CN104155269A

CN104155269A - 一种新型荧光蛋白Frex体外检测血乳酸的方法

Info

Publication number: CN104155269A
Application number: CN201410293387.4A
Authority: CN
Inventors: 欧文斌; 严子琴; 孟凡国; 刘丽; 刘俊; 李海龙
Original assignee: Botai Biological Science & Technology Development Co Ltd Jiaxing; Yangtze Delta Region Institute of Tsinghua University Zhejiang
Current assignee: Botai Biological Science & Technology Development Co Ltd Jiaxing; Yangtze Delta Region Institute of Tsinghua University Zhejiang
Priority date: 2014-06-25
Filing date: 2014-06-25
Publication date: 2014-11-19

Abstract

一种新型荧光蛋白Frex体外检测血乳酸的方法，该方法是：以氧化型辅酶Ⅰ(NAD⁺)作氢受体，乳酸脱氢酶(LDH)催化L-乳酸和NAD⁺生成丙酮酸和NADH，荧光蛋白Frex特异性的与生成的NADH结合并激发荧光，荧光的强弱与乳酸的浓度成线性关系；通过记录荧光强度即可根据荧光强度推算出乳酸浓度，用已知浓度的乳酸测出的荧光强度，做出乳酸浓度标准曲线，未知浓度的乳酸样品就可从该标准曲线推算出来；它具有操作便捷，灵敏度高，检测更安全，有利于环境保护，线性范围宽等特点。

Description

一种新型荧光蛋白Frex体外检测血乳酸的方法

技术领域

本发明涉及一种采用新型荧光蛋白Frex体外检测血乳酸的方法，属于医学检验测定技术领域。

背景技术

乳酸是体内糖代谢的中间产物，主要由红细胞、横纹肌和脑组织产生，血液中的乳酸浓度主要取决于肝脏及肾脏的合成速度和代谢率。在某些病理情况下(如呼吸衰竭或循环衰竭时)，可引起组织缺氧，由于缺氧可引起体内乳酸升高。另外，体内葡萄糖代谢过程中，如糖酵解速度增加，剧烈运动、脱水时，也可引起体内乳酸升高。体内乳酸升高可引起乳酸中毒。检查血乳酸水平，可提示潜在疾病的严重程度。同时，血乳酸测定对指导重症监护患者救治有非常重要的作用，尤其是处理心肌梗塞、心功能不全、血流不足引起的组织缺氧。因此，要求通过快速反应，在较短时间内提交具有诊断价值的检测结果。

我们获得了微生物来源经改造的遗传编码荧光探针Frex，该探针特异性结合NADH后，其开放的二聚体构象转化为封闭构象，同时在激发波长500nm，发射波长530nm有最强荧光强度。荧光探针Frex能够精确测定人体细胞不同亚细胞结构内自由NADH分布水平，并实时动态看到人类等哺乳动物细胞内葡萄糖代谢、线粒体呼吸链功能、氧化还原调控条件下NADH代谢情况，并发现NADH可以自由跨膜进入细胞内调控多种生命活动。Frex荧光探针可以特异性的高度灵敏地监测到细胞内和线粒体中微小的NADH变化，通过与能量代谢相关的各种脱氢酶(糖酵解、三羧酸循环、磷酸戊糖途径等)相偶联，开发出新型的检测血乳酸试剂盒。Frex只特异性的与NADH结合后发生强荧光激发，通过荧光强度可以定量NADH的水平。Frex并不与NADH类似物如NAD+，ADP，ATP，NADP+和NADPH结合并激发荧光，这是本发明的基础及关键。

目前普遍使用的血乳酸测定方法有分光光度法。分光光度法是在NAD存在下，LDH催化L-乳酸脱氢，氧化成丙酮酸。加入硫酸肼使丙酮酸不断被转换消除，并促进反应完成。反应完成后生成的NADH与乳酸为等摩尔，在340nm波长下测定NADH的量来计算乳酸的含量。该方法的的不足之处在于：1.线性范围窄，对于高浓度样品需经稀释后测定，带来一定的不便。2.测试所需时间长。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种特异性强、灵敏度高、适用范围广，便于普及和安全的荧光蛋白Frex体外检测血乳酸浓度的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：以氧化型辅酶Ⅰ(NAD⁺)作氢受体，乳酸脱氢酶(LDH)催化L-乳酸和NAD⁺生成丙酮酸和NADH，荧光蛋白Frex特异性的与生成的NADH结合并激发荧光，荧光的强弱与乳酸的浓度成线性关系；通过记录荧光强度即可根据荧光强度推算出乳酸浓度；用已知浓度的乳酸测出的荧光强度，做出乳酸浓度标准曲线，未知浓度的乳酸样品就可从该标准曲线推算出来。

本发明进一步的技术方案是：所述乳酸浓度标准曲线根据如下试剂、按照表一和表二制作而成，并根据标准曲线进行如下的推算：

1.试剂：

①50mmol/L乳酸标准母液；

②0.1mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.6)；

③6mmol/L NAD+溶液；

④3mmol/L NADH溶液；

⑤终浓度为45μg/mL Frex蛋白溶液；

⑥活力为3600U/L乳酸脱氢酶(LDH)；

2).检测程序：

2).1标准曲线的制备：

按照以下表一和表二进行加样，加样的单位为uL；加好样后室温反应5min后检测荧光强度(Em530/Ex500)，由此得到两条标准曲线，分别标柱为标准曲线一和标准曲线二。

表一

表二：

2).2样品检测：

按表三进行加样，加样单位为μL,总反应体积为100μL；

表三：

	对照组1	对照组2	实验组
				样品	0	0	a
试剂②	98	97	92-a
				试剂③	0	0	2.5
试剂④	0	1	0
				试剂⑤	2	2	2
试剂⑥	0	0	3.5

3).反应5min后测定荧光强度，根据样品的激发荧光与Frex本底荧光的差值，在标准曲线中可得出其在100μL反应体系中的乳酸浓度，再由公式求出原溶液的乳酸浓度：乳酸浓度(mmol/L)＝X*100/a。

本发明用新型荧光蛋白Frex代替显色剂，从而达到更灵敏、更稳定、更安全以及线性范围更宽的目的；用本发明方法可以制备相应的定量测定全血、脑脊液、尿液、胃液等体液中的乳酸浓度的商品化试剂盒。

具体来讲，本发明与传统的分光光度法相比有如下优点：

1、操作便捷。传统方法操作过程中的静置和离心时间较长，而本发明无需静置和离心，大大节约了操作时间，使检测过程更加便捷。

2、灵敏度高。传统方法是检测颜色深浅变化，而本发明是检测Frex蛋白的荧光信号，所测的最低限更小，因而灵敏度更高。

3、检测更安全。本发明的整个检测过程中只需要加入检测样品、NAD⁺、LDH和荧光蛋白Frex即可得到检测结果，无需添加任何其他有害生化试剂，无论是检测还是后期处理废物都很安全，有利于环境保护。

4、线性范围宽。与传统检测方法相比，本发明的检测线性范围更广，可达到20mmol/L。

附图说明

图1是本发明所述标准曲线图一。

图2是本发明所述标准曲线图二。

具体实施方式

下面将结合附图及实施例对本发明作详细的介绍：本发明所述的一种荧光蛋白Frex体外检测血乳酸的方法，该方法是：

以氧化型辅酶Ⅰ(NAD⁺)作氢受体，乳酸脱氢酶(LDH)催化L-乳酸和NAD⁺生成丙酮酸和NADH，荧光蛋白Frex特异性的与生成的NADH结合并激发荧光，荧光的强弱与乳酸的浓度成线性关系；通过记录荧光强度即可根据荧光强度推算出乳酸浓度，用已知浓度的乳酸测出的荧光强度，做出乳酸浓度标准曲线，未知浓度的乳酸样品就可从该标准曲线推算出来。

本发明所述乳酸浓度标准曲线根据如下试剂、按照表一和表二制作而成，并根据标准曲线进行如下的推算：

1.试剂：

①50mmol/L的乳酸标准母液；

②0.1mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.6)；

③6mmol/L NAD+溶液；

④3mmol/L NADH溶液；

⑤终浓度为45μg/mL Frex蛋白溶液；

⑥活力为3600U/L的乳酸脱氢酶(LDH)；

2).检测程序：

2.1)标准曲线的制备：

按照以下表一和表二进行加样，加样的单位为μL；加好样后室温反应5min后检测荧光强度(Em530/Ex500)，由此得到两条标准曲线，分别标注为标准曲线一和标准曲线二：

表一：

表二：

2.2)样品检测：

按下表(表三)进行加样，加样单位为uL,总反应体积为100uL；

表三：

3).反应5min后测定荧光值，根据样品的激发荧光与Frex本底荧光的差值，在标准曲线中可得出其在100μL反应体系中的乳酸浓度，再由公式求出原溶液的乳酸浓度：乳酸浓度(mmol/L)＝X*100/a。

实施例1：

反应原理：NAD⁺+乳酸+LDH+Frex→丙酮酸+NADH+Frex→激发荧光。

1.试剂

①50mmol/L乳酸标准母液；

②0.1mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.6)；

③6mmol/L NAD+溶液；

④3mmol/L NADH溶液；

⑤终浓度为45μg/mL Frex蛋白溶液；

⑥活力为3600U/L的乳酸脱氢酶(LDH)；

2).检测程序：

2.1)标准曲线的制备：

按照以下表一和表二进行加样，加样的单位为uL；加好样后室温反应5min后检测荧光强度(Em530/Ex500)，由此得到两条标准曲线，分别标注为曲线一和标准曲线二，见图1、2所示；

表一：

表二：

2.2)样品检测：

按下表进行加样，加样单位为uL,总反应体积为100uL；

	对照组1	对照组2	实验组
				样品	0	0	a
试剂②	98	97	92-a

试剂③	0	0	2.5
				试剂④	0	1	0
试剂⑤	2	2	2
				试剂⑥	0	0	3.5

3).反应5min后测荧光值，根据样品的激发荧光与Frex本底荧光的差值，在标准曲线中可得出其在100uL反应体系中的乳酸浓度，再由公式求出原溶液的乳酸浓度：乳酸浓度(mmol/L)＝X*100/a。

Claims

1.一种新型荧光蛋白Frex体外检测血乳酸的方法，其特征在于该方法是：

2.根据权利要求1所述的荧光蛋白Frex体外检测血乳酸的方法，其特征在于所述乳酸浓度标准曲线根据如下试剂、按照表一和表二制作而成，并根据标准曲线进行如下推算：

1.试剂：

①50mmol/L乳酸标准母液；

②0.1mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.6)；

③6mmol/L NAD+溶液；

④3mmol/L NADH溶液；

⑤终浓度为45μg/mL Frex蛋白溶液；

⑥活力为3600U/L乳酸脱氢酶(LDH)；

2).检测程序：

2.1)标准曲线的制备：

按照以下表一和表二进行加样，加样的单位为μL；加好样后室温反应5min后检测荧光强度(Em530/Ex500)，由此分别得到两条标准曲线，分别标注为标准曲线一和标准曲线二。

表一

表二

乳酸对照组对照组 6.5 8 10 12 14 15 20

浓度 1 2 mmol/L mmol/L mmol/L mmol/L mmol/L mmol/L mmol/L 试剂① 0 0 13 16 20 24 28 30 40 试剂② 98 97 79 76 72 68 64 62 52 试剂③ 0 0 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 试剂④ 0 1 0 0 0 0 0 0 0 试剂⑤ 2 2 2 2 2 2 2 2 2 试剂⑥ 0 0 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5

2.2)样品检测：

按表三进行加样，加样单位为μL,总反应体积为100μL；

表三：

对照组1 对照组2 实验组样品 0 0 a 试剂② 98 97 92-a 试剂③ 0 0 2.5 试剂④ 0 1 0 试剂⑤ 2 2 2 试剂⑥ 0 0 3.5

3).反应5min后测荧光强度，根据样品的激发荧光与Frex本底荧光的差值，在标准曲线中可得出其在100μL反应体系中的乳酸浓度，再由公式求出原溶液的乳酸浓度：乳酸浓度(mmol/L)＝X*100/a。