CN106442659B - 基于苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8-OhdG活性的方法 - Google Patents

基于苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8-OhdG活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开基于苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8‑OhdG活性的方法，包括以下步骤：带有巯基的DNA四面体结构的制备；带有巯基的DNA四面体结构在金电极上的修饰得到顶端连接8‑OHdG适体的巯基的DNA四面体结构的电极；G‑四链体电极的形成；聚苯胺沉积的电化学传感电极；利用电化学方法对产生的聚苯胺的电流信号进行检测从而检测8‑OhdG的活性。本发明极大地提高了8‑OHdG的检测灵敏度。与传统的以8‑OHdG还原峰为信号的电化学检测方法相比，检测限降低2个数量级。本发明无需制备复杂材料以及标记DNA探针，可避免材料制备及标记DNA探针而导致检测成本高、操作烦琐，重现性差的缺陷。本发明具有成本低、快速、简便、灵敏度高的优点。

Description

基于苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8-OhdG活性的方法
技术领域
本发明属于定量检测8-羟基脱氧鸟苷活性的生物传感技术，具体涉及基于苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8-OhdG活性的方法。
背景技术
氧化应激带来的氧化损伤是引起人类的各种疾病和伤害的一个重要因素。8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG)是活性氧自由基(ROS)引起DNA氧化损伤修饰产物之一，其生成原因很多，主要是电离辐射、化学致癌物代谢活化及细胞正常新陈代谢过程产生大量ROS直接攻击DNA中的鸟嘌呤(dG),使脱氧鸟苷氧化为8-OHdG。8-OHdG可被机体特异性DNA修复酶剪切清除并经肾脏随尿排泄,其含量反映机体氧化损伤程度,既是个体接触标志物,又是效应标志物。它一旦逃避了机体自身修复,就可能成为致突变、致畸、致癌的启动因子。8-OHdG在体内稳定存在，为代谢终产物,且只能通过DNA氧化损伤途径形成,并可通过分析其在组织细胞核DNA及线粒体DNA中的含量来反映体内DNA氧化损伤，体液中8-OHdG水平不受饮食等因素影响,不是细胞更新结果,是目前国际上公认的一种新型评价DNA氧化损伤和氧化应激状态的敏感指标和生物标志物。因此测定机体8-OHdG含量对评估体内氧化损伤和修复程度,氧化应激与DNA损伤相互关系,研究退行性疾病、衰老机制、癌发生机制、环境毒物、慢性炎症疾病与氧化应激的关系等均有重要的意义,也可以用来评价抗氧化剂治疗DNA氧化损伤的效果。
传统的8-OHdG检测方法主要有高效液相色谱-电化学法(HPLC-ECD)、酶联免疫吸附法(ELISA)、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)、高效毛细管电泳(HPCE)。高效液相色谱-电化学法需样品量小，无损伤性，速度快，选择性好，对组织细胞DNA及尿中8-OHdG均可检测,是目前应用广泛、较为成熟的方法。但由于仪器价格较高,此法并未推广应用于常规检验。传统的电化学检测8-OHdG的信号来源是其本身的还原峰，灵敏度不够高。酶联免疫吸附法应用单克隆抗体检测加合物的技术，灵敏度高、重复性好,可用于分析生物样品,尤其是尿中DNA和RNA的氧化损伤产物。然而此法存在交叉反应，可能导致检测值比真实值偏高。因此，对8-OHdG分析的简单、灵敏、低成本的原位实时监测仍然是当前亟待解决的问题。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了基于苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8-OhdG活性的方法，即基于聚苯胺沉积和DNA纳米结构电化学传感进行定量测定8-OHdG的方法。本发明中针对8-OHdG作用于8-OHdG适体产生G-四链体而形成的辣根过氧化物模拟酶，从而催化苯胺到聚苯胺的特异性氧化反应，测得聚苯胺的电化学响应信号。DNA正四面体及8-OHdG引发的G-四链体均含有丰富的DNA双链，而这些DNA双链因其表面丰富的负电荷而成为优秀的苯胺聚合模板，极大地提高了8-OHdG的检测灵敏度。与传统的以8-OHdG还原峰为信号的电化学检测方法相比，检测限降低2个数量级。此外，该方法还具有准确性好、无标记、简单易行等优点。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：基于苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8-OhdG活性的方法，包括以下步骤：
1)带有巯基的DNA四面体结构的制备；
2)带有巯基的DNA四面体结构在金电极上的修饰得到顶端连接8-OHdG适体的巯基的DNA四面体结构的电极；
3)顶端连接8-OHdG适体的巯基的DNA四面体结构的电极中加入8-OHdG和辅助因子氯化血红素的条件下8-OHdG适体的空间构型发生变化，形成G-四链体电极；
4)G-四链体电极中加入过氧化氢和苯胺的CH3COOH-CH3COONa缓冲溶液，电极表面形成具有过氧化酶催化活性的G-四链体DNA辣根过氧化物模拟酶，辣根过氧化物模拟酶催化苯胺形成聚苯胺得到聚苯胺沉积的电化学传感电极；
5)利用电化学方法对产生的聚苯胺的电流信号进行检测从而检测8-OhdG的活性。
其中，上述步骤1)的具体步骤如下：将5’端修饰了巯基的A、B、C三条单链和5’端接了8-羟基脱氧鸟苷适体的D链各0.5～2μL等比例混合在40～50μL TM缓冲液和0.5～2μLTCEP中，配成终浓度为0.5～2μM的样品，然后将配好的样品放入90～100℃热水浴中持续3～10min，然后迅速降温到1～5℃，并在1～5℃中持续20～40分钟以上，即可得到带有巯基的DNA四面体结构。
其中，上述步骤2)的具体步骤如下：将四面体DNA纳米结构滴加到清洗干净的电极表面，盖上烧杯，常温过夜组装即得。
其中，上述步骤3)的具体步骤如下：PBS缓冲液冲洗步骤3)得到的电极的表面，除去非特异性结合，在电极表面滴加浓度不同的8-羟基脱氧鸟苷，室温反应1小时，PBS冲洗，滴加氯化血红素溶液，室温反应1小时，即得G-四链体结构的电极。
其中，上述步骤3)的8-OHdG在缓冲液中的终浓度为0～5nM；优选地0.05～0.5nm。
其中，上述步骤3)中的氯化血红素溶液的浓度为0～20μM。
其中，上述步骤4)中苯胺和过氧化氢的浓度均为80～120mM。苯胺和过氧化氢在HAc-NaAc缓冲溶液(pH＝4.3)里混合，将组装好的电极浸泡到里面，室温反应。
其中，上述步骤1)中TM缓冲溶液为含有pH＝8.0的20mM Tris-HCl溶液和50mMMgCl2溶液，所述CH3COOH-CH3COONa缓冲溶液为含有100mM CH3COOH和100mM CH3COONa的pH＝4.3的缓冲溶液。
其中，上述步骤4)的反应时间为60～120min，更为优选地，所述反应时间为90min。
其中，上述步骤5)的具体步骤如下：将步骤4)修饰好的电极作为工作电极，用一个铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，形成三电极体系，缓冲溶液中执行参数的设置如下：电压范围-0.5V到0V；电位增量：0.004V；脉冲宽度：0.05s；采样宽度：0.0167s；脉冲周期：0.2s；静置时间：2s。
本发明提供的基于聚苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8-OHdG活性的方法的原理为：本发明通过在金电极上修饰了带有巯基和8-OHdG的DNA纳米结构，利用8-OHdG适体与8-OHdG之间的作用，在hemin的存在下形成辣根过氧化物模拟酶G-四链体。在过氧化氢的存在下，DNA四面体和G-四链体结构上会发生辣根过氧化物模拟酶催化苯胺到聚苯胺的特异性氧化反应，聚苯胺的还原得到很强的电化学响应信号。上述方法中，DNA纳米结构是通过巯基与金电极之间的Au-S键从而修饰在电极上。上述方法中，聚苯胺的还原机理具体如下：
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下的特色及优点：
(1)本发明利用DNA四面体构型的稳定性和刚性保证了适体的取向、适体间的距离，避免适体互相缠绕。
(2)Hemin-G四链体接在DNA四面体上时会增强该过氧化物模拟酶的催化活性。
(3)本发明利用8-OHdG对其8-OHdG适体的特异性识别来提高其特异性。
(4)本发明在实验过程中，借助聚苯胺(PANI)卓越氧化还原特性及良好的环境稳定性，在过氧化氢存在下，辣根过氧化物酶有效催化氧化苯胺产生聚苯胺，此反应具有更高的动力学可控性和高效酶催化活性等优点。
(5)电化学生物传感器具有高灵敏度、高兼容性和成本低廉等优点，降低了实验的检测限。
(6)该方法可用于实际样品的检测，具有一定的临床意义。
附图说明
图1显示了基于聚苯胺沉积的电化学传感电极检测8-OHdG的流程图；
图2A显示了金电极表面逐步修饰的循环伏安电化学表征图；图2B显示了金电极表面逐步修饰的微分脉冲伏安谱图(a:裸电极；b:DNA四面体纳米结构是修饰后的电极；c：hemin-G四链体和DNA四面体纳米结构是修饰后的电极；d：聚苯胺修饰后的电极)；
图3A显示了8-OHdG浓度对聚苯胺电流强度影响的微分脉冲伏安谱图；8-OHdG的浓度分别为(a)0，(b)0.01,(c)0.05,(d)0.1,(e)0.5,(f)1,(g)1.5,(h)2,(i)3,(j)4,(k)5；图3B：聚苯胺电流强度与8-OHdG的关系曲线。插图：聚苯胺电流强度与8-OHdG浓度的线性关系曲线。
具体实施方式
下面通过具体的实施例和附图对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
本实验中用到的试剂和仪器：
5’端修饰了巯基的A、B、C三条单链和5’端接了8-羟基脱氧鸟苷适体的D链，8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG),三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐(TCEP)，苯胺，氯化血红素(hemin)，电化学工作站(CHI660),VersaStat 3电化学工作站(普林斯顿),时间分辨表面等离子体共振检测系统(TR-SPR)(DC-TR-SP，长春鼎诚科技有限公司)，金电极购买于天津艾达恒晟科技发展有限公司。
5’端修饰了巯基的A、B、C和D四条单链分别为：
A:5’-SH-(CH2)6-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC-3’；
B:5’-SH-(CH2)6-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC-3’；
C:5’-SH-(CH2)6-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT-3’；
D:5’-ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTATTTTTGCGGGCGATCGGCGGGGGGTGCGTGCGCTCTGTGCCAGGGGGTGGGACAGATCATATGGGGGTGCT-3’；
实施例1：
基于聚苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8-羟基脱氧鸟苷活性，检测步骤是：
1)将5’端修饰了巯基的A、B、C三条单链和5’端接了8-羟基脱氧鸟苷适体的D链各0.5μL等比例混合在40μL TM缓冲液和0.5μL TCEP中，配成终浓度为0.5μM的样品，然后将配好的样品放入90℃热水浴中持续10min，然后迅速降温到1℃，并在1℃中持续40分钟以上，即可得到带有巯基的DNA四面体结构；
2)带有巯基的顶端连接8-OHdG适体的DNA四面体结构在金电极上的修饰得到顶端连接8-OHdG适体的巯基的DNA四面体结构的电极：先将金电极浸泡在食人鱼洗液(H2O2和H2SO4的体积比为3：7)中，浸泡2h洗净后，先后用0.3μm，0.05μm氧化铝粉末进行抛光处理，用超纯水冲洗干净，在氮气氛围下干燥得到清洗干净的电极，取5μL带有巯基的DNA四面体结构滴加到前面清洗干净的电极表面，盖上烧杯，常温过夜组装即得顶端连接8-OHdG适体的巯基的DNA四面体结构的电极；
3)顶端连接8-OHdG适体的巯基的DNA四面体结构的电极中加入8-OHdG和辅助因子氯化血红素的条件下8-OHdG适体的空间构型发生变化，形成G-四链体电极：用PBS缓冲液冲洗步骤2)得到的电极表面，除去非特异性结合，在电极表面滴加浓度为0.05nM的8-OHdG，室温反应1小时，PBS缓冲液冲洗，滴加浓度为20μM的hemin溶液，室温反应1小时形成G-四链体电极；
4)G-四链体电极中加入过氧化氢和苯胺的CH3COOH-CH3COONa缓冲溶液，电极表面形成具有过氧化酶催化活性的G-四链体DNA辣根过氧化物模拟酶，辣根过氧化物模拟酶催化苯胺形成聚苯胺：配制浓度为100mM的苯胺和100mM的过氧化氢在CH3COOH-CH3COONa缓冲溶液(pH＝4.3)里混合，将G-四链体电极浸泡到里面，室温反应90min得到聚苯胺沉积的电化学传感电极；
5)利用电化学方法对产生的聚苯胺的电流信号进行检测从而检测8-OhdG的活性：修饰好的聚苯胺沉积的电化学传感电极作为工作电极，用一个铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，形成三电极体系。微分脉冲伏安(DPV)在100mM CH3COOH-CH3COONa缓冲溶液(pH＝4.3)中执行参数的设置如下：电压范围-0.4V到0.4V；电位增量：0.004V；脉冲宽度：0.05s；采样宽度：0.0167s；脉冲周期：0.2s；静置时间：2s。测定其电压-电流曲线。检测结束后，得到了图3A中的c曲线。c曲线的峰值对应在图3B横坐标为0.05nM的点。
实施例2：基于聚苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8-羟基脱氧鸟苷活性，检测步骤是：
1)将5’端修饰了巯基的A、B、C三条单链和5’端接了8-羟基脱氧鸟苷适体的D链各2μL等比例混合在50μL TM缓冲液和2μL TCEP中，配成终浓度为2μM的样品，然后将配好的样品放入100℃热水浴中持续3min，然后迅速降温到5℃，并在5℃中持续20分钟以上，即可得到带有巯基的DNA四面体结构；该TM缓冲溶液为含有pH＝8.0的20mM Tris-HCl溶液和50mMMgCl2溶液，CH3COOH-CH3COONa缓冲溶液为含有100mM CH3COOH和100mM CH3COONa的pH＝4.3的缓冲溶液；
2)带有巯基的顶端连接8-OHdG适体的DNA四面体结构在金电极上的修饰得到顶端连接8-OHdG适体的巯基的DNA四面体结构的电极：先将金电极浸泡在食人鱼洗液(H2O2和H2SO4的体积比为3：7)中，浸泡2h洗净后，先后用0.3μm，0.05μm氧化铝粉末进行抛光处理，用超纯水冲洗干净，在氮气氛围下干燥得到清洗干净的电极，取5μL带有巯基的DNA四面体结构滴加到前面清洗干净的电极表面，盖上烧杯，常温过夜组装即得顶端连接8-OHdG适体的巯基的DNA四面体结构的电极；
3)顶端连接8-OHdG适体的巯基的DNA四面体结构的电极中加入8-OHdG和辅助因子氯化血红素的条件下8-OHdG适体的空间构型发生变化，形成G-四链体电极：用PBS缓冲液冲洗步骤2)得到的电极表面，除去非特异性结合，在电极表面滴加浓度为0.1nM的8-OHdG，室温反应1小时，PBS缓冲液冲洗，滴加浓度为10μM的hemin溶液，室温反应1小时形成G-四链体电极；
4)G-四链体电极中加入过氧化氢和苯胺的CH3COOH-CH3COONa缓冲溶液，电极表面形成具有过氧化酶催化活性的G-四链体DNA辣根过氧化物模拟酶，辣根过氧化物模拟酶催化苯胺形成聚苯胺：配制浓度为100mM的苯胺和100mM的过氧化氢在CH3COOH-CH3COONa缓冲溶液(pH＝4.3)里混合，将G-四链体电极浸泡到里面，室温反应120min得到聚苯胺沉积的电化学传感电极；
5)利用电化学方法对产生的聚苯胺的电流信号进行检测从而检测8-OhdG的活性：修饰好的聚苯胺沉积的电化学传感电极作为工作电极，用一个铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，形成三电极体系。微分脉冲伏安法(DPV)在100mM CH3COOH-CH3COONa缓冲溶液(pH＝4.3)中执行参数的设置如下：电压范围-0.4V到0.4V；电位增量：0.004V；脉冲宽度：0.05s；采样宽度：0.0167s；脉冲周期：0.2s；静置时间：2s。测定其电压-电流曲线。检测结束后，得到了图3A中的d曲线。d曲线的峰值对应在图3B横坐标为0.1nM的点。
实施例3
基于聚苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8-羟基脱氧鸟苷活性，检测步骤是：
1)将5’端修饰了巯基的A、B、C三条单链和5’端接了8-羟基脱氧鸟苷适体的D链各1.25μL等比例混合在45μL TM缓冲液和1.25μL TCEP中，配成终浓度为1.25μM的样品，然后将配好的样品放入95℃热水浴中持续6min，然后迅速降温到3℃，并在3℃中持续30分钟以上，即可得到带有巯基的DNA四面体结构；
2)带有巯基的顶端连接8-OHdG适体的DNA四面体结构在金电极上的修饰得到顶端连接8-OHdG适体的巯基的DNA四面体结构的电极：先将金电极浸泡在食人鱼洗液(H2O2和H2SO4的体积比为3：7)中，浸泡2h洗净后，先后用0.3μm，0.05μm氧化铝粉末进行抛光处理，用超纯水冲洗干净，在氮气氛围下干燥得到清洗干净的电极，取5μL带有巯基的DNA四面体结构滴加到前面清洗干净的电极表面，盖上烧杯，常温过夜组装即得顶端连接8-OHdG适体的巯基的DNA四面体结构的电极；
3)顶端连接8-OHdG适体的巯基的DNA四面体结构的电极中加入8-OHdG和辅助因子氯化血红素的条件下8-OHdG适体的空间构型发生变化，形成G-四链体电极：用PBS缓冲液冲洗步骤2)得到的电极表面，除去非特异性结合，在电极表面滴加浓度为0.5nM的8-OHdG，室温反应1小时，PBS缓冲液冲洗，滴加浓度为10μM的hemin溶液，室温反应1小时形成G-四链体电极；
4)G-四链体电极中加入过氧化氢和苯胺的CH3COOH-CH3COONa缓冲溶液，电极表面形成具有过氧化酶催化活性的G-四链体DNA辣根过氧化物模拟酶，辣根过氧化物模拟酶催化苯胺形成聚苯胺：配制浓度为100mM的苯胺和100mM的过氧化氢在CH3COOH-CH3COONa缓冲溶液(pH＝4.3)里混合，将G-四链体电极浸泡到里面，室温反应100min得到聚苯胺沉积的电化学传感电极；
5)利用电化学方法对产生的聚苯胺的电流信号进行检测从而检测8-OhdG的活性：修饰好的聚苯胺沉积的电化学传感电极作为工作电极，用一个铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，形成三电极体系。微分脉冲伏安(DPV)在100mM CH3COOH-CH3COONa缓冲溶液(pH＝4.3)中执行参数的设置如下：电压范围-0.4V到0.4V；电位增量：0.004V；脉冲宽度：0.05s；采样宽度：0.0167s；脉冲周期：0.2s；静置时间：2s。测定其电压-电流曲线。检测结束后，得到了图3A中的e曲线。e曲线的峰值对应在图3B横坐标为0.5nM的点。
本发明实施例1～3中的不同8-OhdG浓度的微分脉冲伏安(DPV)曲线峰值对应不同的点反应在图3B中，且在8-OhdG的浓度为0.01～2nM时浓度与峰值有很好的线性关系，体现在图3B的插图中，浓度(X)与峰值(Y)的关系为：Y＝0.66983X+0.7888，R2＝0.9956。
本发明利用聚苯胺(PANI)其卓越的氧化还原特性及良好的环境稳定性，构造出生物传感电极。在过氧化氢存在下，辣根过氧化物酶能够有效催化氧化苯胺产生聚苯胺，此反应具有更高的动力学可控性和高效酶催化活性等优点，将检测限提高了2～3个数量级。
上述仅为本发明优选的实施例，并不限制于本发明。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施例来举例说明。而由此方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.基于苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8-OhdG活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）带有巯基的DNA四面体结构的制备；
2）带有巯基的DNA四面体结构在金电极上的修饰得到顶端连接8-OHdG适体的巯基的DNA四面体结构的电极；
3）顶端连接8-OHdG适体的巯基的DNA四面体结构的电极中加入8-OHdG和辅助因子氯化血红素的条件下8-OHdG适体的空间构型发生变化，形成具有G-四链体结构的电极，G-四链体结构具有辣根过氧化物模拟酶性质；
4）G-四链体电极中加入过氧化氢和苯胺的CH3COOH-CH3COONa缓冲溶液，G-四链体作为辣根过氧化物模拟酶催化苯胺形成聚苯胺得到聚苯胺沉积的电化学传感电极；
5）利用电化学方法对产生的聚苯胺的电流信号进行检测从而检测8-OhdG的活性；
所述步骤1）的具体步骤如下：将5’端修饰了巯基的A、B、C三条单链和5’端接了8-羟基脱氧鸟苷适体的D链各0.5~2μL等比例混合在40~50μL TM 缓冲液和0.5~2μL TCEP中，配成终浓度为0.5~2μM的样品，然后将配好的样品放入90~100℃热水浴中持续3~10 min，然后迅速降温到1~5℃，并在1~5℃中持续20~40分钟以上，即可得到带有巯基的DNA四面体结构；
所述步骤2）的具体步骤如下：将带有巯基的DNA四面体结构滴加到清洗干净的电极表面，盖上烧杯，常温过夜组装即得。
2.根据权利要求1所述的基于苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8-OhdG活性的方法，其特征在于，所述步骤3）的具体步骤如下：PBS缓冲液冲洗步骤2）得到的电极的表面，除去非特异性结合，在电极表面滴加浓度不同的8-羟基脱氧鸟苷，室温反应1小时，PBS缓冲液冲洗，滴加氯化血红素溶液，室温反应1小时，即得G-四链体结构的电极。
3.根据权利要求2所述的基于苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8-OhdG活性的方法，其特征在于，所述步骤3）中的氯化血红素溶液的浓度为0~20μM。
4.根据权利要求2所述的基于苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8-OhdG活性的方法，其特征在于，所述步骤4）中苯胺和过氧化氢的浓度均为80~120mM。
5.根据权利要求1所述的基于苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8-OhdG活性的方法，其特征在于，所述步骤1）中TM缓冲溶液为含有pH =8.0的20 mM Tris-HCl溶液和50mMMgCl2溶液，所述CH3COOH-CH3COONa缓冲溶液为含有100mM CH3COOH和100mM CH3COONa的pH=4.3的缓冲溶液。
6.根据权利要求1所述的基于苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8-OhdG活性的方法，其特征在于，所述步骤4）的反应时间为60~120min。
7.根据权利要求1基于苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8-OhdG活性的方法，其特征在于，所述步骤5）的具体步骤如下：将步骤4）修饰好的电极作为工作电极，用一个铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，形成三电极体系，缓冲溶液中执行参数的设置如下：电压范围-0.5 V到 0 V；电位增量：0.004V；脉冲宽度：0.05s ；采样宽度：0.0167 s；脉冲周期：0.2 s；静置时间：2s。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107287297B (zh) * 2017-06-26 2021-04-06 浙江工业大学 基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测氧化损伤dna的方法
CN108241013A (zh) * 2017-08-23 2018-07-03 河南大学 基于聚苯胺沉积的电化学传感电极定量检测多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1活性的方法
CN108801988B (zh) * 2018-04-02 2021-03-30 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 基于上转换荧光适配体传感器的双酚a和雌二醇检测试剂盒及应用和检测方法
CN110568046B (zh) * 2019-09-16 2022-05-13 南京工业大学 基于hrp催化聚苯胺原位生成用于afb1的检测方法
CN111638258A (zh) * 2020-06-12 2020-09-08 中玺(泉州)科技有限公司 一种肿瘤标志物8-羟基脱氧鸟苷的检测方法
CN113552189B (zh) * 2021-07-23 2022-06-10 济南大学 一种基于铜纳米颗粒的检测赭曲霉毒素a的生物传感器

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104651491A (zh) * 2014-12-23 2015-05-27 中国科学院上海高等研究院 一种dna四面体纳米结构信号探针及其应用
CN104931668A (zh) * 2015-05-21 2015-09-23 南京大学 一种检测污染水体遗传毒性的生物学方法
CN105136882A (zh) * 2015-09-23 2015-12-09 南京市第二医院 基于dna模拟酶诱导苯胺聚合的电化学检测dna甲基转移酶活性的检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104651491A (zh) * 2014-12-23 2015-05-27 中国科学院上海高等研究院 一种dna四面体纳米结构信号探针及其应用
CN104931668A (zh) * 2015-05-21 2015-09-23 南京大学 一种检测污染水体遗传毒性的生物学方法
CN105136882A (zh) * 2015-09-23 2015-12-09 南京市第二医院 基于dna模拟酶诱导苯胺聚合的电化学检测dna甲基转移酶活性的检测方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A colorimetric aptasensor for the highly sensitive detection of 8-hydroxy-2"-deoxyguanosine based on G-quadruplex-hemin DNAzyme;Hui Liu 等;《Analytical Biochemistry》;20140505;第458卷;全文 *
A label-free electrochemical aptasensor for 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine detection;Shan-Shan Shi 等;《Journal of Electroanalytical Chemistry》;20151031;第759卷;第108页2.3-2.4部分 *
Label-free ultrasensitive detection of telomerase activity via multiple telomeric hemin/G-quadruplex triggered polyaniline deposition and a DNA etrahedron-structure regulated signal;Yuanjian Liu 等;《Chemical Communications》;20160131;第52卷(第9期);第1796页右栏最后一段-第1797页左栏第一段，图1 *
Ultrasensitive electrochemical detection of prostate-specific antigen by using antibodies anchored on DNA nanostructural scaffold;Xiaoqing Chen 等;《Analytical Chemistry》;20140626;第86卷(第15期);正文第7页第2段、表1 *

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