CN103616431A - 血清总胆汁酸检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种血清总胆汁酸检测试剂盒及其使用方法，所述试剂盒包括血清样品预处理液、磷酸盐缓冲液、3α-羟基类固醇脱氢酶(3α—HSD)、氧化型辅酶I(NAD⁺)及丝网印刷电极。所述血清总胆汁酸检测试剂盒采用丝网印刷电极进行电化学检测，通过电化学分析方法间接地实现血清总胆汁酸的快速、准确测定，是一种试剂简单，价格低廉，使用方便，高性价比的血清总胆汁酸检测试剂盒。

Description

血清总胆汁酸检测试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明属于医疗检测技术，主要涉及血清总胆汁酸检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

胆汁酸是胆固醇的代谢产物，在肝脏内主要经胆固醇7α-脱羟酶经典途径的合成，分泌入肝胆管储存于胆囊内，在食物刺激下排入肠道后，经肠肝循环进入肝门静脉被肝细胞重吸收。胆汁酸可促进脂类物质的消化吸收和增加胆固醇的溶解度防止胆石生成。胆汁酸的升高主要与肝胆疾病有关，在其他疾病如妊娠肝内胆汁淤积症(ICP)也有不同程度升高。目前认为血清总胆汁酸水平是唯一可同时反应肝脏分泌，肝脏合成与代谢以及肝细胞损伤三方面的血清学指标。与其他临床生化指标(转氨酶，胆红素等)相比，胆汁酸的测定也更有助于早期肝硬化的诊断，急性肝炎的预后判断以及区分活动性和非活动性慢性肝炎等，具有重要的临床价值。

目前，血清总胆酸的测定方法主要包括以下几种：

(1)质谱法能准确测定胆汁酸分子量，对胆汁酸进行分型，但胆汁酸结构比较复杂，需要对结果进行繁琐的分析。检测仪器昂贵，操作复杂且需专人操作，样本需要纯化以避免堵塞仪器。且有离子源产生的记忆效应，污染等问题。

(2)色谱法能很好地分离并定量分析血清胆汁酸，但是测定血清胆汁酸前需要对样本进行衍生化和水解，使整个检测过程复杂化，增加了检测时间，不适合临床的广泛应用。

(3)放射免疫分析法操作简单，但其生物试剂稳定性会受多种因素影响，且存在放射性污染，对环境和工作人员带来的危害是难以预料的。

(4)酶循环法已经在临床得到运用，但试剂价格昂贵，容易造成检测仪器污染，影响测定结果，且需要专用的检测仪器，仪器昂贵难以移动。

电化学分析方法是仪器分析方法的重要组成部分之一。它是根据溶液中物质的电化学性质及其变化规律，建立在以电位、电导、电流和电量等电学量与被测物质某些量之间的计量关系的基础上，对组分进行定性和定量的仪器分析方法。应用电化学分析方法测定血清总胆汁酸具有如下优点：设备简单可移动性强，操作简便检测迅速，灵敏度高，选择性好。目前，国内外还没有关于电化学分析方法检测血清总胆汁酸的试剂盒及其使用方法的相关研究报道。

发明内容

本发明致力于提供一种试剂简单，价格低廉，使用方便，高性价比的血清总胆汁酸检测试剂盒，本发明的血清总胆汁酸检测试剂盒，采用电化学分析方法对血清总胆汁酸进行快速准确的测定。

本发明的血清总胆汁酸检测试剂盒的检测原理为：利用血清样品中的胆汁酸能在3α-羟基类固醇脱氢酶(3α-HSD)特异性地催化下与氧化型辅酶I(NAD⁺)反应生成3-酮类固醇及还原性辅酶I(NADH)，NADH在丝网印刷电极表面被氧化生成NAD⁺，同时失去两个电子产生电信号；利用电化学仪对NADH所产生的氧化峰电流进行检测，其氧化峰电流与血清中胆汁酸的浓度呈正相关，从而实现对血清总胆汁酸的间接定量分析。

一种血清总胆汁酸检测试剂盒，包括血清样品预处理液、磷酸盐缓冲液、3α-HSD、NAD⁺及丝网印刷电极。

其中，所述丝网印刷电极包括PET基板，PET基板上以碳浆印制工作电极和辅助电极、Ag／AgCl浆印制成参比电极，工作电极、辅助电极和参比电极与相应的电极触点间通过碳浆连接，再在PET基板上除工作电极、辅助电极和参比电极形成的一圆形工作区域外印刷上一层绝缘胶。

更优地，所述血清样品预处理液为甲醇。

更优地，所述3α-HSD活性为40U／mL，所述NAD⁺浓度为100mmol／L。

更优地，所述磷酸盐缓冲液为0.2mol／L，pH=12.2的磷酸盐缓冲液。

其中，所述磷酸盐缓冲液由0.2mol／L磷酸氢二钠溶液和饱和氢氧化钠溶液配制。

一种所述的血清总胆汁酸检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

1)用所述血清样品预处理液除去血清样品中的蛋白；

2)将除去蛋白后的所述血清样品离心，取上清液用氮气吹干，用磷酸盐缓冲液复溶；

3)分别取步骤2)得到的溶液、3α-HSD溶液及NAD⁺溶液于Ep管中并混匀，在室温下进行酶反应10min，得到胆汁酸酶催化反应混合液；

4)所述丝网印刷电极与电化学工作站连接，取步骤3)得到的所述胆汁酸酶催化反应混合液滴加在所述电极的工作区域，用示差脉冲伏安法对酶反应产物NADH的氧化峰电流进行测定。

本发明所述血清总胆汁酸检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

1)用甲醇除去血清样品中的蛋白；

2)将除去蛋白后的所述血清样品离心，取上清液用氮气吹干，用0.2mol／L，pH=12.2的磷酸盐缓冲液复溶，所述甲醇，血清样品与磷酸盐缓冲液的体积比为12∶4∶1；

3)分别取步骤2)得到的溶液、40U／mL的3α-HSD溶液及100mmol／L的NAD⁺溶液于Ep管中并混匀，在室温下进行酶反应10min，得到胆汁酸酶催化反应混合液。所述步骤2)得到的溶液，3α-HSD溶液与NAD⁺溶液的体积比为10∶1∶10；

4)所述丝网印刷电极与电化学工作站连接，取步骤3)得到的所述胆汁酸酶催化反应混合液滴加在所述电极的工作区域，用示差脉冲伏安法对酶反应产物NADH的氧化峰电流进行测定。

本发明所述血清总胆汁酸检测试剂盒的使用方法，包括如下具体步骤：

1)取100μL血清样品于Ep管中，涡旋条件下缓慢滴加入300μL甲醇除去血清中的蛋白；

2)将除去蛋白后的血清样品离心，取上清液在60℃用氮气吹干，用0.2mol／L，pH=12.2的25μL磷酸缓冲液复溶；

3)分别取10μL步骤2)得到的溶液、1μL40U／mL的3α-HSD溶液和10μL100mmol／L的NAD⁺溶液涡旋混匀，在室温下进行酶反应10min，得到胆汁酸酶催化反应混合液；

4)所述丝网印刷电极与电化学仪连接，将步骤3)得到的胆汁酸酶催化反应混合液滴加在所述电极的工作区域，对酶反应产物NADH的氧化峰电流进行测定从而对血清总胆汁酸定量，其参数设置为：低电位0V，高电位+1V，电位增量0.005V、振幅0.1V、脉冲宽度0.05s、脉冲周期0.2s。

本发明所述血清总胆汁酸检测试剂盒的有益效果如下：

1)本发明所述血清总胆汁酸检测试剂盒使用丝网印刷电极配合电化学工作站对血清总胆汁酸进行测定，检测仪器操作简单，价格低廉，可移动性强。

2)本发明使用的丝网印刷电极成本低，具有可批量制作的特点。实现了电极的一次性使用，避免了对固体电极单调沉闷的打磨抛光；另外也避免了重复使用造成实验交叉污染。

3)本发明所用试剂种类少，用量小，降低了血清总胆汁酸检测的成本，且可大大降低对环境的污染。

4)本发明所述的试剂盒用于血清总胆汁酸的检测，检测迅速(小于1min)，具有良好的精密度，较高的灵敏度，较高的准确度，可用于对血清总胆汁酸进行快速准确测定。

5)本发明所述的试剂盒可发展为便携式血清总胆汁酸测量装置，为临床肝胆疾病的诊疗提供实时的胆汁酸水平监测。

附图说明

图1为本发明丝网印刷电极结构图。

图中1、工作电极，2、辅助电极，3、参比电极，4、圆形工作区域，5、PET基板。

图2为血清总胆汁酸的示差脉冲伏安曲线图。

图中实线为加标血清的示差脉冲伏安曲线，虚线为空白血清的示差脉冲伏安曲线。

图3为本发明磷酸盐缓冲液pH值影响NADH的氧化峰电流的曲线图。

图中●代表加标血清的氧化峰电流，■代表空白血清的氧化峰电流，▲是加标血清与空白血清氧化峰电流的差值。

图4为本发明NAD⁺浓度影响NADH的氧化峰电流的曲线图。

图5为本发明3α-HSD浓度影响NADH的氧化峰电流的曲线图。

图6为本发明中氧化峰电流对血清胆汁酸浓度的标准曲线图。

图7为本发明的血清总胆汁酸检测结果与临床采用的酶循环法检测结果的相关性图。

具体实施方式

本发明电化学工作站仅以CHI852C电化学工作站为例，其购白于上海辰华仪器有限公司，3α-HSD购于旭化成株式会社，NAD⁺(Roche10621650001)购于罗氏控股股份有限公司。

实施例1：血清总胆汁酸检测试剂盒的制备

1)购置分析纯的甲醇，置于容器中；

2)配制磷酸盐缓冲液：配制0.2mol／L磷酸氢二钠溶液，再加入饱和氢氧化钠溶液调节至pH=12.2，并置于容器中；

3)配制40U／mL的3α-HSD：将购买的3α-HSD配制成活性为40U／mL的溶液，并置于容器中；

4)配制100mmol／L的NAD⁺：将购买的NAD⁺配制成浓度为100mmol／L的溶液，并置于容器中；

5)制备本发明所述丝网印刷电极的：

本发明所述丝网印刷电极是在聚对苯二甲酸二乙酯(PET)基板5上依次印刷碳浆、银浆和绝缘浆。具体包括如下步骤：

①清洗PET基板5，晾干后在PET基板5上印刷碳浆，制作工作电极1和辅助电极2，常温干燥。

②在上述PET基板5上印刷含有氯化银的银浆，制成参比电极3；上述工作电极1、辅助电极2和参比电极3与相应的电极触点间以印刷的碳浆连接，常温干燥。

③避开工作电极区域4，在上述PET基板5上印刷绝缘浆，将导线覆盖住，然后于30-40℃烘干，保存备用。

6)将本发明制备的所述丝网印刷电极置于容器中。

7)将上述5个容器装成血清总胆汁酸检测试剂盒，封装；将所述试剂盒置于-20℃保存(可保存6个月以上)，用前于室温环境解冻即可。

实施例2：血清总胆汁酸检测试剂盒的使用

1)将所述血清总胆汁酸检测试剂盒于室温下解冻；

2)取100μL血清样品于EP管(离心管)中，涡旋条件下逐滴加入300μL甲醇除去血清中的蛋白；

3)将除去蛋白后的血清样品12000×g离心10min，取上清液在60℃用氮气吹干，用25μL0.2mol／L，pH=12.2的磷酸缓冲液复溶；

4)分别取10μL步骤3)得到的溶液、1μL40U／mL的3α-HSD和10μL100mmol／L的NAD⁺涡旋混匀，其混合溶液中3α-HSD的活性为2U／mL，NAD⁺的浓度为50mmol／L，在室温下进行酶反应10min得到胆汁酸酶催化反应混合液；

5)将所述丝网印刷电极与CHI852C电化学工作站连接，将其参数设置为：低电位0V，高电位1V，电位增量0.005V、振幅0.1V、脉冲宽度0.05s、脉冲周期0.2s；将步骤5)得到的胆汁酸酶催化反应混合液滴加在所述电极的工作区域，对NADH在电极所产生的氧化峰电流进行检测，其氧化峰电流与血清总胆汁酸的浓度在线性范围内呈良好的线性关系，从而实现对血清总胆汁酸的间接定量分析。

实施例3

本实施例是考察丝网印刷电极对胆汁酸的酶催化反应产物NADH的电化学响应。分别对空白血清(本发明中指胆汁酸浓度小于0.5μmol／L的人血清样本)和加标血清(本发明中指加入胆汁酸标准品的血清样本)进行测定，操作步骤同实施例2，结果见图2。图中实线为加标血清的示差脉冲伏安曲线，虚线表示空白血清的示差脉冲伏安曲线，说明产生的电化学信号为胆汁酸的酶反应产物NADH的电化学信号。

实施例4

本实施例是考察磷酸盐缓冲液pH值对NADH的氧化峰电流的影响。胆汁酸酶催化反应混合液中3α-HSD的活性为2U／mL，NAD⁺的浓度为50mmol／L，基于以上条件，在pH值11.0～13.0之间，考察磷酸缓冲液pH值对氧化峰电流的影响，结果如图3。pH在11.6～12.2范围，随着pH的增加空白血清氧化峰电流(■表示)迅速降低，表明空白血清中的物质在pH大于12.2失去电化学活性；pH在11.0～12.2范围，随着pH的增加加标血清的氧化峰电流(●表示)逐渐增大，当pH值大于12.2，加标血清的氧化峰电流迅速下降，表明pH值大于12.2后3α-HSD酶的活性迅速失去。因此，磷酸盐缓冲液的pH值是胆汁酸检测最关键的影响因素，不仅影响酶催化反应中酶的活性和氧化峰电流，还决定了血清中干扰物质的电化学活性。加标血清与空白血清的氧化峰电流差值(▲表示)即胆汁酸酶催化反应产物NADH所产生的氧化峰电流值，选择差值最大时pH值12.2为最优的pH值条件。

实施例5

本实施例是考察胆汁酸酶催化反应混合液中NAD⁺浓度对NADH的氧化峰电流的影响。磷酸盐缓冲液pH值为12.2，其它实验条件同实施例3，在30～70mmol／L范围内考察NAD⁺的浓度对所述峰电流的影响，结果见图4。NAD⁺浓度大于50mmol／L时可以保证反应充分进行，过多的NAD⁺将造成试剂浪费。故NAD⁺浓度选择50mmol／L。

实施例6

本实施例是考察胆汁酸酶催化反应混合液中3α-HSD浓度对NADH的氧化峰电流的影响。NAD⁺浓度为50mmol／L，其他实验条件同实施例4，在0.5～4U／mL范围内改变3α-HSD酶浓度，考察3α-HSD浓度对氧化峰电流的影响，结果见图5。3α-HSD浓度为2U／mL时信号最大，过多的3α-HSD反而会降低氧化峰电流。故3α-HSD浓度选择为2U／mL。

实施例7

本实施例是考察所述试剂盒定量血清总胆汁酸时胆汁酸的浓度与氧化峰电流之间的相关性。将胆汁酸标准品加入空白血清中(胆汁酸浓度小于0.5μmol／L的人血清样本)，使其加入胆汁酸标准品浓度分别为5.0，10，20，50，100，200，400μmol／L。在最优的检测条件下，磷酸盐缓冲液pH值为12.2，3α-HSD的活性为2U／mL，NAD⁺的浓度为50mmol／L时，测定加标血清的氧化峰电流，并对其加入的胆汁酸标准品浓度作图(图6)。氧化峰电流大小与胆汁酸的浓度在5～400μmol／L范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=0.0038X+0.2739(Y为NADH的氧化峰电流，X为胆汁酸浓度，r=0.9959)。在信噪比为3(S／N=3)时计算得出的检出限为2μmol／L，灵敏度较好，能定量生理浓度(小于10μmol／L)和病理浓度的血清胆汁酸。

实施例8

本实施例是考察本发明所述试剂盒用于测定血清总胆汁酸的精密度，在空白血清中分别加入高、中、低浓度的胆汁酸标准品溶液，日内重复测定5次，连续测定5天。分别计算不同浓度胆汁酸日内和日间的变异系数，进行精密度考察，结果见表1。变异系数最大为6.1％，表明本发明具有良好的精密度。

表1.精密度

实施例9

本实施例是考察本发明所述试剂盒用于测定血清总胆汁酸的回收率，在血清中分别加入高、中、低浓度的胆汁酸标准品溶液，测定加入各浓度的胆汁酸前后血清对应的NADH氧化峰电流，进行回收率实验。相对回收率=(加标血清中总胆汁酸的检测浓度-加标前血清中总胆汁酸的检测浓度)／加入胆汁酸的浓度×100％，结果见表2，回收率在75％～113％之间，表明本发明具有较好的准确度。

表2.回收率

实施例10

本实施例是考察本发明所述试剂盒用于测定血清总胆汁酸的抗干扰能力，胆红素和血红蛋白是血清样品中最常见的内源性干扰物质，按照美国国家临床实验室标准委员会制定的干扰试验的评价方案进行，即测定未加胆红素标准品的血清总胆汁酸浓度(Xc)和加入胆红素标准品后的胆汁酸浓度(X_T)，干扰值(=X_T-X_c)在本发明方法的1.96S(即95％可信度)范围内为无显著干扰(用N表示)，如干扰值超过1.96S，即为有显著干扰(用I表示)，(干扰记为I，不干扰为N)。结果表明(如表3)，高浓度(大于150μmol／L)的胆红素和溶血才会对胆汁酸的检测造成干扰，本发明具有较好的抗干扰能力。

表3.干扰实验

实施例10

本实施例是考察本发明所述试剂盒测定血清总胆汁酸与临床上应用的酶循环法的相关性。分别用本发明所述试剂盒和酶循环法检测了26例临床标本，结果见图7。结果表明，本发明所述试剂盒测定血清总胆汁酸结果和酶循环法的检测结果具有良好的相关性(r=0.8266)，说明本发明所述试剂盒测定血清总胆汁酸具有很好的可靠性。

Claims (9)

1.一种血清总胆汁酸检测试剂盒，其特征在于：包括血清样品预处理液、磷酸盐缓冲液、3α-羟基类固醇脱氢酶(3α-HSD)、氧化型辅酶I(NAD⁺)及丝网印刷电极。

2.根据权利要求1所述的血清总胆汁酸检测试剂盒，其中，所述丝网印刷电极包括PET基板，PET基板上以碳浆印制工作电极和辅助电极、Ag／AgCl浆印制成参比电极，工作电极、辅助电极和参比电极与相应的电极触点间通过碳浆连接，再在PET基板上除工作电极、辅助电极和参比电极形成的一圆形工作区域外印刷上一层绝缘胶。

3.根据权利要求1或2所述的血清总胆汁酸检测试剂盒，其中，所述血清样品预处理液为甲醇。

4.根据权利要求1或2所述的血清总胆汁酸检测试剂盒，其中，所述3α-HSD活性为40U／mL，所述NAD⁺浓度为100mmol／L。

5.根据权利要求1或2所述的血清总胆汁酸检测试剂盒，其中，所述磷酸盐缓冲液为0.2mol／L，pH=12.2的磷酸盐缓冲液。

6.根据权利要求5所述的血清总胆汁酸检测试剂盒，其中，所述磷酸盐缓冲液由0.2mol／L磷酸氢二钠溶液和饱和氢氧化钠溶液配制。

7.一种如权利要求1—6任意之一项所述的血清总胆汁酸检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)用所述血清样品预处理液除去血清样品中的蛋白；

2)将除去蛋白后的所述血清样品离心，取上清液用氮气吹干，用磷酸盐缓冲液复溶；

3)分别取步骤2)得到的溶液、3α-HSD溶液及NAD⁺溶液于Ep管中并混匀，在室温下进行酶反应10min，得到胆汁酸酶催化反应混合液；

4)所述丝网印刷电极与电化学工作站连接，取步骤3)得到的所述胆汁酸酶催化反应混合液滴加在所述电极的工作区域，用示差脉冲伏安法对酶反应产物NADH的氧化峰电流进行测定。

8.根据权利要求7所述的血清总胆汁酸检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)用甲醇除去血清样品中的蛋白；

2)将除去蛋白后的所述血清样品离心，取上清液用氮气吹干，用0.2mol／L，pH=12.2的磷酸盐缓冲液复溶，所述甲醇，血清样品与磷酸盐缓冲液的体积比为12∶4∶1；

3)分别取步骤2)得到的溶液、40U／mL的3α-HSD溶液及100mmol／L的NAD⁺溶液于Ep管中并混匀，在室温下进行酶反应10min，得到胆汁酸酶催化反应混合液。所述步骤2)得到的溶液，3α-HSD溶液与NAD⁺溶液的体积比为10∶1∶10；

4)所述丝网印刷电极与电化学仪连接，取步骤3)得到的所述胆汁酸酶催化反应混合液滴加在所述电极的工作区域，用示差脉冲伏安法对酶反应产物NADH的氧化峰电流进行测定。

9.如权利要求8所述的血清总胆汁酸检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下具体步骤：

1)取100μL血清样品于Ep管中，涡旋条件下逐滴加入300μL甲醇除去血清中的蛋白；

2)将除去蛋白后的血清样品离心，取上清液在60℃用氮气吹干，用25μL0.2mol／L，pH=12.2的磷酸缓冲液复溶；

3)分别取10μL步骤2)得到的溶液、1μL40U／mL的3α-HSD溶液和10μL100mmol／L的NAD⁺溶液涡旋混匀，在室温下进行酶反应10min，得到胆汁酸酶催化反应混合液；

4)所述丝网印刷电极与电化学仪连接，将步骤3)得到的胆汁酸酶催化反应混合液滴加在所述电极的工作区域，对酶反应产物NADH的氧化峰电流进行测定从而对血清总胆汁酸定量，其参数设置为：低电位0V，高电位+1V，电位增量0.005V、振幅0.1V、脉冲宽度0.05s、脉冲周期0.2s。

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