGA(SEQ ID NO：75)，ASGASSGAGSASGA(SEQ ID NO：76)，PWAAATAASSASASASAPW(SEQ ID NO：77)，PWASAAAATAASSASASAS APW(SEQ ID NO：78)，PWAAATAAAATAASSAS ASASAPW(SEQ ID NO：79)。
在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码前面任一所述的融合蛋白。
在本发明的另一方面，提供一种表达载体，其包含与表达控制序列操作性连接的所述的多核苷酸的序列。
在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，其包含所述的表达载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种制备前面所述的融合蛋白的方法，该方法包括以下步骤：(a)培养所述的宿主细胞，和(b)由所述宿主细胞表达和分离所述的融合蛋白。
在本发明的另一方面，提供前面任一所述的融合蛋白的用途，用于对NADH依赖型酶底物进行检测；或用于制备对NADH依赖型酶底物进行检测的检测试剂或试剂盒。
在本发明的另一方面，提供一种检测NADH依赖型酶底物的方法，所述方法包括：
(1)在包含NAD+的反应体系内，将前面任一所述的融合蛋白与待测样品混合；(2)测定融合蛋白中NADH荧光探针感应NADH所产生的荧光变化，确定待测样品中NADH依赖型酶底物的存在情况或存在量。
在一个优选例中，所述的融合蛋白中，所述的NADH荧光探针是SuperFrex探针；通过分析反应的速度或达到平衡时420nm/485nm的荧光比率来确定相应底物的存在情况或存在量。
在另一优选例中，所述的NADH依赖型酶底物包括(但不限于)：L-乳酸，L-苹果酸、异柠檬酸、甘油醛-3-磷酸、α-酮戊二酸，α-羟基戊二酸。
在本发明的另一方面，提供一种用于检测NADH依赖型酶底物的试剂盒，所述试剂盒中包括：前面任一所述的融合蛋白，或前面所述的表达载体。
在一个优选例中，所述的试剂盒中还包括以下一种或多种：NAD+溶液，Hepes，多孔板，使用说明书。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、本发明的融合蛋白探针对NADH依赖型酶底物进行检测的原理示意图。
图2、实施例1纯化的蛋白的SDS-PAGE电泳结果。M为蛋白标准，1、2、3、4、5、6分别为：LDHA-superFrex、MDH1-superFrex、IDH3A-superFrex、GAPDH-superFrex、OGDH-superFrex；HGDH-superFrex；7、8、9、10、11、12分别为superFrex-LDHA、superFrex-MDH1、superFrex-IDH3A、superFrex-GAPDH、superFrex-OGDH、superFrex-HGDH。
图3、为5种探针分别对不同浓度的底物(乳酸、苹果酸、异柠檬酸、甘油醛-3-磷酸、α-酮戊二酸、α-羟基戊二酸)响应随时间的变化曲线。
图4、反应平衡时的荧光比值F420/F485与检测体系中底物浓度的对应关系。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，揭示了一种融合蛋白，该蛋白包括NADH依赖型酶(NADH依赖型代谢酶)和NADH荧光探针，其可应用于对NADH依赖型酶底物进行检测，具有非常理想的检测灵敏度。
NADH依赖型酶
本发明中，术语“NADH依赖型酶”是指催化NADH依赖型底物将H+转移给NAD+而产生NADH的一类酶。多种适合的NADH依赖型酶均可用于制备本发明的融合蛋白。例如，所述的NADH依赖型酶包括但不限于：乳酸脱氢酶(LDHA，氨基酸序列如SEQ ID NO：2)、苹果酸脱氢酶(MDH1，氨基酸序列如SEQ ID NO：3)、异柠檬酸脱氢酶(IDH3A，氨基酸序列如SEQ ID NO：4)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH，氨基酸序列如SEQ ID NO：5)、α-酮戊二酸脱氢酶(OGDH，氨基酸序列如SEQ ID NO：6)和磷酸甘油酸脱氢酶(HGDH，氨基酸序列如SEQ ID NO：7)等。
NADH依赖型酶的保留酶功能的变异体也包含在本发明中。适当替换氨基酸是本领域的公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使人们认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224。
NADH依赖型酶的生物活性片段也可以应用到本发明中。在这里，NADH依赖型酶的生物活性片段的含义是指作为一种多肽片段，其仍然能保持全长的NADH依赖型酶的全部或部分功能。正常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长NADH依赖型酶的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。
经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的NADH依赖型酶的氨基酸序列也包括在本发明中。
NADH荧光探针
本发明中，所述的“NADH荧光探针”是指一种多肽，其含有对环境内NADH敏感的多肽和通过光谱性质的改变对环境内NADH进行表现的部分。在一个实施方式中，所述通过光谱性质的改变对环境内NADH进行表现的部分是荧光蛋白序列或其衍生物。在另一个实施方式中，所述对NADH敏感的多肽是具有如下特征的多肽，或其功能片段或NADH结合结构域：(1)具有NADH结合特性的Rossman结构域；和/或(2)来源于对NADH敏感的转录调控因子Rex家族蛋白。
申请号为CN102344494A的中国专利公开了一系列高灵敏度还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的重组荧光融合蛋白检测探针。其中，还原型和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸比率探针superFrex(F-rex2-2.20)对NADH响应的范围广，且对NADPH无响应。
因此，在本发明的一个具体实施方式中，所述NADH荧光探针是SuperFrex。SuperFrex的保留功能的变异体也包含在本发明中。SuperFrex的生物活性片段也可以应用到本发明中。在这里，SuperFrex的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的SuperFrex的全部或部分功能。正常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长SuperFrex的活性。在更优选的条件下，所述生物活性片段能够保持60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。
具体地说，SuperFrex具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的SuperFrex的氨基酸序列也包括在本发明中。
连接
作为本发明的一种优选的方式，所述的NADH依赖型酶和NADH荧光探针通过多肽连接子连接，从而形成融合蛋白。在有些情况下，在NADH依赖型酶和NADH荧光探针的氨基酸序列之间连接上一段适当长度的氨基酸接头，可大大提高融合蛋白的检测灵敏度。
本发明人发现，通过在NADH依赖型酶和NADH荧光探针之间进行氨基酸链的修饰或改变连接子的柔韧性，可以改变其对NADH依赖型酶底物检测的灵敏度以及检测范围，以满足不同的检测需要。
在本发明的一种方式中，所述的连接子包括2～50个氨基酸。在本发明的更优选的方式中，所述的连接子包括2～30aa个氨基酸。
作为一种优选的方式，所述的NADH依赖型酶位于融合蛋白的氨基端(N端)；所述的NADH荧光探针位于融合蛋白的羧基端(C端)。
此外，作为另一种方式，将所述的NADH依赖型酶和NADH荧光探针直接连接，比如把NADH荧光探针与NADH依赖型酶的编码基因直接连接，融合表达，二者之间不加氨基酸连接子。
作为本发明的一种优选方式，所述的融合蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，6-His，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1等等。这些标签可用于对融合蛋白进行纯化。
核酸分子、表达载体和宿主细胞
本发明也提供了编码所述的融合蛋白的分离的核酸，也可以是其互补链。
任何编码NADH依赖型酶的合适的DNA结构都适用于本发明。任何编码NADH荧光探针的合适的DNA结构也适用于本发明。下文实例中提及的序列都适用于本发明的方法。
并且，本发明还提供了包含编码所述融合蛋白的核酸分子的载体。多种合适的载体可应用于本发明，在本发明的优选方式中，所述的载体为pRSETb或其同系列载体。
表达载体包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合蛋白DNA序列，如哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因。调节序列包括转录启动子、操纵子、增强子、核糖体结合位点或控制转录和翻译起始和终止的合适序列。在融合蛋白序列需要调节序列功能的时候，则连接合适的调节序列。这样，启动子序列被连接在编码融合蛋白DNA序列前端。在宿主细胞内的复制的能力通常由复制起始点控制。用于转化株识别的筛选基因也可加入表达载体。
另外，非天然的NADH依赖型酶或NADH荧光探针的信号肽的编码序列可以引入表达载体。例如：信号肽(分泌引导物)序列可以和与融合蛋白编码序列融合，从而使翻译的融合蛋白可分泌到细胞外。信号肽可增强宿主细胞向胞外分泌嵌合多肽。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。
此外，含有编码所述融合蛋白的核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。在本发明的一种方式中，该细胞可为原核细胞，如所述细胞可为大肠杆菌细胞(E.coli)。
生产融合蛋白的方法
生产融合蛋白的方法也已包括在本发明中。所述方法包括培养含有融合蛋白编码核酸的重组细胞。所述的融合蛋白包括NADH依赖型酶以及NADH荧光探针。所述方法可包括让细胞表达编码的融合蛋白，以及使表达的融合蛋白的复性。在一个实例中，所述方法还可包括复性的融合蛋白的分离和/或纯化。所述方法的产物也被保护。
可将上述制备获得的融合蛋白纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。例如，当重组蛋白为分泌表达时，可以采用商品化的超滤膜，例如Millipore、Amicon、Pellicon等公司产品，首先将表达上清浓缩。浓缩液可采用凝胶层析的方法进一步加以纯化，或采用离子交换层析的方法纯化。例如阴离子交换层析(DEAE等)或阳离子交换层析。凝胶基质可为琼脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白纯化的基质。SP基团是较为理想的离子交换基团。最后，还可用反相高效液相色谱(RP-HPLC)等方法对上述纯化产物进一步精制纯化。上述所有纯化步骤可利用不同的组合，最终使蛋白纯度达到基本均一。
可利用含有NADH依赖型酶或NADH荧光探针的抗体、受体或配体的亲和层析柱对表达的融合性多肽进行纯化。根据所使用的亲和柱的特性，可利用常规的方法，如高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合性多肽。
融合蛋白的用途
本发明的NADH依赖型酶与NADH荧光探针的融合蛋白可用于对NADH依赖型酶底物进行检测。
所述的融合蛋白中，所述的NADH依赖型酶可催化其底物产生NADH，NADH被NADH荧光探针所响应，通过检测NADH荧光探针的响应信号，间接对酶促反应底物进行分析。如图1，列举了针对几种NADH依赖型酶底物，其相应的NADH依赖型酶参与的反应过程。所述的检测可以是体外或体内的检测，可以是细胞或亚细胞水平的检测，可以是原位的检测。
在另一个实施方式中，本发明的融合蛋白还可应用于筛选药物，所述药物可用于调节对象的NADH依赖型酶底物水平。在另一个实施方式中，本发明提供本发明的融合蛋白可应用于诊断疾病，所述疾病与NADH依赖型酶底物水平有关。
试剂盒
本发明还提供了一种检测NADH依赖型酶底物的试剂盒，其中包含本发明的融合蛋白。所述检测可以在体内、体外、亚细胞或原位水平进行。
本发明还提供一种筛选药物的试剂盒，所述药物可用于调节对象的NADH依赖型酶底物水平，所述试剂盒包含有效量的本发明的融合蛋白。
本发明还提供了一种用于检测与NADH依赖型酶底物水平有关的疾病的试剂盒，所述试剂盒包含有效量的本发明融合蛋白。
在使用时，本领域技术人员能够根据所述融合蛋白的活性方便地确定所述的有效量。
此外，所述的试剂盒中还可包括以下的一种或多种：NAD+溶液，Hepes，多孔板，使用说明书。
本发明中的蛋白质和核酸序列优选以分离形式提供，更优选地被纯化至均质。
下面以L-乳酸、L-苹果酸、丙酮酸、甘油醛-3-磷酸和α-羟基戊二酸5个NADH依赖型酶底物为例并结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中主要采用常规的基因工程分子生物学克隆方法，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的，例如：简.罗斯凯姆斯等的《分子生物学实验参考手册》和J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译：“分子克隆实验指南”(第三版，2002年8月，科学出版社出版，北京)中的有关章节。本领域普通技术人员按照以下实施例，可根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。
实施例中的试剂除特别标注，其他均来自上海国药集团化学试剂有限公司(中国上海)。
实施例中所用的pET28a质粒载体购自Novagen公司，pRSETb质粒载体购自Invitrogen公司，均为原核表达载体，含有His标签、氨苄青霉素抗性基因、T7启动子和IacI基因，可用IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)在原核生物中诱导表达目的蛋白。
所有用于PCR的引物均由上海杰瑞生物工程有限公司合成、纯化和经质谱法鉴定正确。限制性内切酶、T4连接酶购自Fermatas公司，购买时附带有10X TangoTM缓冲液等。
实施例1、融合探针原核表达质粒的构建和表达
L-乳酸、L-苹果酸、异柠檬酸、甘油醛-3-磷酸、α-酮戊二酸和α-羟基戊二酸分别是乳酸脱氢酶(LDHA)、苹果酸脱氢酶(MDH1)、异柠檬酸脱氢酶(IDH3A)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、α-酮戊二酸脱氢酶(OGDH)和磷酸甘油酸脱氢酶(HGDH)的底物，故构建如下质粒：
酶位于superFrex蛋白N端的质粒：pRSETb-LDHA-superFrex、pRSETb-MDH1-superFrex、pRSETb-IDH3A-superFrex、pRSETb-GAPDH-superFrex、pRSETb-OGDH-superFrex、pRSETb-HGDH-superFrex。
酶位于superFrex蛋白C端的质粒：pRSETb-superFrex-LDHA、pRSETb-superFrex-MDH1、pRSETb-superFrex-IDH3A、pRSETb-superFrex-GAPDH、pRSETb-superFrex-OGDH、pRSETb-superFrex-HGDH。
1、扩增LDHA、MDH1、IDH3A、GAPDH、OGDH、HGDH的核酸序列
以含有LDHA、MDH1、IDH3A、GAPDH、OGDH、HGDH基因的cDNA(来自厦门大学韩家淮实验室)为模板，利用相应的引物扩增上述酶的基因，同时扩增SuperFrex的编码序列，引物序列如下：
(1)酶位于superFrex蛋白的N端
LDHA-F：TAGCTCGAGTATGGCAACTCTAAAGGATCAGC(SEQ ID NO：8)
LDHA-R：TAGCCATGGAAATTGCAGCTCCTTTTGGATCCCC(SEQ ID NO：9)
MDH1-F：TAGCTCGAGTATGTCTGAACCAATCAGAGTCC(SEQ ID NO：10)
MDH1-R：TAGCCATGGGGCAGAGGAAAGAAATTCAAAAG(SEQ ID NO：11)
IDH3A-F：TAGCTCGAGATGGCTGGGCCCGCGTGGA(SEQ ID NO：12)
IDH3A-R：TAGCCATGGATCTAAATCTTTTACTCGGCGACA(SEQ ID NO：13)
GAPDH-F：TAGCTCGAGTATGGGGAAGGTGAAGGTCGG(SEQ ID NO：14)
GAPDH-R：TAGCCATGGCTCCTTGGAGGCCATGTG(SEQ ID NO：15)
OGDH-F：TAGCTCGAGTATGTTTCATTTAAGGACTTGTGCTG(SEQ ID NO：16)
OGDH-R：TAGCCATGGCGAGAAGTTCTTGAAGACGTCCA(SEQ ID NO：17)
HGDH-F：TAGCTCGAGTATGAAGGTTTTATGTTATG(SEQ ID NO：18)
HGDH-R：TAGCCATGGTTTGATCTTGTTAGGGCAGTCGCCG(SEQ ID NO：19)
(2)酶位于superFrex蛋白的C端
LDHA-F：CTGCCATGGATGGCAACTCTAAAGGATCAGC(SEQ ID NO：20)
LDHA-R：CTGAAGCTTAAATTGCAGCTCCTTTTGGATCCCC(SEQ ID NO：21)
MDH1-F：CTGCCATGGATGTCTGAACCAATCAGAGTCC(SEQ ID NO：22)
MDH1-R：CTGAAGCTTGGCAGAGGAAAGAAATTCAAAAG(SEQ ID NO：23)
IDH3A-F：CTGCCATGGATGGCTGGGCCCGCGTGGA(SEQ ID NO：24)
IDH3A-R：CTGAAGCTTATCTAAATCTTTTACTCGGCGACA(SEQ ID NO：25)
GAPDH-F：CTGCCATGGATGGGGAAGGTGAAGGTCGG(SEQ ID NO：26)
GAPDH-R：CTGAAGCTTCTCCTTGGAGGCCATGTG(SEQ ID NO：27)
OGDH-F：CTGCCATGGATGTTTCATTTAAGGACTTGTGCTG(SEQ ID NO：28)
OGDH-R：CTGAAGCTTCGAGAAGTTCTTGAAGACGTCCA(SEQ ID NO：29)
HGDH-F：CTGCCATGGATGAAGGTTTATGTATG(SEQ ID NO：30)
HGDH-R：CTGAAGCTTTTTGATCTTGTTAGGGCAGTCGCCG(SEQ ID NO：31)
将PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳，得到LDHA、MDH1、IDH3A、GAPDH、OGDH、HGDH和SuperFrex片段。利用上海生工DNA片段回收纯化试剂盒按照厂商说明书从凝胶中回收和纯化片段。
2、目的基因与载体的连接
分别利用限制性内切酶XhoI/NcoI和NcoI/HindIII将回收纯化的PCR片段以及载体质粒pRSETb分别进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，利用上海生工DNA片段回收纯化试剂盒(上海生物工程有限公司)按照厂商说明书回收并纯化片段。
分别将回收到的LDHA、MDH1、IDH3A、GAPDH、OGDH、HGDH双酶切产物及载体质粒pRSETb的XhoI/NcoI和NcoI/HindIII双酶切产物连接，最终得到含各自酶切位点的质粒pRSETb-LDHA、pRSETb-MDH1、pRSETb-IDH3A、pRSETb-GAPDH、pRSETb-OGDH、pRSETb-HGDH。
以含有SuperFrex基因的质粒pcDNA3.1-cyt-superFrex质粒(参见WO2013/044792)为模板，利用引物SuperFrex-F和SuperFrex-R扩增SuperFrex序列全长，引物SuperFrex-F(1，N端；2，C端)和SuperFrex-R(1，N端；2，C端)序列如下：
SuperFrex-F-1：TAGCCATGGATGAACCGGAAGTGGGGCCTGTGC(SEQ ID NO：32)
SuperFrex-R-1：TGACAAGCTTCTAGCCCATCATCTCCTCCCGCC(SEQ ID NO：33)
SuperFrex-F-2：TAGCTCGAGTATGAACCGGAAGTGGGGCCTGTGC(SEQ ID NO：34)
SuperFrex-R-2：TGACCCATGGCTAGCCCATCATCTCCTCCCGCC(SEQ ID NO：35)
最后，利用NcoI/HindIII和NcoI/HindIII酶分别对上述SuperFrex片段和经过验证的pRSETb-LDHA、pRSETb-MDH1、pRSETb-IDH3A、pRSETb-GAPDH、pRSETb-OGDH和pRSETb-HGDH载体双酶切：反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，利用上海生工DNA片段回收纯化试剂盒按照厂商说明书回收并纯化片段。
将回收到的SuperFrex和pRSETb-LDHA、pRSETb-MDH1、pRSETb-IDH3A、pRSETb-GAPDH、pRSETb-OGDH、pRSETb-HGDH的双酶切产物连接，从而形成最终连接产物pRSETb-LDHA-SuperFrex、pRSETb-MDH1-SuperFrex、pRSETb-IDH3A-SuperFrex、pRSETb-GAPDH-SuperFrex、pRSETb-OGDH-SuperFrex、pRSETb-HGDH-SuperFrex；pRSETb-superFrex-LDHA、pRSETb-superFrex-MDH1、pRSETb-superFrex-IDH3A、pRSETb-superFrex-GAPDH、pRSETb-superFrex-OGDH、pRSETb-superFrex-HGDH。
取菌落PCR鉴定为阳性的克隆，采用通用引物测序，由上海杰李生物技术有限公司进行测序。测定的序列用Vector NTI 8.0进行数据比对分析。
3、蛋白质表达纯化
分别将重组质粒pRSETb-LDHA-SuperFrex、pRSETb-MDH1-SuperFrex、pRSETb-IDH3A-SuperFrex、pRSETb-GAPDH-SuperFrex、pRSETb-OGDH-SuperFrex、pRSETb-HGDH-SuperFrex；pRSETb-superFrex-LDHA、pRSETb-superFrex-MDH1、pRSETb-superFrex-IDH3A、pRSETb-superFrex-GAPDH、pRSETb-superFrex-OGDH和pRSETb-superFrex-HGDH转化入感受态的大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)pLysS(购自天根生化，中国北京)中，方法如下：
(i)在无菌条件下，取1μl质粒加入100μl感受态的大肠杆菌中，冰浴30分钟；
(ii)冰浴后，迅速于42℃水浴中热激90秒；
(iii)再冰浴2分钟；
(iv)加入500μl LB液体培养基，37℃、220rpm摇床复苏1小时；
(v)5000rpm、常温离心4分钟后，弃去上清；
(vi)用少量的新鲜LB重悬沉淀，随后将全部菌液均匀涂布于所需的LB平板上，37℃倒置培养过夜。挑取平板上的克隆，并转入100ml含有相应抗性的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养至OD约为0.4-0.6，加入0.1mM IPTG，18℃诱导表达24小时，用Ni2+亲和层析柱(通用电气，瑞典乌普萨拉)从菌体裂解液中分离纯化LDHA-superFrex、MDH1-superFrex、IDH3A-superFrex、GAPDH-superFrex、OGDH-superFrex、HGDH-superFrex、superFrex-LDHA、superFrex-MDH1、superFrex-IDH3A、superFrex-GAPDH、superFrex-OGDH、superFrex-HGDH蛋白，SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达，结果见图2，从中可看出，当酶位于superFrex C端的时候(7、8、9、10、11、12)，融合蛋白之间的Linker会发生断裂，导致获得的目的蛋白纯度和产量很低。因此，本发明人选择将酶位于superFrex N端的融合蛋白LDHA-SuperFrex、MDH1-SuperFrex、IDH3A-SuperFrex、GAPDH-SuperFrex、OGDH-SuperFrex和HGDH-SuperFrex后续实施例。
实施例2、融合蛋白探针对底物响应的检测
分别检测融合蛋白探针对各自底物(L-乳酸、L-苹果酸、异柠檬酸、甘油醛-3-磷酸、α-酮戊二酸和α-羟基戊二酸)的响应。
(1)配制反应混合溶液：100mM Hepes(PH 7.4)，200μM NAD+，0.2μL融合蛋白探针(选自LDHA-SuperFrex、MDH1-SuperFrex、IDH3A-SuperFrex、GAPDH-SuperFrex、OGDH-SuperFrex和HGDH-SuperFrex蛋白)。
(2)向黑色的96孔塑料检测板分别加入50μL反应混合溶液，37℃孵育5min后，分别加入50μL相应的样品溶液，立即用多功能酶标仪测定SuperFrex荧光，为保证数据准确性，对每个样品做3组平行检测。
(3)处理数据。
图3显示的是探针对其不同浓度的底物的响应，加入底物后，酶促反应迅速达到平衡。图4指示的是达到平衡时荧光比率(420nm/485nm)与底物浓度的关系。
此外，通过与传统检测方法进行对比，本发明具有以下优点：检测灵敏且迅速，耗时短，可对单个细胞的底物进行实时监测，可优化性好。
实施例3、衍生探针的构建和表达
探针构建原理：分别以pRSETb-LDHA-SuperFrex、pRSETb-MDH1-SuperFrex、pRSETb-IDH3A-SuperFrex、pRSETb-GAPDH-SuperFrex、pRSETb-OGDH-SuperFrex和pRSETb-HGDH-SuperFrex质粒为模板，根据反向PCR的原理，分析连接各酶和SuperFrex之间的氨基酸长度对反应的影响。
设计酶(LDHA/MDH1/IDH3A/GAPDH/OGDH/HGDH)-Linker-SuperFrex探针。
1、突变文库的建立
引物设计如表1。
表1
2、PCR扩增
利用反向PCR进行Linker的筛选。
突变PCR扩增体系(引物、酶、dNTP等来自富酶泰斯公司)如表2。
表2
3、DNA片段分离、纯化
DpnI消化
首先利用DpnI酶(来自富酶泰斯公司)在37℃处理上述PCR扩增片段3小时，以便去除潜在的模板质粒污染。然后，使反应体系在80℃变性失活20分钟。经变性失活的反应混合物可以直接用于后续的分子生物学实验。
DNA片段磷酸化
在ATP存在下，利用T4多聚核苷酸激酶(T4polynucleotide kinase，T4PNK)(来自富酶泰斯公司)在37℃处理1小时，以使DNA核糖环的5’-OH磷酸化，以便于片段环化自连。然后，使反应体系在75℃变性失活10分钟。变性失活的反应混合物可以直接用于后续的分子生物学实验。
连接
用T4DNA连接酶(来自富酶泰斯公司)将经过磷酸化处理的DNA片段(突变的DNA片段pRSETb-LDHA-SuperFrex、pRSETb-MDH1-SuperFrex、pRSETb-PDHA-SuperFrex、pRSETb-GAPDH-SuperFrex和pRSETb-HGDH-SuperFrex)进行环化自连(16℃，过夜)。
双引物退火
若融合蛋白之间氨基酸链较长(>20A)，则可直接在引物中设计此氨基酸链。引物合成后，将上下游引物退火。然后直接将退火后的DNA片段连接到双酶切过的载体上，参照实施例1。
突变体质粒鉴定
取菌落PCR筛选为阳性的克隆，采用通用引物测序，由上海杰李生物工程有限公司完成。测定的序列用DNAMAN6.0进行数据比对分析。
4、蛋白质表达纯化
用与实施例1中同样的方法表达和纯化探针。
采用如上方法，制备获得序列如表3的融合探针。其中，Ls-2是LDHA-linker(2个氨基酸)-superFrex的缩写；Ms-2是MDH1-linker(2个氨基酸)-superFrex的缩写；Is-2是IDH3A-linker(2个氨基酸)-superFrex的缩写；Gs-2是GAPDH-linker(2个氨基酸)-superFrex的缩写；Os-2是OGDH-linker(2个氨基酸)-superFrex的缩写；Hs-2是HGDH-linker(2个氨基酸)-superFrex的缩写；其它命名方式也以此为参照。
表3
表3中，LDHA氨基酸序列如SEQ ID NO：2；MDH1氨基酸序列如SEQ ID NO：3；IDH3A氨基酸序列如SEQ ID NO：4；GAPDH氨基酸序列如SEQ ID NO：5；OGDH氨基酸序列如SEQ ID NO：6；HGDH氨基酸序列如SEQ ID NO：7；SuperFrex氨基酸序列如SEQ ID NO：1；Linker的氨基酸序列如下划线。
融合蛋白探针对乳酸响应的性质如表4。Kf表示融合蛋白探针对底物响应达到最大值一半时对应的底物浓度。
表4
由表4的结果可见融合蛋白之间Linker长度对Kf有影响，当Linker长度为2个氨基酸时，融合蛋白对底物响应的Kf值最小，分析灵敏度相对高。
本发明人将本发明制备的融合蛋白代谢物探针与传统的针对L-乳酸等底物的检测方法进行比较如表5。
表5
注：
1，融合蛋白探针的检测结果可指示底物浓度的瞬时变化。
2，酶促反应产生的NADH信号被superFrex探针放大，因此融合蛋白探针对底物响应灵敏度很高。
3，由于检测体系中只需加入少量融合蛋白探针和NAD+，因此本发明成本低廉且操作简便。
4，可将融合蛋白探针定位到细胞膜外表面，实现对单个细胞代谢物分泌的实时分析。
5，可通过理性设计、基因突变、优化linker等方式进行基因改造，得到对代谢物特应性检测的不同灵敏度或动态范围的融合蛋白探针。
上述实施例中，描述了6种NADH依赖型酶底物的探针及其应用，应理解本发明还涵盖其它的NADH依赖型酶检测相应的底物的技术方案。本领域技术人员通过阅读本说明书可获知不背离本发明的构思和范围的各种改进。因此，这些其他实施方式也应包括在所附权利要求书的范围内。
Claims (16)
1.一种用于对NADH依赖型酶底物进行检测的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白包括：
NADH依赖型酶；所述的NADH依赖型酶包括：乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶和磷酸甘油酸脱氢酶；和
NADH荧光探针，其包含：对环境内NADH敏感的多肽和通过光谱性质的改变对环境内NADH进行表现的部分；所述的NADH荧光探针是SuperFrex探针，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
其中，所述的NADH依赖型酶位于融合蛋白的N端，所述的NADH荧光探针位于融合蛋白的C端。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的NADH依赖型酶是催化NADH依赖型底物将H+转移给NAD+而产生NADH的酶。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的乳酸脱氢酶的底物为L-乳酸，所述的苹果酸脱氢酶的底物为L-苹果酸、所述的异柠檬酸脱氢酶的底物为异柠檬酸、所述的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的底物为甘油醛-3-磷酸、所述的α-酮戊二酸脱氢酶的底物为α-酮戊二酸，所述的磷酸甘油酸脱氢酶的底物为α-羟基戊二酸。
4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述通过光谱性质的改变对环境内NADH进行表现的部分是荧光蛋白序列；所述对NADH敏感的多肽是具有如下特征的多肽：(1)具有NADH结合特性的Rossman结构域；和/或(2)来源于对NADH敏感的转录调控因子Rex家族蛋白。
5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的NADH依赖型酶与所述的NADH荧光探针之间，还包括连接肽，其长度为2～50aa。
6.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述的连接肽长度为2～30aa。
7.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码权利要求1～6任一所述的融合蛋白。
8.一种表达载体，其特征在于，其包含与表达控制序列操作性连接的如权利要求7所述的多核苷酸的序列。
9.一种宿主细胞，其特征在于，其包含权利要求8所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求7所述的多核苷酸。
10.一种制备权利要求1～6任一所述的融合蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(a)培养权利要求9所述的宿主细胞，和
(b)由所述宿主细胞表达和分离所述的融合蛋白。
11.如权利要求1～6任一所述的融合蛋白的用途，用于对NADH依赖型酶底物进行检测；或用于制备对NADH依赖型酶底物进行检测的检测试剂或试剂盒。
12.一种检测NADH依赖型酶底物的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)在包含NAD+的反应体系内，将权利要求1～6任一所述的融合蛋白与待测样品混合；
(2)测定融合蛋白中NADH荧光探针感应NADH所产生的荧光变化，确定待测样品中NADH依赖型酶底物的存在情况或存在量。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的融合蛋白中，通过分析反应的速度或达到平衡时420nm/485nm的荧光比率来确定相应底物的存在情况或存在量。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的NADH依赖型酶底物包括：L-乳酸，L-苹果酸、异柠檬酸、甘油醛-3-磷酸、α-酮戊二酸，α-羟基戊二酸。
15.一种用于检测NADH依赖型酶底物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：权利要求1～6任一所述的融合蛋白，或权利要求8所述的表达载体。
16.如权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括以下一种或多种：NAD+溶液，Hepes，多孔板，使用说明书。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510192100.3A CN104789639B (zh) | 2015-04-21 | 2015-04-21 | 用于对nadh依赖型酶底物进行检测的融合蛋白及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510192100.3A CN104789639B (zh) | 2015-04-21 | 2015-04-21 | 用于对nadh依赖型酶底物进行检测的融合蛋白及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104789639A CN104789639A (zh) | 2015-07-22 |
| CN104789639B true CN104789639B (zh) | 2018-01-12 |
Family
ID=53554829
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510192100.3A Active CN104789639B (zh) | 2015-04-21 | 2015-04-21 | 用于对nadh依赖型酶底物进行检测的融合蛋白及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104789639B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107727644A (zh) * | 2016-08-12 | 2018-02-23 | 上海华盈生物医药科技有限公司 | 一种(d)‑2‑羟基戊二酸检测试剂盒 |
| CN110777188B (zh) * | 2019-10-31 | 2024-02-27 | 申友基因组研究院(南京)有限公司 | 一种酶法检测谷氨酸含量的方法及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6469154B1 (en) * | 1999-05-21 | 2002-10-22 | The Regents Of The University Of California | Fluorescent protein indicators |
| CN102344494A (zh) * | 2011-09-26 | 2012-02-08 | 华东理工大学 | 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸基因编码荧光探针及其制备方法和应用 |
| CN104122238A (zh) * | 2013-04-25 | 2014-10-29 | 华东师范大学 | 荧光探针中的比率探测方法 |
| CN104155269A (zh) * | 2014-06-25 | 2014-11-19 | 浙江清华长三角研究院 | 一种新型荧光蛋白Frex体外检测血乳酸的方法 |
-
2015
- 2015-04-21 CN CN201510192100.3A patent/CN104789639B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6469154B1 (en) * | 1999-05-21 | 2002-10-22 | The Regents Of The University Of California | Fluorescent protein indicators |
| CN102344494A (zh) * | 2011-09-26 | 2012-02-08 | 华东理工大学 | 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸基因编码荧光探针及其制备方法和应用 |
| CN104122238A (zh) * | 2013-04-25 | 2014-10-29 | 华东师范大学 | 荧光探针中的比率探测方法 |
| CN104155269A (zh) * | 2014-06-25 | 2014-11-19 | 浙江清华长三角研究院 | 一种新型荧光蛋白Frex体外检测血乳酸的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104789639A (zh) | 2015-07-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lemeille et al. | Stt7-dependent phosphorylation during state transitions in the green alga Chlamydomonas reinhardtii | |
| Pratter et al. | More than just a halogenase: modification of fatty acyl moieties by a trifunctional metal enzyme | |
| Tanaka et al. | Exploring enzymatic catalysis at a solid surface: a case study with transglutaminase-mediated protein immobilization | |
| EP3259365A1 (en) | Sensors, methods and kits for detecting nicotinamide adenine dinucleotides | |
| CN111198272A (zh) | 体外检测蛋白间相互作用的方法和检测试剂盒及其应用 | |
| CN104789639B (zh) | 用于对nadh依赖型酶底物进行检测的融合蛋白及其应用 | |
| Dayal et al. | Exposing the alkanesulfonate monooxygenase protein–protein interaction sites | |
| EP1728080A2 (en) | Development and use of fluorescent probes of unbound analytes | |
| Landrieu et al. | Characterization of the Arabidopsis thaliana Arath; CDC25 dual-specificity tyrosine phosphatase | |
| CN112763562B (zh) | 一种用于三磷酸腺苷检测的枝桠型步行机适体电化学传感器制备方法 | |
| Jang et al. | Green, orange, red, and far-red optogenetic tools derived from cyanobacteriochromes | |
| WO2017183717A1 (ja) | ＨｂＡ１ｃデヒドロゲナーゼ | |
| Yu et al. | Highly sensitive and selective detection of inorganic phosphates in the water environment by biosensors based on bioluminescence resonance energy transfer | |
| Deo et al. | An Immunoassay for Leu-enkephalin Based on a C-Terminal Aequorin− Peptide Fusion | |
| Fujii et al. | Reversible switching of fluorophore property based on intrinsic conformational transition of adenylate kinase during its catalytic cycle | |
| Yu et al. | Photocontrolled reversible self-assembly of dodecamer nitrilase | |
| Miladi et al. | An improved strategy for easy process monitoring and advanced purification of recombinant proteins | |
| CA2998112A1 (en) | High-throughput split aptamer screening assay | |
| Lee et al. | Microarrays of peptides elevated on the protein layer for efficient protein kinase assay | |
| Dikici et al. | Drug detection based on the conformational changes of calmodulin and the fluorescence of its enhanced green fluorescent protein fusion partner | |
| Murata et al. | An electrochemical device for the assay of the interaction between a dioxin receptor and its various ligands | |
| JP2018530605A (ja) | プロテアーゼ抵抗性のストレプトアビジン | |
| Li et al. | Multiple recognition-based sensor for pesticide residues | |
| Müller et al. | Rotary F1‐ATPase: Is the C‐terminus of subunit γ fixed or mobile? | |
| CN108107209B (zh) | 一种检测分泌型报告蛋白含量的优化方法及其所用生物材料 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |