CN107764877B - 一种高灵敏的血清总胆汁酸电化学检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高灵敏的血清总胆汁酸的电化学检测方法。本发明采用的电化学方法仅需直接稀释血清即可消除基质效应，采用高灵敏的双重氧化电化学法检测原理，具有操作简便和响应快速等特点，根据电化学响应信号与待测物浓度之间的线性关系，实现血清总胆汁酸的快速、准确定量。所述检测方法测定血清总胆汁酸的线性良好，灵敏度很高，可检测рmol级的血清总胆汁酸。所述方法检测血清总胆汁酸灵敏、快速，有望用于床旁检测，有较高的科研与临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于电化学检测领域，主要涉及一种高灵敏的血清总胆汁酸电化学检测方法。
背景技术
胆汁酸是胆汁中存在的一大类胆烷酸的总称，是内源性胆固醇的主要代谢产物。生理条件下，胆汁酸随胆汁分泌到肠道，在回肠末端，约95％的胆汁酸经门静脉重吸收入肝，形成肠肝循环。胆汁酸在调节体内胆固醇代谢，促进脂类消化、吸收和防止胆道结石生成方面发挥重要作用。当肝细胞损伤或胆道阻塞会引起胆汁酸代谢异常，导致血中胆汁酸含量显著升高。因此，血清总胆汁酸被认为是肝实质性损伤的灵敏指标。血清总胆汁酸对妊娠期肝内胆汁淤积症和先天性胆道疾病等的诊断有很大的价值。另外，血清总胆汁酸水平可反映急慢性肝炎、肝纤维化和肝硬化门脉高压的病情演变，也是梗阻性黄疸患者梗阻解除的早期敏感指标。
目前，临床主要通过酶循环法测定血清总胆汁酸，其原理是胆汁酸在3α-羟基类固醇脱氢酶(3α-HSD)和Thio-NAD+作用下生成3-酮类固醇及Thio-NADH。新生成的3-酮类固醇在3α-HSD及NADH的作用下生成胆汁酸及NAD+，这样血清中微量胆汁酸检测信号在多次酶循环过程中被放大，同时使生成的Thio-NADH扩增。Thio-NADH在405nm波长处有特异性吸收，通过测定Thio-NADH吸光度值的变化可求得血清中胆汁酸含量。该方法在临床应用较广泛，但其检测灵敏度在μmol/L，有待提高，且用于检测的专用仪器价格昂贵、体积较大无法移动。
电化学分析方法是根据物质在溶液中的电化学性质及其变化规律，以电位、电导和电流等电学量与被测物质量之间的计量关系，对组分进行定性和定量的仪器分析方法。应用电化学分析方法测定血清总胆汁酸具有如下优点：设备简单可移动性强，操作简便快速，灵敏度高，选择性好。目前，国内外还没有关于基于酶促偶联反应-双重氧化法，测定血清总胆汁酸的高灵敏电化学检测方法的相关研究报道。
发明内容
本发明致力于提供一种基于双重氧化的血清总胆汁酸的高灵敏电化学检测方法。本发明的电化学方法以直接稀释血清消除基质效应，省去复杂的样品预处理步骤，结合双重氧化电化学检测的灵敏、简便和快速等特点，通过电化学分析方法实现了血清总胆汁酸快速、准确的定量检测。
本发明的电化学检测方法的原理为：在丝网印刷碳电极(SPCE)的工作电极表面加入含有3α-羟基类固醇脱氢酶(3α-HSD)、氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)和三联吡啶钌(Ru(bpy)3 2+)的磷酸盐缓冲液，再施加一定的氧化恒电位，溶液中部分Ru(bpy)3 2+在电极表面被氧化为Ru(bpy)3 3+，形成Ru(bpy)3 2+/Ru(bpy)3 3+平衡状态，待基线稳定后加入待测血清，3α-HSD特异性催化胆汁酸生成3-酮类固醇和NADH，NADH在电极表面失去电子被氧化生成NAD+，同时Ru(bpy)3 3+还原成Ru(bpy)3 2+，Ru(bpy)3 2+在电极表面再次氧化为Ru(bpy)3 3+产生电化学信号，从而能在I-t曲线上对血清总胆汁酸进行间接电化学定量分析。
本发明中，所述SPCE包括一印制电极的PET基片、PET基片上印制的导线外绝缘层和基片上一端的接口，其特征在于所述的基片上印制有三个电极，分别为碳工作电极、Ag/AgCl参比电极和碳糊对电极，三个电极形成一圆形工作区域，各电极通过绝缘膜下的连接导线与接口相连。
本发明的技术方案是：
一种高灵敏度的血清总胆汁酸电化学检测方法，按以下步骤进行操作：
1)分别取1μL血清样品和1mL超纯水置于Ep管中涡旋混匀，得到一次稀释的血清样品；再分别取1μL一次稀释的血清样品和1mL超纯水置于Ep管中涡旋混匀，得到二次稀释的待测血清样品；
2)分别取20μL 3α-HSD溶液、5μL NAD+溶液、7μL Ru(bpy)3 2+溶液和70μL磷酸盐缓冲液置于Ep管中涡旋混匀，得到混合液；
更优的，所述3α-HSD活性为5.0kU/L，所述NAD+浓度为100.0mmol/L，所述Ru(bpy)3 2+浓度为100.0mmol/L。所述磷酸盐缓冲溶液，浓度为100.0mmol/L，pH值为9.5，其中所述磷酸盐缓冲溶液由100.0mmol/L的磷酸氢二钠溶液和100.0mmol/L的磷酸钠溶液混合而配制。
3)所述丝网印刷碳电极与电化学工作站连接，将步骤2)得到的混合液50μL滴加在所述电极的工作区域，在恒电位下进行电流-时间(I-t)曲线分析，至基线恒定时加入步骤1)得到的5.0μL待测血清样品于所述工作电极表面，通过计算I-t曲线中增加的峰电流，从而对待测血清样品中的总胆汁酸进行间接定量测定，恒电位参数设置为1.15V。
本发明所述高灵敏度的血清总胆汁酸电化学检测方法的有益效果如下：
1)本发明所述的高灵敏度的血清总胆汁酸电化学检测方法，通过使用丝网印刷碳电极配合电化学工作站对血清总胆汁酸进行定量测定，检测仪器操作简单，价格低廉。
2)本发明所述的电化学检测方法中所用的丝网印刷电极，制作成本低，制作过程简单、快速，可实现批量生产。SPCE电极为一次性使用，既避免对传统柱电极单调沉闷的打磨抛光，又避免电极重复使用所造成的实验交叉污染。
3)本发明所述的电化学检测方法用于测定血清总胆汁酸时，仅需对样本进行简单的稀释处理即可消除血清基质效应干扰，避免了复杂的样品预处理过程，有效地降低了检测成本。
4)本发明所述的电化学检测方法，响应快速、操作简便，具有超高的灵敏度、良好的精密度和准确度，可用于对血清总胆汁酸进行快速准确定量。
5)本发明所述的电化学检测方法有望发展为便携式血清总胆汁酸测量装置,为临床肝胆疾病的诊疗提供实时的胆汁酸水平监测。
附图说明
图1为本发明丝网印刷碳电极结构及所述方法的检测原理图。
图中1-工作电极，2-辅助电极，3-参比电极，4-圆形工作区域，5-PET基板，虚线框中为所述方法的检测原理。
图2为本发明丝网印刷电极对胆汁酸的酶催化产物NADH的电化学响应以及加入Ru(bpy)3 2+对NADH电化学响应放大作用的对比。
图中A曲线为在含NAD+的磷酸盐缓冲溶液中加入稀释的胆汁酸标准品测得的I-t曲线；B曲线为在含3α-HSD、NAD+和Ru(bpy)3 2+的磷酸盐缓冲溶液中加入稀释的胆汁酸标准品测得的I-t曲线；C曲线为在含Ru(bpy)3 2+的磷酸盐缓冲溶液中加入NADH溶液测得的I-t曲线；D曲线为在含3α-HSD、NAD+和Ru(bpy)3 2+的磷酸盐缓冲溶液中加入稀释的胆汁酸标准品测得的I-t曲线。
图3为本发明恒电位值影响总胆汁酸检测氧化峰电流的曲线图。
图中■代表胆汁酸检测的氧化峰电流。
图4为本发明中胆汁酸检测混合液中磷酸盐缓冲液的浓度影响总胆汁酸检测氧化峰电流的曲线图。
图中■代表胆汁酸检测的氧化峰电流。
图5为本发明中胆汁酸检测混合液中磷酸盐缓冲液的pH值影响总胆汁酸检测氧化峰电流的曲线图。
图中■代表胆汁酸检测的氧化峰电流增量△I。
图6为本发明中胆汁酸检测混合液中3α-HSD活性影响总胆汁酸检测氧化峰电流的曲线图。
图中■代表胆汁酸检测的氧化峰电流。
图7为本发明中胆汁酸检测混合液中NAD+浓度影响总胆汁酸检测氧化峰电流的曲线图。
图中■代表胆汁酸检测的氧化峰电流。
图8为本发明中胆汁酸检测混合液中Ru(bpy)3 2+浓度影响总胆汁酸检测氧化峰电流的曲线图。
图中■代表胆汁酸检测的氧化峰电流。
图9为本发明中氧化峰电流对血清总胆汁酸浓度的标准曲线图。
图中LnC代表总胆汁酸自然对数浓度。
图10为本发明血清总胆汁酸检测方法与第五代酶循环法检测结果的相关性图。
具体实施方式
本发明电化学工作站仅以CHI852C电化学工作站为例,其购自于上海辰华仪器有限公司,3α-HSD购自于迈克生物科技股份有限公司，NAD+购自于罗氏控股股份有限公司，Ru(bpy)3 2+购自于sigma-Aldrich公司。
实施例1：本发明所述丝网印刷碳电极的制备
本发明所述丝网印刷电极是在聚对苯二甲酸二乙酯(PET)基板上依次印刷碳浆、银/氯化银浆和绝缘浆。具体包括如下步骤：
1)清洗PET基板，晾干后在PET基板上印刷碳浆，制作工作电极和辅助电极，常温干燥；
2)在上述PET基板上印刷含有氯化银的银浆，制成参比电极，常温干燥；
3)避开圆形工作区域，在上述PET基板上印刷绝缘浆，将导线覆盖住；
4)上述工作电极、辅助电极和参比电极形成一圆形工作区域，各电极通过绝缘膜下的导线与接口相连，然后于30～40℃烘干，保存备用。
实施例2：血清总胆汁酸的电化学检测方法
1)血清样品预处理：分别取1μL血清样品和1mL超纯水置于Ep管中涡旋混匀，得到一次稀释的血清样品；再分别取1μL一次稀释的血清样品和1mL超纯水置于Ep管中涡旋混匀，得到二次稀释的待测血清样品；
2)分别取20μL5.0kU/L的3α-HSD溶液、5μL100.0mmol/L的NAD+溶液、7μL100.0mmol/L的Ru(bpy)3 2+溶液和70μL浓度为100.0mmol/L，pH值为9.5的磷酸盐缓冲液置于Ep管中涡旋混匀，得到总胆汁酸检测混合液；
3)所述丝网印刷碳电极与与电化学工作站连接，将步骤2)得到的总胆汁酸检测混合液50μL滴加在所述电极的工作区域，在1.15V恒电位下进行电流-时间曲线分析，至基线恒定时加入步骤1)得到的5.0μL待测血清样品于所述工作电极表面，计算电流-时间曲线中增加的峰电流，其氧化峰电流增加量与血清总胆汁酸浓度的自然对数在一定范围内呈良好的线性关系，从而实现对待测血清样品中总胆汁酸的间接定量测定。
实施例3：
本实施例是对所述电化学检测原理的验证。操作步骤同实施例2，结果见图2。图中A曲线为在含NAD+的磷酸盐缓冲溶液中加入稀释的胆汁酸标准品测得的I-t曲线；B曲线为在含3α-HSD和NAD+的磷酸盐缓冲溶液中加入稀释的胆汁酸标准品测得的I-t曲线；C曲线为在含Ru(bpy)3 2+的磷酸盐缓冲溶液中加入NADH溶液测得的I-t曲线；D曲线为在含3α-HSD、NAD+和Ru(bpy)3 2+的磷酸盐缓冲溶液中加入稀释的胆汁酸标准品测得的I-t曲线。对比A和B曲线可知，A曲线因检测体系中无3α-HSD，不能通过酶促偶联反应生成NADH，故未观察到电化学响应信号。由图中B曲线可知，加入胆汁酸后溶液中3α-HSD和NAD+特异性催化胆汁酸生成3-酮类固醇和NADH，NADH在电极表面被氧化产生电化学信号，但响应信号较低，故通过酶促偶联反应-间接电化学法检测血清胆汁酸的灵敏度有待进一步提高。对比C和D曲线可知，含Ru(bpy)3 2+检测池中加入3α-HSD和NAD+再加入胆汁酸产生的电化学信号与含Ru(bpy)3 2+的磷酸盐缓冲溶液中加入NADH的电化学信号一致，表明通过酶促偶联-双重氧化反应可实现高灵敏的血清胆汁酸电化学法检测。对比A和D曲线可知，在检测池中加入Ru(bpy)3 2+实现双重氧化可使电化学信号显著增加。
实施例4：
本实施例是考察本发明中恒电位值对胆汁酸检测氧化峰电流的影响。胆汁酸检测混合液中磷酸盐缓冲液浓度为100.0mmol/L、pH值为10.3，3α-HSD的活性为1.0kU/L，NAD+的浓度为5.0mmol/L，Ru(bpy)3 2+的浓度为7.0mmol/L，基于以上条件本研究对比分析了恒电位在0.9～1.2V时对氧化峰电流的影响。结果见图3，施加的氧化恒电位在1.15V以上能获得较高的灵敏度和稳定性，继续增大氧化电位背景噪音也增加，故恒电位设置为1.15V。
实施例5：
本实施例是考察磷酸盐缓冲液的浓度和pH值对总胆汁酸检测氧化峰电流的影响。胆汁酸检测混合液中3α-HSD的活性为1.0kU/L，NAD+的浓度为6.0mmol/L，Ru(bpy)3 2+的浓度为5.0mmol/L，基于以上条件，考察磷酸盐缓冲溶液浓度在20～80mmol/L、pH值在8.0～11.0时对氧化峰电流的影响。结果分别见图4和图5，故磷酸盐缓冲液的最佳浓度为70mmol/L，最佳pH值为9.5。
实施例6
本实施例是考察3α-HSD活性对总胆汁酸检测氧化峰电流的影响。胆汁酸检测混合液中磷酸盐缓冲液的浓度为70mmol/L、pH值为9.5，NAD+浓度为6.0mmol/L，Ru(bpy)3 2+的浓度为5.0mmol/L，基于以上条件，考察3α-HSD活性在0.2～1.4kU/L时对氧化峰电流的影响，结果见图6。故3α-HSD的最佳活性为1.0kU/L。
实施例7
本实施例是考察NAD+浓度对总胆汁酸检测氧化峰电流的影响。胆汁酸检测混合液中磷酸盐缓冲液的浓度为70mmol/L、pH值为9.5，3α-HSD活性为1.0kU/L，Ru(bpy)3 2+的浓度为5.0mmol/L，基于以上条件，考察NAD+浓度在3.0～7.0mmol/L范围对氧化峰电流的影响，结果见图7。故NAD+溶液的最佳浓度为5.0mmol/L。
实施例8
本实施例是考察Ru(bpy)3 2+浓度对总胆汁酸检测氧化峰电流的影响。胆汁酸检测混合液中磷酸盐缓冲液的浓度为70mmol/L、pH值为9.5，3α-HSD活性为1.0kU/L，NAD+浓度为5.0mmol/L，基于以上条件，考察Ru(bpy)3 2+浓度在2.0～10.0mmol/L范围内对氧化峰电流的影响，结果见图8。故Ru(bpy)3 2+溶液的最佳浓度为7.0mmol/L。
实施例9
本实施例是考察所述检测方法用于定量血清总胆汁酸浓度与氧化峰电流之间的相关性。在空白混合血清中(总胆汁酸浓度为0.18μmol/L)加入系列浓度(5.0～150.0μmol/L)的胆汁酸标准溶液，经106倍稀释后，在最优实验条件下进行检测，结果见图9。血清总胆汁酸在浓度(5.0～150.0)μmol/L范围内的浓度的自然对数与电化学响应信号有较好的线性关系，血清总胆汁酸的标准曲线为Y＝1.062lnC+6.572(r＝0.9983，n＝5)，该方法测定血清总胆汁酸的最低检测限为0.40μmol/L(S/N>3)，最低定量限为2.0μmol/L(S/N>10)。
实施例10
本实施例是考察本发明所述电化学方法用于测定血清总胆汁酸的精密度和回收率，在空白混合血清(本发明中指总胆汁酸浓度为0.18μmol/L)中分别加入浓度为(5.0，20.0和100.0)μmol/L的胆汁酸标准品溶液，日内重复测定5次，同一样品连续测定5天，分别计算不同浓度胆汁酸的日内和日间变异系数，并考察方法的精密度和回收率，结果见表1和表2。变异系数最大为11.8％，表明本发明的检测方法具有良好的精密度。回收率为92.8％～108.4％，表明本发明具有较好的准确度。
表1.精密度
表2.回收率
实施例11
本实施例是考察本发明所述电化学方法用于测定血清总胆汁酸的抗干扰能力。胆红素和血红蛋白是血浆样品中最常见的内源性干扰物质。干扰实验按照美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)制定的干扰试验指南(CLSI-EP7-A)进行。在内含7.20μmol/L总胆汁酸的血清中分别添加血红蛋白和胆红素标准溶液，终浓度分别为0.0～400mg/mL和0.0～200μmol/L以评价干扰试验。血清总胆汁酸浓度在添加干扰物前、后分别表示为Xc和XT，干扰值(XT-Xc)≤1.96S表示为无显著干扰(N)，反之有显著干扰(I)，结果见表3。血清中血红蛋白和胆红素分别在0.0～200mg/mL和0.0～34.2μmol/L时对血清总胆汁酸的测定无明显干扰，表明本发明具有较好的抗干扰能力。
表3.干扰实验
实施例12
本实施例是考察本发明所述电化学检测方法与第五代循环酶法测定血清总胆汁酸的相关性。分别用本发明所述电化学检测方法与第五代循环酶法测定72份血清样本中总胆汁酸含量，结果见图10。结果表明，本发明所述电化学检测方法测定血清总胆汁酸结果与现有方法测定结果具有良好的相关性(r＝0.9372,p＝0.000)，说明本发明所述传感器用于血清总胆汁酸含量测定，结果稳定、可靠。
Claims (4)
1.一种高灵敏的血清总胆汁酸电化学检测方法，其特征在于，检测步骤包括在丝网印刷碳电极(SPCE)工作电极表面加入含有3α-羟基类固醇脱氢酶(3α-HSD)、氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)和三联吡啶钌(Ru(bpy)3 2+)的磷酸盐缓冲液，再施加一定的氧化恒电位，待基线稳定后加入经稀释的待测血清，根据计时电流法(I-t)曲线上增加的电化学信号，实现对总胆汁酸的间接电化学法定量分析，其中，上述缓冲液中所述3α-HSD的活性为1.0kU/L，所述NAD+浓度为5.0mmol/L，所述Ru(bpy)3 2+浓度为7.0mmol/L，所述磷酸盐缓冲液的浓度为70.0mmol/L，pH值为9.5，所述的血清处理方法为直接稀释法。
2.根据权利要求1所述的电化学检测方法，其特征在于，所述SPCE包括一印制电极的PET基片、PET基片上印制的外部绝缘层和基片上一端的接口，其特征在于所述的基片上印制有三个电极，分别为碳工作电极、Ag/AgCl参比电极和碳浆对电极，三个电极形成一圆形工作区域，各电极通过绝缘膜下的连接导线与接口相连。
3.根据权利要求1所述的电化学检测方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液由100.0mmol/L的磷酸氢二钠溶液和100.0mmol/L的磷酸钠溶液混合而配制。
4.根据权利要求1-3任一项所述的电化学检测方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
1)分别取1μL血清样品和1mL超纯水置于Ep管中涡旋混匀，得到一次稀释的血清样品；再分别取1μL一次稀释的血清样品和1mL超纯水置于Ep管中涡旋混匀，得到二次稀释的待测血清样品；
2)分别取20μL 5.0kU/L 3α-HSD溶液、5μL 100.0mmol/L NAD+溶液、7μL100.0 mmol/LRu(bpy)3 2+溶液和70μL浓度为100.0mmol/L，pH值为9.5的磷酸盐缓冲液置于Ep管中涡旋混匀，得到混合液；
3)所述丝网印刷碳电极与电化学工作站连接，将步骤2)得到的混合液50μL滴加到所述电极的工作区域，在恒电位下进行电流-时间(I-t)曲线分析，至基线恒定时加入步骤1)得到的5.0μL待测血清样品于所述工作电极表面，通过计算I-t曲线中增加的峰电流，从而对待测血清样品中的总胆汁酸进行间接定量测定，恒电位参数设置为1.15V。
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